MXPA01008192A - Estructura cristalina de la cpla2 y metodos de identificacion de agonistas y antagonistas utilizando la misma. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona la cPLA2 cristalina. La estructura del cristal de la cPLA2 tambien se ha resuelto o aclarado utilizando tal material. Tambien se proporcionan los modelos basados en tal estructura cristalina. Tambien se describen los metodos para identificar los inhibidores de la actividad de la cPLA2 y el enlace a la membrana utilizando tales modelos.

Description

ESTRUCTURA CRISTALINA DE LA cPLA2 Y MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN DE AGONISTAS Y ANTAGONISTAS UTILIZANDO LA MISMA Antecedentes de la Invención Los leucotrienos y prostaglandinas son mediadores inflamatorios importantes en el asma, artritis, y otros padecimientos inflamatorios. Los leucotrienos causan la obstrucción de las vias aéreas en los asmáticos a través de la broncoconstricción, la secreción incrementada de moco, y la quimioatracción de las células inflamatorias (O' Byrne, 1997); las prostaglandinas causan dolor y edema asociado con la artritis. El bloqueo por la intervención farmacológica ya sea de la síntesis o la acción de estos mediadores lipidos es efectivo en el tratamiento del padecimiento humano, confirmando asi su importancia (Simón et al., 1998; O' Byrne, 1997) . La fosfolipasa A2 citosólica (cPLA2) inicia la producción de leucotrienos y prostaglandinas mediante la liberación de ácido araquidónico a partir de las membranas celulares. El ácido araquidónico a su vez es metabolizado a las prostaglandinas mediante la via de la ciclooxigenasa y a leucotrienos mediante la via de la 5-lipoxigenasa . Concomitante con la liberación del ácido araquidónico, se .ÍÉ, A. ? forma el factor de activación de las liso-plaquetas (liso-PAF) , el cual se puede entonces acetilar para generar el PAF, una molécula también implicada en la patofisiología del asma y la artritis (Venable et al., 1993). De aquí, la reacción catalizada por la cPLA2 inicia la producción de tres clases de mediadores inflamatorios: los leucotrienos, las prostaglandinas y el PAF. La cPLA2 es un miembro de una superfamilia diversa de enzimas de fosfolipasa A2 con la capacidad común de escindir o desdoblar el éster sn-2 de los glicerofosfolípidos . Los primeros miembros de la familia que se caracterizaron fueron las enzimas de bajo peso molecular que se secretaron ya sea extracelularmente o en granulos (y son referidos colectivamente aquí como sPLA2s; grupos I, II, III, V, VII, y IX) (Dennis, 1997). La familia de PLA2 se ha extendido con la clonación y caracterización de la cPLA2 selectiva del araquidonilo, dependiente del calcio (Clark et al., 1991; Kramer et al., 1991), la PLA2 independiente del calcio (Tang, et al., 1997; Balboa et al., 1997) y las PAF-acetilhidrolasas del plasma e intracelulares (Hattori et al., 1994, 1995). Cada una de estas nuevas enzimas no comparte la homología de secuencia con las enzimas de bajo peso molecular o entre sí. Además, a diferencia de las ifi £f3¡ i. ?. t i . ,kA..t..i . sPLA2s, las cuales usan el agua activada para escindir el fosfolípido, estas enzimas parecen utilizar una serina nucleofílica. En este respecto, tienen más en común con otras lipasas de la familia de la a/ß hidrolasa que con las sPLA2s. Dos enzimas adicionales con un 30% de identidad al dominio catalítico de la cPLA2 se han clonado recientemente; se han llamado la cPLA2ß (C. Song et al., manuscrito en preparación) y cPLA2? (Underwood et al., 1998). La clonación de cPLA2 también se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,322,776, 5,354,677, 5,527,698 y 5,593,878. La clonación de la cPLA2 independiente del calcio también se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,466,595, 5,554,511, 5,589,170 y 5,840,511. Numerosas piezas de evidencia han soportado el papel central de la cPLA2 en la biosíntesis de mediadores de lípidos. La cPLA2 es la única enzima que es altamente selectiva para los fosfolípidos que contienen ácido araquidónico en la posición sn-2 (Clark et al., 1995; Hanel & Gelb, 1993) . La activación de la cPLA2 o su expresión incrementada se ha relacionado con la síntesis incrementada de leucotrieno y prostaglandina (Lin et al., 1992b). Siguiendo la activación, la cPLA2 se transloca a la membrana t-a. k & i t nuclear, en donde se co-localiza con la ciclooxigenasa y lipoxigenasa que metabolizan el araquidonato a las prostaglandinas y leucotrienos (Schievella et al., Glover et • al., 1995). Aunque estos datos son precisos, la evidencia 5 más definitiva para el papel central de la cPLA2 en la producción de los eicosanoides y el PAF viene de los ratones que han sido producidos deficientes en cPLA2 a través de la recombinación homologa (Uozumi et al., 1997; Bonventre et al., 1997). Los macrófagos peritoneales derivados de estos • 10 animales fallaron en fabricar leucotrienos, prostaglandinas, o PAF. Los ratones deficientes en cPLA2 también han sido informativos respecto al papel de la cPLA2 en el padecimiento, puesto que estos ratones son resistentes a la hiperreactividad bronquial en un modelo de anafilaxis 15 utilizado para imitar el asma (Uozumi et al., 1997). La cPLA2 consiste de al menos dos dominios distintos • funcionalmente: un dominio de enlace del lípido dependiente del Ca2+ (CaLB) N-terminal y un dominio catalítico independiente del Ca2+ (Nalefski et al., 1994). El dominio 20 del CaLB N-terminal es un miembro de la familia C2 y su estructura se ha resuelto o aclarado (Perisic et al., 1998; Xu et al., 1998); el mismo media la regulación del calcio mediante la co-localización del dominio catalítico con su substrato de membrana (Nalefski et al., 1994). La actividad de la CPLA2, además, está también regulada por la fosforilación del dominio catalítico (Lin et al., 1991; Leslie, 1997). La Ser505 y Ser727 se conservan a través de 5 todas las especies y se fosforilan en tipos de células múltiples (de Carvalho et al., 1998). La fosforilación de la Ser505 por los miembros de la familia MAP-cinasa es una respuesta común a los estímulos extracelulares que liberan ácido araquidónico. La mutación de la Ser505 a Ala disminuye • 10 la activación (Lin et al., 1993) mientras que la mutación del análogo en la Ser727 no tiene efecto (Leslie, 1998). Varias líneas de evidencia sugieren que el mecanismo catalítico de la CPLA2 procede a través de un intermediario de serina-acilo (Trimble et al., 1993; Hanel & Gelb, 1995). 15 La mutación de la Ser228 elimina la actividad de la cPLA2 contra todos los substratos incluyendo los fosfolípidos, • lisofosfolípidos, y la coumarina acilada grasa (Pickard et al., 1996; Huang et al., 1996). La Ser228 está presente en una secuencia de pentapéptidos, G-L-S-G-S, la cual es 20 similar a la "porción de lipasa" clásica G-X-S-X-G (Schrag & Cygler, 1997) encontrada en la mayoría de las lipasas dentro de la familia más amplia de las enzimas llamadas las a/ß hidrolasas. Estas enzimas poseen un núcleo común que consiste de una hoja o lámina ß mezclada, bien conservada, cuyas hebras están intercaladas por las hélices a. En todas las a/ß hidrolasas, la serina catalítica está presente en una vuelta cerrada entre una hebra ß y una hélice a, llamada la "curva nucleofílica" (ver revisión por Schrag & Cygler, 1997) . Esta vuelta dirige la cadena lateral de serina corta lejos de la estructura o cadena principal de la proteína, reduciendo la obstrucción estérica alrededor del residuo y requiriendo que las cadenas laterales +2 y -2 sean pequeñas para evitar el conflicto o discordancia estérica; de esto surge la prevalencia de la porción G-X-S-X-G (Dere enda & Derewenda, 1991) . Además de la serina, las a/ß hidrolasas usan una histidina y un ácido (aspartato/glutamato) como los otros miembros de una tríada catalítica similar a aquélla presente en las serina proteasas (Schrag & Cygler, 1997). Sin embargo, aunque en la cPLA se mostró que la Asp549 es esencial para la actividad, ninguno de los 19 residuos de histidina, lo fueron (Pickard et al., 1996). Un residuo diferente, Arg200, estaba implicado como jugando un papel en el proceso enzimático, aunque el mecanismo para su implicación permaneció desconocido. Estas observaciones I?a l i i „«,,*..„ ;._.... .. a , : . ,a, __, ______ .. _, _mmi.ij sugirieron que la cPLA2 actúa a través de un nuevo mecanismo catalítico para las acil hidrolasas. Como tanto la sPLAs y las lipasas de la familia de la a/ß hidrolasa, la cPLA2 preferencialmente desdobla los substratos presentados en una interfase (Nalefski et al., 1994). Este fenómeno, conocido como activación interfacial, se ha atribuido a cualquiera de los cambios conformacionales en la enzima o a la presentación más favorable del substrato (Scott et al., 1990). El origen de la diferencia de 1500 veces en la actividad de la cPLA2 hacia el substrato monomérico y micelar permanece desconocido. A pesar del papel clave de la cPLA2 en el padecimiento inflamatorio, su estructura tridimensional permanece aún no resuelta o aclarada, dejando numerosas preguntas sin responder. Aquí, se reporta la estructura cristalina por rayos x de la CPLA2 humana a una resolución de 2.5 Á. La estructura proporciona una visión dentro del origen de la selectividad del araquidonato y la activación interfacial, clarifica los papeles de las Ser228, Asp549, y Arg200, y revela la inter-relación entre CaLB y los dominios catalíticos. De manera importante, la estructura es de una topología única, distinta de aquélla de la familia de las a/ß hidrolasas . l *k <- ¿j .Í?Í¿ Sumario de la Invención Todas las referencias a los aminoácidos en la cPLA2 en la presente se hacen utilizando los números de residuos • que se refieren a la secuencia de cPLA2 que se encuentran en 5 la Tabla 1 de la Patente Norteamericana No. 5,527,698, con la primera metionina que es designada el residuo 1 (Metí) . La presente invención proporciona la cPLA2 cristalina. Preferiblemente, la cPLA2 es ya sea cPLA2 humana o cPLA2 de una especie no mamífera. En ciertas modalidades, • 10 la cPLA2 es la cPLA2 recombinante y/o comprende la secuencia madura de la cPLA2 que se presenta de manera natural. Otras modalidades proporcionan una composición cristalina que comprende la cPLA2 en asociación con una secuencia especie química. Preferiblemente, la segunda 15 especie química se selecciona del grupo que consiste de un inhibidor potencial de la actividad de la cPLA2 y un inhibidor potencial de un enlace de la membrana de cPLA2. Aún otras modalidades proporcionan un modelo de la estructura de la cPLA2 que comprende un conjunto de datos 20 que engloban la estructura de la cPLA2. Preferiblemente, tal conjunto de datos se determinó mediante análisis cristalográfico de la cPLA2, incluyendo posiblemente el análisis mediante NMR. En ciertas modalidades, el conjunto üli. i,i ,,~ A.» ¡ . de datos engloba una porción de la estructura de datos de la cPLA2, incluyendo sin limitación el sitio activo de la cPLA2 o el dominio CaLB de la cPLA2. Cualquier método disponible se puede utilizar para 5 construir tal modelo a partir de los datos cristalográficos y/o NMR descritos aquí u obtenidos a partir del análisis independiente de la cPLA2 cristalina. Tal modelo se puede construir a partir de los puntos de los datos analíticos disponibles utilizando paquetes de programas de computación 10 (software) conocidos, tales como HKL, MOSFILM, XDS, CCP4, SHARP, PHASES, HEAVY, XPLOR, TNT, NMRCOMPASS, NMRPIPE, DIANA, NMRDRA , FÉLIX, VNMR, MADIGRAS, QUANTA, BUSTER, SOLVE, O, FRODO, RASMOL, y CHAIN. El modelo construido a partir de estos datos se puede visualizar entonces 15 utilizando los sistemas disponibles, incluyendo, por ejemplo, Silicon Graphics, Evans y Sutherland, SUN, Hewlett Packard, Apple Macintosh, DEC, IBM, y Compaq. La presente invención también proporciona un sistema de computadora que comprende el modelo de la invención y el equipo físico 20 (hardware) utilizado para la construcción, procesamiento, y/o visualización del modelo de la invención. Las modalidades adicionales proporcionan un sistema de computadora que comprende un equipo físico de computadora y el modelo de la presente invención. También se proporcionan los métodos para identificar una especie que es un agonista o antagonista de la actividad o enlace de la CPLA2 que comprende: (a) proporcionar el modelo de la presente invención, (b) estudiar la interacción de la especie candidata con tal modelo, y (c) seleccionar una especie que se haya predicho que actúa como tal agonista o antagonista. También se proporcionan las especies identificadas de acuerdo con tales métodos. Otras modalidades proporcionan: (1) un proceso para identificar una substancia que inhibe la actividad o enlace de la cPLA2, que comprende determinar la interacción entre una substancia candidata y un modelo de la estructura de la cPLA2, o (2) un proceso para identificar una substancia que imita la actividad o el enlace de la cPLA2, que comprende determinar la interacción entre una substancia candidata y un modelo de la estructura de la cPLA2. También se proporcionan las substancias identificadas de acuerdo con tales procesos. El estudio de la interacción de la especie candidata con el modelo se puede realizar utilizando las plataformas de programas de computo (software) , que incluyen QUANTA, RASMOL, O, CHAIN, FRODO, INSIGHT, DOCK, MCSS/HOOK, CHARMM, LEAPFROG, CAVEAT (UC Berkley) , CAVEAT(MSI), MODELLER, CATALYST, e ISIS. Otras modalidades proporcionan un método para identificar los inhibidores de la actividad de la cPLA2 mediante un diseño racional del fármaco que comprende: (a) diseñar un inhibidor potencial que formará enlaces no covalentes con uno o más aminoácidos en el sitio activo de la cPLA2 con base en las co-ordenadas de la estructura cristalina de la cPLA2; (b) sintetizar el inhibidor; y (c) determinar sí el inhibidor potencial inhibe la actividad de la cPLA2. Preferiblemente, las co-ordenadas de la estructura cristalina de la cPLA2 utilizadas en tales métodos se obtienen a partir del cristal de la cPLA2 del grupo espacial P2x2?2 con a = 153.59 Angstroms, b = 95.49 Angstroms, y c = 139.13 Angstroms. En otras modalidades preferidas, el inhibidor se diseña para interactuar con uno o más átomos de dichos uno o más aminoácidos en el sitio activo de la cPLA2, se selecciona del grupo que consiste de: CB y O (átomos de Ser228); Los átomos 0*1 y 0*2 de Asp549 y Asp575; Los átomos CB, CG, CD, NE, CZ, NH1 y NH2 de Arg200, Arg413 y Arg579; El oxígeno del carbonilo de la estructura de la t¿á £, .t£ A*,á i .j i i. .i cadena principal de la Trp393; Los átomos N*2 y 0*1 de Asn555; Los átomos CDl, CEI, CG, CZ, CE2, y CD2 de Phe397, Phe681, Phe683 y Phel99; Los átomos CG, CDl, NEl, CE2, CZ2, CH2, CZ3, CE3 y CD2 de Trp232 y Trp393; CB y 0 (átomos de Ser577); Los átomos CB y S (de Cys331) ; Los átomos 0E1 y 0E2 de Glu589; Los átomos CB, CG, CD, CE y NZ de Lys588; 0 (1 átomo de Thr680) ; Los átomos 0E1 y 0E2 de Glu418 y Glu422; Los átomos CB, CG, SD y CE de Met417; Los átomos CB, CG, CDl y CD2 de Leu400 y Leu421; Los átomos CB, CG1, CG2, o CDl de Ile424; El NH de la cadena principal y los átomos de oxígeno del carbonilo de Ala578; y Los átomos CB, CG, ND1, CEI, NE2, y CD2 de His639. Se proporcionan también los agonistas y antagonistas identificados mediante tales métodos. También se proporcionan los métodos para identificar los inhibidores del enlace de la membrana de la cPLA2 mediante el diseño racional del fármaco que comprende: (a) Í ?.íÁ .i. i. i i. ,'*! . J, diseñar un inhibidor potencial que formará enlaces no covalentes con uno o más aminoácidos en la región del fragmento electrostático de la cPLA2 con base en las coordenadas de la estructura cristalina de la cPLA2; (b) sintetizar el inhibidor; y (c) determinar sí el inhibidor potencial inhibe el enlace de la membrana de la cPLA2. Preferiblemente, las co-ordenadas de la estructura cristalina de la cPLA2, utilizadas en tales métodos se obtienen a partir del cristal de la cPLA2 del grupo espacial P2x2?2 con a = 153.59 Angstroms, b = 95.49 Angstroms, y c = 139.13 Angstroms. En otras modalidades preferidas, el inhibidor se diseña para interactuar con uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de Arg467, Arg485, Lys488, Lys544 y Lys543. También se proporcionan los agonistas y antagonistas identificados mediante tales métodos . Breve Descripción de los Dibujos Fig. 1. El mapa experimental generado con las fases MAD obtenidas a partir de la dispersión de un solo átomo de Tb por 749 residuos de cPLA2. Se emplearon el aplanado o refinado con solvente (contenido del solvente 60%) y el promedio de la simetría no cristalográfica de 2 veces en DM para la generación del mapa.

