FR3063730A1 - Composes-clips surfactants pour l'extraction et la stabilisation en solution de proteines membranaires - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte à un composé de formule (I) : telle que définie dans la description. La présente invention se rapporte également à un procédé d'extraction de protéines membranaires associées à une membrane biologique, comprenant une étape de mise en contact d'une solution aqueuse de protéines membranaires associées à la membrane biologique avec au moins un composé de l'invention. La présente invention se rapporte en outre à un procédé de stabilisation de protéines membranaires en solution dans une solution aqueuse, comprenant une étape (i) consistant à mettre en contact une solution aqueuse d'une protéine membranaire en solution avec au moins un composé de l'invention.
Description
DESCRIPTION
Domaine technique
La présente invention se rapporte à des composés surfactants et leur utilisation pour l’extration et la stabilisation en solution de protéines membranaires extraites en solution aqueuse.
La présente invention trouve une application industrielle dans le domaine de la biochimie ainsi que dans le domaine médical, et notamment dans le domaine de la conception de médicaments assistée par la structure des cibles.
Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte.
État de la technique
La structure des protéine membranaires (PMs) est instable en dehors de la membrane lipidique qui les entoure. C’est le cas lorsqu’on les extrait des membranes à l’aide de détergents, pour ensuite les purifier et les cristalliser ou les utiliser comme antigènes. Il est cependant impératif que cette structure soit effectivement celle qu’adopte la PM dans sa membrane d’origine et ne soit pas plus ou moins altérée par le processus d’extraction qui est réalisé à l’aide de détergents.
Plus d’une centaine de détergents sont proposés sur le marché pour extraire les PMs. Excellents compétiteurs des lipides dans lesquels sont enchâssées les PMs, ils extraient ces dernières avec une grande efficacité. Celle-ci tient en partie au fait que les détergents s’échangent très vite avec le milieu, contrairement aux lipides (Israelachvili, J. N., Mitchell, D. J. & Ninham, B. W. Theory of self-assembly of lipid bilayers and vesicles. Biochimica et
Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 470, 185-201 (1977) ([1])). Cette forte capacité d’échange entraîne par contre une déstabilisation du domaine membranaire des PMs qui, moins bien maintenu qu’avec des lipides, tend à se déstructurer dans le temps. On observe aussi une agrégation des PMs du fait de l’exposition temporaire des régions hydrophobes des PMs qui s’associent entre-elles pour se protéger mutuellement du milieu aqueux.
Sur le plan de la conception de médicaments, l’enjeu est majeur pour les industries qui adoptent une stratégie de conception de médicaments assistée par la structure des cibles (« Structure-Based Drug Design »). En effet, parmi les 324 cibles pharmacologiques identifiées à ce jour, plus de 60% sont des PMs, et on estime que le nombre de cibles dépassera à terme les 3000 dont 80 % seront membranaires (Overington, J. P., Al-Lazikani, B. & Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nat Rev Drug Discov 5, 993-996 (2006) ([2])). Cette stratégie implique de connaître la structure 3D de la cible, apo ou associée à son ligand, pour développer une génération de modulateurs optimisés sur une base structurale (Mason, J. S., Bortolato, A., Congreve, M. & Marshall, F. H. New insights from structural biology into the druggability of G protein-coupled receptors. Trends in Pharmacological Sciences 33, 249-260 (2012) ([3]) ; Schaffhausen, J. Advances in structurebased drug design. Trends in Pharmacological Sciences 33, 223 (2012) ([4]) ; Shoichet, B. K. & Kobilka, B. K. Structure-based drug screening for G-proteincoupled receptors. Trends in Pharmacological Sciences 33, 268-272 (2012) ([5])). Pour autant, il faut disposer de données structurales, effectivement représentatives de l’état natif de la protéine. C’est ce qui est nettement le plus limitant quand la cible est membranaire, et dans ce contexte, de nouveaux outils qui lèvent cette limitation ont un impact majeur sur ce type d’approches.
Sur le plan de la vaccination, les cibles sont majoritairement accessibles à la surface des pathogènes et donc ancrées ou enchâssées dans la membrane plasmique. Extraire et maintenir des PMs cibles, quelquefois homo- et/ou hétéro-oligomériques, dans leur état natif le temps qu’elles soient prises en charge par le système immunitaire permet d’améliorer la qualité des anticorps, leur efficacité étant directement liée à l’intégrité structurale des protéines injectées. C’est également important sur le plan de la production des antigènes, qui correctement conformés peuvent être injectés à plus faible dose, ce qui permet un gain d’échelle.
Le design de détergents plus stabilisants est un champ de recherches très actif. Ainsi parmi les meilleurs détergents stabilisants, ont été récemment développés les lauryl maltoside néopentyl glycols (LMNG), comportant 2 chaînes grasses courtes pour mimer les lipides (Chae, P. S. et al. Maltoseneopentyl glycol (MNG) amphiphiles for solubilization, stabilization and crystallization of membrane proteins. Nat Meth 7, 1003-1008, (2010) ([6])). Des détergents basés sur des acides biliaires ont aussi été développés (Chae, P. S. et al. Tandem Facial Amphiphiles for Membrane Protein Stabilization. Journal of the American Chemical Society 132, 16750-16752 (2010) ([7]); Zhang, Q. et al. Designing Facial Amphiphiles for the Stabilization of Intégral Membrane Proteins. Angewandte Chemie International Edition 46, 7023-7025 (2007) ([8]) ; Lee, S. C. et al. Steroidbased facial amphiphiles for stabilization and crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110, E1203-1211 (2013) ([9])). Le design de ces molécules est basé sur des concepts classiques tel que balance hydrophilehydrophobe, ce qui limite leur potentiel. Une autre génération de détergents incorporant des fonctions acide faible a permis de gagner en stabilité, basés sur un squelette calix[4]arénique (Suwinska, K. et al. Tri-Anionic Calix[4]arene Monoalkyl Dérivatives: Synthesis, Solid-State Structures and Self-Assembly Properties. New Journal of Chemistry 32, 1988-1998, (2008) ([10]); Matar-Merheb, R. et al. Structuring détergents for extracting and stabilizing functional membrane proteins. PLoS One 6, e18036, (2011) ([11])). Ces fonctions acide favorisent la formation de ponts salins multiples avec les acides aminés localisés à l’interface membrane-cytoplasme, en nombre plus important qu’ailleurs dans la protéine (von Heijne, G. The distribution of positively charged residues in bacterial inner membrane proteins correlates with the trans-membrane topology. Embo J 5, 3021-3027 (1986) ([12]) ; Nilsson, J., Persson, B. & von Heijne, G. Comparative analysis of amino acid distributions in intégral membrane proteins from 107 genomes. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 60, 606-616, (2005) ([13]) ; von Heijne, G. Membrane-protein topology. Nat Rev Mol Cell Biol 7, 909-918 (2006) ([14])). Ces détergents calix[4]aréniques absorbent fortement dans l’UV, notamment à 280 nm où les protéines sont le plus souvent détectées, et chélatent les métaux divalents, ce qui peut-être indésirable.
Il existe donc un réel besoin de nouveaux outils palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l’art antérieur, en particulier de nouveaux outils permettant d’extraire les protéines membranaires et d’augmenter leur stabilité en solution aqueuse.
Description de l’invention
Aux termes d’importantes recherches, les Demandeurs ont conçu de nouveaux composés permettant de résoudre ce problème technique.
Les composés de l’invention consistent en une série de surfactants amphiphiles permettant l’extraction de protéines membranaires (PMs), tout en ayant un faible impact sur l’état natif et fonctionnel des PM.
Avantageusement, les composés de l’invention augmentent significativement la stabilité des PMs extraites en solution aqueuse.
Ces molécules présentent la propriété unique de ceinturer la région hydrophobe des PMs comme des clips par une triple capacité d’interaction : 1/ interaction hydrophobe entre les résidus de la région membranaire de la protéine et la chaîne grasse des détergents, 2/ interaction de type Hydrogène, notamment renforcée par la présence d’osides ou chaîne polyéther et 3/ interaction ionique entre les fonctions de type acide faible de la tête polaire du détergent et les résidus basiques dont l’abondance est particulièrement élevée à l’interface membrane-cytoplasme des PMs.
Les molécules de l’invention permettent en outre d’extraire et stabiliser à court et long termes (plusieurs dizaines de jours) les PM à 4°C.
Ces molécules ont en outre la propriété de ne pas absorber dans l’UV et ne pas chélater les cations divalents.
Ainsi, un premier objet de l’invention se rapporte à des composés de formule (I):
Ύ dans laquelle :
OR1
X représente -OH, -O(CH2)2SR1, /N -OCH2—(' I N'-N , -S(CH2)nCH3,
H 9
N—i— (CH2)pCO2R2
CO2R2 ,-co2r2 ou —OCH \,sN
n=n
N'Y H
HC-(CH2)nCH3 —C—(CH2)pCO2R2
Y représente -(CH2)nCH3, (CH2)mCH3 , co2r2 _ -(CH2)2OR1 ou —C—(CH2)pCO2R2 CONHCH2CO2R2
-N 11 i (CH2)nCH3 H O
Z représente -NHCO(CH2)nCH3, (CH2)mCH3 _ -N-U-(CH2)ncy, o
—N—(CH2)pCO2R2 —N—U—pCO2R2
- N—(CH2)pCO2R2 (CH2)qCO2R2 (CH2)pCO2R2 .
J J J et dans laquelle :
R1 représente un monosaccharide, un disaccharide ou le polyéthylène glycol ;
R2 représente H, Na ou K ;
m est un nombre entier allant de 4 à 21 ;
n est un nombre entier allant de 4 à 21 ;
p est un nombre entier allant de 1 à 3 ;
q est un nombre entier allant de 1 à 5 ;
r est un nombre entier allant de 1 à 10 ;
Cy représente le cyclohexyle ;
ou l’un de ses sels pharmaceutiquement acceptables.
On entend par « monosaccharide », au sens de la présente invention, un monomère de glucide comprenant de 3 à 14 atomes de carbone. Il peut s’agir par exemple d’un monosaccharide choisi parmi le glycéraldéhyde, la dihydroxyacétone, l’érythrose, le thréose, l’érythrulose, le désoxyribose, le ribose, l’arabinose, le xylose, le lyxose, le ribulose, le xylulose, l’allose, l’altrose, le galactose, le glucose, le gulose, l’idose, le mannose, le talose, le fructose, le psicose, le sorbose, le tagatose, le fucose, le rhamnose, le sédoheptulose, le mannoheptulose, l’heptahydroxyoctanal, l’acide neuraminique et l’acide sialique, ainsi que leurs dérivés. De préférence, il peut s’agir du glucose. Il peut s’agir d’un monosaccharide cyclique ou acyclique. Parmi les monosaccharides cycliques, il peut s’agir d’un monosaccharide de forme pyranique ou de forme furanique, par exemple le β-D-Glucopyranose.
On entend par « disaccharide », au sens de la présente invention, un diholoside formé par deux monomères de glucide via une liaison osidique. Il peut s’agir d’un homodiholoside ou d’un hétérodiholoside. S’il s’agit d’un homodiholoside, il peut s’agir par exemple d’un homodiholoside de fructose, comme l’inulobiose, ou de mannose, comme le 2alpha-mannobiose ou le 3alpha-mannobiose, ou de glucose, comme le tréhalose, le kojibiose, le nigerose, le maltose, l’isomaltose, le sophorose, le laminaribiose, le cellobiose ou le gentiobiose, ou leurs dérivés. Il peut s’agir par exemple de l’éthylmaltoside. Alternativement, s’il s’agit d’un hétérodiholoside, il peut s’agir d’un hétérodiholoside de glucose-fructose, par exemple choisi parmi, comme par exemple le tréhalulose, le saccharose, le turanose, le maltulose, le leucrose, l’isomaltulose et le gentiobiulose, ainsi que leurs dérivés, ou bien d’un hétérodiholoside choisi parmi le mélibiose, le lactulose, le lactose et le rutinose, ainsi que leurs dérivés.
Dans le cadre de l’invention, m peut être choisi parmi les nombres entiers 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 et 21.
Dans le cadre de l’invention, n peut être choisi parmi les nombres entiers 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 et 21. Il peut s’agir par exemple des nombres 10, 12 ou 14.
Dans le cadre de l’invention, p peut être choisi parmi les nombres entiers 1,2 et 3.
Dans le cadre de l’invention, q peut être choisi parmi les nombres entiers 1,2, 3, 4 et 5.
Dans le cadre de l’invention, r peut être choisi parmi les nombres entiers 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et 10.
Les nombres entiers m, n, p, q et r sont indépendants les uns des autres, et toutes les combinaisons de ces nombres entiers font partie de l’invention.
Dans le cadre de la présente invention, le terme sels pharmaceutiquement acceptables comprend les sels préparés avec des acides ou bases, non toxiques, en fonction des substituants présents sur les composés. Lorsque les composés de l'invention comportent des fonctions acides, les sels correspondants peuvent être obtenus par addition d'une base organique ou inorganique sur le composé sous forme neutralisée en présence éventuellement dans un solvant de préférence inerte. Des exemples de sel d'addition d'une base peuvent être les sels de sodium, potassium, calcium, ammonium, amino (organique), ou magnésium.
