CN1348502A - 胞质磷脂酶a2的晶体结构以及用其来鉴定激动剂和拮抗剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了结晶的cPLA2。用这种材料也解出了cPLA2的晶体结构。本发明还提供了基于这种晶体结构的模型。本发明还公开了使用这种模型来鉴定cPLA2活性和膜结合的抑制剂的方法。
Description
发明背景
在气喘、关节炎以及其它炎症疾病中，白细胞三烯和前列腺素是重要的炎症介质。在气喘病患者体内，白细胞三烯通过支气管收缩、增加粘液分泌以及炎症细胞的化学引诱导致支气管梗阻(O’Byrne，1997)；前列腺素导致了与关节炎相关的疼痛和水肿。阻塞这些脂类介质的合成或作用的药理学干涉能有效地治疗人类疾病，因此确认了它们的重要性(Simon等，1998年；O’Byrne，1997)。
胞质磷脂酶A2(cPLA2)引发了由从细胞膜释放花生四烯酸来制备白细胞三烯和前列腺素。花生四烯酸依次由环加氧酶途径代谢为前列腺素以及由5-脂氧化酶途径代谢为白细胞三烯。在花生四烯酸的释放的同时，形成了溶血小板活化因子(lyso-PAF)，然后可将其乙酰化生成PAF，而PAF也是一种涉及气喘和关节炎的病理生理学的分子(Venable等，1993)。因此，由cPLA2催化的反应引发制备了三类炎症介质：白细胞三烯、前列腺素和PAF。
cPLA2为各异的磷脂酶A2酶超家族中的一员，其具有分裂甘油磷脂的sn-2酯的共同能力。该家族最初成员的特征为在细胞外或颗粒内分泌的低分子量的酶(并且在本文中统称为sPLA2s；第I、II、III、V、VII和IX族)(Dennis，1997)。PLA2家族由克隆而扩展并且扩充了特征为依赖于钙的对花生四烯酸基有选择性的cPLA2(Clark等，1991；Kramer等，1991)、不依赖于钙的PLA2(Tang等，1997；Balboa等，1997)和血浆与细胞内的PAF-乙酰水解酶(Hattori等，1994、1995)。这些新型酶与所述低分子量酶或其互相之间没有序列同源性。此外，与使用活化水来分裂磷脂的sPLA2s不同，这些酶看来似乎使用了亲核的丝氨酸。在这方面，它们与α/β水解酶家族的其它脂肪酶之间比其与sPLA2s之间具有更多的共同点。最近克隆了两种附加的与cPLA2的催化结构域具有30％同一性的酶；把它们叫做cPLA2β(C.Song等，手稿在准备中)和cPLA2γ(Underwood等，1998)。
在美国专利号5,322,776、5,354,677、5,527,698和5,593,878中描述了克隆cPLA2。在美国专利号5,466,595、5,554,511、5,589,170和5,840,511中描述了克隆不依赖于钙的cPLA2。
各种证据都支持cPLA2在脂类介导的生物合成中起了重要作用。cPLA2是唯一对含有花生四烯酸的磷脂在sn-2位具有高选择性的酶(Clark等，1995；Hanel和Gelb，1993)。cPLA2的活化或其增加的表达与增加白细胞三烯和前列腺素的合成相关(Lin等，1992b)。活化之后，cPLA2易位至核膜，在那里cPLA2与环加氧酶和脂氧化酶共定位(co-localized)，并将花生四烯酯代谢成前列腺素和白细胞三烯(Schievella等，Glover等，1995)。虽然这些数据是令人信服的，但是在类花生酸和PAF的合成中cPLA2起重要作用的最权威的证据来自小鼠试验，其中小鼠缺乏来自同源重组的cPLA2(Uozumi等，1997；Bonventre等，1997)。腹膜的巨噬细胞是源于这些动物不能制造白细胞三烯、前列腺素或PAF。缺乏cPLA2的小鼠也为cPLA2在疾病中的作用提供了信息，因为这些小鼠在用于模拟气喘的过敏反应模型中抵抗支气管机能亢进(hyperreactivity)(Uozumi等，1997)。
cPLA2由至少两个功能独特的结构域组成：N末端的依赖于Ca2+的脂类结合(CaLB)结构域和不依赖于Ca2+的催化结构域(Nalefski等，1994)。N末端的CaLB结构域为C2家族中的一员并且已解出它的结构(Perisic等，1998；Xu等，1998)；它用其膜基体通过共定位所述催化结构域的方式介导钙的调节(Nalefski等，1994)。此外，也由所述催化结构域的磷酸化作用来调节cPLA2的活性(Lin等，1991；Leslie等，1997)。Ser505和Ser727一起保存在所有物种中并且在多细胞的类型中被磷酸化(de Carvalho等，1998)。由MAP-激酶家族的成员将Ser505磷酸化对释放花生四烯酸的细胞外刺激来说是一个共同反应。Ser505突变成Ala减少了活化作用(Lin等，1993)，但是对Ser727的类似的突变没有作用(Leslie，1998)。
几条线的证据表明cPLA2的催化机理经历了丝氨酸-酰基中间体(Trimble等，1993；Hanel和Gelb，1995)。Ser228的突变消除了cPLA2对所有包括磷脂、溶血磷脂和脂肪酰化香豆素在内的底物的活性(Pickard等，1996；Huang等，1996)。Ser228存在于五肽序列G-L-S-G-S中，其与经典的“脂肪酶基序”G-X-S-X-G相似(Schrag和Cygler，1997)，其中在更宽的称为α/β水解酶的酶家族范围内的大多数脂肪酶中都发现了此脂肪酶基序。这些酶具有由保存完好的混合β折叠片层组成的共同核心，其中所述β折叠片层的链被α螺旋所散开。在所有的α/β水解酶中，催化的丝氨酸存在于β链和α-螺旋之间的紧密转角处，并将其称为“亲核肘(nucleophilic elbow)”(见Schrag和Cygler的综述，1997)。这个转角指导短的丝氨酸支链远离蛋白质主链，降低在所述残基周围的空间位阻并要求+2和-2支链要小以避免空间碰撞；因此所述G-X-S-X-G基序占优势(Derewenda和Derewenda，1991)。
除丝氨酸外，α/β水解酶还用组氨酸和一种酸(天冬氨酸/谷氨酸)作为与存在于丝氨酸蛋白酶中类似的催化三联体中的其它成员(Schrag和Cygler，1997)。尽管在cPLA2中Asp549对活性显示出其重要性，但是19个组氨酸残基中没有一个显示相同的重要性(Pickard等，1996)。另一种不同的残基Arg200在酶促过程中起了作用，尽管还不知道其中的机理。这些观察结果表明cPLA2对酰基水解酶通过新的催化机理起作用。
如sPLA2s和α/β水解酶家族的脂肪酶都相似，cPLA2优先分裂位于界面的底物(Nalefaki等，1994)。这种已知为界面活化的现象应归功于酶的构象变化或者归功于底物的更有利的提呈(Scott等，1990)。仍然不知道在cPLA2中的1500-折叠对单体物质和分子团底物的活性不同的起因。
尽管cPLA2在炎症疾病中具有重要作用，但其三维结构还未解开，留下了许多未能解答的问题。在这里，我们报道了人类cPLA2在2.5分辨率下的X-射线晶体结构。所述结构深入了解了花生四烯酸酯的选择性和界面活化的机理，阐明Ser228、Asp549和Arg200的作用，并且揭示CaLB和催化结构域之间的相互作用。重要地是，所述结构为独特的拓扑结构，与α/β水解酶家族的不同。
发明概述
本文所有引用的cPLA2中的氨基酸都用残基号命名，所述残基号指在美国专利号5,527,698的表I中建立的cPLA2序列，同时将第一个蛋氨酸标记为残基1(Metl)。
本发明提供了结晶的cPLA2。优选所述cPLA2为人类cPLA2或为来自非哺乳动物物种的cPLA2。在某些实施方案中，所述cPLA2为重组cPLA2和/或包含天然形成的cPLA2的成熟序列。
