CZ20012933A3 - Krystalická struktura cPLA2 a způsoby identifikace agonistů a antagonistů s jejím pouľitím - Google Patents

Description

Leukotrieny a prostaglandiny jsou mediátory zánětů důležité při astmatu, - arthritis a ostatních zánětlivých chorobách. ’ Leukotrieny způsobují zužováním průdušek bránění dýchacích cest u astmatiků, zvýšenou sekreci hlenu a chemoatrakci buněk zánětu (O‘Byrne, 1997); prostaglandiny způsobují bolest a edém spojený s artritidou. Farmakologická intervence blokováním buď syntézy nebo působení těchto lipidových mediátorů je u lidí při léčení chorob efektivní a tím je potvrzována jejich důležitost (Simon a spol., 1998; O'Byrne, 1997).

Dosavadní stav techniky

Cytosolická fosfolipáza A2 (CPLA2) iniciuje produkci leukotrienů a prostaglandinů uvolňováním kyseliny arachidonové z buněčných membrán. Arachidonová kyselina je střídavě metabolizována prostřednictvím eyelooxygenázy na prostaglandiny a prostřednictvím 5-lipogenázy na leukotrieny. Uvolňování arachidonové J<yseliny je současně provázeno tvorbou faktoru aktivujícího lýzu • · · · ♦ ·· · · • · ♦ · · · · ··· · · · · · • ······ ··· · · ·· ··· krevních destiček (lyso-PAF), který může být potom acetylován, aby generoval PAF, molekulu rovněž implikovanou v patofysiologii astmatu a artritidy. Reakce katalyzovaná cPLA₂ tudíž iniciuje tři druhy mediátorů zánětu: leukotrieny, prostaglandiny a PAF.

cPLA₂ je členem různorodé skupiny enzymů fosfolipázy A₂ s obecnou schopností štěpit sn-2 ester glycerofosfolipidů. Prvními členy popisované skupiny byly enzymy o nízké molekulové hmotnosti, které jsou vylučovány buď extracelulárně nebo do granulí (a jsou zde souhrnné označovány jako sPLA₂; skupiny I, II, III, V, VII a IX) (Dennis, 1997). Třída PLA₂ se rozšířila s klonováním a charakterizací kalciumdependentní arachidonylselektivní cPLA₂ (Clark a spol., 1991; Kramer a spol., 1991), kalcium-independentní PLA₂ (Tang a spol., 1997; Balboa a spol., 1997) a plasmy a intracelulámích PAF-acetylhydroláz (Hattori a spol., 1994, 1995). Každý z těchto nových enzymů sdílí nesekvenční homologii s enzymy o nízké molekulové hmotnosti nebo s každým jiným. Navíc na rozdíl od sPLA₂, které ke štěpení fosfolipidu využívají aktivovanou vodu, zdají se tyto enzymy využívat nukleofilní serin. Z tohoto hlediska mají více společného s ostatními lipázami z třídy α/β hydroláz než &_ sPLA₂. V současné době, byly klonovány dva další enzymy s 30 % identity s katalytickou doménou cPLA₂; byly pojmenovány cPLA₂p (C. Song a spol., rukopis připravován) á cPLA₂y (Underwood a spol., 1998).

Klonování cPLA₂je popsáno také v U.S. patentech č. 5,322,776, 5,354,677, 5,527,698 a 5,593,878. Klonování kalcium nezávislé cPLA₂ je rovněž popsáno v U.S. patentech č. 5,466,595, 5,554,511, 5,589170 a 5,840,511.

Početné případy důkazů podpořily hlavní úlohu cPLA₂ při biosyntéze mediátorů lipidů. cPLA₂ je jediným enzymem, který je vysoce selektivní na fosfolipidy obsahující arachidonovou kyselinu v sn-2 poloze (Clark a spol., 1995; Haněl a Gelb

1993). Aktivace cPLA₂ nebo její zvýšená exprese byly spojeny se zvýšenou syntézou leukotrienu a prostaglandinu (Lín a spol., 1992). Následně po aktivaci se cPLA₂ přemísťuje na nukleární membránu, kde je lokalizována spolu s cyklooxygenázou a lipoxygenázou, které metabolizují arachidonát na prostaglandiny a leukotrieny (Schievella a spol, Glocer a spol., 1995). I když jsou tato data závažná, nejrozhodnější důkaz pro hlavní úlohu cPLA₂ při produkci eikosanoidu a PAF byl získán u myší, u nichž byl nedostatek cPLA₂ vytvořen homologickou rekombinací (Uozumi a spol., 1997; Bonventre a spol.,- 1997). Od těchto zvířat pocházející • φ

Q · φ φφφφφφ φφφ φφφ φφφ φφ φ· φφφ peritoneální makrofágy pro tvoření leukotrienů, prostaglandinů nebo PAF selhaly. Myši s nedostatkem CPLA2 poskytly také informaci o roli CPLA2 při nemoci, protože tyto myši byly resistentní vůči bronchiální hyperreaktivitě při modelu anafylaxe používaného k napodobení astmatu (Uozumi a spol., 1997).

CPLA2 sestává nejméně ze dvou funkčně odlišných domén: N-terminální Ca²⁺závislé, lipid vázající (CaLB) domény a Ca²⁺- nezávislé, katalytické domény (Nalefski a spol., 1994). N-terminální CaLB doména je členem C2 třídy a její struktura byla vyřešena ( Perisic a spol., 1998; Xu a spol., 1998); zprostředkovává regulaci vápníku ko-lokalizací katalytické domény s jejím membránovým substrátem (Nalefski a spol.,

1994). Vedle toho aktivita CPLA2 je také regulována fosforylací katalytické domény (Lin a spol., 1991; Leslie, 1997). Ser505 a Ser 727 jsou zachovávány přes všechny species a jsou fosforylovány v mjohočetných buněčných typech (de Carvalho a spol., 1998). Fosforylace Ser505 členy třídy MAP-kináz je obecnou odezvou na extracelulární stimuly, které uvolňují kyselinu arachidonovou. Mutace Ser505 na Ala aktivaci snižuje (Lin a spol., 1993), zatímco analogická mutace na Ser727 nemá efekt (Leslie, 1998).

Některé z dokladů naznačují, že katalytický mechanismus. CPLA2 probíhá skrze intérmediát acylovanéhó šeřinu (Trimble a spol., 1993; Haněl a Gefb; 1995). Mutace Ser228 ruší aktivitu cPLA₂ vůči všem substrátům včetně fosfolipidů, lysofosfolipidů a tuky acylovaného kumarinu (Pickard a spol., 1996; Huang a spol.,

1996). Ser228 je přítomen v pentapeptidové sekvenci G-L-S-G-S, která je podobná klasickému motivu lipázy G-X-S-X-G (Schrag a Cygler, 1997) nalézanému v rozsáhlé třídě enzymů zvané α/β hydrolázy. Tyto enzymy mají společné střední jádro, které sestává z dobře uchovaných smíšených β pásů, jejichž vlákna jsou promísena s α-helixy. Ve všech α/β hydrolázách je přítomen katalytický serin v těsné otáčce mezi β pásem a α-helixem nazývané nukleofilní koleno (viz přehled od Schraga a Cyglera, 1997). Tato otáčka směruje krátký serinový postranní řetězec ven od proteinového řetězce páteře a snižuje sterickou zábranu kolem zbytku a vyžaduje, aby +2 a -2 postranní řetězce byly malé, a aby zabránily sterické kolisi; tedy převládání G-X-S-X-G motivu (Derewenda a Derewenda, 199T).

Vedle šeřinu využívají α/β hydrolázy histidin a kyselinu (aspartát a glutamát) jako další součásti katalytické triády podobné té, která je přítomná v serinových proteázáčh ( Schrag a Cygler, 1997). Avšak třebaže bylo u CPLA2 prokázáno, že

Asp549 je pro aktivitu nezbytná, žádné z 19 histidinových zbytků nebyly (Pickard a spol., 1996). Při enzymatickém procesu byl jako roli hrající implikován odlišný zbytek,

Arg200, třebaže mechanismus pro jeho participaci zůstává nevyjasněn. Tato pozorování naznačují, že CPLA2 účinkuje pro acyl hydrolázy novým katalytickým mechanismem.

Podobně jako SPLA2 i lipázy z třídy α/β hydroláz, štěpí CPLA2 přednostně substráty přítomné na rozhraní (Nalefski a spol., 1994). Tento fenomén, známý jako interfaciální aktivace, byl přisouzen buď konformačním změnám v enzymu nebo výhodnějšímu zavedení substrátu (Scott a spol., 1990). Původ 1500-násobného rozdílu v aktivitě cPLA₂ vůči monomernímu a micelárnímu substrátu zůstává neznám.

Navzdory klíčové roli CPLA2 při zánětlivém onemocnění zůstává trojrozměrná struktura nevyřešena a ponechává mnohé otázky nezodpovězeny. My zde popisujeme rentgenovou strukturu lidské CPLA2 s rozlišením 2,5 A. Struktura dává proniknout do původu arachidonátové selektivity a interfaciální aktivace, objasňuje role Ser228, Asp549 a Arg200 á odkrývá vzájemné působení mezi CaLB a katalytickými doménami. Je významné, že struktura má jedinečnou topologii, odlišnou od té, kterou má třída α/β hydroláz. ’ _

Podstata vynálezu

Všechny zde uvedené odkazy na aminokyseliny v CPLA2 jsou činěny za použití čísel zbytků, které se vztahují na CPLA2 sekvenci uváděnou v Tabulce I v U.S. patentu č. 5,527,698 s prvním methioninem, označeným jako zbytek 1 (Metl).

Předkládaný vynález uvádí krystalickou cPLAž· CPLA2 je nejlépe buď lidská cPLA₂ nebo cPLA₂ od jiných než savčích druhů. U určitých provedení je CPLA2 rekombinantní CPLA2 a/nebo obsahuje vyvinutou sekvenci přirozeně se vyskytující cPLA₂.

Jiná provedení poskytují krystalickou kompozici obsahující CPLA2 spolu jinou chemickou species. Jiná chemická species je nejlépe volena ze skupiny sestávající z potenciálního inhibitoru aktivity cPLA₂ a potenciálního-inhibitoru vazby cPLA₂ na membránu.

Další provedení poskytují ještě model struktury cPLA₂ obsahující soubor dat vyjadřující strukturu cPLA₂. Tento soubor- dat byl nejvhodněji stanoven krystalografickou analýzeu cPLA₂ včetně eventuální NMR analýzy. U-určitých provedení zahrnuje soubor dat část struktury CPLA2 obsahující bez omezení aktivní centrum CPLA2 nebo CaLB doménu CPLA2.

Ke konstrukci takového modelu ze zde uvedených krystalografických a/nebo NMR dat či získaných nezávislou analýzou krystalické CPLA2, může být využita jakákoliv dostupná metoda. Takový model může být konstruován z dosažitelných položek analytických dat při využití známých souborů softwarových programů jako HKL, MOSFILM, XDS, CCP4, ŠKARP, PHASES, HEAVY, XPLOR, TNT, NMRCOMPASS, NMRPIPE, DIANA, NMRDRAW, FELIX, VNMR, MADIGRAS, QUANTA, BUSTER, SOLVE, O, FRODO, RASMOL a CHAIN. Model konstruovaný z těchto dat může být potom zobrazen s využitím dostupných systémů včetně na příklad Silicon Graphics, Evans and Sutherland, SUN, Hewlet Packard, Apple Macintosh, DEC, IBM a Compaq. Předkládaný vynález poskytuje také výpočetní systém, který zahrnuje model podle vynálezu a hardware užívané pro konstrukci, postup zpracování a/nebo zobrazení podle vynálezu.

Další provedení poskytují výpočetní systém obsahující hardware pro výpočet a model podle předkládaného vynálezu.

Jsou poskytovány rovněž metody pro identifikaci species, které jsou agonistoů nebo antagonistou aktivity nebo vazby CPLA2 obsahující: (a) poskytnutí modelu podle' předkládaného vynálezu, (b) studování interakce mezi případnou species a takovým modelem a (c) výběr species, o níž je předpověděno, že bude působit jako řečený agonista nebo antagonista. Poskytovány jsou také species identifikované v souhlase s takovými metodami.

Jiná provedení představují (1) postup identifikace substance, která inhibuje aktivitu nebo vazbu CPLA2 obsahující určení interakce mezi případnou species a modelem struktury CPLA2 nebo (2) způsob identifikace, který napodobuje aktivitu nebo vazbu CPLA2 obsahující určení interakce mezi případnou species a modelem struktury CPLA2· Poskytovány jsou také substance identifikované v souhlase s takovými postupy.

