SK11782001A3 - Kryštalická štruktúra cPLA2 a spôsoby indentifikácie agonistov a antagonistov s jej použitím - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Leukotriény a prostaglandíny sú zápalové mediátory dôležité pri astme, artritíde a ostatných zápalových ochoreniach. Leukotriény spôsobujú zužovaním priedušiek bránenie dýchacích ciest u astmatikov, zvýšenú sekréciu hlienu a chemoatrakciu buniek zápalu (O‘Byrne, 1997); prostaglandíny spôsobujú bolesť a edém spojený s artritídou. Farmakologická intervencia blokovaním buď syntézy alebo pôsobenia týchto lipidových mediátorov je u ľudí pri liečení chorôb efektívna a tým je potvrdzovaná ich dôležitosť (Šimon a spol., 1998; O'Byrne, 1997).

Doterajší stav techniky

Cytozolická fosfolipáza A₂ (cPLA?) iniciuje produkciu leukotriénov a prostaglandínov uvoľňovaním kyseliny arachidónovej z bunkových membrán. Arachidónová kyselina je striedavo metabolizovaná prostredníctvom cyklooxygenázy na prostaglandíny a prostredníctvom 5-lipogenázy na leukotriény. Uvoľňovanie arachidónovej kyseliny je súčasne vykonávané tvorbou faktoru aktivujúceho lýzu krvných doštičiek (lyso-PAF), ktorý môže byť potom acetylovaný, aby generoval PAF, molekulu tiež implikovanú v patofyziológii astmy a artritídy. Reakcia katalyzovaná cPLA₂ teda iniciuje tri druhy mediátorov zápalu: leukotriény, prostaglandíny a PAF.

cPLA₂ je členom rôznorodej skupiny enzýmov fosfolipázy A₂ s všeobecnou schopnosťou štiepiť sn-2 ester glycerofosfolipidov. Prvými členmi opisovanej skupiny boli enzýmy s nízkou molekulovou hmotnosťou, ktoré sú vylučované buď extracelulárne alebo do granúl (a sú tu súhrnne označované ako sPLA₂; skupiny I, II, III, V, VII a IX) (Dennis, 1997). Trieda PLA₂ sa rozšírila s klonovaním a charakterizáciou kalcium-dependentnej arachidonylselektívnej • <· cPLA₂ (Clark a spol., 1991; Kramer a spol., 1991), kalcium-independentnej PLA₂ (Táng a spol., 1997; Balboa a spol., 1997) a plazmy a intracelulárnych PAF-acetylhydroláz (Hattori a spol., 1994, 1995). Každý z týchto nových enzýmov zdiela nesekvenčnú homológiu s enzýmami s nízkou molekulovou hmotnosťou alebo s každým iným. Navyše na rozdiel od sPLA₂, ktoré na štiepenie fosfolipidov využívajú aktivovanú vodu, zdá sa, že tieto enzýmy využívajú nukleofilný serín. Z tohto hľadiska majú viac spoločného s ostatnými lipázami z triedy α/β hydroláz než s sPLA₂. V súčasnej dobe boli klonované dva ďalšie enzýmy s 30 % identity s katalytickou doménou cPLA₂; boli pomenované cPLA₂p (C. Song a spol., rukopis pripravovaný) a cPLA₂y (Underwood a spol., 1998).

Klonovanie cPLA₂ je opísané tiež v U.S. patentoch č. 5,322,776, 5,354,677, 5,527,698 a 5,593,878. Klonovanie kalcium nezávislej cPLA₂ je tiež opísané v U.S. patentoch č. 5,466,595, 5,554,51 1, 5,589170 a 5,840,51 1.

Mnohé dôkazy podporili hlavnú úlohu cPLA₂ pri biosyntéze mediátorov lipidov. cPLA₂ je jediným enzýmom, ktorý je vysoko selektívny na fosfolipidy obsahujúce arachidónovú kyselinu v sn-2 polohe (Clark a spol., 1995; Hanel a Gelb 1993). Aktivácia cPLA₂ alebo jej zvýšená expresia boli spojené so zvýšenou syntézou leukotriénu a prostaglandínu (Lin a spol., 1992). Následne po aktivácii sa cPLA₂ premiestňuje na nukleačnú membránu, kde je lokalizovaná spolu s cyklooxygenázou a lipoxygenázou, ktoré metabolizujú arachidonát na prostaglandíny a leukotriény (Schievella a spol, Glocer a spol., 1995). Aj keď sú tieto údaje závažné, najrozhodnejší dôkaz na hlavnú úlohu cPLA₂ pri produkcii eikozanoidu a PAF bol získaný u myší, v ktorých bol nedostatok cPLA₂ vytvorený homologickou rekombináciou (Uozumi a spol., 1997; Bonventre a spol., 1997). Od týchto zvierat pochádzajúce peritoneálne makrofágy na tvorenie leukotriénov, prostaglandínov alebo PAF zlyhali. Myši s nedostatkom cPLA₂ poskytli tiež informáciu o úlohe cPLA₂ pri ochorení, pretože tieto myši boli rezistentné voči bronchiálnej hyperreaktivite pri modely anafylaxie používaného na napodobnenie astmy (Uozumi a spol., 1997).

cPLA₂ pozostáva najmenej z dvoch funkčne odlišných domén: Nterminálnej Ca^2>-závislej, lipid viažucej (CaLB) domény a Ca²⁺- nezávislej,

9 katalytickej domény (Nalefski a spol., 1994). N-terminálna CaLB doména je členom C2 triedy a jej štruktúra bola vyriešená ( Perisic a spol., 1998; Xu a spol., 1998); sprostredkováva reguláciu vápnika ko-lokalizáciu katalytickej domény s jej membránovým substrátom (Nalefski a spol., 1994). Okrem toho aktivita CPLA2 je tiež regulovaná fosforyláciou katalytickej domény (Lin a spol., 1991; Leslie, 1997). Ser505 a Ser727 sú zachovávané cez všetky druhy a sú fosforylované v mnohopočetných bunkových typoch (de Carvalho a spol., 1998). Fosforylácia Ser505 členmi triedy MAP-kináz je všeobecnou odozvou na extracelulárne stimuly, ktoré uvoľňujú kyselinu arachidónovú. Mutácia Ser505 na Ala aktiváciu znižuje (Lin a spol., 1993), zatiaľ čo analogická mutácia na Ser727 nemá efekt (Leslie, 1998).

Niektoré z dokladov naznačujú, že katalytický mechanizmus CPLA2 prebieha cez intermediát acylovaného serínu (Trimble a spol., 1993; Hanel a Gelb, 1995). Mutácia Ser228 ruší aktivitu CPLA2 voči všetkým substrátom vrátane fosfolipidov, lyzofosfolipidov a tukmi acylovaného kumarínu (Pickard a spol., 1996; Huang a spol., 1996). Ser228 je prítomný v pentapeptidovej sekvencii GL-S-G-S, ktorá je podobná klasickému motívu lipázy G-X-S-X-G (Schrag a Cygler, 1997) nájdenému v rozsiahlej triede enzýmov zvanej α/β hydrolázy. Tieto enzýmy majú spoločné stredné jadro, ktoré pozostáva z dobre uchovaných zmiešaných β pásov, ktorých vlákna sú premiešané s α-helixami. Vo všetkých α/β/ hydrolázach je prítomný katalytický serín v tesnej otáčke medzi β pásom a α-helixom nazývanej nukleofilné koleno (viď prehľad od Schraga a Cyglera, 1997). Táto otáčka smeruje krátky serínový postranný reťazec von od proteínového reťazca a znižuje stérickú zábranu okolo zvyšku a vyžaduje, aby +2 a -2 postranné reťazce boli malé, a aby zabránili stérickej kolízii; teda prevládanie G-X-S-X-G motívu (Derewenda a Derewenda, 1991).

Okrem serínu využívajú α/β hydrolázy histidín a kyselinu (aspartát a glutamát) ako ďalšiu súčasť katalytickej triády podobnej tej, ktorá je prítomná v serínových proteázach ( Schrag a Cygler, 1997). Avšak aj keď bolo u CPLA2 preukázané, že Asp549 je pre aktivitu nevyhnutná, žiaden z 19 histidínových zvyškov sa nenašiel (Pickard a spol., 1996). Pri enzymatickom procese bol ako úlohu hrajúci impiikovaný odlišný zvyšok, Arg200, aj keď mechanizmus naje4 ho participáciu zostáva nevyjasnený. Tieto pozorovania naznačujú, že CPLA2 účinkuje pre acyl hydrolázy novým katalytickým mechanizmom.

Podobne ako SPLA2 aj lipázy z triedy α/β hydroláz, štiepia CPLA2 prednostne substráty prítomné na rozhraní (Nalefski a spol., 1994). Tento fenomén, známy ako interfaciálna aktivácia, bol prisúdený buď konformačným zmenám v enzýme alebo výhodnejšiemu zavedeniu substrátu (Scott a spol., 1990). Pôvod 1500-násobného rozdielu v aktivite CPLA2 voči monomérnemu a micelárnemu substrátu zostáva neznámy.

Navzdory kľúčovej úlohe CPLA2 pri zápalovom ochorení zostáva trojrozmerná štruktúra nevyriešená a ponecháva mnohé otázky nezodpovedané. My tu opisujeme rôntgénovú štruktúru ľudskej cPLA₂ s rozlíšením 2,5 Ä. Štruktúra dáva preniknúť do pôvodu arachidonátovej selektivity a interfaciálnej aktivácie, objasňuje úlohy Ser228, Asp549 a Arg200 a odkrýva vzájomné pôsobenie medzi CaLB a katalytickými doménami. Je významné, že štruktúra má jedinečnú topológiu, odlišnú od tej, ktorú ma trieda α/β hydroláz.

Podstata vynálezu

Všetky tu uvedené odkazy na aminokyseliny v CPLA2 sú robené s použitím čísel zvyškov, ktoré sa vzťahujú na CPLA2 sekvenciu uvádzanú v Tabuľke I v U.S. patente č. 5,527,698 s prvým metionínom, označeným ako zvyšok 1 (Metl).

Predkladaný vynález uvádza kryštalickú CPLA2. CPLA2 je najlepšie buď ľudská CPLA2 alebo CPLA2 od iných než cicavčích druhov. V určitých uskutočneniach je CPLA2 rekombinantná CPLA2 a/alebo obsahuje vyvinutú sekvenciu prirodzene sa vyskytujúcej CPLA2.

Iné uskutočnenia poskytujú kryštalickú kompozíciu obsahujúcu cPLA₂ spolu s inou chemickou látkou. Iná chemická látka je najlepšie volená zo skupiny pozostávajúcej z potenciálneho inhibítora aktivity CPLA2 a potenciálneho inhibítora väzby cPLA₂ na membránu.

r r5

Ďalšie uskutočnenia poskytujú ešte model štruktúry CPLA2 obsahujúci súbor údajov vyjadrujúci štruktúru CPLA2. Tento súbor údajov bol najvhodnejšie stanovený kryštalografickou analýzou CPLA2 vrátane eventuálnej NMR analýzy. V určitých uskutočneniach zahrnuje súbor údajov časť štruktúry CPLA2 obsahujúcej bez obmedzenia aktívne centrum CPLA2 alebo CaLB doménu cPLA₂.

Na konštrukciu takého modelu z tu uvedených kryštalografických a/alebo NMR údajov či získaných nezávislou analýzou kryštalickej CPLA2, môže byť využitá akákoľvek dostupná metóda. Takýto model môže byť konštruovaný z dosiahnuteľných položiek analytických údajov pri využití známych súborov softwarových programov ako HKL, MOSFILM, XDS, CCP4, SK.ARP, PHASES, HEAVY, XPLOR, TNT, NMRCOMPASS, NMRPIPE, DIANA, NMRDRAW, FELIX, VNMR, MADIGRAS, QUANTA, BUSTER, SOLVE, O, FRODO, RASMOL a CHAIN. Model konštruovaný z týchto údajov môže byť potom zobrazený s využitím dostupných systémov vrátane napríklad Silicon Graphics, Evans and Sutherland, SUN, Hewlet Packard, Apple Macintosh, DEC, IBM a Compaq. Predkladaný vynález poskytuje tiež výpočtový systém, ktorý zahrnuje model podľa vynálezu a hardware používaný na konštrukciu, postup spracovania a/alebo zobrazenia podľa vynálezu.

Ďalšie uskutočnenia poskytujú výpočtový systém obsahujúci hardware na výpočet a model podľa predkladaného vynálezu.

Sú poskytované tiež metódy na identifikáciu látok, ktoré sú agonistou alebo antagonistou aktivity alebo väzby cPLA₂ obsahujúcej: (a) poskytnutie modelu podľa predkladaného vynálezu, (b) študovanie interakcie medzi prípadnou látkou a takýmto modelom a (c) výber látok, o ktorej je predpovedané, že bude pôsobiť ako spomínaný agonista alebo antagonista. Poskytované sú také látky identifikované v súhlase s takýmito metódami.