其它实施方案提供了与第二种化学物种缔合的包含cPLA2的结晶组合物。优选所述第二种化学物种选自cPLA2活性的潜在抑制剂和cPLA2膜结合的潜在抑制剂。
而其它实施方案提供了包含能具体体现cPLA2结构的数据组的cPLA2结构模型。优选这种数据组由对cPLA2的晶体分析，可包括NMR分析来测定。在某些实施方案中，所述数据组具体体现了cPLA2的部分结构，包括(但不限于)cPLA2的活性部位或cPLA2的CaLB结构域。
可使用任何可获得的方法，根据此处公开的或对结晶cPLA2独立分析得到的晶体学或NMR数据构建这种模型。这种模型可由可得的分析数据点，使用已知的软件包来构建，其中软件包如HKL、MOSFILM、XDS、CCP4、SHARP、PHASES、HEAVY、XPLOR、TNT、NMRCOMPASS、NMRPIPE、DIANA、NMRDRAW、FELIX、VNMR、MADIGRAS、QUANTA、BUSTER、SOLVE、O、FRODO、RASMOL和CHAIN。然后，从这些数据构建的模型能用可得的系统目视观测，其中所述系统包括例如Silicon Graphics、Evans和Sutherland、SUN、Hewlett Packard、Apple Macintosh、DEC、IBM及Compaq。本发明也提供了包含本发明模型的计算机系统及用于构建、加工和/或观察本发明模型的硬件。
其它实施方案还提供了包含计算机硬件和本发明模型的计算机系统。
也提供了鉴定物种，即cPLA2的活性或结合的激动剂或拮抗剂的方法，包括：(a)提供本发明的模型，(b)研究这种模型与候选物种(candidate species)的相互作用，和(c)选择预定作为所述激动剂或拮抗剂的物种。也提供根据这种方法鉴定的物种。
其它实施方案提供：(1)鉴定能抑制cPLA2的活性或结合的物质的方法，包括确定候选物质和cPLA2的结构模型之间的相互作用，或(2)鉴定模拟cPLA2的活性或结合的物质的方法，包括确定候选物质和cPLA2的结构模型之间的相互作用。也提供根据这种方法鉴定的物质。
候选物种与所述模型之间的相互作用的研究可用可得的软件平台来实施，其中所述软件平台包括QUANTA、RASMOL、O、CHAIN、FRODO、INSIGHT、DOCK、MCSS/HOOK、CHARMM、LEAPFROG、CAVEAT(UC Berkley)、CAVEAT(MSI)、MODELLER、CATALYST和ISIS。
其它实施方案提供了由合理的药物设计鉴定cPLA2活性抑制剂的方法，包括：(a)设计潜抑制剂，该抑制剂能基于cPLA2的晶体结构的坐标在cPLA2的活性部位与一个或多个氨基酸形成非-共价键；(b)合成所述抑制剂；和(c)确定所述潜抑制剂是否抑制cPLA2的活性。优选用于这种方法的cPLA2的晶体结构的坐标得自空间群P21212的cPLA2晶体，其中a＝153.59埃，b＝95.49埃和c＝139.13埃。在其它优选实施方案中，将所述抑制剂设计成与在所述cPLA2活性部位中的一种或多种氨基酸的一个或多个原子相互作用，所述原子选自：
Ser228的CB和Oγ原子；
Asp549和Asp575的Oδ1和Oδ2原子；
Arg200、Arg413和Arg579的CB、CG、CD、NE、CZ、NH1和NH2原子；
Trp393的主链羰基氧；
Asn555的Nδ2和Oδ1原子；
Phe397、Phe681、Phe683和Phe199的CD1、CE1、CG、CZ、CE2和CD2原子；
Trp232和Trp393的CG、CD1、NE1、CE2、CZ2、CH2、CZ3、CE3和CD2；
Ser577的CB和Oγ原子；
Cys331的CB和Sγ原子；
Glu589的OE1和OE2原子；
Lys588的CB、CG、CD、CE和NZ原子；
Thr680的Oγ1原子；
Glu418和Glu422的OE1和OE2原子；
Met417的CB、CG、SD和CE原子；
Leu400和Leu421的CB、CG、CD1和CD2原子；
Ile424的CB、CG1、CG2或CD1原子；
Ala578的主链NH和羰基氧原子；和His639的CB、CG、ND1、CE1、NE2和CD2原子。也提供了由这种方法鉴定的激动剂和拮抗剂。
也提供了通过合理的药物设计鉴定cPLA2膜结合的抑制剂的方法，包括：(a)设计潜抑制剂，该抑制剂能基于cPLA2的晶体结构的坐标在cPLA2的静电斑区中与一个或多个氨基酸形成非-共价键；(b)合成所述抑制剂；和(c)确定所述潜抑制剂是否抑制cPLA2的膜结合。优选用于这种方法的cPLA2的晶体结构的坐标得自空间群P21212的cPLA2晶体，其中a＝153.59埃，b＝95.49埃和c＝139.13埃。在其它优选实施方案中，将所述抑制剂设计成与一种或多种氨基酸相互作用，所述氨基酸选自Arg467、Arg485、Lys488、Lys544和Lys543。也提供了采用这种方法鉴定的激动剂和拮抗剂。
附图简述
图1.用从每749个cPLA2残基单一个铽原子的散射获得的MAD相生成的实验示意图。为生成示意图使用了溶剂平化(solventflattening)(溶剂含量为60％)和在DM中双重非-晶体学对称平均(2-foldnon-crystallographic symmetry averging)。
图2(A).cPLA2单体的带状图。所述CaLB结构域以绿色显示，同时将两个钙原子画成红色。将cPLA2的“帽”结构染成紫色。低电子密度的活动环以点来表示。将CaLB和所述催化结构域之间的弹性连接体染成红色。也显示了4个在cPLA2中被磷酸化的丝氨酸残基的位置。图用Molscript(Kraulis，1991)和RASTER3D(Bacon和Anderson，1988)制作。(B)cPLA2的GRASP表面图。将在由Xu等(1998)做的NMR实验中与十二烷基胆碱磷酸分子团相互作用而发生N15/NH移动的残基涂成紫色。用红色突出所述cPLA2的活性裂缝。为了表示清楚，除去了盖残基。(C)cPLA2的表面能图象，将碱性残基涂上蓝色阴影并且将酸性残基涂上红色。为了表示清楚，除去了盖残基。在所述分子的膜-结合区上可清楚见到碱性非常强的斑。图用GRASP(Nicholls，1992)制作。所有的观察都在相同的方向。
图3(A)规则的α/β水解酶折叠的Richardson图象。用箭头代表β链，同时用矩形代表α螺旋。二级结构元素根据Schrag和Cygler(1997)的综述编号。将紧跟“亲核肘”之后的C螺旋染成粉红色。
(B)cPLA2折叠的Richardson图。与在规则的α/β水解酶折叠中一样，设计编号方案使得紧跟在Ser288之后的螺旋是C螺旋。为了更易与(A)中的规则的α/β水解酶折叠对比，因此将中心核染成黄色。将组成所述“帽”的元素涂成紫色；红色的环状区很易移动并且不存在可追踪的电子密度。
图4.cPLA2α、β和γ的一级结构的排列。将同样的残基装入盒内，同时将在cPLA2的X-射线晶体结构中观测到的二级结构元素在所述序列的下面表明。用黄色显示位于所述帽区结构域之外的二级结构元素，同时用紫色显示在所述帽区内的二级结构元素。黑线代表转角或环状区。带有黑线的未鉴定的残基或二级结构元素不显示出可追踪的电子密度。
图5(A).显示由盖残基覆盖的cPLA2催化结构域的表面图。在漏斗状物体的底部显示的是Ser228。由红色点代表在实验图上不可见的连续序列并且提出其参与形成了盖铰合部。在电子密度图中只能看见主链原子的残基代表丙氨酸。将所有疏水残基的暴露表面染成蓝色，并且将Arg200的所有疏水残基的暴露表面染成红色。用GRASP(Nicholls，1992)制备该图。