Ainsi, l’invention s’entend par exemple d’un composé de formule (I) dans lequel :
OR1
X représente -O(CH2)2SR1 ,
-OCH, ou
-|— (CH2)pCO2R2 CO2R2 — C—(CH2)pCO2R2 —C—(CH2)pCO2R2 ou CONHCH2CO2R2
Y représente C°2R2
H II — N 11 | (CH2)nCH3
Z représente -NHCO(CH2)nCH3 ou (CH2)mCH3
R1 représente un monosaccharide, par exemple le glucose, un disaccharide, par exemple le maltose, ou le polyéthylène glycol ;
R2 représente H, Na ou K ;
m est un nombre entier allant de 4 à 21, par exemple égal à 11 ;
n est un nombre entier allant de 4 à 21, par exemple égal à 8,10, 11, 12, 14 ou 17 ;
p est un nombre entier égal à 1 à 3, par exemple égal à 2 ;
ou l’un de ses sels pharmaceutiquement acceptables.
Dans ce cas, il peut s’agir par exemple des composés du groupe 3.7, par exemple 3.7b, 3.7c, 3.7e, 3.7g, 3.7j, 3.7I, ou du groupe 3.6, par exemple 3.6c, ou du groupe 4.6, par exemple 4.6b ou 4.6d, tels que décrits dans la partie « Exemples » ci-dessous.
Alternativement, l’invention s’entend par exemple d’un composé de formule (I) dans lequel :
X représente -S(CH2)nCH3
Y représente -(CH2)2OR1 ;
H II 9 —N—u—|—CO2R2
Z représente (ch2)pco2r2 .
R1 représente un monosaccharide, un disaccharide, par exemple le matlose, ou le polyéthylène glycol ;
R2 représente H, Na ou K ;
n est un nombre entier allant de 4 à 21, par exemple égal à 11, 13, 15 ou
17;
p est un nombre entier égal à 1 à 3, par exemple égal à 2 ; ou l’un de ses sels pharmaceutiquement acceptables.
Dans ce cas, il peut s’agir par exemple des composés du groupe 5.3, 10 par exemple 5.3a, b, c ou d, et en particulier du composé 5.3a, tels que décrits dans la partie « Exemples » ci-dessous.
D’une manière générale, chacun des composés répondant à la formule (I), et décrits dans la partie « Exemples », et notamment dans les tableaux 1 et 2 de la partie « Exemples » sont des molécules objet de l’invention.
Avantageusement, les molécules de la présente invention n’absorbent pas, ou de façon négligeable, de 220 à 500 nm (et au-delà), et n’empêchent donc pas la détection des protéines à 280 nm.
Avantageusement, les molécules de l’invention ne forment pas un complexe insoluble avec des métaux divalents. Cette absence d’interaction
0 avec des métaux est par exemple très utile lors des étapes de chromatographie de type affinité-métal, qui utilisent du Nickel ou du Cobalt, et qui ne peuvent être mises en oeuvre avec des fortes concentrations de détergents classiques, contrairement aux molécules de l’invention. Elle est aussi très utile pour éviter la précipitation des complexes en présence de
5 calcium et magnésium qui sont des cofacteurs protéiques couramment rencontrés dans le vivant.
Les inventeurs ont mis en évidence expérimentalement qu’il est possible de faire varier la CMC (concentration micellaire critique) des composés de l’invention en faisant varier leurs substituants, par exemple en ίο faisant varier la longueur de la chaîne aliphatique et/ou la taille des têtes polaires, en fonction du but recherché, par exemple éliminer facilement par dialyse ou ultrafiltration un détergent à CMC élevée ou bien conserver celui-ci en utilisant des composés à CMC plus faible.
Les inventeurs ont mis en évidence expérimentalement qu’il est possible de réaliser des extractions sélectives, en fonction des protéines membranaires à extraires, au moyen des molécules de l’invention, en faisant varier leurs caractéristiques techniques, notamment leurs substituants, en particulier lorsque des protéines membranaires d’intérêt est généralement copurifié au moyen des techniques classiques avec un contaminant.
Avantageusement, l’extraction de protéines membranaires au moyen des molécules de l’invention ne provoque pas une diminution de l’activité fonctionnelle des PM une fois celles-ci extraites. Facultativement, l’extraction au moyen des molécules de l’invention peut permettre une augmentation de l’activité fonctionnelle de la PM extraite, ceci étant fonction de la nature de la PM à extraire.
Les inventeurs ont en outre mis en évidence expérimentalement que les molécules de l’invention stabilisent en solution des protéines membranaires au moins 2 fois plus longtemps, par exemple 2 fois, 3 fois, 4 fois, 5 fois, voire plus, qu’un détergent classique.
Les composés de l’invention peuvent être préparés au moyen de toute méthode appropriée connue de l’homme du métier, incluant au moins une des méthodes comprenant le couplage peptidique, déprotection du groupement Fmoc (fluorénylméthoxycarbonyle), formation d’amides, hydrogénation catalytique, déprotection du groupement fBu (fe/ï-butyle), déprotection des esters de méthyle ou d’éthyle, déprotection des groupements Boc, couplage thiol-ène, cycloaddition de Huisgen, réaction de désacétylation, formation des sels de carboxylate (Na, K) et déprotection trityle et couplage thiol-ène. Des protocoles de synthèse de chacun des composés de l’invention sont décrits par exemple dans la partie « Exemple » ci-après.
Un deuxième objet de l’invention se rapporte à un procédé d’extraction de protéines membranaires associées à une membrane biologique, comprenant une étape de mise en contact d’une solution aqueuse de protéines membranaires associées à la membrane biologique avec au moins un composé de formule (I) tel que défini ci-avant.
On entend par « membrane biologique », au sens de la présente invention, tout assemblage de molécules lipophiles en un double feuillet séparant une cellule de son environnement, composée d'une bicouche de lipides amphiphiles, notamment des phospholipides, chaque lipide membranaire étant constitué d'une tête polaire hydrophile orientée vers l’extérieur de la membrane et d'une queue hydrophobe orientée vers l'intérieur. Il peut s’agir d’une membrane de cellule procaryote, de cellule eucaryote, animale - à l’exception des cellules souches embryonnaires humaines - ou végétale, ou d’un virus. S’il s’agit d’une cellule eucaryote, il peut s’agir par exemple d’une membrane plasmique, d’une membrane intracellulaire, comme une membrane nucléaire, un lysosome, un exosome, un proteoliposome, une membrane du réticulum endoplasmique lisse ou rugueux, ou une membrane de l’appareil de Golgi, cette liste n’étant pas limitative. Il peut s’agir en outre d’une cellule-hôte isolée transgénique issue d’une lignée cellulaire dans laquelle un ou plusieurs antigènes d’intérêts sont exprimés, par exemple par des techniques de génie génétique de l’ADN, ou de l’ARN recombinant, ou par infection d’une cellule par un vecteur viral exprimant un ou des antigènes vaccinaux d’intérêt. Toute technique de génie génétique connue de l’homme du métier permettant l’expression d’un transgène dans une cellule peut être utilisée. Il peut s’agir d’une technique impliquant l’expression d’un ADN ou d’un ARN, par exemple un ARNm codant synthétique, introduit dans une cellule par transduction, par exemple par électroporation, micro-injection, ultra-sons, infection, transfection. L’expression peut être par exemple transitoire et/ou inductible et/ou constitutive d’au moins un antigène d’intérêt, comme par exemple décrit dans le document W002090533 ([29]). La cellule peut en outre être toute cellule isolée, notamment à l’exception des cellules souches embryonnaires humaines, par exemple une cellule humaine isolée - les cellules souches embryonnaires humaines étant par exemple exclues -, ou une cellule isolée animale - non-humaine- ou végétale. La cellule isolée peut être issue d’une lignée cellulaire choisie parmi Vero (ATCC No. CCL-81) comme Vero 76 (ATCC No. CRL-1587), CHO comme CHO-KI (CCL 61, ATCC), BHK comme BHK-21 [C-13] (ATCC® CCL-10™), HELA, perC6® (Crucell), HEK293 (ATCC® CRL-1573™), Sf9 (ATCC, CRL-1711), MDCK, par exemple MDCK (NBL-2) (ATCC® CCL-34™), cette liste n’étant pas limitative.
La membrane biologique peut être entière, c’est-à-dire intègre, ou être une fraction de membrane biologique, c’est-à-dire une partie d’une membrane biologique.
On entend par protéine membranaire au sens de la présente invention, une protéine associée aux membranes biologiques, c'est-à-dire soit ancrée, soit intégrale, et non libre de diffusion dans les milieux aqueux. Parmi les protéines membranaires, on peut citer par exemple les protéines de membranes plasmiques et les protéines de membranes intracellulaires, comme par exemple les protéines de membranes mitochondriales, nucléaires ou lysosomales. Il peut s’agir par exemple d’une protéine de transport, par exemple un transporteur ABC, éventuellement choisi dans le groupe comprenant la glycoprotéines P (Pgp/ABCB1), MRP1/ABCC1, MRP2/ABCC2, BCRP/ABCG2 et BmrA. Alternativement, il peut s’agir d’une protéine d’intérêt exprimée de manière transgénique dans une membrane biologique, par exemple les protéines citées ci-dessus et exprimées dans des cellules eucaryotes, comme décrit par Baiceanu et al. (Baiceanu E et al. : « 2-lndolylmethylenebenzofuranones as first effective inhibitors of ABCC2 », Eur J Med Chem. 2016 Oct 21 ; 122:408-18 ([30])) pour ABCB1, C1, C2 et G2, ou BmrA exprimé dans des bactéries (Matar-Merheb, R. et al. ([11])).
La membrane biologique peut être mise en contact avec au moins un composé de formule (I) tel que défini ci-avant, ou au moins deux, ou au moins trois de ces composés, voire plus. Avantageusement, la sélection de plusieurs d’un ou de plusieurs composé(s) de l’invention peut permettre l’extraction sélective d’une protéine membranaire, par exemple pour s’affranchir des contaminants.
Dans le cadre de l’invention, la membrane biologique peut être préalablement mise en solution aqueuse, par exemple dans une solution tampon.
L’étape de mise en contact d’une solution aqueuse comprenant la protéine membranaire à extraire avec au moins un composé de formule (I) peut être réalisée à un pH auquel les groupements carboxyliques des molcules de l’invention sont ionisés, pour maximaliser l’effet clip des molécules. Avantageusemen, le pH est un pH compris entre 5,0 et 12, par exemple un pH de 5,0, ou 6,0, ou 7,0, ou 8,0, ou 9,0, ou 10,0, ou 11,0, ou 12,0.
Le procédé d’extraction de l’invention peut en outre comprendre une étape d’incubation de la protéine membranaire et du composé de l’invention. Le temps d’incubation peut être adapté pour que tout ou partie des protéines membranaires à extraire se retrouvent en solution. Le temps d’incubation peut être déterminé par l’homme du métier qui saura l’adapter en fonction de la membrane à solubiliser et/ou de la protéine à extraire et/ou du rendement d’extraction souhaité. Le temps d’incubation peut être par exemple de 15 minutes, ou de 30 minutes, ou de 1 heure, ou de 2 heure, ou de 3 heures, voire être supérieur à 3 heures.
L’étape d’incubation peut être réalisée à une température adaptée à la protéine à extraire, notamment pour éviter la dénaturation de celle-ci, notamment à la chaleur. La température peut être adaptée en conséquence par l’homme du métier ; typiquement, pour des protéines non thermostables, elle peut être comprise entre 4 et 40°C et pour les protéines thermostables, 40-90°C.
Le procédé d’extraction de l’invention peut en outre comprendre une étape de séparation, pour obtenir la fraction contenant la protéine recherchée. Il peut s’agir de toute méthode connue de l’homme du métier, par exemple une centrifigation. A l’issue de l’étape de séparation, une fraction contenant la protéine extraite de la membrane est obtenue.
Avantageusement, à l’issue de l’extraction, la protéine peut être conservée dans une solution comprenant au moins un composé de l’invention. Avantageusement, les composé de l’invention permettent la stabilisation fonctionnelle des protéines, notamment après que celles-ci aient été extraites de leur membrane.
Un autre objet de l’invention se rapporte ainsi à un procédé de stabilisation de protéines membranaires en solution, c’est-à-dire donc hors de la membrane biologique dans laquelle elles se trouvaiten initialement, dans une solution aqueuse, comprenant une étape (i) consistant à mettre en contact une solution aqueuse d’une protéine membranaire en solution avec au moins un composé de formule (I) de l’invention.
La stabilisation de la protéine peut être une conservation de tout ou partie des propriétés fonctionnelles de celle-ci par rapport à son état natif. Il peut s’agir d’une conservation d’au moins 50% de l’activité de la protéine par rapport à son état natif, ou au moins 60%, ou au moins 70%, ou au moins 80%, ou au moins 90%, ou 100% de cette activité.
