HRP20000762A2 - Antibodies to cd23, derivatives thereof, and their therapeutic uses - Google Patents

Description

Predmetni izum govori o antitijelima koja se spajaju na CD23 (FCεRII) tip II molekule naročito promijenjenih antitijela, o načinu dobivanja takvih antitijela, farmaceutskom sastavu koji sadrži ta antitijela i njegovoj upotrebi u liječenju.

CD23 (FCeRII) tip II molekule potječe iz C-lecitinske porodice u koju je također uključen limfocitni ulazni receptor (MEL-14) i adhezijska molekula-1 endotelijalnih leukocita (ELAM-1). To je receptor koji ima niski afinitet za IgE. Kod ljudi je raznolikost hematopoetskih staničnih tipova izražena na površini CD23, uključujući folikularno dendritske stanice, B stanice, T stanice i makrofage. CD23 molekule su također nađene u topivom obliku u biološkim tekućinama. Topive CD23 (sCD23) molekule su napravljene proteolitskim cijepanjem transmembranskih receptora. CD23 posjeduje pleiotropsku aktivnost uključujući posredovanje u adheziji stanica, regulaciju IgE i histaminskog otpuštanja, spašavanje B stanica od apoptoze i regulaciju mieloida u rastu stanica. Te funkcionalne aktivnosti su posredovane preko spajanja specifičnog liganda CD23 združenih–stanica, ili sCD23, koje kasnije djeluju na principu poput-citokina (Conrad, D.H., Annu Rev Immunol 8, 623-645, (1990); Delespesse, G., i sur., Adv Immunol 49, 149-191 (1991); Bonnefoy, J.Y., i sur., Curr Opin Imunnol 5, 944-47 (1993).

Povećana ekspresija CD23 je primijećena u brojnim imflamatornim bolestima. CD23 su dokazana u sinovijalnoj biopsiji kod pacijenta sa kroničnom upalom sinusa, i sCD23 se mogu mjeriti u povišenim koncentracijama u serumu i sinovijalnoj tekućini kod pacijenta sa reumatoidnim artritisom (Bansal, A.S, Oliver, W., Marsh, M.N., Pumphrey, R.S., i Wilson, P.B., Immunology 79, 285-289 (1993); Hellen, E.A., Rowlands, D.S., Hansel, T.T., Kitas, G.D., i Crocker, J.J., Clin Path 44, 293-296 (1991); Chromat, P., Brioloay, J., Banchereau, J., & Miossec, P., Arthritis Rheum 86, 234-242 (1993); Bansal, A., i sur., Clin Exp Immunol 89, 452-455 (1992); Rezonzow, R., & Newkirk, M.N., Clin Immunol Immunopathol 71, 156-163 (1994). Nadalje, nivo sCD23 u serumu kod pacijenta sa reumatoidnim artritisom je u vezi sa stanjem bolesti i povezan je sa serum reumatoidnim faktorom (Bansal, A.S., i sur., Clin Exp Rheumatol 12, 281-285 (1994). Pro-inflamatorni citokini se pojavljuju kao naročito važni čimbenici kod reumatoidnog artritisa, i igraju glavnu ulogu u TNF-a i IL-1b u razaranju artritisnih promjena koje su bile prisutne (Brennan, F.M., Chantry, D., Jackson, A., Maini, R., & Feldman, M., Lancet 2, 244-247 (1989); Brennan, F.M., Maini, R.M., & Feldman M.., Br J Rheumatol 31, 293-298 (1992).

Antitijela tipično sadrže dva teška lanca koja su vezana zajedno na disulfidni spoj i dva lagana lanca. Svaki lagani lanac je vezan sa pojedinim teškim lancem sa disulfidnim spojem. Svaki teški lanac ima na jednom kraju promjenjivu domenu nakon čega slijede brojne konstantne domene. Svaki lagani lanac ima promjenjivu domenu na jednom kraju i konstantnu domenu na njegovom drugom kraju. Promjenjiva domena laganog lanca je poravnata sa promjenjivom domenom teškog lanaca. Konstantna domena laganog lanca je poravnata sa prvom konstantnom domenom teškog lanca. Konstantna domena laganog i teškog lanca nije izravno uključena u spajanje antitijela i antigena.

Promjenjiva domena svakog para laganih i teških lanaca oblikuje mjesto za spajanje antigena. Domene laganih i teških lanaca imaju istu opću strukturu i svaka domena obuhvaća poredak od četiri regije, čije sekvence su razmjerno zaštićene i povezane sa tri komplementarne određene regije (CDRma). Četvrta regija u poretku uvelike prihvaća beta-slojno prilagođenje i CDR oblik koji je povezan petljom, i u nekim slučajevima oblikuje dio beta-slojne strukture. CDRi su zadržani u blizini sa poretkom regijama, sa CDRima iz drugih domena, pridonose oblikovanju mjesta za spajanje antigena. CDRi i poredak regija antitijela su određeni u referencama koje su opisali Kabat i sur («Sequences of proteins of immunological interest» SAD Ministarstvo zdravlja i ljudske usluge, US Government Printing Office, 1987).

Pripravljanje izmijenjenih antitijela, od antitijela glodavaca čija je promjenjiva regija spojena sa konstantnom regijom ljudskog antitijela, a to je sada već vrlo uhodano u području imunologije (Oi i Morrison (1986) Biotechniques 4, 214-212). Humanizirana antitijela u kojima su CDRi dobiveni iz različitih izvora nego oni u poretku u promjenjivoj domeni antitijela otkrivena su u EP-A-0239400. CDRi mogu biti dobiveni iz monoklonskih antitijela glodavaca ili primata. Poredak promjenjivih domena, i konstantnih domena, antitijela se obično dobiva iz ljudskih antitijela. Ta izmijenjena antitijela ne smiju izazivati jaki imunološki odgovor prilikom davanja ljudima, u usporedbi sa imunim odgovorom dobivenim na ljudima protiv čitavog niza stranih antitijela kao što su ona dobivena od glodavaca.

Štakorska monoklonska antitijela su bila uzgajana protiv CD23 receptora (FCεRII) (PCT/EP/95/04109). Iako, takva monoklonska antitijela nisu idealna za ljudsku terapiju kao što su potencijalno imunogenska kada se ubrizgaju u ljudskog pacijenta i stoga će možda biti razorena. Nadalje komercijalno prisutna antitijela koja se spajaju na CD23 receptor prepoznaju različite epitope izražene na CD23 receptoru; specifičnost spajanja epitopa može odigrati značajnu ulogu u efikasnosti antitijela za određene namjene. I više od toga, selekcija antitijela koja imaju visoki afinitet za ciljni receptor mogu se, kao terapeutska prednost, kod zahtijevane doze smanjiti u odnosu na monoklonska antitijela sa manjim afinitetom za isti receptor.

U skladu sa predmetnim izumom, dana su izmijenjena antitijela koja sadrže dovoljno amino kiselinskih sekvenci od svakog CDR prikazanog niže i to se je antitijelo sposobno spojiti na CD23 (FCeRII) tip II molekule ekspresionirane na hematopoetskim stanicama:

Lagani lanac

RSSKSLLY KDGKTYLN CDRL1 (SEKV. ident. broj: 3)

LMSTRAS… CDRL2 (SEKV. ident. broj: 5)

QQLVEYPFT CDRL3 (SEKV. ident. broj: 7)

Teški lanac

GYWMS… CDRH1 (SEKV. ident. broj: 9)

EIRLKSDNYATHYAESVKG CDRH2 (SEKV. ident. broj: 11)

FID… CDRH3 (SEKV. ident. broj: 13)

Predmetni izum također govori o antitijelima koja se spajaju na isti epitop kao antitijela koja imaju CDRe a koja su opisana iznad. Pokus kompetetivne inhibicije je iskorišten za pravljenje mapa antigenih epitopa kao što su molekule CD23. Na primjer kompeticijska FACS analiza uključuje upotrebu stanica koje ekspresioniraju molekulu kao metu, a testirana antitijela su obilježena sa fluorokromom a druga su se poznata antitijela spajala na isti antigen koji je obilježen sa drugim drugačije obojenim florokromom. Ako su oba flurokroma prisutna, antitijelo kompetitivno ne inhibira svaki od njih i stoga se smatra da prepoznaje odvojene epitope ciljne molekule. Mapiranje epitopa može također biti napravljeno uz korištenje pokusa peptidnog spajanja u kojem je svaka peptidna sekvenca ciljnog antigena izražena na pinu i promatrana je korištenjem flourokrom-obilježenih antitijela kao i ranije. U studijama mapiranja epitopa, antitijela su imala CDRe koji su opisani ranije a koji su bili prikazani na način da odrede novi epitop na CD23 molekuli. Izum stoga osigurava antitijelo koje kompetativno inhibira spajanje antitijela koje ima CDR sekvence prikazane izvan CD23 (FCεRII) tipa II molekule ekspresionirane na hematopoetskim stanicama.

Antitijela u skladu sa izumom su naročito promijenjena, a to može biti kimerno antitijelo koje sadržava dovoljno promjenjivih teških i laganih lančanih sekvenci mišjih C11 antitijela prikazano je na crtežu 1 i 2 (SEKV. ident. broj 1 i 2 i SEKV. ident. broj 46, 47, 50 i 51) kao i ta koja su sposobne spojiti CD23 molekule i ljudsku konstantnu regiju. Antitijelo može biti kimerno antitijelo u tipu koje je opisano u WO 86/01533 i koje sadrži regiju spajanja antigena i ne-imunoglobulinsku regiju. Regija spajanja antigena je promjenjiva domena laganog lanaca antitijela i/ili promjenjiva domena teškog lanca. Kimerna antitijela tipično sadrže obje i laganu i tešku promjenjivu domenu. Ne-imunoglobulinska regija je spojena na C-kraj antigene regije spajanja. Ne-imunoglobulinska regija je tipičan ne-imunoglobulinski protein koji može biti i enzimska regija izvedena iz proteina koji ima poznatu specifičnost spajanja, iz proteina toksina ili dapače iz bilo kojeg proteina ekspresioniranog sa genom. Ne-imunoglobulinska regija može biti i ugljikohidratna regija. Dvije regije kimernog antitijela mogu biti povezane preko rascijepljenih sekvenci za spajanje. Promijenjeno antitijelo može biti i bi-specifično antitijelo.

Izmijenjeno antitijelo može biti i humanizirano antitijelo u kojem ima dovoljno jedne ili više amino kiselinskih sekvenci svakog od CDRa (i ako je neophodno, poredak rezidua), a koja su nazočna u ljudskom poretku kao i ta koja su sposobna spajati CD23 molekule.

Podesno je da su CDRi antitijela u skladu sa izumom i da imaju laki lanac CDRa od L1 do L3 i teški lanac CDRa od H1 do H3 (iznad). Međutim, amino kiselinske sekvence tih CDRa se mogu promijeniti. Amino kiselinske sekvence svakog CDRa se mogu promijeniti sa amino kiselinskom zamjenom, umetanjem i/ili brisanjem.

Svaki CDR stoga uključuje jednu ili dvije amino kiselinske zamjene, umetanje i/ili brisanje. Može biti i više od tri amino kiselinske zamjene, umetanja i/ili brisanja u laganom lancu CDRL3 ili u teškom lancu CDRH3. Više od četiri amino kiselinske zamjene, umatanja i/ili brisanja može biti prisutno u laganom lancu CDRL1. Više od šest amino kiselinskih zamjena, umetanja i/ili brisanja može biti prisutno u teškom lancu CDRH2. Poželjna amino kiselinska sekvenca svakog CDR je stvarno homologna sa svakim od CDR iznad.

Poželjni stupanj sekvencijskog prepoznavanja je najmanje 50% i više, a poželjno je najmanje 75%. Sekvencijsko prepoznavanje od najmanje 90% ili od najmanje 95% je još poželjnije.

