KR20010103010A

KR20010103010A - ｃＰＬＡ₂의 결정 구조 및 이것을 사용하여 작용제 및길항제를 확인하는 방법

Info

Publication number: KR20010103010A
Application number: KR1020017010320A
Authority: KR
Inventors: 안드레아 데센; 윌리엄 에스. 소머즈; 마크 엘. 스탈; 자스버 에스. 시이라
Original assignee: 브루스 엠. 에이센, 토마스 제이 데스로저; 제네틱스 인스티튜트, 인코포레이티드
Priority date: 1999-02-15
Filing date: 2000-02-14
Publication date: 2001-11-17
Also published as: BG105886A; HRP20010678A2; PL351242A1; CA2362612A1; EE200100426A; EP1155144A4; MXPA01008192A; HUP0200554A3; NO20013947D0; NO20013947L; CN1238520C; EA200100899A1; BR0008231A; AU779488B2; SK11782001A3; US6801860B1; CZ20012933A3; WO2000047763A1; JP2002540766A; HK1040745A1

Abstract

본 발명은 결정성 cPLA₂를 제공한다. cPLA₂의 결정 구조는 또한 이러한 물질을 사용하여 규명되었다. 이러한 결정 구조에 근거한 모델도 제공된다. 이러한 모젤을 사용하여 cPLA₂활성 및 막 결합의 억제제를 확인하는 방법도 개시된다.

Description

ｃＰＬＡ₂의 결정 구조 및 이것을 사용하여 작용제 및 길항제를 확인하는 방법 {CRYSTAL STRUCTURE OF cPLA2, AND METHODS OF IDENTIFYING AGONISTS AND ANTAGONISTS USING SAME}

발명의 배경

류코트리엔 및 프로스타글란딘은 천식, 관절염, 및 기타 염증성 질환에서 중요한 염증 매개물질이다. 류코트리엔은 기관지수축, 점액 분비 증가, 및 염증 세포의 화학유인에 의해 천식 환자에서 기도 폐쇄를 초래하고[참조: O'Byrne, 1997]; 프로스타글란딘은 관절염과 관련된 통증 및 부종을 초래한다. 이들 지질 매개물질의 합성 또는 작용을 약리학적으로 개입하여 차단하는 것은 인간 질환을 치료하는데 있어서 효과적이므로, 이들의 중요성이 확인된다[Simon et al., 1998; O'Byrne, 1997].

세포질 포스포리파아제 A₂(cPLA₂)는 세포막으로부터 아라키돈산을 방출시킴으로써 류코트리엔 및 프로스타글란딘의 생성을 개시한다. 아라키돈산은 시클로옥시게나아제 경로에 의해 프로스타글란딘으로 대사되며 5-리포옥시게나아제 경로에 의해 류코트리엔으로 대사된다. 아라키돈산의 방출과 동시에, 라이소-혈소판-활성화 인자(lyso-PAF)가 형성되며, 이것이 그 후 아세틸화되어 천식 및 관절염의 병태생리에 관련된 분자인 PAF를 형성할 수 있다[Venable et al., 1993]. 그러므로, cPLA₂에 의해 촉매된 반응은 3종의 염증 매개물질, 즉 류코트리엔, 프로스타글란딘, 및 PAF의 생성을 개시한다.

cPLA₂는 글리세로인지질의 sn-2 에스테르를 절단하는 공통적인 능력을 가진 포스포리파아제 A₂효소의 상이한 수퍼패밀리(superfamily)의 구성원이다. 특성화된 패밀리(family)의 최초의 구성원은 세포외로 또는 과립내로 분비되는 저분자량 효소들(여기서는 집합적으로 sPLA₂s; 그룹 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅴ, Ⅶ, 및 Ⅸ로 칭함)이었다[참조: Dennis, 1997]. cPLA₂패밀리는 칼슘 의존성 아라키도닐 선택성 cPLA₂[참조: Clark et al., 1991; Kramer et al., 1991], 칼슘 의존성 PLA₂[Tang et al., 1997; Balboa et al., 1997], 및 혈장 및 세포내 PAF-아세틸히드롤라아제[Hattori et al, 1994, 1995]의 클로닝 및 특성화에 따라 확대되었다. 이들 각각의 새로운 효소는 저분자량 효소와, 또는 서로간에 서열 상동성을 공유하지 않는다. 또한, 인지질을 절단하기 위해 활성화된 물을 사용하는 sPLA₂s와는 달리, 이들 효소는 친핵성 세린을 사용하는 것으로 생각된다. 이와 관련하여, 이들은 sPLA₂s 보다는 α/β히드롤라아제 패밀리의 기타 리파아제와 보다 공통점이 많다. cPLA₂의 촉매작용성 도메인과 30% 동일성을 가진 2개의 추가 효소가 최근에 클로닝되었고, 이들은 cPLA₂β[C. Song et al., manuscript in preparation] 및 cPLA₂γ[Underwood et al., 1998]로 명명되었다.

cPLA₂의 클로닝은 또한 미국 특허 제 5,322,776호, 제 5,354,677호, 제 5,527,698호 및 제 5,593,878호에 기재되어 있다. 칼슘 의존성 cPLA₂의 클로닝은 또한 미국 특허 제 5,466,595호, 제 5,554,511호, 제 5,589,170호 및 제 5,840,511호에 기재되어 있다.

지질 매개물질 생합성에서 cPLA₂이 중요한 역할을 하는 것은 많은 증거에 의해 지지되었다. cPLA₂는 sn-2 위치에서 아라키돈산을 함유하는 인지질에 대해 고도로 선택적인 유일한 효소이다[Clark et al., 1995; Hanel & Gelb, 1993]. cPLA₂의 활성화 또는 이것의 발현 증가는 류코트리엔 및 프로스타글란딘 합성 증가와 연결되었다[Lin et al., 1992b]. 활성화 후에, cPLA₂는 핵막으로 이동하며, 여기서 cPLA₂는 아라키도네이트를 프로스타글란딘 및 류코트리엔으로 대사시키는 시클로옥시게나아제 및 리포옥시게나아제와 함께 국재한다[Schievella et al., Glover et al., 1995]. 이러한 데이터가 설득력이 있지만, 에이코사노이드 및 PAF 생성에서 cPLA₂가 중요한 역할을 하는 것에 대한 가장 결정적인 증거는 상동성 재조합에 의한 cPLA₂결핍 마우스로부터 얻어졌다[Uozumi et al., 1997; Bonventre et al., 1997]. 이들 동물로부터 유래하는 복막 마크로파지는 류코트리엔, 프로스타글란딘 또는 PAF를 생성하지 못하였다. cPLA₂결핍 마우스는 천식 모의용으로 사용한 아나필락시스 모델에서 기관지 과민성에 저항성을 나타내기 때문에, 질환에서 cPLA₂의역할에 대한 정보도 제공하였다[Uozumi et al., 1997].

cPLA₂는 2개 이상의 기능적으로 별개의 도메인, 즉 N-말단 Ca²⁺의존성 지질 결합(CaLB) 도메인 및 Ca²⁺비의존성 촉매작용성 도메인으로 구성된다[참조: Nalefski et al., 1994]. N-말단 CaLB 도메인은 C2 패밀리의 구성원이며 그 구조가 밝혀져 있으며[Perisic et al., 1998; Xu et al., 1998]; 이것은 막 기질과 함께 촉매작용성 도메인에 국재함으로써 칼슘 조절을 매개한다[Nalefski et al., 1994]. 또한, cPLA₂활성은 촉매작용성 도메인의 인산화에 의해 조절된다[Lin et al., 1991; Leslie, 1997]. Ser505 및 Ser727은 모든 종을 교차하여 보존되며 다수의 세포 유형에서 인산화된다[de Carvalho et al., 1998]. MAP-키나아제 패밀리의 구성원에 의한 Ser505의 인산화는 아라키돈산을 방출시키는 세포외 자극에 대한 통상적인 반응이다. Ser505의 Ala로의 돌연변이는 활성화를 감소시키는 반면[Lin et al., 1993], Ser727에 대한 유사한 돌연변이는 영향을 미치지 않는다[Leslie, 1998].

여러 방면의 증거가 cPLA₂의 촉매적 메카니즘이 세린-아실 중간체를 통해 진행됨을 시사한다[Trimbel et al., 1993; Hanel & Gelb, 1995]. Ser228의 돌연변이는 인지질, 라이소인지질, 및 지방 아실화된 쿠마린을 포함하는 모든 기질에 대한 cPLA₂의 활성을 폐지한다[Pickard et al., 1996; Huang et al., 1996]. Ser228은 펜타펩티드 서열 G-L-S-G-S에 존재하며, 이것은 α/β 히드롤라아제로 지칭되는 보다 광범위한 효소 패밀리내의 대부분의 리파아제에서 발견되는 고전적인 "리파아제 모티프" G-X-S-X-G [Schrag & Cygler, 1997]와 유사하다. 이들 효소는 그 가닥이 α헬릭스에 의해 산재되어 있는 잘 보존된 혼합 β시트로 구성되는 공통 코어를 가진다. 모든 α/β히드롤라아제에서, 촉매작용성 세린은 "친핵성 엘보우 (nucleophilic elbow)"라 지칭되는, β가닥과 α헬릭스 사이의 밀착 회전에 존재한다[Schrag & Cygler, 1997]. 이러한 회전은 단백질 골격으로부터 떨어져서 짧은 세린 측쇄를 향해 있고, 잔기 주변의 입체 장애를 감소시키며, +2 및 -2 측쇄가 입체적 겹침(steric clash)을 피하기 위해 작을 것을 요구하여, G-X-S-X-G 모티프가 우세하다.

세린에 부가하여, α/β히드롤라아제는 세린 프로테아제에 존재하는 것과 유사한 촉매작용성 트리아드(triad)의 다른 구성원으로서 히스티딘 및 산(아스파르테이트/글루타메이트)를 사용한다[Schrag & Cygler, 1997]. 그러나, cPLA₂에서 Asp549가 활성에 대해 필수적인 것으로 나타났지만, 19개 히스티딘 잔기는 그렇지 않았다[Pickard et al., 1996]. 상이한 잔기인 Arg200은 효소적 과정에서 일정 역할을 하는 것으로 관련되어 있으나, 그 관련 메카니즘은 알려져 있지 않다. 이러한 관찰은 cPLA₂가 아실 히드롤라아제에 대한 신규의 촉매 작용을 통해 작용함을 시사하였다.

sPLA₂s 및 α/β히드롤라아제 패밀리의 리파아제 양자 모두와 유사하게, cPLA₂는 계면에 존재하는 기질을 선택적으로 절단시킨다[Nalefski et al., 1994].이러한 현상은 계면적 활성화(interfacial activation)로서 알려져 있으며, 효소의 형태적 변화(conformational change) 또는 보다 유리한 기질 제공에 기인하였다 [Scott et al., 1990]. 단량체성 및 미셀형 기질에 대한 cPLA₂활성이 1500배 차이가 나는 원인은 알려져 있지 않다.

염증성 질환에서 cPLA₂의 중심적인 역할에도 불구하고, 그 3차원적 구조는 밝혀져 있지 않고, 많은 과제가 해결되지 않은 채로 남아있다. 본원에서 본 발명자들은 인간 cPLA₂의 x-선 결정 구조를 2.5Å 해상도로 공표한다. 이 구조는 아라키도네이트 선택성 및 계면적 활성화의 원인에 대한 인식을 제공하고, Ser228, Asp549, 및 Arg200의 역할을 명백히 하며, CaLB 및 촉매작용성 도메인간의 상호작용을 밝힌다. 중요한 것은, 상기 구조가 독특한 토폴로지(topology)를 가지며, α/β히드롤라아제 패밀리의 구조와는 별개라는 점이다.