Fig. 2 (A) . El diagrama Ribbon del monómero de la cPLA2. El dominio CaLB se muestra en verde, con los dos átomos de Ca2+ mostrados en rojo. La estructura de la W "porción de cubierta terminal" de la cPLA2 está coloreada de 5 púrpura. Los bucles móviles con una densidad pobre de electrones se muestran como puntos. El enlazador flexible entre CaLB y el dominio catalítico está coloreado de rojo. También se muestran las posiciones de los 4 residuos de serina que están fosforilados en la cPLA . La figura se 10 preparó con Molscript (Kraulis, 1991) y RASTER3D (Bacon & Anderson, 1988) . (B) El diagrama de la superficie GRASP de la cPLA2. Los residuos que presentaron desviaciones N15/NH luego de la interacción con micelas de dodecilfosfocolina en los 15 experimentos de NMR por Xu et al. (1998) están coloreados de púrpura. La hendidura activa de cPLA2 está realzada en rojo. Los residuos de los opérculos o tapas se han eliminado para claridad. (C) La representación potencial de la superficie de 20 la CPL 2, con residuos básicos en matices azules y residuos ácidos en rojo. Los residuos de los opérculos o tapas se han eliminado para claridad. Un fragmento altamente básico es claramente visible en la región de enlace a la membrana de la molécula. La figura está preparada con GRASP (Nicholls, 1992) . Todas las vistas están en la misma orientación. Fig. 3 (A). La representación de Richardson del pliegue canónico o en forma estándar de la a/ß hidrolasa. Las hebras ß están representadas como flechas, mientras que las hélices a son rectángulos. La numeración de los elementos estructurales, secundarios, está de acuerdo a la revisión por Schrag & Cygler (1997). La hélice C, que sigue inmediatamente a la "curva nucleofílica", está coloreada de rosa. (B) El diagrama de Richardson del pliegue de la cPLA2. La numeración del esquema se diseñó de manera que la hélice que sigue inmediatamente a la Ser288 sea la Hélice C, como en el pliegue canónico o de forma estándar de la a/ß hidrolasa. El núcleo central está coloreado de amarillo para una comparación más fácil con el pliegue canónico de la a/ß hidrolasa en (A) . Los elementos que componen la "porción de cubierta terminal" están coloreados de púrpura; las regiones de bucle en rojo son altamente móviles y no presentan una densidad de electrones susceptibles de ser descubiertas. Fig. 4. La alineación de la estructura primaria de la cPLA2 a, ß, y ?. Los residuos idénticos están en cuadros, Li Í.Á ? ?? Í..Í.Í . .,Atí I i mientras que los elementos estructurales secundarios observados en la estructura de cristales de rayos X de la cPLA2 a están indicados debajo de las secuencias. Los elementos estructurales secundarios fuera de la región de la porción de cubierta terminal se muestran en amarillo, mientras que aquellos en la región de la porción de cubierta terminal se muestran en púrpura. Las líneas negras representan áreas de las vueltas o bucles. Los residuos no identificados con líneas negras o los elementos estructurales secundarios no muestran una densidad de electrones, susceptibles de ser halladas. Fig. 5 (A) . El diagrama de superficie que muestra el dominio catalítico de la cPLA cubierta por los residuos del opérculo o tapa. La Ser228 se muestra en la parte inferior de la estructura en forma de embudo. La continuación de la secuencia que no es visible en los mapas experimentales se representa por los puntos rojos y se propone que está involucrada en la formación de una articulación de opérculo. Los residuos para los cuales solamente los átomos de la estructura de la cadena principal son visibles en los mapas de densidad de electrones se representan como alaninas. Las superficies expuestas de todos los residuos hidrofóbicos se han coloreado de azul, y aquélla de la Arg200 se ha coloreado de rojo. La figura se preparó con GRASP (Nicholls, 1992) . (B) El acercamiento del sitio activo de la cPLA2 en un radio de 7 Á alrededor de la Ser228. Los dos residuos implicados directamente en la catálisis están coloreados de verde. La Arg200 y el bucle que alberga los residuos Gly 197 y 198 se muestran en amarillo. Una sola molécula de agua visible en los mapas experimentales muestra enlaces de hidrógeno con Asp549 y átomos de carbonilo del Trp393 y Thr330. La figura se generó con Molscript y RASTER3D. Fig. 6. El mecanismo catalítico propuesto para cPLA2, que implica el ataque de la Ser228 en la posición sn-2 del substrato glicerofosfolipídico. AA: ácido araquidónico; HG: grupo de la cabeza; C18: grupo de octadecilo. Se sugiere que Gly 197 y 198 sean parte del agujero del oxianión, mientras que Arg200 estabiliza la porción o radical del fosfato del grupo de la cabeza.