Avantageusement, la protéine est ainsi stabilisée à une température comprise de 0°C à 10°C, pendant une durée de temps supérieure à 1 journée, par exemple supérieure à 5 jours, ou supérieure à 10 jours, ou supérieure à 20 jours ou supérieure à 30 jours, ou supérieure à 40 jours.
Les protéines membranaires peuvent avoir été mises en solution par une étape d’extraction au moyen d’un composé de l’invention, tel que défini précédemment, ou au moyen d’une étape d’extraction par un autre détergent, c’est-à-dire un détergent commercial, par exemple le DDM, le LMNG, le Triton X100 ou le FA3.
D’autres avantages pourront encore apparaître à l’homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif.
Brève description des figures
La Figure 1 représente la topologie du transporteur ABC BmrA et le cycle de transport de substrats à travers la membrane plasmique. S = substrat ; NBD = nucleotide-binding domain ; ATP = adénosine triphosphate.
La Figure 2 représente les spectres d’absorption des détergents calix[4]aréniques (exemplifié avec le C4C7) comparés à ceux des moléculesclips de l’invention. Les longueurs d’ondes sont exprimées en nm. Panneau A : le spectre d’absorption du DDM (1 mM) est représenté en ligne continue ; celui du C4C7 (1 mM) est représenté en pointillés. Panneau B : le spectre d’absorption du composé 2.3b (1 mM) est représenté en —- ; celui du composé 2.3c (1 mM) est représenté en ligne continue ; celui du composé 2.3d (1 mM) est représenté en . Panneau C : le spectre d’absorption du composé 3.7e (1 mM) est représenté en ; celui du composé 3.7f (1 mM) est représenté en —celui du composé 3.7g (1 mM) est représenté en ; celui du composé 3.7h (1 mM) est représenté en ; celui du composé 3.7j (1 mM) est représenté en ligne continue. Panneau D : le spectre d’absorption du composé 4.6b (1 mM) est représenté en ; celui du composé 4.6c (1 mM) est représenté en ligne continue ; celui du composé 4.6d (1 mM) est représenté en . Panneau E : le spectre d’absorption du composé 3.6a (1 mM) est représenté en ligne continue ; celui du composé 3.6b (1 mM) est représenté en . Panneau F : le spectre d’absorption du composé 3.9a (1 mM) est représenté en ligne continue. Panneau G : le spectre d’absorption du composé 3.7a (1 mM) est représenté en ; celui du composé 3.7b (1 mM) est représenté en --- ; celui du composé 3.7k (1 mM) est représenté en -- ; celui du composé 3.7I (1 mM) est représenté en ligne continue; celui du composé 3.7c (1 mM) est représenté en ; celui du composé 3.7d (1 mM) est représenté en ” .
La Figure 3 (A et B) représente l’interaction des cations divalents avec les molécules de l’invention par opposition aux détergents calix[4]aréniques, ici exemplifié avec le C4C12, et montre l’absence d’interaction des cations divalents avec les molécules de l’invention par opposition aux détergents calix[4]aréniques. L’absorbance est mesurée à 600 nm pour différentes concentrations en MgCl2 (mM). Panneau A : absorption du composé 3.7b aux concentrations 0,45 mM (ronds), 1,5 mM (carrés) et 4,5 mM (triangles). Panneau B : absorption du composé 3.7c aux concentrations 0,2 mM (croix), 0,5 mM (ronds), 2 mM (carrés) et 6 mM (triangles). Panneau C : absorption du composé 3.7d aux concentrations 0,0045 mM (ronds), 0,0015 mM (carrés) et 0,045 mM (triangles). Panneau D: absorption du composé 3.7e aux concentrations 0,2 mM (croix), 0,5 mM (ronds), 2 mM (carrés) et 6 mM (triangles). Panneau E : absorption du composé 3.7f aux concentrations 0,006 mM (ronds), 0,02 mM (carrés) et 0,06 mM (triangles). Panneau F : absorption du composé 3.7g aux concentrations 0,003 mM (ronds), 0,01 mM (carrés) et 0,03 mM (triangles). Panneau G : absorption du composé 3.7h aux concentrations 0,003 mM (ronds), 0,01 mM (carrés) et 0,05 mM (triangles). Panneau H : absorption du composé 3.7i aux concentrations 0,3 mM (ronds), 1 mM (carrés) et 3 mM (triangles). Panneau I : absorption du composé 3.7j aux concentrations 0,006 mM (ronds), 0,02 mM (carrés) et 0,06 mM (triangles). Panneau J : absorption du composé 3.7k aux concentrations 0,3 mM (ronds), 1 mM (carrés) et 3 mM (triangles). Panneau K : absorption du composé 3.7I aux concentrations 0,3 mM (ronds), 1 mM (carrés) et 3 mM (triangles). Panneau L : absorption du composé 2.3f aux concentrations 0,24 mM (ronds), 0,8 mM (carrés) et 2,4 mM (triangles). Panneau M : absorption du composé 2.3g aux concentrations 0,03 mM (ronds), 0,1 mM (carrés) et 0,3 mM (triangles). Panneau N : absorption du composé 2.3h aux concentrations 0,15 mM (ronds), 0,5 mM (carrés) et 1,5 mM (triangles). Panneau O : absorption du composé 4.5c aux concentrations 0,3 mM (ronds), 1 mM (carrés) et 3 mM (triangles). Panneau P : absorption du composé 4.5d aux concentrations 0,15 mM (ronds), 0,5 mM (carrés) et 1,5 mM (triangles). Panneau Q : absorption du composé 4.6c aux concentrations 1,5 mM (ronds), 5 mM (carrés) et 15 mM (triangles). Panneau R : absorption du composé 4.6d aux concentrations 1 mM (ronds), 3 mM (carrés) et 9 mM (triangles). Panneau S : absorption du composé 3.6c aux concentrations 0,3 mM (ronds), 1 mM (carrés) et 3 mM (triangles). Panneau T : absorption du composé 3.9a aux concentrations 0,01 mM (ronds), 0,1 mM (carrés) et 1 mM (triangles). Panneau U : absorption du composé C4C12 (calixarène) aux concentrations 0,03 mM (ronds), 0,1 mM (carrés) et 0,3 mM (triangles).
La Figure 4 représente la fluorescence (%) du DPH (1,6-diphenyl1,3,5-hexatriene) en présence de concentrations croissantes (0,0001 mM, 0,001 mM, 0,01 mM, 0,1 mM, 1 mM et 10 mM) de clips (composés de l’invention), exemplifié avec les composés #3.7e (C13, points représentés par des carrés) et 3.7f (C18, points représentés par des ronds). L’expérience est réalisée en triplicats. En accord avec Chattopadhyay, A. & London, E ([22]), la CMC correspond à la concentration à partir de laquelle la rupture de pente est constatée, ici 20 μΜ pour 3.7f et 2 mM pour 3.7e (symboles noirs).
La Figure 5 représente la diffusion de la lumière (DLS) de clips, en Intensité (%, colonne A à gauche) et en nombre (%, colonne B à droite), en fonction de la longueur d’onde (nm). Les diamètres estimés sont indiqués sur chaque panneau (colonne A). Colonnes A et B, de haut en bas : composé 3.7c (10 mM, 5xCMC), composé 3.7d (10 mM, 5xCMC), composé 3.7e (2 mM, 5xCMC), composé 3.7f (10 mM, 500xCMC), composé 3.7h (1 mM, 100xCMC), composé 3.7j (2 mM, 100xCMC), composé 3.9a (1 mM, 50xCMC).
La Figure 6 représente l’extraction des protéines membranaires BmrA (panneaux A et C) et AcrB (panneaux B et D) à l’aide de détergents commerciaux et des molécules de l’invention (panneaux A et B, de gauche à droite: SDS, DDM, FC12, TX100, composés de l’invention 1.4, 1.5, 2.3a, 2.3b, 2.3c, 2.3d, 2.3e, 2.3f, 2.3g, 2.3h, 2.3i, 3.6a, 3.6b, 3.6c, 3.7a, 3.7b ; panneau C : composés de l’invention 3.7c 0,8%, 3.7d 0,16%, 3.7e 0,8%, 3.7f 0,3%, 3.7g 0,4%, 3.7h 0,2%, 3.7i 0,07%, 3.7j 0,09%, 3.7k, 3.7I 0,25%, 3.9a, 4.5a, 4.5b, 4.5c, 4.5d 0,34%, 4.6a, 4.6b, 4.6c, 4.6d, 5.3a, 5.3b, 5.3c 0,3%, 5.3d 0,3%; panneau D: 3.7c, 3.7d, 3.7e, 3.7f, 3.7h, 3.7i 0,1%, 3.7j, 3.7k, 3.7I, 3.9a, 4.5a, 4.5b, 4.5c, 4.5d, 4.6a, 4.6b, 4.6c, 4.6d . Les détergents sont ajoutés à 10 g/L (1%) sauf indication. L’équivalent de 20 pg de protéines de la fraction extraite après centrifugation 100 000xg 30 min est déposé sur SDSPAGE 10%, coloré au bleu de Coomassie après migration. BmrA migre sous sa forme monomérique à hauteur de la bande de 55 kDa ; AcrB migre sous forme monomérique à hauteur de 100 kDa. SDS = dodécyle sulfate de sodium; DDM = β-D-dodécyle maltoside ; FC12= foscholine 12; TX100= triton X-100.
La Figure 7 représente l’effet des détergents de l’invention sur la fonctionnalité de BmrA (activité ATPasique, %). La fraction membranaire enrichie en BmrA (~25%) diluée à 2 g/L est additionnée des composés aux concentrations (mM) indiquées (panneau A, de haut en bas : 3.7e 10,7 mM, 3.7e 8,6 mM, 3.7e 6,4 mM, 3.7e 4,3 mM, 3.7e 2,2 mM, 3.7e 1,1 mM, 3.7d 4 mM, 3.7d 3 mM, 3.7d 2 mM, 3.7d 1 mM, 3.7d 0,8 mM, 3.7d 0,6 mM, 3.7d 0,05 mM, 3.7d 0,03 mM, 3.7d 0,02 mM, 3.7c 13 mM, 3.7c 10,4 mM, 3.7c 10 mM, 3.7b 1,5 mM, 3.7b 0,7 mM, 3.7b 0,5 mM, 3.6c 12,5 mM, 3.6b 14,4 mM, 2.3gNa2 20,5 mM, 2.3gK2 19,3 mM, 2.3f 21,1 mM, 2.3e 22 mM, 2.3d 23,2 mM, 2.3a 3,2 mM, 1.5a 22 mM, DDM 20 mM, DDM 2mM, DDM 10 mM, DDM 2mM, DDM 1 mM, LMNG 10 mM, LMNG 1 mM, LMNG 0,1 mM, LMNG 0,01 mM, FA3 27 mM, FA3 9 mM, FA3 2 mM, FA3 1 mM, TX100 16 mM ; panneau B de haut en bas : composés de l’invention 5.3d 3,2 mM, 5.3c 3,3 mM, 5.3b 11,7 mM, 5.3b 2,9 mM, 5.3a 3 mM, 4.6c 14,6 mM, 4.6b 15,2 mM, 4.5c 18,6 mM, 4.5b 19,6 mM, 3.9a 8 mM, 3.9a 0,51 mM, 3.9a 0,31 mM, 3.9a 0,11 mM, 3.7I 12,01 mM, 3.7I 6,01 mM, 3.7I 3mM, 3.7I 1 mM, 3.7k 10 mM, 3.7k 3 mM, 3.7j 3 mM, 3.7j 2 mM, 3.7j 1 mM, 3.7j 0,6 mM, 3.7j 0,03 mM, 3.7j 0,02 mM, 3.7j 1 mM, 3.7i 0,3 mM, 3.7h 3 mM, 3.7h 2 mM, 3.7h 1 mM, 3.7h 0,6 mM, 3.7h 0,58 mM, 3.7h 0,5 mM, 3.7h 0,35 mM, 3.7h 0,1 mM, 3.7h 0,5 mM, 3.7h 0,35 mM, 3.7h 0,1 mM, 3.7h 0,05 mM, 3.7h 0,03 mM, 3.7h 0,02 mM, 3.7g 12,5 mM, 3.7g 9 mM, 3.7g 7,5 mM, 3.7g 5 mM, 3.7g 3 mM, 3.7g 1 mM, 3.7f3,2 mM, 3.7f2 mM, 3.7f 1 mM, 3.7f 0,061 mM, 3.7f 0,031 mM, 3.7f 0,015 mM). Après incubation 2 h à 4°C, l’activité ATPasique est mesurée. Les solutions sont ensuite centrifugées 1 h à 4°C, 100 000xg et les surnageants déposés sur SDS PAGE 10% (cf Figure 8). Les histogrammes gris et noirs correspondent aux concentrations auxquelles BmrA est partiellement (gris) ou complètement (noir) extrait d’après ces SDSPAGE. L’activité ATPasique est en % par rapport à celle de la protéine sans composé, 0.7 pmol ATP hydrolysé/min/mg protéines.