발명의 개요

본원의 cPLA₂의 아미노산에 대한 모든 언급은 미국 특허 제 5,527,698호의 표 I에 기재된 cPLA₂서열을 언급하는 잔기 번호를 사용하며, 제 1 메티오닌을 잔기 1(Met 1)로 지정한다.

본 발명은 결정성 cPLA₂를 제공한다. 바람직하게는, cPLA₂는 인간 cPLA₂또는 비포유류종 유래의 cPLA₂이다. 특정 구현예에서, cPLA₂는 재조합 cPLA₂이고/거나천연 cPLA₂의 성숙 서열을 포함한다.

다른 구현예는 제 2의 화학종과 관련된 cPLA₂를 포함하는 결정성 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 제 2의 화학종은 cPLA₂활성의 잠재적인 억제제 및 cPLA₂막 결합의 잠재적인 억제제로 구성된 군으로부터 선택된다.

또다른 구현예는 cPLA₂구조를 구체화하는 데이터 세트를 포함하는 cPLA₂구조의 모델을 제공한다. 바람직하게는, 이러한 데이터 세트는 가능하게는 NMR 분석을 포함하여 cPLA₂의 결정학적 분석에 의해 측정하였다. 특정 구현예에서, 데이터 세트는 cPLA₂의 활성 부위 또는 cPLA₂의 CaLB 도메인을 제한없이 포함하는 cPLA₂구조의 일부를 구체화한다.

본원에 기재되거나 결정성 cPLA₂의 독립적 분석으로부터 얻은 결정학적 및/또는 NMR 데이터로부터 이러한 모델을 구성하기 위해서 어떠한 가능한 방법도 사용될 수 있다. 이러한 모델은 HKL, MOSFILM, XDS, CCP4, SHARP, PHASES, HEAVY, XPLOR, TNT, NMRCOMPASS, NMRPIPE, DIANA, NMRDRAW, FELIX, VNMR, MADIGRAS, QUANTA, BUSTER, SOLVE, O, FRODO, RASMOL, 및 CHAIN과 같은 공지의 소프트웨어 패키지를 사용하여 이용가능한 분석적 데이터 포인트로부터 구성할 수 있다. 그 후, 이러한 데이터로부터 구성한 모델은 예를 들어 실리콘 그래픽스(Silicon Graphics), 에반스 앤드 서덜랜드(Evans and Sutherland), SUN, 휴렛 팩커드(Hewlett Packard), 애플 매킨토시(Apple Macintosh), DEC, IBM, 및컴팩(Compaq)을 포함하는 이용가능한 시스템을 사용하여 가시화할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 모델 및 본 발명의 모델의 구성, 프로세싱 및/또는 가시화에 사용된 하드웨어를 포함하는 컴퓨터 시스템을 제공한다.

추가의 구현예는 컴퓨터 하드웨어 및 본 발명의 모델을 포함하는 컴퓨터 시스템을 제공한다.

또한, 하기 단계를 포함하여 cPLA₂활성 또는 결합의 작용제 또는 길항제인 화학종을 확인하는 방법이 제공된다: (a) 본 발명의 모델을 제공하는 단계, (b) 이러한 모델과 후보 화학종의 상호작용을 조사하는 단계, 및 (c) 작용제 또는 길항제로서 작용할 것으로 예측되는 화학종을 선택하는 단계. 이러한 방법에 따라 확인된 화학종 또한 제공된다.

다른 구현예는 (1) 후보 물질과 cPLA₂구조의 모델 간의 상호작용을 결정하는 단계를 포함하여 cPLA₂활성 또는 결합을 억제하는 물질을 확인하는 방법, 또는 (2) 후보 물질과 cPLA₂구조의 모델 간의 상호작용을 결정하는 단계를 포함하여 cPLA₂활성 또는 결합을 모방하는 물질을 확인하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에 따라 확인된 물질 또한 제공된다.

후보 화학종과 모델간의 상호작용의 조사는 QUANTA, RASMOL, O, CHAIN, FRODO, INSIGHT, DOCK, MCSS/HOOK, CHARMM, LEAPFROG, CAVEAT(UC Berkley), CAVEAT(MSI), MODELLER, CATALYST, 및 ISIS를 포함하는 이용가능한 소프트웨어 플랫포움을 사용하여 수행할 수 있다.

다른 구현예는 하기 단계를 포함하는 추론적인 약물 설계에 의해 cPLA₂활성의 억제제를 확인하는 방법을 제공한다: (a) cPLA₂의 결정 구조 코오디네이트(co-ordinate)에 근거하여 cPLA₂활성 부위의 하나 이상의 아미노산과 비공유 결합을 형성할 잠재적인 억제제를 설계하는 단계; (b) 억제제를 합성하는 단계; 및 (c) 잠재적인 억제제가 cPLA₂활성을 억제하는지 여부를 결정하는 단계. 바람직하게는, 이러한 방법에 사용되는 cPLA₂결정 구조 코오디네이트는 a=153.59옹스트롬, b=95.49옹스트롬, 및 c=139.13옹스트롬을 가진 스페이스 그룹(space group) P2₁2₁2의 cPLA₂결정으로부터 얻는다. 한 바람직한 구현예에서, 억제제는 하기 원자로 구성된 군으로부터 선택되는, cPLA₂활성 부위의 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 원자와 상호작용하도록 설계된다:

Ser228의 CB 및 Oγ원자;

Asp549 및 Asp575의 Oδ1 및 Oδ2 원자;

Arg200, Arg413, 및 Arg579의 CB, CG, CD, NE, CZ, NH1 및 NH2 원자;

Trp393의 골격 카르보닐 산소;

Asn555의 Nδ2 및 Oδ1 원자;

Phe397, Phe681, Phe683, 및 Phe199의 CD1, CE1, CG, CZ, CE2, 및 CD2 원자;

Trp232 및 Trp393의 CG, CD1, NE1, CE2, CZ2, CH2, CZ3, CE3 및 CD2;

Ser577의 CB 및 Oγ원자;

Cys331의 CB 및 Sγ원자;

Glu589의 OE1 및 OE2 원자;

Lys588의 CB, CG, CD, CE, 및 NZ 원자;

Thr680의 Oγ1 원자;

Glue418 및 Glue422의 OE1 및 OE2 원자;

Met417의 CB, CG, SD 및 CE 원자;

Leu400 및 Leu421의 CB, CG, CD1, CD2 원자;

Ile424의 CB, CG1, CG2, 또는 CD1 원자;

Ala578의 골격 NH 및 카르보닐 산소 원자; 및

His639의 CB, CG, ND1, CE1, NE2, CD2 원자.

이러한 방법에 의해 확인된 작용제 및 길항제가 또한 제공된다.

하기 단계를 포함하는 추론적인 약물 설계에 의해 cPLA₂막 결합의 억제제를 확인하는 방법이 또한 제공된다:

(a) cPLA₂의 결정 코오디네이트에 근거하여 cPLA₂정전기적 패치 영역 (electrostatic patch region)의 하나 이상의 아미노산과 비공유 결합을 형성하는 잠재적인 억제제를 설계하는 단계;

(b) 억제제를 합성하는 단계; 및

(c) 잠재적인 억제제가 cPLA₂의 막 결합을 억제하는지 여부를 결정하는 단계. 바람직하게는, 이러한 방법에 사용되는 cPLA₂의 결정 구조 코오디네이트는 a=153.59옹스트롬, b=95.49옹스트롬, 및 c=139.13옹스트롬을 가진 스페이스 그룹 P2₁2₁2의 cPLA₂결정으로부터 얻는다. 다른 바람직한 구현예에서, 억제제는Arg467, Arg485, Lys488, Lys544 및 Lys543으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산과 상호작용하도록 설계된다. 이러한 방법에 의해 확인된 작용제 및 길항제가 또한 제공된다.

도면의 간단한 설명

도 1은 cPLA₂의 749개 잔기당 단 하나의 Tb 원자의 산란(scattering)으로부터 얻은 MAD 위상(phase)으로 작성된 실험적 맵(map)이다. DM에서 용매 플래트닝(solvent flattening)(60% 용매 함량) 및 2-폴드 비결정학적 대칭 평균화(2-fold non-crystallographic symmetry averaging)를 사용하여 맵을 작성하였다.

도 2a는 cPLA₂단량체의 리본 다이아그램(ribbon diagram)이다. CaLB 영역은 녹색으로 도시되어 있고, 2개의 Ca²⁺원자는 적색으로 도시되어 있다. cPLA₂의 "캡(cap)" 구조는 자색으로 채색되어 있다. 전자 밀도가 낮은 이동성 루프(mobile loop)는 점으로 도시되어 있다. CaLB 및 촉매작용성 도메인간의 유연한 링커(flexible linker)는 적색으로 채색되어 있다. cPLA₂에서 인산화되어 있는 4개 세린 잔기의 위치도 도시되어 있다. 도면은 몰스크립트(Molscript)[Kraulis, 1991] 및 RASTER3D[Bacon & Anderson, 1988]로 제도하였다. 도 2b는 cPLA₂의 GRASP 표면 다이아그램이다. 수(Xu) 등(1998)의 NMR 실험에서 도데실포스포콜린 미셀과의 상호작용시 N¹⁵/NH를 나타낸 잔기는 자색으로 채색되어 있다. cPLA₂활성 클레프트(active cleft)는 적색으로 하이라이트 표시되어 있다. 리드 잔기(lid residue)는 명확성을 위해 제거되었다. 도 2c는 염기성 잔기는 청색 음영 및 산성 잔기는 적색으로 표시한 cPLA₂의 표면 위치 표시도이다. 리드 잔기는 명확성을 위해 제거되었다. 매우 염기성인 패치는 분자의 막 결합 영역상에서 뚜렷하게 보인다. 도면은 GRASP[Nicholls, 1992]으로 제도하였다. 모든 도면은 동일한 방향에 있다.

도 3a는 정규 α/β히드롤라아제 폴드(fold)의 리처드슨(Richardson) 표시도이다. β가닥은 화살표로 표시된 반면, α헬릭스는 직사각형으로 표시된다. 2차 구조 원소의 넘버링은 문헌[Schrag & Cygler(1997)]에 따른다. "친핵성 엘보우" 바로 다음에 오는 헬릭스 C는 핑크색으로 채색되어 있다. 도 3b는 cPLA₂폴드의 리처드슨 다이아그램이다. 넘버링 방식은 정규 α/β히드롤라아제 폴드에서와 같이 Ser288 바로 뒤의 헬릭스가 헬릭스 C이도록 하였다. 중심 코어는 도 3a의 정규 α/β히드롤라아제 폴드와 보다 용이하게 비교하기 위해 황색으로 채색되어 있다. "캡"을 구성하는 원소는 자색으로 채색되어 있고, 적색의 루프 영역은 매우 이동성이 있고 추적가능한 전자 밀도를 나타내지 않는다.