Descripción Detallada de la Invención y Modalidades Preferidas La estructura de la cPLA2 se resolvió o aclaró empleando un dispersor de un átomo pesado por 749 residuos. k t A? i *. ?..? n üi i LÁ La cPLA2 humana de longitud completa se expresó en células de CHO y se purificó mediante la modificación de la metodología descrita en Clark et al., 1990 (Stahl et al., manuscrito en preparación) . Los cristales se obtuvieron a 18 °C utilizando PEG 1000 como un precipitante y empleando las técnicas de difusión de vapor estándar. Los cristales únicos crecieron en pocos días hasta dimensiones de 0.6 mm X 0.5 mm X 0.1 mm pero fueron altamente susceptibles al daño por rayos x. Las rondas de remojo del cristal en soluciones crioprotectoras con cantidades incrementadas de PEG 400 y DMSO, seguidas por enfriamiento rápido o instantáneo y la exposición a la radiación de sincrotrones, fueron críticas para obtener la difracción a un espaciamiento Bragg mínimo de 2.5 A. Los cristales son del grupo espacial P2?2?2 (a = 153.59 A, b = 95.49 A, c = 139.13 Á) , con dos monómeros (1498 residuos) y 60% de solvente por unidad asimétrica. Los intentos para preparar cristales remojados o impregnados de átomos pesados de la cPLA2 revelaron que solamente el gadolinio o el terbio podrían proporcionar derivados isomorfos. Cualquier lantánido, sin embargo, remplazó un solo átomo de Ca2+ en CaLB, proporcionando así un difusor de un solo átomo pesado por 749 residuos de aminoácidos. La información de la formación de fases Í .l.*¿ ? ?<M internas a partir de estos cristales no fue de una calidad lo suficientemente alta para producir un mapa de densidad de electrones inicial. Esta observación, agregada al hecho que el enlace de la mayoría de los átomos pesados no generó isomorfismo entre los cristales nativos e impregnados, llevó a un esfuerzo para resolver la estructura de la cPLA2 mediante la formación de fases de dispersión anómala de longitudes de onda múltiples (MAD) (Hendrickson, 1991) . Se prepararon los cristales de la cPLA2 impregnados con terbio, criotratados (ver los Métodos) , y se enfriaron en una corriente de nitrógeno a 100°K. Se recolectaron los datos de tres diferentes longitudes de onda alrededor del borde Tb Lm a partir de un solo cristal, el cual debido a la sensibilidad a la radiación, se tradujo a lo largo de su eje de rotación entre las recolecciones de datos. Las fases experimentales a 3.2 A se calcularon con SHARP (de La Fortelle & Bricogne, 1997); subsecuentemente, varios ciclos de aplanamiento o refinamiento con solvente y el promedio dos veces en DM (Cowtan et al., 1996) permitieron extender las fases a 2.5 Á. Este procedimiento generó un mapa de densidad electrónica de alta calidad (Fig. 1) en la cual ambos dominios de cada monómero cPLA2 se pudieron identificar claramente. Inicialmente, la CaLB (Perisic et al., 1998; ?? íJ 1RLW) se hizo girar en la densidad y un resto o traza de polialanina se construyó para las regiones visibles del dominio catalítico usando el programa QUANTA (Molecular • Simulations Inc.), generando un modelo con aproximadamente 5 550 residuos para cada monómero. El refinamiento restringido de fase de esta estructura inicial con una etapa de combinación de fase final (REFMAC; Murshudow et al., 1997) seguido por la construcción manual del modelo (QUANTA) generó un modelo que fue refinado subsecuentemente en XPLOR 10 (Brunger et al., 1992b). El presente modelo contiene 1285 residuos (entre ambos monómeros) y 40 moléculas de agua.

Estructura molecular El monómero de cPLA2 es una estructura elipsoidal de 15 dos dominios con dimensiones de ~ 100 Á X 55 A x 45 A (Fig. 2a). El dominio de CaLB N-terminal (residuos 16-138) es una • intercalación ß doblada distintamente, conectada por los residuos 139-143 al dominio catalítico, con el cual forma muy pocos contactos proteína-proteína. El núcleo central del 20 dominio catalítico está compuesto de una hoja ß central de 10 hebras con hélices intercaladas que se distinguen del pliegue canónico de la a/ß hidrolasa. Los monómeros de cPLA2 presentes en la unidad asimétrica no están perfectamente l? .. í t .L t .i sobrepuestos debido a la flexibilidad del bucle del interdominio . De hecho, cuando los dominios de CaLB están sobrecolocados, hay una diferencia de 4-5° entre los dos dominios catalíticos. El bucle que interconecta los dominios tiene una conformación distinta en cada monómero y sus residuos despliegan factores de alta temperatura. La cPLA2 es una proteína citosólica que se translocaliza o transposiciona a la membrana cuando se elevan los niveles libres de Ca2+ a los niveles submicromolares (Clark et al., 1990, 1991). El arreglo del dominio de la cPLA sugiere cómo el sitio activo está orientado con respecto a la membrana celular. La Fig. 2b es un diagrama de superficie que resalta los resultados de los estudios HSQC realizados sobre CaLB por Xu y colaboradores (1998). Los residuos que mostraron desviaciones N15/NH luego de la incubación con micelas de dodecilfosfocolina en estos experimentos están resaltados en púrpura. Es claro que los residuos resaltados aparecen sobre la misma superficie de la molécula que el sitio activo. Consecuentemente, si el CaLB emplea estos residuos para asociarse con una membrana de fosfolípido, el dominio catalítico está colocado de manera general para enlazar un substrato de fosfolípido en el sitio activo. La flexibilidad del enlazador entre los dominios así »* ? ? i li t I it ... & .« 8.a .g.Í^ j como la carencia de las interacciones principales proteína-proteína entre ellos sugiere que una rotación pequeña entre los dominios se puede realizar para interacciones óptimas con la membrana. Como se muestra en el diagrama potencial de superficie en la Fig. 2c, existe una región altamente básica que se extiende desde el sitio activo a través de una tira o banda de residuos cargados positivamente en la hebra ß3 de CaLB. Esta característica básica se esperaría de una región en la proteína que hace múltiples contactos electrostáticos con los grupos de la cabeza del fosfolípido, cargados negativamente, de la capa de la membrana (ver abajo) . Los residuos 434 a 456, no obstante, están desordenados, haciendo imposible definir con exactitud el tamaño verdadero del fragmento básico. Sin embargo, es de notar que los fragmentos básicos similares se observan en la PI4 cinasa y en diferentes especies de sPLA2s (Rao et al., 1998). Es tentador sospechar que el enlace de alta afinidad de la cPLA2 a las membranas hechas de liposomas de metanol de fosfatidilo (Hixon & Gelb, 1998) está mediado a través de este fragmento y la extensión básica cercana de la hebra 3 ß en el dominio CaLB. ? *f: .

El dominio CaLB N-terminal La estructura del dominio CaLB en la CPLA2 de longitud completa es muy similar a aquella resuelta o aclarada mediante NMR y cristalografía por rayos X (Xu et al., 1998; Perisic et al., 1998), con pequeñas diferencias.

De manera breve, consiste de ocho hebras ß antiparalelas, interconectadas por seis bucles, que se pliegan en un intercalamiento ß que se ajusta a la topología "tipo II" para los dominios C2 (Nalefski et al., 1994b). Dos átomos de Ca2+ están unidos en un extremo del CaLB a través de una constelación de cadenas laterales de Asp y Asn, así como átomos de carbonilo de la estructura de la cadena principal, en tres distintos bucles (bucles de unión del calcio, CBLs) ; el mismo arreglo atómico se ha observado en el dominio CaLB resuelto por Perisic y colaboradores (1998). Los átomos de Ca2+ están aproximadamente 4 A separados. El ambiente de los átomos de Ca2+ en la cPLA2 de longitud completa, sin embargo, no muestra ninguna de las moléculas de agua presentes en la estructura de CaLB resuelta por estos autores; en lugar de esto, coordinada al sitio 1 del calcio (definido en Perisic et al., 1998) está una molécula de MES (ácido 2- [N-morfolino] etanosulfónico) a partir del amortiguador empleado en la cristalización y la crioprotección. En ambos XtútLít monómeros de cPLA2, la distancia entre el Ca2+ 1 y el átomo de oxígeno de sulfonato de MES más cercano es de aproximadamente 2.2 A. Además, el grupo morfolino también está en contacto con las cadenas laterales de His 62 y Tyr96, formando así un nicho hidrofóbico pequeño. A pesar de un artefacto de cristalización, la coordinación del Ca2+ 1 de la cPLA2 al sulfato de MES podría emular o imitar el modo de enlace del grupo fosfato de una molécula de fosfolípido, sugiriendo así que, en la CPLA2, el Ca2+ actúa como un puente entre la proteína y la membrana fosforilada en lugar de solamente como un activador alostérico.