Studie interakce mezi případnou species a modelem mohou být uskutečněny za použití dostupných softwarových programů včetně QUANTA, RASMOL, O, CHAIN, FRODO, INSIGHT, DOCK, MCSS/HOOK, CHARMM, LEAPFROG, CAVEAT(UC Berkley), CAVEAT(MSI), MODELLER, CATALYST a ISIS.

Jiná provedení poskytují způsob identifikace inhibitorů aktivity CPLA2 racionálním návrhem léčiva a obsahují: (a) navrhnutí potenciálního inhibitoru, který «ΦΦΦ Φ ♦ · • ΦΦ ΦΦΦ Φ Φ ·« ΦΦ ΦΦΦ ·

Φ ΦΦΦΦ· bude tvořit nekovalentní vazby s jednou nebo více aminokyselinami v aktivním centru cPLA₂ na základě koordinát krystalové struktury cPLA₂; (b) syntetizování inhibitoru a (c) určení, zda potenciální inhibitor inhibuje aktivitu cPLA₂. Koordináty krystalové struktury cPLA₂ užívané při takových postupech se získají nejlépe z krystalů cPLA₂ prostorové grupy Ρ2ϊ2ι2 s a = 153,59 A, b = 95,49 A a c = 139,13 A. U jiných preferovaných provedení inhibitor, zamýšlený pro interakci s jedním nebo více atomy řečené jedné nebo více aminokyselin v aktivním centru cPLA₂, je volen ze skupiny, kterou tvoří:

CB a Ογ atomy v Ser228;

Οδ a Οδ2 atomy v Asp549 a Asp575;

CB, CG, CD, NE, CZ, NH1 a NH2 atomy v Arg200, Arg413 a Arg 579; karbonylový kyslík v řetězci páteře u Trp393;

Νδ2 a Οδ1 atomy v Asn555;

atomy CD1, CE1, CG, CZ, CE2 a CD2 v Phe397, Phe 681, Phe683 a Phe199; CG, CD1, NE1, CE2, CH2.CZ3, CE3 a CD2 v Trp232 a Trp 393;

CB a Ογ atomy v Ser377;

-atomy CB a Sy v Cys331; _ atomy OE1 a OE2 v Glu589;

atomy CB, CG, CD, CE a NZ v Lys588;

Ογΐ atom v Thr680;. OE1, a OE2 atomy v Glu 418 a Glu422;

atomy CB, CG, SD a CE v Met417;

atomy CB, CG, CD1 a CD2 v Leu400 a Leu421;

atomy CB, CG1, CG2 nebo CD1 v Ile424;

NH a karbonylový kyslík v řetězci páteře u Ala578; a atomy CB, CG, ND1, CE1, NE2 a CD2 v His639.

Jsou také poskytováni agonisté a antagonisté identifikovaní takovými metodami.

Uvádějí se rovněž metody identifikace inhibitorů vazby cPLA₂ na membránu racionálním návrhem léčiva obsahujícím: (a) navrhnutí potenciálního inhibitoru, který bude tvořit nekovalentní Vazby s jednou nebo více aminokyselinami v oblasti elektrostatického pole cPLA₂ na základě koordinát krystalové struktury cPLA₂; (b) syntetizování inhibitoru a (c) určení, zda potenciální inhibitor inhibuje vazbu cPLA₂. Koordináty krystalové struktury cPLA₂ užívané při takových postupech se získají nejlépe z krystalů CPLA2 prostorové grupy P2i2i2 s a = 153,59 A, b = 95,49 A a c =

139,13 A. U jiných preferovaných provedení inhibitor, zamýšlený pro interakci s jednou nebo více aminokyselinami, je volen ze skupiny tvořené Arg467, Arg485,

Lys488, Lys544 a Lys543. Poskytováni jsou také agonisté a antagonisté identifikovaní takovými metodami.

Podrobný popis vynálezu a preferovaných provedení

Struktura cPLA₂ byla řešena za použití jednoho těžkého atomu jako silně rozptylujícího atomu pro 749 zbytků * Lidská CPLA₂ kompletní délky byla exprimována v CHO buňkách a vyčištěna modifikací metodologie podle Clarka a spol., 1990 (Stáhl a spol., rukopis je připravován). Při 18°C byly získány krystaly za použití PEG 1000 jako srážedla a při aplikaci standardních technik difuse pár. Monokrystaly vyrostly po několika dnech až do rozměrů 0,6 mm x 0,5 mm x 0,1 mm, avšak byly vysoce citlivé na poškození rentgenovými paprsky. Cykly nasycení krystalu v roztocích kryoprotektantů se vzrůstajícím množstvím PEG 400 a DMSO, následované bleskovým ochlazením a expozicí vůči synchrotronové radiaci, byly rozhodující pro získání difrakce při minimálním Braggově intervalu 2,5 A. Krystaly mají prostorovou grupu P2i2í2 (a = 153,59 A, b = 95,49 A, c = 139,13 A) se dvěma monomery (1498 zbytků) a 60 % rozpouštědla na asymetrickou jednotku.

Pokusy připravit těžkým atomem nasycené krystaly cPLA₂ ukázaly, že isomorfní deriváty může poskytnout pouze gadolinium nebo terbium. Avšak jeden nebo druhý lanthanoid nahradil jediný Ca²⁺ atom v CaLB a takto poskytl jediný těžký atom jako rozptylující atom pro 749 aminokyselinových zbytků. Informace o vnitřního fázování z těchto krystalů neměla dostatečně vysokou kvalitu, aby poskytla výchozí mapu elektronové hustoty. Toto pozorování spolu se skutečností, že vázání většiny těžkých atomů negeneruje isomorfismus mezi nativními a nasáknutými krystaly, vedlo ke snaze řešit strukturu cPLA₂ fázováním anomální disperse více vlnovými délkami (MAD) (Hendrickson, 1991).

Byly připraveny terbiem nasycené krystaly CPLA2, kryotisovány (viz Metody) a .ochlazeny v proudu dusíku o teplotě 100 K. Při třech různých vlnových délkách byla kolem T_b L_m hrany sejmuta data monokrystalu, který vzhledem k citlivosti na radiaci • · · · φ · · · * · · · · byl mezi sběrem dat posunován podél své rotační osy. Experimentální fáze do 3,2 A byly vypočteny pomocí SHARP (de La Fortelle a Bricogne, 1997); potom několik cyklů snižování rozpouštědla a dvojnásobné průměrování v DM (Cowtan a spol., 1996) nám dovolilo rozšířit fáze na 2,5 A. Touto procedurou byla vytvořena mapa elektronové hustoty o vysoké kvalitě (Obr. 1), ve které lze jasně identifikovat obě domény každého CPLA2 monomeru. Nejprve byla v hustotě rotována CaLB (Perisic a spol., 1998; 1RLW) a polyalaninová stopa byla zasazena do viditelných oblastí katalytické domény za použití programu QUANTA (Molecular Simulations lne.) generujícím model s přibližně 550 zbytky pro každý monomer. Fázově omezená rafinace této počáteční struktury s finálním stupněm kombinace fáze (REFMAC; Murshudov a spol., 1997), následované manuálním sestavením modelu (QUANTA) vytvořilo model, který byl následně zpřesněn v XPLOR (Brůnger a spol., 1992b). Předložený model obsahuje 1285 zbytků (mezi oběma monomery) a 40 molekul vody.

Molekulární struktura

- Monomer CPLA2 je dvoudoménová _elipso^áiní struktura a rozměry ~ 100 A x 55 A x 45 A (Obr. 2a). N-terminální CaLB doména (zbytky 16-138) je zřetelně zavinutý β sendvič připojený zbytky 139-143 ke katalytické doméně, se kterou tvoří velmi málo kontaktů protein-protein. Centrální jáďro katalytické domény je složeno z desetivláknového centrálního β pásu promíchaného s helixy, který je odlišný od kanonického stočení α/β hydrolázy. Monomery CPLA2 přítomné v asymetrické jednotce nejsou dokonale superponovatelné vzhledem flexibilitě interdoménové smyčky. Skutečně, když jsou CaLB domény superponovány, je mezi dvěma katalytickými doménami diference 4-5°. Smyčka, která vzájemně propojuje domény, má u každého monomeru odlišnou konformaci a její zbytky projevují vysokoteplotní faktory.

cPLA₂ je cytosolickým proteinem, který se přemísťuje k membráně, když volné

- hladiny Ca²⁺ jsou zvýšeny na mikromolekulární úrovně (Clark a spol., 1990. 1991). Uspořádání domén cPLA₂ naznačuje, jak je aktivní centrum orientováno vzhledem k buněčné membráně. Obr. 2a je diagramem povrchu, který osvětluje HSQC studie, které na CaLB provedl Xu a spolupracovníci (1998). Zbytky, které zobrazují N¹⁵/NH • · ·· • · ·· • · · ·· • · ·· posuny po inkubaci micelami dodecylfosfocholinu při těchto experimentech, jsou znázorněny v purpurové barvě. Je zřejmé, že zobrazené zbytky se objevují na stejné čelní ploše jako aktivní centrum. Proto tedy, když CaLB využívá tyto zbytky pro asociaci s membránou fosfolipidu, je katalytická doména přibližně nastavena do polohy, aby vázala fosfolipidový substrát v aktivní centru. Flexibilita spojovacího článku mezi dvěma doménami, právě tak jako nedostatek větších interakcí proteinprotein mezi nimi nasvědčuje, že optimálních interakcí s membránou lze dosáhnout malou rotací mezi doménami.

Jak je ukázáno na diagramu povrchového potenciálu na Obr. 2c, existuje tu vysoce basická oblast, která se rozprostírá od aktivního centra přes úzký pás positivně nabitých zbytků na β3 pramen CaLB. Tato basická charakteristika by byla očekávána u oblasti v proteinu, která vytváří elektrostatické kontakty s negativně nabitými čelními skupinami fosfolipidu membránové vrstvy (viz níže). Avšak zbytky 434 až 456 jsou neuspořádány a způsobují, že je nemožné přesně definovat skutečnou velikost basického úseku. Nicméně stojí za zaznamenání, že podobné basické úseky byly poznány u PI4kinázy a v různých druzích sPLA₂ (Rao a spol., 1998). Svádí to, aby vznikl dojem, že vysoká afinita vazby cPLA₂ na membrány vytvořené z fosfatidýlmethanol Hposomů (Hixon a Gelb, 1998) je zprostředkovávána touto částí a sousedícím basickým úsekem β vlákna 3 v CaLB doméně.

N-Terminální CaLB doména

Struktura CaLB domény v celkové délce cPLA₂ je s menšími rozdíly velice podobná té, která byla vyřešena pomocí NMR a rentgenové krystalografie (Xu a spol., 1998, Perisic a spol., 1998). Stručně řečeno, je tvořena osmi antiparalelními β prameny, navzájem spojenými šesti smyčkami, svinujícími se do β sendviče, které vyhovují typu II topologie pro C2 domény (Nalefski a spol., 1994b). Dva Ca²⁺ atomy jsou vázány na jeden konec CaLB prostřednictvím konstelace postranních řetězců Asp a Asn, stejné jako karbonylovými atomy v řetězci páteře, na třech rozdílných smyčkách (vápník vázajíeí smyčky; CBLs); stejné uspořádání atomů bylo pozorováno v CaLB doménách, které vyřešil Perisic a spolupracovníci (1998). Ca²⁺ atomy jsou od sebe přibližně 4 A. Okolí Ca²⁺ atomů v celkové délce cPLA₂ však ve struktuře CaLB řešené těmito autory, nevykazuje přítomnost žádné z-molekul vody; 10 místo toho k vápníkovému centru 1 (definováno u Perisica a spolupracovníků, 1998) je koordinována molekula MES [2-(N-morfolino)ethansulfonová kyselina] z pufru použitého při krystalizací a kryoprotekci. U obou CPLA2 monomerů je vzdálenost mezi Ca²⁺ 1 v CPLA2 a nejbližším sulfonátovým kyslíkovým atomem MES přibližně 2,2 A. Vedle toho je morfolinové skupina v kontaktu také s postranními řetězci His62 a Tyr96 tvoříc tak malý hydrofobní výklenek. Ačkoli krystalizační artefakt, koordinace Ca²⁺ 1 v CPLA2 k sulfonové skupině MES by mohla imitovat vazebný způsob fosfátové skupiny molekuly fosfolipidů a takto nasvědčovat, že Ca²⁺ v cPLA₂ působí jako můstek mezi proteinem a fosforylovanou membránou spíše, než jenom jako allosterický aktivátor.