도 4는 cPLA₂α, β, γ의 1차 구조 배열이다. 동일한 잔기는 박스안에 표시되어 있는 반면, cPLA₂α의 x-선 결정 구조에서 관찰되는 2차 구조 원소는 그 서열 아래에 표시되어 있다. 캡 영역 외부의 2차 구조 원소는 황색으로 표시되어 있는 반면, 캡 영역에 있는 것들은 자색으로 표시되어 있다. 흑색 선은 회전 또는루프의 영역을 나타낸다. 잔기들은 흑색 선과 동일하지 않거나 또는 2차 구조 원소는 추적가능한 전자 밀도를 나타내지 않는다.

도 5a는 리드 잔기에 의해 커버링되는 cPLA₂의 촉매작용성 도메인을 나타내는 표면 다이아그램이다. Ser228은 펀넬(funnel)의 바닥에 도시되어 있다. 실험적 맵에서 보이지 않는 연속 서열은 적색 점으로 표시되어 있고 리드 힌지(lid hinge)의 형성과 관련되는 것으로 제안된다. 전자 밀도 맵에서 골격 원자만이 보이는 잔기는 알라닌으로 표시된다. 모든 소수성 잔기의 노출된 표면은 청색으로 착색되었고, Arg200의 표면은 적색으로 착색되었다. 도면은 GRASP[Nicholls, 1992]로 제도하였다. 도 5b는 Ser228 주위의 7Å 반경에 있는 cPLA₂의 활성 부위의 클로즈업이다. 촉매작용에 직접적으로 관여하는 2개의 잔기는 녹색으로 착색되어 있다. Arg200와 Gly 잔기 197 및 198을 잠복하는 루프는 황색으로 표시된다. 실험적 맵에서 보이는 단 하나의 물 분자는 Asp549와, Trp393 및 Thr330의 카르보닐 원자와 수소결합한다. 도면은 몰스크립트 및 RASTER3D로 제도하였다.

도 6은 글리세로인지질 기질의 sn-2 위치에 대한 Ser228의 공격을 포함하는, cPLA₂에 대해 제안된 촉매작용 메카니즘을 나타낸다. AA: 아라키돈산; HG: 헤드 기(head group); C18: 옥타데실기. Gly197 및 198은 옥시음이온 호울(oxyanion hole)의 일부로 제안된 반면, Arg200은 헤드기의 포스페이트 부분을 안정화시킨다.

발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예

cPLA ₂ 의 구조를 749개 잔기당 하나의 중원자 스캐터러(heavy atomscatterer)를 사용하여 규명하였다.

전장(full length) 인간 cPLA₂를 CHO 세포에서 발현시켰고 문헌[Clark et al., 1990]에 기재된 방법의 변법에 의해 정제하였다[Stahl et al., manuscript in preparation]. 침전제로서 PEG 1000을 사용하고 표준 증기 확산 기술을 사용하여 18℃에서 결정을 수득하였다. 단일 결정들은 수일 내에 0.6mmX0.5mmX0.1mm의 크기로 성장하였으나, x-선 손상에 대해 매우 민감하였다. PEG400 및 DMSO의 양을 증가시키면서 항냉동제 용액내에 결정을 수회 침지한 후에, 플래시 냉각(flash cooling)하고 싱크로트론 조사(synchrotron radiation)에 노출시키는 것은 2.5Å의 최소 브래그 스페이싱(Bragg spacing)에 대한 회절을 얻는데 중요하였다. 결정은 스페이스 그룹 P2₁2₁2(a=153.59Å, b=95.49Å, 및 c=139.13Å)을 가지며 비대칭 단위당 2개의 단량체(1498개 잔기) 및 60% 용매를 가진다.

cPLA₂의 중원소 침지된 결정을 제조하고자 하는 시도에 의해 가돌리늄 또는 테르븀만이 동형 유도체(isomorphous derivative)를 제공할 수 있음이 밝혀졌다. 그러나, 란탄족은 CaLB에서 단 하나의 Ca²⁺원자를 대체하여, 749개 아미노산 잔기당 단 하나의 중원자 스캐터러를 제공하였다. 이러한 결정으로부터 얻은 인하우스 위상(inhouse phasing) 정보는 초기 전자 밀도 맵을 제작할 정도의 양질은 아니었다. 이러한 관찰은, 대부분의 중원자의 결합이 천연 및 침지 결정간의 비-유질동상(non-isomorphism)을 생성한다는 사실에 부가하여, 다중파장 변칙분산(multiwavelength anomalous dispersion: MAD) 위상법에 의해 cPLA₂의 구조를 규명하도록 하였다[Hendrickson, 1991].

테르븀 침지된 cPLA₂결정을 제조하고, 저온처리하고(방법 참조), 100°K 질소 스트림에서 냉각하였다. Tb L_m에지(표 I 참조) 주위의 3개의 상이한 파장에서의 데이터를 단일 결정으로부터 수집하였고, 조사 민감성 때문에, 결정을 데이터 수집 사이에 회전 축을 따라 이동(translation)시켰다. 3.2Å에 대한 실험적 위상을 SHARP[de La Fortelle & Bricogne, 1997]으로 계산하였고; 후속하여 DM에서 용매 플래트닝 및 2-폴드 평균화[Cowtan et al., 1996]의 수회 사이클로 위상을 2.5Å까지 확장시켰다. 이러한 과정으로 양질의 전자 밀도 맵(도 1)을 작성하였고, 각 cPLA₂단량체의 도메인 둘 모두가 명료하게 확인되었다. 초기에는, CaLB[Perisic et al., 1998; 1RLW]를 밀도 안으로 회전시켰고, 각 단량체에 대하여 약 550개 잔기를 가진 모델을 생성하는 프로그램 QUANTA(Molecular Simulations Inc.)을 사용하여 촉매작용성 도메인의 가시 영역을 위해 폴리알라닌 흔적(trace)를 만들었다. 최종 위상 조합 단계에 의해 이러한 초기 구조의 위상 제한 정밀화(refinement)[REFMAC; Murshudov et al., 1997] 후에 수동 모델 설정(QUANTA)은 XPLOR[Bruenger et al., 1992b]에서 후속하여 정밀화되는 모델을 제작하였다. 본 모델은 1285개의 잔기(두 단량체 사이에) 및 40개의 물 분자를 함유한다(표 I).

분자 구조

cPLA₂단량체는 ∼ 100ÅX55ÅX45Å의 크기를 가진 2 도메인 타원형 구조이다(도 2a). N-말단 CaLB 도메인(잔기 16 내지 138)은 뚜렷하게 폴딩된 β샌드위치형이며, 잔기 139 내지 143에 의해 촉매작용성 도메인으로 연결되고, 촉매작용성 도메인과 함께 매우 적은 단백질-단백질 접촉을 형성한다. 촉매작용성 도메인의 중심 코어는 정규 α/β 히드롤라아제 폴드와는 구별되는 산재된 헬릭스와 함께 10 가닥 중심 β시트로 이루어진다. 비대칭 단위로 존재하는 cPLA₂단량체는 도메인간 루프의 유연성(flexibility) 때문에 완전히 겹쳐지지 않는다. 사실, CaLB 도메인이 겹쳐지는 경우, 2개의 촉매작용성 도메인간에 4 내지 5°의 차이가 존재한다. 도메인을 상호연결하는 루프는 각 단량체에서 상이한 형태(conformation)를 가지며 그 잔기는 고온 인자(high temperature factor)를 나타낸다.

cPLA₂는 유리 Ca²⁺수준이 마이크로몰 이하(submicromolar) 수준으로 증가하는 경우 막으로 이동하는 세포질 단백질이다[Clark et al., 1990, 1991]. cPLA₂의 도메인 배열은 활성 부위가 세포막에 관하여 어떻게 배향되어 있는지를 시사한다. 도 2b는 수 및 그의 공동 연구자(1998)에 의해 CaLB에 대해 수행된 HSQC 연구의 결과를 하이라이트 표시한 표면 다이아그램이다. 이 실험에서 도데실포스포콜린 미셀과 인큐베이션시 N¹⁵/NH를 나타낸 잔기들은 자색으로 하이라이트 표시되어 있다. 하이라이트 표시된 잔기들이 활성 부위와 동일한 분자 표면상에 나타나는 것은 명백하다. 결과적으로, CaLB가 이러한 잔기를 사용하여 인지질막과 회합하면, 촉매작용성 도메인은 활성 부위에서 인지질 기질과 결합하도록 개략적으로 배치된다. 두 도메인간의 링커의 유연성 뿐만 아니라 이들간의 주된 단백질-단백질 상호작용의 결핍은 도메인간의 작은 회전이 막과의 최적 상호작용을 위해 이루어질 수 있음을 시사한다.

도 2c의 표면 위치 다이아그램에서 나타난 바와 같이, 활성 부위로부터 CaLB의 β3 가닥상의 양으로 하전된 잔기의 스트립(strip)을 통하여 연장된 매우 염기성인 영역이 존재한다. 이러한 염기성의 특성은 막층의 음으로 하전된 인지질 헤드기와 다수의 정전기적 접촉을 이루는 단백질 영역일 것으로 예측된다(하기 참조). 그러나, 잔기 434 내지 456이 혼란되어 염기성 패치의 실제 크기를 정확히 규정하는 것이 불가능해진다. 그럼에도 불구하고, 유사한 염기성 패치가 PI4 키나아제 및 sPLA₂s의 상이한 종에서 발견되었음은 주목할 만하다[Rao et al., 1998]. 이것은 포스파티딜 메탄올 리포좀으로 제조된 막[Hixon & Gelb, 1998]에 대한 cPLA₂의 고친화성 결합이 CaLB 도메인에서 이러한 패치 및 β가닥 3의 가까운 염기성 스트레치(stretch)를 통해 매개되는 것으로 추측되게끔 한다.

N-말단 CaLB 도메인

전장 cPLA₂의 CaLB 도메인의 구조는 NMR 및 x-선 결정학에 의해 규명된 것들[Xu et al., 1998]과 매우 유사하며 근소한 차이만을 가진다. 간단히 언급하면, 이것은 6개 루프에 의해 상호연결되고, C2 도메인에 대한 "타입 II" 토폴로지에 맞는 β샌드위치형으로 폴딩된 8개의 역평행(antiparallel) β가닥으로 구성된다[Nalefski et al., 1994b]. 2개의 Ca²⁺원자는, 골격 카르보닐 탄소 원자 뿐만 아니라, 3개의 상이한 루프(칼슘 결합 루프; CBLs)상의 Asp 및 Asn 측쇄의 배열(constellation)에 의해 CaLB의 한쪽 말단에서 결합되며; 동일한 원자 배열은 페리식(Perisic) 및 그의 공동 연구자들(1998)에 의해 규명된 CaLB 도메인에서 관찰되었다. Ca²⁺원자들은 약 4Å 거리로 떨어져 있다. 그러나, 전장 cPLA₂의 Ca²⁺원자의 환경은 상기 연구자들에 의해 규명된 CaLB 구조에 존재하는 어떠한 물 분자도 나타내지 않으며; 대신에 결정화 및 저온보호(cryoprotection)에 사용된 완충액으로부터의 MES(2-[N-모르폴리노]에탄설폰산)의 분자가 칼슘 부위 1(페리식 등에 의해 정의됨, 1998)에 배위되어 있다. cPLA₂단량체 둘 모두에서, Ca²⁺1 및 가장 가까운 MES 설설포네이트 산소 원자간의 거리는 약 2.2Å이다. 또한, 모르폴리노기는 또한 His62 및 Tyr96의 측쇄와 접촉함으로써, 작은 소수성 니체(niche)를 형성한다. 결정화 인공산물이지만, MES의 설페이트에 대한 cPLA₂의 Ca²⁺1의 배위는 인지질 분자의 포스페이트기의 결합 방식을 모방할 수 있어서, cPLA₂에서 Ca²⁺는 단지 알로스테릭 활성화제로서 보다는 단백질 및 인산화된 막간의 브리지로서 작용하는 것으로 시사된다.