La nueva topología del pliegue de la cPLA2 la distingue de las a/ß hidrolasas. El dominio catalítico de la cPLA2 está compuesto de 14 hebras ß y 13 hélices a; su núcleo central consiste de una lámina ß mezclada, central de 10 hebras, rodeada por 9 hélices a con las hebras ß5 hasta ßll formando la porción más obvia de la lámina (referirse al diagrama de Richardson en la Fig. 3b). La lámina ß tiene un giro superhelicoidal. Para simplicidad, los elementos secundarios de la cPLA2 se han identificado con base en la nomenclatura del pliegue de a/ß hidrolasa presentado por Schrag & Cylger (1997), en la cual la serina catalítica está siempre precedida por ß5 y seguida por la Hélice C. La primera hebra ß en el núcleo de la cPLA2 es ßl, que sigue la conexión flexible después de la CaLB. Un bucle largo que contiene una hélice larga hace la conexión a ß4, en la parte central del pliegue. Esta construcción de ßl/hélice a es análoga a aquélla observada en la lipasa de Humicola lanuginosa , en donde la región helicoidal no está considerada también como parte del pliegue pero conecta su ßlO a la primera hebra ß en el núcleo (entrada 1TIB en la PDB) . La siguiente hebra ß paralela, ß5, precede la serina catalítica (228) . Las topologías de ß5, la Hélice C (coloreada de rosa en las Figs. 3a y 3b), y del bucle que las conecta son similares en las a/ß hidrolasas. Este bucle de interconexión se llama la "curva nucleofílica". Tres hélices a mas, interenlazadas por núcleos, proporcionan la conexión entre esta región y las 4 hebras ß adicionales de esta parte del pliegue. De las cuatro hebras ß que siguen (ß6-ß9) , ß6 es la más larga, haciendo pocos enlaces de hidrógeno con ß7. Las hebras ß7 a ßl, por lo tanto, aunque no son contiguas en secuencia, se pueden considerar una lámina ß pequeña dentro de una estructura grande. Después de ß9 hay una mayor divergencia de la formación del núcleo central a/ß. La secuencia de la cPLA2 en este punto forma la región mostrada en púrpura en las Figs. 2a y 3b. Este fragmento de 180 residuos forma una "porción de cubierta terminal" del dominio catalítico. La Asp549, el socio catalítico de Ser228, yace en la región entre el extremo de la porción de cubierta terminal y ßlO, que es parte del núcleo central. Siguiendo la estructura de la porción de cubierta terminal, las últimas tres hebras ß están colocadas para completar la lámina ß central y están intercaladas por las hélices G a J. El pliegue de a/ß hidrolasa es común en muchas esterasas y otras enzimas hidrolíticas (Schrag & Cygler, 1997). Su diagrama de Richardson (Fig. 3a) consiste de una lámina ß central cuyo orden de hebras ß sigue la secuencia linealmente (con la excepción de ß3, que a menudo se coloca entre ß4 y ß5) . A primera vista, la topología de la cPLA2 parece ser una permutación circular del pliegue a/ß hidrolasa. Sin embargo, una comparación cuidadosa de las Figs. 3a y 3b revela claramente que solamente la región que engloba la curva nucleofílica es de hecho directamente comparable (ß5 a Hélice C; residuos 222-238). Las distinciones principales incluyen la naturaleza antiparalela de las hebras ß6 a ß9, la multiplicidad de hélices entre ß5 y ß6, y la ausencia de hélices que intervienen entre las hebras de la última parte del núcleo cpla2 a/ß. Aunque la estructura de la porción de cubierta terminal en la cPLA (residuos 370-548) es parte del dominio catalítico, no está incluida en el núcleo a/ß. Las comparaciones de secuencia de los dominios catalíticos de las cPLA2s a, ß y ? humanas (Fig. 4) muestran que la homología está concentrada dentro del núcleo a/ß (elementos en amarillo) y las hebras ß 9a y 9d. Así, la parte central de la porción de cubierta terminal es distinta entre las isoformas de cPLA2. Una comparación entre el diagrama de Ribbon de la cPLA2 en la Fig. 2a, en la cual la región de porción de cubierta terminal está mostrada en púrpura, y el diagrama potencial de superficie en la Fig. 2c, revela que la región altamente básica hipotetizada arriba como haciendo contactos electrostáticos con los fosfolípidos de la membrana, está formada de hecho en gran parte por residuos de la porción de cubierta terminal.

I S í i :i i i-.l i.jLt .i, Lj La región de porción de cubierta terminal de la cPLA2 también contiene dos de las tres regiones más móviles de la estructura completa, los residuos 433-456 y 500-536 (la tercera región es el C-terminal, los residuos 728-749). Estas extensiones de aminoácidos no tienen una densidad de electrones que se puedan rastrear y no están incluidos en el modelo (líneas punteadas en la Fig. 2a) . Interesantemente, son estas regiones altamente flexibles de la porción de cubierta terminal las cuales albergan tres de los cuatro residuos de serina que se vuelven fosforilados luego de la estimulación agonista (437, 454, 505). El papel de la Ser437 y Ser 454 no es claro, puesto que no están conservadas entre las diferentes especies. En contraste, la Ser505 está conservada en la cPLA2 a partir de distintas especies evolucionariamente (pollos, humanos, pez cebra, murinos, ratas) , y su fosforilación mediante la MAP cinasa se requiere para una máxima activación de la cPLA2 en las células de insectos (Lin, et al., 1993; Qiu et al., 1998). La Ser505, la cual en nuestros cristales es probable que esté fosforilada heterogéneamente y esté localizada en un bucle expuesto al solvente, altamente flexible, no hace contacto ya sea con el cuerpo de la proteína u otros monómeros de la cPLA2 en los alrededores en el retículo. La . i i. ?. . Í Lá Ser505 está distante a ambos, el sitio activo y la región de enlace de la membrana (ver Fig. 2a); sin embargo, su proximidad a la articulación entre CaLB y el dominio catalítico es notoria (ver discusión) . El cuarto sitio de la fosforilación de la cPLA2, la Ser727, está en el C-terminal de la estructura. Aunque este sitio se conserva entre las especies, su relevancia funcional aún no es conocida.

La estructura de embudo del sitio activo está cubierta parcialmente por un opérculo o tapa accesible al solvente La característica más remarcable de la estructura de la cPLA2 es la configuración en embudo del sitio activo, que penetra un tercio de la distancia hacia el dominio catalítico para revelar o descubrir la Ser228 y Asp549 colocadas en la parte inferior de una hendidura estrecha, profunda. Aunque ancho en la parte superior, el embudo se estrecha hacia abajo a un diámetro aproximado de 7 A en la boca de la hendidura del sitio activo visible en la Fig. 5a. El embudo está revestido con residuos hidrofóbicos (azul en la Fig. 5a) y forma un marco dentro del cual las porciones o radicales de acilo, grasas, de los substratos del fosfolípido de la membrana, se pueden enlazar. ¡ t J .

El sitio activo de la cPLA2 está cubierto parcialmente por un "opérculo" o "tapa" compuesto de los residuos 413-457. El opérculo se pliega hacia una región de bucle, seguido por un estiramiento helicoidal pequeño y una vuelta o giro corto (ver la Figura 5a) . Los residuos 408-412, que llevan hacia la región del opérculo, muestran factores de temperatura muy grandes, y los residuos 434-456 no poseen una densidad de electrones que se pueda rastrear. Estas observaciones sugieren que estas regiones son altamente móviles y se podrían considerar como una "articulación del opérculo". La región visible del opérculo tiene un carácter anfipático; su superficie expuesta al solvente está formada principalmente por los residuos polares (T416, E418, E419, E420, N423), mientras que el lado interno está revestido con los aminoácidos hidrofóbicos (M417, L421, 1424) . Es concebible que el carácter de "doble lado" del opérculo entre en acción luego del enlace del fosfolípido de la membrana, puesto que una superficie tiene la capacidad de formar los contactos del enlace del hidrógeno mientras que la otra es más apta para las interacciones hidrofóbicas, ya sea con el substrato o la membrana . Los intentos para modelar una molécula de diacilfosfolípido en la hendidura activa de la CPLA2 con el opérculo en el lugar, demostraron que el enlace del éster de acilo no se puede colocar en la vecindad de la serina del sitio activo sin la generación de conflictos con los residuos alrededor. Consecuentemente, es concebible que la generación del espacio apropiado para el enlace del substrato requiere el movimiento del opérculo, una propuesta de acuerdo con la observación que la cPLA2 muestra una actividad mayor en la presencia de micélulas en lugar de substratos monoméricos (Cygler & Schrag, 1997), un fenómeno conocido como activación interfacial. La mayoría de las lipasas muestran una activación interfacial como un resultado del rearreglo conformacional de un opérculo o tapa que cubre el sitio activo en la forma "cerrada" de la enzima. El opérculo se mueve lejos luego del enlace de las micelas, generando así la forma "abierta", en la cual los residuos catalíticos se exponen al substrato. La cristalografía por rayos X ha generado múltiples ejemplos de este mecanismo de activación a través de la determinación de las estructuras de las lipasas tanto en las formas "cerrada" y "abierta", la última para la mayor parte cristalizada en la presencia de inhibidores (Cygler & Schrag et al., 1997). Es probable que el mecanismo de activación interfacial de la cPLA2 sea comparable a aquélla de otras lipasas que contienen el opérculo, en que el movimiento del opérculo es una etapa clave en el incremento del área superficial accesible del embudo de sitio activo así como para proporcionar acceso sin obstrucción a los residuos catalíticos.

El sitio activo de la cPLA2 contiene una diada catalítica La hidrólisis del acilo mediante las a/ß hidrolasas se realiza por una tríada catalítica (Ser-Asp/Glu-His) reminiscente de aquélla presente en las serina proteasas. El enlace del éster de acilo del substrato es atacado por la serina nucleofílica, generando un intermediario de acilo- enzima enlazado covalentemente que se libera subsecuentemente siguiendo una etapa que involucra el ataque de una molécula de agua. Aunque todas las enzimas que metabolizan lípidos con el pliegue de la a/ß hidrolasa proceden vía el uso de una tríada catalítica, la identificación de todos los miembros de tal tríada en la cPLA2 probó ser una tarea difícil. La mutagénesis dirigida al sitio por Sharp y colaboradores (1994) confirmó el papel de la Ser228 y la Asp549 en la catálisis; la falla de cualquiera de los 19 residuos de histidina afectan la actividad, sin embargo, apunta a un mecanismo catalítico novedoso (Pickard et al., 1996). Estas observaciones pueden llevar a muchos a proponer que la cPLA2 contiene un nuevo centro catalítico que no requiere la participación de la • histidina, mientras que la relevancia de la Arg200 para la 5 actividad permanece aún desconocida (Leslie, 1997; Pickard et al. , 1996) . La estructura de los cristales por rayos X de la cPLA2 revela claramente un sitio activo en la cual la Ser228 se encuentra en la parte inferior de una cavidad en forma de 10 embudo; el Od2 de la Asp549 yace a una distancia de 2.9 Á desde su átomo O? (Fig. 5b) . Es claro, sin embargo, que el sitio activo de la cPLA2 carece de un residuo de histidina. Además, no hay otros residuos en un rango de 6 A que pudieran llenar la función de la base del sitio activo. 15 Todas las contribuciones polares en un rango de 3.5 A lejos de cualquier residuo se hacen mediante los grupos de la cadena principal o mediante una molécula de agua sola colocada 3.2 A lejos del átomo Odl de Asp549. Aunque la Asn555 reviste el embudo del sitio activo, su átomo Nd2 está 20 aproximadamente 6 A lejos de cualquier residuo y no sería el candidato ideal para cumplir esta función. En las acil hidrolasas, luego del ataque en la posición sn-2 de un substrato glicerofosfolipídico, el estado de transición requiere la estabilización mediante un "agujero de oxianión", o un conjunto de donadores de enlace de hidrógeno (usualmente átomos de amida) y/o residuos básicos con la función de estabilizar la carga negativa en desarrollo del estado de transición. En varias lipasas, al menos uno de los residuos que contribuyen al agujero del oxianión es parte de un bucle en movimiento, y la conformación adecuada se logra solamente cuando la lipasa esta en forma "abierta"; este rearreglo, sin embargo, no es un requerimiento absoluto. En la cPLA2, la Glyl97 y 198 son parte de un bucle flexible rico en glicina entre ß4 y la Hélice B; este posicionamiento permite que las cadenas principales de amida de Glyl97 y 198 sean buenos candidatos para los miembros de un agujero de oxianión pre-formado (ver Fig. 5b) . Además, el grupo de amida de la cadena principal de la Gly229, que está en el vértice de la curva o vuelta entre ß5 y la Hélice C, también apunta en la dirección del bucle de Glyl97 y por lo tanto puede ser parte del agujero. Consecuentemente, esta región bastante como el agujero de oxianión en la quimiotripsina, parece estar bien diseñada para estabilizar el intermediario tetraédrico generado por el ataque nucleofílico del éster.