Nová topologie stočení cPLA₂ ji odlišuje od α/β hydroláz

Katalytická doména cPLA₂ se skládá z 14 β pramenů a 13 a helixů; její centrální jádro sestává z desetipramenného centrálního smíšeného β pásu obklopeného 9 a helixy s prameny β5 až do β11 tvořícími nejzřetelnější část pásu (viz Richardsonův diagram na Obr. 3b). β -pás má superhelikální zatočení. Pro jednoduchost: sekundární elementy CPLA2 byly identifikovány na základě nomenklatury svinutí α/β hydrolázy, kterou uvádí Schrag a Cylger (1997), v níž je katalytický serin vždy předcházen β5 a následován Helixem C.

Prvním β pramenem v jádru cPLA₂ je β1, který následuje flexibilní spojení po

CaLB. Dlouhá smyčka obsahující jeden dlouhý helix tvoří spojení s β4 v centrální části záhybu. Tato konstrukce βΐ/α-helix je analogická k té, jež byla pozorována v lipáze Humicola lanuginosa, kde helikální oblast také není uvažovanou částí záhybu, nýbrž spojuje její β10 s prvním β pramenem v jádru (vstup 1 TIB v PDB). Následující paralelní β pramen, pramen β5 předchází katalytický serin (228). Topologie β5,

Helixu C (růžové zbarvený na Obr. 3a a 3b) a smyčka, která je spojuje, jsou v α/β hydolázách podobné. Tato propojující smyčka se nazývá nukleofilní koleno. Tři další α-helixy protkané smyčkami poskytují spojení mezi touto oblastí a dalšími 4 β prameny této části záhybu. Ze čtyř pramenů, které následují (β6-β9) je βδ nejdelší a tvoří nemnoho vodíkových můstků s β7. Prameny β7 až β1, i když v sekvenci nesouvisejí, mohou být tudíž považovány za malý β pás uvnitř větší struktury.

• 9 · · · · ··· ·· · · ···

Ρο β9 existuje větší odchylka od utváření centrálního α/β jádra. V tomto bodě tvoří cPLA₂ oblast uvedenou v purpurové barvě na Obr. 2a a 3b. Tato část se 180 zbytky tvoří čepičku katalytické domény. Asp549, katalytický partner Ser228 leží v oblasti mezi koncem čepičky a βίο, který je součástí centrálního jádra. Podle struktury čepičky jsou poslední tři β prameny umístěny tak, aby doplňovaly centrální β pás a jsou promíseny helixy G až J.

α/β stočení hydrolázy je společné mnoha esterázám a jiným hydrolytickým enzymům (Schrag a Cygler, 1997). Jeho Richardsonův diagram (Obr. 3a) sestává z centrálního β pásu, u něhož uspořádání β pramenů sleduje sekvenci lineárně (s výjimkou β3, který je často umístěn mezi β4 a β5). Na první pohled se topologie cPLA₂ jeví, jako že by byla cirkulární permutací α/β stočení hydrolázy. Avšak pečlivé srovnání Obr. 3a a 3b jasně odhaluje, že ve skutečnosti srovnatelná je pouze oblast obklopující nukleofilní koleno (β5 až Helix C; zbytky 222-228). Hlavní rozdíly zahrnují antiparalelní povahu pramenů β6 až β9, multiplicitu helixů mezi β5 a β6 a nepřítomnost zasahujících helixů mezi prameny naposled zmíněné části cpla2 α/β jádra. - : - _ I když struktura čepičky v cPLA₂ (zbytky :378-548)- je součástí katalytické domény, není zaTirnována do α/β jádra. Sekvenční srovnávání katalytických domén lidských cPLA₂ α, β, a γ (Obr. 4) ukazuje, že homologie je soustředěna uvnitř α/β -jádra (žluté elementy) a β pramenů 9a a 9b. Centrální část čepičky je tedy mezi isoformami cPLA₂ rozdílná. Při srovnávání mezi pásovým diagramem cPLA₂ na Obr. 2a, ve kterém je oblast čepičky znázorněna v purpurové barvě s diagramem povrchového potenciálu na Obr. 2c, vychází najevo, že shora hypotetisovaná, vysoce basická oblast jako úsek vytvářející kontakt s fosfolipidy membrány, je tvořena skutečné z velké části zbytky ve čepičce.

Oblast čepičky v cPLA₂ obsahuje také dva ze tří nejpohyblivéjších úseků celé struktury, zbytky 433-456 a 500-536 (třetí úsek je C-zakončení, zbytky 728-749). Tyto úseky aminokyselin nemají vystopovatelnou elektronovou hustotu a nejsou do modelu zahrnuty (tečkované čáry na Obr. 2a). Je zajímavé, že to jsou tyto vysoce flexibilní úseky čepičky, které v sobě obsahují tři ze čtyř serinových zbytků, u nichž po stimulaci agonistou dochází k fosforylaci (437, 454, 505). Role Ser437 a Ser454 je nejasná , protože nejsou zachovávány mezi různými species. Na rozdíl od toho je Ser454 v cPLA2_zachován u evolučně rozdílných druhů (kuřete, člověka, pruhované akvarijní rybky, myší, krysy) a jeho fosforylace MAP kinázou je vyžadována pro maximální aktivaci cPLA₂ v hmyzích buňkách (Lin a spol., 1993; Qiu a spol., 1998). Ser505, který je v našich krystalech pravděpodobně heterogenně fosforylován a je umístěn ve vysoce flexibilní, rozpouštědlu vystavené smyčce, nevytváří kontakty ani s hlavní částí proteinu ani s jinými, v krystalové mřížce sousedícími monomery cPLA₂. Ser505 je vzdálený oběma aktivním centrům a vazebné oblasti membrány (viz Obr. 2a); nicméně jeho blízkost stočení mezi CaLB a katalytickou doménou je pozoruhodná (viz diskuse). Čtvrtá poloha fosforylace cPLA₂, Ser727 je na Czakončení struktury. Třebaže je tato poloha mezi druhy zachovávána, její funkční důležitost není dosud známa.

Nálevkovitý tvar aktivního centra je částečně zakryt příklopem přístupným pro rozpouštědlo

Nejpozoruhodnější rys struktury cPLA₂ je nálevkovitý tvar aktivního centra, který prostupuje třetinu cesty do katalytické domény a odkrývá Ser228 a Asp549, umístěné na spodní části hluboké, úzké spáry. Třebaže u vrcholu široký, dolů se tvar zužuje na průměr přibližně 7 A it ústí spáry v aktivním centru, viditelné na Obr 5a. Nálevka je lemována hydrofobními zbytky (na Obr. 5a modré) a tvoří lůžko do kterého se mohou vázat podíly acylových zbytků mastných kyselin fosfolipidových substrátů membrán.

Aktivní centrum cPLA₂ je částečně překryto příklopem složeným ze zbytků 413-457. Příklop je zahnut do oblasti smyčky, je následován malým helikálním úsekem a krátkým ohbím (viz Obr. 5a). Zbytky 408-412, které vedou do oblasti příklopu, se projevují jako velmi značné teplotní faktory a zbytky 434-456 nemají vystopovatelnou elektronovou hustotu. Tato pozorování naznačují, že tyto oblastí jsou vysoce mobilní a mohou být nahlíženy jako pant příklopu. Viditelná oblast příklopu má amfipatický charakter; její rozpouštědlu vystavená čelní strana je primárně tvořena polárními zbytky (T416, E418, E419, E420, N423), zatímco vnitřní strana je lemována hydrofobními aminokyselinami (M417, L421J424). Je možné, že _ dvojstranný charakter příklopu vchází do hry po vazbě membránového fosfolipidu, protože jeden povrch má schopnost vytvářet kontakty pomocí vodíkových vazeb, zatímco druhý má sklon _k hydrofobním interakcím buď se substrátem nebo membránou. _

Pokusy modelovat molekulu diacylfosfolipidu v aktivní spáře CPLA2 v místě s příklopem ukázaly, že acylesterová vazba nemůže být umístěna v sousedství šeřinu aktivního centra bez vzniku kolisí s obklopujícími zbytky. Proto je tedy myslitelné, že vytvoření vhodného prostoru pro vazbu substrátu vyžaduje pohybování příklopu, představy v souhlase s pozorováním, že CPLA2 projevuje větší aktivitu v přítomnosti micelárních, spíše než monomerických substrátů (Cygler a Schrag, 1997), což je fenomén známý jako interfaciální aktivace.

Většina lipáz projevuje interfaciální aktivaci jako výsledek konformačního přeskupení příklopu, která pokrývá aktivní centrum v uzavřené formě enzymu. Příklop se pohne stranou po vazbě micel a tak generuje otevřenou formu, ve které jsou katalytické zbytky exponovány vůči substrátu. Rentgenová krystalografie poskytla mnohočetné příklady tohoto aktivačního mechanismu určením struktur lipáz v obou formách, uzavřené a otevřené, v případě posledně jmenované krystalizované z největší části v přítomnosti inhibitorů (Cygler a Schrag a spol.,

1997). Je pravděpodobné, že interfaciální^- aktivační mechanismus cPLA₂ je srovnatelný s oním, u jiných příklop obsahujících lipáz v tom, že pohybování příklopu je klíčový stupeň pro zvětšení přístupné oblasti povrchu nálevkovitého aktivního centra, stejně-jako pro poskytnutí nebráněného přístupu ker katalytickým zbytkům.

Aktivní centrum CPLA2 obsahuje katalytickou diádu

Hydrolýza acylů α/β hydrolázami je uskutečňována katalytickou triádou (SerAsp/Glu-His) připomínající jednu v serinových proteázách z přítomných. Acylesterová vazba v substrátu je atakována nukleofilním serinem za vzniku kovalentně vázaného intermediátu acyl-enzym, který je potom uvolněn ve stupni, který zahrnuje atak molekuly vody. I když všechny lipid metabolizující enzymy s α/β stočením hydrolázy probíhají za využití katalytické triády, identifikace všech členů takové triády u CPLA2 se ukazuje být náročným úkolem. Polohově zaměřená mutagenese provedená Sharpem a spolupracovníky (1994) stanovila roli Ser228 a Asp549 při katalýze; selhání každého z 19 histidinových zbytků k ovlivnění aktivity však poukázalo na nový katalytický mechanismus (Pickard a spol., 1996). Tato pozorování vedla mnohé k předpokladu, že cPLA₂ obsahuje nové katalytická centrum, které nevyžaduje participaci histidinu, protože význarřjost Arg200 pro aktivitu zůstává neznámá (Leslie, 1997; Pickard a spol., 1996). — • · · «

Rentgenová krystalová struktura cPLA jasně odhaluje aktivní centrum, ve kterém Ser228 sedí na spodku nálevkovitě tvarované dutiny; Οδ2 v Asp549 leží ve vzdálenosti 2,9 A od jeho Ογ atomu (Obr. 5b). Je však jasné, že aktivní centrum CPLA2 postrádá histidinový zbytek. Mimo to nejsou v rozsahu 6 A žádné jiné zbytky, které by mohly v aktivním centru plnit funkci base. Veškeré polární příspěvky v rozsahu 3,5 A od každého ze zbytků jsou vytvářeny skupinami v řetězci páteře nebo osamocenou molekulou vody umístěnou 3,2 A vzdálenou od 051 v Asp549. I když Asn555 lemuje nálevku aktivního centra, jeho N52 atom je vzdálen přibližně 6 A od každého z residuí a nebyl by ideálním kandidátem na plnění této funkce.

Po ataku na sn-2-polohu glycerofosfolipidického substrátu vyžaduje transitní stav u acylhydroláz stabilizaci oxyaniontovým otvorem nebo soustavou donorů vodíkových vazeb (obvykle amidových atomů) a/nebo basickými zbytky s funkcí stabilizovat rozvoj negativního náboje transitního stavu. U některých lipáz nejméně jeden ze zbytků, které přispívají do oxyaniontového otvoru, je součástí pohyblivé smyčky a vhodné konformace je dosaženo, jenom když je lipáza otevřené formě; toto uspořádání není však absolutním požadavkem. Gly197 a 198 v CPLA2 jsou součástí na glycin bohaté smyčky mezi β4 a Helixem B; toto umístění dovoluje, že amidové skupiny Gly 197 .a Gly198 jsou dobrými uchazeči na členy přeformovaného oxyaniontového otvoru (viz Obr. 5b). Vedle toho amidová skupina Gly229 v řetězci páteře, která je na vrcholu otáčky mezi β5 a Helixem C, směřuje rovněž do směru smyčky Gly197, a proto může být také součástí otvoru. Proto se tedy tako oblast, téměř jako oxyaniontový otvor v chymotrypsinu, ukazuje jako dobře určená pro stabilizaci tetrahedrálního intermediátu vznikajícího nukleofilním atakem esteru.