cPLA₂폴드의 새로운 토폴로지는 α/β히드롤라아제와 구별된다.

cPLA₂의 촉매작용성 도메인은 14개 β가닥 및 13개 α헬릭스를 포함하며; 그중심 코어는 9개 α헬릭스에 의해 둘러싸인 10 가닥 중심 혼합 β시트로 구성되며 가닥 β5 내지 β11은 시트의 가장 명백한 부분을 형성한다(도 3b의 리처드슨 다이아그램 참조). β시트는 수퍼헬릭스 꼬임(superhelical twist)을 가진다. 간단히 언급하면, cPLA₂의 2차 원소는, 촉매작용성 세린은 슈래그 및 사이글러(Schrag & Cygler, 1997)에 의해 제시된 α/β히드롤라아제 폴드 명명에 기초하여 확인되며, 상기 명명에서는 항상 β5가 앞에 있고 헬릭스 C가 뒤에 있다.

cPLA₂코어의 제 1 β가닥은 CaLB 뒤의 유연한 연결부 다음에 있는 β1이다. 하나의 긴 헬릭스를 함유하는 긴 루프는 폴드의 중심 부위에서 β4에 연결부를 만든다. 이러한 β1/α-헬릭스 구조는 휴미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa) 리파아제에서 관찰되는 구조와 유사한데, 헬릭스 영역이 또한 폴드의 일부로 간주되지 않으나 코어에서 β10을 제 1 β가닥과 연결된다(PDB에서 엔트리 1TIB). 뒤따르는 평행 β가닥인 β5는 촉매작용성 세린(228)에 선행한다. β5, 헬릭스 C의 토폴로지(도 3a 및 3b에서 핑크색으로 착색), 이들을 연결하는 루프의 토폴로지는 α/β히드롤라아제에서 유사하다. 이러한 상호연결 루프는 "친핵성 엘보우"로 명명된다. 루프에 의해 짜여진 3개 이상의 α헬릭스는 이러한 영역 및 폴드의 이 부분의 추가 4β가닥간의 연결을 제공한다. 뒤따르는 4개의 β가닥(β6 내지 β9)중에서, β6가 가장 길며, β7과 수소 결합을 거의 하지 않는다. 따라서, 가닥 β7 내지 β1은, 서열에 인접하지 않으나, 보다 큰 구조내의 작은 β시트로 간주될 수 있다.

β9 다음에, 중심 α/β코어의 형성으로부터 중요한 분기(divergence)가 있다. 이 지점에서 cPLA₂서열은 도 2a 및 3b에서 자색으로 나타낸 영역을 형성한다. 이러한 180 잔기의 패치는 촉매작용성 도메인 "캡"을 형성한다. Ser228의 촉매작용성 파트너인 Asp549는 캡의 말단 및 β10간의 영역에 있으며, 상기 영역은 중심 코어의 일부이다. 캡 구조에 뒤이어서, 마지막 3개의 β가닥은 중심 β시트를 완성하도록 배치되며 헬릭스 G 내지 J에 의해 산재된다.

α/β히드롤라아제 폴드는 많은 에스테라아제 및 기타 가수분해 효소에 공통적이다[Schrag & Cygler, 1997]. 리처드슨 다이아그램(도 3a)은 β가닥의 순서가 서열을 선형적으로 따르는 중심 β시트로 구성된다(예외적으로 β3는 종종 β4와 β5 사이에 위치함). 일견하여, cPLA₂의 토폴로지는 α/β히드롤라아제 폴드의 원형 퍼뮤테이션(permutation)인 것으로 보인다. 그러나, 도 3a 및 3b를 주의깊게 비교하면 친핵성 엘보우를 둘러싸는 영역만이 사실상 직접적으로 유사한 것으로 분명히 나타난다(β5 내지 헬릭스 C; 잔기 222 내지 238). 주된 차이점은 가닥 β6 내지 β9의 역평행 성질, β5 및 β6 사이의 헬릭스의 다수성, 및 cpla2 α/β코어의 후반 부분의 가닥 사이에 개재하는 헬릭스의 부재를 포함한다.

cPLA₂의 캡 구조(잔기 370 내지 548)가 촉매작용성 도메인의 일부이지만, 이것은 α/β코어에 포함되지 않는다. 인간 cPLA₂s α, β, 및 γ의 촉매작용성 도메인(도 4)을 비교하면 상동성은 α/β코어(황색 원소) 및 β가닥 9a 및 9d에 집중된 것으로 나타난다. 따라서, 캡의 중심 부분은 cPLA₂이형체(isoform)간에 상이하다. 캡 영역이 자색으로 표시된 2a의 cPLA₂의 리본 다이아그램 및 도 2c의 표면 위치 다이아그램을 비교하면 상기에서 막 인지질과의 정전기적 접촉을 이루는 것으로 가정된 매우 염기성인 영역이 사실상 대부분이 캡 잔기에 의해 형성되는 것으로 나타난다.

cPLA₂의 캡 영역은 또한 전체 구조의 3개의 가장 이동성인 영역중 2개, 즉 잔기 433 내지 456과 500 내지 536(제 3 영역은 C-말단, 잔기 728 내지 749이다)을 함유한다. 이들 아미노산 스트레치는 추적가능한 전자 밀도를 갖지 않으며 모델에 포함되지 않는다(도 2a에서 점선). 흥미롭게도, 이것은 작용제 자극시에 인산화되는 4개의 세린 잔기중의 3개(437, 454, 505)를 잠복하는 캡의 고도로 유연한 영역이다. Ser437 및 Ser454은 다른 종들간에 보존되지 않기 때문에, 이들의 역할은 불명하다. 대조적으로, Ser505는 진화론적으로 상이한 종들(닭, 인간, 제브라다니오(zebrafish), 쥐과동물, 랫트)의 cPLA₂에 보존되며, MAP 키나아제에 의한 인산화가 곤충 세포에서 cPLA₂의 최대 활성화에 필요하다[Lin et al., 1993; Qiu et al., 1998]. 본 발명자들의 결정에서 이종적으로 인산화될 것 같고 매우 유연한 용매 노출 루프에 위치하는 Ser505는 단백질의 몸체(body) 또는 격자내의 기타 이웃하는 cPLA₂와 접촉하지 않는다. Ser505는 활성 부위 및 막결합 부위 둘 모두에 멀리 있지만(도 2a), CaLB 및 촉매작용성 도메인간의 힌지에 근접해 있는 것은 주목할 만하다(검토 참조). cPLA₂인산화의 제 4 부위인 Ser727은 구조의 C-말단에 있다.이 부위가 종들간에 보존되지만, 그 기능적 관련성은 아직 알려져 있지 않다.

활성 부위 펀넬은 용매 접근가능한 리드(solvent-accessible lid)에 의해 부분적으로 커버링된다.

cPLA₂구조의 가장 현저한 특징은 촉매작용성 도메인으로 경로의 3분의 1을 침투하여 깊고 좁은 클레프트에 위치한 Ser228 및 Asp549를 드러내는 활성 부위 펀넬이다. 상단에서는 넓지만, 펀넬은 아래로 가면서 좁아져서 도 5a에서 볼 수 있는 활성 부위 클레프트의 입구에서는 약 7Å의 직경으로 된다. 펀넬은 소수성 잔기로 채워져 있고(도 5a의 청색), 막 인지질 기질의 지방 아실 부분이 결합할 수 있는 크래들(cradle)을 형성한다.

cPLA₂활성 부위는 잔기 413 내지 457을 포함하는 "리드(lid)"에 의해 부분적으로 커버링된다. 리드는 루프 영역, 그 다음에 작은 헬릭스 스트레치 및 짧은 회전내로 폴딩된다. 리드 영역내로 도입된 잔기 408 내지 412는 매우 큰 온도 인자를 나타내며, 잔기 434 내지 456은 추적가능한 전자 밀도를 갖지 않는다. 이러한 관찰은 이들 영역이 매우 이동성이며 "리드 힌지"로서 상정될 수 있음을 시사한다. 리드의 가시 영역은 양쪽성을 가지며, 이것의 용매 노출 표면은 주로 극성 잔기(T416, E418, E419, E420, N423)로 형성되는 반면, 내부 면은 소수성 아미노산(M417, L421, I424)로 채워져 있다. 리드의 "이중면(double-sided)" 성질은 막 인지질 결합시 작용할 것으로 생각할 수 있는데, 이는 한 표면이 수소 결합 접촉을 형성하는 능력을 가진 반면, 다른 쪽 표면은 기질 또는 막과 소수성 상호작용에 보다 적합하기 때문이다.

리드가 위치된 cPLA₂의 활성 클레프트의 디아실인지질 분자를 모델링하려는 시도는 아실 에스테르 결합이 주변 잔기와 겹침이 일어나지 않고 활성 부위 세린의 부근에 배치될 수 없음을 입증하였다. 결론적으로, 기질 결합에 적당한 공간의 생성은 리드 이동을 필요로 한다고 생각할 수 있으며, 이 제안은 계면적 활성화로 알려진 현상인, cPLA₂가 단량체 기질 보다는 미셀의 존재하에서 보다 큰 활성을 나타낸다[Cygler & Schrag, 1997]는 관찰과 일치한다.

대부분의 리파아제는 효소의 "폐쇄(closed)" 형태에서 활성 부위를 커버링하는 리드의 형태적 재배열의 결과로 계면적 활성화를 나타낸다. 리드는 미셀의 결합시에 떨어져 이동함으로써, 촉매작용성 잔기가 기질에 노출되는 "개방(open)" 형태를 형성시킨다. x-선 결정학은 "폐쇄" 형태 및 대부분이 억제제의 존재하에서 결정화되는 "개방" 형태 양자 모두의 리파아제의 구조 결정에 의해 이러한 활성화 메카니즘의 다수예를 산출하였다[Cygler & Schrag et al., 1997]. cPLA₂의 계면적 활성화 메카니즘은, 리드 이동이 활성 부위 펀넬의 접근가능한 표면적을 증가시킬 뿐만 아니라 촉매작용성 잔기에 대한 저지되지 않은 접근을 제공하는데 중요한 단계라는 점에서 다른 리드 함유 라파아제의 메카니즘과 유사할 것이다.

cPLA₂활성 부위는 촉매작용성 다이아드(dyad)를 함유한다.