(B)在Ser228周围7的半径范围内的cPLA2的活性部位的特写。将直接参与催化的两个残基染成绿色。用黄色显示Arg200和所述环停靠的甘氨酸残基197与198。在所述实验图中可见的单个水分子与Asp549和来自Trp393和Thr330的羰基原子之间以氢键结合。用Molscript和RASTER3D制成该图。
图6.提出cPLA2的催化机理：包括Ser228进攻在甘油磷脂底物的sn-2位。AA：花生四烯酸；HG：首基；C18：十八烷基。假定Gly197和198为含氧阴离子洞(oxyanion hole)的一部分，而Arg200稳定所述首基的磷酸根部分。
发明及优选实施方案的详细描述运用每749个残基一个重原子散射体解出cPLA2的结构
在CHO细胞中表达全长的人类cPLA2，并通过经过修改的在Clark等，1990(Stahl等，手稿在准备中)中描述的方法进行纯化。在18℃用PEG1000做沉淀剂并使用标准蒸汽扩散技术获得晶体。单晶在几天内可生长至最高可达0.6mm×0.5mm×0.1mm的尺寸，但是其对X-射线损伤非常敏感。将晶体的四周浸泡在增加PEG400和DMSO含量的冷冻保护剂溶液中，随后将其快速冷却并暴露在同步辐射下，以上操作为使衍射达到最小2.5的布拉格间距的关键。晶体为空间群P21212(a＝153.59，b＝95.49，c＝139.13)，每个不对称单位具有两个单体(1498个残基)和60％的溶剂。
制备渗入重原子的cPLA2晶体的尝试显示仅有钆或铽能提供同晶衍生物。但是，任一镧系元素替代了CaLB中一个Ca2+原子就由此提供了每749个氨基酸残基一个重原子散射体。这些晶体本身的相位信息的质量不够高，因此不能制备原始的电子密度图。这个观测结果，加上大部分重原子的结合在其本身和被渗入的晶体间产生非-类质同晶的事实，将导致由多波长反常色散(MAD)相(Hendrickson，1991)解出cPLA2的结构。
制备渗入铽的cPLA2晶体，然后经低温处理(cryotreated)(见方法)，并且在100°K的氮气流中冷却。收集单晶围绕TbLm边缘(见表1)在三个不同的波长的数据，出于辐射灵敏度的原因，在数据集合之间所述单晶沿着其旋转轴转变。用SHARP(de La Fortelle和Bricogne，1997)计算实验相至3.2；随后，几个溶剂平化的循环和在DM的双重平均(Cowtan等，1996)允许我们将相扩展至2.5。这个方法生成了高质量的电子密度图(图1)，其中能清楚地鉴定每个cPLA2单体的两个结构域。最初，用QUANTA程序(Molecular Simulation Inc.)将CaLB(Perisic等，1998；1RLW)转化成密度(was rotated into density)并且将聚氨丙酸轨迹建立为催化结构域的可见区，生成了每个单体具有大约550个残基的模型。用最终相合并步骤(REFMAC；Murshudov等，1997)改良这个最初结构的受限相，接着由人工模型建造法(QUANTA)生成模型，随后在XPLOR(Brünger等，1992b)中修改。本发明模型包含1285个残基(在两单体之间)和40个水分子(表1)。分子结构
cPLA2单体为大约100×55×45大小的两个结构域的椭圆体结构(图.2a)。N末端的CaLB结构域(残基16-138)为独特的折叠的β夹心，其由残基139-143连接至催化结构域，这样它形成了非常少的蛋白质-蛋白质接触。所述催化结构域的中心核由具有散布的螺旋的10-链中心β折叠片层组成，其中所述β折叠片层与规则的α/β水解酶折叠不同。由于所述结构域间环具有弹性，因此不对称单元中存在的cPLA2单体不为完美可重叠的。实际上，当CaLB结构域为重叠时，在两个催化结构域之间有4-5°的差别。连接所述结构域的环在每个单体中有独特的构象并且其残基表现为高温因子。
cPLA2为当自由Ca2+的水平升高至亚微摩尔水平时易位至所述膜的胞质蛋白(Clark等，1990，1991)。cPLA2的结构域排列显示了所述活性部位是如何由所述细胞膜导向的。图2b为一表面图，它突出了由Xu和其合作者对CaLB实施的HSQC研究(1998)的结果。将在这些实验中，在与十二烷基磷酸胆碱分子团培育时显示发生N15/NH移动的残基用紫色突出。很明显，突出的残基出现在所述分子的作为活性部位的同一表面上。因此，如果CaLB用这些残基来缔合磷脂膜，那么所述催化结构域大概会处于使磷脂底物在所述活性部位结合的位置上。在两个结构域之间的连接体的弹性以及它们之间缺乏主要蛋白质-蛋白质的相互作用表明为了与所述膜达到最佳的相互作用能完成结构域之间的小旋转。
如图2c的表面能图所示，存在从所述活性部位伸展通过CaLB的β3链上一条带正电荷的残基的高碱性结构域。可期望所述碱区具有以下特征：其为在所述蛋白质上的一个区域，使得与所述膜层(见下文)带负电荷的磷脂首基产生多静电接触。但是，残基434至456为无序的，使得不可能准确定义所述碱性斑的真实大小。然而，值得注意的是在PI4激酶中和在不同种类的sPLA2s中见到了相似的碱性斑(Rao等，1998)。可设想cPLA2与由磷脂酰甲醇脂质体构成的膜(Hixon和Gelb，1998)的非常紧密的结合是通过这个斑和附近的CaLB结构域中的β链3的一段碱性序列来介导。N末端的CaLB结构域
在全长的cPLA2中的CaLB结构域的结构与那些由NMR和X-射线晶体学(Xu等，1998；Perisic等，1998)解出的非常相似，只有很小的区别。简单地说，它由八个由六个环互相连接的反平行β链组成，并折叠成符合C2结构域的“II型”拓扑结构的β-夹心(Nalefski等，1994b)。将两个Ca2+原子通过一群天冬氨酸和天冬酰胺支链，以及主链羰基原子结合至CaLB的一端的三个独立环上(钙-结合环；CBLs)；在由Perisic和合作者(1998)解出的CaLB结构域中观察到相同的原子排列。所述Ca2+原子的间隔大约为4。但是，在全长的cPLA2中的Ca2+原子的环境并没有显示出在由这些作者解出的CaLB结构中存在有任何水分子；相反，与钙位点1(由Perisic等定义，1998)配位的是来自用于结晶和低温保护中的缓冲剂的MES(2-[N-吗啉基]乙磺酸)的分子。在两个cPLA2单体中，Ca2+1和最靠近的MES磺酸盐氧原子之间的距离为大约2.2。此外，吗啉基团也与His62和Tyr96的支链接触，因此形成了小的疏水生态位。虽然是人工结晶作用，但是cPLA2的Ca2+1对MES的硫酸盐的配位作用能效法磷脂分子的磷酸根的结合模式，因此显示了在cPLA2中，Ca2+充当了所述蛋白质与所述磷酸化膜之间的桥梁，而非仅作为变构激活体。cPLA2折叠的新拓扑结构对其与α/β水解酶的区别
cPLA2的催化结构域由14条β链和13段α螺旋组成；其中心核由10条绞合的中心混合的β折叠片层组成，其中所述中心核被9段α螺旋包围，而β5至β11链形成了所述折叠片层最明显的部分(指的是图3b中的Richardson图)。所述β折叠片层具有超螺旋结构。为了简化，基于由Schrag和Cylger(1997)提出的α/β水解酶折叠命名法来区别cPLA2的二级元素，其中催化性丝氨酸总是在β5之后并在C螺旋之前。
所述cPLA2核中的第一条β链是β1，其跟在CaLB后面的弹性连接之后。在所述折叠的中心部分，包含一段长螺旋的长环完成了到β4的连接。这个β1/α螺旋结构与在Humicola lanuginosa脂肪酶中观察到的类似，其中所述螺旋区也不能认做所述折叠的一部分，但将其β10连接到所述核中的第一β链上(PDB中的入口1TIB)。随后跟着的平行β链，β5位于所述催化性丝氨酸(228)之前。β5、C螺旋(在图3a和3b中涂成粉红色)以及连接前两者的环的拓扑结构与α/β水解酶类似。将这个连接环命名位“亲核肘”。另外三个由环混杂的α螺旋提供了这个区和所述折叠的这个部分的另外4条β链之间的连接。在跟随(β6-β9)的四条β链中，β6最长，并与β7之间有极少量的氢键。因此，尽管β7至β1链的次序不连续，也能在更大的结构内看成是一个小β折叠片层。