Bit će jasno stručnjacima područja taj visoki stupanj prepoznavanja sekvenci nije neophodno zahtijevan otkad se različite amino kiseline mogu često zamijeniti za druge amino kiseline koje imaju slične osobine bez stvarne promijene ili štetnog djelovanja na neka svojstva proteina. To nas ponekad upućuje na «konzervativnu» amino kiselinsku promjenu. Stoga, amino kiseline glicinin, valin, leucin ili izoleucin često mogu zamijeniti jedna drugu. Ostale amino kiseline koje često mogu zamijeniti jedna drugu su: fenilalanin, tirozin, triptofan (amino kiseline koje imaju aromatski vanjski lanac); lizin, arginin i histidin (amino kiseline koje imaju osnovni lanac); aspartat i glutamat (amino kiseline koje imaju kiselinski vanjski lanac) i cistin i metionin (amino kiseline koje sadrže sumpor u vanjskom lancu). Stoga izraz «izveden» također uključuje varijantu amino kiselinske sekvence koja sadrži jednu ili više takvih «konzervativnih» promjena povezanih sa navedenom sekvencom.

Poželjno je da je poredak konstantnih domena antitijela ljudskog poretka i ljudskih konstantnih domena. Poželjno je da je poredak promjenjivih regija antitijela teškog lanaca stvarno homologan sa odgovarajućim poretkom ljudskog proteina KOL (Schmidt i sur, Hoppe-Seyer`s Z. Physiol. Chem., 364 713-747, 1983). Homolognost u odnosu na poredak je općenito 80% ili više sa u odnosu na KOL, na primjer 90% ili više od 95% ili još više. Nadalje, sedma rezidua poretka 4 u KOLu odgovara triptofanu ili leucinu, poželjnije leucinu. Ta je rezidua KOL rezidua i numerirana je kao 109 po Kabatu i sur, 1987. Bit će prezentiran broj amino kiselinskih zamjena, umetanja i/ili brisanja. Na primjer, jedna ili više rezidua na poziciji 49, 66, 76, 77 i 94 mogu biti promijenjene sa ekvivalentnom reziduom u mišjem antitijelu. Ostali kandidatski poredak promjena koje se mogu napraviti da obnove spajanje uključuju amino kiselinske rezidue 27, 30, 48, 67, 71, 91 i 93. Amino kiselinski brojevi su numerirani u skladu sa Kabatom i sur (iznad).

Poredak promjenjivih regija laganog lanca antitijela je obično stvarno homologan sa poretkom promjenjive domene proteina HSIGKVII (EMBL baza podataka: Klobeck, H.G., EMBL knjižnica baza koja je predložena 7. travnja 1986). Tamo je dana promjena u poretku u toj sekvenci na poziciji 452. Ispravljen je poredak čitanja, a napravljeno je brisanje u bazi 452(T).

Homolognost u odnosu na poredak je općenito 80% ili više u odnosu na izabranu sekvencu, na primjer 90% ili više od 95% ili još više. Broj amino kiselinskih zamjena, umetanja i/ili brisanja bit će prezentiran, na primjer na amino kiselinskoj rezidui 64 ali također ili umjesto na 71 u skladu sa numeriranjem po Kabatu i sur.

Izum također daje antitijela koja sadržavaju promjenjivu tešku i laganu sekvencu namještenu u crtežu 3 i 4 (SEKV. ident. broj 17 i 18).

Za antitijela je poželjno da imaju strukturu prirodnih antitijela ili njihovih fragmenata. Antitijela stoga sadržavaju kompletno antitijelo, (Fab`)2 fragment, Fab fragment, lagani lanac koji ima dvostruko veći broj atoma ili teški lanac sa dvostruko većim brojem atoma. Antitijela mogu biti i IgG kao IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4; ili IgM, IgA, IgE ili IgD ili njihove modificirane varijante. I prema tome može biti izabrana konstantna domena teškog lanca antitijela. Konstantna domena laganog lanca može biti kappa ili lambda konstantna domena.

Konstantna regija je odabrana u skladu sa funkcionalnim zahtjevima. Normalni IgG1 će pokazati sposobnost lize kroz spajanje sa komplementom uz posredovanje ADCC (stanična citotoksičnost ovisna o antitijelu). Poželjan je IgG4 ako se zahtijeva ne-citotoksički blokirano antitijelo. Kao i obično, IgG4 antitijela će pokazati nestabilnost kod dobivanja, i stoga, bit će još poželjnije da se modificiraju u općenito stabilnije IgG1. Predložena modifikacija je opisna u EP0307434 a poželjna modifikacija je uključena na poziciji 235 i 237. Izum nadalje daje lizijski ili ne-lizijski oblik antitijela koji je u skladu sa izumom.

Svaki lanac antitijela može biti napravljen sa zamjenom CDRa. CDRi promjenjive regije od lakog ili teškog lanca ljudskog antitijela su zamijenjeni sa dovoljnom amino kiselinskom sekvencom svakog CDRa od anti-CD21 antitijela tako da je to rezultirano antitijelo sposobno vezati CD23 molekulu. CDR-kodirana regija hiper promjenjive regije lanca ljudskog antitijela kodirane DNK je zamijenjena sa kodiranom DNK željenog CDRa. Ako je odgovarajuće, ta promijenjena DNK je vezana na kodiranu DNK konstantnu domenu za lanac antitijela. DNK je klonirana u ekspresiju vektora. Ekspresija vektora je uvedena u kompatibilnu stanicu-domaćin koja je kultivirana pod takvim uvjetima da je lanac antitijela ekspresioniran. Komplementarni lanci antitijela su ko-ekspresionirani na način da se mogu sakupiti tako da oblikuju ljudska antitijela.

Postoje četiri osnovna koraka da se humanizira monoklonsko antitijelo. I to su:

- određivanje nukleotida i predviđene amino kiselinske sekvence početnog laganog i teškog lanca promjenjive domene antitijela;

- napraviti humanizirano antitijelo, na primjer odlučiti koji će se sustav regije antitijela upotrijebiti u postupku humaniziranja;

- aktualni postupci/tehnike humaniziranja; i

- transfekcija i ekspresija humaniziranog antitijela.

Izum nadalje osigurava DNK kodiranu sekvencu lanca antitijela koja sadrži jednu ili više sekvenci u skladu sa:

CDRL1 baza brojevi parova 70-117 na crtežu 3 (SEKV. ident. broj: 4)

CDRL2 baza brojevi parova 163-183 na crtežu 3 (SEKV. ident. broj: 6)

CDRL3 baza brojevi parova 280-306 na crtežu 3 (SEKV. ident. broj: 8)

CDRH1 baza brojevi parova 91-105 na crtežu 4 (SEKV. ident. broj: 10)

CDRH2 baza brojevi parova 148-204 na crtežu 4 (SEKV. ident. broj: 12)

CDRH3 baza brojevi parova 301-309 na crtežu 4 (SEKV. ident. broj: 14)

ili DNK Sekvencu koja kodira lanac antitijela koji sadrži jednu ili obije sekvence prema crtežima 3 ili 4 (SEKV. ident. broj 17 ili 18 i SEKV. ident. broj 48 i 49).

Korak 1: Određivanje nukleotida i predviđene amino kiselinske sekvence laganog i teškog lanaca promjenjivih domena antitijela

Za humaniziranje antitijela potrebno je poznavati samo amino kiselinsku sekvencu teškog i lakog lanca promjenjive domene antitijela. Sekvence konstantnih domena su irelevantne zbog toga jer one ne pridonose poboljšanju strategije. Jednostavni postupak određivanja promjenjive domene antitijela amino kiselinske sekvence je iz klonirane kodirane cDNK teških i laganih lančanih promjenjivih domena.

Dva su glavna postupka za kloniranje koje daje teški i lagani lanac promjenjivih domena antitijela od cDNK: (1) preko konvencionalne cDNK kolekcije, ili (2) preko reakcije lanca polimeraze (PCR). Ta oba postupka su širom poznata. Dobivši nukleotidnu sekvencu cDNK, jednostavno je prevesti tu informaciju u predviđenu amino kiselinsku sekvencu promjenjive domene antitijela. U sadašnjem primjeru, nukleotidna sekvenca i predviđena amino kiselinska sekvenca štakorskog lanca C11 antitijela je prikazana u crtežu 1 i 2 (SEKV. ident. broj: 1 (teškog) i 2 (laganog) i SEKV. iden. broj 46 i 47).

Korak 2: Napraviti humanizirano antitijelo

Postoje mnogi čimbenici prilikom razmatranja i odlučivanja koja će se ljudska sekvenca antitijela upotrebljavati za vrijeme humanizacije. Humanizacija laganog i teškog lanca je razmatrana neovisno jedna od druge, ali su zaključci u biti slični za svaku od njih.

Taj postupak selekcije je baziran na slijedećem principu: dajući antitijelu antigenu specifičnost i afinitet koji je primarno određen sa amino kiselinskim sekvencama promjenjive regije CDRa. Poredak promjenjivih domena rezidue ima mali ili nikakav doprinos. Primarna uloga poretka regija je da zadrži CDRe u njihovom vlastitoj prostornoj orijentaciji tako da prepoznaju antigen. Stoga supstitucija štakorskih CDRa u poretku ljudske promjenjive domene više nalikuje na rezultat u zadržavanju njihovih ispravnih prostornih orijentacija u poretku promjenjivih ljudskih domena koji je visoko homologan sa štakorskim promjenjivim domenama iz kojih one potječu. Ljudske promjenjive domene bi poželjno trebale biti izabrane tako da su visoko homologne sa štakorskim promjenjivim domena(ma).

Prikladna sekvenca ljudske promjenjive domene antitijela može se izabrati kako slijedi:

Koristeći se kompjutorskim programom, pretražujući sve dostupne proteinske (i DNK) baze podataka za te sekvence ljudske promjenjive domene antitijela na način da su vrlo homologne sa štakorskim promjenjivim domena antitijela. Završni izlaz tog prikladnog programa je lista sekvenci koje su vrlo homologne sa štakorskim antitijelom, postotak homolognosti svake sekvence, i usklađenost svake sekvence sa štakorskom sekvencom. To je napravljeno nezavisno za oba, i za teški i za lagani lanac promjenjive domene sekvence. Gornje analize su izrazito lagane i potpune ako su uključene ljudske imunoglobulinske sekvence.

Lista sekvenca ljudske promjenjive domene antitijela koja je uspoređena zbog homolognosti. Primarno uspoređivanje je izvedeno na dužini CDRa, osim teškog lanca CDR3 koji je u potpunosti promjenjiv. Ljudski teški lanac i kappa i lambda lagani lanci su podijeljeni u pod skupine; 3 podskupine teškog lanca, 4 podskupine kappa lanca, 6 podskupina lambda lanca. Veličina CDR unutar svake skupine je slična ali varira između podskupina. Obično je moguće pripasati CDR štakorskog antitijela na jednu ljudsku podskupinu kao prvu aproksimativnu homolognost. Antitijela nose CDRe slične dužine i zatim se uspoređuju na homolognost amino kiselinskih sekvenci, posebno unutar CDRa, ali također i u okruženju poretka regije. Ljudska promjenjiva domena koja je najviše homologna je izabrana kao početak za humanizaciju.

Korak 3: Aktualni postupci/tehnike humaniziranja

Antitijelo se može humanizirati pomoću kalemljenja CDRa na ljudski poredak u skladu sa EP-A-0239400. DNK sekvenca kodira željene različite oblike antitijela koja, stoga, mogu biti u početku napravljena sa ljudskom DNK sa čijim CDRima se želi promijeniti oblik. Promjenjiva domena štakorske amino kiselinske sekvence sadrži željene CDRe koji su uspoređeni sa tim izabranim sekvencama ljudske promjenjive domene antitijela. Rezidue u ljudskim promjenjivim domenama su označene tako da budu promijenjene u odgovarajuće rezidue u štakoru na način da dobijemo ljudsku promjenjivu regiju uključenu u štakorske CDRe. Također postoje rezidue koje je potrebno zamijeniti, dodati ili izbrisati iz ljudske sekvence.

Oligonukleotidi su sintetizirani tako da se mogu upotrijebiti u mutageniranju poretka promjenjive ljudske domene i da sadrže željene rezidue. Ti oligonukleotidi mogu biti bilo koje konvencionalne veličine. Normalna je jedna koja je samo ograničena u dužini sa sposobnošću određene sinteze one koja je dostupna. Dobro je poznat postupak oligonukleotidne-usmjerene mutageneze in vitro.

Alternativno, humaniziranje se može postići korištenjem lančane reakcije rekombinantne polimeraze (PCR), postupkom opisanim u WO92/07075. Korištenjem tog postupka, CDR se može spojiti između poretka regija ljudskog antitijela.