Iné uskutočnenia predstavujú (1) postup identifikácie substancie, ktorá inhibuje aktivitu alebo väzbu cPLA₂ obsahujúcu určenie interakcie medzi prípadnou látkou a modelom štruktúry cPLA₂ alebo (2) spôsob identifikácie, ktorý napodobňuje aktivitu alebo väzbu cPLA₂ obsahujúcu určenie interakcie medzi prípadnou látkou a modelom štruktúry cPLA₂. Poskytované sú tiež substancie identifikované v súhlase s takýmito postupmi.

Štúdie interakcie medzi prípadnou látkou a modelom môžu byť uskutočnené s použitím dostupných softwarových programov vrátane QUANTA, RASMOL, O, CHAIN, FRODO, INSIGHT, DOCK, MCSS/HOOK, CHARMM, LEAPFROG, CAVEAT(UC Berkley), CAVEAT(MSI), MODELLER, CATALYST a ISIS.

Iné uskutočnenia poskytujú spôsob identifikácie inhibítorov aktivity cPLA₂ racionálnym návrhom liečiva a obsahujú: (a) navrhnutie potenciálneho inhibítora, ktorý bude tvoriť nekovalentné väzby s jednou alebo viacerými aminokyselinami v aktívnom centre cPLA₂ na základe koordinát kryštálovej štruktúry cPLA₂; (b) syntetizovanie inhibítoru a (c) určenie, či potenciálny inhibítor inhibuje aktivitu cPLA₂. Koordináty kryštálovej štruktúry cPLA₂ používané pri takýchto postupoch sa získajú najlepšie z kryštálov cPLA₂ priestorovej grupy P2|2)2 s a = 153,59 Ä, b = 95,49 Ä a c = 139,13 Ä. U iných preferovaných uskutočneniach inhibítor, zamýšľaný na interakciu s jedným alebo viacerými atómami spomínanej jednej alebo viacerých aminokyselín v aktívnom centre cPLA₂, je volený zo skupiny, ktorú tvorí:

CB a Ογ atómy v Ser228;

Οδ a Οδ2 atómy v Asp549 a Asp575;

CB, CG, CD, NE, CZ, NH1 a NH2 atómy v Arg200, Arg413 a Arg 579; karbonylový kyslík v reťazci chrbta u Trp393;

Νδ2 a Οδΐ atómy v Asn555;

atómy CD1, CE1, CG, CZ, CE2 a CD2 v Phe397, Phe 681, Phe683 a Phel99;

CG, CD1, NE1, CE2, CH2,CZ3, CE3 a CD2 v Trp232 a Trp 393;

CB a Ογ atómy v Ser377;

atómy CB a Sy v Cys331;

atómy OE1 a OE2 v Glu589;

atómy CB, CG, CD, CE a NZ v Lys588;

ΟγΙ atóm v Thr680;

f *

0E1, a OE2 atómy v Glu 418 a Glu422;

atómy CB, CG, SD a CE v Met417;

atómy CB, CG, CD1 a CD2 v Leu400 a Leu421;

atómy CB, CG1, CG2 nebo CD1 v Ile424;

NH a karbonylový kyslík v reťazci chrbta u Ala578; a atómy CB, CG, ND1, CE1, NE2 a CD2 v His639.

Sú tiež poskytovaní agonisti a antagonisti identifikovaní takýmito metódami.

Uvádzajú sa tiež metódy identifikácie inhibítorov väzby CPLA2 na membránu racionálnym návrhom liečiva obsahujúcim: (a) navrhnutie potenciálneho inhibítoru, ktorý bude tvoriť nekovalentné väzby s jednou alebo viacerými aminokyselinami v oblasti elektrostatického poľa CPLA2 na základe koordinát

I kryštálovej štruktúry CPLA2; (b) syntetizovanie inhibítoru a (c) určenie, či potenciálny inhibítor inhibuje väzbu CPLA2. Koordináty kryštálovej štruktúry

I

CPLA2 používané pri takýchto postupoch sa získajú najlepšie z kryštálov CPLA2 priestorovej grupy P2j2|2 s a = 153,59 Ä, b = 95,49 Ä a c = 139,13 Ä. V iných preferovaných uskutočneniach inhibítor, zamýšľaný na interakciu s jednou alebo viacerými aminokyselinami, je volený zo skupiny tvorenej Arg467, Arg485, Lys488, Lys544 a Lys543. Poskytované sú tiež agonisti a antagonisti identifikovaní takýmito metódami.

Podrobný opis vynálezu a preferovaných uskutočnení

Štruktúra cPĽÄ2 bola riešená s použitím jedného ťažkého atómu ako silne rozptyľujúceho atómu pre 749 zvyškov

Ľudská CPLA2 kompletnej dĺžky bola exprimovaná v CHO bunkách a vyčistená modifikovanou metódou podľa Čiarka a spol., 1990 (Stahl a spol., rukopis je pripravovaný). Pri 18 °C boli získané kryštály s použitím PEG 1000 ako zrážadla a pri aplikácii štandardných techník difúzie pár. Monokryštály vyrástli po niekoľkých dňoch až do rozmerov 0,6 mm x 0,5 mm x 0,1 mm, avšak p · boli vysoko citlivé na poškodenie rontgénovými lúčmi. Cykly nasýtenia kryštálu v roztokoch kryoprotektantov so vzrastajúcim množstvom PEG 400 a DMSO, nasledované bleskovým ochladením a expozíciou voči synchrotrónovej radiácii, boli rozhodujúce na získanie difrakcie pri minimálnom Braggovom intervale 2,5 Ä. Kryštály majú priestorovú grupu P21212 (a = 153,59 Ä, b = 95,49 Ä, c = 139,13 Ä) s dvoma monomérmi (1498 zvyškov) a 60 % rozpúšťadla na asymetrickú jednotku.

Pokusy pripraviť ťažkým atómom nasýtené kryštály cPLA₂ ukázali, že izomorfné deriváty môže poskytnúť len gadolínium alebo terbium. Avšak jeden alebo druhý lantanoid nahradil jediný Ca²⁺ atóm v CaLB a takto poskytol jediný ťažký atóm ako rozptyľujúci atóm pre 749 aminokyselinových zvyškov. Informácia o vnútornom fázovaní z týchto kryštálov nemala dostatočne vysokú kvalitu, aby poskytla východiskovú mapu elektrónovej hustoty. Toto pozorovanie spolu so skutočnosťou, že viazanie väčšiny ťažkých atómov negeneruje izomorfizmus medzi natívnymi a nasiaknutými kryštálmi, viedlo k snahe riešiť štruktúru cPLA₂ fázovaním anomálnej disperzie viacerými vlnovými dĺžkami (MAD) (Hendrickson, 1991).

Boli pripravené terbiom nasýtené kryštály cPLA₂, kryotizované (viď Metódy) a ochladené v prúde dusíka s teplotou 100 K. Pri troch rôznych vlnových dĺžkach boli okolo Tb L_m hrany snímané údaje monokryštálu, ktorý vzhľadom na citlivosť na radiáciu bol medzi zberom údajov posunovaný pozdĺž svojej rotačnej osi. Experimentálne fázy do 3,2 é boli vypočítané pomocou SHARP (de La Fortelle a Bricogne, 1997); potom niekoľko cyklov znižovania rozpúšťadla a dvojnásobné priemerovanie v DM (Cowtan a spol., 1996) nám dovolilo rozšíriť fázy na 2,5 Ä. Touto procedúrou bola vytvorená mapa elektrónovej hustoty o vysokej kvalite (Obr. 1), v ktorej je možné jasne identifikovať obidve domény každého cPLA₂ monoméru. Najprv bola v hustote rotovaná CaLB (Perisic a spol., 1998; 1RLW) a polyalanínová stopa bola zasadená do viditeľných oblastí katalytickej domény s použitím programu QUANTA (Molecular Simulations Inc.) generujúcim model s približne 550 zvyškami pre každý monomér. Fázovo obmedzená rafinácia tejto počiatočnej štruktúry s finálnym stupňom kombinácie fázy (REFMAC; Murshudov a spol., 1997), nasledovanej r · manuálnym zostavením modelu (QUANTA) vytvorila model, ktorý bol následne spresnený v XPLOR (Brunger a spol., 1992b). Predložený model obsahuje 1285 zvyškov (medzi obidvoma monomérmi) a 40 molekúl vody.

Molekulárna štruktúra

Monomér cPLA₂ je dvojdoménová elipsoidálna štruktúra a rozmery ~ 100 Ä x 55 Ä x 45 Ä (Obr. 2a). N-terminálna CaLB doména (zvyšky 16-138) je zreteľne zavinutý β sendvič pripojený zvyškami 139-143 ku katalytickej doméne, s ktorou tvorí veľmi málo kontaktov proteín-proteín. Centrálne jadro katalytickej domény je zložené z desaťvláknového centrálneho β pásu premiešaného s helixami, ktorý je odlišný od kanonického stočenia α/β/ hydrolázy. Monoméry cPLA₂ prítomné v asymetrickej jednotke nie sú dokonale superponovateľné vzhľadom na flexibilitu interdoménovej slučky. Skutočne, keď sú CaLB domény superponované, je medzi dvoma katalytickými doménami diferenciácia 4-5°. Slučka, ktorá vzájomne prepojuje domény, má u každého monoméru odlišnú konformáciu a jej zvyšky prejavujú vysokoteplotné faktory.

cPLA₂ je cytozolickým proteínom, ktorý sa premiesťuje k membráne, keď volné hladiny Ca²⁺ sú zvýšené na mikromolekulárnu úroveň (Clark a spol., 1990. 1991). Usporiadanie domén cPLA₂ naznačuje, ako je aktívne centrum orientované vzhľadom na bunkovú membránu. Obr. 2a je diagramom povrchu, ktorý osvetľuje HSQC štúdie, ktoré na CaLB vykonal Xu a spolupracovníci (1998). Zvyšky, ktoré zobrazujú N¹⁵/NH posuny po inkubácii micelami dodecylfosfocholínu pri týchto experimentoch, sú znázornené v purpurovej farbe. Je zrejmé, že zobrazené zvyšky sa objavujú na rovnakej čelnej ploche ako aktívne centrum. Preto teda, keď CaLB využíva tieto zvyšky na asociáciu s membránou fosfolipidu, je katalytická doména približne nastavená do polohy, aby viazala fosfolipidový substrát v aktívnom centre. Flexibilita spojovacieho článku medzi dvoma doménami, práve tak ako nedostatok väčších interakcií proteínproteín medzi nimi nasvedčuje, že optimálnych interakcií s membránou je možné dosiahnuť malou rotáciou medzi doménami.

Ako je ukázané na diagramu povrchového potenciálu na Obr. 2c, existuje tu vysoko bázická oblasť, ktorá sa rozprestiera od aktívneho centra cez úzky pás pozitívne nabitých zvyškov na β3 prameň CaLB. Táto bázická charakteristika by bola očakávaná v oblasti proteínu, ktorá vytvára elektrostatické kontakty s negatívne nabitými čelnými skupinami fosfolipidu membránovej vrstvy (viď nižšie). Avšak zvyšky 434 až 456 sú neusporiadané a spôsobujú, že je nemožné presne definovať skutočnú veľkosť bázického úseku. Viac-menej stojí za zaznamenanie, že podobné bázické úseky boli poznané u PI4kinázy a v rôznych druhoch SPLA2 (Rao a spol., 1998). Zvádza to, aby vznikol dojem, že vysoká afinita väzby cPLA₂ na membrány vytvorené z fosfatidylmetanol lipozómov (Hixon a Gelb, 1998) je sprostredkovaná touto časťou a susediacim bázickým úsekom β vlákna 3 v CaLB doméne.

N-Terminálna CaLB doména

Štruktúra CaLB domény v celkovej dĺžke cPLA₂ je s menšími rozdielmi veľmi podobná tej, ktorá bola vyriešená pomocou NMR a rôntgénovej kryštalografie (Xu a spol., 1998, Perisic a spol., 1998). Stručne povedané, je tvorená ôsmi antiparalelnými β prameňmi, navzájom spojenými šiestimi slučkami, zvinujúcimi sa do β sendviča, ktoré vyhovujú typu II topológie pre C2 domény (Nalefski a spol., 1994b). Dva Ca²⁺ atómy sú viazané na jeden koniec CaLB prostredníctvom konštelácie postranných reťazcov Asp a Asn, rovnako ako karbonylovými atómami v reťezci chrbta, na troch rozdielnych slučkách (vápnik viažuce slučky; CBLs); rovnaké usporiadané atómov bolo pozorované v CaLB doménach, ktoré vyrešil Perisic a spolupracovníci (1998). Ca²⁺ atómy sú od seba pribli±ne 4 é . Okolie Ca²⁺ atómov v celkovej dĺžke cPLA2 však v štruktúre CaLB riešenej týmito autormi nevykazuje prítomnosť žiadnej z molekúl vody; miesto toho k vápnikovému centru 1 (definované u Perisica a spolupracovníkov, 1998) je koordinovaná molekula MES [2-(N-morfolino)etánsulfónová kyselina] z pufru použitého pri kryštalizácii a kryoprotekcii. U obidvoch cPLA2 monomérov je vzdialenosť medzi Ca²⁺ 1 v cPLA2 a najbližším sulfonátovým kyslíkovým atómom MES približne 2,2 Ä. Okrem toho je morfolínová skupina v kontakte tiež s postrannými reťazcami His62 a Tyr96 tvoriac tak malý hydro • * fóbny výklenok. Aj keď kryštalizačný artefakt, koordinácia Ca²⁺ 1 v CPLA2 k sulfónovej skupine MES by mohla imitovať väzbový spôsob fosfátovej skupiny molekuly fosfolipidu a takto nasvedčovať, že Ca²⁺ v CPLA2 pôsobí ako mostík medzi proteínom a fosforylovanou membránou skôr, než lén ako alosterický aktivátor.