在β9之后，存在一个关于中心α/β核的结构的重要分歧。在这一点的cPLA2序列形成了在图2a和3b中以紫色显示的区。这180个残基斑形成了催化结构域“帽”。Asp549，Ser228的催化配偶体位于所述帽的尾部与β10之间的区域中，其中该区为所述中心核的一部分。在所述帽结构之后，占据了最后3条β链以完成所述中心β折叠片层并且螺旋G到J散布在其中。
所述α/β水解酶折叠为许多酯酶和其它水解酶所共有(Schrag和Cygler，1997)。它的Richardson图(图3a)由中心β折叠片层组成，所述中心β折叠片层的β链次序接着线性序列(β3除外，它通常位于在β4和β5之间)。乍看之下，cPLA2的拓扑结构显示为所述α/β水解酶折叠的环状排列。但是，仔细对照图3a和3b，清楚地表明只有环绕所述亲核肘的区域才实际上直接可比(β5至C螺旋；残基222-238)。主要的区别包括链β6至β9的反平行性质，β5和β6之间的螺旋的多样性以及所述cpla2的α/β核的较后部分的链之间的缺少插入的螺旋。
虽然在cPLA2中(残基370-548)的帽结构为催化结构域的一部分，但是它不包括在α/β核中。人类cPLA2的α、β和γ(图4)的催化结构域的序列对比显示了同源性集中在所述α/β核(黄色元素)与β链9a和9d中。因此，所述帽的中心部分不同于cPLA2的同种型。在图2a中cPLA2的带状图和图2c中表面能图之间的对比显示上文假设的与膜磷脂静电接触的高碱性区事实上大部分由帽残基形成，其中在图2a中用紫色显示所述帽区。
cPLA2的帽区也包括整个结构的三个活动性最大的区中的两个，残基433-456和500-536(第三区为C末端，残基728-749)。这些氨基酸段没有可追踪的电子密度并且不包括在所述模型中(图2a中的点状线)。有趣的是，当受到激动剂的刺激时，正是这些帽的高弹性区被磷酸化，其中该区停靠了四个丝氨酸残基中的三个(437、454、505)。Ser437和Ser454的作用还不清楚，因为在不同物种中没有保存它们。相反，在来自不同进化物种(小鸡、人类、斑马鱼、小鼠、大鼠)的cPLA2中保存了Ser505，并且在昆虫细胞中为了cPLA2的最大活化作用需要由MAP激酶将其磷酸化(Lin等，1993；Qiu等，1998)。Ser505不与蛋白体或者不与晶格中其它相邻的cPLA2单体接触，其中Ser505在我们的晶体中很可能是异形磷酸化的并位于高弹性的、被溶剂暴露的环中。Ser505对所述活性部位和膜结合区来说都是在末端的(见图2a)；然而，值得注意的是它接近CaLB和所述催化结构域之间的铰合部(见讨论)。cPLA2磷酸化作用的第四个位点，Ser727，是在结构的C末端。虽然在各种物种中保存了这个位点，但是仍然不知道相关的功能。活性部位漏斗部分由溶剂可浸入的盖覆盖
所述cPLA2结构最显著的特征为活性部位漏斗，其中该漏斗深入了三分之一进入所述催化结构域中，从而揭示了Ser228和Asp549位于一个深的、窄裂隙的底部中。虽然顶部宽，但是在图5a中可见在所述活性部位裂隙的嘴的位置，所述漏斗缩减直径至接近7。所述漏斗排满了亲水残基(在图5a为蓝色)并且形成支架，其中膜磷脂底物的脂肪酰基部分可以结合到支架中。
所述cPLA2的活性部位由“盖”部分覆盖，其中“盖”由残基413-457组成。所述盖折叠到环区中，其后跟随小螺旋序列和短转角(见图5a)。引导进入所述盖区的残基408-412表现为非常大的温度因子，并且残基434-456没有可追踪的电子密度。这些观察表明这些区是非常易移动的并且可将其设想为“盖铰合部”。所述盖的可见区具有两亲性质；其暴露于溶剂的面主要由极性残基(T416、E418、E419、E420、N423)形成，而其内侧排满了疏水性氨基酸(M417、L421、I424)。可以想象所述盖的“双面”特征在膜磷脂结合上发挥了一定作用，因为一面具有形成氢-结合接触的能力，而另一面更易于或者与所述底物或者与所述膜发生疏水相互作用。
模拟在具有在适当位置的盖的cPLA2的活性裂隙中的二酰基磷脂分子的尝试证明酰基酯键不能位于没有与周围残基产生冲突的活性部位丝氨酸的附近。因此，可以想象为了底物结合需要盖移动以生产适当的空间，与观察结果相符合的提议是cPLA2在分子束而非单体底物的存在下显示出更高的活性(Cygler和Schrag，1997)，该现象称为界面活化。
大多数脂肪酶显示界面活化为覆盖“关闭”形式的酶的活性部位的盖的构象重排的结果。所述盖在分子团的结合部位之上离开，因此形成“敞开”形式，其中催化性残基暴露于所述底物。X-射线晶体学通过确定“关闭”和“敞开”两种形式的脂肪酶的结构得出了许多这种活化机理的例子，其中在有抑制剂的情况下大部分已结晶时为“敞开”形式(Cygler和Schrag等，1997)。cPLA2的界面活化机理可与其它包含盖的脂肪酶的界面活化机理相比，这样盖移动是增加活性部位漏斗的可接近的表面积以及提供顺畅进入所述催化性残基的重要步骤。cPLA2活性部位包括催化二联体
α/β水解酶酰基水解是由使人联想到在丝氨酸蛋白酶中存在的(Ser-Asp/Glu-His)催化三联体实施的。由亲核丝氨酸攻击所述底物的酰基酯键，产生通过共价键结合的酰基-酶中间体，随后该中间体被释放出，接着参与水分子的攻击步骤。虽然所有具有所述α/β水解酶折叠的脂类代谢酶通过催化三联体的作用起作用，但是鉴定这种在cPLA2中的三联体证明是一项挑战性的工作。由Sharp和合作者(1994)发现的位点定向突变证实了Ser228和Asp549在催化中的作用；但是，19个组氨酸残基中的任一个都不影响活性，这一点指出了新的催化机理(Pickard等，1996)。这些观察导致许多人提出cPLA2包含新的催化中心，该中心不需要组氨酸参与，而仍然不知道Arg200对活性的作用(Leslie，1997；Pickard等，1996)。
cPLA2的X-射线晶体结构清楚地显示了活性部位，其中Ser228位于漏斗形空穴的底部；Asp549的Oδ2位于距离其Oγ原子2.9的位置上(图5b)。但是，必须清楚的是cPLA2的活性部位没有组氨酸残基。另外，在6的范围内没有其它能实现活性部位基的功能的残基。离任一残基3.5的范围内的所有极性均由主链基团或由距离Asp549的Oδ1原子3.2的单独水分子作出贡献。虽然Asn555沿所述活性部位漏斗排成一行，但是它的Nδ2原子距离任一残基大约6并且不是理想地完成这个功能的候选物。
在酰基水解酶中，当攻击甘油磷脂底物的sn-2位时，过渡态要求由具有稳定形成的过渡态的负电荷的功能的“氧阴离子洞”或一组氢键给体(通常为酰胺原子)和/或碱性残基来稳定。在一些脂肪酶中，至少一个构成所述氧阴离子洞的残基为移动环的一部分，并且仅当脂肪酶为“敞开”形式时能得到合适的构象；但是，这种重排不是绝对必要的。在cPLA2中，Gly197和198为β4和B螺旋之间的有富含甘氨酸的弹性环的一部分；这个位置允许Gly197和Gly198的酰胺主链成为预先形成的氧阴离子洞成员的理想候选物(见图5b)。另外，位于β5和C螺旋之间的转角尖端的Gly229的主链酰胺基团也指向Gly197环，所以也可成为所述洞的一部分。因此，这个与胰凝乳蛋白酶中的氧阴离子洞非常相似的区看来是经过良好设计，从而能稳定由所述酯的亲核进攻产生的四面体中间体。