Općenito, tehnika u WO92/07075 se može izvesti korištenjem predloška koji sadrži dva poretka ljudskih regija, AB i CD, i između njih CDR koji se može zamijeniti sa donatorskim CDRom. Primeri A i B su iskorišteni da pojačaju poredak regije AB, i primeri C i D se koriste da pojačaju poredak u regiji CD. Međutim, svaki od primera B i C sadrži, na njegovom 5` kraju, dodatnu sekvencu odgovarajuću sa svim ili bar nekim dijelovima donorske CDR sekvence. Primeri B i C prekrivaju svojom dovoljnom dužinom i dozvoljavaju rekombiniranje lanaca nukleotida nakon zagrijavanja njegovog 5` kraja sa ostalim, pod uvjetima koji dopuštaju da PCR bude izveden. Stoga su pojačane regije AB i CD iskusile umetanje gena sa prekrivenom ekstenzijom da se dobije humanizirani produkt u jednoj reakciji.

Korak 4: Transfekcija i ekspresija promijenjenih antitijela

Slijedeći mutagensku reakciju preoblikovanih antitijela, mutagenirana DNK se veže na odgovarajuću kodiranu DNK konstantnu regiju laganog ili teškog lanca, kloniranu u ekspresiju vektora, i transfekciranu u stanicu domaćin, poželjno stanice sisavaca. Taj će korak biti izveden rutinski. Promijenjena antitijela će stoga biti dobivena sa postupkom koji sadržava:

- dobivanje prve replikabilne ekspresije vektora uključujući i prikladnog promotora operativno vezanog na DNK sekvencu koja kodira najmanje promjenjivu domenu jednog teškog ili laganog lanca Ig, a promjenjiva domena obuhvaća poredak regija ljudskog antitijela i zahtijevani CDR za humanizirana antitijela izuma;

- dobivanje druge replikabilne ekspresije vektora uključujući i prikladnog promotora operativno vezanog na DNK sekvencu koja kodira najmanje promjenjivu domenu komplementarnog jednog teškog ili laganog lanca Ig pojedinačno;

- transformacija stanične linije sa prvim ili oba dobivena vektora; i

- kulturiranje navedene transformirane stanice da dobijemo navedeno promijenjeno antitijelo.

Poželjna DNK sekvenca u koraku (a) kodira obije promjenjive varijable domena i svaku konstantnu domenu lanca ljudskog antitijela. Bit će obnovljeno i pročišćeno svako humanizirano antitijelo. Linija stanica koja je transformirana da proizvodi promijenjena antitijela može biti linija stanica ovarija kineskog zamorca (CHO) ili besmrtna linija stanica sisavaca, koja je poželjno limfoidnog porijekla, kao što je mielom, hibridom, triom ili kvadrom linija stanica. Linija stanica također sadržava normalne limfoidne satnice, kao što su B-stanice, koje su postale besmrtne transformacijom sa virusom, kao što je Epstein-Barr virus. Još poželjnije, da je besmrtna stanična linija mielomska stanična linija ili od nje potječe. Ekspresijski poredak izbora je glutamin sintetaza ekspresijskog poretka koji je opisan u WO87/04462.

Linija stanica koja je korištena za dobivanje humaniziranih antitijela je linija stanica sisavaca, ali može biti i druga prikladna linija, kao što je bakterijska linija stanica ili kvaščeva linija stanica koje se mogu alternativno upotrijebiti. Za jednostavni lanac antitijela, vidljivo je da je E. coli – izveden bakterijski pravac koji se može upotrijebiti. Dobivenim antitijelima se provjerava njihova funkcionalna sposobnost. Ako je funkcionalnost izgubljena, potrebno je vratiti se na korak (2) i promijeniti poredak antitijela.

Izum stoga daje ekspresiju vektora koji sadržava kodiranu DNK i koja je adaptirana za ekspresiju bilo kojeg antitijela u skladu sa izumom i stanice domaćina transformirane navedenom ekspresijom vektora.

Jednom izražena antitijela, i njihovi spojevi sa dvostruko većim brojem molekula, samostalni lagani i teški lanci, ili ostali imunoglobulinski oblici predmetnog izuma će se pročistiti u skladu sa standardnim postupcima u području, uključujući precipitaciju s amonijakovim sulfatom, afinitetni stupac, kolumnu kromatografiju, gel elektroforezu i slične (vidi, općenito, Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y. (1982)). Poželjni su supstancionalni čisti imunoglobulini od najmanje 90 do 95% homogenosti, a još poželjniji su sa 98 do 99% homogenosti, za farmaceutsku upotrebu. Kada su jednom pročišćena, a poželjno je djelomično ili do homogenosti, ta se antitijela mogu zatim upotrijebiti terapeutski ili u razvoju i izvedbi pokusnih postupaka, imunoflourescentnih bojila, i slično (vidi, općenito, Immunological Methods, Volumeni I i II, Lefkovits i Pernis, eds., Academic Press, New York, N. Y. (1979 i 1981)).

Antitijela mogu funkcionirati na način da blokiraju interakciju između spojene membrane CD23 i liganda koji je spojen na nju. U pokusima in vitro na primjer, radio-imuni pokus se može upotrijebiti za proučavanje tog blokirajućeg učinka. Antitijela mogu također funkcionirati tako da se spajaju na topivi CD23. Membrana spajanja CD23 zna iskusiti cijepanje površine stanice koje vodi do formiranja brojnih topivih fragmenata. Ti fragmenti se ponašaju kao citokini i igraju glavnu ulogu u formiranju IgE. Pretjerani nivo topivih CD23 će stoga biti upleten u bolest. Spajanjem tih fragmenata antitijela, u skladu s izumom. može se dovesti u pitanje sposobnost topivih CD23 u posredovanju u njegovog učinka. Za antitijela u skladu sa izumom se vjeruje da preveniraju proizvodnju topivih CD23 sa prevencijom cijepanja membrane spajanja receptora. Izum stoga daje uporabu anti-CD23 antitijela kao i proizvodnju medikamenata za blokiranje topivih CD23 formacija.

Sposobnost bilo kojeg antitijela da posreduje njegovom učinku bit će povezana sa afinitetom ciljnog antigena. Antitijela u skladu sa izumom imaju visoki afinitet za CD23 receptore. Poželjno je da je konstantni afinitet tih antitijela veći od 1x109 Ka Mo1-1 i još poželjnije je da je veći od 1x1010 Ka Mo1-1. Ovaj izum stoga osigurava antitijela koja su se sposobna spajati na CD23 receptor ili topivi CD23, a antitijela su karakterizirana sa konstantnim afinitetom koji je jednak ili veći od 1x109 Ka Mo1-1.

Antitijela koja se spajaju na CD23 receptor se koriste in vivo u liječenju ili profilaksi inflamatornih autoimunih bolesti. To je od velikog značenja imajući u vidu činjenice da je mnoge od tih bolesti teško ili nemoguće liječiti, usprkos dugim istraživanjima o prirodi uzroka. To je naročito važno u slučajevima artritisa, koji često pogađa ljude u srednjim godinama i uzrokuje preuranjene odlaske u mirovinu. Učinkoviti tretman artritisa bio je dugo cilj mnogih istraživačkih skupina.

Za antitijela koja su opisana u predmetnom izumu se vjeruje da su korisna u liječenju ili profilaksi nekoliko bolesti uključujući artritis, lupus erythematosus, Hashimoto tiroiditis, multipla skleroza, diabetes, uveitis, dermatitis, psorijaza, urtikarija, nefrotični sindrom, glomerulonefritis, upale potrbušnice, ulcerativni kolitis, Kronova bolest, Sjorgenov sindrom, alergije, specifične astme, alergijska ili urođena astma, akutna asmatska egzarcebacija, rinitis, ekcem, GVH, COPD, inzulitis, bronhitis (naročito kronični bronhitis) ili dijabetes (naročito Tip 1 dijabetes).

Predmetni izum stoga daje upotrebu antitijela u skladu sa izumom u proizvodnji medikamenata za liječenje bilo koje ili više bolesti a koje su opisane iznad. Izum također daje postupak za liječenje jedne ili više bolesti, a koje su opisane iznad, sadržavajući davanje terapeutski učinkovite doze antitijela u skladu sa izumom.

Antitijela u skladu sa izumom mogu također biti korisna u proučavanju interakcije između CD23 i različitih liganda na primjer, između CD23 i CD21, između CD23 i CD11b, između CD23 i CD11c, između CD23 i 80 do 85 KDa endotelijalnog staničnog proteina (koji može biti 80 ili 85 KDa endotelijalni stanični protein) ili između CD23 i 115 KDa protein (za kojeg se vjeruje da je povezan sa 80 do 85 KDa endotelijalnim proteinom). Za jednu ili više gornjih interakcija se vjeruje da se zbivaju in vivo. Antitijela ili druga sredstva za spajanje a koja su sposobna blokirati te interakcije naročito su poželjna otkad se vjeruje da su ona možda specijalno prikladna za smanjenje ili za pomoć pri inflamatornom efektu uzrokovanom citokinima. Ona mogu biti korisna protiv malignih B-stanica kao što je kronična limfatična leukemija, i ostali oblici leukemije.

Jedan alternativni mehanizam djelovanja anti CD23 terapije je možda uključen u blokiranju IgE imunog odgovora.

Antitijela u ovom izumu se naročito mogu koristiti za liječenje ili profilaksu alergijskih bolesti, uključujući bolesti posredovanu ne-IgE. Ona se mogu koristiti u liječenju i profilaksi ulcerativnog kolitisa a, također se mogu upotrijebiti u liječenju ili profilaksi Kronove bolesti.

Antitijela u predmetnom izumu se mogu upotrebljavati sama ili u kombinaciji sa imunosupresivnim sredstvima kao što su steroidi, ciklosporini, ili antitijela kao što su anti-limfocitna antitijela ili još poželjnije sa induciranom –tolerancijom, anti-autoimuna ili anti-inflamatornim sredstvima kao što je CD4+T sredstvo stanične inhibicije na primjer anti-CD4 antitijelo (poželjno je da blokira ili ne-iscrpljuje antitijelo), anti-CD8 antitijelo, antagonist TNF na primjer anti-TNF antitijelo ili inhibitor TNF na primjer topivi TNF receptor, ili sredstva kao što su NSAIDi.

Prikladne doze za supstancu predmetnog izuma će varirati, te će ovisiti o raznim faktorima kao što je stupanj bolesti ili poremećaj koji treba liječiti, način davanja i starosna dob, te težina pacijenta koji će se liječiti. Bez vezanja na naročitu dozu, vjeruje se da na primjer dnevna doza za parenteralno davanje se kreće u opsegu 0,01 do 20 mg/kg antitijela predmetnog izuma (obično prisutna kao dio farmakološkog sastava kako je naznačeno iznad) će biti dovoljna za liječenje normalnog odraslog čovjeka. Još prikladnije doza će biti u opsegu od 0,1 do 5 mg/kg, kao i 0,1 do 2 mg/kg. Jedinična doza će biti od 1-400 mg.

Antitijela se također mogu upotrebljavati kao zasebno davani sastavci koji se daju združeni sa kemoterapeuticima ili imunosupresivnim sredstvima. Obično, ta sredstva uključuju ciklosporin A ili analog purina (na primjer metotreksat, 6-merkaptopurin, ili slična), ali i brojne druge dodane sastojke (na primjer ciklofosfamid, prednizon itd.) koji su dobro poznati stručnjacima područja i koji se također mogu upotrijebiti.

Ukoliko se želi liza stanice na koju je antitijelo spojeno, antitijela predmetnog izuma mogu biti oblika imunotoksina. Imunotoksini su karakterizirani sa dvije komponente i naročito su korisni za ubijanje određenih stanica in vitro ili in vivo. Jedna komponenta je citotoksično sredstvo koje je obično smrtonosno za stanicu koja se prihvati ili apsorbira. Druga komponenta, poznata je kao "transportno sredstvo", daje sredstvo za isporuku toksičkog sredstva za određeni tip stanice, kao što su stanice koje sadrže karcinom. Dvije komponente su obično kemijski spojene zajedno sa nekom od bilo koje varijante dobro poznatog kemijskog postupka. Na primjer, kada je citotoksičko sredstvo protein a druga komponenta je intaktni imunoglobulin, vezanje može biti na način da je to heterobifunkcionalno poprečno vezanje, na primjer SPDP, karbodimid, glutaraldehid, ili slično. Dobivanje različitih imunotoksina je dobro poznato u tom području, i može se naći, na primjer u "Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet", Thorpe i sur, Monoclonal Antibodeies in Clinical Medicine, Academic press, strane 168-190 (1982).