Nová topológia stočenia cPLAž ju odlišuje od α/β hydroláz

Katalytická doména CPLA2 sa skladá z 14 β prameňov a 13 a helixov; jej centrálne jadro pozostáva z desaťpramenného centrálneho zmiešaného β pásu obklopeného 9 a helixami s prameňmi β5 až do βΐ 1 tvoriacimi najzreteľnejšiu časť pásu (viď Richardsonov diagram na Obr. 3b). β pás má superhelikálne zatočenie. Pre jednoduchosť: sekundárne elementy CPLA2 boli identifikované na základe nomenklatúry zvinutia α/β hydrolázy, ktorú uvádza Schrag a Cylger (1997), v ktorej je katalytický serín vždy predchádzaný β5 a nasledovaný Helixom C.

Prvým β prameňom v jadre cPLA₂ je βΐ, ktorý nasleduje flexibilné spojenie po CaLB. Dlhá slučka obsahujúca jeden dlhý helix tvorí spojenie s β4 v centrálnej časti záhybu. Táto konštrukcia βΐ/α-helix je analogická k tejj ktorá bola pozorovaná v lipáze Humicola lanuginosa, kde helikálna oblasť tiež nie je uvažovanou časťou záhybu, ale spojuje jej βΙΟ s prvým β prameňom v jadre (vstup 1TIB v PDB). Nasledujúci paralelný β prameň, prameň β5 predchádza katalytický serín (228). Topológia β5, Helixu C (ružovo sfarbený na Obr. 3a a 3b) a slučka, ktorá ich spojuje, sú v α/β hydrolázach podobné. Táto prepojujúca slučka sa nazýva nukleofilné koleno. Tri ďalšie α-helixy pretkané slučkami poskytujú spojenie medzi touto oblasťou a ďalšími 4 β prameňmi tejto časti záhybu. Zo štyroch prameňov, ktoré nasledujú (β6-β9) je β6 najdlhší a tvorí nemnoho vodíkových mostíkov s β7. Pramene β7 až β 1, a j keď v sekvencii nesúvisia, môžu byť teda považované za malý β pás vo vnútri väčšej štruktúry.

Po β9 existuje väčšia odchýlka od utvárania centrálneho α/β jadra. V tomto bode tvorí CPLA2 oblasť uvedenú v purpurovej farbe na Obr. 2a a 3b. Táto časť so 180 zvyškami tvorí čiapočku katalytickej domény. Asp549, katalytický partner Ser228 leží v oblasti medzi koncom čiapočky a β 10, ktorý je súčasťou centrálneho jadra. Podľa štruktúry čiapočky sú posledné tri β pramene umiestené tak, aby doplňovali centrálny β pás a sú premiešané helixami G až J.

α/β stočenie hydrolázy je spoločné mnohým esterázam a iným hydrolytickým enzýmom (Schrag a Cygler, 1997). Jeho Richardsonov diagram (Obr. 3a) pozostáva z centrálneho β pásu, v ktorom usporiadanie β prameňov sleduje sekvenciu lineárne (s výnimkou β3, ktorý je často umiestený medzi β4 a β5). Na prvý pohľad sa topológia CPLA2 javí, ako že by bola cirkulárnou permutáciou α/β stočenia hydrolázy. Avšak starostlivé porovnanie Obr. 3a a 3b jasne odhaľuje, že v skutočnosti porovnateľná je len oblasť obklopujúca nukleofilné koleno (β5 až Helix C; zvyšky 222-228). Hlavné rozdiely zahrnujú antiparalelnú povahu prameňov β6 až β9, multiplicitu helixov medzi β5 a β6 a neprítomnosť zasahujúcich helixov medzi prameňmi naposledy spomínanej časti cpla2 α/β jadra.

Aj keď štruktúra čiapočky v cPLA₂ (zvyšky 370-548) je súčasťou katalytickej domény, nie je zahrnovaná do α/β jadra. Sekvenčné porovnávanie katalytických domén ľudských CPLA2 α, β, a γ (Obr. 4) ukazuje, že homológia je sústredená vo vnútri α/β jadra (žlté elementy) a β prameňov 9a a 9b. Centrálna časť čiapočky je teda medzi izoformami CPLA2 rozdielna. Pri porovnávaní medzi pásovým diagramom CPLA2 na Obr. 2a, v ktorom je oblasť čiapočky znázornená v purpurovej farbe s diagramom povrchového potenciálu na Obr. 2c, vychádza najavo, že vyššie hypotetizovaná, vysoko bázická oblasť ako úsek vytvárajúci kontakt s fosfolipidmi membrány, je tvorená skutočne z veľkej časti zvyškami v čiapočke.

Oblasť čiapočky v CPLA2 obsahuje tiež dva z troch najpohyblivejších úsekov celej štruktúry, zvyšky 433-456 a 500-536 (tretí úsek je C-zakončenie, zvyšky 728-749). Tieto úseky aminokyselín nemajú vystopovateľnú elektróno13 vú hustotu a nie sú do modelu zahrnuté (čiarkované čiary na Obr. 2a). Je zaujímavé, že to sú tieto vysoko flexibilné úseky čiapočky, ktoré v sebe obsahujú tri zo štyroch serínových zvyškov, v ktorých po stimulácii agonistom dochádza k fosforylácii (437, 454, 505). Úloha Ser437 a Ser454 je nejasná, pretože nie sú zachovávané medzi rôznymi látkami. Na rozdiel od toho je Ser454 v cPLA₂ zachovaný u evolučné rozdielnych druhov (kurčaťa, človeka, pruhované akvarijné rybky, myši, krysy) a jeho fosforylácia MAP kinázou je vyžadovaná kvôli maximálnej aktivácii cPLA₂ v hmyzích bunkách (Lin a spol., 1993; Qiu a spol., 1998). Ser505, ktorý je v našich kryštáloch pravdepodobne heterogénne fosforylovaný a je umiestený vo vysoko flexibilnej, rozpúšťadlu vystavenej slučke, nevytvára kontakty ani s hlavnou časťou proteínu ani s inými, v kryštálovej mriežke susediacimi monomérmi cPLA₂. Ser5O5 je vzdialený obidvom aktívnym centrám a väzbovej oblasti membrány (viď Obr. 2a); avšak jeho blízkosť stočenia medzi CaLB a katalytickou doménou je pozoruhodná (vid' diskusia). Štvrtá poloha fosforylácie cPLA₂, Ser727 je na C-zakončenie štruktúry. Aj keď je táto poloha medzi druhmi zachovávaná, jej funkčná dôležitosť nie je dosiaľ známa.

Lievikovitý tvar aktívneho centra je čiastočne zakrytý príklopom prístupným pre rozpúšťadlo

Najpozoruhodnejší rys štruktúry cPLA₂ je lievikovitý tvar aktívneho centra, ktorý prestupuje tretinu cesty do katalytickej domény a odkrýva Ser228 a Asp549, umiestené na spodnej časti hlbokej, úzkej štrbiny. Aj keď pri vrchole široký, dolu sa tvar zužuje na priemer približne 7 Ä pri ústí štrbiny v aktívnom centre, viditeľnej na Obr. 5a. Lievik je lemovaný hydrofóbnymi zvyškami (na Obr. 5a modré) a tvorí lôžko do ktorého sa môžu viazať acylové zvyšky mastných kyselín fosfolipidových substrátov membrán.

Aktívne centrum cPLA₂ je čiastočne prekryté príklopom zloženým zo zvyškov 413-457. Príklop je zahnutý do oblasti slučky, je nasledovaný malým helikálnym úsekom a krátkym ohybom (viď Obr. 5a). Zvyšky 408-412, ktoré vedú do oblasti príklopu, sa prejavujú ako veľmi značné teplotné faktory a zvyšky 434-456 nemajú vystopovateľnú elektrónovú hustotu. Tieto pozorovania naznačujú, že tieto oblasti sú vysoko mobilné a môžu byť chápané ako záves príklopu. Viditeľná oblasť príklopu má amfipatický charakter; jej rozpúšťadlu vystavená čelná strana je primárne tvorená polárnymi zvyškami (T416, E418, E419, E420, N423), zatiaľ čo vnútorná strana je lemovaná hydrofóbnymi aminokyselinami (M417, L42l,I424). Je možné, že dvojstranný charakter príklopu vchádza do hry po väzbe membránového fosfolipidu, pretože jeden povrch má schopnosť vytvárať kontakty pomocou vodíkových väzieb, zatiaľ čo druhý má sklon k hydrofóbnym interakciám bud' so substrátom alebo membránou.

Pokusy modelovať molekulu diacylfosfolipidu v aktívnej štrbine CPLA2 v mieste s príklopom ukázali, že acylesterová väzba nemôže byť umiestená v susedstve serínu aktívneho centra bez vzniku kolízie s obklopujúcimi zvyškami. Preto je teda mysliteľné, že vytvorenie vhodného priestoru pre väzbu substrátu vyžaduje pohybovanie príklopu, predstavy sú v súlade s pozorovaním, že CPLA2 prejavuje väčšiu aktivitu v prítomnosti micelárnych, skôr než monomerických substrátov (Cygler a Schrag, 1997), čo je fenomén známy ako interfaciálna aktivácia.

Väčšina lipáz prejavuje interfaciálnu aktiváciu ako výsledok konformačného preskupenia príklopu, ktorá pokrýva aktívne centrum v uzavretej forme enzýmu. Príklop sa pohne stranou po väzbe micel a tak generuje otvorenú formu, v ktorej sú katalytické zvyšky exponované voči substrátu. Rôntgenová kryštalografia poskytla mnohopočetné príklady tohto aktivačného mechanizmu určením štruktúr lipáz v obidvoch formách, uzavretej a otvorenej, v prípade posledne menovanej kryštalizované z najväčšej časti v prítomnosti inhibítorov (Cygler a Schrag a spol., 1997). Je pravdepodobné, že interfaciálny aktivačný mechanizmus CPLA2 je porovnateľný v iných príklop obsahujúcich lipázach v tom, že pohybovanie príklopu je kľúčový stupeň na zväčšenie prístupnej oblasti povrchu lievikovitého aktívneho centra, rovnako ako na poskytnutie nebráneného prístupu ku katalytickým zvyškom.

e r

Aktívne centrum CPLA2 obsahuje katalytickú dvojicu

Hydrolýza acylov α/β hydrolázami je uskutočňovaná katalytickou triádou (Ser-Asp/Glu-His) pripomínajúcou jednu v serínových proteázach z prítomných. Acylesterová väzba v substráte je atakovaná nukleofilným serínom za vzniku kovalentne viazaného intermediátu acyl-enzým, ktorý je potom uvoľnený v stupni, ktorý zahrnuje atak molekuly vody. Aj keď všetky lipid metabolizujúce enzýmy s α/β stočením hydrolázy prebiehajú s využitím katalytickej triády, identifikácia všetkých členov takejto triády u cPLA₂ sa ukazuje byť náročnou úlohou. Polohovo zameraná mutagenéza vykonaná Sharpom a spolupracovníkmi (1994) stanovila úlohu Ser228 a Asp549 pri katalýze; zlyhanie každého z 19 histidínových zvyškov pri ovplyvnení aktivity však poukázalo na nový katalytický mechanizmus (Pickard a spol., 1996). Tieto pozorovania viedli k predpokladu, že cPLA₂ obsahuje nové katalytické centrum, ktoré nevyžaduje participáciu histidínu, pretože významnosť Arg200 pre aktivitu zostáva neznáma (Leslie, 1997; Pickard a spol., 1996).

Rôntgenová kryštálová štruktúra cPLA jasne odhaľuje aktívne centrum, v ktorom Ser228 sedí na spodku lievikovito tvarovanej dutiny; Οδ2 v Asp549 leží vo vzdialenosti 2,9 Ä od jeho Ογ atómu (Obr. 5b). Je však jasné, že aktívne centrum cPLA₂ postráda histidínový zvyšok. Okrem toho nie sú v rozsahu 6 Ä žiadne iné zvyšky, ktoré by mohli v aktívnom centre plniť funkciu bázy. Všetky polárne príspevky v rozsahu 3,5 A od každého zo zvyškov sú vytvárané skupinami v reťazci chrbta alebo osamotenou molekulou vody umiestenou 3,2 A vzdialenou od Οδΐ v Asp549. Aj keď Asn555 lemuje lievik aktívneho centra, jeho Νδ2 atóm je vzdialený približne 6 é od ka±dČho z rezíduí a nebol by ideálnym kandidátom na plnenie tejto funkcie.