已提出Asp200的许多作用。它涉及为CaLB提供结合所述酶到脂类界面的帮助；与所述磷脂膜相互作用；作为催化性残基参与反应；稳定酰基-酶中间体；或与所述底物磷脂的磷酰基有关(Pickard等，1996)。埋入所述漏斗中的Arg200(在图5a中将它的表面区域染成红色)的位置阻止它为CaLB提供任何脂类结合的帮助。另外，其支链距离活性部位丝氨酸大约9，这样可令它不能在催化中起作用。但是，Arg200与活性部位漏斗周围的残基形成了一些重要的接触。所述侧链与Thr680形成了盐桥并且与Phe678的主链原子产生接触，两者都位于螺旋H和I之间的环上。氧阴离子洞上的Arg200的位置表明由Pickard和合作者(1996)报道的Arg200Lys突变体中缺少这些二氢键可能是微细改变氧阴离子洞环的构象将导致活性的不寻常结果的原因。由cPLA2实施的通过不同于其它酰基水解酶的机理进行的催化
在cPLA2的活性部位缺乏组氨酸残基或任何其它可能的碱基表明所述酶通过新的催化机理促使酰基水解。在丝氨酸蛋白酶和其它的水解酶中，组氨酸残基接受了来自活性丝氨酸的羟基的质子，因此有助于形成共价四面体中间体。在第二步中，所述酰基-酶中间体由水分子水解释放出产品，在所述酶中重建丝氨酸-羟基。A类TEM-1β内酰胺酶的催化途径也包括活性部位丝氨酸的酰化作用，接着是酯键的水解作用，其从活性部位Ser70直接地(Gibson等，1990)或通过水分子(Lamotte-Brasseur等，1991)转移了一个质子到Glu166的羧酸根基上。更多最近的研究(Damblon等，1996)表明在Glu166和Ser70的羧酸根氧之间的长距离阻止了质子的直接转移，但是这些研究提出了桥接水分子参与转运了质子。在青霉素酰基转移酶的催化机理中(Duggleby等，1995)，一个桥接水介导了Serl的α-氨基的碱性，其中青霉素酰基转移酶包含由N末端的丝氨酸组成的单独的残基催化中心。结果，Serl的Oγ原子具有其足以由末端氨基增强的亲核性，并确保形成酰基-酶中间体。
在cPLA2中，唯一能充当通用碱基(general base)的残基为Asp549，因为Ser228的Oγ原子的3.5半径范围内没有其它的支链。图6显示了所提出的cPLA2的催化机理的模型。一旦将所述酶结合到所述膜上，就有一个磷脂分子结合在所述活性部位上。所述首基的磷酸盐部分(图6中的HG)由所述Arg200支链稳定。也显示了由Gly197和Gly198的主链酰胺基形成的氧阴离子洞，其中所述氧阴离子洞能极化sn-2酯并稳定在板B中形成的四面体中间体。在形成所述酶-底物的配合物之后，Asp549充当催化碱基并吸收了来自活性Ser228的羟基质子，其中所述质子攻击所述sn-2酯并通过稳定的四面体中间体形成酰基酶。接着，所述酰基酶由水分子(板C)水解，生成游离的溶血-磷脂，并且当花生四烯酸基中间体的双键坍塌之后，生成游离的花生四烯酸(图6中的AA；板D和E)。然后可使cPLA2与所述膜界面分离或与另一个磷脂物质结合并且重复该循环。因此，cPLA2为使用没有完整催化三联体的亲核丝氨酸的第三个独特的例子。讨论
尽管cPLA2晶体具有大的不对称单元(1498个氨基酸)和脆性，用MAD相成功地由得自单晶的数据制作了高质量电子密度图。这个成功主要(central to this success)为大Bijvoet和分散了各种不同类型的镧系原子的Lm边界，并结合高级光源的高通量和波长稳定性(Berkeley，CA)。随着第三代同步加速器的到来，常规上将采用MAD来解出大分子结构。
正如使用缺乏cPLA2的小鼠证明的那样，cPLA2对炎症脂类介质的生物合成很重要(Bonventre等，1997；Uozumi等，1997)。因为白细胞三烯、前列腺素和PAF在主要的公共压力(major public impact)疾病的病理生理学中起了重要作用，所以必须了解它们的生物合成如何控制。cPLA2的结构提供了对花生四烯酸基的选择性和由磷酸化控制的原由新的理解。此外，它鉴定了脂肪酶的新折叠和新机理。cPLA2的结构是仅有的第二个在整个蛋白的范围内可见到C2结构域的结构。可见到在PLCδ1和cPLA2之间的显著区别。
所述cPLA2折叠清楚地显示所述酶由两个独特的、独立的折叠结构域组成。基于前期工作可期望得到这个结果，在前期工作中，当独立表达CaLB和催化结构域时，两者都具备完整的功能。但是，令人惊奇的是所述结构域间的接触及潜在的弹性很少。虽然通常在信号分子中观察到C2结构域，但是只有PLCδ1的晶体结构的数据报道在所述催化结构域的范围内存在C2结构域(Essen等，1996)。在这种情况下，几乎在所述C2结构域和催化结构域的一面的整个表面之间存在大量的疏水接触。相反，在cPLA2的催化结构域和CaLB结构域之间的相互作用受到充分地限制，因此连接了不对称单元的不同单体中的两个的多肽的构象是独特的。这个观察结果具有机械学的重要性，因为没有固定所述CaLB和催化结构域的最佳取向，但是反而可在某些方式中受到控制。有趣的是可注意到，虽然包括对蛋白在细胞中的最佳活性很重要的Ser-505的蛋白的区是无序的，但是这个重要的MAP-激酶部位位于所述铰合部区的附近。
详细对比cPLA2和规则的α/β水解酶折叠的结构，结果清楚地表明cPLA2包含新的拓扑结构。但是，如前文提到的一样，包含活性部位丝氨酸的β发夹结构与所述α/β水解酶折叠的“亲核肘”在结构上相似。cPLA2催化结构域的Blast检查显示PLBs与cPLA2α、β和γ间有相同的延长区，其中该延长区包括残基～190-232。这种同源性具有重要的功能，因为它包括Arg200、包含氧阴离子洞的主链区以及新的GXSXS脂肪酶的基序，在所述基序中，第二个丝氨酸代替了传统的甘氨酸。也由基因组的结构来解释同源性“集中”在短区中，其中这些残基由单独的编码序列(对应残基186-238)编码。
cPLA2用由Ser-228和Asp-549组成的二分体来分裂sn-2酯，而不是在所述α/β水解酶中见到的包括丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸/谷氨酸的催化三分体来分裂。Asp-549的羧酸根是唯一的为了亲核进攻而足够靠近以活化丝氨酸的残基。对于由A类β-内酰胺酶催化酰胺的水解反应已提出相似的催化二分体(Matagne等，1998)。但是，在这种情况下，谷氨酸支链通过混杂水分子活化了丝氨酸残基。虽然很难评价二分体与三分体的可比的效率，但是值得注意的是，达到过渡态所需的活化能在催化中很重要。因此，有效的氧阴离子洞获得的稳定能抵消较不亲核的丝氨酸。在这个晶体结构中，适当地安放了甘氨酸197和198的主链酰胺基，使其充当所述氧阴离子洞，其中所述主链酰胺基放置了起码两个来自关键性的Arg-200的残基。Gly-229的主链NH也可帮助稳定建立过渡态的氧阴离子并存在于所述四面体中间体中。所述氧阴离子洞的效率与NMR研究是一致的，在该研究中花生四烯酸基三氟甲基酮似乎结合到所述酶上作为离子化的半缩酮。
cPLA2的催化丝氨酸存在于靠近所述催化结构域的中心的深的漏斗中。模拟所述磷脂进入活性部位的尝试证明目前所述活性部位漏斗的构象不足够大。因此，我们提议某些将其C-末端连到完全无序的23个氨基酸序列上的可移动的盖可在膜结合部位上面移动，因此在所述漏斗顶部的附近提供了较大的可到达的体积以容纳所述底物。同时存在和缺少底物/洗涤剂分子团的胰脂肪酶/共脂肪酶的晶体结构提供了这个模型的先例(van Tilbeurgh等，1993)。在这个例子中，存在分子团或抑制剂时发生了显著的构象变化，该变化需要盖移动大至29的距离以暴露所述活性裂隙和疏水斑。在其它α/β水解蛋白中已经注意到这种大的结构变化。用这种在膜表面结合部位上的构象变化来解释界面活化的过程，其中脂肪酶的催化活性对存在于分子团中的底物来说比对以单体存在的底物的活性大几个数量级。