Pro Arg200 bylo navrženo velké množství rolí. Byl implikován do poskytování podpory pro CaLB ve vázání enzymu k lipidovému rozhraní; pro interakci s fosfolipidovou membránou; pro participaci jako katalytický zbytek; pro stabilizaci acylenzymového intermediátu; nebo asociaci s fosforylovou skupinou fosfolipidového substrátu (Pickard a spol., 1996). Umístění Arg200 uvnitř nálevkovitě dutiny (oblast jejího povrchu je na Obr. 5a vybarvena červeně), mu zabraňuje poskytovat jakoukoliv podporu vázání lipidu na CaLB. Vedle toho jeho postranní řetězec je vzdálen asi 9 A od šeřinu v aktivním centru a to mu brání v hraní role při katalýze. Avšak Arg200 tvoří několik klíčových kontaktů se zbytky kolem nálevkovitě části aktivního centra.

[anní řetězec vytváří solný můstek s Thr680 a kontaktuje atomy Phe678 řetězce • »4 · * ·· « 4 4 · ♦

444 · · · » · 4 4 páteře, z nichž oba leží ve smyčce mezi helixy Hal. Umístění Arg200 na smyčce oxyaniontového otvoru naznačuje, že nedostatek těchto dvou vodíkových vazeb v mutantu Arg200 Lys, publikovaný Pickardem a spolupracovníky (1996), by mohl být zodpovědný za jemné alterace v konformaci smyčky oxyaniontového otvoru s dramatickými důsledky pro aktivitu.

Katalýza s cPLA₂ probíhá mechanismem odlišným od mechanismu jiných acylhydroláz

Absence histidinového zbytku nebo kterékoli jiné potenciální base v aktivním centru CPLA2 nasvědčuje, že enzym podněcuje hydrolýzu acylů novým katalytickým mechanismem. V serinových proteázách i jiných hydrolázách přijímá histidinový zbytek proton od hydroxylové skupiny reaktivního sehnu a tak usnadňuje vytvoření kovalentního tetraedrálního intermediátu. Ve druhém stupni je intermediát acylenzymu hydrolyzován molekulou vody, aby se uvolnil produkt obnovující v enzymu serinový hydroxyl. Třída ATEM-1 β laktamázy, jejíž katalytická cesta zahrnuje rovněž acylaci 'šeřinu v aktivním centru _ následovanou hydrolýzou esterové vazby, transferuje proton ze Ser70 v aktivním Oentru ná karboxylátovou skupinu u Glu166 buď přímo ( Gibson a spol., 1990) nebo cestou molekuly vody (Lamotte-Brasseur a spol., 1991). Současnější studie (Damblon a spol., 1996) naznačily, že dlouhá vzdálenost mezi karboxylátovými kyslíky Glu166 a Ser70 zabraňuje přímému transferu protonu, avšak pro přenos protonu nabízejí participaci přemosťující molekuly vody. V katalytickém mechanismu penicilinové acylázy (Duggleby a spol.,

1995), která obsahuje jednotný zbytek katalytického centra složený z N-terminálního šeřinu, přemosťující molekula vody zprostředkovává basický charakter aaminoskupiny Ser 1. Jako důsledek má Ογ atom Ser1 svoji nukieofilitu dostatečně zvýšenou terminální aminoskupinou a vytvoření intermediátu acyl-enzymu následuje.

V CPLA2 jediným zbytkem schopným hrát roli generální base je Asp549, protože tam nejsou jiné postranní řetězce v okruhu 3,5 A od Ογ atomu v Ser228. Obr. 6 ukazuje model navrhovaný pro katalytický mechanismus CPLA2. Jakmile se enzym naváže na membránu, váže se na aktivní centrum jednotlivá molekula fosfolipidu. Fosfátová část čelní skupiny (HG na Obr. 6) je stabilizována postranním řetězcem Arg200. Oxyaniontový otvor-vytvorený amidovými skupinami Gly197 v řetězci-páteře

•	···· · ·· ·· · • · · · · · ··· ··. · · · · * · • ······

a Gly198 také vykazuje polarizaci sn-2-esteru a stabilizaci tetraedrálního intermediátu utvořeného v panelu B. Po vytvoření komplexu enzym-substrát působí Asp549 jako katalytická base a abstrahuje proton z hydroxylové skupiny reaktivního Ser228, který atakuje sn-2-ester a tvoří acyl-enzym cestou stabilizovaného tetraedrálního intermediátu. Acyl-enzym je potom hydrolyzován molekulou vody (panel C), aby poskytl volný lyso-fosfolipid a po kolapsu dvojné vazby arachidonylového intermediátu, volnou arachidonovou kyselinu (AA na Obr. 6; panel D a E). CPLA2 může potom disociovat od rozhraní membrány nebo vázat jiný fosfolipidový substrát a cyklus zopakovat. Je tedy CPLA2 třetím odlišným příkladem acylázy, která využívá nukleofilní serin bez kompletní katalytické triády.

Diskuse

Navzdory velké asymetrické jednotce (1498 aminokyselin) a křehkosti krystalů CPLA2, bylo MAD fázování úspěšné pro vytvoření vysoce kvalitní mapy elektronové hustoty z dat získaných z monokrystalu. Hlavní pro tento úspěch byly velké Bijvoet- ovy a dispersivní diference typické pro Lm hranu atomu lanthanidu, spojenou s vysokým tokem a stabilitou vlriovýclr délek u Advanced Light Scurce (Berkeíey, CA). S příchodem synchrotronů třetí generace by MAD měla být rutinně používána pro řešení struktur velkých makromolekul.

CPLA2 je nezbytná pro biosyntézu lipidových mediátorů zánětu, jak bylo prokázáno využitím myší nemajících dostatek cPLA₂ (Bonventre a spol., 1997; Uozumi a spol., 1997). Protože leukotrieny, prostaglandiny a PAF hrají významné role v patofysiologii chorob majících závažný obecný dosah, je nezbytným požadavkem porozumět, jak je jejich biosyntéza regulována. Struktura CPLA2 poskytuje nové pohledy na původ arachidonylové selektivity a regulaci vlivem fosforylace. Mimo to identifikuje u lipáz jak nové stočení tak mechanismus. Struktura cPLA₂ je teprve druhá, ve které lze vidět C2 doménu v kontextu s celkovým proteinem. Výrazné rozdíly lze vidět mezi PLC61 a CPLA2.

Zavinutí CPLA2 ukazuje jasně, že enzym se skládá ze dvou. nezávisle stočených domén. Tento výsledek nebyl neočekávatelný na základě dřívější práce, ve které CaLB a katalytické domény byly zcela funkční, když byly nezávisle exprimovány. Avšak co bylo překvapující, byl řídký kontakt a potenciální flexibilita mezi doménami. I když C2 domény jsou obvykle pozorovány při označování molekul, • · bylo až doposud publikováno pouze, že v souvislosti s katalytickou doménou je v krystalové struktuře PLC61 přítomná C2 doména (Essen a spol., 1996). V tomto případě existují extensivní hydrofobní kontakty mezi téměř celým povrchem čela C2 domény a katalytickou doménou. Na rozdíl od toho interakce mezi katalytickou a CaLB doménami u cPLA₂ jsou dostatečně omezovány, protože konformace polypeptidu spojujícího dvě, v rozdílných monomerech asymetrické jednotky, jsou odlišné. Toto pozorování má mechanistický význam v tom, že optimální orientace CaLB a katalytických domén není fixována, ale místo toho může být jistým způsobem regulována. Je zajímavé zaznamenat, že i když je rozrušena oblast proteinu včetně Ser505, která je podstatná pro optimální aktivitu v buňkách, je toto důležité místo MAP-kinázy lokalizováno blízko oblasti pantu.

Podrobné srovnávání struktury cPLA₂ a klasického svinutí α/β hydrolázy dokazuje, že cPLA₂ má novou topologii. Avšak, jak bylo dříve poznamenáno, β stočení obsahující serin v aktivním centru je strukturně analogické nukleofilnímu kolenu svinutí α/β hydrolázy. Kritický průzkum katalytické domény cPLA₂ vykazuje rozšířenou oblast homologie mezi PLBs a cPLA₂ α, β a γ, která zahrnuje zbytky ~ 190-232. Tato homologie má funkční důležitost v tom, že obsahuje Arg200; oblasti hlavního'řetězce obsahující oxyaniontový otvor stejně jako nový motiv CXSXS lipázy, ve kterém druhý serin nahrazuje klasický glycin. Tato koncentrace homologie na krátkém úseku je vysvětlována také genomickou strukturou, kde jsou tyto zbytky zakódovány jediným exonem (který odpovídá zbytkům 186-238).

Místo obsahu katalytické triády Ser, His, Asp/Glu, kterou lze nalézt v α/β hydrolázách, štěpí cPLA₂ sn-2-ester za využití diády složené ze Ser228 a Asp549. Karboxylát v Asp549 je k aktivaci šeřinu pro nukleofilní atak jediným zbytkem v dostatečně těsné blízkosti. Podobná katalytická diáda byla navržena pro hydrolytickou reakci amidu katalyzovanou třídou A β-laktamáz (Matagne a spol.,

1998). V tomto případě však postranní řetězec glutamátu aktivuje serinový zbytek skrze intervenující molekulu vody. I když je nesnadné zhodnotit srovnatelnou efektivitu diady versus triáda, je pozoruhodné, že to je pro dosažení transitního stavu potřebná aktivační energie, která je u katalýzy důležitá. Proto tedy stabilizace díky efektivnímu oxyaniontovému otvoru může vykompensovat méně nukleofilní serin. V této krystalové struktuře amidové skupiny glycinů 197 a 198 v hlavním řetězci, umístěné pouze dva zbytky od kritické Arg20(J, jsou vhodně umístěny, aby působily ♦··· »44 44 * • · · ······ <

« · · 4 4 4 4 4

444 444 444 4· 44 444 jako oxyaniontový otvor. NH u Gly229 v hlavním řetězci by mohla možná také napomoci ke stabilizaci oxyaniontu vytvářejícího se v transitním stavu a přítomného v tetraedrických intermediátech. Efektivita oxyaniontového otvoru je konsistentní s

NMR studiemi, kde se ukazuje, že se arachidonyl-trifluormethylketon váže na enzym jako ionizovaný hemiketal.

Katalytický serin v CPLA2 je přítomen v hluboké nálevkovité dutině blízko centra katalytické domény. Pokusy modelovat fosfolipid do aktivního centra ukázaly, že běžná konformace nálevky aktivního centra nebyla dostatečně veliká. Proto tedy navrhujeme, že poněkud mobilní příklop, jehož C-zakončení je spojeno s neuspořádaným úsekem 23 aminokyselin, se po navázání membrány může pohybovat a tak poskytne větší přístupný prostor blízko vrcholu nálevky pro přizpůsobení substrátu. Krystalové struktury pankreatické lipázy/kolipázy jak v přítomnosti tak nepřítomnosti substrátu/micel detergentu poskytují precedens pro tento model (van Tilbeurgh a spol.,, 1993). V tomto případě dochází k dramatické změně konformace v přítomnosti micel nebo inhibitorů mající za následek pohyb příklopu až na 29 A, aby se exponovala aktivní spára a hydrofobní část. Tak velké strukturní modifikace byly zaznamenány u dalších proteinů α/β hydrolázy. Tyto

- konformační změny po navázání povrchu membrány byly využity k vysvětlení “ procesu interfaciální aktivace, při kterém katalytická aktivita lipázy je v řádech větší vůči substrátům přítomným ve formě micel než jako monomer.

V případě CPLA2 byla její lysofosfolipáza využita ke srovnání její aktivity vůči témuž substrátu přítomnému buď jako monomer nebo jako součást micely. Taková měření odhalila, že aktivita CPLA2 vzrůstá ~ 1500-krát, zatímco u 1-palmitoyl-2lysofosfatidylcholinu vzrůstá pouze 1O-krát; CPLA2 je tedy mnohem více aktivní vůči substrátům přítomným v plošné formě. Naše struktura nasvědčuje, že konformační změna diktovaná pohybem flexibilního příklopu nastává po navázání membrány; toto pozorování je konsistentní s dříve pozorovanou interfaciální aktivací.