Po ataku na s/í-2-polohu glycerofosfolipidického substrátu vyžaduje tranzitný stav u acylhydroláz stabilizáciu oxyaniónovým otvorom alebo sústavou donorov vodíkových väzieb (obvykle amidových atómov) a/alebo bázickými zvyškami s funkciou stabilizovať rozvoj negatívneho náboja tranzitného stavu. U niektorých Iipáz najmenej jeden zo zvyškov, ktoré prispievajú do oxyaniónového otvoru, je súčasťou pohyblivej slučky a vhodná konformácia je dosiahnu tá, len keď je lipáza otvorenej formy; toto usporiadanie nie je však absolútnou požiadavkou. Glyl97 a 198 v CPLA2 sú súčasťou na glycín bohatej slučky medzi β4 a Helixom B; toto umiestenie dovoľuje, že amidové skupiny Gly 197 a Gly 198 sú dobrými uchádzačmi na členy preformovaného oxyaniónového otvoru (viď Obr. 5b). Okrem toho amidová skupina GIy229 v reťazci chrbta, ktorá je na vrcholu otáčky medzi β5 a Helixom C, smeruje tiež do smeru slučky Gly 197, a preto môže byť tiež súčasťou otvoru. Preto sa teda táto oblasť, takmer ako oxyaniónový otvor v chymotrypzíne, ukazuje ako dobre určená na stabilizáciu tetrahedrálneho intermediátu vznikajúceho nukleofilným atakom esteru.

Pre Arg200 bolo navrhnuté veľké množstvo úloh. Bol implikovaný do poskytovania podpory pre CaLB vo viazaní enzýmu k lipidovému rozhraniu; pre interakciu s fosfolipidovou membránou; pre participáciu ako katalytický zvyšok; pre stabilizáciu acylenzýmového intermediátu; alebo asociáciu s fosforylovou skupinou fosfolipidového substrátu (Pickard a spol., 1996). Umiestenie Arg200 vo vnútri lievikovitej dutiny (oblasť jej povrchu je na Obr. 5a vyfarbená červeno), mu zabraňuje poskytovať akúkoľvek podporu viazaniu lipidu na CaLB. Okrem toho jeho postranný reťazec je vzdialený asi 9 Ä od serínu v aktívnom centre a to mu bráni v hraní úlohy pri katalýze. Avšak Arg200 tvorí niekoľko kľúčových kontaktov so zvyškami okolo lievikovitej časti aktívneho centra. Postranný reťazec vytvára soľný mostík s Thr680 a kontaktuje atómy Phe678 reťazca chrbta, z ktorých obidva ležia v slučke medzi helixami H a I. Umiestenie Arg200 na slučke oxyaniónového otvoru naznačuje, že nedostatok týchto dvoch vodíkových väzieb v mutante Arg200 Lys, publikovaný Pickardom a spolupracovníkmi (1996), by mohol byť zodpovedný za jemné alterácie v konformácii slučky oxyaniónového otvoru s dramatickými dôsledkami pre aktivitu.

r 17

Katalýza s cPL'Až prebieha mechanizmom odlišným od mechanizmu iných acylhydroláz

Absencia histidínového zvyšku alebo ktorejkoľvek inej potenciálnej bázy v aktívnom centre CPLA2 nasvedčuje, že enzým podnecuje hydrolýzu acylov novým katalytickým mechanizmom. V serinových proteázach aj iných hydrolázach prijíma histidínový zvyšok protón od hydroxylovej skupiny reaktívneho serínu a tak uľahčuje vytvorenie kovalentného tetraedrálneho intermediátu. V druhom stupni je intermediát acyl-enzýmu hydrolyzovaný molekulou vody, aby sa uvoľnil produkt obnovujúci v enzýme serínový hydroxyl. Trieda A TEM-1 β laktamázy, ktorej katalytická cesta zahrnuje takisto acyláciu serínu v aktívnom centre nasledovanou hydrolýzou esterovej väzby, transferuje protón z Ser70 v aktívnom centre na karboxylátovú skupinu u Glul66 buď priamo (Gibson a spol., 1990) alebo cestou molekuly vody (Lamotte-Brasseur a spol., 1991). Súčasnejšie štúdie (Damblon a spol., 1996) naznačili, že dlhá vzdialenosť medzi karboxylátovými kyslíkmi Glul66 a Ser70 zabraňuje priamemu transferu protónu, avšak pre prenos protónu ponúkajú participáciu premosťujúce molekuly vody. V katalytickom mechanizme penicilínovej acylázy (Duggleby a spol., 1995), ktorá obsahuje jednotný zvyšok katalytického centra zložený z Nterminálneho serínu, premosťujúca molekula vody sprostredkováva bázický charakter α-aminoskupiny Ser 1. Ako dôsledok má Ογ atóm Serl svoju nukleofilitu dostatočne zvýšenú terminálnou aminoskupinou a vytvorenie intermediátu acyl-enzýmu nasleduje.

V CPLA2 jediným zvyškom schopným hrať úlohu generálnej bázy je Asp549, pretože tam nie sú iné postranné reťazce v okruhu 3,5 Á od Ογ áámu v Ser228. Obr. 6 ukazuje model navrhovaný pre katalytický mechanizmus CPLA2. Akonáhle sa enzým naviaže na membránu, viaže sa na aktívne centrum jednotlivá molekula fosfolipidu. Fosfátová časť čelnej skupiny (HG na Obr. 6) je stabilizovaná postranným reťazcom Arg200. Oxyaniónový otvor vytvorený amidovými skupinami Gly 197 v reťazci chrbta a Gly 198 tiež vykazuje polarizáciu sn-2-esteru a stabilizáciu tetraedrálneho intermediátu utvoreného v panely B. Po vytvorení komplexu enzým-substrát pôsobí Asp549 ako katalytická báza a abstrahuje protón z hydroxylovej skupiny reaktívneho Ser228, ktorý a18 takuje sn-2-ester a tvorí acyl-enzým cestou stabilizovaného tetraedrálneho intermediátu. Acyl-enzým je potom hydrolyzovaný molekulou vody (panel C), aby poskytol voľný lyzo-fosfolipid a po kolapse dvojnásobnej väzby arachidonylového intermediátu, voľnú arachidónovú kyselinu (AA na Obr. 6; panel D a E). CPLA2 môže potom disociovať od rozhrania membrány alebo viazať iný fosfolipidový substrát a cyklus zopakovať. Je teda CPLA2 tretím odlišným príkladom acylázy, ktorá využíva nukleofilný serín bez kompletnej katalytickej triádyDiskusia

Navzdory veľkej asymetrickej jednotke (1498 aminokyselín) a krehkosti kryštálov CPLA2, bolo MAD fázovanie úspešné na vytvorenie vysoko kvalitnej mapy elektrónovej hustoty z údajov získaných z monokryštálu. Hlavné pre tento úspech boli veľké Bijvoet-ové a dispersívne diferencie typické pre L_m hranu atómu lantanoidu, spojenú s vysokým tokom a stabilitou vlnových dĺžok u Advanced Light Source (Berkeley, CA). S príchodom synchrotrónov tretej generácie by MAD mala byť rutinne používaná na riešenie štruktúr veľkých makromolekúl.

CPLA2 je nevyhnutná pre biosyntézu Iipidových mediátorov zápalu, ako bolo dokázané využitím myší nemajúcich dostatok CPLA2 (Bonventre a spol., 1997; Uozumi a spol., 1997). Pretože leukotriény, prostaglandíny a PAF hrajú významné úlohy v patofyziológii chorôb majúcich závažný všeobecný dosah, je nevyhnutnou požiadavkou porozumieť, ako je ich biosyntéza regulovaná. Štruktúra CPLA2 poskytuje nové pohľady na pôvod arachidonylovej selektivity a reguláciu vplyvom fosforylácie. Mimo to identifikuje u lipáz ako nové stočenie tak mechanizmus. Štruktúra CPLA2 je len druhá, v ktorej je možné vidieť C2 doménu v kontexte s celkovým proteínom. Výrazné rozdiely je možné vidieť medzi PLCÔl a cPLA₂.

Zavinutie cPLÄ2 ukazuje jasne, že enzým sa skladá z dvoch nezávisle stočených domén. Tento výsledok nebol neočakávateľný na základe predchádzajúcej práce, v ktorej CaLB a katalytické domény boli úplne funkčné, keď boli nezávisle exprimované. Avšak čo bolo prekvapujúce, bol riedky kontakt a potenciálna flexibilita medzi doménami. Aj keď C2 domény sú obvykle pozorované pri označovaní molekúl, bolo až doposiaľ publikované len, že v súvislosti s katalytickou doménou je v kryštálovej štruktúre PLCôl prítomná C2 doména (Essen a spol., 1996). V tomto prípade existujú extenzívne hydrofóbne kontakty medzi takmer celým povrchom čela C2 domény a katalytickou doménou. Na rozdiel od toho interakcie medzi katalytickou a CaLB doménami u cPLA₂ sú dostatočne obmedzované, pretože konformácia polypeptidu spojujúceho dve, v rozdielnych monoméroch asymetrické jednotky, sú odlišné. Toto pozorovanie má mechanistický význam v tom, že optimálna orientácia CaLB a katalytických domén nie je fixovaná, ale miesto toho môže byť istým spôsobom regulovaná. Je zaujímavé zaznamenať, že aj keď je rozrušená oblasť proteínu vrátane Ser505, ktorá je podstatná pre optimálnu aktivitu v bunkách, je toto dôležité miesto MAP-kinázy lokalizované blízko oblasti závesu.

I

Podrobné porovnávanie štruktúry cPLA₂ a klasického zvinutia α/β hydrolázy dokazuje, že cPLA₂ má novú topológiu. Avšak, ako bolo skôr poznamenané, β stočenie obsahujúce serín v aktívnom centre je štruktúrne analogické nukleofilnému kolenu zvinutie α/β hydrolázy. Kritický prieskum katalytickej domény cPLA₂ vykazuje rozšírenú oblasť homológie medzi PLBs a cPLA₂ α,β, a γ, ktorá zahrnuje zvyšky ~ 190-232. Táto homológia má funkčnú dôležitosť v tom, že obsahuje Arg200; oblasti hlavného reťazca obsahujúce oxyaniónový otvor rovnako ako nový motív CXSXS lipázy, v ktorom druhý serín nahradzuje klasický glycín. Táto koncentrácia homológie na krátkom úseku je vysvetľovaná tiež génomickou štruktúrou, kde sú tieto zvyšky zakódované jediným exónom (ktorý zodpovedá zvyškom 186-238).

Miesto obsahu katalytickej triády Ser, His, Asp/Glu, ktorú je možné nájsť v α/β hydrolázach, štiepi cPLA₂ 5n-2-ester za využitia diády zloženej zo Ser228 a Asp549. Karboxylát v Asp549 je k aktivácii serínu pre nukleofilný atak jediným zvyškom v dostatočne tesnej blízkosti. Podobná katalytická diáda bola navrhnutá pre hydrolytickú reakciu amidu katalyzovanú triedou A βlaktamáz (Matagne a spol., 1998). V tomto prípade však postranný reťazec glutamátu aktivuje serínový zvyšok cez intervenujúcu molekulu vody. Aj keď je ťažké zhodnotiť porovnateľnú efektivitu diády versus triáda, je pozoruhodné, že to je na dosiahnutie tranzitného stavu potrebná aktivačná energia, ktorá je u katalýzy dôležitá. Preto teda stabilizácia vďaka efektívnemu oxyaniónovému otvoru môže vykompenzovať menej nukleofilný serín. V tejto kryštálovej štruktúre amidové skupiny glycínov 197 a 198 v hlavnom reťazci, umiestené len dva zvyšky od kritickej Arg200, sú vhodne umiestené, aby pôsobili ako oxyaniónový otvor. NH u Gly229 v hlavnom reťazci by mohla možno tiež pomôcť ku stabilizácii oxyaniónu vytvárajúceho sa v tranzitnom stave a prítomného v tetraedrických intermediátoch. Efektivita oxyaniónového otvoru je konzistentná s NMR štúdiami, kde sa ukazuje, že sa arachidonyl-trifluórmetylketón viaže na enzým ako ionizovaný hemiketal.

Katalytický serín v cPLA₂ je prítomný v hlbokej lievikovitej dutine blízko centra katalytickej domény. Pokusy modelovať fosfolipid do aktívneho centra ukázali, že bežná konformácia lievika aktívneho centra nebola dostatočne veľká. Preto teda navrhujeme, že trochu mobilný príklop, ktorého C-zakončenie je spojené s neusporiadaným úsekom 23 aminokyselín, sa po naviazaní membrány môže pohybovať a tak poskytne väčší prístupný priestor blízko vrcholu lievika na prispôsobenie substrátu. Kryštálové štruktúry pankreatickej lipázy/kolipázy ako v prítomnosti tak neprítomnosti substrátu/micel detergentu poskytujú precedens pre tento model (van Tilbeurgh a spol., 1993). V tomto prípade dochádza k dramatickej zmene konformácie v prítomnosti micel alebo inhibítorov majúcej za následok pohyb príklopu až na 29 Ä, aby sa exponovala aktívna štrbina a hydrofóbna časť. Tak veľké štruktúrne modifikácie boli zaznamenané u ďalších proteínov α/β hydrolázy. Tieto konformačné zmeny po naviazaní povrchu membrány boli využité na vysvetlenie procesu interfaciálnej aktivácie, pri ktorom katalytická aktivita lipázy je v rádoch väčšia voči substrátom prítomným vo forme micel než ako monomér.