La Figure 8 représente l’extraction de BmrA testée à différentes concentrations (exprimées en mM et en xCMC) de différents détergents (DDM, LMNG et FA3) et de molécules de l’invention (3.6c, 3.7b, 3.7c, 3.7d, 3.7e, 3.7f, 3.7h, 3.7g, 3.7j, 3.7I, 3.9a, 4.3d, 5.3b) comme indiqué dans la Figrure 7. Les fractions totales (T) et solubles (S) des solutions préparées dans la Figure 7 sont déposées sur SDSPAGE 10% après séparation par centrifugation à 100 000xg 30 min, 4°C. DDM = β-D-dodécyle maltoside ; LMNG : lauryl maltoside neopentyl glycol (Chae, P. S. et al. ([6])). FA3= facial amphiphile #3 (Lee, S. C. et al. ([9])).
La Figure 9 représente la stabilité dans le temps de BmrA purifiée en DDM (points représentés par des ronds) et additionnée des composés de l’invention (3.7c, points représentés par des carrés et 3.7g, points représentés par des losanges), ou de FA3 (points représentés par des triangles). L’activité ATPasique (%) est mesurée en fonction des jours d’incubation post-purification, comme expliqué dan l’exemple 13.
EXEMPLES
Exemple 1 : Procédés de préparation des composés de l’invention
Les différents exemples des détergents appartenant à la formule (I) sont préparés selon les protocoles suivants :
Protocole général A: couplage peptidique
D’après Corzana et al, 2006 (Corzana, F. et al. New Insights into aGalNAc-Ser Motif: Influence of Hydrogen Bonding versus Solvent Interactions on the Preferred Conformation. Journal of the American Chemical Society 128, 14640-14648 (2006) ([15])). A une solution de dérivé d’acide aminé possédant une fonction acide carboxylique libre (1 équiv.) dans le DMF anhydre (15 mL/mmol) sont ajoutés l’acide aminé possédant une fonction amine libre ou sous forme de sel de tosylate (2 équiv.), la DIEA (5 équiv.) et le TBTU (1,2 équiv.). Le mélange réactionnel est agité sous atmosphère inerte et à TA pendant 3 h. Après ajout d’eau (15 mL/mmol), le milieu réactionnel est extrait à l’éther éthylique. Les phases organiques sont rassemblées, lavées par de l’eau distillée et une solution aqueuse saturée de NaCI, séchées sur MgSCU, filtrées puis concentrées sous vide. Le produit brut est purifié par colonne chromatographique sur gel de silice.
Protocole général B1 : déprotection du groupement Fmoc
A une solution d’amine protégée sous forme de Fmoc (1 équiv.) dans du CH2CI2 anhydre (20 mL/mmol) est ajoutée la diéthylamine (20 équiv.). Après une nuit d’agitation à TA et sous N2, le milieu réactionnel est concentré sous vide. Le résidu est repris dans du CH2CI2. Cette solution est lavée avec une solution saturée de NaHCO3, séchée sur K2CO3 puis concentrée sous vide.
Protocole général B2 : déprotection du groupement Fmoc
Protocole identique à B1, excepté la diéthylamine qui est remplacée par la pipéridine.
Protocole général C : formation d’amides
A une solution d’amine déprotégée (1 équiv.) dans du CH2CI2 anhydre (30 mL/mmol) sont ajoutés un chlorure d’acide (2 équiv.), la DMAP (0,5 équiv.) et la pyridine (34 équiv.). Après une nuit d’agitation à TA et sous N2, le milieu réactionnel est acidifié (pH = 3) par ajout d’une solution aqueuse de HCl 10 %. Le milieu réactionnel est extrait au CH2CI2. Les phases organiques sont rassemblées, lavées par une solution aqueuse saturée de NaCI, séchées sur MgSCU, filtrées puis concentrées sous vide. Le produit brut est purifié par colonne chromatographique sur gel de silice.
Protocole général D1 : hydrogénation catalytique
A une solution d’ester de benzyle (1 équiv.) dans du MeOH (100 mL/mmol) est ajouté le Pd/C 10 % (200 mg/mmol). Après 4 h à une nuit d’agitation sous Η2 et à TA, le milieu réactionnel est filtré sur Célite® puis concentré sous vide. Le produit brut obtenu est directement utilisé dans l’étape suivante sans purification. Dans le cas des détergents PEGylés, le résidu est lavé par du cyclohexane et/ou CH2CI2.
Protocole général D2 : hydrogénation catalytique
A une solution d’ester de benzyle (1 équiv.) dans du THF (30 mL/mmol) est ajouté le Pd/C 5 % (120 mg/mmol). Après une nuit d’agitation sous H2 et à TA, le milieu réactionnel est filtré sur Célite® puis concentré sous vide. Le produit brut obtenu est directement utilisé dans l’étape suivante sans purification.
Protocole général E : déprotection du groupement tert-butyl (fBu)
D’après Christensen et al., 2005 (Christensen, C. A. & Meldal, M. Efficient solid-phase synthesis of peptide-based phosphine ligands: towards combinatorial libraries of sélective transition métal catalysts. Chemistry 11, 4121-4131, doi:10.1002/chem.200500105 (2005) ([16])). A une solution d’alcool protégé sous forme d’éther f-butylique (1 équiv.) dans du CH2CI2 (12 mL/mmol) est ajouté à 0°C l’acide trifluoroacétique TFA (4 mL/mmol). Après une nuit d’agitation à TA et sous N2, le milieu réactionnel est concentré sous vide. Le résidu est repris dans du CH2CI2 puis une solution aqueuse de NaOH 2 M est ajoutée (pH = 11-12). La phase aqueuse est lavée par de l’AcOEt puis acidifiée par une solution concentrée de HCl (pH = 1-2) avant d’être extraite par l’AcOEt. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgSCU, filtrées et concentrées sous vide. Le résidu est lavé par du CH2CI2 pour éliminer l’acide gras restant.
Protocole général F : déprotection des esters de méthyle ou d’éthyle
A une solution d’acide protégé sous forme d’ester de méthyle ou d’éthyle (1 équiv.) dans du THF (10,4 mL/mmol) est ajoutée une solution de LiOH (5 équiv.) dans l’eau (10,4 mL/mmol). Le milieu réactionnel est agité 4 h à TA. Après ajout d’une solution aqueuse de H3PO4 5 % (pH = 1-2), le milieu réactionnel est extrait à l’AcOEt (à moins que le composé souhaité précipite, dans ce cas, il est lavé avec de l’eau distillée préalablement refroidie). Les phases organiques sont rassemblées, lavées par une solution aqueuse saturée de NaCI, séchées sur MgSCL, filtrées puis concentrées sous vide. Le produit brut est ensuite purifié par chromatographie sur colonne en phase inverse C18 (éluant : H2O puis MeOH).
Protocole général G : déprotection des groupements Boc
A une solution d’amine protégée par un groupement Boc (1 équiv.) dans le CH2CI2 anhydre (5 mL/g) est ajoutée, à 0°C, le TFA (2,5 mL/g). Après 4-5 h d’agitation à TA et sous N2, le milieu réactionnel est concentré sous vide. Le résidu est repris dans du CH2CI2 et une solution aqueuse de NaOH (2 M) est ajoutée (pH = 11-12). La phase aqueuse est lavée par AcOEt, acidifiée par une solution concentrée de HCl (pH = 1-2), lavée par du CH2CI2 puis extraite par AcOEt. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgSO4, filtrées puis concentrées sous vide. Le produit brut obtenu est directement utilisé dans l’étape suivante sans purification.
Protocole général H : couplage thiol-ène
D’après Boyère et al., 2013 (Boyere, C., Broze, G., Blecker, C., Jerome, C. & Debuigne, A. Monocatenary, branched, double-headed, and bolaform surface active carbohydrate esters via photochemical thiol-ene/-yne reactions. Carbohydr Res 380, 29-36 (2013) ([17])). Une solution d’alcène terminal (1 équiv.), de thio-saccharide protégé sous forme d’acétate (1,2 équiv.) et de DMPA (0,2 équiv.) dans le THF (15 mL/mmol) est agitée sous N2 et sous irradiation UV à TA pendant 2 h. Après concentration sous vide, le produit brut est purifié par colonne chromatographique sur gel de silice.
Protocole général I : cycloaddition de Huisgen
D’après Munteanu et al., 2008 (Munteanu, M., Choi, S. & Ritter, H. Cyclodextrin Méthacrylate via Microwave-Assisted Click Reaction. Macromolecules 41, 9619-9623 (2008) ([18])). A une solution d’alcyne (1 équiv.), d’azido-saccharide protégé sous forme d’acétate ou azido-PEG (11,5 équiv.), de CUSO4.5H2O (0,1 équiv.) et d’ascorbate de sodium (0,2 équiv.) dans le DMF (6 mL/mmol) sont ajoutées quelques gouttes d’eau. Le milieu réactionnel est agité sous irradiation micro-onde à 140°C pendant 1 h.
Après ajout d’eau, le milieu réactionnel est extrait à l’AcOEt. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgSO4, filtrées puis concentrées sous vide. Le produit brut est purifié par colonne chromatographique sur gel de silice.
Protocole général J : réaction de désacétylation
D’après Chae, P.S. et al., 2010 ([6]). A une solution de dérivé saccharidique protégé sous forme d’acétate (1 équiv.) dans du MeOH (16,7 mL/mmol) est ajouté MeONa (0,2 équiv.). Après une nuit d’agitation à TA, la résine échangeuse de proton (Dowex-H+) est ajoutée et le milieu réactionnel est agité 30 min. avant d’être filtré. Le filtrat est concentré sous vide et le produit brut obtenu est utilisé directement dans l’étape suivante sans purification.
Protocole général K : formation des sels de carboxylate (Na, K)
A une solution d’acide carboxylique (1 équiv.) dans un minimum de
MeOH est ajouté MeONa ou MeOK (1 équiv. par fonction carboxylate à salifier). Après 5 min. d’agitation, le solvant est évaporé et le produit final est récupéré sous forme de solide.
Protocole général L : déprotection trityle et couplage thiol-ène A une suspension de L-Fmoc-Cys(Trt)-OH (1 équiv.) dans du CH2CI2
0 (10 mL/g) en présence de Et3SiH (1,5 équiv.), est ajouté à 0°C du TFA (5 mL/g). Après 3 h d’agitation, le milieu réactionnel est concentré sous vide pour donner un solide gris. Ce résidu, l’alcène (1,2 équiv.) et le photoinitiateur DMPA (0,5 équiv.) sont dissous dans du THF (7,5 mL/g). Le milieu est agité 3 h à TA et sous UV. Après concentration sous vide, le produit brut est purifié
5 par colonne chromatographique sur gel de silice.
Exemple 2 : Exemple de composés 1.1 à 1.5
co2h co2h
i. CH3(CH2)iiNH2, TBTU, DIEA, DMF; ii. Pipéridine/DMF 20:80; iii. Acrylate d’éthyle, MeOH ; iv. Acrylate de benzyle, 70°C ; v. LiOH, THF, H2O,
TA ; vi. TFA, CH2CI2, TA ; vii. H2, Pd/C 10%, MeOH.
Composé 1.1 nh2
A une solution de Fmoc-Ser(fBu)-OH (3,0 g, 7,82 mmol, 1 équiv.) dans le DMF (300 mL) sont ajoutés le dodécylamine (2,9 g, 15,64 mmol, 2 équiv.) puis la DIEA (6,8 mL, 39,11 mmol, 5 équiv.) et le TBTU (3,01 g, 9,38 mmol,
1,2 équiv.). Après 4 h d’agitation à TA, le milieu réactionnel est concentré sous vide et dilué par l’éther. La phase organique est lavée successivement par une solution saturée de NaCl, une solution d’HCI (0,1 N) puis par une solution de NaHCO3 (5 %) avant d’être séchée sur Na2SO4, filtrée et concentrée sous vide. Le résidu obtenu est repris dans un mélange pipéridine/DMF (20:80, 300 mL). Après 1 h d’agitation à TA, le milieu réactionnel est ensuite concentré sous vide. Le produit brut obtenu est purifié par colonne chromatographique sur gel de silice (CH2CI2/MeOH 98:2) pour donner le composé attendu (2,44 g, 7,43 mmol, 95 %) sous forme d’une huile jaune. Rf = 0,45 (CH2CI2/MeOH 95:5) ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,89 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1,20 (s, 9H), 1,26-1,35 (m, 22H), 3,25 (q, J = 4,4 Hz, 2H), 3,42-3,51 (m, 2H), 3,62 (dd, J = 4,0, 4,0 Hz, 1H), 7,39 (m, 1H) ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 14,4 (CH3), 23,0 (CH2), 27,3 (CH2), 27,8 (3xCH3),
29,6 (2xCH2), 29,9 (3xCH2), 30,0 (CH2), 32,0 (CH2), 36,8 (CH2), 39,4 (CH2),
55,7 (CH), 64,3 (CH2), 73,7 (C), 173,2 (C) ; Masse (ESI+) : m/z (%) 329 [M+H]+ (100).