Varijante citotoksičkog sredstva su prikladne za uporabu u imunotoksinima. Citotoksička sredstva uključuju radionukleide, kao što je Jod-131, Itrij-90, Renium-188, i Bizmut-212; brojne kemoterapeutske lijekove, kao što su vindesin, metotreksat, adriamicin i cisplatin, i citotoksičke proteine kao što su slični proteini inhibirani ribosomima kao bockajući antiviralni protein, Pseudomonas egzotoksin A, ricin, difterija toksin, ricin A lanac, itd, ili aktivno sredstvo na površini stanice, kao što su fosfolipazni enzimi (na primjer fosfolipaza C). Vidi, općenito, "Chimeric Toxinsi", Olsnes i Phil, Pharmac. Ther., 25: 335-381 (1982), i "Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy", eds. Baldwin i Byers, strane 159-179, 224-266, Academic Press (1985).

Komponenta za isporuku imunotoksina je antitijelo u skladu sa predmetnim izumom. Poželjno se koriste intaktni imunoglobulini ili njihovi spojeni fragmenti, kao što je Fab. Tipično, antitijela u imunotoksinima bit će ljudski IgA, IgM ili IgG izotopi, ali i ostale konstantne regije sisavaca se mogu upotrijebiti po želji.

Izum nadalje daje farmaceutski sastav koji sadrži farmaceutski prihvatljive nosače ili diluente i, kao aktivnu supstancu, antitijelo u skladu sa izumom. Sastav može sadržavati imunotoksin u skladu sa izumom. Antitijela, imunotoksin i njihov farmaceutski sastav tog izuma su naročito korisni za parenteralno davanje, na primjer supkutano, intramuskularno ili intravenozno.

Sastav za parenteralno davanje normalno sadrži otopinu antitijela ili njihov koktel otopljen na prihvatljivom nosaču, poželjno u vodenom nosaču. Varijante vodenog nosača koji se mogu upotrijebiti su, na primjer; voda, puferirana voda, 0,4% soli, 0,3% glicina i slično. Te otopine su sterilne i općenito su slobodne od raznih čestica. Ti sastojci se moraju sterilizirati po konvencionalnim postupcima, i po dobro poznatim tehnikama sterilizacije. Sastojci mogu sadržavati farmaceutski prihvatljive vanjske supstance koje su zahtijevane uz fiziološke uvjete kao što je podešeni pH i puferska sredstva, sredstva prilagođena toksicitetu i slična, na primjer natrij acetat, natrij klorid, kalijev klorid, kalcijev klorid, natrij laktat, itd. Koncentracija antitijela u tim sastojcima može jako varirati, na primjer od manje od 0,5%, obično na ili manje od 1% do visokih 15 ili 20% po težini i bit će primarno izabrana i bazirana na volumenu tekućine, viskozitetu, itd., i u skladu sa naročitom upotrebom i davanjem koje je određeno.

Stoga tipični farmaceutski sastav za intramuskularnu injekcijsku primjenu može se napraviti tako da sadrži 1 ml sterilne puferirane vode i 50 mg antitijela. Tipični sastav za intravenoznu infuziju može sadržavati 250 ml sterilne Ringerove otopine i 150 mg antitijela. Aktualni postupak za pripravljanje parenteralnog sastava za davanje bit će poznat ili očit stručnjacima područja i opisan je detaljnije u, na primjer, Remington`s Pharmaceutical Sience, 15to izdanje., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980).

Antitijela u izumu mogu se liofilizirati za pohranjivanje i mogu se ponovo vratiti u oblik pomoću prikladnog nosača poznatog u području. Tehnike koje su bile prikazane su efektivne sa konvencionalnim imuno globulinima. Bit će upotrijebljena bilo koja prikladna tehnika liofilizacije te postupci vraćanja. Bit će jasno stručnjacima područja da liofilizacija i rekonstitucija vodi k različitom stupnju smanjenja aktivnosti antitijela (na primjer, sa konvencionalnim imunoglobulinima, IgM antitijela imaju tendenciju ka većem gubitku aktivnosti u odnosu na IgG antitijela) i taj nivo gubitka se može podesiti tako da se na početku odmah kompenzira.

Jednostruko ili višestruko davanje sastava bit će izvedeno sa količinom doze i uzorkom koji će odrediti doktor. U svakom slučaju, farmaceutski sastav će dati kvantitetu antitijela izuma koja su dostatna za liječenje pacijenta.

Antitijela u predmetnom izumu će nadalje pokazivati razne varijante u korištenju in vitro. Na primjera, antitijela u primjerima se mogu iskoristiti za tipizaciju T-stanica, za izolaciju specifičnog CD23 antigena koji nosi stanice ili fragmente receptora, za dobivanje vakcina, ili sličnog.

Iz dijagnostičkih razloga, antitijela se nadalje mogu označavati ili ne. Neoznačena antitijela se mogu upotrijebiti u kombinaciji sa ostalim obilježenim antitijelima (druga antitijela) koja reagiraju sa humaniziranim antitijelima, kao što su antitijela specifična za ljudsku imunoglobulinsku konstantnu regiju. Alternativno, antitijela se mogu direktno označavati. Mogu se upotrijebiti različite varijante označivača (markera) kao što su radionukleidi, fluor, enzimi, enzimski supstrati, kofaktori enzima, inhibitori enzima, ligandi (naročito hapteni), itd. Dostupni su brojni tipovi imuno pokusa koji su poznati stručnjacima područja.

Sredstva za dijagnostiku bit će korištena u svrhu zaštite za predmetna antitijela i detekciju stanične aktivnosti ili u svrhu nazočnosti određenih antigena. Stoga će antitijela predmetnog izuma obično bit dana u liofilizarnom obliku u specijalnim spremnicima, a mogu biti sama ili u združena sa dodanim antitijelima koja su specifična za željeni stanični tip. Antitijela, se mogu združiti sa označivaćem ili toksinom, ili se razdružiti, te su uključena u sredstvo sa puferima, kao što su Tris, fosfati, karbonati, itd., stabilizatori, biocidi, inertni proteini, na primjer serum albumini, ili sličnim te će biti određena njihova uporaba pomoću pratećih instrukcija. Općenito, ova sredstva bit će nazočna u najmanje 5% težine koja je bazirana na iznosu aktivnih antitijela, i obično je prisutna u ukupnoj količini od najmanje 0,001% težine koja je bazirana na koncentraciji antitijela. Poželjno je učestalo uključivanje inertnog ekstendera ili ekscipienta da razrijedi aktivnu supstancu, gdje ekscipient može biti prisutan u svom obliku od 1 do 99% težine u ukupnom sastavu. Kada se koriste druga antitijela koja su se sposobna spajati sa kimerna antitijelima u pokusu, ona će se obično nalaziti u zasebnim bočicama. Druga antitijela se obično združuju sa označivačima i formuliraju se na isti način kao i antitijela koja su formulirana i opisana iznad.

Crteži

Crtež 1 prikazuje amino kiselinu i nukleotidnu sekvencu mišje C11 teškog lanca promjenjive regije.

Crtež 2 prikazuje amino kiselinu i nukleotidnu sekvencu mišje C11 laganog lanca promjenjive regije.

Crtež 3 prikazuje amino kiselinu i nukleotidnu sekvencu humaniziranog anti-CD23 antitijela teškog lanca promjenjive regije.

Crtež 4 prikazuje amino kiselinu i nukleotidnu sekvencu humaniziranog anti-CD23 antitijela laganog lanca promjenjive regije.

Crtež 5 prikazuje polovicu maksimalnog spajanja kimernih CD23 IgG1m

Crtež 6 prikazuje polovicu maksimalnog spajanja humaniziranih CD23 IgG1m

Slijedeći primjeri ilustriraju izum.

Kloniranje i sekvencioniranje mišjeg anti-CD23 monoklonskog antitijela C11

Općenito postupanje

Ukoliko nije drugačije naznačeno u izjavi, korišteni su standardni postupci i uvjeti. Proizvođačka specifikacija je upotrijebljena i primijenjena. Izvedeno je ukidanje digestije i ostalih rutinskih molekularno-bioloških postupaka a sustavno je opisano u Maniatis i sur («Molecular Cloning – a laboratory manual» drugo izdanje, Cold Spring Harbour Press).

PCR je izveden uz upotrebu programibilnog termalnog brojača (Trio; Biometra). Tipična 100 μm reakcija sadrži 2,5 jedinica AmpliTaq polimeraze (Perkin-Elmer-Cetus, Beaconsfield, UK) u puferu koji opskrbljuje proizvođač; 250 μM od svakog dATP, dCTP, dGTP i dTTP; pojačani su primeri na 1 μM i predložena DNK. Ukoliko nije drugačije navedeno, korišten je slijedeći ciklus specifikacija:

Korak 0: 95°C za 5 minuta

Korak 1: 95°C za 1 minutu

Korak 2: 50°C za 1 minutu, uz približavanje koraku 3 sa 0,4°C/s

Korak 3: 72°C za 1 minutu, idi na korak 1, ponavljati kružni postupak 30 puta

Korak 4: 72°C za 5 minuta

Sekvencioniranje DNK je izvedeno uz korištenje dideoksi završnog postupka upotrebom oba Sequenase v2 poretka (USB, Cambridge, UK) ili fluorescentnog dyeterminator sistema (ABI).

Gel pročišćavanje DNK je izvedeno sa odvojenim reakcijama na agaroznom gelu sa malom točkom topljenja (NuSieve GTG, FMC, Rockland, ME). Izabrani fragment je uklonjen pod UV osvjetljenjem, i DNK je oporavljena upotrebom Wizard PCR Preps kit (Promega, Southampton, UK).

Brojne amino-kiselinske rezidue u lancu antitijela slijede sheme koje su opisane u Kabat i sur («Sequnces of proteins of immunological interest), SAD Ministarstvo zdravlja i ljudskih službi, US Govt Printing Office, 1991).

Dobivanje cDNK iz C11 hibridoma

Rastuća kultura stanica C11 je upotrijebljena za ekstrakciju RNK. Kultura sadrži 1,2x107 stanica koje su centrifugirane i obje mase stanica i supernatanta su uzete za analizu. Supernatant je testiran na prisutnost različitih izotopa u mišjim imunoglobulinima pomoću imunološkog postupka (ISO1 kit; Sigma, Poole, UK) i postavljeno je da su u C11 izotopi IgG1.

Glasnička RNK je izolirana iz stanične mase sa sekvencijskom aplikacijom Total RNK Isolation Kit (Stratagene, Cambridge, UK) (proizvodnja ukupne RNK) i zatim sa mRNK Purification Kit (Dynal, Oslo, Norway). Dijelovi obiju mRNK i ukupne RNK su zatim promijenjeni u jedno nukleotidnu cDNK uz upotrebu Superscript Preamplification System (BRL, Paisley, Scotland, UK). Uzorci rezultirajuće cDNK su upotrijebljeni u PCRu da se naprave i posebno pojačaju promjenjive regije C11 imunoglobulinskih teških i laganih lanaca.

Kloniranje i sekvencioniranje promjenjive regije teškog lanca C11

Teški lanac je kloniran pomoću varijacije postupka Bendig i Jones (Bio-Technology 9:88-89) u kojem su 12 prednjih primera koji su specifični za signalnu peptidnu regiju glasnika teškog lanca i 1 zadnji primer specifičan za mišju γ1 konstantnu regiju upotrijebljeni u PCRu za pojačavanje cijele promjenjive regije. Radije nego svih 12 prednjih primera u samoj reakciji, izvedeno je 12 pojedinačnih PCR, a za svaki je upotrijebljen jedan od primera u kombinaciji sa γ1 okrenutim primerom. Ova reakcija je izvedena sa zagrijavanjem na temperaturi 42,5°C (korak 2 u shemi iznad).