V prípade CPLA2 bola jej lyzofosfolipáza využitá na porovnanie jej aktivity voči tomu istému substrátu prítomnému buď ako monomér alebo ako súčasť micely. Takéto merania odhalili, že aktivita cPLA₂ vzrastá ~ 1500-krát, zatiaľ čo u 1-palmitoyl-2-lyzofosfatidylcholínu vzrastá len 10-krát; cPLA₂ je teda omnoho viac aktívna voči substrátom prítomným v plošnej forme. Naša štruktúra nasvedčuje, že konformačná zmena diktovaná pohybom flexibilného príklopu nastáva po naviazaní membrány; toto pozorovanie je konzistentné so skôr pozorovanou interfaciálnou aktiváciou.

Okrem pohybu príklopov kryjúcich aktívne centrá niektoré štruktúry ukázali, že oxyaniónový otvor, ktorý stabilizuje tranzitný stav, je úplne sformovaný len v prítomnosti viazaného substrátu alebo inhibitora (Cygler a Schrag, 1997). Výnimkou z tohto všeobecného pravidla je kutináza v tom, že oxyaniónový otvor je úplne sformovaný v natívnej štruktúre. Je dôležité, že kutináza nevykazuje interfaciálnu aktiváciu (Martinez a spol., 1992).

Selektivita CPLA2 pre arachidonyl obsahujúci fosfolipidy je charakteristickým rysom. sPLA₂ s nízkou molekulovou hmotnosťou nerozlišujú medzi rôznymi mastnými kyselinami, zatiaľ čo cPLA₂ v mnohých analytických štúdiách vykazuje vysokú selektivitu pre arachidonyl a iné mastné kyseliny s cisI dvojnásobnými väzbami v polohách 5 a 8 (Clark a spol., 1995; Gelb aasn-1 a sn-2, Gelb hydrazín). Pred určením štruktúry bol pôvod selektivity cPLA₂ neznámy. Bolo predstaviteľné, že katalytický systém bol lokalizovaný blízko povrchu enzýmu, kde mohol pôsobiť na sn-2 ester bez extrahovania lipidu z dvojvrstvy. Ten by bol analogický k vyrovnanej kinázovej doméne u PI4 kinázy, kde sa má za to, že enzým účinkuje na čelnú skupinu lipidu bez extrahovania samotného fosfolipidu (Rao a spol., 1998). V prípade cPLA₂ by sme predpokladali, že selektivita bude vďaka väčšej expozícii sn-2 esteru vzhľadom na voľný obal polynenasýtených mastných kyselín. Avšak ako vidíme v štruktúre, fosfolipid sa musí viazať ~ 8-10 Ä hlboko do aktívneho centra. Selektivita musí byť teda zapríčinená interakciami medzi arachidonylovým podielom a enzýmom. Aby sa stanovili rozdiely v selektivite bude informatívne mutovať zvyšky, ktoré sa líšia medzi a a γ cPLA₂ a to v aktívnom centre a nekompletné zachované oblasti príklopu.

f

Preferované metódy podávania a dávkovania substancií identifikovaných podľa vynálezu

Tu používaná aktivita enzýmu fosfolipázy znamená aktivitu v teste na metabolizmus fosfolipidov (najlepšie jeden z testov opísaných v príklade 2 nižšie alebo opísaných v niektorom z tu uvedených odkazov). Zlúčenina má aktivitu inhibujúcu enzým fosfolipázy, keď inhibuje aktivitu fosfolipázy (najskôr CPLA2) pri ktoromkoľvek vhodnom teste na enzýmovú aktivitu (najlepšie test opísaný nižšie v príklade 70). Pri preferovaných uskutočneniach má zlúčenina (1) hodnotu IC50 menšiu než okolo 25 μΜ v LysoPC teste; (2) hodnotu IC50 menšiu než okolo 50 μΜ pri vačkovom teste a/alebo (3) hodnotu IC50 menšiu než okolo 1 μΜ pri PMN teste.

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu a ursólová kyselina sú platné na inhibíciu aktivity enzýmu fosfolipázy (najskôr CPLA2) a sú teda užitočné pri liečení (tj. liečbe, prevencii alebo zlepšovaní) zápalových alebo so zápalom príbuzných stavov (napr. reumatoidná artritída, psoriáza, astma, zápalové črevné ochorenie a ďalšie ochorenia sprostredkovávané prostaglandínmi, leukotriénmi alebo PAF) a ďalších stavov ako je osteoporóza, kolitída, myelogénna leukémia, diabetes, suchoty a ateroskleróza.

Predkladaný vynález zahrnuje ako farmaceutické kompozície tak terapeutické metódy liečenia alebo využitia, kedy sa požívajú zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu.

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byť používané vo farmaceutickej kompozícii v kombinácii s farmaceutický prijateľným nosičom. Takáto kompozícia môže obsahovať tiež (okrem zlúčeniny alebo zlúčenín podľa predkladaného vynálezu a nosiča) riedidla, plniva, soli, pufry, stabilizátory, solubilizátory a ďalšie materiály, ktoré sú v praxi odboru bežné. Termínom farmaceutický prijateľný sa rozumie netoxický materiál, ktorý neinterferuje s efektivitou biologickej aktivity účinnej ingrediencie(í). Charakteristika nosiča bude závisieť na ceste podávania. Farmaceutická kompozícia podľa vynálezu môže obsahovať tiež cytokíny, lymfokíny alebo iné hematopoetické faktory ako M-CSF, GM-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10.

• *

IL-11, IL-12, G-CSF, Meg-CSF, kmeňový bunkový faktor a erytropoetín. Farmaceutická kompozícia môže ďalej obsahovať iné protizápalové prostriedky. Takéto prídavné faktory a/alebo prostriedky môžu byť zahrnuté do farmaceutickej kompozície, aby vyvolali synergetický účinok so zlúčeninami podľa predkladaného vynálezu, alebo aby minimalizovali vedľajšie účinky spôsobené zlúčeninami podľa predkladaného vynálezu. Naopak zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byť zahrnované do formulácií jednotlivého cytokínu, lymfokínu, ďalšieho hematopoetického faktoru, trombolytického alebo antitrombolytického faktoru alebo protizápalového prostriedku na eliminovanie vedľajších efektov, cytokínu, lymfokínu, ďalšieho hematopoetického faktoru, trombolytického alebo antitrombolytického faktoru alebo protizápalového prostriedku.

Farmaceutická kompozícia podľa vynálezu môže byť vo forme lipozómu, v ktorom sú zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu, okrem ďalších farmaceutický prijateľných nosičov, spolu s amfipatickými prostriedkami ako lipidy, ktoré existujú v agregovanej forme ako micely, nerozpustné monovrstvy, kvapalné kryštály alebo lamelárne vrstvy vo vodnom roztoku. Vhodné lipidy pre lipozomálne formulácie bez obmedzenia predstavujú monoglyceridy, diglyceridy, sulfatidy, lyzolecitín, fosfolipidy, saponín, žlčové kyseliny a podobne. Príprava takých lipozomálnych formulácií zodpovedá úrovni skúseností v odbore, ako je opísané na príklad v U. S. patente č. 4 235 871; U. S. patente č. 4 501 728; U. S. patente č. 4 837 028 ; U. S. patente č. 4 737 323, a na všetky sa tu odkazuje.

Tu používaný termín terapeuticky účinné množstvo znamená celkové množstvo každej účinnej zložky farmaceutickej kompozície alebo metódu, ktorá je dostatočná, aby preukázala u pacienta významný prospech, tj. pri liečení, hojení, prevencii alebo zlepšovaní protizápalovej odozvy alebo stavov alebo zvýšenie rýchlosti pri liečení, hojení, prevencii alebo zlepšovaní takýchto stavov. Keď je jednotlivcovi aplikovaná účinná ingrediencia a podávaná samotná, vzťahuje sa termín len na túto ingredienciu. Ak je aplikovaná kombinácia, vzťahuje sa termín na spojené množstvá účinných ingrediencií, ktorých výsled24 kom je terapeutický efekt, nech už sú podávané v kombinácii, po sebe alebo simultánne.

Pri praktikovaní spôsobu ošetrovania alebo využitia podľa predkladaného vynálezu sa cicavcovi v stave, ktorý má byť ošetrovaný, podáva terapeuticky účinné množstvo zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu. Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byť aplikované v súlade so spôsobom podľa vynálezu buď samotné, alebo v kombinácii s ďalšími terapiami ako liečbou využívajúcou iné protizápalové prostriedky, cytokíny, lymfokíny alebo ďalšie hematopoetické faktory. Ak dochádza ku spoločnej administrácii s jedným alebo viacerými protizápalovými prostriedkami, cytokíny, lymfokíny alebo ďalšími hematopoetickými faktormi, môžu byť zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu podávané buď súčasne s ďalším(i) protizápalovým()i prostriedkam(i), cytokínom(i), lymfokínom(i) alebo ďalším(i) hematopoetickým(i) faktorom(i), trombolytickými alebo antitrombolytickými prostriedkami alebo podávané postupne. Pokiaľ sú podávané postupne, bude o poradie podávania zlúčenín podľa vynálezu v kombinácii s ďalším(i) protizápalovým()i prostriedkom(i), cytokínom(i), Iymfokínom(i) alebo ďalším(i) hematopoetickým(i) faktorom(i), trombolytickými alebo antitrombolytickými prostriedkami rozhodovať ošetrujúci lekár.

Podávanie zlúčenín podľa vynálezu použitých vo farmaceutickej kompozícii, alebo praktikovanie metódy podľa vynálezu, môže byť vykonávané skupinou konvenčných spôsobov ako orálnym užívaním, inhaláciou alebo kutánne, subkutánne či intravenózne injekciou.

Keď je terapeuticky účinné množstvo zlúčenín podľa predkladaného vynálezu aplikované orálne, budú zlúčeniny podľa vynálezu vo forme tablety, kapsule, prášku, roztoku alebo tinktúry. Pri podávaní vo forme tabliet môže farmaceutická kompozícia podľa vynálezu dodatočne obsahovať pevný nosič ako želatínu alebo adjuvant. Tableta, kapsula a prášok obsahujú okolo 5 % až 95 % zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu a najlepšie 25 % až 90 % zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu. Keď sa podáva v kvapalnej forme môže byť pridaný kvapalný nosič ako voda, petrolej, oleje rastlinného pôvodu ako podzemnicový olej, minerálny olej, sójový olej alebo sezamový olej či syntetické oleje. Kvapalná forma farmaceutickej kompozície môže ďalej obsahovať fy ziologický soľný roztok, dextrózu alebo roztok iného sacharidu, alebo glykoly ako etylénglykol, propylénglykol alebo polyetylénglykol. Keď sa podáva v kvapalnej forme obsahuje farmaceutická kompozícia od okolo 0,5 % až do 90 % hmotnosti zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu a najlepšie od okolo 1 % do 50 % zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu.

Ak sa terapeuticky účinné množstvo zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu podáva intravenózne, kutánne alebo subkutánne injekciou, budú zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu vo forme parenterálne prijateľného vodného roztoku bez pyrogénov. Príprava takýchto parenterálne prijateľných roztokov proteínov s ohľadom na pH, izotonicitu, stabilitu a podobne, patrí k znalostiam vo vednom odbore. Preferovaná farmaceutická kompozícia pre intravenóznu, kutánnu alebo subkutánnu injekciu by okrem zlúčenín podľa predkladaného vynálezu mala obsahovať izotonické vehikulum ako injekčný chlorid sodný, Ringer-ovu injekciu, injekčnú dextrózu, injekčnú dextrózu a chlorid sodný, laktatizovanú Ringer-ovu injekciu a ďalšie vehikula, ktoré sa v odbore používajú. Farmaceutická kompozícia podľa predkladaného vynálezu môže tiež obsahovať stabilizátory, konzervačné prostriedky, pufry, antioxidanty alebo ďalšie aditíva, ktoré sú odborníkom známe.