A une solution d’intermédiaire 1.1 (1,06 g, 3,22 mmol, 1 équiv.) dans le méthanol (3,5 ml) est ajouté l’acrylate d’éthyle (1,37 ml, 12,9 mmol, 2,5 équiv.). Le mélange a été purgé à l’azote, couvert de papier aluminium et agité pendant 5 jours à TA. Le produit brut obtenu est purifié par colonne chromatographique sur gel de silice (CH2CI2/MeOH 95:5) pour donner le composé attendu (1,24 g, 2,90 mmol, 83 %) sous forme d’une huile jaune. Rf = 0.56 (CH2CI2/MeOH 98:2) ; RMN 1H (400 MHz, CDCI3) δ ppm 0,89 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,13 (s, 9H), 1,22-1,25 (m, 25H), 1,46-1,49 (m, 2H), 2,04 (m, 1 H), 2,44 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 2,79-2,83 (m, 2H), 3,16 (dd, J = 4,0, 4,0 Hz, 1H), 3,20 (q, J = 6,8 Hz, 2H), 3,29 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,62 (dd, J = 4,0, 4,0 Hz, 1H), 4,12 (q, J = 7,2 Hz, 2H), 7,46 (t, J = 4,8 Hz, 1H) ; RMN 13C (400 MHz, CDCIs) δ ppm 14,3 (CH3), 14,4 (CH3), 22,8 (CH2), 27,1 (CH2), 27,7 (3xCH3), 29,5-29,8 (7xCH2), 32,1 (CH2), 35,0 (CH2), 39,2 (CH2), 44,0 (CH2), 60,7 (CH2), 62,6 (CH), 63,5 (CH2), 73,5 (C), 172,0 (C), 172,7 (C) ; Masse (ESI+) : m/z (%) 429 [M+H]+ (100); SMHR (ESI+) m/z calculée pour C24H49N2O4 429,3692, trouvée 429,3696.
Une solution d’intermédiaire 1.2 (1,40 g, 3,26 mmol, 1 équiv.) et d’acrylate de benzyle (1,32 g, 8,16 mmol, 2,5 équiv.) est agitée à 70°C pendant 7 jours puis le milieu réactionnel est concentré sous vide. Le produit brut obtenu est purifié par colonne chromatographique sur gel de silice (CH2CI2 100%) pour donner le composé attendu (640 mg, 1,07 mmol, 33 %) sous forme d’une huile jaune. Rf = 0,47 (CH2CI2/MeOH 98:2) ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,80 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,10 (s, 9H), 1,13-1,25 (m, 22H), 1,40 (m, 2H), 2,30-2,52 (m, 4H), 2,87-3,04 (m, 4H), 3,09 (q, J = 6,4 Hz, 2H),
3,38 (dd, J = 8,8, 4,4 Hz, 1H), 3,57 (ddd, J = 19,2, 12,8, 3,2 Hz, 1H), 3,89 (dd, J = 6,0, 2,4 Hz, 1H), 4,04 (q, J = 7,2 Hz, 2H), 5,04 (s, 2H), 7,23-7,33 (m, 5H), 7,51 (t, J = 6,0 Hz, 1 H), ; RMN 13C (400 MHz, CDCIs) δ ppm 14,1 (CH3),
14,2 (CH3), 22,7 (CH2), 27,0 (CH2), 27,5 (3xCH3), 29,4-29,7 (7xCH2), 31,9 (2xCH2), 33,5 (CH2), 39,2 (CH2), 47,0 (2xCH2), 60,0 (CH2), 60,4 (CH2), 65,1 (CH), 66,3 (CH2), 73,3 (C), 128,3-128,6 (5xCH), 136,3 (C), 171,6 (C), 172,4 (C), 172,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 613 (46) [M+Na]+, 591 (100) [M+H]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C34Hs9N2O6 591,4373, trouvée 591,4384.
Le composé 1.4 (huile jaune, 17 mg, 0,05 mmol, 38 %) a été obtenu à partir du composé 1.2 (59 mg, 0,13 mmol) en suivant les protocoles généraux F puis K (sans toutefois effectuer les lavages acido-basiques) ; RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ ppm 0,64 (t, J = 8,0 Hz, 3H), 1,06-1,07 (m, 18H), 1,27-1,31 (m, 2H), 2,55 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 3,00 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 3,04-3,05 (m, 2H), 3,60 (dd, J = 8,0, 8,0 Hz, 1H), 3,69-3,77 (m, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, MeOD) δ ppm 14,3 (CH3), 23,6 (CH2), 27,4 (CH2), 27,8 (CH2), 30,1 (CH2),
30,2 (CH2), 30,3 (CH2), 30,5 (CH2), 30,6 (3xCH2), 32,9 (CH2), 40,8 (CH2), 43,5 (CH2), 60,4 (CH), 60,9 (CH2), 167,0 (2xC) ; Masse (ESI+) m/z (%) 345 (100) [M+H]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour Ci8H37N2O4 345,2747, trouvée 345,2746.
Composé 1.5 n H ho2c co2h
Le composé 1.5 (huile jaune, 147 mg, 0,35 mmol, 72 %) a été obtenu à partir du composé 1.3 (300 mg, 0,50 mmol) en suivant les protocoles généraux D1, F puis K (sans toutefois effectuer les lavages acido-basiques) ; RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ ppm 0,90 (t, 3H, J = 8,0 Hz), 1,22-1,37 (m, 22H), 1,53-1,57 (m, 2H), 2,90 (t, J = 8,0 Hz, 4H), 3,18-3,29 (m, 3H), 3,64 (m,
J = 8,0 Hz, 4H), 4,08 (t, J = 4,0 Hz, 1H), 4,16-4,18 (m, 1H), 8,42 (t, J = 4,0
Hz, NH); RMN 13C (100 MHz, MeOD) δ ppm 14,5 (CH3), 17,9 (CH2), 23,8 (CH2), 24,3 (CH2), 28,1 (CH2), 29,8 (CH2), 30,2 (CH2), 30,5 (CH2), 30,6 (CH2),
30.8 (2xCH2), 33,2 (2xCH2), 41,0 (CH2), 54,9 (2xCH2), 59,4 (CH), 69,2 (CH2),
173.8 (3xC) ; Masse (ESI+) m/z (%) 417 (100) [M+H]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C2iH4iN2O6 417,2959, trouvée 417,2956.
Exemple 3: Composés 2.1 à 2.3 t-BuO
OH +
NHFmoc (CH2)„CO2Bn
A p-tosylateH2N' CO2Bn
O (CH,)„CO,Bn
FmocHN
ii, iii ou iv V
i. TBTU, DIEA, DMF ; ii. Et2NH, CH2CI2 ; iii. RCOCI, DMAP, pyridine, 10 CH2CI2 ; iv. RCOOH, TBTU, DIEA, DMF; v. H2, Pd/C, MeOH ; vi. TFA,
CH2CI2.
Exemple 2.1a
^.COOBn Ο Γ t-BuO^^Y^N'''^COOBn ]_5 FmocNH H
Le composé 2.1a (solide blanc, 2,95 g, 4,34 mmol, 83%) a été obtenu à partir des composés commerciaux Fmoc-L-Ser(f-Bu)-OH (2,00 g, 5,22 mmol) et H-D-Asp(OBn)-OBn.p-tosylate (5,07 g, 10,43 mmol) en suivant le protocole général A (purification : colonne chromatographique sur gel de silice, éluant :
0 cyclohexane/AcOEt 9:1 à 7:3).
Rf = 0,32 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 115-117 °C ; RMN 1H (400 MHz,
CDCIs) δ ppm 1,15 (s, 9H), 2,82-2,96 (m, 1H), 3,06 (dd, J = 17,1, 4,6 Hz, 1H),
3,38 (dd, J = 8,3, 8,3 Hz, 1H), 3,74-3,77 (m, 1H), 4,19-4,26 (m, 2H), 4,354,37 (m, 2H), 4,88-4,93 (m, 1H), 5,01 (s, 2H), 5,12 (s, 2H), 5,74 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 7,25-7,34 (m, 12H, H3”), 7,38 (dd, J = 7,5, 7,5 Hz, 2H), 7,59-7,61 (m, 2H), 7,65 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 7,74 (d, J = 7,5 Hz, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 27,5 (3xCH3), 36,6 (CH2), 47,3 (CH), 49,0 (CH), 54,8 (CH), 61,7 (CH2), 66,9 (CH2), 67,3 (CH2), 67,7 (CH2), 74,4 (C), 120,1 (2xCH), 125,3 (2xCH), 127,3 (2xCH), 127,9 (2xCH), 128,4 (CH), 128,5 (CH), 128,6 (CH), 128,6 (CH), 128,7 (CH), 135,3 (C), 135,5 (C), 141,5 (2xC), 143,9 (2xC),
156,2 (C), 170,3 (2xC), 170,6 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 426 (100), 701 (60) [M+Na]+; SMHR (ESI+) m/z calculée pour 04οΗ43Ν2θ8 679,3019, trouvée 679,3013.
Exemple 2.1b
COOBn t-BuO γ FmocNH
COOBn
Le composé 2.1b (solide blanc, 5,14 g, 7,42 mmol, 81%) a été obtenu à partir des composés commerciaux Fmoc-L-Ser(f-Bu)-OH (3,5 g, 9,12 mmol) et H-D-Glu(OBn)-OBn.p-tosylate (9 g, 18,24 mmol) en suivant le protocole général A (modification : après ajout d’eau, le composé souhaité précipite et a été purifié par recristallisation dans un mélange CH2Cl2/Et2O).
Rf = 0,50 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 126-128 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 1,19 (s, 9H), 1,99-2,11 (m, 1H), 2,22-2,35 (m, 1H), 2,322,55 (m, 2H), 3,41 (dd, J = 8,3, 8,3 Hz, 1H), 3,75-3,87 (m, 1H), 4,23 (t, J =
7,1 Hz, 1H), 4,24-4,33 (m, 1H), 4,40 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 4,68-4,76 (m, 1H), 5,09 (s, 2H), 5,17 (s, 2H), 5,78 (bs, 1H), 7,21-7,46 (m, 15H), 7,61 (d, J = 7,0 Hz, 2H), 7,76 (d, J = 7,5 Hz, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 27,4 (3xCH3), 27,5 (CH2), 30,0 (CH2), 47,1 (CH), 51,8 (CH), 54,6 (CH), 61,7 (CH2), 66,5 (CH2), 67,2 (CH2), 67,4 (CH2), 74,3 (C), 120,0 (2xCH), 125,1 (2xCH),
127.1 (2xCH), 127,7 (2xCH), 128,2-128,7 (10xCH), 135,1 (C), 135,7 (C),
141,3 (2xC), 143,7 (2xC), 156,1 (C), 170,1 (C), 171,2 (C), 172,3 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 426 (100), 570 (3), 715 (1) [M+Na]+; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C41H45N2O8 693,3176, trouvée 693,3156.
Exemple 2.2a θ COOBn t-BuO j N ' XOOBn O NH H 10 (CH2)12CH3
Le composé 2.2a (solide blanc, 105 mg, 0,16 mmol, 27%) a été obtenu à partir du composé 2.1a en suivant les protocoles généraux B puis C.
Rf = 0,30 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 59-61 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,16 (s, 9H), 1,18-1,36 (m, 20H), 1,5615 1,67 (m, 2H), 2,20 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,89 (dd, J = 17,1, 4,7 Hz, 1H), 3,07 (dd, J = 17,1, 4,7 Hz, 1H), 3,27 (dd, J = 8,6, 8,6 Hz, 1H), 3,79 (dd, J = 8,6,
4.1 Hz, 1H), 4,43-4,50 (m, 1H), 4,87-4,93 (m, 1H), 5,06 (s, 2H), 5,13 (s, 2H), 6,36 (d, J = 6,3 Hz, 1H, NH), 7,26-7,38 (m, 10H), 7,60 (d, J = 8,1 Hz, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCI3) δ ppm 14,2 (CH3), 22,8 (CH2), 25,6 (CH2), 27,4
0 (3xCH3), 29,4-29,8 (8xCH2), 32,0 (CH2), 36,5 (CH2), 36,7 (CH2), 48,9 (CH),
53.1 (CH), 61,3 (CH2), 66,9 (CH2), 67,6 (CH2), 74,3 (C), 128,5-128,8 (10xCH), 135,3 (C), 135,5 (C), 170,3 (C), 170,6 (C), 170,6 (C), 173,4 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 690 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C39H59N2O7 667,4322, trouvée 667,4318.
5 Exemple 2.2b o
COOBn
OOOBn (CH2)6CH3
Le composé 2.2b (solide blanc, 67 mg, 0,11 mmol, 39 %) a été obtenu à partir du composé 2.1b en suivant les protocoles généraux B puis C.