A..í.l± ?i i?. .J ?f* Una multiplicidad de papeles se han sugerido para la Arg200. Se ha implicado en la provisión de la asistencia para la CaLB en el enlace de la enzima a la interfaz del lípido; interactuando con la membrana fosfolípida; participando como un residuo catalítico; estabilizando un intermediario de acilo-enzima : o asociándose con el grupo fosforilo del fosfolípido del substrato (Pickard et al., 1996) . El posicionamiento de la Arg200 incrustada dentro del embudo (su área superficial está coloreada en rojo en la Fig. 5a) la elimina de proporcionar cualquier asistencia de enlace al lípido para la CaLB. Además, su cadena lateral está aproximadamente 9 Á lejos de la serina del sitio activo, lo cual evita que juegue un papel en la catálisis. La Arg200, sin embargo, hace varios contactos clave con los residuos alrededor del embudo del sitio activo. La cadena lateral hace un puente de sal con Thr680 y entra en contacto con los átomos de la cadena principal de Phe678, ambos de los cuales yacen en el bucle entre las hélices H e I. La localización de la Arg200 sobre el bucle del agujero de oxianión sugiere que la carencia de estos enlaces de dos hidrógenos en el mutante Lys de Arg200 reportados por Pickard y colaboradores (1996) podrían ser responsables de alteraciones muy finas en la conformación del bucle del agujero de oxianión con consecuencias dramáticas sobre la actividad.

La catálisis mediante la cPLA2 procede via un mecanismo distinto de aquél de otras acil hidrolasas. La ausencia de un residuo de histidina o cualquier otra base potencial en el sitio activo de la cPLA sugiere que la enzima promueve la acil hidrólisis vía un nuevo mecanismo catalítico. En las serinas proteasas y otras hidrolasas, un residuo de histidina acepta un protón desde el grupo de hidroxilo de la serina reactiva, facilitando así la formación del intermediario tetraédrico covalente. En una segunda etapa, el intermediario de acil-enzima se hidroliza mediante una molécula de agua para liberar el producto, restaurando el ser-hidroxilo a la enzima. La ß lactamasa TEM- 1, clase A, cuya vía catalítica también involucra la acilación de una serina de sitio activo seguida por la hidrólisis del enlace éster, transfiere un protón desde la Ser70 del sitio activo al grupo carboxilato de la Glul66, ya sea directamente (Gibson et al., 1990) o vía una molécula de agua (Lamotte-Brasseur et al., 1991). Estudios más recientes (Damblon et al., 1996) han sugerido que la distancia larga entre los oxígenos del carboxilato de la Glul66 y Ser70 evita la transferencia directa del protón, pero propone la participación de una molécula de agua que forma un puente para el relevo del protón. En el mecanismo catalítico de la penicilina acilasa (Duggleby et al., 1995), que contiene un solo centro catalítico de residuo, compuesto de la serina N-terminal, un puente de agua media el carácter básico del grupo a-amino de la Serl. Como una consecuencia, el átomo O? de la Serl tiene su nucleofilicidad suficientemente mejorada por el grupo amino-terminal, y sobreviene la formación del intermediario de acilo-enzima. En la cPLA2, el único residuo capaz de jugar el papel de base general es la Asp549 puesto que no hay otras cadenas laterales en un radio de 3.5 Á del átomo O? de Ser228. La Fig. 6 muestra un modelo propuesto para el mecanismo catalítico de la cPLA2. Una vez que la enzima se enlaza a la membrana, una sola molécula de fosfolípido se enlaza en el sitio activo. La porción de fosfato del grupo de la cabeza (HG en la Fig. 6) se estabiliza por la cadena lateral de Arg200. Un agujero de oxianión formado por los grupos amida de la cadena principal de Glyl97 y Glyl98 también se muestra polarizando el éster sn-2 y estabilizando el intermediario tetraédrico formado en el panel B. Siguiendo la formación del complejo de enzima-substrato, la Asp549 actúa como la base catalítica y substrae o retira un protón del grupo hidroxilo del reactivo Ser228, que ataca el éster sn-2 y forma la acilo enzima vía el intermediario tetraédrico estabilizado. La acilo-enzima se hidroliza subsecuentemente por una molécula de agua (panel C) para producir un lisofosfolípido libre y, después se colapsa del doble enlace del intermediario de araquidonilo, el ácido araquidónico libre (AA en la Fig. 6; paneles D y E) . La cPLA2 luego se disocia de la interfaz de la membrana o se enlaza a otro substrato de fosfolípido y repite el ciclo. Así, la cPLA2 es un tercer ejemplo distinto de una acilasa que utiliza una serina nucleofílica sin una tríada catalítica completa.

Discusión A pesar de la unidad asimétrica grande (1498 aminoácidos) y la fragilidad de los cristales de la cPLA2, la formación de fase MAD fue exitosa en la producción de un mapa de densidad de electrones de alta calidad a partir de los datos obtenidos de un solo cristal. Parte central de este éxito fueron las diferencias Bijvoet y dispersivas grandes, típicas del borde Lm de un átomo de lántanido, acoplado al flujo alto y estabilidad de longitud de onda de la Fuente de Luz Avanzada (Berkeley, CA) . Con el íiá li?lJ,i .A .I.iilj advenimiento de los sincrotrones de tercera generación, el MAD deberá ser empleado rutinariamente para la solución de estructuras macromoleculares grandes. La cPLA2 es esencial para la biosíntesis de lípidos mediadores de la inflamación, como se demostró por el uso de los ratones deficientes en cPLA2 (Bonventre et al., 1997; Uozumi et al., 1997). Puesto que los leucotrienos, las prostaglandinas y las PAF juegan papeles significativos en la patofisiología de los padecimientos de mayor impacto público, es imperativo entender cómo se regula su biosíntesis. La estructura de la cPLA proporciona nuevas visiones hacia el origen de la selectividad del araquidonilo y la regulación mediante la fosforilación. Además, identifica tanto un nuevo pliegue como un nuevo mecanismo para las lipasas. La estructura de la cPLA2 es solamente la segunda en la cual un dominio C2 se observa en el contexto de la proteína completa. Se observan diferencias significativas entre PLCdl y la cPLA . El pliegue de la cPLA2 muestra claramente que la enzima consiste de dos dominios plegados independientemente, distintos. Este resultado no fue inesperado con base al trabajo anterior en el cual los dominios de la CaLB y los dominios catalíticos fueron completamente funcionales cuando se expresaron independientemente. Sin embargo, lo que fue sorprendente fue la escasez de los contactos y la flexibilidad potencial entre los dominios. Aunque los dominios C2 se observan comúnmente en las moléculas de señalización, hasta la fecha sólo la estructura cristalina del PLCdl ha reportado un dominio C2 presente en el contexto del dominio catalítico (Essen et al., 1996). En este caso, los contactos hidrofóbicos extensivos existen entre casi la totalidad de la superficie de una cara o superficie del dominio C2 y el dominio catalítico. En contraste, las interacciones entre los dominios catalíticos y de CaLB de la cPLA2 son suficientemente limitados que las conformaciones del polipéptido que enlaza a los dos en los monómeros diferentes de la unidad asimétrica son distintas. Esta observación es de importancia mecanística en que la orientación óptima de los dominios de la CaLB y catalíticos no están fijos, sino por el contrario, se pueden regular de alguna forma. Es interesante notar que aunque la región de la proteína que incluye Ser-505, la cual es esencial para la actividad óptima en las células, está desordenada, este sitio MAP-cinasa importante está localizado cerca de la región de articulación. La comparación detallada de la estructura de la cPLA2 y el pliegue clásico de la a/ß hidrolasa argumenta claramente que la cPLA2 contiene una nueva topología. Sin embargo, como se notó anteriormente, la ß hairpina que contiene la serina del sitio activo es estructuralmente análoga a la "curva nucleofílica" del pliegue de la a/ß hidrolasa. Una búsqueda Blast del dominio catalítico de la cPLA2 muestra una región extendida de homología entre PLBs y cPLA2 a, ß y ?, que incluye los residuos aproximadamente 190-232. Esta homología es de importancia funcional en que contiene Arg200, las regiones de la estructura o cadena principal que comprende el agujero del oxianión así como la porción novedosa de lipasa GXSXS en la cual la segunda serina reemplaza la glicina clásica. La "concentración" de homología en la región corta también se explica por la estructura genómica, en donde estos residuos se codifican por un solo exón (que corresponde a los residuos 186-238). En lugar de contener una tríada catalítica de Ser, His, Asp/Glu como se observa para las a/ß hidrolasas, la cPLA2 escinde o desdobla el éster sn-2 utilizando una diada compuesta de Ser-228 y Asp-549. El carboxilato de Asp-549 es el único residuo en la proximidad suficientemente cercano para activar la serina para el ataque nucleofílico. Una diada catalítica similar se ha propuesto para la reacción de la hidrólisis de la amida catalizada por las ß-lactamasas de Clase A (Matagne et al., 1998). En este caso, sin embargo, la cadena lateral del glutamato activa el residuo de serina vía una molécula de agua que interviene. Aunque es difícil valorar la eficiencia comparable de una diada contra una tríada, es notable que sea la energía de activación requerida para alcanzar el estado de transición la que sea importante en la catálisis. Por lo tanto, la estabilización debida a un agujero de oxianión puede desviar una serina menos nucleofílica. En esta estructura cristalina, el grupo amida de la estructura o cadena principal de las glicinas 197 y 198, colocaron sólo dos residuos de la Arg-200 crítica, se posicionan apropiadamente para actuar como el agujero del oxianión. El NH de la estructura o cadena principal del Gly-229 podría posiblemente también ayudar en estabilizar el desarrollo del oxianión en el estado de transición y estar presente en los intermediarios tetraédricos . La efectividad del agujero del oxianión es consistente con los estudios NMR en donde la araquidoniltrifluorometilcetona parece enlazarse a la enzima como el hemicetal ionizado. La serina catalítica de la cPLA2 está presente en una --¿Ü * X ? estructura de embudo profundo cerca del centro del dominio catalítico. Los intentos para modelar el fosfolípido dentro del sitio activo demostraron que la conformación actual de la estructura de embudo del sitio activo no era lo suficientemente grande. Por lo tanto, se propone que el opérculo o tapa algo móvil, cuyo C-terminal está enlazado a una extensión completamente desordenada de 23 aminoácidos, se pueda mover luego del enlace a la membrana, proporcionando así un volumen accesible más grande .cerca de la parte superior del embudo para acomodar el substrato. Las estructuras de cristales de la lipasa/colipasa pancreáticas tanto en la presencia como en la ausencia de las micelas del substrato/detergente proporcionan precedente para este modelo (van Tilbeurgh et al., 1993). En este caso, ocurre un cambio conformacional dramático en la presencia de micelas o inhibidores que ocasionan un movimiento del opérculo de tanto como 29 A para exponer la hendidura activa y una extensión hidrofóbica. Tales modificaciones estructurales grandes se han notado para otras proteínas de a/ß hidrolasa. Este cambio conformacional luego del enlace de la superficie de la membrana se ha utilizado para explicar el proceso de activación interfacial, en el cual la actividad catalítica de una lipasa es del orden de magnitud más grande hacia un , i¿ ^ . .* .- AüS,.».,.,, __ __,__„ « i ^ t . . . - Hit., i , l í substrato presentado en una micela que como un monómero. En el caso de la cPLA2, su lisofosfolipasa se ha utilizado para comparar su actividad hacia el mismo substrato presentado ya sea como un monómero o como una parte de una micela. Tales mediciones han revelado que la actividad de la cPLA2 se incrementa aproximadamente 1500 veces que la concentración de la l-palmitoil-2-lisofosfatidilcolina que se incrementa por solamente 10 veces; así, la cPLA2 es mucho más activa hacia los substratos presentados como una superficie. Nuestra estructura sugiere que un cambio conformacional, dictado por el movimiento del opérculo o tapa flexible, ocurre luego del enlace de la membrana; esta observación es consistente con la activación interfacial, observada previamente. Además del movimiento de los opérculos o tapas que cubre los sitios activos, varias estructuras han mostrado que el agujero de oxianión que estabiliza el estado de transición está solamente formado completamente en la presencia del substrato o inhibidor enlazado (Cygler & Schrag, 1997). La cutinasa es una excepción a esta regla general en que el agujero del oxianión está completamente formado en la estructura nativa. De manera importante, la cutinasa no muestra activación interfacial (Martínez et al., 1992) . La selectividad de la cPLA para los fosfolípidos que contienen el araquidonilo es una característica que la distingue. Las SPLA2S de bajo peso molecular no se distinguen entre diferentes ácidos grasos, mientras que la cPLA2 muestra alta selectividad para el araquidonilo y otros ácidos grasos con enlaces dobles cis en las posiciones 5 y 8 en numerosos formatos de ensayo (Clark et al., 1995; Gelb aasn-1 y sn-2, Gelb hydrazin) . Antes de la determinación de la estructura, el origen de la selectividad de la cPLA2 era desconocido. Fue concebible que la maquinaría catalítica estuviera localizada cerca de la superficie de la enzima donde podría actuar sobre el éster sn-2 sin extraer el lípido de la bicapa. Esto sería análogo al dominio de la cinasa refinada o de forma plana de la PI4 cinasa en donde se piensa que la enzima trabaja sobre el grupo de la cabeza de lípidos sin extraer el fosfolípido mismo (Rao et al., 1998). En el caso de la cPLA , se anticiparía la selectividad debido a una mayor exposición del éster sn-2 debido al empaque más suelto del ácido graso poliinsaturado. Sin embargo, como se ve en la estructura, el fosfolípido debe enlazarse a aproximadamente 8-10 Á dentro del sitio activo profundo. Así, la selectividad debe ser debida a las interacciones entre el radical araquidonilo y la enzima. Será informativo mutar los residuos que son distintos entre a y ? cPLA2s, a saber, en el sitio activo y la región del opérculo no conservada completamente, para determinar las diferencias en la selectividad.