α/β히드롤라아제에 의한 아실 가수분해는 세린 프로테아제에 존재하는 것을 상기시키는 (Ser-Asp/Glu-His) 촉매작용성 트리아드에 의해 수행된다. 기질의 아실 에스테르 결합은 친핵성 세린에 의해 공격되며, 물 분자의 공격을 수반하는단계를 따라 후속하여 방출되는 공유결합된 아실 효소 중간체를 생성한다. α/β히드롤라아제 폴드를 가진 모든 지질 대사 효소가 촉매작용성 트리아드의 사용에 의해 작용하지만, cPLA₂에서 이러한 트리아드의 모든 구성원의 확인은 힘든 작업인 것으로 판명되었다. 샤프(Sharp) 및 그의 공동 연구자들(1994)에 의한 부위 지정 돌연변이생성에 의해 촉매작용에서 Ser228 및 Asp549의 역할이 확인되었으나; 19개 히스티딘 잔기 모두가 활성에 영향을 미치지 못한 것은 새로운 촉매작용 메카니즘을 암시한다[Pickard et al., 1996]. 이러한 관찰로부터 cPLA₂가 히스티딘의 참여를 필요로 하지 않는 새로운 촉매작용 중심을 함유한다는 제안에 이르게 된 반면, 활성에 대한 Arg200의 관련성은 미지인 채로 남아있다[Leslie, 1997; Pickard et al., 1996].

cPLA₂의 x-선 결정 구조는 Ser228이 펀넬형 공동의 바닥에 위치하고; Asp549의 Oδ2는 Oγ원자로부터 2.9Å의 거리에 있는 활성 부위를 분명히 나타낸다(도 5b). 그러나, cPLA₂활성 부위는 히스티딘 잔기가 결핍되어 있는 것이 명백하다. 또한, 활성 부위 염기의 기능을 수행할 수 있는 6Å 범위내의 다른 잔기는 없다. 어느 한 쪽 잔기로부터 3.5Å 범위내의 모든 극성 기여도는 골격 기에 의하거나, Asp549의 Oδ1 원자로부터 3.2Å 떨어져 위치한 고립 물 분자에 의해 이루어진다. Asn555가 활성 부위 펀넬을 채우지만, 그 Nδ2 원자는 어느 한 쪽 잔기로부터 약 6Å 떨어져 있고 이 기능을 수행하기 위한 이상적인 후보는 아니다.

아실 히드롤라아제에서, 글리세로인지질 기질의 sn-2 위치에 대한 공격시,전이 상태는 "옥시음이온 호울", 또는 한 세트의 수소 결합 공여체(일반적으로 아미드 원자) 및/또는 전이 상태의 증가하는 음전하를 안정화하는 기능을 가진 염기성 잔기에 의한 안정화를 필요로 한다. 여러 리파아제에서, 옥시음이온 호울에 기여하는 하나 이상의 잔기가 이동 루프의 일부이고, 적당한 형태는 리파아제가 "개방" 형태에 있는 경우에만 달성되지만, 이러한 재배열이 절대적인 요건은 아니다. cPLA₂에서, Gly197 및 198은 β4 및 헬릭스 B간의 글리세린이 농후한 유연한 루프의 일부이며, 이러한 배치는 Gly197 및 Gly198의 아미드 골격이 미리 형성된 옥시음이온 호울의 구성원에 대한 우수한 후보가 되도록 한다(도 5b 참조). 또한, Gly229의 골격 아미드기는 β5 및 헬릭스 C 사이 회전의 정점에 있는데, 또한 Gly197 루프의 방향으로 향해 있기 때문에 호울의 일부일 수도 있다. 결과적으로, 이 영역은 키모트립신의 옥시음이온 호울에서와 같이, 에스테르의 친핵성 공격에 의해 생성되는 사면체 중간체를 안정화하도록 잘 설계되어 있는 것으로 보인다.

다수의 호울이 Arg200에 대해 제안되었다. 이것은 효소를 지질 계면과 결합시키고; 인지질막과 상호작용시키며; 촉매작용성 잔기로서 참여시키고; 아실 효소 중간체를 안정화시키거나; 기질 인지질의 포스포릴기와 회합하는데 있어서 CaLB를 보조하는데 관련되었다[Pickard et al., 1996]. 펀넬내에 파묻힌 Arg200의 배치(그 표면 영역은 도 5a에서 적색으로 착색되어 있다)는 CaLB에 어떠한 지질 결합 보조도 제공하지 못하도록 한다. 또한, 그 측쇄는 활성 부위 세린으로부터 약 9Å 떨어져 있어, 촉매작용에서 역할을 수행하지 못한다. 그러나, Arg200은 활성 부위펀넬 주위의 잔기와 어려가지 중요한 접촉을 한다. 측쇄는 Thr680과 염다리(salt bridge)를 형성하고 Phe678의 골격 원자와 접촉하며, 상기 둘 모두는 헬릭스 H 및 I 사이의 루프에 존재한다. 옥시음이온 호울 루프상의 Arg200의 위치는 피카드 및 그의 공동 연구자들(1996)에 의해 보고된 Arg200 Lys 변이체에서 이들 2개의 수소 결합의 결여가 활성에 현저한 중요성을 갖는 옥시음이온 호울 루프의 형태에 대한 미묘한 변화를 초래할 수 있음을 시사한다.

cPLA ₂ 에 의한 촉매작용은 다른 아실 히드롤라아제와는 상이한 메카니즘에 의해 진행된다.

cPLA₂의 활성 부위에서 히스티딘 잔기 또는 다른 가능한 염기의 부재는 효소가 새로운 촉매작용 메카니즘에 의해 아실 가수분해를 촉진함을 시사한다. 세린 프로테아제 및 다른 히드롤라아제에서, 히스티딘 잔기는 반응성 세린의 히드록실기로부터 양성자를 받아서, 공유성 사면체 중간체의 형성을 촉진한다. 제 2 단계에서, 아실 효소 중간체는 물 분자에 의해 가수분해되어 생성물을 방출하고, 효소에 ser-히드록실을 회복시킨다. 촉매작용 경로가 활성 부위 세린의 아실화 후에 에스테르 결합의 가수분해와도 관련되어 있는 클래스 A TEM-1 β락타마아제는, 직접적으로[Gibson et al., 1990], 또는 물 분자를 경유하여[Lamotte-Brasseur et al., 1991] 활성 부위 Ser70으로부터 Glu166의 카르복실레이트기에 양성자를 전이시킨다. 보다 최근의 연구[Damblon et al., 1996]에서는 Glu166 및 Ser70의 카르복실레이트 산소간의 긴 거리가 직접적인 양성자의 전이를 배제하는 것으로 제안되었으나, 양성자 릴레이(proton relay)에 대한 교량 물 분자(bridging water molecule)의 참여가 제안된다. N-말단 세린으로 이루어진 단일 잔기 촉매작용 중심을 함유하는 페니실린 아실라아제의 촉매작용 메카니즘[Duggleby et al., 1995]에서, 교량 물 분자는 Ser1의 α-아미노기의 염기성 성질을 중개한다. 결과적으로, Ser1의 Oγ원자는 아미노말단기에 의해 충분히 증가되는 친핵성을 가지며, 아실 효소 중간체의 형성이 후속하여 일어난다.

cPLA₂에서, 일반적인 염기의 역할을 할 수 있는 유일한 잔기는 Asp549이며, 이는 Ser228의 Oγ원자의 3.5Å 반경내에 다른 측쇄가 존재하기 않기 때문이다. 도 6은 cPLA₂의 촉매작용 메카니즘에 대한 제안된 모델을 나타낸다. 효소가 막에 결하되면, 단일 인지질 분자가 활성 부위에 결합한다. 헤드기(도 6의 HG)의 포스페이트 부분은 Arg200 측쇄에 의해 안정화된다. Gly197 및 Gly198의 골격 아미드기에 의해 형성되는 옥시음이온 호울은 또한 sn-2 에스테르를 극성화하고 패널 B에서 형성된 사면체 중간체를 안정화시키는 것으로 확인된다. 효소-기질 복합체의 형성 후에, Asp549는 촉매작용성 염기로서 작용하고 반응성 Ser228의 히드록실기로부터 양성자를 추출하며, 이것이 sn-2 에스테르를 공격하고 안정화된 사면체 중간체를 경유하여 아실 효소를 형성한다. 아실 효소는 후속하여 물 분자에 의해 가수분해되어(패널 C) 유리 라이소-인지질(lyso-phospholipid)를 생성하고, 아라키도닐 중간체의 이중 결합 분해 후에, 유리 아라키돈산(도 6에서 AA; 패널 D 및 E)을 생성한다. 그 후 cPLA₂는 막 계면으로부터 해리되거나 다른 인지질 기질과 결합하여사이클을 반복할 수 있다. 따라서, cPLA₂는 완전한 촉매작용성 트리아드 없이 친핵성 세린을 사용하는 아실라아제의 제 3의 상이한 예이다.

검토

cPLA₂결정이 거대 비대칭 단위(1498개 아미노산)이고 부서지기 쉬움에도 불구하고, MAD 위상법은 단일한 결정으로부터 얻은 데이터로부터 양질의 전자 밀도 맵을 작성하는데 성공적이었다. 어드밴스드 라이트 소오스(Advanced Light Source, Berkeley, CA)의 높은 플럭스(flux) 및 파장 안정성과 결합하여 란탄족 원자의 L_m에지에 전형적인 큰 비쥬보에(Bijvoet) 및 분산 차이가 이러한 성공에 중요하였다. 제 3 세대 싱크로트론의 출현으로, MAD는 거대 고분자 구조의 규명에 통상적으로 사용된다.

cPLA₂는 cPLA₂결핍 마우스의 사용에 의해 증명되는 바와 같이, 염증의 지질 매개물질의 생합성에 필수적이다[Bonventre et al., 1997; Uozumi et al., 1997]. 류코트리엔, 프로스타글란딘 및 PAF는 중요한 대중적 영향력을 갖는 질환의 병태생리에 중요한 역할을 하기 때문에, 이들의 생합성이 어떻게 조절되는지 이해하는 것이 긴요하다. cPLA₂의 구조는 아라키도닐 선택성의 원인 및 인산화에 의한 조절에 대한 새로운 인식을 제공한다. 또한, 이것은 리파아제에 대한 새로운 폴드 및 매카니즘 양자 모두를 확인한다. cPLA₂의 구조는 C2 도메인이 전체 단백질의 콘텍스트(context)에서 확인되는 제 2 구조일 뿐이다. PLCδ2 및 cPLA₂사이에 상당한차이가 확인된다.

cPLA₂폴드는 효소가 2개의 상이한, 독립적으로 폴딩된 도메인으로 구성됨을 명백히 보여준다. 이러한 결과는 CaLB 및 촉매작용성 도메인이 독립적으로 발현될 때 완전히 기능적이었다는 초기 연구를 근거로는 예측되지 않았다. 그러나, 놀라운 것은 도메인간의 접촉점의 희박성 및 잠재적인 유연성이었다. C2 도메인은 분자 시그널링에서 통상적으로 관찰되지만, 이제까지는 PLCδ1의 결정 구조만이 촉매작용성 도메인의 콘텍스트에 존재하는 C2 도메인을 보고하였다[Essen et al., 1996]. 이 경우에, C2 도메인의 한 면의 거의 전체적인 표면과 촉매작용성 도메인 사이에 광범위한 소수성 접촉이 존재한다. 대조적으로, cPLA₂의 촉매작용성 도메인 및 CaLB 도메인간의 상호작용은 충분히 제한되어 비대칭 단위의 상이한 단량체에서 2개를 연결하는 폴리펩티드의 형태들이 상이하다. 이러한 관찰은 CaLB 및 촉매작용성 도메인의 최적 배향이 고정적이지 않고, 대신에 어떤 방식으로 조절될 수 있다는 점에서 메카니즘상 중요한 것이다. 흥미롭게도 세포에서 최적의 활성에 필수적인 Ser-505를 포함하는 단백질의 영역이 혼란될지라도, 이러한 중요한 MAP-키나아제 부위는 힌지 영역 부근에 위치한다는 점이 주목된다.

cPLA₂및 고전적인 α/β히드롤라아제 폴드의 구조를 상세히 비교하면 cPLA₂가 신규한 토폴로지를 함유하는 것이 명백히 입증된다. 그러나, 전술한 바와 같이, 활성 부위 세린을 함유하는 β헤어핀(haipin)은 α/β히드롤라아제 폴드의 "친핵성 엘보우"와 구조적으로 유사하다. cPLA₂촉매작용성 도메인의 블래스트조사(blast search)는 잔기 ∼190 내지 232를 포함하는, PLBs 및 cPLA₂α, β, γ간의 상동성의 확장 영역을 나타낸다. 이러한 상동성은 Arg200, 옥시음이온 호울을 포함하는 골격 영역 및 제 2 세린이 고전적인 글리신을 대체하는 새로운 GXSXS 리파아제 모티프를 포함한다는 점에서 기능성인 중요성을 가진다. 짧은 영역에서 상동성의 "집중(concentration)"은 게놈 구조에 의해서도 설명되며, 이들 잔기는 단일한 엑손(잔기 186 내지 238에 상응)에 의해 코딩된다.