Rf = 0,35 (7:3 cyclohexane/AcOEt) ; Tf = 86°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,87 (t, 3H, J = 7,0 Hz), 1,17 (s, 9H), 1,23-1,38 (m, 8H), 1,571,72 (m, 2H), 1,98-2,11 (m, 1H), 2,19-2,35 (m, 3H), 2,35-2,53 (m, 2H), 3,38 (t, J = 8,5 Hz, 1H), 3,78 (dd, J = 8,8, 4,2 Hz, 1H), 4,53-4,60 (m, 1H), 4,674,75 (m, 1H), 5,10 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 6,66 (d, J = 6,9 Hz, 1H, NH), 7,277,38 (m, 10H), 7,45 (d, J = 7,9 Hz, 1H, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,1 (CH3), 22,6 (2xCH2), 27,4 (3xCH3), 27,5 (CH2), 29.0-30.0 (3xCH2), 31,7 (CH2), 36,6 (CH2), 51,8 (CH), 53,0 (CH), 61,3 (CH2), 66,5 (CH2), 67,41 (CH2), 74,4 (3xCH3), 128,3-128,7 (10xCH), 135,1 (C), 135,8 (C), 170,36 (C), 171,23 (C), 172,34 (C), 173,34 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 597 (100) [M+H]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C34H49N2O7 597,3540, trouvée 597,3538.
Exemple 2.2c
(CH2)7CH3
Le composé 2.2c (solide blanc, 69 mg, 0,11 mmol, 39 %) a été obtenu à partir du composé 2.1b en suivant les protocoles généraux B puis C.
Rf = 0,38 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 91 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,87 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 1,17 (s, 9H), 1,22-1,38 (m, 10H), 1,561,70 (m, 2H), 1,98-2,10 (m, 1H), 2,18-2,34 (m, 3H), 2,36-2,53 (m, 2H), 3,41 (t, J = 8,5 Hz, 1H), 3,76 (dd, J = 8,9, 4,1 Hz, 1H), 4,57-4,64 (m, 1H), 4,684,76 (m, 1H), 5,09 (s, 2H), 5,14 (s, 2H), 6,75 (d, J = 6,9 Hz, 1H, NH), 7,267,38 (m, 10H), 7,53 (d, J = 7,9 Hz, 1H, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCI3) δ ppm 14,2 (CH3), 22,8 (2xCH2), 27,5 (3xCH3), 27,7 (CH2), 29.3-30.1 (4xCH2), 32,0 (CH2), 36,7 (CH2), 51,9 (CH), 53,1 (CH), 61,4 (CH2), 66,7 (CH2), 67,5 (CH2), 74,5 (C), 128,4-128,8 (10xCH), 135,2 (C), 135,9 (C), 170,5 (C), 171,3 (C), 172,5 (C), 173,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 633 (100) [M+H]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C35H51N2O7 611,3696, trouvée 611,3681.
Exemple 2.2d
(CH2)8CH3
Le composé 2.2d (solide blanc, 195 mg, 0,31 mmol, 45 %) a été obtenu à partir du composé 2.1b en suivant les protocoles généraux B puis C.
Rf = 0,18 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 82-85 °C ; RMN 1H (400 MHz,
CDCIs) δ ppm 0,87 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,16 (s, 9H), 1,19-1,35 (m, 12H), 1,551,66 (m, 2H), 1,96-2,07 (m, 1H), 2,21 (t, J = 7,8 Hz, 2H), 2,21-2,30 (m, 1H),
2,32-2,50 (m, 2H), 3,31 (dd, J = 8,7, 8,7 Hz, 1H), 3,80 (dd, J = 8,7, 4,2 Hz,
1H), 4,44-4,50 (m, 1H), 4,65-4,72 (m, 1H), 5,08 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 6,40 (d,
J = 6,4 Hz, 1H, NH), 7,27-7,36 (m, 11 H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm
14,1 (CH3), 22,7 (2xCH2), 25,6 (CH2), 27,4 (3xCH3), 27,5 (CH2), 29,3-29,44 (4xCH2), 30,0 (CH2), 31,9 (CH2), 36,6 (CH2), 51,8 (CH), 53,0 (CH), 61,3 (CH2), 66,5 (CH2), 67,3 (CH2), 74,3 (C), 128,3-128,7 (10xCH), 135,2 (C),
135,8 (C), 170,4 (C), 171,2 (C), 172,3 (C), 173,3 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 626 (30) [M+H]+, 648 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C36H53N2O7 625,3853, trouvée 625,3846.
Exemple 2.2e
Le composé 2.2e (solide blanc, 182 mg, 0,28 mmol, 48 %) a été obtenu à partir du composé 2.1b en suivant les protocoles généraux B puis C.
Rf = 0,12 (cyclohexane/AcOEt 8:2) ; Tf = 67-69°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,17 (s, 9H), 1,19-1,35 (m, 16H), 1,561,67 (m, 2H), 1,96-2,08 (m, 1H), 2,21 (t, J = 7,Q Hz, 2H), 2,21-2,32 (m, 1H),
2,32-2,50 (m, 2H), 3,30 (dd, J = 8,7, 8,7 Hz, 1H), 3,81 (dd, J = 8,7, 4,2 Hz, 1H), 4,42-4,49 (m, 1H), 4,64-4,72 (m, 1H), 5,09 (s, 2H), 5,16 (s, 2H), 6,38 (d, J = 6,3 Hz, 1H, NH), 7,23-7,39 (m, 11 H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm
14,2 (CHs), 22,8 (CH2), 25,6 (CH2), 27,5 (3xCH3), 27,6 (CH2), 29,4-29,7 (6xCH2), 30,0 (CH2), 32,0 (CH2), 36,7 (CH2), 51,9 (CH), 53,1 (CH), 61,4 (CH2), 66,6 (CH2), 67,5 (CH2), 74,4 (C), 128,4-128,8 (10xCH), 135,2 (C), 135,9 (C), 170,4 (C), 171,3 (C), 172,4 (C), 173,4 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 131 (30), 199 (40), 654 (50) [M+H]+, 677 (100), 699 (20) ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C3sH57N2O7 653,4166, trouvée 653,4158.
Exemple 2.2f
(CH^CHj
Le composé 2.2f (solide blanc, 233 mg, 0,35 mmol, 50 %) a été obtenu à partir du composé 2.1b en suivant les protocoles généraux B puis C.
Rf = 0,24 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 68-71 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,17 (s, 9H), 1,20-1,36 (m, 18H), 1,551,67 (m, 2H), 1,96-2,08 (m, 1H), 2,21 (t, J = 7,Q Hz, 2H), 2,21-2,32 (m, 1H),
2,32-2,50 (m, 2H), 3,31 (dd, J = 8,7, 8,7 Hz, 1H), 3,80 (dd, J = 8,7, 4,2 Hz, 1H), 4,44-4,50 (m, 1H), 4,63-4,73 (m, 1H), 5,08 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 6,41 (d, J = 6,4 Hz, 1H, NH), 7,25-7,37 (m, 11 H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,1 (CHs), 22,7 (CH2), 25,5 (CH2), 27,4 (3xCH3), 27,5 (CH2), 29,3-29.7 (7xCH2), 29,9 (CH2), 31,9 (CH2), 36,5 (CH2), 51,8 (CH), 53,0 (CH), 61,3 (CH2), 66,5 (CH2), 67,3 (CH2), 74,2 (C), 128,3-128,6 (10xCH), 135,2 (C), 135,8 (C), 170,4 (C), 171,2 (C), 172,3 (C), 173,3 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 668 (20) [M+H]+, 690 (100) [M+Na]+; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C39H59N2O7 667,4322, trouvée 667,4334.
Exemple 2.2g
O < COOBn 5 t-BuO^^Y^N''' OOOBn
O^NH H (CH2)12CH3
Le composé 2.2g (solide blanc, 187 mg, 0,27 mmol, 48 %) a été obtenu à partir du composé 2.1b en suivant les protocoles généraux B puis C.
Rf = 0,07 (cyclohexane/AcOEt 8:2) ; Tf = 71-73°C ; RMN 1H (400 MHz,
CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,17 (s, 9H), 1,20-1,36 (m, 20H), 1,561,67 (m, 2H), 1,97-2,08 (m, 1H), 2,21 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 2,23-2,50 (m, 3H), 3,29 (dd, J = 8,7, 8,7 Hz, 1H), 3,80 (dd, J = 8,7, 4,2 Hz, 1H), 4,41-4,49 (m, 1H), 4,63-4,72 (m, 1H), 5,09 (s, 2H), 5,14 (d, J = 12,3 Hz, 1H), 5,18 (d, J =
12,3 Hz, 1H), 7,25-7,39 (m, 11 H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,2 (CH3), 22,8 (CH2), 25,6 (CH2), 27,5 (3xCH3), 27,6 (CH2), 29,4-29,8 (8xCH2), 30,0 (CH2), 32,0 (CH2), 36,7 (CH2), 51,9 (CH), 53,1 (CH), 61,4 (CH2), 66,6 (CH2), 67,5 (CH2), 74,4 (C), 128,4-128,8 (10xCH), 135,2 (C), 135,8 (C), 170,5 (C), 171,3 (C), 172,4 (C), 173,4 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 131 (65), 199 (100), 682 (60) [M+H]+; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C4oH6iN207
681,4479, trouvée 681,4447.
Exemple 2.2h
(CH2)14CH3
Le composé 2.2h (solide blanc, 93 mg, 0,13 mmol, 30 %) a été obtenu à
5 partir du composé 2.1b en suivant les protocoles généraux B puis C. Rf =
0,11 (cyclohexane/AcOEt 8:2) ; Tf = 69-71 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,86 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,15 (s, 9H), 1,19-1,31 (m, 24H), 1,56-1,63 (m,
2H), 1,96-2,05 (m, 1H), 2,19 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 2,23-2,47 (m, 3H), 3,27 (dd, J = 8,7, 8,7 Hz, 1H), 3,79 (dd, J = 8,7, 4,2 Hz, 1H), 4,41-4,45 (m, 1H), 4,634,68 (m, 1H), 5,07 (s, 2H), 5,14 (s, 2H), 7,22-7,37 (m, 10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,3 (CH3), 22,9 (CH2), 25,7 (CH2), 27,6 (3xCH3), 27,7 (CH2), 29,5-30,2 (11xCH2), 32,1 (CH2), 36,8 (CH2), 52,0 (CH), 53,2 (CH), 61,5 (CH2), 66,7 (CH2), 67,6 (CH2), 74,6 (C), 128,5-128,9 (10xCH), 135,3 (C), 136,0 (C), 170,5 (C), 171,4 (C), 172,5 (C), 173,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%)
199 (15), 710 (100) [M+H]+, 732 (15) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C42H65N2O7 709,4792, trouvée 709,4805.
Exemple 2.2i
COOBn t-BuO'
COOBn (CD2)ioCD3
Le composé 2.2i (solide blanc, 162 mg, 0,24 mmol, 83 %) a été obtenu à partir du composé 2.1b en suivant le protocole général A (purification : colonne chromatographique sur gel de silice, éluant : cyclohexane/AcOEt 9:1 à 7:3)
Rf = 0,28 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 70-72°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 1,15 (s, 9H), 1,94-2,06 (m, 1H), 2,17-2,29 (m, 1H), 2,29-2,48 (m, 2H), 3,29 (dd, J = 8,6, 8,6 Hz, 1H), 3,78 (dd, J = 8,6, 4,1 Hz, 1H), 4,394,48 (m, 1H), 4,60-4,71 (m, 1H), 5,06 (s, 2H), 5,13 (s, 2H), 6,36 (d, J = 6,4 Hz, 1H, NH), 7,22-7,35 (m, 11 H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 13,1 (st, Jc,d = 18,6 Hz, CD3), 21,4 (qt, Jc,d = 18,4 Hz, CD2), 24,5 (qt, Jc,d = 19,2 Hz, CD2), 27,4 (3xCH3), 27,5 (CH2), 27,2-28,8 (6xCD2), 30,0 (CH2), 30,5 (qt, J = 18,7 Hz, CD2), 35,7 (qt, J = 19,5 Hz, CD2), 51,8 (CH), 53,0 (CH), 61,4 (CH2), 66,5 (CH2), 67,4 (CH2), 74,3 (C), 128,3-128,7 (10xCH), 135,2 (C), 135,8 (C), 170,4 (C), 171,2 (C), 172,3 (C), 173,4 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 199 (40), 265 (100), 677 (80) [M+H]+; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C38H34D23N2O7 676,5610, trouvée 676,5610.
Exemple 2.3a .COOH ° (
ΗΟ'χ^γ^χΝ'''^COOH O^NH H (CH2)12CH3
Le composé 2.3a (solide blanc, 55 mg, 0,13 mmol, 98 %) a été obtenu à partir du composé 2.2a en suivant les protocoles généraux D1 puis K.
Tf = 125-135°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,2 Hz, 3H), 1,19-1,42 (m, 20H), 1,54-1,71 (m, 2H), 2,23-2,33 (m, 2H), 2,76-2,93 (m,
2H), 3,71-3,83 (m, 2H), 4,47 (dd, J = 5,4, 5,4 Hz, 1H), 4,74 (dd, J = 5,4, 5,4
Hz, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 30,4-30,9 (8xCH2), 33,1 (CH2), 36,9 (CH2), 37,0 (CH2), 50,3 (CH), 56,7 (CH), 63,0 (CH2), 172,2 (C), 174,3 (C), 176,5 (C), 176.5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 429 (100) [M-Hp ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour
C2iH37N2O7 429,2601, trouvée 429,2591.