Métodos preferidos de Administración y Dosificación de las Substancias Identificadas de Acuerdo con la Invención Como se usa aquí, la "actividad de la enzima fosfolipasa" significa la actividad positiva en un ensayo para el metabolismo de los fosfolípidos (preferiblemente uno de los ensayos descritos en el Ejemplo 2 a continuación o descritos en cualquiera de las referencias incorporadas aquí) . Un compuesto tiene la "actividad de inhibición de la enzima fosfolipasa" cuando inhibe la actividad de una fosfolipasa (preferiblemente CPLA2) en cualquier ensayo disponible (preferiblemente un ensayo descrito a continuación en el Ejemplo 70) para la actividad de la enzima. En las modalidades preferidas, un compuesto tiene (1) un valor IC50 de menos de aproximadamente 25 µM en el ensayo LysoPC; (2) un valor IC50 de menos de aproximadamente 50 µM en el ensayo de vesícula; y/o (3) un valor IC5o de menos de aproximadamente 1 µM en el ensayo PMN. Los compuestos de la presente invención y el ácido ursólico son útiles para inhibir la actividad de la enzima fosfolipasa (preferiblemente la cPLA2) y, por lo tanto, son útiles en el "tratamiento" (es decir, el tratamiento, prevención o mejoramiento) de las condiciones inflamatorias o relacionadas con la inflamación (por ejemplo, artritis reumatoide, psoriasis, asma, padecimiento inflamatorio del intestino, y otros padecimientos mediados por las prostaglandinas, leucotrienos o PAF) y otras condiciones, tales como la osteoporosis, colitis, leucemia mielógena, diabetes, el agotamiento y la aterosclerosis. La presente invención engloba tanto composiciones farmacéuticas como métodos terapéuticos de tratamiento o uso los cuales emplean los compuestos de la presente invención. Los compuestos de la presente invención se pueden utilizar en una composición farmacéutica cuando se combinan con un portador aceptable farmacéuticamente. Tal composición puede contener también (además del compuesto o compuestos de la presente invención y un portador) diluyentes, rellenadores, sales, amortiguadores, estabilizadores, solubilizadores, y otros materiales bien conocidos en la técnica. El término "aceptable farmacéuticamente" significa un material no tóxico que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica del (los) ingrediente (s) activo (s). Las características del portador dependerán de la ruta de administración. La composición farmacéutica de la invención también puede contener citocinas, linfocinas, u otros factores hematopoyéticos tales como M-CSF, GM-CSF, IL-1, IL- 2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, G-CSF, Meg-CSF, el factor de las células madre, y la eritropoyetina. La composición farmacéutica puede además contener otros agentes anti-inflamatorios. Tales factores y/o agentes adicionales se pueden incluir en la composición farmacéutica para producir un efecto sinergístico con compuestos de la presente invención, o minimizar los efectos colaterales causados por el compuesto de la presente invención. De manera inversa, los compuestos de la presente invención se pueden incluir en formulaciones de la citocina, linfocina, otros factores hematopoyéticos, el factor trombolítico o anti-trombótico, o el agente antiinflamatorio particular para minimizar los efectos colaterales de la citosina, linfocina, u otro factor hematopoyético, el factor trombolítico o anti-trombótico, o el agente anti-inflamatorio. La composición farmacéutica de la invención puede estar en la forma de un liposoma en el cual los compuestos de la presente invención están combinados, además de otros portadores aceptables farmacéuticamente, con agentes • antipáticos tales como lípidos que existen en forma agregada 5 como micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, o capas laminares en solución acuosa. Los lípidos adecuados para la formulación liposómica incluyen, sin limitación, monoglicéridos, diglicéridos, sulfatidas, lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares, y similares. La 10 preparación de tales formulaciones liposómicas está dentro del nivel de habilidades en la técnica, como se describió por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 4,235,871; Patente Norteamericana No. 4,501,728; Patente Norteamericana No. 4,837,028; y Patente Norteamericana No. 4,737,323; todas 15 las cuales se incorporan aquí como referencia. Como se usa aquí, el término "cantidad efectiva • terapéuticamente" significa la cantidad total de cada componente activo de la composición farmacéutica o método que es suficiente para mostrar un beneficio significativo al 20 paciente, es decir, tratamiento, curación, prevención o mejoramiento de una respuesta o condición inflamatoria, o un incremento en la velocidad de tratamiento, curación, prevención o mejoramiento de tales condiciones. Cuando se tú á á aplica a un ingrediente activo individual, administrado solo, el término se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación, el término se refiere a las cantidades combinadas de los ingredientes activos que dan como resultado el efecto terapéutico, ya sea que se administren en combinación, en serie o simultáneamente. En la práctica del método de tratamiento o uso de la presente invención, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención se administra a un mamífero que tiene una condición que se va a tratar. Los compuestos de la presente invención se pueden administrar de acuerdo con el método de la invención ya sea solos o en combinación con otras terapias tales como los tratamientos que emplean otros agentes anti-inflamatorios, citocinas, linfocinas u otros factores hematopoyéticos. Cuando se coadministran con uno o más agentes anti-inflamatorios, citocinas, linfocinas u otros factores hematopoyéticos, los compuestos de la presente invención se pueden administrar ya sea simultáneamente con el (los) otro(s) agente (s) anti-inflamatorio (s) , citocina (s), linfocina (s) , u otro(s) factor (es) hematopoyético (s) , factores trombolíticos o antitrombóticos o secuencialmente. Si se administran secuencialmente; el médico que atiende decidirá sobre la ,1 i t ,4 i.. tí? ? . secuencia apropiada de administración de los compuestos de la presente invención en combinación con otro(s) agente (s) anti-inflamatorio (s) , citocina (s), linfocina (s) , otro(s) factor (es) hematopoyético (s) , factores trombolíticos o anti-trombóticos. La administración de los compuestos de la presente invención utilizados en la composición farmacéutica o para practicar el método de la presente invención se puede realizar en una variedad de formas convencionales, tales como la ingestión oral, inhalación, o inyección cutánea, subcutánea, o intravenosa. Cuando una cantidad efectiva terapéutica de los compuestos de la presente invención se administra oralmente, los compuestos de la presente invención estarán en la forma de una tableta, cápsula, polvo, solución o elixir. Cuando se administra en forma de tabletas, la composición farmacéutica de la invención puede contener adicionalmente un sólido tal como una gelatina o un adyuvante. La tableta, cápsula, y polvo contiene desde aproximadamente 5 a 95% del compuesto de la presente invención, y de manera preferible aproximadamente 25 a 90% del compuesto de la presente invención. Cuando se administra en forma líquida, un portador líquido tal como agua, petróleo, aceites de origen animal o de plantas tales como aceite de cacahuate, aceite mineral, aceite de soya, aceite de ajonjolí o aceites sintéticos se pueden agregar. La forma líquida de la composición farmacéutica puede además contener solución salina, dextrosa u otra solución de sacárido, o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Cuando se administra en forma líquida, la composición farmacéutica contiene desde aproximadamente 0.5 a 90% en peso del compuesto de la presente invención, y preferiblemente desde aproximadamente 1 a 50% del compuesto de la presente invención. Cuando una cantidad efectiva terapéuticamente de los compuestos de la presente invención se administra mediante inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, los compuestos de la presente invención estarán en la forma de una solución acuosa aceptable parenteralmente, libre de pirógenos. La preparación de tales soluciones de proteína aceptables parenteralmente, que tienen vencimiento en relación al pH, isotonicidad, estabilidad, y similares, está dentro de las habilidades en la técnica. Una composición farmacéutica preferida para inyección intravenosa, cutánea, o subcutánea deberá contener, además de los compuestos de la presente invención, un vehículo isotónico tal como Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección de Dextrosa, Inyección de Dextrosa y Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer Lactada, u otro vehículo según sea conocido en la técnica. La composición farmacéutica de la presente invención también puede contener estabilizadores, conservativos, amortiguadores, antioxidantes, u otros aditivos conocidos por aquéllos de habilidades en la técnica. La cantidad del (los) compuesto (s) de la presente invención en la composición farmacéutica de la presente invención dependerá de la naturaleza y severidad de la condición que se va a tratar, y de la naturaleza de los tratamientos previos a los cuales el paciente se haya sometido. Finalmente, el médico que atiende decidirá la cantidad del compuesto de la presente invención con el cual tratar a cada paciente individual. Inicialmente, el médico que atiende administrará bajas dosis del compuestos de la presente invención y observará la respuesta del paciente. Las dosis más grandes de los compuestos de la presente invención se pueden administrar hasta que se obtenga el efecto terapéutico óptimo para el paciente, y en ese punto, la dosificación no se incrementará adicionalmente. Se contempla que las diversas composiciones farmacéuticas Lá i -¿ -J t a.-; t ? utilizadas para practicar el método de la presente invención deberán contener aproximadamente 0.1 µg hasta aproximadamente 100 mg (de manera preferible 100 :g hasta aproximadamente 50 mg, de manera más preferible 100 :g hasta aproximadamente 5 mg) del compuesto de la presente invención por kg de peso del cuerpo. La duración de la terapia intravenosa usando la composición farmacéutica de la presente invención variará, dependiendo de la severidad del padecimiento que se va a tratar y la condición y respuesta idiosincrática potencial de cada paciente individual. Se contempla que la duración de cada aplicación de los compuestos de la presente invención estarán en el rango de 12 a 24 horas de administración intravenosa continua. Finalmente el médico que atiende decidirá sobre la duración apropiada de la terapia intravenosa utilizando la composición farmacéutica de la presente invención. ?jemplo 1 Producción, cristalización y recolección de datos de la proteina . Se clonó la cPLA2 humana de longitud completa (residuos 1 - 749) en el vector pMT2-EMC-cPLA2 y se *•!!,>>&%>&*&$-transfectó en células CHO. La línea celular resultante, E5-CHO, se hizo crecer en un medio a (Gibco) que contiene 10% (v/v) de suero de ternero fetal dializado y 10 µM de metotrexato como se describió en Lin et al. (1992) . Las pelotillas o pelets de células se usaron típicamente en amortiguador a pH 9.0 y la cPLA2 en el sobrenadante se precipitó subsecuentemente con (NH4)2S04. Las etapas múltiples que incluyen cromatografía por exclusión de tamaño y afinidad generaron las muestras de la proteína que fueron adecuadas para los experimentos de cristalización. Un rendimiento típico de una pelotilla de 100 g sería de 15-25 mg de cPLA2 pura. Los cristales de la cPLA2 se obtuvieron mediante difusión de vapor a 18°C utilizando PEG 1000 como un precipitante utilizando 12 mg/ml de proteína. Típicamente, los cristales similares a placas aparecieron durante toda la noche y continuaron creciendo hasta un tamaño máximo de 0.6 mm X 0.5 mm X 0.1 mm dentro de una semana. Los cristales se impregnaron con átomos pesados y nativos y se crioprotegieron mediante la transferencia en cantidades incrementadas de PEG 400 y DMSO. Los cristales modificados con átomos pesados se prepararon mediante la impregnación de los cristales nativos durante toda la noche en una .ü.A,? .1.JL1 criosolución con CaCl2 reemplazada por 250 µM GdCl2 ó TbCl2. Los cristales crioprotegidos se enfriaron rápidamente en una corriente de nitrógeno líquido a 100° K antes de la recolección de datos. Los datos de la difracción de los cristales de la cPLA2 impregnados con Gd y Tb, nativos, se recolectaron en las líneas de haces de 5.0.2 en una Fuente de Luz Avanzada utilizando un detector Quantum 4 CCD (Área Detector Systems) . Debido a la sensibilidad del cristal, la primera imagen de cada conjunto de datos se analizó con STRATEGY (R. Ravelli) en un esfuerzo para calcular la cantidad mínima de la recolección de los datos requerida para un conjunto completo de datos. Después de la determinación del punto de inicio óptimo, se recolectaron los datos a través de un barrido a 90° después de lo cual, los cristales se hicieron girar a una posición de 180° desde el punto de inicio y un segundo barrido a 90° fue recolectado con vista hacia la maximización de la acumulación del par Bijvoet. Los cristales empezaron a desplegar una sensibilidad a la radiación después de aproximadamente 100° de colección de datos, haciendo necesario traducirlos a lo largo del eje de rotación entre los cambios de longitud de onda. Esta metodología probó ser útil en que los conjuntos de datos recolectados de tres diferentes longitudes de onda mostraron estadísticas similares. Todos los datos fueron recolectados a 100 K y procesados con DENZO/SCALEPACK (Otwinowski, 1993) .