α/β히드롤라아제에 대해서 볼 수 있는 바와 같이, Ser, His, Asp/Glu의 촉매작용성 트리아드를 함유하는 대신에, cPLA₂는 Ser-228 및 Asp-549로 이루어진 다이아드를 사용하여 sn-2 에스테르를 절단시킨다. Asp-549의 카르복실레이트는 친핵성 공격에 대해 세린을 활성화하기에 충분히 가깝게 근접하여 있는 유일한 잔기이다. 유사한 촉매작용성 다이아드는 클래스 A β-락타마아제에 의해 촉매되는 아미드 가수분해 반응에 대해 제안되었다[Matagne et al., 1998]. 그러나, 이 경우에 글루타메이트 측쇄는 개재 물 분자를 경유하여 세린 잔기를 활성화한다. 다이아드 대 트리아드의 유사한 효율성을 평가하는 것은 어렵지만, 촉매작용에서 중요한 것은 전이 상태에 도달하는데 필요한 활성화 에너지라는 것은 주목할 만하다. 따라서, 효과적인 옥시음이온 호울에 기인한 안정화는 덜 친핵성인 세린을 벌충할 수 있다. 이러한 결정 구조에서, 결정적인 Arg-200으로부터 단지 2개의 잔기를 배치한 글리신 197 및 198의 골격 아미드기는 옥시음이온 호울로서 작용하도록 적절하게 배치된다. Gly-229의 골격 NH는 가능하게는 전이 상태에서 발생하고 사면체중간체로 존재하는 옥시음이온을 안정화하는데 도움이 될 수도 있다. 옥시음이온 호울의 효과는 NMR 연구와 일치하며, 상기 연구에서는 아라키도닐트리플루오로메틸 케톤이 이온화된 헤미케탈로서 효소와 결합하는 것으로 나타났다.

cPLA₂의 촉매작용성 세린은 촉매작용성 도메인의 중심 부근의 깊은 펀넬에 존재한다. 인지질을 활성 부위로 모델링하려는 시도에 의해 활성 부위 펀넬의 현 형태가 충분히 크기 않았음이 입증되었다. 그러므로, 본 발명자들은 C-말단이 23개 아미노산으로 된 완전히 혼란된 스트레치에 연결된 약간 이동성인 리드가 막 결합시 이동할 수 있어서, 펀넬의 상단 부근에 기질을 수용하도록 보다 큰 접근가능한 부피를 제공할 것을 제안한다. 기질/세정제 미셀의 존재 및 부재 모두에서 췌장 라파아제/코리파아제(colipase)의 결정 구조는 이 모델에 대한 선례를 제공한다[van Tilbeurgh et al., 1993]. 이 경우에, 미셀 또는 저해제의 존재하에서 현저한 형태 변화가 일어나 29Å의 리드 이동을 수반하여 활성 클레프트 및 소수성 패치를 노출시킨다. 이러한 큰 구조적 변화는 다른 α/β히드롤라아제 단백질에 대해서 언급되었다. 막 표면 결합시 이러한 형태적 변화는 계면적 활성화의 과정을 설명하는데 사용되었고, 계면적 활성화에서 리파아제의 촉매 활성은 단량체로서 보다 미셀 상태로 제공되는 기질에 대해 보다 크다.

cPLA₂의 경우, 그 라이소포스포리파아제는 단량체로서 또는 미셀의 일부로서 제공되는 동일한 기질에 대한 활성을 비교하는데 사용되었다. 이러한 측정에 따르면, cPLA₂활성은 1-팔미토일-2-라이소포스파티딜콜린의 농도가 단지 10배 증가될 때∼1500배 증가하므로, cPLA₂는 표면으로서 제공된 기질에 대하여 보다 활성적인 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들의 구조는 유연한 리드의 이동에 의해 규정되는 형태적 변화가 막 결합시 일어남을 시사하며, 이러한 관찰은 이전에 관찰된 계면적 활성화와 일치한다.

활성 부위를 커버링하는 리드의 이동에 부가하여, 몇가지 구조들은 전이 상태를 안정화하는 옥시음이온 호울이 결합된 기질 또는 억제제의 존재하에서만 완전히 형성됨을 보여준다[Cygler & Schrag, 1997]. 큐티나아제(cutinase)는 옥시음이온 호울이 천연 구조에서 완전히 형성된다는 점에서 이러한 일반 원칙의 예외이다. 중요한 것은 큐티나아제는 계면적 활성화를 나타내지 않는다는 것이다[Martinez et al., 1992].

아라키도닐 함유 인지질에 대한 cPLA₂의 선택성은 구별되는 특징이다. 저분자량 sPLA₂s는 상이한 지방산을 구별하지 않지만, cPLA₂는 많은 검정 포맷에서 아라키도닐 및 5 및 8번 위치에서 시스-이중 결합을 가진 다른 지방산에 대해 높은 선택성을 나타낸다[Clark et al., 1995; Gelb aasn-1 and sn-2, Gelb hydrazin]. 구조 결정 전에는, cPLA₂선택성의 원인은 알려져 있지 않았다. 촉매작용 기구는 효소의 표면 부근에 위치하며, 여기서 이중층으로부터 지질을 추출하지 않고 sn-2 에스테르에 대해 작용할 수 있는 것으로 생각할 수 있었다. 이것은 PI4 키나아제의 플래트닝된 키나아제 도메인과 유사하며, 상기 도메인에서 효소는 인지질 그 자체를 추출하지 않고 지질 헤드기에 대해 작용하는 것으로 생각된다[Rao et al.,1998]. cPLA₂의 경우 본 발명자들은 선택성이 폴리불포화 지방산의 보다 느슨한 충전에 기인하여 sn-2 에스테르의 노출이 더 크기 때문인 것으로 예상하였다. 그러나, 본 발명자들이 구조에서 확인한 바와 같이, 인지질은 깊은 활성 부위내로 ∼8 내지 10Å에 결합하여야 한다. 따라서, 선택성은 아라키도닐 부분과 효소간의 상호작용에 기인하는 것이 틀림없다. 선택성의 차이를 결정하기 위하여 α및 γcPLA₂s 사이의, 즉 활성 부위 및 완전한 비보존 리드 영역에서 상이한 잔기를 돌연변이시키는 것은 유익할 것이다.

본 발명에 따라 확인된 물질의 바람직한 투여 방법 및 투여량

본원에서 사용된 "인지질 효소 활성"은 인지질의 대사에 대한 검정(바람직하게는, 하기 실시예 2에 기재되거나 본원에 삽입된 참고문헌중에 기재된 검정중 하나)에서 양성 활성인 것을 의미한다. 화합물은 효소 활성에 대해 이용가능한 임의의 검정(바람직하게는 실시예 70에서 후술되는 검정)에서 포스포리파아제(바람직하게는 cPLA₂)의 활성을 억제할 때 "포스포리파아제 효소 억제 활성"을 가진다. 바람직한 구현예에서, 화합물은 (1) LysoPC 검정에서 약 25μM 미만의 IC₅₀값; (2) 소포 검정(vesicle assay)에서 약 50μM 미만의 IC₅₀값; 및/또는 (3) PMN 검정에서 약 1μM 미만의 IC₅₀값을 가진다.

본 발명의 화합물 및 우르솔산(ursolic acid)은 포스포리파아제 효소(바람직하게는 cPLA₂) 활성을 억제하는데 유용하며, 따라서 염증성 질환 또는 염증 관련 질환(예를 들어, 류마티스성 관절염, 건선, 천식, 염증성 장질환, 및 프로스타글란딘, 류코트리엔 또는 PAF에 의해 매개되는 기타 질환) 및 기타 질환, 예를 들어 골다공증, 대장염, 골수성 백혈병, 당뇨병, 소모병 및 죽상경화증을 "치료"(즉, 치료, 예방 또는 경감)하는데 유용하다.

본 발명은 본 발명의 화합물을 사용하는 약학 조성물 및 치료 또는 사용의 치료 방법 둘 모두를 포함한다.

본 발명의 화합물은 약학적으로 허용되는 담체와 배합된 약학 조성물에 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 또한 (본 발명의 화합물 및 담체에 부가하여) 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 및 당해 분야에서 잘 알려진 기타 물질을 함유할 수 있다. 용어 "약학적으로 허용되는"은 활성 성분의 생물학적 활성의 효과를 손상시키지 않는 비독성 물질을 의미한다. 담체의 성질은 투여 경로에 좌우된다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 사이토카인, 림포카인, 또는 기타 조혈 인자, 예를 들어 M-CSF, GM-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, G-CSF, Meg-CSF, 간세포 인자(stem cell factor), 및 에리스로포이에틴을 포함할 수 있다. 약학 조성물은 다른 항염증약을 추가로 함유할 수 있다. 이러한 추가의 인자 및/또는 약제는 본 발명의 화합물과 함께 상승적 효과를 내기 위하여, 또는 본 발명의 화합물에 의한 부작용을 최소화하기 위하여 약학 조성물에 포함될 수 있다. 역으로, 본 발명의 화합물은 사이토카인, 림포카인, 다른 조혈 인자, 혈전용해성 또는 항혈전성 인자, 또는 항염증약의 부작용을 최소화하기 위하여 특정 사이토카인, 림포카인, 다른 조혈 인자, 혈전용해성 또는 항혈전성 인자, 또는 항염증약의 제형에 포함될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 화합물이, 약학적으로 허용되는 담체에 부가하여, 수용액중의 미셀, 불용성 단층, 액정, 또는 라멜라층으로서 집합된 형태로 존재하는 지질과 같은 양쪽성 약제와 함께 배합되는 리포좀의 형태일 수 있다. 적당한 지질 또는 리포좀 제형은 비제한적으로 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 설파티드, 라이소레시틴, 인지질, 사포닌, 담즙산 등을 포함한다. 이러한 리포좀 제형의 제조는, 본원에서 참고문헌으로 삽입된, 예를 들어 미국 특허 제 4,235,871호, 미국 특허 제 4,501,728호, 미국 특허 제 4,837,028호, 및 미국 특허 제 4,737,323호에 기재된 바와 같이 당업계의 기술수준내에 있다.

본원에서 사용된 용어 "치료적 유효량"은 의미있는 환자 이익, 즉 염증 반응 또는 질환의 치료, 치유, 예방 또는 개선, 또는 이러한 질환의 치료, 치유, 예방 또는 개선율의 증가를 나타내기에 충분한, 약학 조성물 또는 방법의 각 활성 성분의 총량을 의미한다. 단독으로 투여되는 각각의 활성 성분에 적용되는 경우, 상기 용어는 단독 성분의 양을 언급한다. 조합약에 적용되는 경우, 상기 용어는 연속적으로든 동시로든 병용 투여되는 경우, 치료 효과를 가져오는 활성 성분의 배합량을 언급한다.