在cPLA2的例子中，用其溶血磷脂酶对比其对以单体或分子团的部分存在的相同底物的活性。这种测量显示cPLA2的活性增加了大约1500倍，而1-棕榈酰-2-溶血磷脂酰胆碱的浓度仅增加了10倍；因此，cPLA2对以表面存在的底物活泼得多。我们的结构显示由弹性盖的移动支配的构象变化发生在膜结合部位上方；这个观察结果与先前界面活化的观察结果一致。
除了移动覆盖所述活性部位的盖之外，一些结构显示稳定过渡态的氧阴离子洞仅当存在结合底物或抑制剂时才能完全形成(Cygler和Schrag，1997)。角质素酶(cutinase)对这个通用规则是例外，因为所述氧阴离子洞在天然结构中完全形成。重要地是，角质素酶不显示界面活化(Martinez等，1992)。
对包含花生四烯酸基的磷脂来说，cPLA2的选择性是一个不同的特征。低分子量sPLA2s不能从不同的脂肪酸区别开来，但是在许多试验版本中，cPLA2对花生四烯酸基和其它在5和8位具有顺-双键的脂肪酸显示出高的选择性(Clark等，1995；Gelb aasn-1和sn-2，Gelb肼)。在确定结构之前，不知道cPLA2选择性的起因。可以想象所述催化机器位于酶的表面，在那里它能对sn-2酯起作用，同时没有将所述脂类从双层中提取出。这与PI4激酶的压扁的激酶结构域类似，对于PI4激酶认为所述酶对脂类的首基起作用，同时不提取出磷脂本身(Rao等，1998)。在cPLA2的例子中，我们期望所述选择性归因于由于更松地包装了聚不饱和脂肪酸而导致更多地暴露了sn-2酯。但是，正如我们在所述结构中见到的那样，所述磷脂必须结合进入到所述深活性部位大约8-10。因此，所述选择性必须归因于花生四烯酸基部分和酶之间的相互作用。可为与α和γcPLA2不同的残基(也就是位于活性部位和完全未保护的盖区中)的突变提供信息以测定选择性的不同。依照本发明鉴定的物质的优选给药方法和剂量
如在本文中的使用，“磷脂酶的酶活性”指在磷脂代谢试验(优选在下文实施例2中描述的或在任何结合到本文中的参考文献中描述的一种试验)中的正活性。当化合物在任何可得的酶活性试验(优选在下文实施例70中描述的试验)中抑制磷脂酶(优选cPLA2)的活性时，它具有“磷脂酶的酶抑制活性”。在优选的实施方案中，化合物具有以下三个值：(1)在LysoPC试验中IC50值小于大约25μM；(2)在vesicle试验中IC50值小于大约50μM；和/或(3)在PMN试验中IC50值小于大约1μM。
本发明的化合物和熊果酸能有效抑制磷脂酶(优选cPLA2)的活性，因此，用于“治疗”(也就是治疗、预防或改善)炎症或与炎症有关的疾病(例如风湿性关节炎、牛皮癣、气喘、炎性肠疾病和其它由前列腺素、白细胞三烯或PAF作为介导的疾病)以及其它疾病，例如骨质疏松、结肠炎、骨髓性白血病、糖尿病、萎缩病和动脉粥样硬化。
本发明既包括药物组合物又包括使用本发明化合物治疗或使用的治疗方法。
当与药学可接受的载体结合时，本发明的化合物可用于药物组合物中。这种组合物也可包括(除了化合物或本发明的化合物和载体之外)稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和其它本领域已知的物质。术语“药学可接受的”指不妨碍活性成分的生物活性的有效性的无毒物质。载体的性质依赖于给药方式。本发明的药物组合物也可包括细胞因子、淋巴因子或其它造血因子例如M-CSF、GM-CSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、G-CSF、Meg-CSF、干细胞生长因子和红细胞生成素。所述药物组合物还可包括其它抗炎试剂。这些加入的因子和/或试剂可包括在所述药物组合物中，从而与本发明的化合物一起产生协同作用，或尽可能减少由本发明的化合物引起的副作用。相反地，本发明的化合物可包括在具体的细胞因子、淋巴因子、其它造血因子、溶栓剂或抗凝血因子或抗炎试剂的药物制剂中以尽可能减少由细胞因子、淋巴因子、其它造血因子、溶栓剂或抗凝血因子或抗炎试剂引起的副作用。
本发明的药物组合物可为脂质体形式，其中，将本发明的化合物与除其它药学可接受的载体之外的两亲试剂例如以聚集体形式存在的脂类合并，而聚集体形式如分子团、不溶的单分子层、液晶或水溶液中的片层。适用于脂质体制剂的脂类包括但不限于甘油单酯、甘油二酯、硫苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸等。这些脂质体制剂的制备方法是在本领域的技术人员熟知的水平范围内，例如在美国专利号4,235,871；美国专利号4,501,728；美国专利号4,837,028和美国专利号4,737,323中的公开，将它们全部通过引用结合到本文中。
如在本文中的使用，术语“治疗有效量”指所述药物组合物或方法中每种活性组分的总量，该量足以表现出有意义的病人利益，也就是治疗、康复、预防或改善炎症反应或疾病，或提高治疗、康复、预防或改善这些疾病的速度。当应用于单独给药的独立的活性成分时，所述术语只是单指那个组分。当应用于组合物时，不管以组合物形式连续或同时给药，所述术语指的是产生治疗效果的活性组分的组合的总量。
在实施本发明的治疗方法或使用方法时，将治疗有效量的本发明的化合物给药于待治疗的带病的哺乳动物。可依照本发明，将本发明的化合物单独给药或者结合其它疗法给药，其它疗法如使用其它抗炎试剂、细胞因子、淋巴因子或其它造血因子。当与一种或多种其它的抗炎试剂、细胞因子、淋巴因子或其它造血因子共同给药时，本发明的化合物可同时与其它的抗炎试剂、细胞因子、淋巴因子、其它造血因子、溶栓剂或抗凝血因子一起给药，或者依次给药。如果依次给药，主治医生将决定本发明的化合物与其它的抗炎试剂、细胞因子、淋巴因子、其它造血因子、溶栓剂或抗凝血因子组合的适合给药次序。
可使用各种通用的方法来服用用于所述药物组合物的本发明的化合物或者来实践本发明的方法，其中通用的方法的例子为口服、摄食、吸入或皮肤、皮下或静脉注射。
当将治疗有效量的本发明的化合物口服给药时，本发明的化合物可为片剂、胶囊剂、粉末剂、溶液剂或酏剂的形式。当以片剂形式给药时，本发明的药物组合物还可包含固体载体例如明胶或佐剂。所述片剂、胶囊剂和粉末剂包含大约5到95％的本发明化合物，优选大约25到90％的本发明化合物。当以液体形式给药时，可加入液体载体例如水、石油、源于动物或植物的油如花生油、矿物油、大豆油、或芝麻油或合成油。液体形式的药物组合物还可包含生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖类溶液，或二元醇类物质如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。当以液体形式给药时，所述药物组合物包括大约0.5到90％重量的本发明化合物，优选大约1到50％的本发明化合物。
当治疗有效量的本发明化合物由静脉、皮肤或皮下注射给药时，本发明的化合物应为无致热原的、肠胃外可接受的水溶液的形式。本领域的技术人员熟知制备这种肠胃外可接受的蛋白溶液的方法，在制备中适当地考虑到pH值、等张性、稳定性及类似性质。除了本发明的化合物之外，优选用于静脉、皮肤或皮下注射的药物组合物还应包括等渗媒介物如氯化钠注射液、林格注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、乳酸盐林格注射液或其它本领域已知的媒介物。本发明的药物组合物也可包括稳定剂、防腐剂、缓冲剂或本领域的技术人员熟知的其它添加剂。