Vedle pohybu příklopů kryjících aktivní centra některé struktury ukázaly, že oxyaniontový otvor, který stabilizuje tranzitní stav, je úplně zformován pouze v přítomnosti vázaného substrátu nebo inhibitoru (Cygler a Schrag, 1997). Výjimkou z tohoto obecného pravidla je kutináza v tom, že oxyaniontový otvor je úplně zformován v nativní struktuře. Je důležité, že kutináza nevykazuje interfaciální aktivaci (Martinez a spol., 1992).

• · φ φφ·· * φφφ φ · · * · · φ · · * φ φφφ • ΦΦ φφφ ··· ··

Selektivita CPLA2 pro arachidonyl obsahující fosfolipidy je charakteristickým rysem. SPLA2 o nízké molekulové hmotnosti nerozlišují mezi různými mastnými kyselinami, zatímco cPLA₂ v četných analytických studiích vykazuje vysokou selektivitu pro arachidonyl a jiné mastné kyseliny s cis-dvojnými vazbami v polohách 5 a 8 (Clark a spol., 1995; Gelb aasn-1 a sn-2, Gelb hydrazin). Před určením struktury byl původ selektivity CPLA2 neznám. Bylo představitelné, že katalytický systém byl lokalizován blízko povrchu enzymu, kde mohl působit na sn-2 ester bez extrahování lipidu z dvojvrstvy. Ten by byl analogický k vyrovnané kinázové doméně u PI4 kinázy, kde se má za to, že enzym účinkuje na čelní skupinu lipidu bez extrahování samotného fosfolipidu (Rao a spol., 1998). V případě CPLA2 bychom předpokládali, že selektivita bude díky větší expozici sn-2 esteru vzhledem k volnému obalu polynenasycených mastných kyselin. Avšak jak vidíme ve struktuře, fosfolipid se musí vázat ~ 8-10 A hluboko do aktivního centra. Selektivita musí být tedy zapříčiněna interakcemi mezi arachidonylovým podílem a enzymem. Aby se stanovily rozdíly v selektivitě bude informativní mutovat zbytky, které se liší mezi a a γ cPLA₂ a to v aktivním centru a nekompletně zachované oblasti příklopu.

Preferované metody podávání a ďávkování substancí identifikovaných podle vynálezu

Zde používaná aktivita enzymu fosfolipázy znamená aktivitu v eseji pro metabolismus fosfolipidů (nejlépe jeden z esejů popsaných v příkladu 2 níže nebo popsaných v některém ze zde uvedených odkazů). Sloučenina má aktivitu inhibující enzym fosfolipázy, když inhibuje aktivitu fosfolipázy (nejspíše CPLA2) při kterémkoliv vhodném eseji na enzymovou aktivitu (nejlépe esej popsaný níže v příkladu 70). Při preferovaných provedeních má sloučenina (1) hodnotu IC50 menší než kolem 25 μΜ při LysoPC eseji; (2) hodnotu IC50 menší než kolem 50 μΜ při váčkovém eseji a/nebo (3) hodnotu IC50 menší než kolem 1 μΜ při PMN eseji.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu a ursolová kyselina jsou platné pro inhibici aktivity enzymu fosfolipázy (nejspíše CPLA2) a jsou tudíž užitečné při léčení (tj. léčbě, prevenci nebo zlepšování) zánětlivých nebo se zánětem příbuzných stavů (např. reumatoidní artritida, psoriasis, astma, zánětlivá střevní choroba a další » · nemoci zprostředkovávané prostaglandiny, leukotrieny nebo PAF) a dalších stavů jako je osteoporósa, kolitida, myelogenní leukemie, diabetes, úbytě a aterosklerosa.

Předkládaný vynález zahrnuje jak farmaceutické kompozice tak terapeutické metody léčení nebo využití, kdy se užívají sloučeniny podle předkládaného vynálezu.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být užívány ve farmaceitické kompozici v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem. Taková kompozice může obsahovat rovněž (vedle sloučeniny nebo sloučenin podle předkládaného vynálezu a nosiče) ředidla, plniva, soli, pufry, stabilizátory, solubilizátory a další materiály, které jsou v praxi oboru běžné. Termínem farmaceuticky přijatelný se rozumí netoxický materiál, který neinterferuje s efektivitou biologické aktivity účinné ingredience(í). Charakteristika nosiče bude záviset na cestě podávání. Farmaceutická kompozice podle vynálezu může obsahovat také cytokiny, lymfokiny nebo jiné hematopoetické faktory jako M-CSF, GM-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, G-CSF, Meg-CSF, kmenový buněčný faktor a erytropoetin. Farmaceutická kompozice může dále obsahovat jiné protizánětlivé prostředky. Takové přídavné faktory a/nebo prostředky mohou být zahrnuty“ do farmaceutické kompozice, aby vyvolaly synergetický účinek se sloučeninami podle předkládaného vynálezu; nebo aby minimalizovaly vedlejší účinky způsobené sloučeninami podle předkládaného vynálezu. Naopak sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být zahrnovány do formulací jednotlivého cytokinu, lymfokinu, dalšího hematopoetického faktoru, trombolytického nebo antitrombolytického faktoru nebo protizánětlivého prostředku k eliminování vedlejších efektů, cytokinu, lymfokinu, dalšího hematopoetického faktoru, trombolytického nebo antitrombolytického faktoru anebo protizánětlivého prostředku.

Farmaceutická kompozice podle vynálezu může být ve formě liposomu, ve kterém jsou sloučeniny podle předkládaného vynálezu, vedle dalších farmaceuticky přijatelných nosičů, spolu s amfipatickými prostředky jako lipidy, které existují v agregované formě jako micely, nerozpustné monovrstvy, kapalné krystaly nebo lamelární vrstvy ve vodném roztoku. Vhodné lipidy pro liposomální formulace bez omezení představují monoglyceridy, diglyceridy, S⁴u)fatidy, lysolecitin, fosfolipidy, saponin, žlučové kyseliny a podobně. Příprava takových liposomálních formulací odpovídá úrovni zkušeností v oboru, jak je popsáno na příklad v U. S. patentu č. 4 235 871; U. S. patentu č. 4 501 728; U. S. patentu č. 4 837 028 ; U. S. patentu č. 4 737 323, a na všechny se zde_odkazuje. __ ♦ Φ· 9 · ·* ··♦ • · · · · φ · φ φ •φφ · · · φ φ· • · · · · · · 9· • · · · Φ Φ· ··♦ 9·Φ φ· ΦΦ Φ·Φ

Zde používaný termín terapeuticky účinné množství znamená celkové množství každé účinné složky farmaceutické kompozice nebo metodu, která je dostatečná, aby prokázala u pacienta významný prospěch, tj. při léčení, hojení, prevenci nebo zlepšování protizánětlivé odezvy nebo stavů nebo zvýšení rychlosti při léčení, hojení, prevenci nebo zlepšování takových stavů. Když je jednotlivci aplikována účinná ingredience a podávána samotná, vztahuje se termín pouze na tuto ingredienci. Je-li aplikována kombinace, vztahuje se termín na spojená množství účinných ingrediencí, jejichž výsledkem je terapeutický efekt, ať už jsou podávána v kombinaci, po sobě nebo simultánně.

Při praktikování způsobu ošetřování nebo využití podle předkládaného vynálezu se savci ve stavu, který má být ošetřován, podává terapeuticky účinné množství sloučeniny podle předkládaného vynálezu. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být aplikovány v souhlase se způsobem podle vynálezu buď samotné, nebo v kombinaci s dalšími terapiemi jako léčbou využívající jiné protizánětlivé prostředky, cytokiny, lymfokiny nebo další hematopoetické faktory. Jestliže dochází ke společné administraci s jedním nebo více protizánětlivými prostředky, cytokiny, lymfokiny nebo dalšími hematopoetickými faktory,, mohou být sloučeniny podle předkládaného vynálezu podávány buď současně s dalším(i) “ protizánétlivým()i prostředkem(y), cytokinem(y), lymfokinem(y) nebo dalším(i) hematopoetickým(i) faktorem(y), trombolytickými nebo antitrombolytickými prostředky anebo podávány postupně. Pokud jsou podávány postupně, bude o pořadí podávání sloučenin podle vynálezu v kombinaci s dalším(i) protizánětlivým()i prostředkem(y), cytokinem(y), lymfokinem(y) nebo dalším(i) hematopoetickým(i) faktorem(y), trombolytickými nebo antitrombolytickými prostředky rozhodovat ošetřující lékař.

Podávání sloučenin podle vynálezu použitých ve farmaceutické kompozici, nebo praktikování metody podle vynálezu, může být prováděno řadou konvenčních způsobů jako ústním užíváním, inhalací nebo kutánní, subkutánní či intravenosní injekcí.

Když je terapeuticky účinné množství sloučenin podle předkládaného vynálezu aplikováno orálně, budou sloučeniny podle vynálezu ve formě tablety, kapsle, prášku, roztoku nebo tinktury. Při podávání ve formě tablet může farmaceutická kompozice podle vynálezu dodatečně obsahovat pevný nosič jako želatinu nebo adjuvant. Tableta, kapsle a prášek obsahují kolem 5 % až 95 % sloučeniny podle_ předkládaného vynálezu a nejlépe 25 % až 90 % sloučeniny_podle předkládaného vynálezu. Když se podává v kapalné formě může být přidán kapalný nosič jako voda, petrolej, oleje rostlinného původu jako podzemnicový olej, minerální olej, sojový olej nebo sezamový olej či syntetické oleje. Kapalná forma farmaceutické kompozice může dále obsahovat fysiologický solný r^tok, dextrosu nebo roztok jiného sacharidu, nebo glykoly jako ethylenglykol, propylenglykol nebo polyethylenglykol. Když se podává v kapalné formě obsahuje farmaceutická kompozice od kolem 0,5 % až do 90 % hmotnosti sloučeniny podle předkládaného vynálezu a nejlépe od kolem 1 % do 50 % sloučeniny podle předkládaného vynálezu.

Jestliže se terapeuticky účinné množství sloučeniny podle předkládaného vynálezu podává intravenosní, kutánní nebo subkutánní injekcí, budou sloučeniny podle předkládaného vynálezu ve formě parenterálně přijatelného vodného roztoku bez pyrogenů. Příprava takových parenterálně přijatelných roztoků proteinů s ohledem na pH, isotonicitu, stabilitu a podobně, patří k řemeslným dovednostem v oboru. Preferovaná farmaceutická kompozice pro intravenosní, kutánní nebo subkutánní injekci by vedle sloučenin podle předkládaného vynálezu měla obsahovat isotonické vehikulpm jako injekční chlorid sodný, Ringer-ovu injekci, injekční dextrosu, injekční dextrosu a chlorid sodný, laktatisováná Ringer-ova injekce a další vehikula, která se v oboru používají.- Farmaceutická kompozice podle předkládaného vynálezu může rovněž obsahovat stabilizátory, konservační prostředky, pufry, antioxidanty nebo další aditiva, která jsou odborníkům známá.

Množství sloučenin(y) podle předkládaného vynálezu ve farmaceutické kompozici podle předkládaného vynálezu bude záviset na povaze a závažnosti stavu, který má být ošetřován a na povaze dřívějších ošetření, které pacient podstoupil. O množství sloučeniny podle předkládaného vynálezu, se kterým má být ošetřován každý jednotlivý pacient, bude nakonec rozhodovat ošetřující lékař. Zpočátku bude ošetřující lékař předpisovat nízké dávky sloučeniny podle předkládaného vynálezu a pozorovat odezvu u pacienta. Větší dávky sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být podávány dokud není u pacienta dosaženo optimálního terapeutického účinku a od tohoto bodu se dávkování dále nezvyšuje. Uvažuje se, že různé farmaceutické kompozice používané k praktikování metody podle předkládaného vynálezu by měly obsahovat kolem 0,1 pg až kolem 100 mg (spíše kolem 100 pg až kolem 50 mg, nejlépe 100 pg až kolem 5 mg) sloučeniny podle předkládaného vynálezu na kg tělesné hmotnosti.