본 발명의 치료 또는 사용 방법을 실시함에 있어서는, 치료하려는 질환을 가진 포유동물에게 본 발명의 화합물의 치료적 유효량을 투여한다. 본 발명의 화합물은 본 발명의 방법에 따라 단독으로 또는 다른 항염증약, 사이토카인, 림포카인 또는 기타 조혈 인자를 사용한 치료와 같이 다른 요법과 병용하여 투여될 수 있다.하나 이상의 다른 항염증약, 사이토카인, 림포카인 또는 기타 조혈 인자와 병용투여되는 경우, 본 발명의 화합물은 다른 항염증약, 사이토카인, 림포카인, 기타 조혈 인자, 혈전용해성 또는 항혈전성 인자와 동시에 또는 연속하여 투여될 수 있다. 연속하여 투여되는 경우, 주치의는 다른 항염증약, 사이토카인, 림포카인, 기타 조혈 인자, 혈전용해성 또는 항혈전성 인자와 병용하여 본 발명의 화합물을 투여하는 적당한 순서를 결정한다.

약학 조성물에 사용되거나 본 발명의 방법을 실시하기 위한 본 발명의 화합물의 투여는 다양한 통상적인 방식, 예를 들어 경구 섭취, 흡입, 또는 피부, 피하, 또는 정맥 주사로 수행될 수 있다.

본 발명의 화합물의 치료적 유효량이 경구 투여되는 경우, 본 발명의 화합물은 정제, 캡슐, 산제, 액제 또는 엘릭실의 형태일 것이다. 정제 형태로 투여되는 경우, 본 발명의 약학 조성물은 젤라틴과 같은 고형 담체 또는 보조제를 추가로 함유할 수 있다. 정제, 캡슐, 및 산제는 약 5 내지 95%의 본 발명의 화합물, 및 바람직하게는 약 25 내지 90%의 본 발명의 화합물을 함유한다. 액체 형태로 투여되는 경우, 물, 석유, 동물성유 또는 식물성유, 예를 들어 땅콩유, 광유, 대두유, 또는 참기름, 또는 합성유와 같은 액체 담체가 첨가될 수 있다. 약학 조성물의 액체 형태는 생리 식염 용액, 덱스트로오스 또는 기타 당용액, 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜을 추가로 함유할 수 있다. 액체 형태로 투여되는 경우, 약학 조성물은 약 0.5 내지 90중량%의 본 발명의 화합물, 및 바람직하게는 약 1 내지 50%의 본 발명의 화합물을 함유한다.

본 발명의 화합물의 치료적 유효량이 정맥내, 피부 또는 피하 주사에 의해 투여되는 경우, 본 발명의 화합물은 발열성 물질 부재의 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태일 것이다. pH, 등장성, 안정성 등이 적당한 이러한 비경구적으로 허용되는 단백질 용액의 제조는 당업계의 기술 수준내에 있다. 정맥내, 피부 또는 피하 주사를 위한 바람직한 약학 조성물은 본 발명의 화합물에 부가하여 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 덱스트로오스 주사액, 덱스트로오스 첨가 염화나트륨 주사액, 락테이트 첨가 링거 주사액과 같은 등장성 비히클, 또는 당업계에 공지된 기타 비히클을 함유하여야 한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 안정화제, 보존제, 완충제, 항산화제, 또는 당업자에게 공지된 기타 첨가제를 함유할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물중의 본 발명의 화합물의 양은 치료하려는 질환의 성질 및 경중도, 및 환자가 받은 이전의 치료의 성질에 좌우된다. 궁극적으로, 주치의가 각 개별적인 환자를 치료하기 위한 본 발명의 화합물의 양을 결정한다. 초기에는, 주치의는 저용량의 본 발명의 화합물을 투여하고 환자의 반응을 관찰할 것이다. 환자에 대해 최적의 치료 효과가 얻어질 때까지 본 발명의 화합물을 보다 고용량으로 투여할 수 있고, 최적 효과가 얻어진 시점에서 용량을 더 이상 증가시키지 않는다. 본 발명의 방법을 실시하기 위하여 사용되는 다양한 약학 조성물은 체중 kg당 약 0.1㎍ 내지 약 100mg(바람직하게는 약 100㎍ 내지 약 50mg, 보다 바람직하게는 약 100㎍ 내지 약 5mg)의 본 발명의 화합물을 함유하여야 한다.

본 발명의 약학 조성물을 사용하는 정맥내 요법의 지속기간은 치료하려는 질환의 경중도 및 각 개별적인 환자의 질환 및 가능한 특이체질 반응에 따라 변화할것이다. 본 발명의 화합물의 각 투여 기간은 12 내지 24시간 범위의 연속 정맥내 투여일 것으로 생각된다. 궁극적으로, 주치의가 본 발명의 약학 조성물을 사용하는 정맥내 요법의 적당한 기간을 결정할 것이다.

실시예 1

단백질 제조, 결정화 및 데이터 수집

전장 인간 cPLA₂(잔기 1 내지 749)를 벡터 pMT2-EMC-cPLA₂내로 클로닝하고 CHO 세포내로 트랜스펙션시켰다. 생성된 세포주 E5-CHO를 린(Lin) 등의 문헌(1992)에 기재된 바와 같이, 10%(v/v) 투석된 우태아 혈청 및 10μM 메토트렉세이트를 함유하는 α배지(Gibco)에서 성장시켰다. 세포 펠릿을 pH 9.0 완충액에서 전형적으로 용해시키고 상청액중의 cPLA₂를 후속하여 (NH₄)₂SO₄로 침전시켰다. 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피를 포함한 다단계를 수행하여 결정화 실험에 적합한 단백질 샘플을 수득하였다. 100g 펠릿으로부터의 전형적인 수율은 순수한 cPLA₂15 내지 25mg이었다.

cPLA₂결정을 12mg/ml 단백질을 사용하여 침전제로서 PEG 1000을 사용하여 18℃에서 증기 확산에 의해 수득하였다. 전형적으로, 밤새 판상 결정이 나타났고 1주일 내에 최대 크기 0.6mmX0.5mmX0.1mm까지 성장을 계속하였다. 천연 결정 및 중원자 침지 결정을 증가량의 PEG 400 및 DMSO에 옮겨서 저온보호하였다. 중원자개질된 결정은 천연 결정을 CaCl₂이 250μM GdCl₂또는 TbCl₂에 의해 치환된 저온용액(cryosolution)에서 밤새 침지시켜 제조하였다. 저온보호된 결정을 데이터 수집 전에 100K에서 액체 질소 스트림에서 플래시 냉각시켰다.

천연, Gd- 및 Tb-침지 cPLA₂결정의 회절 데이터를 퀀텀 4 CCD 검출기(Quantum 4 CCD Detector)(Area Detector System)을 사용하는 어드밴스드 라이트 소스(Advanced Light Source)에서 빔라인(beamline) 5.0.2에서 수집하였다. 결정의 민감성 때문에, 각 데이터의 첫 이미지는 완전한 데이터 세트에 필요한 데이터 수집의 최소량을 계산하기 위하여 STRATEGY(R. Ravelli)로 분석하였다. 최적 출발점을 결정한 후에 데이터를 90°스위프(sweep)를 통해 수집하였고, 그 후 결정을 출발점으로부터 180°위치로 회전시키고 비쥬보에 쌍(Bijvoet pair) 축적을 최대화하기 위한 시야로 제 2의 90°스위프를 수집하였다. 결정은 데이터 수집 약 100°후에 조사 민감성(radiation sensitivity)을 나타내기 시작하였고, 파장 변화 사이에 회전 축을 따라 결정을 이동(translation)시킬 필요가 있었다. 이러한 방법은 3개의 상이한 파장으로부터 수집한 데이터 세트가 유사한 통계학을 나타냈다는 점에서 성공적인 것으로 판명되었다.

중원자 부위- Tb 부위 둘 모두는 Tb L_m에지의 최고 파장에서 수집한 회절 데이터를 사용하여 변형 패터슨(Patterson) 맵의 시각적 검사에 의해 확인되었고(표 I 참조), 인-하우스 랙시스 IV 검출기(in-house Raxis IV Detector)(Molecular Structure Corp.)상에서 수집한 이전의 보다 저해상도의 Tb 및 Gd 데이터로부터의결과가 확인되었다. 중원자 파라미터 정밀화 및 위상법은 SHARP로 수행하였다[de la Fortelle & Bricogne, 1997]. 밀도 변형은 SHARP내에서 실행되는 SOLOMON(CCP4)으로 수행하였다. 양질의 실험적 3.2Å 전자 밀도 맵은 전체 CaLB 도메인의 위치결정 뿐만 아니라 촉매작용성 도메인의 초기 추적 및 서열 배정을 허용하였고(QUANTA), 이러한 절차는 추가 계산에 포함되는 단백질 영역을 둘러싸는 마스크(mask)의 계산을 용이하게 하였다. 이들은 히스토그램 매칭(Zhang and Main, 1990), 2-폴드 비결정학적 대칭 평균화, 및 DM에서 천연 회절 데이터를 사용하는 3.2 내지 2.5Å의 위상 확장(Cowtan et al., 1996)을 포함하였다. 위상 조합 및 정밀화의 사이클은 REFMAC(Murshudov et al., 1997)으로 수행하여, 유연한 리드의 중심 잔기들을 포함하여 대부분의 모델이 확인될 수 있는 맵을 작성하였다.

정밀화- XPLOR에서 위치 및 열 파라미터 정밀화 뿐만 아니라 재설정의 사이클(Bruenger, 1992b)을 사용하여 모델을 개량하였고, 모델은 Rfree가 32% 미만으로 내려간 후에 시뮬레이션된 어닐링 정밀화(12 내지 2.5Å)에 따랐다[Bruenger et al., 1992a]. 후속 모델-설정 단계는 BUSTER에서 수행된 최대 가능 정밀화를 통해 작성된 오미트 맵(omit map)의 도움으로 수행하였다[Bricogn, 1993]. 정밀화는 또한 일정한 벌크 용매 보정(Bsol=23.8Å²; ksol=0.305e^-/Å³) 및 비결정학적 대칭 제한의 적용을 포함하였다. Rfree의 계산에 사용된 10% 무작위 선정 시험 세트를 제외하고는, F>2.0에서의 모든 회절 데이터를 정밀화 내내 사용하였다. Fo-Fc 맵을 사용하여 물 분자를 위치시켰고, 물 분자는 밀도 > 3.0σ를 나타내고 공간적 충돌없이 적합한 단백질-용매 수소 결합 거리를 나타내는 부위에 배치되었다. 최종 모델은 1285개 잔기(분자 A: 9-433, 456-500, 537-727) 및 40개 물 분자를 포함하며, 평균 결합 길이 및 이론 기하학으로부터의 결합각 편차가 각각 0.010Å 및 1.38°인 양호한 입체화학을 나타낸다. 12 내지 2.5Å의 회절 데이터를 사용하여 전체적인 자유 R-값(free R-value)은 29.7%이고 R값은 24.3%이다(표 I).

(표 1)

상기 식에서, <I_h>는 대칭 등가물에 대한 평균 강도이다.

￡ 프리델 쌍(Friedel pairs)이 나뉜다.