Uzorci svake od reakcija su analizirani na agaroznom gelu, i reakcijska traka očekivane veličine je viđena u reakciji koja je koristila prednje primere MHV11. Bazirano na tim rezultatima, dva PCRa koriste MVH11 a g1 okrenuti primer koji je izveden uz upotrebu cDNK koja je izvedena iz mRNK i iz ukupne RNK pojedinačno. Upotreba dva nezavisna PCRa da služe kao izvor materijala za kloniranje je uobičajeni postupak koji je poznat stručnjacima tako da bi se izbjegle serkvencijske greške uzrokovane pogrešnim rasporedom nukleotida sa Taq polimerazom.

Rezultirajući PCR fragmenti su napravljeni sa Xmal i Sall, gel pročišćavanjem, i zatim su klonirani u pUC18. Umetanje velikog broja klona iz svakog PCRa, a koji su sekvencionirani i identično su postavljeni, predlažući da sekvence ne sadrže greške koje su povezane sa PCR postupkom. Kompletne sekvence promjenjive regije su prikazane na crtežu 1 (SEKV. ident. broj 1), i potpuno se poklapaju sa Kabat Group III C suglasnim teškim lancem.

Kloniranje i sekvencioniranje promjenjive regije laganog lanca C11

Promjenjiva regija laganog lanca C11 je klonirana po sličnom postupku, ponovno uključujući set od 11 prednjih primera specifičnih za signalnu peptidnu regiju glasnika laganog lanca i 1 obrnuti primer specifičan za mišju κ konstantnu regiju (Bending i Jones, op cit). U dodatku, kako je prije određeno da taj set primer nedovoljno pojačava sve mišje kappa lagane lance, uključen je još jedan primer, ovdje označen kao MKV12 (sekvenca 5` ACTAGTCGACATGAAGTTTCCTTCTCAACTTCTGCTC3`) (SEKV. ident. broj 41). Kao i iznad, odvojeni PCRi, svaki uključuje jedan prednji primer i κ konstantni okrenuti primer, koji je izveden, i analiziran sa elektroforezom na agaroza gelu.

Tri dobivena reakcijska produkta su očekivane veličine. Na njih je odvojeno djelovano sa enzimima sa Small i Xmal, zatim su pročišćeni i klonirani u pUC18 da dobijemo klonove označene kao VKI, VKJ iVKK. Oni su djelomično sekvencionirani tako da se odredi njihov identitet. Djelomična sekvenca za klon VKI je postavljena da bude identična sa poznatom sekvencom laganog lanca izvedenog iz MOPC21 mieloma koji je dio u CDR3 (Genbank M35669), a VKI je odbačen. Djelomična sekvenca za klon VKK, uključujući CDR3, postavljena je da identična sa produktivnim promijenjenim MOPC21 laganog lanca (Genbank J00560, J00552). To samo za sebe unaprijed ne isključuje da je VKK klon od ispravnog C11 laganog lanca kao i da oba lagana lanca mogu dijeliti CDR3 u zametnoj konfiguraciji, ali dajući to mielomima srodnim hiridomima za koje je poznato da su MOPC21 izvedeni, i drugim MOPC21 povezanim sekvencama koje su već dokazane (klon VKI), a za klon VKK je mišljenje da je za razliku ispravan.

Za klon VKJ se smatralo da najviše predstavlja pravi C11 lagani lanac promjenjive regije, a kao djelomična sekvenca nije identičan sa sekvencama u Genbangu. VKJ je sekvencioniran potpuno, te je postavljen da bude potpuno-funkcionalna sekvenca laganog lanca, bez dijelova, nalik na korištenje VK167 ili VK24 gena, smještajući ih kao atipične u Kabat group II sekvence. Kompletna sekvenca VKJ klona je prikazana u crtežu 2 (SEKV. ident. broj 2). Drugi nezavisni PCR koristi primerski par koji proizvodi VKJ klon je također izveden , i dobiveni produkt je kloniran i sekvencioniran kao i iznad da se unaprijed isključe mogućnosti da VKJ sekvenca sadrži PCR greške. Klonovi tog drugog pojačavanja imaju sekvencu identičnu sa izvornim VKJ klonom.

Definitivni dokaz da VKJ sadrži C11 promjenjivu regiju laganog lanca je dobiven kroz izradu kimerskih antitijela koja koriste taj VK i VH koji su opisani iznad. Ta su antitijela prikazana spojena na CD23.

Pravljenje kimernih antitijela

Da se potvrde ispravne promjenjive regije teškog i laganog lanca one su klonirane i sekvencionirane, a kimerni anti-CD23 je napravljen. Promjenjiva regija teškog lanca je pojačana uz upotrebu kolonova iz cDNK knjižnice. Prednji primer sadrži 5` kloniranih mjesta (Hind III), 5` ne translatiranih sekvenci uključujući i funkcionalni Kozac signal, zajedno sa prvih šest kodona mišjeg promjenjivog teškog lanca. Okrenuti primer stvara Spe I mjesto u poretku 4 u okviru da spoji ljudsku gamma I konstantnu regiju. Ti primeri pokreću 430 parova baza produkta.

Teški lanac anti-CD23 kimernog oligo PCRa

5` gAT gAA gCT TTA CAg TTA CTC AgC ACA CAg gAC CTC ACC ATg gAT TTT ggg CTg aTT 3` SEKV. ident. broj 19

5` gAT ggA CTA gTg TCC CTT ggC CCC A 3` SEKV. iden. broj 20

Primeri za pojačavanje anti-CD23 promjenjive regije laganog lanca za pravljenje kimernih laganih lanca su napravljeni da sadržavaju 5` kloniranih mjesta (Hind III), 5` ne translatiranih sekvenci uključujući funkcionalni Kozak signal, zajedno sa prvih šest kodona mišje promjenjivog laganog lanca. Okrenuti primer sadrži BsiW 1 mjesto i antikodone za indikaciju amino kiselina. Provjereni kodovi su standardni: Y = T ili C; K = T ili G; V = A, G ili C. Produkt je 420 baznih parova.

Lagani lanac anti-CD23 kimernog oligo PCRa

5` gAT gAA gCT TTA CAg TTA CTC AgC ACA CAg gAC CTC ACC ATg Agg TTC TCT gTT CAg 3` SEKV. ident. broj 21

5` gAT gCg TAC gTY TKA TYT CCA VCT TKG T 3` SEKV. iden. broj 22 ( i SEKV. ident. broj sekvenci 42 do 45 i 52 i 53)

T R K I E L K T

R V

PCR produkti teškog lanca su očišćeni, odrezani sa Hind III i Spe I, i zatim su klonirani u pUC vektor koji je odrezan sa Hind III a Spe I sadrži ljudsku gamma I konstantnu regiju. Ljudska konstantna regija upotrebljavala je IgG1 teškog lanca a opisao ju je Reichmann L i sur (1988) Nature 322, 323-327 ali u cDNK kontekstu ju je opisao Page, M. J. Sydenham, M. A. (1991) Biotechnology 9, 64-68 i Crowe J. S. i sur. u Clinical Exp Immunol (1992) 87-105.

Promjenjiva i konstantna regija su uklonjene iz pUC vektora sa Hind III i Eco R1, a zatim su klonirana u Hind II – Eco R1 mjesto ekspresije vektora pEE6 dobiveno je iz Celltech (Stephens & Cockett i Nucl. Acids. Res. (1989) 17, 7110).

Kada je kimerni teški lanac sekvencioniran, nedostajalo je 100 parova baza od 5` sekvenci. Nakon pregleda mišje promjenjive sekvence teškog lanca, zapaženo je jedno Hind III mjesto. Da bi se stvorila kompletna promjenjiva sekvenca teškog lanca stvorena u PCR produktu, na PCR produkt je djelovano sa Hind III i mali fragmenti 100 parova baza su klonirani u Hind III uz djelovanje pEE6 koji sadrži teški lanac kimernog anti-CD23.

Lagani lanac PCR produkta je očišćen, zatim je odrezan sa Hind III i BsiW 1, te je zatim je ligiran u pUC vektor koji sadrži ljusku kappa konstantnu regiju. Ljudska kappa konstantna regija je upotrijebljena kako je opisao Reichmann L. i sur (1988) Nature (iznad). Promjenjiva i konstantna regija laganog lanca je uklonjena iz pUC vektora sa Hind III i Eco R1. Fragment je kloniran u Hind III – Eco R1 mjesto ekspresije vektora pEE12 koje je dobiveno iz Celtech (Bebbington i Hentschel, In DNA cloning, Vol 3, poglavlje 8 IRL PRESS 1987).

Kimerni teški lanac je izoliran kao Bgl II – Sal I kazeta koja je umetnuta u Bam H1 – Sal I mjesto u pEE12 plazmidu laganog lanca, tako da su se geni laganog i teškog lanca našli u istom plazmidu.

Završna ekspresija plazmida sadrži kimerni CD23 koji je prolazno ekspresioniran u COS stanicama (bubrežne stanice zelenog majmuna) kako slijedi. Transfectam (Promega) je otopljen u 1mg/ml u skladu sa proizvođačkim uputstvima. Dan prije transfekcije, 5,0 x 105 stanica je stavljeno u šest posuda (Costar) u ukupnom volumenu od 2,5 ml u sredstvu. Sredstvo je Dulbecco`s Modified Eagle medium (Gibco/BRL) i 10% dijalizirani fetalni serum teleta (Hyclone). Posude su inkubirane preko nići na 37°C. U svaku od 6-prikladnih posudica, dodano je 20μl Transfectama u 0,5 ml sredstva, koje je slobodno od seruma, u sterilni polistirenski maleni spremnik, i zatim je brzo vrtloženo. Za svaki tekući sastojak koji će biti transfekcioniran, dodano je 4 μg plazmida DNK u 0,5 ml Transfectam otopine u sredstvo slobodno od seruma, zatim je miješano i ostavljeno na sobnoj temperaturi kroz 10 min dok su se dobivale stanice za transfekciju. Sredstvo je aspirirano iz stanica koje su tranfektirane i zatim su stanice pažljivo isprane 1 do 2 puta sa 5 ml pred-zagrijanog sredstva slobodnog od seruma po svakom tekućem sastojku, i zatim je 0,5 sredstva slobodnog od seruma dodano tekućem sastojku. Ranije dobiveno 0,5 ml DNK/Transfektam otopine je dodano u svako tekuće sredstvo i kada je sredstvo kompletirano, posudice su nježno uzburkane da bi se postiglo miješanje. Posudice su vraćene u inkubator kroz 4 sata. 2 ml kompletnog sredstva (koje sadrži 1,5 puta normalne koncentracije seruma) je dodano u transfekcijsku otopinu. Posudice su vraćene u inkubator kroz tri dana kad je sredstvo koje je sakupljeno iz posudica ubačeno u pokuse za mjerenje aktivnosti antitijela.

Kimerna antitijela su spojena sa sCD23 u ELISA pokusu. U ELISA pokusu za određivanje sCD23 spajanja, EIA/RIA posudice (Costar) su prekrivene sa 100 μl/sastojka od 2 μg/ml sCD23 u 35 mM NaHCO3, 15 mM Na2CO3, pH 9,3 i ostavljeno je preko noći na 4°C. Posudice su isprane tri puta sa 150mM NaCl, 50 mM Trizma bazom, 0,1% (v/v)nTween-20, pH 7,4 (TBS/Tween), i blokirana su kroz 1-2 sata na 22°C sa 100 μl/sastojka 2% goveđeg serum albumina u TBS/Tween, i isprana tri puta sa TBS/Tween.

Razrjeđenom supernatantu mišjeg hibridoma C11 je dodano 100 ml/sastojka jednog dijela 96 sastojka posude a razrjeđena kimerna anti-CD23 antitijela su prolazno izražena u supernatantu COS stanica te su dodana u drugi dio od 96 sastojaka posudica. C11 mišja antitijela su otkrivena sa anti-mišjim IgG (cijela molekula) peroksidazom koja je razvijena i konjugirana na kozi u Sigma A4416, razrjeđena 1:1000 u PBS/BSA (goveđi serum albumin) (1%). Kimerna anti-CD23 antitijela su otkrivena sa anti-ljudskim kappa laganim lancem (spojenim i slobodnim) i spojenom peroksidazom, (Sigma A-7164), razrjeđenom u 1:5000 u PBS/BSA (1%). Kimerna anti-CD23 su sigurna na spajanje sa sCD23 u ELISA pokusu.