« ·♦· ♦ · ·♦ ·♦ « · · * · · · ♦ · · • ··· · · · · · • ······ ··· ·· · ♦ ·· ·

Trvání intravenosní terapie při použití farmaceutické kompozice podle předkládaného vynálezu bude kolísat v závislosti na léčené chorobě a stavu a potenciální idiosynkratické odezvě každého jednotlivého pacienta. Uvažuje se, že trvání každé aplikace sloučenin podle předkládaného vynálezu bude v rozsahu 12 až 24 hodin kontinuální intravenosní aplikace. O přiměřeném trvání intravenosní terapie při použití farmaceutické kompozice podle předkládaného vynálezu bude nakonec rozhodovat ošetřující lékař.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1. Experimentální mapa vytvořená s MAD fázemi získaná rozptylem Tb atomu na 749 zbytků cPLA₂. Pro vytvoření mapy bylo použito vyrovnání rozpouštědla (obsah rozpouštědla 60 %) a dvojnásobné průměrovánf nekrystalografické symetrie v DM.

Obr. 2 (A) . Páskový diagram monomeru CPLA2. CaLB doména je uvedena zeleně se dvěma Ca²⁺ atomy vyobrazenými červeně. Struktura čepičky u cPLA₂ je zbarvena purpurově.- Pohyblivé smyčky s nízkou elektronovou hustotou jsou zobrazeny tečkované. Flexibilní spojovací článek mezi CaLB a katalytickou doménou je zbarven červeně. Uvedeny jsou také polohy 4 serinových zbytků, které jsou v cPLA₂ fosforylovány. Obrázek byl vytvořen s Molscript (Kraulis, 1991) a RASTER3D (Bacon a Anderson, 1998).

(B) . GRASP diagram povrchu cPLA₂. Zbytky, které vykazují N¹⁵/NH posuny po interakci s micelami dodecylfosfocholinu při NMR experimentech podle Xu a spol. (1998) jsou vybarveny červeně. Aktivní spára u CPLA2 je zobrazena červeně. Residua příklopu byla pro jasnost odstraněna.

(C) . Znázornění povrchového potenciálu cPLA₂ s basickými zbytky v modrých odstínech a kyselými zbytky červeně. Residua příklopu byla pro jasnost odstraněna. Vysoce basický úsek je jasně viditelný ve vazebné oblasti membrány. Obrázek byl vytvořen s GRASP (Nicholls, 1992). Všechny náhledy mají stejnou orientaci.

Obr. 3 (A). Richardsonovo zobrazení kanonického stočení α/β hydrolázy. β prameny jsou zobrazeny jako šipky, zatímco a helixy jsou obdélníky. Číslování sekundárních • #4 * ♦ ·♦ ·« · * · · · · · t · · ··· · * · · · · • *♦··· ··· * · w ·· ·· ♦ ·♦ strukturních elementů je podle přehledu Schraga a Cyglera (1997). Helic C, který následuje bezprostředně po nukleofilním kolenu je zbarven růžově.

(B). Richardsonův diagram stočení CPLA2. Schéma číslování bylo sestaveno tak, že helix bezprostředně následující po Ser288 je Helix C jako u kanonického stočení α/β hydrolázy. Centrální jádro je zbarveno žlutě pro snadnější srovnávání s kanonickým stočením α/β hydrolázy u (A). Elementy skládající čepičku jsou zbarveny purpurově; oblasti smyčky v červené barvě jsou vysoce mobilní a nevykazují vystopovatelnou elektronovou hustotu.

Obr. 4. Primární seřazení cPLA₂ α, β a γ. Identické zbytky jsou v plných rámečcích, zatímco sekundární strukturní elementy pozorované v rentgenové krystalové struktuře CPLA2 a jsou označeny pod sekvencemi. Sekundární strukturní elementy mimo oblast čepičky jsou uvedeny žlutě, zatímco v oblasti čepičky jsou uvedeny, v purpurové barvě. Černé linky představují arey otáček nebo smyček. Zbytky.neoznačené černými linkami nebo sekundární strukturní elementy nevykazují vystopovatelnou elektronovou hustotu.

Obr. 5 (A) . Povrchový diagram ukazující katalytickou doménu CPLA2 krytou zbytky čepičky. Ser228 je ukázán na spodku riálevkovítého tvaru. Pokračování sekvence, která na experimentální mapě není viditelná, je představováno červenými tečkami a předpokládá se, že se podílí na vytvoření pantu příklopu. Residua, u nichž jsou v mapách elektronové hustoty viditelné pouze atomy hlavního řetězce páteře, jsou zobrazeny jako alaniny. Odkryté povrchy všech hydrofobních zbytků jsou vybarveny modře a zbytek Arg200 byl vybarven červeně. Obrázek byl vytvořen s GRASP (Nicholls, 1992).

(B) . Detail aktivního centra CPLA2 v poloměru 7 A kolem Ser228. Dva zbytky zúčastňující se přímo při katalýze jsou zbarveny zeleně. Arg200 a smyčka skrývající v sobě zbytky Gly197 a Gly198 jsou zbarveny žlutě. Jediná molekula vody viditelná v experimentální mapě se vodíkovými vazbami váže s Asp549 a karbonylovými atomy u Trp393 a Trp330. Obrázek byl vytvořen s Molscript a RASTER3D.

Obr. 6. Katalytický mechanismus navržený pro CPLA2 zahrnující atak Ser228 na sn-2 polohu glycerofosfolipidického substrátu. AA: arachidonová kyselina; HG: skupina na vrcholu; C18: oktadecylová skupina. Gly197 a Gly198jsou navrženy jako *444 « ·· ··* · 4 · 4 4 « · • 444 #44 44 součást oxyaniontového otvoru, zatímco Arg200 stabilizuje fosfátový podíl skupiny na vrcholu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Produkce proteinu, krystalizace a sběr dat

Lidská cPLA₂ kompletní délky (zbytky 1 - 749) byla klonována na vektor pMT2-EMC-cPLA₂ a transfektována do CHO buněk. Vzniklá řada buněk ES-CHO byla pěstována v a mediu (Gibco) obsahujícím 10 obj. % dialyzovaného telecího plodového séra a 10 μΜ methotrexatu jak popsal Lín a spol. (1992). Buněčné pelety byly typicky lýzovány v pufru pH 9,0 a cPLA₂ v supernatantu byla následně srážena pomocí (NHUhSCU Vícečetné kroky včetně afinitní a gelové permeační chromatografie poskytly vzorky proteinu, které byly vhodné pro krystalizační experimenty. Typický výtěžek ze 100 g pelet by byl 15-25 mg čisté cPLA₂.

Kry_staly cPLA₂ byly získány difusí par při 18°C za_použití PEG 1000 jako precipitantu při 12 mg/mf proteinu. Přes noc še objevily typicky destičkovité krystaly a v průběhu jednoho týdne pokračovaly v růstu do maximální velikosti 0,6 mm x 0,5 mm x 0,1 mm. Nativní a těžkým atomem nasáknuté krystaly byly podrobeny kryoprotekci přenosem do vzrůstajících množství PEG 400 a DMSO. Krystaly modifikované těžkým atomem byly připraveny nasakováním nativních krystalů přes noc v kryoroztoku s CaCI₂ nahrazeným 250 mM GdCI₂ nebo TbCI₂. Krystaly po kryoprotekci byly před sběrem dat bleskově ochlazeny v proudu kapalného dusíku při 100 K.

Difrakční data nativního, Gd- a Tb-nasáknutých krystalů byla snímána při směru paprsku 5.0.2 na Advanced Light Source za použití Quantum 4 CCD detektoru (Area Detector Systems). Vzhledem k ciltlivosti krystalu bylo první zobrazení každého datového souboru analyzováno pomocí STRATÉGY (R. Ravelli) ve snaze spočítat minimální množství sejmutí dat potřebných pro kompletní datový soubor. Po stanovení optimálního výchozího bodu byla data snímána během 90° rozmítání, po němž byly krystaly otočeny do polohy o 180° proti výchozímu bodu a druhé 90°rozmítání bylo sejmuto za účelem maximalisování akumulace Bijvoet-ova páru. Krystaly začaly projevovat radiační citlivost—po přibližně 100° sběru dat, což • · w ······ • « · · · · · • · ·*· ··· ·· a· · činilo nutné posunovat je podél rotační osy mezi změnami vlnových délek. Tato metodologie se osvědčila jako úspěšná v tom, že data sejmutá při třech různých vlnových délkách vykazovala podobnou statistiku. Všechna data byla shromažďována při 100 K a zpracovávána s DENZO/SCALEPACK (Otwinowski, 1993).

Polohy těžkého atomu - Obě polohy Tb byly identifikovány visuálním prozkoumáním Patterson-ových map při využití difrakčních dat snímaných na vrcholu vlnové délky Tb L_m okraje, potvrzujícím výsledky z předchozího nižšího rozlišení Tb a Gd datových souborů shromážděných z vlastního domácího Raxis IV detektoru (Molecular Structure Corp.). Rafinace a fázování parametrů těžkého atomu bylo uskutečněno pomocí SHARP (de Ia Fortelle a Bricogne, 1997). Modifikace hustoty byla udělána pomocí SOLOMON (CCP4), jak se v SHARP provádí. Vysoce kvalitní experimentální 3,2 A mapa elektronové hustoty umožnila určení polohy úplné CaLB domény, právě tak jako počáteční záznam a stanovení sekvence katalytické domény (QUANTA). Tato procedura usnadnila výpočet masky obsahující oblast proteinu, která byla včleněna do dalších výpočtů. Ty zahrnují dvojnásobné průměrování nekrystalické symetrie a extensi fáze od 3,2 A do 2,5 A s použitím difrakčních dat v DM (Cowtan a spol., 1996). Cykly kombinace fáze a rafinace byly prováděny s REFMAC (Mushudov a spol., 1997) vytvářejícím mapu, ve které může být rozpoznána většina modelu včetně centrálních zbytků flexibilního příklopu.

Rafinace - Cykly obnovování stejně jako zpřesňování polohových a termálních parametrů pomocí XPLOR (Brůnger, 1992b) byly použity ke zdokonalování modelu, který byl podroben simulované rafinaci ochlazením (12 - 2,5 A), když R-volné kleslo pod 32 % (Brůnger, 1992a). Následující stadia budování modelu byla prováděna za pomoci vynechání map generovaných maximálně-možnou rafinaci, jak se uskutečňuje v BUSTER (Bricogne, 1993). Rafinace zahrnuje rovněž jednotnou korekci objemu rozpouštědla (Bsol = 23,8 A²; ksol = 0,305 e / A³) a aplikaci nekrystalografických symetrických omezení. Při veškeré rafinaci byla použita všechna difrakční data s F > 2,0 s výjimkou pro 10 % náhodně zvoleného testového souboru, který byl použit pro výpočet R-volné. Fo-Fc mapy byly použity pro situování molekul vody, které byly umístěny na místech, která vykazovala hustoty > 3,0 σ a projevovala přiměřené vzdálenosti vodíkových vazeb protein-rozpouštědlo bez • ·· ·· ·· · · · · ·

9 9 9 9 9

999 99 99 999 sférických zábran. Finální model obsahuje 1285 zbytků (molekula A: 9-433, 456-500, 537-727)a 40 molekul vody a vykazuje dobrou stereochemii, s průměrnou délkou vazeb 0,010 A a 1,38°deviací vazebného úhlu od ideální geometrie. Celková hodnota R-volné je 29,7 % a za použití difrakčních dat mezi 12 a 2,5 A je hodnota R 24,3 %.

Rsym = Σ | l_h - < lh > | / Σ l_h, kde < l_h > je průměrná intenzita u ekvivalentů symetrie.

L separátní Friedelovy páry.

Síla fázování ⁼ Σ I FH I / Σ I I FZjištěno 11 | Fvypočteno | | ·

R = Σ | | F_o | - | F_c| / Σ | Fo |, kde R volné je vypočteno z náhodně volených 10 % reflexí a Rfaktor jevypočten pro zbývajících 90 % reflexí (F > 2,0) použitých pro rafinaci struktury.

Koordináty budou uloženy u Brookhaven Protein Databank.

Příklad 2

Eseje, na aktivitu (a) Váčkový esej

1-Palmitoyl-2-[C¹⁴]-arachidonyl-fosfotidylcholin (58 Ci / mmol) (finální koncentrace 6 μΜ) a 1,2-dioleyolglycerol (finální koncentrace 3 μΜ) byly smíseny a vysušeny v proudu dusíku. K lipidům bylo přidáno 50 mM Hepes pH 7,5 (2 x finální koncentrace lipidů) a suspense byla sonifikována 3 min. při 4°C. K suspensi bylo přidáno 50 mM Hepes pH 7,5, 300 mM NaCI, 2 mM DTT, 2 mM CaCI₂ a 2 mg/l albuminu hovězího séra (BSA) (Sigma A7511) (1,2 x finální koncentrace lipidů). Typický esej sestával ze směsi lipidů (85 μΙ), ke které byl postupně po sobě přidáván inhibitor (5 μΙ v DMSO) a cPLA₂, 10 ng pro automatizovaný systém nebo 1 ng pro manuální provedení, v 10 μΙ BSA pufru. Tento esej byl prováděn buď podle níže popsaného protokolu manuálního nebo automatizovaného eseje.