Sitios de los átomos pesados - Ambos sitios Tb fueron identificados mediante inspección visual de los mapas anómalos Petterson utilizando los datos de difracción recolectados en la longitud de onda máxima del borde Lm, que confirman los resultados del previo conjunto de datos de Tb y Gd de baja resolución recolectados en un detector Raxis IV interno (Molecular Structure Corp.). El refinamiento y la formación de fases de los parámetros de los átomos pesados se complementaron con SHARP (de la Fortelle & Bricogne, 1997). La modificación de la densidad se realizó en SOLOMON (CCP4) como se implemento en SHARP. El mapa de densidad de electrones a 3.2 Á experimental, de alta calidad, permitió el posicionamiento del dominio de CaLB completo así como la formación del trazo inicial y la asignación de la secuencia del dominio catalítico (QUANTA) ; este procedimiento facilitó el calculó de una máscara que abarca la región de la proteína, la cual se incluyó en cálculos adicionales. Este acoplamiento del histograma incluyó (Zhang y Main, 1990), el promedio de simetría no cristalográfico de dos veces, y la extensión de fase de 3.2 a 2.5 A utilizando los datos de difracción nativos en DM (Cowtan et al., 1996). Los ciclos de combinación y refinamiento de fases se realizaron con REFMAC (Murshudov et al., 1997), generando un mapa en el cual la mayor parte del modelo se pudo identificar, incluyendo los residuos centrales del opérculo o tapa flexible .

Refinamiento. Los ciclos de reconstrucción así como el refinamiento de los parámetros de posición y térmicos en XPLOR (Brünger, 1992b) se utilizaron para mejorar el modelo, el cual se sometió a un refinamiento por calentamiento y enfriamiento simulado (12 - 2.5 A) después de que Rfree había caído por abajo del 32% (Brunger et al., 1992a). Las etapas subsecuentes de la construcción del modelo se realizaron con la ayuda de los mapas omit generados a través del refinamiento con probabilidad máxima como se i plementaron en BUSTER (Bricogne, 1993) . El refinamiento también incluyó una corrección del solvente de volumen uniforme (Bsol = 23.8 Á2; ksol = 0.305 e"/Á3) y la aplicación de las restricciones simétricas no cristalográficas. Todos los datos de difracción con F > 2.0 se utilizaron a través de todo el refinamiento excepto para un conjunto de pruebas -* - s »<»• I? . ?j t-? seleccionado aleatoriamente del 10% que se utilizó para el cálculo de Rfree. Se utilizaron los mapas Fo-Fc para localizar las moléculas de agua, las cuales se colocaron en los sitios cuyas densidad desplegaron > 3.0 s y que mostraron unas distancias de enlace del hidrógeno de la proteína-solvente, razonables, sin un conflicto estérico. El modelo final contiene 1285 residuos (molécula A: 9-433, 456- 500, 537-727) y 40 moléculas de agua, y exhibe una buena estequiometría, con una longitud de enlace promedio y una desviación del ángulo de enlace desde la geometría ideal de 0.010 Á y 1.38°, respectivamente. El valor R libre total es de 29.7% y el valor R es de 24.3% utilizando los datos de difracción entre 12 y 2.5 Á. Rsym = S I I _ <In> I ?l en donde <Ih> es la intensidad promedio sobre los equivalentes de simetría. £ son los pares de Friedel separados. Energía de formación de fase = S | FH | /S | | FPH?bs I ~ I FPHCaic II • R = S | | F0 | - | Fc | /S | F0 I , en donde Rfree se calcula para una elección aleatoria del 10% de las reflexiones y el factor R es calculado para el 90% restante de las reflexiones (F>2.0) utilizadas para el refinamiento de la estructura. Las coordenadas se depositarán en el banco de datos Brookhaven Protein Databank.

Ejemplo 2 Ensayos de Actividad (a) Ensayos de Vesículas Se mezclaron l-palmitoil-2- [ -1i4y,C] araquidonil fosfotidilcolina (58 mCi/mmol) (concentración final 6 µM) y 1, 2-dioleiolglicerol (concentración final 3 µM) y se secaron bajo una corriente de nitrógeno. A los lípidos se les agregó Hepes 50 mM pH 7.5 (concentración final de lípidos 2x) y la suspensión fue sometida a tratamiento con sonido durante 3 min. a 4°C. A la suspensión se le agregaron Hepes 50 mM pH 7.5, NaCl 300 mM, DTT 2 mM, CaCl2 2 mM y 2 mg/ml de albúmina de suero de bovino (BSA) (Sigma A7511) (concentración final de lípidos 1.2x). Un ensayo típico consistió de la mezcla de lípidos (85 µl) a la cual se agregó consecutivamente, el inhibidor (5 µl en DMSO) y la cPLA2, 10 ng para un sistema automatizado ó 1 ng para un ensayo manual, en 10 µl del amortiguador BSA. Este ensayo se condujo ya sea por el protocolo de ensayo manual o de ensayo automatizado descrito más adelante. (b) Ensayo del Substrato Soluble (LysoPC, ktA .__£ ,¿„ A guante * .. .,, **&** .