在本发明药物组合物中本发明化合物的用量依赖于待治疗的疾病的性质和严重性，并依赖于病人经历的前期治疗的性质。最终，主治医生决定本发明化合物的用量以治疗每个独立的病人。初始时，主治医生将给病人服用低剂量的本发明化合物并观察病人的反应。直到获得病人的最佳治疗效果后才给他服用较大剂量的本发明化合物，这时不再增加剂量。考虑用于实施本发明方法的各种药物组合物应包括每公斤体重大约0.1μg到大约100mg(优选大约100μg到大约50mg，更优选大约100μg到大约5mg)的本发明化合物。
使用本发明的药物组合物的静脉疗法的持续期依赖于每个独立的病人的待治疗的疾病的严重性和疾病以及可能的特异反应而变化。考虑每次使用本发明化合物的持续期为持续静脉给药12到24小时。最终，主治医生将决定适当的使用本发明的药物组合物的静脉疗法的持续期。
实施例1蛋白的制备、结晶和数据收集。
将全长人类cPLA2(残基1-749)克隆到载体pMT2-EMC-cPLA2中并转染到CHO细胞中。如在Lin等(1992)中描述的那样，所得的细胞系E5-CHO在包含10％体积的透析的胎牛血清和10μM氨甲蝶啉的α介质(Gibco)中生长。细胞小球一般溶解在pH值为9.0的缓冲液中并且随后用硫酸铵沉淀上清液中的cPLA2。包括亲合层析和大小排阻层析的多步骤产生适合结晶实验的蛋白样品。一般从100g小球得到的产量为15-25mg的纯cPLA2。
在18℃使用PEG1000为沉淀剂使用12mg/ml蛋白质由蒸汽扩散得到cPLA2的晶体。一般，过夜后出现平板形晶体并且在一星期内，可继续生长出最大尺寸为0.6mm×0.5mm×0.1mm的晶体。通过将天然和渗入重原子的晶体转移到不断增加量PEG 400和DMSO中进行低温防护。通过在低温溶液中浸泡天然晶体过夜，用250μM GdCl2或TbCl2代替CaCl2来制备重原子改性的晶体。收集数据之前把用低温保护的晶体在100K的液氮流中快速冷却。
在高级光源的光束(beamline)5.0.2使用Quantum 4 CCD检测器(面检测器系统)收集天然的、浸泡Gd和Tb的cPLA2晶体的衍射数据。由于晶体敏感性，用STRATEGY(R.Ravelli)分析每个数据组的第一个图象，以计算出一个完整数据组所要求收集的数据的最少量。当确定了最佳起点后，经90°扫描收集数据，此后旋转所述晶体至离起点180°的位置并收集第二次90°的扫描以最大化Bijvoet对的积累。在收集接近100°数据后，晶体表现出辐射敏感性，这使得必须在波长变化之间沿旋转轴解释这些数据。这个方法学证明从显示相似统计结果的三个不同波长收集数据组是成功的。在100K收集所有数据并用DENZO/SCALEPACK(Otwinowski，1993)进行处理。重原子部位-两个Tb部位都由反常Patterson图的视觉检查鉴定，其中反常Patterson图使用在Tb Lm边缘的最大波长收集的衍射数据(见表1)，确认先前在内部Raxis IV检测器(Molecular Structure Corp.)中收集的较低分辨率的铽和镉的数据组的结果。用SHARP(de la Fortelle& Bricogne，1997)完成重原子参数的精修及定相。如在SHARP中执行一样，在SOLOMON(CCP4)中完成密度修改。高质量实验性3.2电子密度图应考虑整个CaLB结构域的位置以及所述催化结构域(QUANTA)的初始踪迹和序列排布；这个方法帮助计算包围所述蛋白区的面层(mask)，该面层包括在更多的计算中。这些包括柱形图匹配(histogrm matching)(Zhang和Main，1990)、双重非结晶学的对称平均(symmetry averging)以及用在DM中的天然衍射数据由3.2至2.5的相扩展(phase extension)(Cowtan等，1996)。用REFMAC实施相循环的结合和精修(Murshudov等，1997)，产生能鉴定大部分模型的图，包括所述弹性盖的中心残基。精修-使用重建的循环以及在XPLOR中(Brünger，1992b)位置与热参数的精修来改进所述模型，在Rfree下降低于32％之后(Brünger等，1992a)进行模拟退火精修(12-2.5)。如同在BUSTER(Bricogne，1993)中完成那样，在通过最相似的精修生成的省略图(omit map)的帮助下，实施随后的建立模型的步骤。精修也包括均匀的总溶剂校正(uniform bulk solvent correction)(Bsol＝23.82；Ksol＝0.305e-/3)和非晶体学对称性限制的应用。在整个精修过程中，使用除了10％随机选择的用于计算Rfree的试验组之外的所有F＞2.0的衍射数据。使用Fo-Fc图定位水分子，其中水分子位于显示出密度＞3.0σ的部位并且显示出合理的没有空间冲突的蛋白-溶剂氢键的距离。最终模型包括1285个残基(分子A：9-433、456-500、537-727)和40个水分子，并显示了良好的立体化学，具有平均分别偏离理想几何学0.010和1.38°的键长和键角。使用12和2.5(表I)之间的衍射数据，总自由R值为29.7％并且所述R值为24.3％。
[插入表1]
[有意留的空白页]
Rsym＝∑|Ih-<Ih>|/∑Ih，其中<Ih>为平均强度与对称当量之比。
￡Friedel对分离(Friedel pairs separate)。
相位能＝∑|FH|/∑||FPHobs|-|FPHcalc||
R＝∑||Fo|-|Fc|/∑|Fo|，其中计算Rfree为随机挑选的10％反射并且计算Rfactor为剩余的90％的用于结构精修的反射(F＞2.0)。
将坐标存入Brookhaven蛋白数据库。
实施例2活性试验(a)小泡试验
混合1-棕榈酰-2-[14C]花生四烯酸基磷脂酰胆碱(58mCi/mmol)(最终浓度为6μM)和1，2-二油酰基甘油(dioleyoglycerol)(最终浓度为3μM)并在氮气流中干燥。将50mM Hepes pH7.5(最终脂类浓度的两倍)加入所述脂类中并将所得悬浮液在4℃下进行超声处理3分钟。将50mM Hepes pH7.5、300mM氯化钠、2mM DTT、2mM氯化钙和2mg/ml牛血清白蛋白(BSA)(Sigma A7511)(最终脂类浓度的1.2倍)加入所述悬浮液中。典型的试样由脂类混合物(85μl)组成，往其中连续加入抑制剂(5μl的DMSO溶液)和cPLA2在10μl的BSA缓冲剂中的溶液，其中cPLA2在自动系统中的用量为10ng或在手动试验中的用量为1ng。这个试验由下文描述的手动试验或自动试验方案实施。(b)可溶底物的试验(溶血PC)
将1-[14C]-棕榈酰-2-羟基磷脂酰胆碱(57mCi/mmol)(最终浓度为4.4μM)在氮气流中干燥。由涡旋80mM Hepes pH7.5、1mM EDTA(最终脂类浓度的1.2倍)将所述脂类再悬浮。典型的试样由脂类悬浮液(85μl)组成，往其中连续加入抑制剂(5μl的DMSO溶液)和cPLA2，其中cPLA2在80mM HepespH7.5、2mMDTT和1mM EDTA中的用量为200ng。这个试验由下文描述的手动试验或自动试验方案实施。(c)自动试验
将脂类悬浮液和抑制剂在37℃下预温育7分钟。加入酶并继续温育30分钟。然后，通过添加癸烷∶异丙醇∶三氟乙酸(192∶8∶1w/v，150μl)骤冷所述反应液。将部分骤冷层通过Rainin Spheric-5二氧化硅柱(5μ，30×2.1mm)，用庚烷∶甲醇∶TFA(97∶3∶0.1体积比)洗脱。由线上的Radiomatic Flo-one/β计算器(Packard)分析[14C]-花生四烯酸的含量。(d)手动试验