\r (b) Esej s rozpustným subsťátem (LysoPC)

1-[C¹⁴]-Palmitoyl-2-hydroxyfosfotidyl-cholin (57 Ci / mmol) (finální koncentrace 4,4 μΜ) byl v proudu dusíku vysušen. Lipid byl resuspendován rozmícháním s 80 »···

*.· mM Hepes pH 7,5, 1 mM EDTA (1,2 x finální koncentrace). Typický esej sestával ze suspense lipidu (85 μΙ), ke které byl postupně po sobě přidáván inhibitor (5 μΙ v

DMSO) a cPLA₂, 200 ng v 80 mM Hepes pH 7,5, 2 mM DTT a 1 M EDTA. Tento esej byl prováděn buď podle níže popsaného protokolu manuálního nebo automatizovaného eseje.

(c) Automatizovaný esej

Suspense lipidu a inhibitor byly předem 7 min. inkubovány při 37°C. Byl přidán enzym a v inkubaci bylo pokračováno dalších 30 min. Reakce byla potom zrušena přidáním směsi děkan / isopropylalkohol / trifluoroctová kyselina (192 : 8 : 1 hmotnost / objem, 150 μΙ). Část vrstvy použité ke zrušení (50 μΙ) prošla kolonou s Rainin Spheric-5 křemelinou (5 μ, 30 x 2,1 mm) při eluci směsí heptan / methanol / TFA (97 : 3 : 0,1 obj./obj.) Úroveň [C¹⁴]-arachidonové kyseliny byla analyzována pomocí inline Radiomatic Flo-One / Beta counter Packard).

(d) Manuálníesej

Směs lipidu, inhibitoru a enzymu byla inkubována při 37-C 30 min. Reakce byla zrušena přidáním směsi heptan / isopropylalkohol / 0,5 M kyselina sírová (105/ 20 : 1) obj./obj., 200 μΙ). Polovina vrstvy použité ke zrušení byla nanesena na jednoúčelovou kolonu se silikagelem (Whatman SIL., 1 ml) ve vakuu různě umísťovanou nad scintilační nádobkou. Volná [C¹⁴]-arachidonová kyselina byla eluována přidáním ethyletheru (1 ml). Úroveň radioaktivity byla měřena kapalným scintilačním čítačem.

(e) PMN esej

PMN byly izolovány za použití Ficoll-Hypaque podle směrnic výrobců. Buňky červených krvinek kontaminující PMN byly odstraněny hypotonickou lýzou a PMN pelety byly jednou promyty a resuspendovány v Hanks-ově pufrované solance při koncentraci 2 x 10⁶ buněk / ml. Buňky byly předem inkubovány s inhibitory 15 min při 37°C a potom stimulovány s 2 μΜ A23187. Když byla monitorována produkce LTB4 jako míra inhibice CPLA2, byla reakce přerušena stejným objemem ledové, fosfátem pufrované solanky. Centrifugací byly odstraněny buňky a LTB₄ přítomná v buněčném supernatantu, byla podle směrnic výrobců měřena za použití eseje blízké scintilace

LTB4, který poskytuje Amersham. Když byla monitorována produkce arachidonové kyseliny, byla reakce zrušena methanolem obsahujícím D8-arachidonovou kyselina jako vnitřní standard. Lipidy byly extrahovány metodou Bligha a spol., [(1959) Can. J. Biochem. Physiol., 37, 911-917] a mastná kyselina byla konvertována na pentafluorbenzylester a analyzována GC-MS způsobem podobným tomu, který popsal Ramesha a Taylor [(1991) Anal. Biochem. 192, 173-180).

Literární odkazy

Altschul S.F., Madden T.L., Scháffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. (1997): Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search program. Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402.

Bacon D.J., Anderson W.F. (1988): A fast algorithm fór rendering space-filling molecule pictures. J. Mol. Graph. 6, 219-220.

Balboa M.A., Balsinde J., Jones S.S, Dennis E.A. (1997): Identity between the Ca²⁺independent phospholipase A₂ enzymes from P388Di macrophages and chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem. 272, 8576-8580.

Bonventre J.V., Huang Z., Reza Taheri M., 0' Leary E., Li E., Moskowitz M.A. Sapirstein A. (1997): Reduced fertility and postischaemic brain injury in mice deficient in cytosolic phospholipase A₂. Nátuře 390, 622-625.

Bórsch-Haubold A.G., BarfolLF.; Asselin ď., DudlerT., Kramer R.M., Apitz-CástroR., Watson S.P., Gelb M.H. (1998): Identification of the phosphorylation sites of cytosolic phospholipase A₂ in agonist-stimulated human platelets and HeLa cells. J. Biol. Chem. 273, 4449-4458.

Bricogne G. (1993): Direct phase detremination by entropy maximization and likelihood ranking: status report and perspectives. Acta cryst. D49, 37-60.

Brúnger A.T., Krukowski A., Erickson J. (1980): Slow cooling protocols for crystallographic refinement by simulated annealing. Acta cryst. A46, 585-593.

Brúnger A.T. (1992a): The free R value a novel statistical quantity for assesing the accuracy of crystal structures. Nátuře 355, 472-474.

Brúnger A.T. (1992b): X-PLOR Version 3.1. A systém for x-ray crystalography and NMR (New Haven: Yale University Press).

• · · • * · · w

Clark J.D., Lin L.-L., Kriz R.W., Ramesha C.S., Sultzman L.A., Lin A.Y., Milona N., Knopf J.L. (1991): A novel arachidonic acid-selective cytosolic PLA2 contains Ca²⁺dependent translocation domain with homology to PKC a GAP. Cell 65, 1043-1051.

Clark J.D., Scievella A.R., Nalefski E.A., Lin L.-L. (1995): Cytosolic phospholipase A2. Lipid Mediators Cell Signalling 12, 83-117.

Cleland W.W., Kreevoy M.M. (1994): Low-barrier hydrogen bonds and enzymic catalysis. Science 264, 1887-1890.

Collaborative Computing Project Number 4 (1994). Acta Crystallogr. S 760-763.

Cowtan K.D., Main P., (1996): Phase combination and cross validation in iterated density modification calculations. Acta Crystallogr. D42, 43-48.

Cygler M., Schrag J.D. (1997): Struckture as basis for understanding interfacial properties of lipases. Meth. Enzymol 284, 3-27.

Dennis E.A. (1997): The growing phospholipase A2 superfamily of signál transduction enzymes. Trends Biochem. Sci. 22, 1-2.

De Carvalho M.G.S., McCormack A.L., Olson E., Ghomaschi F., Gelb M., Yates III

J.R., Leslie C.C. (1996): Identification of phosphorylation sites of human 85kda cytosolic phospholipase A2 expressed in insect celíš and present in human monocytes. J. Biol. Chem. 271, 1-11.

De La Fortelle E., Bricogne G. (1997): Maximum-likelihood heavy-atom parameter refinement for multiple isomorphous replacement and multiwavelength anomalous diffraction methods. Methods Enzymol 276, 494-523.

Derewenda Z.S., Derewenda U (1991): Relationship among serine hydrolases: evidence for a common structural motif in triacylglyceride lipases and esterases. Biochem: Cell. Biol. 69 842-851.

Duggleby H.J., Tolley S.P., Hill C.P., Dodson E.J., Dodson G., Moody P.C.E. (1995): Penicillin acylase has a single-amino-acid catalytic centre. Nátuře, 373, 264-168.

Essen L.-O., Preisic O., Cheung R., Katan M., Williams R.L., (1996): Crystal structure of a mammalian phosphoinositide-specific phospholipase C. Nátuře, 380, 595-602.

Glover S., de Carvalho M., Bayburt T., Jonas M., Chi E., Leslie E., Gelb M. (1995). Translocation of the 85-kDa phospholipase A₂from cytosol to the nuclear envelope in rat basophilic leukemia celíš stimulated with calcium ionophore or IgE/antigen, J. Biol. Chem. 270, 15359-15367.

Grobler J.A., Essen L.-O., Williams R.L., Hurley J.H. (1996): C2 domain conformational changes in phospholipase C. Nat. Struct. Biol. 3,788-795.

Haněl A. M., Gelb M.H. (1993): Progressive facial catalysis by mammalian 85kilodalton phosholipase A₂ enzymes on product containing vesicles: application to the détermination of substráte preferences. Biochemistry 32,5949-5958.

Haněl A. M., Gelb M.H. (1995): Multiple enzymatic activities of the human cytosolic 85-kDa phospholipase A₂: hydrolytic reactions and acyl transfer to glycerol. Biochemistry 34, 7807-7818.

Hattori M., Adachi H., Tsujimoto M., Arai H., Inoue K. (1994): The catalytic subunit of bovine platelet-activating factor acetylhydrolase is a novel pype of serine esterase. J.Bioí. Chem. 269 23150-23155.

Hattori M., Adachi H., Aoki J., Tsujimoto M., Araj H., Inoue K. (1995): Cloning and expression of a cDNA encoding the beta-subunit (30-kDa subunit) of bovine brain platelet-activating factor acetylhydrolase. J.Biol. Chem. 270 31345-31352.

Hendrixon W.A. (1991): Determination of macromolecular structures from anomalous diffraction of synchrotron radiation. Science 254, 51-58.

Hixon M.S., Balí A., Gelb M.H. (1998): Calcium-dependent and -independent interfacial binding and catalysis of cytosolic group IV phospholipase A₂. Biochemistry 37, 8516-8526.

Huang Z., Payette P., Abdullah K., Cromlish W.A., Kennedy B.P. (1996): Functional identification of the active-site nucleophile of the human 85-kDa cytosolic phospholipase A₂. Biochemistry 35, 3712-3721.

Kramer R.M., Roberts E.F., Manetta J., Putnám J.E., (1991): The Ca²⁺-sensitive cytosolic phospholipase A₂ is a 100-kDa protein human monoblast U937 cells. J. Biol. Chem. 266, 5268-5272.

Kraulis P.J. (1991): MOLSCRIPT: a program to produce both detailed and schematic plots of protein structures. J. Appl. Cryst. 24, 946-950.

Leslie C.C., Channon J.Y. (1990): Anionic phospolipids stimulate.an arachidonylhydrolyzing phospholipase A₂ from macrophagěs and reduce the calcium requirement for activity. B/ochim. Biophys. Acta 1045, 261-270. - Leslie C.C. (1997): Properties and regulation of cytosolic phospholipase A₂. J. Biol. Chem. 272, 16709-16712.

Lin L-L., Lin A.Y., DeWitt D.L. (1992a): IL-1 induces the accumulation of cPLA₂ and the release of PGE₂ in human fibroplasts. J. Biol. Chem. 267, 23451-23454.

Lin L.-L., Lin A.Y., Knopf J.L. (1992b): Cytosolic phospholipase A₂ is coupled to hormonally regulated release of arachidonic acid. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89, 6147-6151.

Lin L.-L., Wartmann M., Lin A.Y., Knopf J.L., Seth A., Davis R.J. (1993): cPLA₂ is phosphorylated and activated by MAP kinase. Cell 72, 269-278.

Matagne A., Lamotte-Braseur J., Frére J.M. (1998): Catalytic properties of clas A Jactamases: efficiency and diversity. Biochem. J. 330, 581-598.

Mosior M., Six D.A., Dennis E.A. (1998): Group IV cytosolic phospholipase A2binds with high affinity and specificity to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate resulting in dramatic increases in activity. J. Biol. Chem. 273, 2184-2191.

Murshudov G.N., Vagín A.A., Dodson E.J. (1997): Acta Crystallogr. Séct. D 53, 240255.

Nalefski E.A., Sultzman L.A., Martin D.M., Křiž R.W., Towler P.S., Knopf J.L., Clark J.D. (1994): Delineation of two functionally distinct domains of cytosolic phospholipase A₂, a regulátory Ca²⁺-dependent lipid-binding domain and a Ca²⁺independent catalytic domain. J. Biol. Chem. 269, 18239-18249.