Množstvo zlúčenín(y) podľa predkladaného vynálezu vo farmaceutickej kompozícii podľa predkladaného vynálezu bude závisieť na povahe a závažnosti stavu, ktorý má byť ošetrovaný a na povahe skorších ochorení, ktoré pacient podstúpil. O množstve zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu, s ktorým má byť ošetrovaný každý jednotlivý pacient, bude nakoniec rozhodovať ošetrujúci lekár. Spočiatku bude ošetrujúci lekár predpisovať nízke dávky zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu a pozorovať odozvu u pacienta. Väčšie dávky zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byť podávané dokiaľ nie je u pacienta dosiahnutý optimálny terapeutický účinok a od tohto bodu sa dávkovanie ďalej nezvyšuje. Uvažuje sa, že rôzne farmaceutické kompozície používané k praktikovaniu metódy podľa predkladaného vynálezu by mali obsahovať okolo 0,1 pg až okolo 100 mg (skôr okolo 100 pg až okolo 50 mg, najlepšie 100 pg až okolo 5 mg) zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu na kg telesnej hmotnosti.

e r

Trvanie intravenóznej terapie pri použití farmaceutickej kompozície podľa predkladaného vynálezu bude kolísať v závislosti na liečenej chorobe a stavu a potenciálnej idiosynkratickej odozve každého jednotlivého pacienta. Uvažuje sa, že trvanie každej aplikácie zlúčenín podľa predkladaného vynálezu bude v rozsahu 12 až 24 hodín kontinuálnej intravenóznej aplikácie. O primeranom trvaní intravenóznej terapie pri použití farmaceutickej kompozície podľa predkladaného vynálezu bude nakoniec rozhodovať ošetrujúci lekár.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1. Experimentálna mapa vytvorená s MAD fázami získaná rozptylom Tb atómu na 749 zvyškov CPLA2. Na vytvorenie mapy bolo použité vyrovnanie rozpúšťadla (obsah rozpúšťadla 60 %) a dvojnásobné priemerovanie nekryštalografickej symetrie v DM.

Obr. 2 (A) . Páskový diagram monoméru cPLA₂. CaLB doména je uvedená zeleno s dvoma Ca²⁴ atómami vyobrazenými červene. Štruktúra čiapočky u cPLA₂ je sfarbená purpurovo. Pohyblivé slučky s nízkou elektrónovou hustotou sú zobrazené čiarkované. Flexibilný spojovací článok medzi CaLB a katalytickou doménou je sfarbený červeno. Uvedené sú tiež polohy 4 serínových zvyškov, ktoré sú v cPLA₂ fosforylované. Obrázok bol vytvorený s Molscript (Kraulis, 1991) a RASTER3D (Bacon a Anderson, 1998).

(B) . GRASP diagram povrchu cPLA₂. Zvyšky, ktoré vykazujú N^1S/NH posuny po interakcii s micelami dodecylfosfocholínu pri NMR experimentoch podľa Xu a spol. (1998) sú vyfarbené červeno. Aktívna štrbina u cPLA₂ je zobrazená červeno. Rezídua príklopu boli kvôli jasnosti odstránené.

(C) . Znázornenie povrchového potenciálu cPLA₂ s bázickými zvyškami v modrých odtieňoch a kyslými zvyškami červeno. Rezídua príklopu boli kvôli jasnosti odstránené. Vysoko bázický úsek je jasne viditeľný vo väzbovej ob27 lasti membrány. Obrázok bol vytvorený s GRASP (Nicholls, 1992). Všetky náhľady majú rovnakú orientáciu.

Obr. 3 (A) . Richardsonovo zobrazenie kanonického stočenia α/β hydrolázy. β pramene sú zobrazené ako šípky, zatiaľ čo a helixy sú obdĺžniky. Číslovanie sekundárnych štruktúrnych elementov je podľa prehľadu Schraga a Cyglera (1997). Helic C, ktorý nasleduje bezprostredne po nukleofilnom kolene je sfarbený ružovo.

(B) . Richardsonov diagram stočenia cPLA₂. Schéma číslovania bola zostavená tak, že helix bezprostredne nasledujúci po Ser288 je Helix C ako u kanonického stočenia α/β hydrolázy. Centrálne jadro je sfarbené žlto kvôli ľahšiemu porovnávaniu s kanonickým stočením α/β hydrolázy u (A). Elementy skladajúce čiapočku sú sfarbené purpurovo; oblasti slučky v červenej farbe sú vysoko mobilné a nevykazujú vystopovateľnú elektrónovú hustotu.

Obr. 4. Primárne zoradenie cPLA₂ α, β a y. Identické zvyšky sú v plných rámčekoch, zatiaľ čo sekundárne štruktúrne elementy pozorované v rontgenovej kryštálovej štruktúre cPLA₂ a sú označené pod sekvenciami. Sekundárne štruktúrne elementy mimo oblasť čiapočky sú uvedené žlto, zatiaľ čo v oblasti čiapočky sú uvedené v purpurovej farbe. Čierne linky predstavujú oblasť otáčok alebo slučiek. Zvyšky neoznačené čiernymi linkami alebo sekundárne štruktúrne elementy nevykazujú vystopovateľnú elektrónovú hustotu.

Obr. 5 (A). Povrchový diagram ukazujúci katalytickú doménu cPLA₂ krytú zvyškami čiapočky. Ser228 je ukázaný na spodku lievikovitého tvaru. Pokračovanie sekvencie, ktorá na experimentálnej mape nie je viditeľná, je predstavované červenými bodkami a predpokladá sa, že sa podieľajú na vytvorení závesu príklopu. Rezídua, v ktorých mapách elektrónovej hustoty sú viditeľné len atómy hlavného reťazca chrbta, sú zobrazené ako alaníny. Odkryté povrchy všetkých hydrofóbnych zvyškov sú vyfarbené modro a zvyšok Arg200 bol vyfarbený červeno. Obrázok bol vytvorený s GRASP (Nicholls, 1992).

(B). Detail aktívneho centra cPLA₂ v polomere 7 Ä okolo Ser228. Dva zvyšky zúčastňujúce sa priamo pri katalýze sú sfarbené zeleno. Arg200 a slučka skrývajúca v sebe zvyšky Glyl97 a Glyl98 sú sfarbené žlto. Jediná molekula vody viditeľná v experimentálnej mape s vodíkovými väzbami sa viaže s Asp549 a karbonylovými atómami u Trp393 a Trp330. Obrázok bol vytvorený s Molscript a RASTER3D.

Obr. 6. Katalytický mechanizmus navrhnutý pre cPLA₂ zahrnujúci atak Ser228 na sn-2 polohu glycerofosfolipidického substrátu. AA: arachidónová kyselina; HG: skupina na vrchole; C18: oktadecylová skupina. Gly 197 a Gly 198 sú navrhnuté ako súčasť oxyaniónového otvoru, zatiaľ čo Arg200 stabilizuje fosfátový podiel skupiny na vrcholu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Produkcia proteínu, kryštalizácia a zber údajov

Ľudská cPLA₂ kompletnej dĺžky (zvyšky 1 - 749) bola klonovaná na vektor pMT2-EMC-cPLA₂ a transfektovaná do CHO buniek. Vzniknutý rad buniek ES-CHO bol pestovaný v a médiu (Gibco) obsahujúcom 10 obj. % dialyzovaného teľacieho plodového séra a 10 μΜ metotrexátu ako opísal Lin a spol. (1992). Bunkové pelety boli typicky lýzované v pufry pH 9,0 a cPLA₂ v supernatante bola následne zrážaná pomocou (NH4)₂SC>4. Viacpočetné kroky vrátane afinitnej a gélovej permeačnej chromatografie poskytli vzorky proteínu, ktoré boli vhodné na kryštalizačné experimenty. Typický výťažok zo 100 g peliet by bol 15-25 mg čistej cPLA₂.

Kryštály cPLA₂ boli získaní difúziou pár pri 18 °C s použitím PEG 1000 ako precipitantu pri 12 mg/ml proteínu. Cez noc sa objavili typicky doštičkovité kryštály a v priebehu jedného týždňa pokračovali v raste do maximálnej veľkosti 0,6 mm x 0,5 mm x 0,1 mm. Natívny a ťažkým atómom nasiaknuté r r kryštály boli podrobené kryoprotekcii prenosom do vzrastajúcich množstiev PEG 400 a DMSO. Kryštály modifikované ťažkým atómom boli pripravené nasakovaním natívnych kryštálov cez noc v kryoroztoku s CaCh nahradeným 250 mM GdCh alebo TbCh- Kryštály po kryoprotekcii boli pred zberom údajov bleskovo ochladené v prúde kvapalného dusíka pri 100 K.

Difrakčné údaje natívneho, Gd- a Tb-nasiaknutých kryštálov bola snímaná pri smere lúča 5.0.2 na Advanced Light Source za použitia Quantum 4 CCD detektora (Area Detector Systems). Vzhľadom na citlivosť kryštálu bolo prvé zobrazenie každého dátového súboru analyzované pomocou STRATEGY (R. Ravelli) v snahe spočítať minimálne množstvo získaných dát potrebných pre kompletný dátový súbor. Po stanovení optimálneho východiskového bodu boli dáta snímané počas 90° rozmetania, po ktorom boli kryštály otočené do polohy o 180° proti východiskovému bodu a druhé 90°rozmetanie bolo realizované za účelom maximalizovania akumulácie Bijvoet-ovho páru. Kryštály začali prejavovať radiačnú citlivosť po približne 100° zberu dát, čo Činilo nutné posunovať ich pozdĺž rotačnej osi medzi zmenami vlnových dĺžok. Táto metodológia sa osvedčila ako úspešná v tom, že dáta získané pri troch rôznych vlnových dĺžkach vykazovala podobnú štatistiku. Všetky údaje boli zhromažďované pri 100 K a spracovávané s DENZO/SCALEPACK (Otwinowski, 1993).

Polohy ťažkého atómu - Obidve polohy Tb boli identifikované vizuálnym preskúmaním Patterson-ových máp pri využití difrakčných údajov snímaných na vrchole vlnovej dĺžky Tb L_m okraja, potvrdzujúcim výsledky z predchádzajúceho nižšieho rozlíšenia Tb a Gd dátových súborov zhromaždených z vlastného domáceho Raxis IV detektora (Molecular Structure Corp.). Rafinácia a fázovanie parametrov ťažkého atómu bolo uskutočnené pomocou SHARP (de la Fortelle a Bricogne, 1997). Modifikácia hustoty bola realizovaná pomocou SOLOMON (CCP4), ako sa v SHARP vykonáva. Vysoko kvalitná experimentálna 3,2 Ä mapa elektrónovej hustoty umožnila určenie polohy úplnej CaLB domény, práve tak ako počiatočný záznam a stanovenie sekvencie katalytickej domény (QUANTA). Táto procedúra uľahčila výpočet masky obsahujúcej oblasť proteínu, ktorá bola včlenená do ďalších výpočtov. Tie zahrnujú dvojnásobné priemerovanie nekryštalickej symetrie a extenziu fázy od 3,2 Ä do 2,5 é s pou±itím difrakčných údajov v DM (Cowtan a spol., 1996). Cykly kombinácie fázy a rafinácie boli vykonávané s REFMAC (Mushudov a spol., 1997) vytvárajúcim mapu, v ktorej môže byť rozpoznaná väčšina modelu vrátane centrálnych zvyškov flexibilného príklopu.

Vylepšenie- Cykly obnovovania rovnako ako spresňovanie polohových a termálnych parametrov pomocou XPLOR (Briinger, 1992b) boli použité na zdokonaľovanie modelu, ktorý bol podrobený simulovanému vylepšeniu ochladením (12 - 2,5 Ä), keď R-voľné kleslo pod 32 % (Briinger, 1992a). Nasledujúce štádia budovania modelu boli vykonávané za pomoci vynechania máp generovaných maximálne-možným vynechaním, ako sa uskutočňuje v BUSTER (Bricogne, 1993). Vylepšenie zahrnuje tiež jednotnú korekciu objemu rozpúšťadla (Bsol = 23,8 A²; ksol = 0,305 e/ij) a aplikáciu nekryštalografických symetrických obmedzení. Pri vylepšení boli použité všetky difrakčné údaje s F > 2,0 s výnimkou pre 10 % náhodne zvoleného testového súboru, ktorý bol použitý na výpočet R-voľné. Fo-Fc mapy boli použité na situovanie molekúl vody, ktoré boli umiestené na miestach, ktoré vykazovali hustotu > 3,0 σ a prejavovali primerané vzdialenosti vodíkových väzieb proteín-rozpúšťadlo bez stérických zábran. Finálny model obsahuje 1285 zvyškov (molekula A: 9-433, 456-500, 537-727) a 40 molekúl vody a vykazuje dobrú stereochémiu, s priemernou dĺžkou väzieb 0,010 A a 1,38°deviaciou väzbového uhla od ideálnej geometrie. Celková hodnota R-voľné je 29,7 % a za použitia difrakčných údajov medzi 12 a 2,5 Ä je hodnota R 24,3 %.

Rsym = Σ | Ih - < Ih > / Σ Ih, kde < Ih > je priemerná intenzita u ekvivalentov symetrie.

L separátne Friedelove páry.

Sila fazovama Σ | FH | / Σ | | F^istené ! Fyyp₀{jtané r r r

r * p « r

R = Σ | | F_o - F_c / Σ | F_o , kde R voľné je vypočítané z náhodne volených 10 % reflexií a R faktor je vypočítaný pre zvyšných 90 % reflexií (F > 2,0) použitých na rafináciu štruktúry.

Koordináty budú uložené u Brookhaven Protein Databank.