Exemple 2.3b
(CH2)6CH3
Le composé 2.3b (solide incolore hygroscopique, 27 mg, 0,07 mmol, quantitatif) a été obtenu à partir du composé 2.2b en suivant les protocoles généraux D1 puis K.
Tf = 39-40°C ; RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ ppm 0,89 (t, J = 7,0 Hz, 25 3H), 1,23-1,39 (m, 8H), 1,57-1,67 (m, 2H), 1,90-2,02 (m, 1H), 2,16-2,32 (m,
3H), 2,40 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 3,72-3,84 (m, 2H), 4,42-4,50 (m, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, MeOD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,6 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 30,1-31,1 (3xCH2), 32,8 (CH2), 36,9 (CH2), 53,3 (CH), 56,7 (CH), 63,0 (CH2), 172,6 (C), 175,0 (C), 176,5 (C), 176,6 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 360 (100) [Μ-H]’ ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C16H27N2O7 359,1818, trouvée 359,1803.
Exemple 2.3c
(CH2)7CH3
Le composé 2.3c (solide incolore hygroscopique, 31 mg, 0,08 mmol, quantitatif) a été obtenu à partir du composé 2.2c en suivant les protocoles généraux D1 puis K.
Tf = 46°C ; RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ ppm 0,89 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 1,22-1,40 (m, 10H), 1,56-1,68 (m, 2H), 1,90-2,02 (m, 1H), 2,15-2,32 (m, 3H), 2,40 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 3,73-3,83 (m, 2H), 4,43-4,50 (m, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, MeOD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 30,215 31,1 (4xCH2), 33.0 (CH2), 36,9 (CH2), 53,3 (CH), 56,7 (CH), 63,0 (CH2),
172,6 (C), 175,1 (C), 176,5 (C), 176,6 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 373 (100) [M-H]’ ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C17H29N2O7 373,1975, trouvée 373,1992.
Exemple 2.3d
(CH2)8CH3
Le composé 2.3d (solide blanc, 182 mg, 0,47 mmol, 94 %) a été obtenu 2 5 à partir du composé 2.2d en suivant les protocoles généraux D1 puis K.
Tf = 53-57°C; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,89 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,22-1,38 (m, 12H), 1,56-1,69 (m, 2H), 1,90-2,03 (m, 1H), 2,14-2,26 (m, 1H), 2,29 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 2,36-2,43 (m, 2H), 3,73-3,84 (m, 2H), 4,42-4,52 (m, 2H). RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 30,3-30,5 (4xCH2), 31,1 (CH2), 33,0 (CH2), 36,9 (CH2),
53,3 (CH), 56,6 (CH), 63,1 (CH2), 172,5 (C), 174,9 (C), 176,5 (C), 176,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 387 (100) [M-Hp, 404 (20) ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C18H31N2O7 387,2131, trouvée 387,2140.
Exemple 2.3e
(CH2)10CH3
Le composé 2.3e (solide blanc, 1,683 g, 4,04 mmol, 70 %) a été obtenu à partir du composé 2.2e en suivant les protocoles généraux D1 puis K.
Tf = 100-102°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,22-1,38 (m, 16H), 1,57-1,67 (m, 2H), 1,91-2,01 (m, 1H), 2,15-2,26 (m, 1H), 2,29 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,37-2,44 (m, 2H), 3,72-3,81 (m, 2H), 4,43-4,51 (m, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 30,4-30,7 (6xCH2), 31,0 (CH2), 33,1 (CH2), 36,9 (CH2),
53,1 (CH), 56,6 (CH), 63,1 (CH2), 172,6 (C), 174,6 (C), 176,4 (C), 176,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%)157 (40), 199 (30), 387 (80), 415 (100) [M-Hp ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C20H35N2O7 415,2444, trouvée 415,2447.
Exemple 2.3f
(CH^nCHs
Le composé 2.3f (solide blanc, 115 mg, 0,27 mmol, 89 %) a été obtenu à partir du composé 2.2f en suivant les protocoles généraux D1 puis K.
Tf = 58-63°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,89 (t, J = 6,9 Hz,
3H), 1,21-1,41 (m, 16H), 1,54-1,68 (m, 2H), 1,90-2,04 (m, 1H), 2,14-2,27 (m,
1H), 2,29 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,36-2,48 (m, 2H), 3,71-3,83 (m, 2H), 4,43-4,53 (m, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,8 (CH2), 30,3-30,9 (7xCH2), 31,0 (CH2), 33,0 (CH2), 36,9 (CH2),
53,1 (CH), 56,6 (CH), 63,1 (CH2), 172,6 (C), 174,6 (C), 176,4 (C), 176,5 (C) ;
Masse (ESI-) m/z (%) 429 (100) [M-Hp, 446 ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C2iH37N2O7 429,2601, trouvée 429,2599.
Exemple 2.3g
O < COOH
HO'
ΟγΝΗ
N' COOH H (CH2)12CH3
Le composé 2.3g (solide blanc, 57 mg, 0,13 mmol, quantitatif) a été obtenu à partir du composé 2.2g en suivant les protocoles généraux D1 puis K.
Tf = 109-112°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz,
3H), 1,19-1,39 (m, 20H), 1,57-1,67 (m, 2H), 1,90-2,02 (m, 1H), 2,16-2,26 (m, 3H), 2,29 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,36-2,45 (m, 2H), 3,71-3,84 (m, 2H), 4,43-4,52 (m, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 30,4-30,9 (8xCH2), 31,1 (CH2), 33,0 (CH2), 36,9 (CH2),
53,3 (CH), 56,6 (CH), 63,1 (CH2), 172,6 (C), 174,9 (C), 176,5 (C), 176,5 (C).
Masse (ESI-) m/z (%) 443 (100) [M-Hp ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C22H39N2O7 443,2757, trouvée 443,2754.
Exemple 2.3h
HO
O;
NH
COOH
Ν' COOH H (CH2)14CH3
Le composé 2.3h (solide blanc, 36 mg, 0,08 mmol, 65 %) a été obtenu à partir du composé 2.2h en suivant les protocoles généraux D1 puis K.
Tf= 111-113°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,19-1,37 (m, 24H), 1,55-1,68 (m, 2H), 1,90-2,03 (m, 1H), 2,15-2,26 (m, 1H), 2,29 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,36-2,44 (m, 2H), 3,72-3,82 (m, 2H), 4,43-4,52 (m, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 30,4-30,8 (10xCH2), 31,1 (CH2), 33,1 (CH2), 36,9 (CH2),
53,2 (CH), 56,6 (CH), 63,1 (CH2), 172,6 (C), 174,7 (C), 176,5 (C), 176,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 471 (100) [M-Hp ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C24H43N2O7 471,3070, trouvée 471,3057.
Exemple 2.3i
(CD2)ioCD3
Le composé 2.3i (solide blanc, 33 mg, 0,08 mmol, 75 %) a été obtenu à partir du composé 2.2i en suivant les protocoles généraux D1 puis K.
Tf > 80 °C (décomposé) ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 1,90-2,03 (m, 1H), 2,14-2,27 (m, 1H), 2,33-2,48 (m, 2H), 3,72-3,84 (m, 2H), 4,41-4,54 (m, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 13,3 (st, Jc.d = 19,8 Hz, CD3),
22,4 (qt, Jc,d = 19,6, Hz, CD2), 25,7 (qt, Jc,d = 20,2 Hz, CD2), 27,9 (CH2), 28,6-29,9 (6xCD2), 31,1 (CH2), 31,7 (qt, Jc,d = 16,9 Hz, CD2), 36,1 (qt, Jc,d = 21,1 Hz, CD2), 53,2 (CH), 56,6 (CH), 63,1 (CH2), 172,6 (C), 174,8 (C), 176,5 (C), 176,6 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 438 (100) [M-Hp ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C2oH-i2D23N207 438,3888, trouvée 438,3889.
Exemple 4: Composés 3.1 à 3.9
3.6
i. Bromure d’allyle ou de propargyle, NaH, DMF ; ii. H-D-Glu(OBn)-OBn.ptosylate, TBTU, DIEA, DMF ; iii. TFA, CH2CI2 ; iv. R3COCI, DMAP, pyridine,
CH2CI2 ; v. tétraacétate de 1-thio-3-D-glucose, DMPA, THF, UV ; vi. Azidosaccharide (acétate) ou PEG-N3, CUSO4.5H2O, ascorbate de sodium, DMF, H2O ; vii. MeONa, MeOH puis Dowex ; viii. LiOH, THF/H2O ; ix. H2,Pd/C, MeOH. Avec R1 = propargyle ou allyle ; R2 = -OBn ou -NHCH2COOBn ; R2a = -OH ou -NHCH2COOH ; R3 = -(CH2)nCH3, -CH[(CH2)nCH3]2 ou 10 (CH2)nCyclohexyle.
A une solution de L-Boc-Serine (1,00 g, 4,87 mmol, 1 équiv.) dans le DMF anhydre est ajouté, à 0°C, le NaH (60%, 487 mg, 12,2 mmol, 2,2 équiv.). Après 30 min. d’agitation à 0 °C, le bromure d’allyle (6,09 mmol, 1,1 équiv.) est ajouté goutte à goutte. Le milieu réactionnel est agité 30 min. à
0 0°C puis une nuit à TA. La reaction est stoppée par ajout de H2O (5 mL) puis le milieu réactionnel est acidifié par ajout d’une solution aqueuse de HCl 10 % (pH = 1) avant d’être extrait par AcOEt (3x50 ml_). Les phases organiques sont rassemblées, lavées à l’eau puis par une solution aqueuse saturée de NaCl, séchées sur MgSCU, filtrées et concentrées sous vide. Le produit brut obtenu (huile incolore) est directement utilisé pour l’étape suivante.
Composé 3.1b
OH t-BuO
Le produit 3.1b (huile jaunâtre, 915 mg, 3,76 mmol, 77 %) a été obtenu en suivant le protocole ci-dessus (exemple 3.1a) en utilisant le bromure de propargyle. Le produit brut obtenu (huile incolore) est directement utilisé pour l’étape suivante.
Composé 3.2a
Le composé 3.2a (huile incolore, 569 mg, 1,03 mmol, 50 % sur 2 étapes) a été obtenu à partir du composé 3.1a en suivant le protocole général A (purification : colonne chromatographique sur gel de silice, éluant : cyclohexane/AcOEt 8:2 à 7:3).
Rf = 0,40 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 1,44 (s, 9H), 1,95-2,07 (m, 1H), 2,21-2,32 (m, 1H), 2,30-2,48 (m, 2H), 3,51 (dd, J = 9,3, 6,4 Hz, 1H), 3,80 (dd, J = 9,3, 3,5 Hz, 1H), 3,92-4,03 (m, 2H), 4,27 (s, 1H), 4,66-4,73 (m, 1H), 5,09 (s, 2H), 5,15 (ddd, J = 10,4, 3,0, 1,6 Hz, 1H), 5,16 (s, 2H), 5,23 (ddd, J = 17,2, 3,0, 1,6 Hz, 1H), 5,37 (s, 1H, NH), 5,83 (ddt, J = 17,2, 10,4, 5,9 Hz, 1H), 7,01 (d, J = 7,8 Hz, 1H, NH), 7,27-7,40 (m,
10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 27,5 (CH2), 28,4 (3xCH3), 30,0 (CH2), 51,8 (CH), 54,2 (CH), 66,6 (CH2), 67,5 (CH2), 69,5 (CH2), 72,3 (CH2),
80,4 (C), 117,8 (CH2), 128,4-128,8 (10xCH), 134,0 (CH), 135,3 (C), 135,9 (C), 155,6(C), 170,3(0, 171,4 (C), 172,5 (C);
Masse (ESI+) m/z (%) 455 (30), 499 (40), 555 (100) [M+H]+, 577 (15) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C3oH39N2Os 555,2706, trouvée 555,2711.
Composé 3.2b
COOBn
Le composé 3.2b (huile jaunâtre, 1,91 g, 3,45 mmol, 77 %) a été obtenu à partir du composés 3.1a en suivant le protocole général A (purification : colonne chromatographique sur gel de silice, éluant : cyclohexane/AcOEt 9:1 à 7:3).
Rf = 0,33 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; RMN 1H (400 MHz, CDCI3) δ ppm 1,44 (s, 9H), 1,95-2,08 (m, 1H), 2,22-2,32 (m, 1H), 2,32-2,53 (m, 3H), 3,66 (dd, J = 9,3, 6,1 Hz, 1H), 3,87 (dd, J = 9,3, 4,0 Hz, 1H), 4,08 (dd, J = 15,9,
2,4 Hz, 1H), 4,15 (dd, J= 15,9, 2,4 Hz, 1H), 4,25-4,38 (m, 1H), 4,66-4,74 (m, 1H), 5,08 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 5,38 (s, 1H, NH), 6,98 (d, J = 7,9 Hz, 1H, NH), 7,26-7,39 (m, 10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCI3) δ ppm 27,4 (CH2), 28,3 (3xCH3), 30,0 (CH2), 51,7 (CH), 54,0 (CH), 58,6 (CH2), 66,5 (CH2), 67,4 (CH2), 69,3 (CH2), 75,4 (CH), 79,0 (C), 80,4 (C), 128,3-128,7 (10xCH), 135,2 (C), 135,8 (C), 155,6 (C), 170,0 (C), 171,4 (C), 172,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 453 (40), 497 (35), 553 (100) [M+H]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C3oH37N208 553,2550, trouvée 553,2528.