Nalefski E.A, Falke J.J. (1996): The C2 domain calcium-binding motif structural and functional diversity. Protein Sci. 12, 2375-2390.

Nalefski E.A, McDonagh T·, Sommers W., Seěhra J., Falke J.J., Clark J.D._ (1998): Independent folding. and ligand specifrty of the C2 calcium-dependent lipid binging domain of cytosolic phospholipase A2. J. Biol. Chem. 273,1365-1372.

Nalefski E.A., Falke J.J. (1998): Location of the membrane-docking face on the Ca²⁺activated domain of cytosolic phospholipase A2. Biochemistry 37, 17642-17650.

Nicholls A. (1992): GRASP: Graphical representation and analysis of surface properties (Columbia University, New York).

0'Byrne P.M.(1997): Leukotrienes in the pathogenesis of asthma. Chest 111, 27S34S.

Otwinowski Z. (1993). V Data Collection and Processing. Vydavatelé L. Sawyer, N. Isaacs a W. Bailey. (Daresbury, U.K.: Science and Engineering Council), str. 56-62.

« · *

Perisic O., Fong S., Lynch D.E., Bycroft M., Williams R.L. (1998): Crystal structure of a calcium-phospholipid binding domain from cytosolic phospholipase A₂. J. Biol. Chem. 273, 1596-1604.

Pickard R.T., Chiou X.G., Strifler B.A., DeFeliúúis M.R., Hyslop P.A., Tebbe A.L., Yee Y.K., Reynolds L.J., Dennis E.A., Kramer R.M., Sharp J.D. (1996): Identification of essential residues for the catalytic function of 85-kDa cytosolic phospholipase A₂. J. Biol. Chem. 271, 19225-19231.

Qiu Z.H., Gijón M.A., de Carvalho M.S., Spencer D.M., Leslie C.C. (1998): The role of calcium and phosphorylation of cytosolic phospholipase A₂ in regulating arachidonic acid release in macrophages . J. Biol. Chem. 273, 8203-8211.

Rao V.D., Misra S., Boronekov I.V., Anderson R.A., Hurley J.H. (1998): Structure of type II beta phosphatidylinositol phosphate kinase: a protein kinase fold flattened for interfacial phosphorylation. Cell 94, 829-839.

Reynolds’L.J., Hughes L.L., Louis A.I., Kramer R;M., Dennis E.A. (1993): Metal ion and salt effects on the phospholipase A₂, lysophospholipase and transacylase aktivities of human cytosolic phospholipase A₂. Biochem. Biophys. Acta 1167, 272280.

Schievella A.R., Regier M.K., Smith W.L., Lin L.-L. (1995): Calcium mediated translocation of cytosolic phospholipase A₂ to the nuclear envelope and endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 270, 30749-30754.

Schrag J.D., Cyger M. (1997): Lipases and hydrolases fold. Meth. Enzymol. 284, 85107.

Scott D.L., White S.P., Zbyszed 0., Xan W„ Gelb M.H., Sigler P.B. (1990): Interfacial catalysis: the mechanism of phospholipase A₂. Science 250, 1541-1546.

Sharp J.D., White D.L., Chiou X.G., Goodson T., Gamboa G.C., McCIure D., Burgett S., Hoskins J., Skatrud P.L., Spotsman J.R., Becker G.W., Kang L.H., Roberts E.F.,

Kramer R.M. (1991): Molecular cloning and expression of human Ca²⁺-sensitive cytosolic phospholipase A2. J. Biol. Chem. 266, 14850-14853.

Sharp J.D., Pickard R.T., Chiou X.G., Manetta J.V., Kovacevic S., Miller J.R., Varshavsky A.D., Roberts E.F., Strifler B.A., Brems D.N. a spol. (1994): Serine 228 is essential for catalytic activities of 85-kDa cytosolic phospholipase A2. J. Biol. Chem. 269, 23250-23254.

Simon L.S., Lanza F.L., Lipsky P.E., Hubbard R.C., Talwalker S.,Schwartz B.D., Isakson P.C., Geis G.S. (1998): Preliminary study of the safety and efficacy of SC58635, a novel cyklooxygenase 2 inhibitor: efficacy and safety in two placebocontrolled trials in osteoarthritis and rheumatoid arthritis, and studies of gastrointestinal and platelet effects. Arthritis Rheum, 41, 1591-1602.

Tang 1, Kriz R.W., Wolfman N., Shaffer M., Seehra J., Jones S.S. (1997): A novel cytosolic calcium-independent phospholipase A2 contains eight ankyrin motifs. J. Biol. Chem. 272, 8567-8575.

Tjoelker L.W., Wilder C., Eberhardt C., Stafforini Ď.M., Dietsch G., Schimpf B., Hooper S., Le Trong H., Cousens L.S., Zimmerman G.A. a spol. (1995): Antiinflammatory properties of a platelet-activating factor acetylhydrolase. Nátuře 274, 549-553.

Trimble L.A., Street I.P., Perrier H., Tremblay N.M., Weech P.K., Bernstein M.A. (1993): NMR structural studies of the tight complex between a trifluoromethyl ketone and 85-kDa human phospholipase A2. Biochemistry 32, 12560-12565.

Underwood K.W., Song C., Kriz R.W., Chang X.j., Konpf J.L., Lin l.-L. (1998). A novel calcium-independent phospholipase A2, cPLA2, that is prenylated and contains homology to cPLA2. J. Biol. Chem. 273,21926-21932.

Uozumi N., Kume K., Nagase T., Nakatani N., Ishii S., Tashiro F., Komagata Y., Maki

K., Ikuta K., Ouchi Y., Miyazaki J-i., Shimizu T. (1997): Role of cytosolic phospholipase_A₂ in allergic response and parturition. Nátuře 390^618-622.

Venable M.E., Olson S.C., Nieto M.L., Wykle R.L. (1993): Enzymatic studies of lyso platelet-activating factor acylation in human neutrophils and changes upon stimulation. J. Biol. Chem. 268, 7965-7975.

Xu G.-Y., McDonagh T., Yu H.-A., Nalefski E., Clark J.D., Cumming D.A.(1998): Solution structure and membrane interactions of the C2 domain of cytosolic phospholipase A2. J. Mol. Biol. 280, 485-500.

Všechny zde citované literární údaje jsou tu zahrnuty v celé šíři.

• ······

Claims (29)

1. Krystalická cPLA₂.

2. Krystalická cPLA₂ podle nároku 1, kde uvedená cPLA₂je lidskou cPLA₂.

3. Krystalická cPLA₂ podle nároku 1, kde uvedená cPLA₂ je cPLA₂ znesavčího druhu.

4. Krystalická cPLA₂ podle nároku 1, kde uvedená cPLA₂ je rekombinantní cPLA₂.

5. Krystalická cPLA₂ podle nároku 1, kde uvedená cPLA₂ obsahuje maturovanou sekvenci přírodně se vyskytující cPLA₂.

6. Krystalická kompozice vyznačená tím, že obsahuje cPLA₂ spolu s další chemickou species.

7. Kompozice podle nároku 6vyznačená tím, že další chemická species je volena ze skupiny, kterou tvoří potenciální inhibitor aktivity cPLA₂ a potenciální inhibitor vazby cPI_A₂.

8. Model struktury cPLA₂ vyznačující se tím, že obsahuje soubor dat představující strukturu cPLA₂.

9. Model podle nároku 8 vyznačující se tím, že soubor dat byl stanoven krystalografickou analýzou cPLA₂.

10. Model podle nároku 8 vyznačující se tím, že soubor dat byl stanoven NMR analýzou cPLA₂.

11. Model podle nároku 8 vyznačující se tím, že soubor dat vyjadřuje úplnou strukturu cPLA₂.

··· ·

12. Model podle nároku 8 vyznačující se tím, že soubor dat vyjadřuje část struktury CPLA2.

13. Model podle nároku 12 vyznačující se tím, že část je aktivní centrum CPLA2.

14. Model podle nároku 12 vyznačující se tím, že část je CaLB doména cPLA₂.

15. Výpočetní systém vyznačující se tím, že obsahuje hardware počítače a model podle nároku 8.

16. Způsob identifikace species, která je agonistou nebo antagonistou aktivity nebo vazby cPLA₂ vyznačující se tím, že zahrnuje: (a) použití modelu podle nároku 8, (b) studování interakce případných species s takovým modelem a (c) vybrání species, o níž se předpokládá, že bude působit jako řečený agonista nebo antagonista. -

17. Species, identifikovaná způsobem podle nároku 16.

18. Způsob identifikace substance, která inhibuje cPl_A₂ aktivitu nebo vazbu vyznačující se tím, že zahrnuje určení interakce mezi případnou substancí a modelem struktury cPLA₂.

19. Způsob identifikace substance, která napodobuje cPLA₂ aktivitu nebo vazbu vyznačující se tím, že zahrnuje určení interakce mezi případnou substancí a modelem struktury CPLA2.

20. Způsob identifikace inhibitorů aktivity cPLA₂ racionálním navrhováním léčiv vyznačující se tím, že zahrnuje:

(a) návrh potenciálního inhibitoru, který bude tvořit nekovalentní vazby s jednou nebo více aminokyselinami v aktivním centru cPLA₂, založený na koordinátách krystalové struktury cPLA₂;

(b) syntetizování inhibitoru; a • · (c) určení, zda potenciální inhibitor inhibuje aktivitu CPLA2.

21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že koordináty krystalové struktury CPLA2 jsou získány z krystalu cPLA₂ prostorové grupy P2í2i2 s a = 153,59 angstrómů, b = 95,49 angstrómů a c = 139,13 angstrómů.

22. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že inhibitor je navržen, aby interagoval s jedním nebo více atomy uvedené jedné nebo více aminokyselin v aktivním centru CPLA2, přičemž uvedený jeden nebo více atomů je volen ze skupiny, kterou tvoří:

CB a Ογ atomy v Ser228;

051 a 052 atomy v Asp 549 a Asp575;

CB, CG, CD, NE, CZ, NH1 a NH2 atomy v Arg200, Arg413 a Arg579; karbonylový kyslík v hlavním řetězci páteře v Trp393;

N52 a 051 atomy u Asn555;

atomy CD1, CE1, CG, CZ, CE2 a CD2 v Phe397, Phe681, Phe683 a Phe199; CG.CD1, NE1, CE2, CZ2, CH2, CZ3, CE3 a CD2 v Třp232 a Trp393.

CB a Ογ atomy v Ser577; .

atomy CB a Sy v Cys331;

atomy OE1 a OE2 v Glu589;

atomy CB, CG, CD, CE a NZ v Lys588;

Ογ1 atom v Thr680;

0E1 a OE2 atomy v Glu418 a Glu422;

atomy CB, CG, SD a CE v Met417;

atomy CB, CG, CD1 a CD2 v Leu400 a Leu421;

atomy CB, CG1, CG2 nebo CD1 v Ile424;

NH v hlavním řetězci páteře a karbonylové kyslíkové atomy v Ala578 a atomy CB, CG, ND1, CE1, NE2 a CD2 v His639.

23. Způsob identifikace inhibitorů vazby CPLA2 na membránu racionálním navrhováním léčiv vyznačující se tím, že zahrnuje:

• ··♦ · 9 ·· wto * • · · * β · « • · ·· • to · • · • ♦ » • · · Φ · 9 · ••9 ··· ··· ♦ ♦ • to ·

(a) návrh potenciálního inhibitoru, který bude tvořit nekovalentní vazby s jednou nebo více aminokyselinami v oblasti elektrostatického pole CPLA2, založený na koordinátách krystalové struktury cPLA₂;

(b) syntetizování inhibitoru; a (c) určení, zda potenciální inhibitor inhibuje vazbu cPLA₂na membránu.

24. Způsob podle nároku 23 vyznačující se tím, že koordináty krystalové struktury cPLA₂ jsou získány z krystalu cPLA₂ prostorové grupy P2i2i2 s a = 153,59 angstrómů, b = 95,49 angstrómů a c = 139,13 angstrómů.

25. Způsob podle nároku 23 vyznačující se tím, že uvedená jedna nebo více aminokyselin je volena ze skupiny, kterou tvoří Arg467, Arg485, Lys488, Lys544 a Lys543.

26. Agonista nebo antagonista identifikovaný způsobem podle nároku 20.

-

27. Agonista nebo antagonista identifikovaný způsobem podle nároku 23.

28. Substance identifikovaná způsobem podle nároku 18.

29. Substance identifikovaná způsobem podle nároku 19.