Se secó la 1- [14C] -palmitoil-2-hidroxifosfotidil-colina (57 mCi/mmol) (concentración final 4.4 µM) se secó bajo una corriente de nitrógeno. El lípido se resuspendió mediante la aplicación de un vórtice o torbellino de Hepes 80 mM pH 7.5, EDTA 1 mM (concentración final 1.2 x) . Un ensayo típico consistió de la suspensión de lípidos (85 µl) a la cual se agregó consecutivamente el inhibidor (5 µl en DMSO) y la cPLA2, 200 ng en Hepes 80 mM pH 7.5, DTT 2 mM y EDTA 1 M. Este ensayo se condujo ya sea por el protocolo de ensayo manual o de ensayo automatizado descrito más adelante. (c) Ensayo Automatizado La suspensión del lípido y el inhibidor se pre-incubaron durante 7 min. a 37°C. La enzima se agregó y la incubación se continuó por 30 min. adicionales. La reacción se apagó o enfrió rápidamente mediante la adición de decano: isopropanol : ácido trifluoroacético (192:8:1 p/v, 150 µl) . Una porción de la capa apagada (50 µl) se hizo pasar a través de una columna de sílice Rainin Spheric-5 (5 µ, 30 x 2.1 mm) eluyendo con heptano :metanol : TFA (97:3:0.1 v/v). El nivel de [14C] -ácido araquidónico se analizó mediante un contador Radiomatic Flo-One/Beta (Packard) en línea. í .?.& ? Á -£ a- a ^. . . ^.. * *. &, .*:.* ..^, ¿ -...** ^ ^t . . . .Í . (d) Ensayo Manual El lípido, el inhibidor y la mezcla de enzima se incubaron a 37°C durante 30 min. La reacción se apagó o enfrió rápidamente mediante la adición de heptano: isopropanol : ácido sulfúrico 0.5M (105:20:1 v/v, 200 µl) . La mitad de la capa apagada se aplicó a una columna de gel de sílice desechable (Whatman SIL, 1 ml) en un múltiple o colector al vacío colocado sobre una ampolleta de centelleo. Se eluyó el [14C] -ácido araquidónico libre mediante la adición de éter etílico (1 ml) . Se midió el nivel de radioactividad mediante el contador de centelleo líquido. (e) Ensayo PMN Los PMNs se aislaron utilizando Ficoll-Hypaque de acuerdo a las instrucciones de los fabricantes. Las células rojas de la sangre que contaminan los PMN se removieron o eliminaron mediante lisis hipotónica, y las pelotillas o pelets de PMN se lavaron una vez, y se resuspendieron en solución salina amortiguada de Hanks a una concentración de 2 x 106 células/ml. Las células se preincubaron con inhibidores durante 15 min. a 37°C y luego se estimularon con 2 uM A23187. Cuando se monitoreó la producción de LTB4 como una medición de la inhibición de cPLA2, la reacción se apagó con un volumen igual de solución salina amortiguada con fosfato, enfriada con hielo. Las células se removieron mediante centrifugación y el LTB4 presente en el sobrenadante de las células se midió utilizando el ensayo de proximidad de centelleo de LTB4 proporcionado por Amersham de acuerdo a las direcciones de los fabricantes. En los ensayos reportados en las Tablas anteriores, se midió el LTB4. Cuando se monitoreó la producción de ácido araquidónico, la reacción se apagó con metanol que contiene D8-ácido araquidónico como una referencia interna. Los lípidos se extrajeron mediante el método de Bligh et al. ((1959) Can. J. Biochem. Physiol., 37, 911-917), y el ácido graso se convirtió al éster de pentafluorobencilo y se analizó mediante GC-MS de una manera similar a aquélla reportada por Ramesha y Taylor ((1991) Anal . Biochem . 192, 173-180).

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Todas las referencias citadas aquí se incorporan como referencia como se estableció en su totalidad. i i * ?. * .t . »^? «..- . .^.^. .

Claims (3)

REIVINDICACIONES 1.- La fosfolipasa A2 citosólica (cPLA2) cristalina. 2.- La cPLA2 cristalina de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizada en que dicha cPLA2 es CPLA2 humana 3.- La cPLA2 cristalina de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizada en que dicha cPLA2 es cPLA2 de especies no mamíferas 4.- La cPLA2 cristalina de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizada en que dicha cPLA2 es cPLA2 recombinante . 5.- La cPLA2 cristalina de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizada en que dicha cPLA2 comprende la secuencia madura de la cPLA2 que se presenta de manea natural. 6.- Una composición cristalina, caracterizada en que comprende la cPLA2 en asociación con una segunda especie química . 7.- La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada en que dicha segunda especie química se selecciona de un inhibidor potencial de la actividad de la cPLA2 y un inhibidor potencial del enlace de la cPLA2. 8.- Un modelo de la estructura de la CPLA2, caracterizado en que comprende un conjunto de datos que expresan o incorporan la estructura de la cPLA2. 9.- El modelo de acuerdo a la reivindicación 8, caracterizado en que el conjunto de datos se determinó mediante el análisis cristalográfico de la cPLA2. 10.- El modelo de acuerdo a la reivindicación 8, caracterizado en que dicho conjunto de datos se determinó mediante el análisis NMR de la cPLA2. 11.- El modelo de acuerdo a la reivindicación 8, caracterizado en que dicho conjunto de datos expresa o incorpora la estructura completa de la cPLA2. 12.- El modelo de acuerdo a la reivindicación 8, caracterizado en que dicho conjunto de datos expresa o incorpora una porción de la estructura de la cPLA2. 13.- El modelo de acuerdo a la reivindicación 12, caracterizado en que dicha porción es el sitio activo de la CPLA2. 14.- El modelo de acuerdo a la reivindicación 12, caracterizado en que dicha porción es el dominio CaLB de la CPLA2. 15.- Un sistema de computadora, caracterizado en que comprende el equipo físico de la computadora y el modelo de acuerdo a la reivindicación 8. 16.- Un método para identificar una especie que es un agonista o antagonista de la actividad o enlace de la CPLA2, caracterizado en que comprende: (a) proporcionar el modelo de conformidad a la reivindicación 8, (b) estudiar la interacción de la especie candidata con tal modelo, y (c) seleccionar una especie que se predice que actúa como dicho agonista o antagonista. 17.- Una especie identificada de acuerdo con el método de la reivindicación 16. 18.- Un proceso para identificar una substancia que inhibe la actividad o el enlace de la cPLA2, caracterizado en que comprende la determinación de la interacción entre una substancia candidata y un modelo de la estructura de la CPLA2. 19.- Un proceso para identificar una substancia que imita la actividad o el enlace de la cPLA2, caracterizado en que comprende la determinación de la interacción entre una substancia candidata y un modelo de la estructura de la cPLA2. 20.- Un método para identificar los inhibidores de la actividad de la cPLA2 mediante un diseño racional del fármaco, caracterizado en que comprende: ¡1 (a) diseñar un inhibidor potencial que formará enlaces no covalentes con uno o más aminoácidos en el sitio activo de la cPLA2 en base a las co-ordenadas de la estructura del cristal de la CPLA2; (b) sintetizar el inhibidor; y (c) determinar sí el inhibidor potencial inhibe la actividad de la cPLA2. 21.- El método de acuerdo a la reivindicación 20, caracterizado en que las co-ordenadas de la estructura del cristal de la cPLA2 se obtienen a partir de un cristal de la cPLA2 del grupo espacial P2?2x2 con a = 153.59 Angstroms, b = 95.49 Angstroms, y c = 139.13 Angstroms. 22.- El método de acuerdo a la reivindicación 20, caracterizado en que dicho inhibidor se diseña para interactuar con uno o más átomos de dichos uno o más aminoácidos en el sitio activo de la cPLA2, y en donde dichos uno o más átomos se seleccionan del grupo que consiste de: CB y 0 (los átomos de Ser228); los átomos 0*1 y 0*2 de Asp549 y Asp575; los átomos CB, CG, CD, NE, CZ, NH1 y NH2 de Arg200, Arg413 y Arg579; el oxígeno del carbonilo de la estructura de la cadena principal de la Trp393; los átomos N*2 y 0*1 de Asn555; los átomos CDl, CEI, CG, CZ, CE2, y CD2 de Phe397, Phe681, Phe683 y Phel99; los átomos CG, CDl, NEl, CE2, CZ2, CH2, CZ3, CE3 y CD2 de Trp232 y Trp393; los átomos CB y 0 (átomos de Ser577); los átomos CB y S (de Cys331) ; los átomos 0E1 y 0E2 de Glu589; los átomos CB, CG, CD, CE y NZ de Lys588; el átomo O (1 átomo de Thr680); los átomos OE1 y OE2 de Glu418 y Glu422; los átomos CB, CG, SD y CE de Met417; los átomos CB, CG, CDl y CD2 de Leu400 y Leu421; los átomos CB, CG1, CG2, ó CDl de Ile424; los átomos del oxígeno del carbonilo y el NH de la estructura de la cadena principal de Ala578; y los átomos CB, CG, ND1, CEI, NE2, y CD2 de His639. 23.- Un método para identificar los inhibidores del enlace de la membrana de la cPLA2 mediante el diseño racional del fármaco, caracterizado en que comprende: (a) diseñar un inhibidor potencial que formará enlaces no covalentes con uno o más aminoácidos en la región del

1.1 A.? ...3- i a jfc kJiJ Í,i fragmento electrostático de la cPLA2 con base a las coordenadas de la estructura del cristal de la cPLA2; (b) sintetizar el inhibidor; y (c) determinar si el inhibidor potencial inhibe el enlace de la membrana de la cPLA

2. 24.- El método de acuerdo a la reivindicación 23, caracterizado en que las co-ordenadas de la estructura del cristal de la cPLA2 se obtienen a partir de un cristal de la cPLA2 del grupo espacial P2?2x2 con a = 15

3.59 Angstroms, b = 95.49 Angstroms, y c = 139.13 Angstroms. 25.- El método de acuerdo a la reivindicación 23, caracterizado en que dichos uno o más aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste de Arg467, Arg485, Lys488, Lys544 y Lys543. 26.- Un agonista o antagonista identificado mediante el método de la reivindicación 20. 27.- Un agonista o antagonista identificado mediante el método de la reivindicación 23. 28.- Una substancia identificada mediante el método de la reivindicación 18. 29.- Una substancia identificada mediante el método de la reivindicación 19. Í¿í..i^.-Á3i 1 ...i i ,