将所述脂类、抑制剂和酶的混合物在37℃下预温育30分钟。通过添加庚烷∶异丙醇∶0.5M硫酸(105∶20∶1体积比，200μl)骤冷所述反应液。将一半骤冷层施加于位于闪烁管上的真空歧管中的一次性硅胶柱(Whatman SIL，1ml)中。通过添加乙醚(1ml)洗脱游离的[14C]-花生四烯酸。由液体闪烁计算器测量放射性的水平。(e)PMN试验
用Ficoll-Hypaque，根据制作者的说明分离出PMNs。由低渗溶胞作用除去污染PMNs的红血细胞，并且将所述PMN小球洗涤一次，并以2×106细胞/ml的浓度在Hanks缓冲盐水中再悬浮。将所述细胞与抑制剂在37℃下预温育15分钟，然后用2μM A23187刺激细胞。当监测LTB4的制备作为衡量cPLA2的抑制作用时，用等体积的冰冷的磷酸缓冲盐水骤冷所述反应液。离心除去细胞，并且用由Amersham提供的依照制造者的说明使用LTB4闪烁亲近测定法测量在细胞上清液中的LTB4的含量。在上表中报道的试验中测量了LTB4。当监测花生四烯酸的制备时，用包含作为内参的D8-花生四烯酸的甲醇骤冷所述反应液。由Bligh等((1959)，Can.J.Biochem.Physiol.，37，911-917)的方法萃取所述脂类，并且将所述脂肪酸转变成五氟苄基酯并通过GC-MS分析，该方法与由Ramesha和Taylor((1991)Anal.Biochem.192，173-180)报道的类似。参考文献Altschul，S.F.、Madden，T.L.、Schffer，A.A.、Zhang，J.、Zhang，Z.、Miller，W.和Lipman，D.J.(1997)。有缺口的(gapped)BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白数据库检索程序。Nucleic Acids Res.25，3389-3402。Bacon，D.J.和Anderson，W.F.(1988)。提供空间填充分子图的快速运算法(A fast algorithm for rendering space-filling molecule pictures)。J.Mol.Graph.6，219-220。Balboa，M.A.、Balsinde，J.、Jones，S.S.和Dennis，E.A.(1997)。鉴别来自P388D1巨噬细胞和中国仓鼠卵巢细胞的不依赖于Ca2+的磷脂酶A2酶之间的同源性。J.Biol.Chem.272，8576-8580。Bonventre，J.V.、Huang，Z.、Reza Taheri，M.、O’Leary，E.、Li，E.、Moskowitz，M.A和Sapirstein，A.(1997)由缺乏胞质磷脂酶A2造成的小鼠生育力下降及postischaemic脑损伤。Nature 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此处所有引用的参考文献通过引用结合到本文中来，就如在此完全阐述一样。
Claims (29)
1.结晶cPLA2。
2.权利要求1的结晶cPLA2，其中所述cPLA2为人类cPLA2。
3.权利要求1的结晶cPLA2，其中所述cPLA2为来自非哺乳动物物种的cPLA2。
4.权利要求1的结晶cPLA2，其中所述cPLA2为重组的cPLA2。
5.权利要求1的结晶cPLA2，其中所述cPLA2包含天然存在的cPLA2的成熟序列。
6.一种包含cPLA2的结晶组合物，所述结晶组合物与第二种化学物种缔合。
7.权利要求6的组合物，其中所述第二种化学物种选自cPLA2活性的潜在抑制剂和cPLA2结合的潜在抑制剂。
8.一种cPLA2的结构模型，所述模型包含具体体现cPLA2结构的数据组。
9.权利要求8的模型，其中所述数据组由cPLA2的晶体学分析确定。
10.权利要求8的模型，其中所述数据组由cPLA2的NMR分析确定。
11.权利要求8的模型，其中所述数据组具体体现了cPLA2的整体结构。
12.权利要求8的模型，其中所述数据组具体体现了cPLA2的部分结构。
13.权利要求12的模型，其中所述部分为cPLA2的活性部分。
14.权利要求12的模型，其中所述部分为cPLA2的CaLB结构域。
15.一个计算机系统，所述系统包括计算机硬件和权利要求8的模型。
16.一种鉴定为cPLA2的活性或结合的激动剂或拮抗剂的物种的方法，所述方法包括：(a)提供权利要求8的模型；(b)研究候选物种与这个模型的相互作用，和(c)选择预期可充当所述激动剂或拮抗剂的物种。
17.一种经过按照权利要求16的方法鉴定的物质。
18.一种鉴定抑制cPLA2活性或结合的物质的方法，所述方法包括确定候选物质与cPLA2的结构模型之间的相互作用。
19.一种鉴定模拟cPLA2活性或结合的物质的方法，所述方法包括确定候选物质与cPLA2的结构模型之间的相互作用。
20.一种通过合理的药物设计鉴定cPLA2活性的抑制剂的方法，所述方法包括：
(a)基于cPLA2的晶体结构的坐标，设计与cPLA2的活性部位中的一个或多个氨基酸形成非共价键的潜在抑制剂；
(b)合成所述抑制剂；并且
(c)确定所述潜在抑制剂是否能抑制cPLA2的活性。
21.权利要求20的方法，其中所述cPLA2的晶体结构坐标得自空间群P21212的cPLA2晶体，其中a＝153.59埃，b＝95.49埃和c＝139.13埃。
22.权利要求20的方法，其中设计所述抑制剂与cPLA2活性部位中的所述一个或多个氨基酸的一个或多个原子相互作用，并且其中所述一个或多个原子选自：
Ser228的CB和Oγ原子；
Asp549和Asp575的Oδ1和Oδ2原子；
Arg200、Arg413和Arg579的CB、CG、CD、NE、CZ、NH1和NH2原子；
Trp393的主链羰基氧；
Asn555的Nδ2和Oδ1原子；
Phe397、Phe681、Phe683和Phe199的CD1、CE1、CG、CZ、CE2和CD2原子；
Trp232和Trp393的CG、CD1、NE1、CE2、CZ2、CH2、CZ3、CE3和CD2；
Ser577的CB和Oγ原子；
Cys331的CB和Sγ原子；
Glu589的OE1和OE2原子；
Lys588的CB、CG、CD、CE和NZ原子；
Thr680的Oγ1原子；
Glu418和Glu422的OE1和OE2原子；
Met417的CB、CG、SD和CE原子；
Leu400和Leu421的CB、CG、CD1和CD2原子；
Ile424的CB、CG1、CG2或CD1原子；
Ala578的主链NH和羰基氧原子；和His639的CB、CG、ND1、CE1、NE2和CD2原子。
23.一种通过合理的药物设计鉴定cPLA2膜结合的抑制剂的方法，所述方法包括：
(a)基于cPLA2的晶体结构的坐标，设计与cPLA2的静电斑区中的一个或多个氨基酸形成非共价键的潜在抑制剂；
(b)合成所述抑制剂；并且
(c)确定所述潜在抑制剂是否能抑制cPLA2的膜结合。
24.权利要求23的方法，其中所述cPLA2的晶体结构坐标得自空间群P21212的cPLA2晶体，其中a＝153.59埃，b＝95.49埃和c＝139.13埃。
25.权利要求23的方法，其中所述一个或多个氨基酸选自Arg467、Arg485、Lys488、Lys544和Lys543。
26.一种由权利要求20的方法鉴定的激动剂或拮抗剂。
27.一种由权利要求23的方法鉴定的激动剂或拮抗剂。
28.一种由权利要求18的方法鉴定的物质。
29.一种由权利要求19的方法鉴定的物质。
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