Kimerna anti-CD23 su također sigurna u spajanje sa membranom CD23 kako je određeno sa FACS. Ti podaci dokazuju da su ispravni mišji C11 teški i lagani lanac promjenjive regije bili klonirani i sekvencionirani. Te mišje sekvence su zatim upotrijebljene za razvoj humaniziranih anti-CD23 antitijela.

Sastavljanje teškog i lakog lanca humaniziranih gena

Humanizirani teški i lagani lanci su sastavljeni uz slijeđenje postupaka koje su opisali Lewis i Crowe (Gene 101 297-302, 1991).

(i) Lagani lanac

Mišji poredak promjenjive regije sekvenci je uspoređen sa ljudskim poretkom sekvenci u GenBank bazi podataka.

Ljudski predak laganog lanca je uspoređen na homolognost sa mišjim anti-ljudskim anti-CD23 promjenjivim poretkom sekvence laganog lanca. Poredak koji je najviše homologan je izabran za PCR preklopno proširivanje; on je:

Lokus: HSIGKVII 490 bp mRNK

Definicija: Ljudska promijenjena DNK za kappa-imunoglobulinske vodeće peptide i promjenjivu regiju

Izvor: homo sapiens

Autori: Klobeck, H.G. i sur. Contribution of human V kappa II germ-line genes to light chain diversitiy, Nature, 309, 73-76, 1984.

Pregledana je svaka amino kiselina koja je različita u istoj poziciji u mišjem i ljudskom poretku. Ljudska amino kiselina je držana ukoliko antigeno spajanje nije djelotvorno iz razloga što ljudske rezidue moraju biti manje imunogenske nego mišje rezidue. Prepoznavanje specifičnih rezidua za djelotvorno spajanje je hipotetsko i bazira se na podacima dobivenim u drugim antigen-antitijelo interakcijama. Iz objavljenih podataka, rezidue 71, 91, i 94 u poretku teškog lanca su bile prikazane u međudjelovanju sa antigenim spajanjem (Tramontano, A., Chotia, C., i A. M. Lesk, J. Mol. Biol 215, 175-182, 1990.; Kettebourgh, C. A., Saldanha, J., Heath, V. J., Morrison, C. J. i M. M. Bending, Protein Eng, 4, 773-783, 1991). Te rezidue su stoga bile slične u humaniziranom poretku kao i u mišjem poretku. Svaka amino kiselinska promjena je uzeta u obzir zbog veličine, hidrofobnosti, hidrofilnosti i punjenja. Ukoliko je ljudska amino kiselina slična sa mišjom amino kiselinom u tim karakteristikama, stoga se ljudska amino kiselina koristi na tom mjestu.

Postoji 13 razlika između amino kiselinske sekvence mišjeg promjenjivog poretka sekvenci laganog lanca i homolognog ljudske promjenjive sekvence laganog lanca. Nijedna od mišjih rezidua nije podupirana. Ljudska promjenjiva sekvenca laganog lanca je stvorena i GCG program je iskorišten za dokazivanje tihih mjesta za slijedeće enzime:

Accl; Heal; Nhel; Pvull; Xbal; Xhol; Xmal

Promjene u nukleotidnim sekvencama su napravljene da uključe ta restrikcijska enzimska mjesta bez promjene amino kiselinske sekvence. Nazočnost tih mjesta je uključena da se lakše napravi rez i bojenje fragmenta PCR klona.

Humanizirani promjenjivi lagani lanac je stvoren pomoću cijepljenja mišjeg laganog lanca CDRa na postojeće predloške (na primjer HSIGKVII Klobek, H. G. i sur. Nature (1984) 309, 73-76) sadržavajući izabrani ljudski poredak sekvenci laganog lanca koristeći spajanje preklapanja PCR. (Crowe, i sur. iznad.). Plazmidi kodiraju humanizirane promjenjive sekvence laganog lanca koje su razvijene kako slijedi:

Kozak sekvenca za transkripciju i signalna sekvenca (MGWSCIILFLVATATGVHS – SEKV. ident. broj 15) su uključeni u predloženu sekvencu laganog lanca. Hind II mjesto je dodano na 5` kraj i Bswi I mjesto je dodano na 3` kraj Pcr produkta za kloniranje. Oligo za PCR preklopno proširenje su:

AL: SEKV. ident. broj: 23. 5` gAT CAA gCT TCT CTA CAg TTA CTg AgC ACA 3`

BL: SEKV. ident. broj: 24. 5` AAT CAA gTA TgT CTT CCC ATC CTT ATA CAg gAg ACT CTT ACT CgA gCg ACA ggA ggC 3`

CL: SEKV. ident. broj: 25. 5` CgC TCg AgT AAg AgT CTC CTg TAT AAg gAT ggg AAg ACA TAC TTg AAT Tgg TAC CTg CAg AAg 3`

DL: SEKV. ident. broj: 26. 5` TgA TgC CCg ggT ggA CAT CAA ATA gAT CAg gAg CTg 3`

EL: SEKV. ident. broj: 27. 5` TTg ATg TCC ACC Cgg gCA TCA ggg gTC CCT gAC Agg 3`

FL: SEKV. ident. broj: 28. 5` AgC CAC CTg ACg TTT gAT CTC CAC CTT ggT CCC TTg

gCC gAA Cgt gAA Tgg ATA CTC TAC CAg CTg TTg ACA gTA ATA AAC CCC 3`

PCR reakcije (Saiki i sur. Science 239, 487-491, 1988) su izvedene na programibilnom zagrijanom bloku (Perkin Elmer, GeneAmp 9600) koristeći okruglo 25 temperaturnih ciklusa (94°C kroz 1 min, 50°C kroz 2 min, i 72°C kroz 3 min) i nakon toga krajnji 5 min. korak na 72°C. Primeri (na 40 uM koncentracije svaki), specificirani iznos predloška, i 2,5 jedinica Taq polimeraze (Perkin Elmer Cetus) je upotrijebljeno u završnom volumenu od 50 ul sa reakcijskim puferom koji je preporučio proizvođač.

Tri primarne PCR reakcije su inicijalno izvedene sa 10 ng predloška po reakciji, koristeći primerske parove AL sa BL, CL sa DL, EL sa FL pojedinačno. Produkti tih PCR reakcija, fragmenti ABL, CDL i EFL pojedinačno su pročišćeni uporabom Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen Ltd, Surrey, UK, produkt #28104) slijedeći protokol koji je preporučio proizvođač. Fragmenti ABL i CDL su spojeni upotrebom jedne desetine svakog pročišćenog produkta, i smještene u rekombinantnu PCR reakciju sa primerima AL i DL. Produkt te reakcije, fragment ADL je pročišćen kao i iznad, i jedna desetina produkta je spojena u rekombinantnu PCR reakciju sa jednom desetinom pročišćenog EFL uz upotrebu primera AL i FL. Finalni humanizirani rekombinant laganog lanca PCR produkta, AFL, je vezan u pCTTM II sa «TA Cloning Kit» (Invitrogen BV, Leek, Nizozemska, produkt #K2000-01) slijedeći protokol koji je preporučio proizvođač.

Plazmidini izolati su sekvencionirani upotrebom ABI fluorescentnog sekvencionera.

(ii) Teški lanac

Ljudski poredak sekvenci koji je homologan sa mišjim poretkom sekvenci je dokazan za teški lanac. Najviše homologna sekvenca u bazi podataka za teški lanac je:

Locus: HUMSIGVS 423 BP mRNK

Definicija: Ljudski Ig mišji-lanac mRNK V3b-D-J4 regija 5` kraj

Izvor: Homo sapiens cDNK do mRNK

Autori: Sanz, I. i sur. VH sekquebce of human autoantibody. Evidence that autoantibodies can be unmutated copis of germline genes. J. Immuno. 142, 883-887, 1989.

Postoji sedamnaest razlika između amino kiselinske sekvence mišjeg promjenjivog poretka sekvenci teškog lanca i homologne ljudske promjenjive sekvence poretka teškog lanca. U pet pozicija 49, 66, 76, 77 i 94 mišje amino kiseline su se podudarale. Na ostalim pozicijama ljudske amino kiseline su korištene za humaniziranje poretka teškog lanca.

Niz ljudskih promjenjivih sekvenci teškog lanca je proizveden u GCG programu te je iskorišten za dokazivanje tihih mjesta za slijedeće enzime:

Eagl, Nhel, Xbal; Xhol; Xmal

Promjene u nukleotidnoj sekvenci su napravljene da uključe ta restrikcijska mjesta enzima bez promjene amino kiselinske sekvence. Nazočnost tih mjesta je uključena da se lakše napravi rez i bojenje fragmenta PCR klona.

Hind III restrikcijsko mjesto za kloniranje, Kozak sekvenca za početak transkripcije, i mišja signalna sekvenca (MAWVWTLLFLMAAAQSAQA – SEKV. ident. broj 16) za proteinsku sekreciju su dodani 5` kraju humanizirane promjenjive regijske sekvence teškog lanca. Spel restrikcijsko mjesto je dodan na 3` kraj za kloniranje.

Humanizirani promjenjivi poredak teškog lanca sa mišjim CDRima je izgrađen u PCRu uz upotrebu dugih preklapajućih oligonukleotida: Osam oliga je sintetiziralo približno 60 parova baza sa 15 parova baza koji se preklapaju. Oligo su kako slijede:

AH: SEKV. ident. broj: 29. 5` ACA CgA AGC TTC ACC ATg gCT Tgg gTg Tgg ACC TTg CTA TTC CTg ATg gCg gCC gCC CAA 3`

BH: SEKV. ident. broj: 30. 5` CTT TAC CAA gCC TCC CCC AgA CTC CAC CAg CTg CAC CTC TgC TTg ggC ACT TTg ggC ggC CgC CAT 3`

CH: SEKV. ident. broj: 31. TTg gTA Aag CCC ggg ggg TCC CTT AgA CTC TCC TgT gCA gCT AgC ggA TTC ACT TTC AgT 3`

DH: SEKV. ident. broj: 32. 5` CCC CTT CCC Tgg AgC CTg gCg gAC CCA ggA CAT CCA gTA gCC ACT gAA AgT gAA TCC gCT 3`

EH: SEKV. ident. broj: 33. 5` ggg AAg ggg CTC gAg Tgg gTT gCT gAA ATT AgA TTg AAA TCT gAT AAT TAT gCA ACA CAT 3`

FH: SEKV. ident. broj: 34. 5` ATC ATC TCT TgA gAT ggT gAA TTT CCC CTT CAC AgA CTC CgC ATA ATg TgT TgC ATA ATT 3`

GH: SEKV. ident. broj: 35. 5` ATC TCA AgA gAT gAT TCA AAA TCT AgA CTg TAT CTg CAA Atg AAC AgC CTg AAA ACC gAg gAC ACA 3`

HH: SEKV. ident. broj: 36. 5` ggT gAC TAg TgT TCC CTg gCC CCA gTC TAT gAA ATC TgT ACA gTA ATA CAC ggC TgT gTC CTC ggT TTT 3`

Mišji CDRi su cijepljeni na predlošku uz korištenje rekombinantnog PCR. PCR je izveden upotrebom programibilnog termičkog ciklusa (Trio; Biometra). 50 μl reakcije sadržava 2,5 jedinica AmpliTa polimeraze (Perkin-Elmer-Cetus, Beaconsfield, UK) u puferu koji je opskrbio proizvođač, pufer koji osigurava poželjni pH i ionsku snagu za pojačavanje (10mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl i 1,5 mM MgCl2), 200 μM od svakog dATP, dCTP, dGTP, i dTTP, i primere za pojačavane na 1 μg/μl. Uzorci su grijani na 94°C kroz 2 minute u grijanom bloku, zatim se centrifugirani kroz 30 sec. Na 16,000xG. Uzorci su zatim smješteni na led kroz 1 min, zatim je dodana Taq polimeraza i kap mineralnog ulja na svaki uzorak. Uzorci su miješani, zatim su centrifugirani kroz 30 sec na 16,000xG. Uzorci su smješteni u termalno kolo koje je programirano kako slijedi:

Korak 1: 94°C kroz 1 minutu

Korak 2: 50°C kroz 2 minute, podižući do koraka 3 za 0,4°C/sekundi

Korak 3: 72°C kroz 3 minute, idi na korak 1 i okreni sve 25 puta

Sedam primarnih PCR reakcija je inicijalno izvedeno sa 1 μg/μl od svakog primera po reakciji, uz korištenje primerske kombinacije AH i BH, CH i DH, EH i FH, GH i HH; AH BH CH i DH EH FH GH i HH; AH BH CH i DH, EH i FH GH i HH. 1 ul dio u primarnoj PCR reakciji produkta je kombiniran sa primerima (1 ug/ul) i smješten je u iste PCR reakcijske uvjeta koji su opisani za primarnu PCR reakciju da se stvori puna dužina promjenjive regije teškog lanca. Primarni reakcijski PCR fragmenti AFH i EHH fragment, AHH, fragmenti ABH, GHH i AHH, fragmenti ABH, CDH, EFH i GHH, fragmenti ABH, CDH, EFH, GHH i AHH su kombinirani sa primerima AH i HH. Sve PCR reakcije su dale punu dužinu fragmenata. Promjenjiva regija humaniziranog teškog lanca PCR produkta od ABH, GHH, i AHH reakcije je pročišćena uz pomoć Wizard PCR Preps DNK Purification Sistem (Promega) slijedeći protokol koji je preporučio proizvođač. Pročišćeni produkt je izrezan sa Hind III i Spe I i zatim je kloniran u pUC vektor koji sadrži konstantnu regiju mutiranog IgG1 (vidi ispod).