상기 식에서, Rfree는 무작위로 선택된 10% 반사에 대해 계산되며, Rfactor는 구조 정밀화에 사용된 반사의 나머지 90%(F>2.0)에 대해 계산된다.

코오디네이트는 브룩해븐 프로테인 데이터뱅크(Brookhaven Protein Databank)에 기탁될 것이다.

실시예 2

활성 검정

(a)소포 검정

1-팔미토일-2-[¹⁴C]아라키도닐 포스파티딜콜린(58mCi/mmol)(최종 농도 6μM)및 1,2-디올레이올글리세롤(최종 농도 3μM)을 혼합하고 질소 스트림 하에서 건조하였다. 상기 지질에 50mM 헤페스(Hepes)(pH 7.5)(2x지질의 최종 농도)를 첨가하고 현탁액을 4℃에서 3분간 음파처리하였다. 현탁액에 50mM 헤페스(pH 7.5), 300mM NaCl, 2mM DTT, 2mM CaCl₂, 및 2mg/ml 소혈청 알부민(BSA)(Sigma A7511)(1.2x지질의 최종 농도)을 첨가하였다. 전형적인 검정은 지질 혼합물(85㎕)에 억제제(DMSO중 5㎕)와 BSA 완충액 10㎕중의, 자동 시스템에 대해서는 10ng 또는 수동 검정에 대해서는 1ng의 cPLA₂를 연속적으로 첨가하는 것으로 구성되었다. 이 검정은 후술되는 수동 검정 또는 자동 검정 프로토콜에 의해 수행하였다.

(b)가용성 기질 검정(LysoPC)

1-[¹⁴C]-팔미토일-2-히드록시포스파티딜콜린(57mCi/mmol)(최종 농도 4.4μM)을 질소 스트림 하에서 건조하였다. 상기 지질을 80mM 헤페스(Hepes)(pH 7.5), 1mM EDTA(1.2x지질의 최종 농도)를 볼텍싱(vortexing)함으로써 재현탁시켰다. 전형적인 검정은 지질 현탁액(85㎕)에 억제제(DMSO중 5㎕)와 80mM 헤페스(Hepes)(pH 7.5), 2mM DDT 및 1M EDTA중의 200ng의 cPLA₂를 연속적으로 첨가하는 것으로 구성되었다. 이 검정은 후술되는 수동 검정 또는 자동 검정 프로토콜에 의해 수행하였다.

(c)자동 검정

지질 현탁액 및 억제제를 37℃에서 7분간 예비인큐베이션하였다. 효소를 첨가하고 인큐베이션을 30분 더 계속하였다. 그 후 데칸:이소프로판올:트리플루오로아세트산(192:8:1 w/v, 150㎕)을 첨가하여 반응을 켄칭(quenching)시켰다. 켄치층의 일부(50㎕)를 레이닌 스페릭-5 실리카 칼럼(Rainin Spheric-5 silica column)(5μ, 30x2.1mm)을 통과시켜 헵탄:메탄올:TFA(97:3:0.1 v/v)로 용리시켰다. [¹⁴C]-아라키돈산의 수준을 인-라인 라디오매틱 플로-원/베타 카운터(in-line Radiomatic Flo-One/Beta counter)(Packard)에 의해 분석하였다.

(d)수동 검정

지질, 억제제 및 효소 혼합물을 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 반응을 헵탄:이소프로판올:0.5M 황산(105:20:1 v/v, 200㎕)을 첨가하여 켄칭시켰다. 켄치층의 반을 신틸레이션 바이알 위에 위치한 진공 매니폴드내에서 일회용 실리카겔 칼럼(Whatman SIL, 1ml)에 적용시켰다. 유리 [¹⁴C]-아라키돈산을 에틸 에테르(1ml)를 첨가하여 용리시켰다. 방사능을 액체 신틸레이션 계수기에 의해 측정하였다.

(e)PMN 검정

PMN을 제조자의 지시에 따라 피콜-하이팩(Ficoll-Hypaque)을 사용하여 분리하였다. PMN을 오염시키는 적혈구를 저장성 용해에 의해 제거하고, PMN을 1회 세척하고 2x10⁶세포/ml의 농도로 행크스(Hanks) 완충 식염액에 재현탁시켰다. 세포를 37℃에서 15분간 억제제와 함께 예비인큐베이션시킨 후 2uM A23187로 자극하였다. LTB₄생성을 cPLA₂억제의 척도로서 모니터링하는 경우, 반응을 동등 부피의 빙냉 인산염 완충 식염액으로 켄칭시켰다. 세포를 원심분리에 의해 제거하고,애머샴(Amersham)에 의해 제공된 LTB₄신틸레이션 프록시미티 검정(scintillation proximity assay)을 제조자의 지시에 따라 사용하여 세포 상청액에 존재하는 LTB₄를 측정하였다. 상기 표에서 보고된 검정에서, LTB₄가 측정되었다. 아라키돈산 생성을 모니터링하는 경우, 반응을 내부 표준물질로서 D8-아라키돈산을 함유하는 메탄올로 켄칭시켰다. 지질을 블라이 등(Bligh et al.)의 문헌[(1959) Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917]의 방법에 의해 추출하였고, 지방산을 펜타플루오로벤질 에스테르로 전환시키고 라메샤 및 테일러(Ramesha and Tayler)[(1991) Anal. Biochem. 192. 173-180]에 의해 보고된 것과 유사한 방식으로 GC-MS에 의해 분석하였다.

<참고문헌>

본원에서 인용된 모든 참고문헌은 전문이 기재된 것으로서 본원에 참고문헌으로 삽입된다.

Claims

결정성 cPLA₂.
제 1항에 있어서, cPLA₂가 인간 cPLA₂임을 특징으로 하는 결정성 cPLA₂.
제 1항에 있어서, cPLA₂가 비포유동물종을 기원으로 하는 cPLA₂임을 특징으로 하는 결정성 cPLA₂.
제 1항에 있어서, cPLA₂가 재조합 cPLA₂임을 특징으로 하는 결정성 cPLA₂.
제 1항에 있어서, cPLA₂가 천연 cPLA₂의 성숙 서열을 포함함을 특징으로 하는 결정성 cPLA₂.
제 2의 화학종과 관련된 cPLA₂를 포함하는 결정성 조성물.
제 6항에 있어서, 제 2의 화학종이 cPLA₂활성의 잠재적인 억제제 및 cPLA₂결합의 잠재적인 억제제로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
cPLA₂의 구조를 구체화하는 데이터 세트를 포함하는 cPLA₂구조의 모델.
제 8항에 있어서, 데이터 세트가 cPLA₂의 결정학적 분석에 의해 측정됨을 특징으로 하는 모델.
제 8항에 있어서, 데이터 세트가 cPLA₂의 NMR 분석에 의해 측정됨을 특징으로 하는 모델.
제 8항에 있어서, 데이터 세트가 cPLA₂의 전체적인 구조를 구체화함을 특징으로 하는 모델.
제 8항에 있어서, 데이터 세트가 cPLA₂구조의 일부를 구체화함을 특징으로 하는 모델.
제 12항에 있어서, 구조의 일부가 cPLA₂의 활성 부위임을 특징으로 하는 모델.
제 12항에 있어서, 구조의 일부가 cPLA₂의 CaLB 도메인임을 특징으로 하는 모델.
컴퓨터 하드웨어 및 제 8항의 모델을 포함하는 컴퓨터 시스템.
(a) 제 8항의 모델을 제공하는 단계, (b) 이러한 모델과 후보 화학종의 상호작용을 조사하는 단계, 및 (c) 작용제 또는 길항제로서 작용할 것으로 예측되는 화학종을 선택하는 단계를 포함하여, cPLA₂활성 또는 결합의 작용제 또는 길항제인 화학종을 확인하는 방법.
제 16항의 방법에 따라 확인된 화학종.
후보 물질과 cPLA₂구조의 모델간의 상호작용을 결정하는 단계를 포함하여 cPLA₂활성 또는 결합을 억제하는 물질을 확인하는 방법.
후보 물질과 cPLA₂구조의 모델간의 상호작용을 결정하는 단계를 포함하여 cPLA₂활성 또는 결합을 모방하는 물질을 확인하는 방법.
(a) cPLA₂의 결정 구조 코오디네이트에 근거하여 cPLA₂활성 부위의 하나 이상의 아미노산과 비공유 결합을 형성할 잠재적인 억제제를 설계하는 단계;

(b) 억제제를 합성하는 단계; 및

(c) 잠재적인 억제제가 cPLA₂활성을 억제하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 추론적인 약물 설계에 의해 cPLA₂활성의 억제제를 확인하는 방법.
제 20항에 있어서, cPLA₂결정 구조 코오디네이트가 a=153.59옹스트롬, b=95.49옹스트롬, 및 c=139.13옹스트롬을 가진 스페이스 그룹(space group) P2₁2₁2의 cPLA₂결정으로부터 얻어짐을 특징으로 하는 방법.
제 20항에 있어서, 억제제가 cPLA₂활성 부위의 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 원자와 상호작용하도록 설계되고, 하나 이상의 원자가 하기 원자로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법:

Ser228의 CB 및 Oγ원자;

Asp549 및 Asp575의 Oδ1 및 Oδ2 원자;

Arg200, Arg413, 및 Arg579의 CB, CG, CD, NE, CZ, NH1 및 NH2 원자;

Trp393의 골격 카르보닐 산소;

Asn555의 Nδ2 및 Oδ1 원자;

Phe397, Phe681, Phe683, 및 Phe199의 CD1, CE1, CG, CZ, CE2, 및 CD2 원자;

Trp232 및 Trp393의 CG, CD1, NE1, CE2, CZ2, CH2, CZ3, CE3 및 CD2;

Ser577의 CB 및 Oγ원자;

Cys331의 CB 및 Sγ원자;

Glu589의 OE1 및 OE2 원자;

Lys588의 CB, CG, CD, CE, 및 NZ 원자;

Thr680의 Oγ1 원자;

Glue418 및 Glue422의 OE1 및 OE2 원자;

Met417의 CB, CG, SD 및 CE 원자;

Leu400 및 Leu421의 CB, CG, CD1, 및 CD2 원자;

Ile424의 CB, CG1, CG2, 또는 CD1 원자;

Ala578의 골격 NH 및 카르보닐 산소 원자; 및

His639의 CB, CG, ND1, CE1, NE2, CD2 원자.
(a) cPLA₂의 결정 코오디네이트에 근거하여 cPLA₂정전기적 패치 영역(electrostatic patch region)의 하나 이상의 아미노산과 비공유 결합을 형성하는 잠재적인 억제제를 설계하는 단계;

(b) 억제제를 합성하는 단계; 및

(c) 잠재적인 억제제가 cPLA₂의 막 결합을 억제하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 추론적인 약물 설계에 의해 cPLA₂막 결합의 억제제를 확인하는 방법.
제 23항에 있어서, cPLA₂의 결정 구조 코오디네이트가 a=153.59옹스트롬, b=95.49옹스트롬, 및 c=139.13옹스트롬을 가진 스페이스 그룹 P2₁2₁2의 cPLA₂결정으로부터 얻어짐을 특징으로 하는 방법.
제 23항에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 Arg467, Arg485, Lys488, Lys544 및 Lys543으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제 20항의 방법에 의해 확인된 작용제 또는 길항제.
제 23항의 방법에 의해 확인된 작용제 또는 길항제.
제 18항의 방법에 의해 확인된 물질.
제 19항의 방법에 의해 확인된 물질.