Príklad 2

Testy na aktivitu (a) V a č k o v ý test l-Palmitoyl-2-[C^l4]-arachidonyl-fosfotidylcholín (58 Ci/mmol) (finálna koncentrácia 6 μΜ) a 1,2-dioleyolglycerol (finálna koncentrácia 3 μΜ) boli zmiešané a vysušené v prúde dusíka. K lipidom bolo pridaných 50 mM Hepes pH 7,5 (2 x finálna koncentrácia lipidov) a suspenzia bola sonifikovaná 3 min. pri 4 °C. K suspenzii bolo pridaných 50 mM Hepes pH 7,5, 300 mM NaCl, 2 mM DTT, 2 mM CaCh a 2 mg/1 albumínu hovädzieho séra (BSA) (Sigma A7511) (1,2 x finálna koncentrácia lipidov). Typický test pozostával zo zmesi lipidov (85 μΐ), ku ktorej bol postupne po sebe pridávaný inhibítor (5 μΐ v DMSO) a CPLA2, 10 ng pre automatizovaný systém alebo 1 ng pre manuálne uskutočnenie, v 10 μΐ BSA pufry. Tento esej bol vykonávaný buď podľa nižšie opísaného protokolu manuálneho alebo automatizovaného testu.

(b) Esej s rozpustným substrátom (LysoPC) l-[C^l4]-Palmitoyl-2-hydroxyfosfotidyl-cholín (57 Ci/mmol) (finálna koncentrácia 4,4 μΜ) bol v prúde dusíka vysušený. Lipid bol resuspendovaný rozmiešaním s 80 mM Hepes pH 7,5, 1 mM EDTA (1,2 x finálna koncentrácia). Typický test pozostával zo suspenzie lipidu (85 μΐ), ku ktorej bol postupne po sebe pridávaný inhibítor (5 μΐ v DMSO) a cPLAj, 200 ng v 80 mM Hepes pH ŕ r r ^r r r e r r *

7,5, 2 mM DTT a 1 M EDTA. Tento test bol vykonávaný buď podľa nižšie opísaného protokolu manuálneho alebo automatizovaného testu.

(c) Automatizovaný test

Suspenzia lipidu a inhibítor boli vopred 7 min. inkubované pri 37 °C. Bol pridaný enzým a v inkubácii sa pokračovalo ďalších 30 min. Reakcia bola potom zrušená pridaním zmesi dekán/izopropylalkohol/trifluórctová kyselina (192 : 8 : 1 hmotnosť/objem, 150 μΐ). Časť vrstvy použitej na zrušenie (50 μΐ) prešla kolónou s Rainin Spheric-5 kremelinou (5 μ, 30 x 2,1 mm) pri elúcii zmesou heptán/metanol/TFA (97 : 3 : 0,1 obj./obj.) Úroveň [C^l4]-arachidónovej kyseliny bola analyzovaná pomocou in-line Radiomatic Flo-One/Beta počítač Packard).

(d) Manuálny test

Zmes lipidu, inhibítoru a enzýmu bola inkubovaná pri 37 °C 30 min. Reakcia bola zrušená pridaním zmesi heptán/izopropylalkohol/0,5 M kyselina sírová (105 : 20 : 1) obj./obj., 200 μΐ). Polovica vrstvy použitej na zrušenie bola nanesená na jednoúčelovú kolónu so silikagélom (Whatman SÍL., 1 ml) vo vákuu rôzne umiesťovanou nad scintilačnou nádobkou. Voľná [C^l4]-arachidónová kyselina bola eluovaná pridaním etyléteru (1 ml). Úroveň rádioaktivity bola meraná kvapalným scintilačným čítacom.

(e) P M N test

PMN boli izolované s použitím Ficoll-Hypaque podľa smerníc výrobcov. Bunky červených krviniek kontaminujúce PMN boli odstránené hypotonickou lýzou a PMN pelety boli raz premyté a resuspendované v Hanks-ovej pufrovanej soľanke pri koncentrácii 2 x 10⁶ buniek/ml. Bunky boli vopred inkubované s inhibítormi 15 min pri 37 °C a potom stimulované s 2 μΜ A23187. Keď bola monitorovaná produkcia LTBj ako miera inhibície cPLAi. bola reakcia prerur ” sená rovnakým objemom ľadovej, fosfátom pufrovanej soľanky. Centrifugáciou boli odstránené bunky a LTB4 prítomná v bunkovom supernatante, bola podľa smerníc výrobcov meraná za použitia testu blízkej scintilácie LTB₄, ktorý poskytuje Amersham. Keď bola monitorovaná produkcia arachidónovej kyseliny, bola reakcia zrušená metanolom obsahujúcom D8-arachidónovou kyselina ako vnútorný štandard. Lipidy boli extrahované metódou Bligha a spol., [(1959) Can. J. Biochem. Physiol., 37, 911-917] a mastná kyselina bola konvertovaná na pentafluórbenzylester a analyzovaná GC-MS spôsobom podobným tomu, ktorý opísal Ramesha a Taylor [(1991) Anál. Biochem. 192, 173-180).

Literárne odkazy

Altschul S.F., Madden T.L.. Schäffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. (1997): Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search program. Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402.

Bacon D.J., Anderson W.F. (1988): A fast algorithm for rendering space-filling molecule pictures. J. Mol. Graph. 6, 219-220.

Balboa M.A., Balsinde J., Jones S.S, Dennis E.A. (1997): Identity between the Ca²⁺-independent phospholipase A₂ enzymes from P388D1 macrophages and chinese hamster ovary celíš. J. Biol. Chem. 272, 8576-8580.

Bonventre J.V., Huang Z., Reza Taheri M., O' Leary E., Li E., Moskowitz M.A. Sapirstein A. (1997): Reduced fertility and postischaemic brain injury in mice deficient in cytosolic phospholipase A₂. Náture 390, 622-625.

Borsch-Haubold A.G., Bartoli F., Asselin J., Dudler T., Kramer R.M., ApitzCastro R., Watson S.P., Gelb M.H. (1998): Identification of the phosphorylation sites of cytosolic phospholipase A₂ in agonist-stimulated human platelets and HeLa cells. J. Biol. Chem. 273, 4449-4458.

Bricogne G. (1993): Direct phase detremination by entropy maximization and likelihood ranking: status report and perspectives. Acta cryst. D49, 37-60.

Briinger A.T., Krukowski A., Erickson J. (1980): Slow cooling protocols for crystallographic refinement by simulated annealing. Acta cryst. A46, 585-593.

Briinger A.T. (1992a): The free R value a novel statistical quantity for assesing the accuracy of crystal structures. Náture 355, 472-474.

Briinger A.T. (1992b): X-PLOR Version 3.1. A systém for x-ray crystalography and NMR (New Haven: Yale University Press).

Clark J.D., Lin L.-L., Kriz R.W., Ramesha C.S., Sultzman L.A., Lin A.Y., Milona N., Knopf J.L. (1991): A novel arachidonic acid-selective cytosolic PLA₂ contains Ca²⁺- dependent translocation domain with homology to PKC a GAP.

Celí 65, 1043-1051.

* r

Clark J.D., Scievella A.R., Nalefski E.A., Lin L.-L. (1995): Cytosolic phospholipase A2. Lipid Mediators Celí Signalling 12, 83-117.

Cleland W.W., Kreevoy M.M. (1994): Low-barrier hydrogen bonds and enzymic catalysis. Science 264, 1887-1890.

Collaborative Computing Project Number 4 (1994). Acta Crystallogr. S 760763.

Cowtan K.D., Main P., (1996): Phase combination and cross validation in iterated density modification calculations. Acta Crystallogr. D42, 43-48.

Cygler M.. Schrag J.D. (1997): Struckture as basis for understanding interfacial properties of lipases. Meth. Enzymol 284, 3-27.

Dennis E.A. (1997): The growing phospholipase A2 superfamily of signál transduction enzymes. Trends Biochem. Sci. 22, 1-2.

De Carvalho M.G.S., McCormack A.L., Olson E., Ghomaschi F., Gelb M., Yates III J.R., Leslie C.C. (1996): Identification of phosphorylation sites of human 85kda cytosolic phospholipase A₂ expressed in insect cells and present in human monocytes. J. Biol. Chem. 271, 1-11.

De La Fortelle E., Bricogne G. (1997): Maximum-likelihood heavy-atom parameter refinement for multiple isomorphous replacement and multiwavelength anomalous diffraction methods. Methods Enzymol 276, 494-523.

Derewenda Z.S., Derewenda U (1991): Relationship among serine hydrolases: evidence for a common structural motif in triacylglyceride lipases and esterases. Biochem. Celí. Biol. 69 842-851.

Duggleby H.J., Tolley S.P., Hill C.P., Dodson E.J., Dodson G., Moody P.C.E. (1995): Penicillin acylase has a single-amino-acid catalytic centre. Náture, 373, 264-168.

Essen L.-O., Preisic O., Cheung R., Katan M., Williams R.L., (1996): Crystal structure of a mammalian phosphoinositide-specific phospholipase C. Náture,

380, 595-602.

r r • r

Glover S., de Carvalho M., Bayburt T., Jonas M., Chi E., Leslie E., Gelb M. (1995). Translocation of the 85-kDa phospholipase A2 from cytosol to the nuclear envelope in rat basophilic leukémia cells stimulated with calcium ionophore or IgE/antigen, J. Biol. Chem. 270, 15359-15367.

Grobler J.A., Essen L.-O., Williams R.L., Hurley J.H. (1996): C2 domain conformational changes in phospholipase C. Nat. Strúci. Biol. 3,788-795.

Hanel A. M., Gelb M.H. (1993): Progressive facial catalysis by mammalian 85kilodalton phosholipase A2 enzymes on product containing vesicles: application to the determination of substráte preferences. Biochemistry 32, 5949-5958.

Hanel A. M., Gelb M.H. (1995): Multiple enzymatic activities of the human cytosolic 85-kDa phospholipase A2: hydrolytic reactions and acyl transfer to glycerol. Biochemistry 34, 7807-7818.

Hattori M., Adachi H., Tsujimoto M., Arai H., Inoue K. (1994): The catalytic subunit of bovine platelet-activating factor acetylhydrolase is a novel pype of serine esterase. J.Biol. Chem. 269 23150-23155.

Hattori M., Adachi H., Aoki J., Tsujimoto M., Arai H., Inoue K. (1995): Cloning and expression of a cDNA encoding the beta-subunit (30-kDa subunit) of bovine brain platelet-activating factor acetylhydrolase. J. Biol. Chem. 270 31345-31352.

Hendrixon W.A. (1991): Determination of macromolecular structures from anomalous diffraction of synchrotron radiation. Science 254, 51-58.

Hixon M.S., Balí A., Gelb M.H. (1998): Calcium-dependent and -independent interfacial binding and catalysis of cytosolic group IV phospholipase A2. Biochemistry 37, 8516-8526.

Huang Z., Payette P., Abdullah K., Cromlish W.A., Kennedy B.P. (1996): Functional identification of the active-site nucleophile of the human 85-kDa cytosolic phospholipase A2. Biochemistry 35, 3712-3721.

Kramer R.M., Roberts E.F., Manetta J., Putnam J.E., (1991): The Ca²⁺sensitive cytosolic phospholipase A₂ is a 100-kDa proteín human monoblast U937 cells. J. Biol. Chem. 266, 5268-5272.

Kraulis P.J. (1991): MOLSCRIPT: a program to produce both detailed and schematic plots of proteín structures. J. Appl. Cryst. 24, 946-950.

Leslie C.C., Channon J.Y. (1990): Anionic phospolipids stimulate an arachidonyl-hydrolyzing phospholipase A₂ from macrophages and reduce the calcium requirement for activity. Biochim. Biophys. Acta 1045, 261-270.

Leslie C.C. (1997): Properties and regulation of cytosolic phospholipase A₂. J. Biol. Chem. 272, 16709-16712.

Lin L.-L., Lin A.Y., DeWitt D.L. (1992a): IL-1 induces the accumulation of cPLA₂ and the release of PGE₂ in human fibroplasts. J. Biol. Chem. 267, 23451-23454.

Lin L.-L., Lin A.Y., Knopf J.L. (1992b): Cytosolic phospholipase A₂ is coupled to hormonally regulated release of arachidonic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6147-6151.

Lin L.-L., Wartmann M., Lin A.Y., Knopf J.L., Seth A., Davis R.J. (1993): cPLA₂ is phosphorylated and activated by MAP kinase. Celí 72, 269-278.

Matagne A., Lamotte-Braseur J., Frére J.M. (1998): Catalytic properties of clas A lactamases: efficiency and diversity. Biochem. J. 330, 581-598.

Mosior M., Six D.A., Dennis E.A. (1998): Group IV cytosolic phospholipase A₂ binds with high affinity and specificity to phosphatidylinositol 4,5bisphosphate resulting in dramatic increases in activity. J. Biol. Chem. 273, 2184-2191.

Murshudov G.N., Vagin A.A., Dodson E.J. (1997): Acta Crystallogr. Sect. D 53, 240-255.

Nalefski E.A., Sultzman L.A., Martin D.M., Kriz R.W., Towler P.S., Knopf J.L., Clark J.D. (1994): Delineation of two functionally distinct domains of cytosolic phospholipase A2, a regulátory Ca²⁺-dependent lipid-binding domain and a Ca²⁺-independent catalytic domain. J. Biol. Chem. 269, 18239-18249.