Pravljenje humaniziranih antitijela

Promjenjiva regija PCR produkta humaniziranog teškog lanca je izrezana sa Hind III i Spe I i zatim je klonirana u pUC vektor koji sadrži konstantnu regiju mutiranog IgG1 (vidi ispod). Promjenjive regije klona su sekvencionirane, crtež 3 i 4 (SEKV. ident. broj 17 i 18). Klon sadrži ispravnu humaniziranu promjenjivu amino kiselinu teškog lanca koja je odabrana. Taj klon ima tihi nukleotid promijenjen u modelu humanizirane promjenjive sekvence teškog lanca.

IgG1 sa mutacijama eliminira C1q, a Fc spajanje je upotrijebljeno za konstantnu regiju humaniziranog teškog lanca. Te mutacije su bazirane na slijedeća dva rada: Duncan, A.R. i Winter, G. Localization of the C1q binding site on antibodies by surface scanning. Nature 332, 738-740, 1988 i Duncan, A. R., Woolf, J. M., Partidge, L. J. Burton, D. R. i Winter, G. Localisation of the binding site for human FcR1 on IgG. Nature 332, 563-564, 1988.

Mutirane rezidue su prikazane u Kabat, E. A., Wu, T. T. , Perry, H. M., Gottesman, K. S. i C. Foeller, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Volumen 1, strana 680.

Promjene napravljene na IgG1 da se stvori IgG1 izotop smanjene citototoksičnosti su kako slijede: 248 Leu (CTg) do Ala (gCg) i 250 Gli (ggA) do Ala (gCA).

Te mutacije su napravljene na mjestu direktne mutageneze ljudskog IgG1 kako slijedi:

Konstantne regije oligo PCR koje su upotrijebljene za dobivanje IgG1 sa mutacijama su:

SEKV. ident. broj 37 Ac gCT gCT CCT TTT AAg CTT Tgg ggT CAA ggC TCA CTA gTC ACA gTC TCC

SEKV. ident. broj 38 Bc TgA Cgg TgC CCC CgC gAg TTC Agg

SEKV. ident. broj 39 Cc CCT gAA CTC gCg ggg gCA CCg TCA

SEKV. ident. broj 40 Dc AAg CTT CCg TCg AAT TCA TTT ACC Cgg AgA CAg

Oligo Ac sadrži Hind/Spel mjesto. Oligo Bc i Cc sadrže mutacije u poziciji 248 i 250. Oligo Dc sadrži Eco R1 mjesto. Oligo Ac i Bc su upotrijebljeni za stvaranje fragmenata AB uz korištenje PCR specificiranih uvjeta opisanih u General Methodology section of this application and cloned human IgG1 constant region as template (Reichmann, L., Clark, M., Waldmann, H., i Winter, G. (1988) Resharping human antibodies for therapy, Nature 322, 323-327). Oligo Cc i Dc su upotrijebljeni za stvaranje fragmenta CD uz korištenje istih PCR uvjeta kao predložak za AB. PCR fragmenti AB i CD su pročišćeni uporabom Wizard PCR Preps DNK Purification Sistem (Promega). PCR fragmenti ABc (5,0 ul) i CDc (5,0 ul) su kombinirani sa oligo Ac i Dc na način da stvore fragment ADc koji sadrži konstantnu regiju IgG1 sa mutacijama. Fragment ADc je pročišćeni uporabom Wizard PCR Preps DNK Purification Sistem (Promega), digestiran sa Hind II i Eco R1, zatim ligiran u Hind III – EcoR1 digestiran PEE6 plazmid koji sadrži promjenjivu regiju humaniziranog anti-CD23 teškog lanca.

Konstantna regija je sekvencionirana da potvrdi mutacije. Fragment koji sadrži te mutacije je premješten na ekspresionirani plazmid pEE6 koji sadrži promjenjivu regiju humaniziranog anti-CD23 teškog lanca.

Promjenjiva regija humaniziranog PCR produkta laganog lanca je izrezana sa Hind III i BsiW1, i zatim je klonirana u ekspresiju plazmida pEE12 koji sadrži konstantnu regiju ljudskog kappa laganog lanca a koja je opisana iznad. Klonovi su sekvencionirani uporabom ABI fluorescentnog sekvencera a taj odabrani klon sadrži ispravnu amino kiselinsku sekvencu za promjenjivu regiju humaniziranog lakog lanca.

Bgl II – Sal I fragment sadrži humanizirani anti-CD23 teški lanac iz pEE6 plazmida koji je ligiran na Bam H1 – Sal I mjesto pEE12 plazmid koji sadrži humanizirani anti-CD23 teški lanac na način da se napravi jedan plazmid koji će sadržavati oba humanizirana anti-CD23 teška lanca. Sekvencionirana je promjenjiva i konstantna regija humaniziranog teškog lanca i promjenjiva i konstantna regija humaniziranog laganog lanca u finalnoj ekspresiji plazmida.

Prolazna ekspresija humaniziranog antitijela

Plazmid sa humaniziranim anti-CD23 je tranfekcioniran u COS stanice i prolazno je ekspresioniran uz upotrebu istog protokola koji je opisan za kimerna antitijela iznad. Ekspresionirani plazmid sa ljudskim anti-CD23 je tranfekcioniran u COS stanice i prolazno ekspresioniran kako je opisano i za kimernu anti-CD23 prolaznu ekspresiju.

Koncentracija kimernih i humaniziranih anti-CD23 antitijela zahtijevanih za polovicu-maksimuma spajanja s sCD23 je pokusno upotrijebljena s sCD23 a ELISA pokus je već opisan. Optička gustoća na 405 nm je unesena u dijagram nasuprot stupnju koncentracije antitijela koja stvaraju sigmoidalnu krivulju sa «dobrim položajem» u korelaciji koeficijenta 1. Optička gustoća je očitana uz pomoć molekularne naprave za čitanje s posudica (Menlo Park, Calif., SAD) i Softmax (Molecular Devices Corp) softvera za izračunavanje najbolje prilagodbe sa log-logit algoritmom i zatim prikazuje krvulju danu jednadžbom parametra i koeficijentom korelacije. Rasprave prilagodbi krivulja dane su u «Data Analysis and Quality Control of assays: A Practical Primer», od R. P. Channing Rogers u Practical Immuno Assay, pisca Wilfrid Butt; objavljuje Marcel Dekker, Inc., New York 1984. Algoritam prilagodbi krivulja za log-logit sustav jednadžbi je baziran na Levenberg-Maquardt postupku. Rasprava o tom postupku može se naći u Numerical Principles in C: The Art of Science computing by William H Press, Brian P Flannery, Saul A Teukolski i William T Vetterling, a objavio ga je Cambridge University Press, New york, 1988. Iznos za x u ng/ml je uračunat u slijedećim jednadžbama:

x = c x [a - y] 1/b

[y - d]

kada y + d – c

2

i kada

je d y-vrijednost koja odgovara ravnoj crti za visoke vrijednosti x-osovine a i ako y-vrijednost odgovara ravnoj crti za male vrijednosti x-osovine

c je x-vrijednost za među točku između a i b

b opisuje kako rapidno zavoj radi svoju transformaciju iz ravne crte u centar zavoja, tipično 1.

Polovica-maksimalnog spajanja sCD23 sa kimernim anti-CD23 je 16,28 ng/ml (vidi crtež 5). Polovica-maksimalnog spajanja je konstantna za humanizirani anti-CD23 i ona iznosi 15,03 (vidi crtež 6). Ovi podaci pokazuju da humanizirani anti-CD23 ima ekvivalentno spajanje sa kimernim anti-C23 koji je kompletna promjenjiva regija mišjeg C11.

Stabilna ekspresija

Stabilna linija stanica ekspresioniranih humaniziranih anti-CD23 je izabrana upotrebom glutaminin sintetaze sistema za pojačavanje gena dobivenog u Celtech. Osnovni sistem je kako slijedi opisao Bebbington i sur., 1992, Biotechnology 10, 169-175. Sistem opisuje pravljenje prikladne linije stanica uvođenjem linearizirane ekspresije vektora koji sadrži cDNK koja kodira hrčkovu glutamin sintetazu pod kontrolom SV40 ranog promotora i isprepletenog SV40 i poliadenilacijskog signala te cDNK za teški i lagani lanac antitijela u stanice sisavca pomoću elektroporacije. Transfektirane stanice su zatim odabrane po sposobnosti za rast u sredstvu slobodnom od glutamina. NSO stanice (ne-imunoglobulinske sekrecijske mišje mieloma B stanice) su upotrijebljene za pravljenje humanizirane anti-CD23 stabilne linije stanica koja raste u Iscove`s Modified Dulbecco`s Medium (Sigma) sa 2 mM glutamina (GIBCO/BRL) i 10% fetalnom serumu teleta (Hyclone) (ne-selektivno sredstvo). Anti-CD23 linija stanica je napravljena kako slijedi. Ekspresija plazmida koja sadrži humanizirane anti-CD23 (40 ug) je linearizirana sa FsP1 (New England Biolabs), etanolnim precipitatom te je resuspendirana u 50 μl sterilne vode. Brojan je eksponencijalni rast NSO stanica. Stanice (107) su centrifugirane i jednom isprane u fosfatnom slanom puferu (PBS). Stanice su resuspendirane u 950 μl sterilnog PBS. DNK a zatim i stanice su dodane u elektroporacijsku kivetu (0,4 mm, Bio-Rad) na ledu. Kiveta je smještena u Bio-Rad elektroporator i isporučena su dva uzastopna pulsa od 1500 volti sa 3 μF. Kiveta je uklonjena iz elektroporatora i smještena na led. Stanice su razrjeđene od 104, 103, 102 stanica/ml u ne-selektivnom sredstvu i smještene su u 96 posudica (Costar), 50 μl/sastojku. Slijedeći dan 150 μl Iscove`s Modified Dulbecco`s Medium (Sigma) sa 60 μg/ml glutaminske kiseline (Sigma), 60 μg/ml asparagina (Sigma), 7 μg/ml od svakog adenozina (Sigma), gvanozin (Sigma), citidin (Sigma), uridin (Sigma) i timidin (Sigma), i 10% fetalnog seruma teleta (Hyclone) (selektivno sredstvo) je dodano svakom sastojku. Posudice su vraćene na 37°C u inkubator i ostavljene sve dok se nije pojavila supstancijalna stanična smrt te su se pojavile diskretne kolonije koje su preživjele.