Nalefski E.A., Falke J. J. (1996): The C2 domain calcium-binding motif structural and functional diversity. Proteín Sci. 12, 2375-2390.

Nalefski E.A., McDonagh T., Sommers W., Seehra J., Falke J.J., Clark J.D. (1998): Independent folding and ligand specifity of the C2 calcium-dependent lipid binging domain of cytosolic phospholipase A2. J. Biol. Chem. 273, 13651372.

Nalefski E.A., Falke J.J. (1998): Location of the membrane-docking face on the Ca²⁺-activated domain of cytosolic phospholipase A2. Biochemistry 37, 1764217650.

Nicholls A. (1992): GRASP: Graphical representation and analysis of surface properties (Columbia University, New York).

O'Byrne P.M.(1997): Leukotrienes in the pathogenesis of asthma. Chest 111, 27S-34S.

Otwinowski Z. (1993). V Data Collection and Processing. Vydavatelé L. Sawyer, N. Isaacs a W. Bailey. (Daresbury, U.K.: Science and Engineering Council), str. 56-62.

Perisic O., Fong S., Lynch D.E., Bycroft M., Williams R.L. (1998): Crystal structure of a calcium-phospholipid binding domain from cytosolic phospholipase A2. J. Biol. Chem. 273, 1596-1604.

Pickard R.T., Chiou X.G., Strifler B.A., DeFeliúúis M.R., Hyslop P.A., Tebbe A.L., Yee Y.K., Reynolds L.J., Dennis E.A., Kramer R.M., Sharp J.D. (1996): Identification of essential residues for the catalytic function of 85-kDa cytosolic phospholipase A2. J. Biol. Chem. 271, 19225-19231.

Qiu Z.H., Gijón M.A., de Carvalho M.S., Spencer D.M., Leslie C.C. (1998):

The role of calcium and phosphorylation of cytosolic phospholipase A2 in rer * e r í* ŕ r r p r f r r gulating arachidonic acid release in macrophages . J. Biol. Chem. 2Ί3, 82038211.

Rao V.D., Misra S., Boronekov I.V., Anderson R.A., Hurley J.H. (1998): Structure of type II beta phosphatidylinositol phosphate kinase: a protein kinase fold flattened for interfacial phosphorylation. Celí 94, 829-839.

Reynolds L.J., Hughes L.L., Louis A.I., Kramer R.M., Dennis E.A. (1993): Metal ion and sált effects on the phospholipase A2, lysophospholipase and transacylase aktivities of human cytosolic phospholipase A2. Biochem. Biophys. Acta 1167, 272-280.

Schievella A.R., Regier M.K., Smith W.L., Lin L.-L. (1995): Calcium mediated translocation of cytosolic phospholipase A2 to the nuclear envelope and endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 270, 30749-30754.

Schrag J.D., Cyger M. (1997): Lipases and hydrolases fold. Meth. Enzymol. 284, 85-107.

Scott D.L., White S.P., Zbyszed O., Xan W., Gelb M.H., Sigler P.B. (1990): Interfacial catalysis: the mechanism of phospholipase A2. Science 250, 15411546.

Sharp J.D., White D.L., Chiou X.G., Goodson T., Gamboa G.C., McClure D., Burgett S., Hoskins J., Skatrud P.L., Spotsman J.R., Becker G.W., Kang L.H., Roberts E.F., Kramer R.M. (1991): Molecular cloning and expression of human Ca²⁺-sensitive cytosolic phospholipase A2. J. Biol. Chem. 266, 14850-14853.

Sharp J.D., Pickard R.T., Chiou X.G., Manetta J.V., Kovacevic S., Miller J.R., Varshavsky A.D., Roberts E.F., Strifler B.A., Brems D.N. a spol. (1994): Serine 228 is essential for catalytic activities of 85-kDa cytosolic phospholipase A₂. J. Biol. Chem. 269, 23250-23254.

Šimon L.S., Lanza F.L., Lipský P.E., Hubbard R.C., Talwalker S.,Schwartz

B.D., Isakson P.C., Geis G.S. (1998): Preliminary study of the safety and efficacy of SC-58635, a novel cyklooxygenase 2 inhibitor: efficacy and safety in two placebo-controlled trials in osteoarthritis and rheumatoid arthritis, and studies of gastrointestinal and platelet effects. Arthritis Rheum, 41, 1591-1602.

Táng J., Kriz R.W., Wolfman N., Shaffer M., Seehra J., Jones S.S. (1997): A novel cytosolic calcium-independent phospholipase A₂ contains eight ankyrin motifs. J. Biol. Chem. 272, 8567-8575.

Tjoelker L.W., Wilder C., Eberhardt C., Stafforini D.M., Dietsch G., Schimpf B., Hooper S., Le Trong H., Cousens L.S., Zimmerman G.A. a spol. (1995): Anti-inflammatory properties of a platelet-activating factor acetylhydrolase. Náture 274, 549-553.

Trimble L.A., Street I.P., Perrier H., Tremblay N.M., Weech P.K., Bernstein

M.A. (1993): NMR structural studies of the tight complex between a trifluoromethyl ketóne and 85-kDa human phospholipase A₂. Biochemistry 32, 1256012565.

Underwood K.W., Song C., Kriz R.W., Chang X.j., Konpf J.L., Lin l.-L. (1998). A novel calcium-independent phospholipase A₂, cPLA2, that is prenylated and contains homology to cPLA2. J. Biol. Chem. 273, 21926-21932.

Uozumi N., Kume K., Nagase T., Nakatani N., Ishii S., Tashiro F., Komagata Y., Maki K., Ikuta K., Ouchi Y., Miyazaki J-i., Shimizu T. (1997): Role of cytosolic phospholipase A₂ in allergic response and parturition. Náture 390, 618622.

Venable M.E., Olson S.C., Nieto M.L., Wykle R.L. (1993): Enzymatic studies of lyso platelet-activating factor acylation in human neutrophils and changes úpon stimulation. J. Biol. Chem. 268, 7965-7975.

Xu G.-Y., McDonagh T., Yu H.-A., Nalefski E., Clark J.D., Cumming D.A.(1998): Solution structure and membráne interactions of the C2 domain of cytosolic phospholipase A₂. J. Mol. Biol. 280, 485-500.

Všetky tu citované literárne údaje sú tu zahrnuté v celej šírke.

Claims (29)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Kryštalická CPLA2.
2. 2. Kryštalická CPLA2 podľa nároku 1, kde uvedená CPLA2 je ľudskou cPLA₂.
3. 3. Kryštalická CPLA2 podľa nároku 1, kde uvedená CPLA2 je CPLA2 z necicavčieho druhu.
4. 4. Kryštalická cPLA₂ podľa nároku 1, kde uvedená CPLA2 je rekombinantná cPLA₂.
5. 5. Kryštalická cPLA₂ podľa nároku 1, kde uvedená CPLA2 obsahuje maturovanou sekvenciu prírodné sa vyskytujúcej CPLA2.
6. 6. Kryštalická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje CPLA2 spolu s ďalšou chemickou látkou.
7. 7. Kompozícia podľa nároku 6, vyznačujúca sa tým, že ďalšia chemická látka je volená zo skupiny, ktorú tvorí potenciálny inhibítor aktivity CPLA2 a potenciálny inhibítor väzby CPLA2.

   ŕ 42
8. 8. Model štruktúry cPLA₂ vyznačujúci sa tým, že obsahuje súbor údajov predstavujúci štruktúru cPLA₂.
9. 9. Model podľa nároku 8 vyznačujúci sa tým, že súbor údajov bol stanovený kryštalografickou analýzou cPLA₂.
10. 10. Model podľa nároku 8 vyznačujúci sa tým, že súbor údajov bol stanovený NMR analýzou cPLA₂.
11. 11. Model podľa nároku 8 vyznačujúci sa tým, že súbor údajov vyjadruje úplnú štruktúru cPLA₂.
12. 12. Model podľa nároku 8 vyznačujúci sa tým, že súbor údajov vyjadruje časť štruktúry cPLA₂.
13. 13. Model podľa nároku 12 vyznačujúci sa tým, že časť je aktívne centrum cPLA₂.
14. 14. Model podľa nároku 12 vyznačujúci sa tým, že časť je CaLB doména cPLA₂.
15. 15. Výpočtový systém vyznačujúci sa tým, že obsahuje hardware počítača a model podľa nároku 8.

    r e r
16. 16. Spôsob identifikácie látky, ktorá je agonistom alebo antagonistom aktivity alebo väzby cPLA₂ vyznačujúci sa tým, že zahrnuje: (a) použitie modelu podľa nároku 8, (b) študovanie interakcie prípadných látok s takým modelom a (c) vybranie látky, o ktorej sa predpokladá, že bude pôsobiť ako spomínaný agonista alebo antagonista.
17. 17. Látka, identifikovaná spôsobom podľa nároku 16.
18. 18. Spôsob identifikácie substancie, ktorá inhibuje cPLA₂ aktivitu alebo väzbu vyznačujúci sa tým, že zahrnuje určenie interakcie medzi prípadnou substanciou a modelom štruktúry cPLA₂.

    I
19. 19. Spôsob identifikácie substancie, ktorá napodobuje cPLA₂ aktivitu alebo väzbu vyznačujúci sa tým, že zahrnuje určenie interakcie medzi prípadnou substanciou a modelom štruktúry cPLA₂.
20. 20. Spôsob identifikácie inhibítorov aktivity cPLA₂ racionálnym navrhovaním liečiv vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:

    (a) návrh potenciálneho inhibitora, ktorý bude tvoriť nekovalentné väzby s jednou alebo viacerými aminokyselinami v aktívnom centre cPLA₂, založený na koordinátach kryštálovej štruktúry cPLA₂;

    (b) syntetizovanie inhibitora; a (c) určenie, či potenciálny inhibítor inhibuje aktivitu cPLA₂.
21. 21. Spôsob podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, žc koordináty kryštálovej štruktúry cPLA₂ sú získané z kryštálu cPLA₂ priestorovej grupy P2i2j2 s a - 153,59 angstrômov, b = 95,49 angstrômov a c = 139,13 angstrômov.
22. 22. Spôsob podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že inhibítor je navrhnutý, aby interagoval s jedným alebo viacerými atómami uvedenej jednej alebo viacerých aminokyselín v aktívnom centre cPLA₂, pričom uvedený jeden alebo viac atómov je volený zo skupiny, ktorú tvorí :

    CB a Ογ atómy v Ser228;

    Οδΐ a Οδ2 atómy v Asp 549 a Asp575;

    CB, CG, CD, NE, CZ, NH1 a NH2 atómy v Arg200, Arg413 a Arg579;

    I karbonylový kyslík v hlavnom reťazci chrbta v Trp393;

    Νδ2 a Οδΐ atómy u Asn555;

    atómy CD1, CE1, CG, CZ, CE2 a CD2 v Phe397, Phe681, Phe683 a Phel99;

    CG, CD1, NE1, CE2, CZ2, CH2, CZ3, CE3 a CD2 v Trp232 a Trp393.

    CB a Ολ atómy v Ser577;

    atómy CB aSXv Cys331;

    atómy OE1 a OE2 v Glu589;

    atómy CB, CG, CD, CE a NZ v Lys588;

    Ολί atóm v Thr680;

    OE1 a OE2 atómy v Glu418 a Glu422;

    atómy CB, CG, SD a CE v Met417;

    atómy CB, CG, CD1 a CD2 v Leu400 a Leu421;

    atómy CB, CG1, CG2 alebo CD1 v Ile424;

    NH v hlavnom reťazci chrbta a karbonylové kyslíkové atómy v Ala578 a atómy CB, CG, ND1, CE1, NE2 a CD2 v His639.
23. 23. Spôsob identifikácie inhibítorov väzby cPLA₂ na membránu racionálnym navrhovaním liečiv vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:

    (a) návrh potenciálneho inhibítora, ktorý bude tvoriť nekovalentné väzby s jednou alebo viacerými aminokyselinami v oblasti elektrostatického poľa cPLA₂, založený na koordinátach kryštálovej štruktúry cPLA₂;

    (b) syntetizovanie inhibítora; a (c) určenie, či potenciálny inhibítor inhibuje väzbu cPLA₂ na membránu.
24. 24. Spôsob podľa nároku 23 vyznačujúci sa tým, že koordináty kryštálovej štruktúry cPLA₂ sú získané z kryštálu cPLA₂ priestorové grupy P2]2|2 s a = 153,59 angstrômov, b = 95,49 angstrómov a c = 139,13 angstrômov.
25. 25. Spôsob podľa nároku 23 vyznačujúci sa tým, že uvedená jedna alebo viac aminokyselín je volená zo skupiny, ktorú tvorí Arg467, Arg485, Lys488, Lys544 a Lys543.
26. 26. Agonista alebo antagonista identifikovaný spôsobom podľa nároku 20.
27. 27. Agonista alebo antagonista identifikovaný spôsobom podľa nároku 23.
28. 28. Substancia identifikovaná spôsobom podľa nároku 18.
29. 29. Substancia identifikovaná spôsobom podľa nároku 19.