Kolonije su premještene iz mase od 96 sastojaka u jedan sastojak sa 24 posudice, zatim poslije nekoliko dana, masa sastojaka iz 24 posudice je upotrijebljena za inokuliranje u bočicu od 25 ml. Potrošeno sredstvo je isključeno sa svježim selekcijskim sredstvom da se izvede bolja ekspanzija. Jednom u bočici, kulture su održavane između 105 i 106 stanica/ml. specifično dobiveni odnos (SPR) 144 klonova je izveden da se usporedi dobivanje antitijela svakog klona tako da najveća produkcija klona bude izabrana kao produkcijska linija. SPR je izveden uzimanjem 106 stanica iz smjese iz bočice, a zatim su stanice isprane sa PBS, te je stanicama dodano 10 ml svježeg sredstva kro 24 sata na 37°C. Dobivanje antitijela je mjereno pomoću ELISA pokusa.

Klonovi koji su prvi zaštićeni za dobivane ljudskih IgG koriste ELISA pokus kako slijedi. EIA/RIA posudice (Costar) su prekrivene sa 100 μl/sastojka sa 5 μg/ml kozjeg anti-ljudskog IgG (Jackson Immunoresearch Labs #109-001-003) u 35 mM NaHCO3, 15 mM Na2CO3, pH 9,3 na 4°c preko noći. Posudice su isprane tri puta sa 150 mM NaCl, 50mM Trizma baze, 0,1% (tež/tež) Tween-20, pH 7,4 (TBS/Tween), blokirane kroz 1-2 sata na 2°C sa 100 μl/sastojku 2% kravljeg serum albumina u TBS/Tween, i zatim su isprane tri puta sa TBS/Tween. Jedna stotina mikrolitre kontrolnog Campath-1H IgG [age, M. J. i Sydenham (1991) (iznad)] standard (1000 ng/ml – 1 ngml) dodano je kontrolnom sredstvu ili uzorku supernatanta, u triplikate, u sastojak te je inkubirano preko noći na 4°C. Posudice su isprane pet puta sa TBS/Tween i 100 μl od 1:5000 otopine kozje anti-ljudske alkalne fosfataze je konjugirano (Jackson Immunoresearch Labs #109-055-088) te je dodano i inkubirano kroz 2 sata na 22°C ili preko noći na 4°C. Posudice su isprane pet puta sa TBS/Tween i dodano je100 μl od 3 nM pNPP u puferskom supstratu (Sigma 104-0) i posudice su očitane na 405 nm na mikrotitracijskom čitaču posudica (Molecular Devices) upotrebom 20 minutnog kinetičkog programa. Standardni zavoji i uzorak koncentracije IgG je uračunat i unesen je direktno u program. SPR je izražen kao μg/ 106 stanica/ 24 sata. SPRi od 144 klona opsega od 14 – 0 μg/106 stanica/24 sata. Klonovi koji su izraženi na najmanje 5μg / 106 stanica/ 24 sata su također testirani na spajanje s sCD23 upotrebom ELISA pokusa koji je već opisan. Kimerni CD23 je upotrijebljen kao standard za te pokuse.

Liza komplemenata i ADCC pokusi

FITC koji je označen kao humaniziran anti-CD23 je upotrijebljen da potvrdi ekspresiju površine CD23 na RPMI stanicama sa tekućom citometrijom. Te iste stanice su obojene sa FITC označenim humaniziranim anti-CDw52 antitijelima (hCD52) i nađeno je da su negativne za CD52 ekspresiju. Naprotiv, Wein 133 obojane stanice su pozitivne na hCD52 ali negativne za anti-CD23.

RPMI 8866 stanice su obojane sa europium dietilen triaminopentaacetatom (Eu/DTPA) dok su Wein 133 stanice označene sa samarium dietilen triaminopentaacetatom (Sm/DTPA) u skladu sa postupcima koje je opisao (Blomberg, K, 1993, J. Immunol. Methods 168, 267 Patel i sur, 1995, J. Immunol. Methods 184, 29). A1:1 mješavina označenih Wein 133 stanica i RPMI 8866 stanice su zatim lizirane sa jednim ili drugim hCD52 ili anti-CD23 uz prisutnost NHS kao izvora komplementa. Aktivacija komplementa kroz klasične ulazne putove sa hCD52 uzrokuje otpuštanje Sm/DTPA. Nijedan Sm/DTPA nije otpušten u prisutnosti anti-CD23. podaci potvrđuju da samo hCD52 i ne anti-Cd23 uzrokuju lizu Wein 133 stanica. Podaci nadalje potvrđuju da se ulazni putovi komplementa budu aktivirali da uzrokuju lizu stanica. Nijedan Eu/DTPA iz RPMI 8866 nije otpušten sa hCD52 kako je unaprijed očekivano. Mada RPMI 8866 stanice izražavaju CD23, nijedan Eu/DTPA nije otpušten sa anti-CD23, prikazujući tako da su antitijela nesposobna aktivirati komplement.

Liza 1:1 mješavine označenih Wein 133 stanica i RPMI 8866 sa antitijelima ovisi o staničnoj citotoksičnosti (ADCC) te je pokušana sa oba anti-Cd23 ili hCD52 u prisutnosti monklirnih stanica periferne krvi (PBMC). Otpuštanje Sm/DTPA sa hCD52 i ne anti-Cd23 potvrđuje da je samo kasnije nemoguće djelovati lizi ADCC na Wein 133 stanice. To ne iznenađuje, otkad Wein 133 stanice ne izražavaju CD23. Nijedno od antitijela ne uzrokuje otpuštanje Eu/DTPA. To nas upućuje da iako je ekspresija CD23 potvrđena na RPMI 8866 stanicama pomoću tekuće citometrije, a nije otkriveno da ADCC djeluje na lizu stanica sa anti-CD23.

Kinetička analiza

Odnos udruživanja, odnos razdruživanja i konstantni odnos razdruživanja za spajanje humaniziranih anti-Cd23 na CD23 antigen je ocjenjivano na Biacore Biosensor. Ukratko, pročišćeni rekombinant CD23 je imobiliziran na CMC osjetljivu površinu. Karboksilna skupina na površini dekstrana je aktivirana sa 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbamid (EDCO/N-hidroksisukcimimid) (NHS). Slijedeći aktivaciju, rekombinantni CD23 je prošao preko površine da inicira imobilizaciju. Zatim je dodan etanolamin da se poliju rezidualne aktivne skupine. Humanizirana anti-CD23 otopljena u HBS puferu su pasirana preko osjetljive površine. Spajanje anti-CD23 na imobilizirane CD23 je praćen u pravom vremenu za ocjenu odnosa združivanja (M-1 sec-1). Disocijacija CD23 i anti-CD23 kompleksa u puferu je također praćena za ocjenu odnosa disocijacije (sec-1). Konstanta disocijacije (nM) izračunata iz odnosa disaocijacije i združivanja. Za 6 serija anti-CD23 podaci pokazuju odnos združivanja u opsegu od 1,5-1,8x106 M-1 sec-1 i odnos disocijacije od 1-2x10-5 sec-1. Za konstanta disocijacije za anti-CD23 je nađeno da je unutar 8-12 pM. Određena je konstanta afiniteta na približno 9x1010 Ka mo1-1.

Claims (19)

1. Antitijelo, naznačeno time, da ima dovoljno amino kiselinskih sekvenci za svaki CDR prikazan ispod kao i da je antitijelo sposobno spajati CD23 (FCεRII) tip II molekule ekspresionirane na hematopoetskim stanicama: RSSKSLLY KDGKTYLN CDRL1 (SEKV. ident. broj: 3) LMSTRAS… CDRL2 (SEKV. ident. broj: 5) QQLVEYPFT CDRL3 (SEKV. ident. broj: 7) GYWMS… CDRH1 (SEKV. ident. broj: 9) EIRLKSDNYATHYAESVKG CDRH2 (SEKV. ident. broj: 11) FID… CDRH3 (SEKV. ident. broj: 13).

2. Antitijelo, naznačeno time, da spaja CD23 (FCεRII) tip II molekule ekspresioniran na hematopoetskim stanicama ili topivom CD23 kojeg karakterizira konstantni afinitet jednak ili veći od 1x109 Ka Mo1-1.

3. Antitijelo, naznačeno time, da kompetitivno inhibira spajanje antitijela koje ima CDR sekvence izvedene u zahtjevu 1, sa CD23 (FCεRII) tip II molekule ekspresionirane u hematopoetskim stanicama.

4. Antitijelo u skladu sa bilo kojim od prethodnih zahtjeva, naznačeno time, da je to izmijenjeno antitijelo.

5. Antitijelo u skladu za zahtjevom 4, naznačeno time, da je to humanizirano antitijelo.

6. Antitijelo u skladu sa bilo kojim prethodnim zahtjevom, naznačeno time, da poredak laganog lanca uključuje amino kiselinske rezidue na bilo kojoj od pozicija 49, 66, 76, 77 i 94.

7. Antitijelo u skladu sa bilo kojim prethodnim zahtjevom, naznačeno time, da poredak laganog lanca uključuje amino kiselinske rezidue svojih mišjih antitijela na poziciji 64.

8. Antitijelo, naznačeno time, da sadrži jednu ili obje amino kiselinske sekvence u skladu sa SEKV. ident. broj sekvence: 1 i 2.

9. Antitijelo, naznačeno time, da sadrži jednu ili obje amino kiselinske sekvence u skladu sa SEKV. ident. broj sekvence 17 i 18.

10. Antitijelo u skladu sa bilo kojim prethodnim zahtjevom, naznačeno time, da konstantna regija sadrži Ala na poziciji 235 i Ala na poziciji 237 po Kabatovom sistemu označavanja.

11. Antitijelo u skladu sa bilo kojim prethodnim zahtjevom, naznačeno time, da je za upotrebu u terapiji ljudi.

12. Upotreba antitijela prema zahtjevima od 1-10, naznačena time, da se koristi u proizvodnji medikamenata za liječenje slijedećih poremećaja artritis, lupus erythematosus, Hashimoto tiroiditis, multipla skleroza, diabetes, uveitis, dermatitis, psorijaza, urtikarija, nefrotični sindrom, glomerulonefritis, upale potrbušnice, ulcerativni kolitis, Kronova bolest, Sjorgenov sindrom, alergije, specifične astme, alergijska ili urođena astma, akutna asmatska egzarcebacija, rinitis, ekcem, GVH, COPD, inzulitis, bronhitis (naročito kronični bronhitis) ili dijabetes (naročito Tip 1 dijabetes), i malignosti B-stanica.

13. Upotreba antitijela, naznačena time, da spaja CD23 (FCeRII) tip II molekule ekspresionirane na hematopoetskim stanicama u proizvodnji medikamenta za blokiranje topive CD23 formacije.

14. Upotreba antitijela u skladu sa zahtjevom 13, naznačena time, da je antitijelo prema bilo kojim od zahtjeva 1–10.

15. DNK sekvenca koja kodira lanac antitijela, naznačena time, da sadrži jednu ili više sekvenci u skladu sa: CDRL1 baza brojevi parova od 70-117 na crtežu 3 (SEKV. ident. broj sekvence: 4) CDRL2 baza brojevi parova od 163-183 na crtežu 3 (SEKV. ident. broj sekvence: 6) CDRL3 baza brojevi parova od 280-306 na crtežu 3 (SEKV. ident. broj sekvence: 8) CDRH1 baza brojevi parova od 91-105 na crtežu 4 (SEKV. ident. broj sekvence: 10) CDRH2 baza brojevi parova od 148-204 na crtežu 4 (SEKV. ident. broj sekvence: 12) CDRH3 baza brojevi parova od 301-309 na crtežu 4 (SEKV. ident. broj sekvence: 14).

16. DNK sekvenca koja kodira lanac antitijela, naznačena time, da sadrži jednu ili obje kodirane sekvence od sekvenci u skladu sa SEKV. ident. broj sekvence: 1 i 2.

17. DNK sekvenca koja kodira lanac antitijela, naznačena time, da sadrži jednu ili obje sekvence u skladu sa SEKV. ident. broj sekvence: 17 i 18.

18. Farmaceutska formulacija, naznačena time, da sadrži antitijelo kako je definirano u bilo kojem od zahtjeva od 1 do 10 i farmaceutski prihvatljivi ekscipient.

19. Farmaceutska formulacija, naznačena time, da sadrži antitijela kako je definirano u bilo kojem od zahtjeva od 1 do 10 u kombinaciji sa imunomodulatorima ili anti-upalnim sredstvima i farmakološki prihvatljivim ekscipientom.