Composé 3.2c
t-BuO
COOBn
ΗΝ. .COOBn
Le composé 3.2c (huile jaunâtre, 886 mg, 1,45 mmol, 65 %) a été obtenu à partir du composés 3.1b et le H-L-Glu(OBn)-Gly-OBn (non décrit) en suivant le protocole général A (purification : colonne chromatographique sur gel de silice, éluant : cyclohexane/AcOEt 9:1 à 7:3).
Rf = 0,28 (cyclohexane/AcOEt 5:5) ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 1,43 (s, 9H), 1,99-2,13 (m, 1H), 2,15-2,27 (m, 1H), 2,39 (t, J = 2,4 Hz, 1H), 2,42-2,54 (m, 1H), 2,54-2,66 (m, 1H), 3,69 (dd, J = 9,2, 5,6 Hz, 1H), 3,86 (dd, J = 9,3, 4,4 Hz, 1H), 3,95 (dd, J = 17,9, 5,1 Hz, 1H), 4,12 (dd, J = 17,9, 6,0 Hz, 1H), 4,09 (dd, J = 15,8, 2,4 Hz, 1H), 4,14 (dd, J = 15,8, 2,4 Hz, 1H), 4,22-4,32 (m, 1H), 4,52-4,61 (m, 1H), 5,11 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 5,12 (d, J =
12.2 Hz, 1H), 5,14 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 5,17 (d, J = 12,2 Hz, 1H), 5,41 (d, J = 5,3 Hz, 1H, NH), 7,15 (bs, 1H, NH), 7,28-7,43 (m, 10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 26,9 (CH2), 28,4 (3xCH3), 30,5 (CH2), 52,9 (CH), 54,7 (CH), 58,8 (CH2), 66,8 (CH2), 67,2 (CH2), 69,5 (CH2), 75,6 (CH), 78,9 (C), 80,8 (C), 128,4-128,7 (10xCH), 135,4 (C), 135,8 (C), 155,9 (C), 169,5 (C), 170,3 (C),
171.2 (C), 174,0 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 610 (15) [M+H]+, 632 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C32H4oN309 610,2765, trouvée 610,2764.
Composé 3.3a
COOBn
COOBn (CH2)8CH3
Le composé 3.3a (solide blanc, 562 mg, 0,92 mmol, 54 %) a été obtenu à partir du composé 3.2a en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,21 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 96-97°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,87 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,17-1,36 (m, 12H), 1,56-1,67 (m, 2H),
1,95-2,08 (m, 1H), 2,15-2,30 (m, 3H), 2,30-2,48 (m, 2H), 3,46 (dd, J = 9,3, 7,1 Hz, 1H), 3,82 (dd, J = 9,4, 4,1 Hz, 1H), 3,92-4,05 (m, 2H), 4,54-4,62 (m, 2H), 4,63-4,71 (m, 1H), 5,09 (s, 2H), 5,11-5,18 (m, 3H), 5,23 (ddd, J = 17,3, 3,1, 1,6 Hz, 1H), 5,80 (ddt, J = 17,3, 10,4, 5,7 Hz, 1H), 6,34 (d, J = 6,8 Hz, 1H, NH), 7,10 (d, J = 7,8 Hz, 1H, NH), 7,29-7,39 (m, 10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,2 (CH3), 22,8 (CH2), 25,6 (CH2), 27,3 (CH2), 29,4-29,5 (4xCH2), 30,0 (CH2), 32,0 (CH2), 36,7 (CH2), 51,9 (CH), 52,5 (CH), 66,6 (CH2), 67,5 (CH2), 69,2 (CH2), 72,4 (CH2), 117,9 (CH2), 128,4-128,8 (10xCH), 134,0 (CH), 135,2 (C), 135,8 (C), 170,1 (C), 171,3 (C), 172,5 (C), 173,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 495 (30), 610 (10) [M+H]+, 632 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C3sH49N2O7 609,3540, trouvée 609,3536.
Composé 3.3b
COOBn
Ό
O^NH (CH2)i0CH3
N'' OOOBn
Le composé 3.3b (solide blanc, 801 mg, 1,26 mmol, 87 %) a été obtenu à partir du composé 3.2a en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,28 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 101-102°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,15-1,35 (m, 16H), 1,55-1,68 (m, 2H), 1,95-2,08 (m, 1H), 2,15-2,30 (m, 3H), 2,30-2,48 (m, 2H), 3,46 (dd, J = 9,3, 7,1 Hz, 1H), 3,82 (dd, J = 9,4, 4,1 Hz, 1H), 3,92-4,05 (m, 2H), 4,554,62 (m, 1H), 4,64-4,71 (m, 1H), 5,09 (s, 2H), 5,12-5,18 (m, 3H), 5,23 (ddd, J = 17,3, 3,1, 1,5 Hz, 1H), 5,83 (ddt, J = 17,3, 10,4, 5,7 Hz, 1H), 6,35 (d, J = 6,8 Hz, 1H, NH), 7,10 (d, J = 7,8 Hz, 1H, NH), 7,28-7,39 (m, 10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,2 (CHs), 22,8 (CH2), 25,7 (CH2), 27,3 (CH2),
29,4-29,7 (6xCH2), 30,0 (CH2), 32,0 (CH2), 36,7 (CH2), 51,9 (CH), 52,5 (CH),
66,6 (CH2), 67,5 (CH2), 69,2 (CH2), 72,4 (CH2), 117,9 (CH2), 128,4-128,8 (10xCH), 134,0 (CH), 135,2 (C), 135,8 (C), 170,1 (C), 171,3 (C), 172,5 (C),
173,5 (C); Masse (ESI+) m/z (%) 307 (15), 638 (10) [M+H]+, 660 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C37H53N2O7 637,3853, trouvée 637,3837.
Composé 3.3c
(CH2)12CH3
Le composé 3.3c (solide blanc, 208 mg, 0,31 mmol, 75 %) a été obtenu à partir du composé 3.2a en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,22 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 90-92°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,16-1,37 (m, 20H), 1,54-1,68 (m, 2H),
1,95-2,08 (m, 1H), 2,19-2,31 (m, 3H), 2,31-2,49 (m, 2H), 3,48 (dd, J = 9,3,
7,0 Hz, 1H), 3,80 (dd, J = 9,3, 4,1 Hz, 1H), 3,91-4,04 (m, 2H), 4,58-4,72 (m,
2H), 5,09 (s, 2H), 5,10-5,18 (m, 3H), 5,22 (ddd, J = 17,2, 3,1, 1,5 Hz, 1H), 5,82 (ddt, J = 17,2, 10,5, 5,7 Hz, 1H), 6,47 (d, J = 6,9 Hz, 1H, NH), 7,21 (d, J = 7,8 Hz, 1H, NH), 7,27-7,39 (m, 10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm
14.2 (CH3), 22,7 (CH2), 25,6 (CH2), 27,2 (CH2), 29,3-29,7 (8xCH2), 30,0
0 (CH2), 32,0 (CH2), 36,5 (CH2), 51,9 (CH), 52,4 (CH), 66,6 (CH2), 67,4 (CH2),
69.2 (CH2), 72,3 (CH2), 117,8 (CH2), 128,3-128,7 (10xCH), 133,9 (CH), 135,2 (C), 135,8 (C), 170,2 (C), 171,2 (C), 172,5 (C), 173,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%)131 (70), 199 (100), 666 (95) [M+H]+, 688 (30) [M+Na]+; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C39H57N2O7 665,4166, trouvée 665,4174.
5 Composé 3.3d ο < cooBn
ΌΟΟΒη
NH (CH2)8CH3
Le composé 3.3d (solide blanc, 813 mg, 1,34 mmol, 67 %) a été obtenu à partir du composé 3.2b en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,13 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 93-94°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,87 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,19-1,35 (m, 12H), 1,56-1,67 (m, 2H), 1,97-2,10 (m, 1H), 2,16-2,32 (m, 3H), 2,32-2,51 (m, 3H), 3,62 (dd, J = 9,2,
6,6 Hz, 1H), 3,88 (dd, J = 9,2, 4,0 Hz, 1H), 4,10 (dd, J = 16,0, 2,4 Hz, 1H), 4,18 (dd, J = 16,0, 2,4 Hz, 1H), 4,58-4,72 (m, 2H), 5,09 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 6,32 (d, J = 7,0 Hz, 1H, NH), 7,02 (d, J = 7,8 Hz, 1H, NH), 7,28-7,40 (m, 10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,2 (CHs), 22,8 (CH2), 25,6 (CH2), 27,3 (CH2), 29,4-29,5 (4xCH2), 30,1 (CH2), 32,0 (CH2), 36,7 (CH2), 52,0 (CH), 52,4 (CH), 58,7 (CH2), 66,7 (CH2), 67,5 (CH2), 69,0 (CH2), 75,5 (CH), 79,0 (C),
128,4-128,8 (10xCH), 135,2 (C), 135,9 (C), 169,8 (C), 171,3 (C), 172,6 (C),
173,5 (C); Masse (ESI+) m/z (%) 491 (100), 608 (20) [M+H]+, 630 (95) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C35H47N2O7 607,3383, trouvée 607,3373.
Composé 3.3e
Ο rf^COOBn ΌΟΟΒΠ
Ο γ NH H (CH2)i0CH3
Le composé 3.3e (solide blanc, 651 mg, 1,03 mmol, 77 %) a été obtenu à partir du composé 3.2b en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,16 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 99-100°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,19-1,35 (m, 16H), 1,56-1,67 (m, 2H),
1,96-2,09 (m, 1H), 2,16-2,31 (m, 3H), 2,32-2,50 (m, 3H), 3,62 (dd, J = 9,2,
6,6 Hz, 1H), 3,89 (dd, J = 9,2, 4,0 Hz, 1H), 4,10 (dd, J = 16,0, 2,4 Hz, 1H), 4,18 (dd, J = 16,0, 2,4 Hz, 1H), 4,59-4,72 (m, 2H), 5,09 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 6,32 (d, J = 7,0 Hz, 1 H, NH), 7,02 (d, J = 7,8 Hz, 1 H, NH), 7,27-7,39 (m, 10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,2 (CH3), 22,8 (CH2), 25,6 (CH2), 27,3 (CH2), 29,4-29,7 (6xCH2), 30,1 (CH2), 32,0 (CH2), 36,7 (CH2), 52,0 (CH), 52,4 (CH), 58,7 (CH2), 66,7 (CH2), 67,5 (CH2), 69,0 (CH2), 75,5 (CH), 79,0 (C),
128,4-128,8 (10xCH), 135,2 (C), 135,9 (C), 169,8 (C), 171,3 (C), 172,6 (C),
173,5 (C1 ’) ; Masse (ESI+) m/z (%) 636 (25) [M+H]+, 658 (100) [M+Na]+ ;
SMHR (ESI+) m/z calculée pour C37HsiN2O7 635,3696, trouvée 635,3697.
Composé 3.3f
(CH2)12CH3
Le composé 3.3f (solide blanc, 1,085 g, 1,64 mmol, 84 %) a été obtenu à partir du composé 3.2b en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,21 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 101-103°C ; RMN 1H (400
MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,17-1,37 (m, 20H), 1,56-1,66 (m, 2H), 1,97-2,08 (m, 1H), 2,14-2,32 (m, 3H), 2,32-2,50 (m, 3H), 3,62 (dd, J = 9,2, 6,6 Hz, 1H), 3,89 (dd, J = 9,2, 4,1 Hz, 1H), 4,10 (dd, J = 16,0, 2,4 Hz, 1H), 4,17 (dd, J = 16,0, 2,4 Hz, 1H), 4,62-4,72 (m, 2H), 5,09 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 6,39 (d, J = 7,1 Hz, 1H, NH), 7,10 (d, J = 7,9 Hz, 1H, NH), 7,28-7,39 (m,
10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,2 (CHs), 22,8 (CH2), 25,6 (CH2),
27,2 (CH2), 29,4-29,8 (8xCH2), 30,1 (CH2), 32,0 (CH2), 36,6 (CH2), 51,9 (CH),
52,4 (CH), 58,7 (CH2), 66,6 (CH2), 67,5 (CH2), 69,0 (CH2), 75,5 (CH), 79,0 (C), 128,4-128,8 (10xCH), 135,2 (C), 135,8 (C), 169,8 (C), 171,3 (C), 172,6 (C), 173,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 199 (15), 664 (100) [M+H]+, 686 (20)
5 [M+Na]+; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C39Hs5N2O7 663,4009, trouvée
663,4006.
Composé 3.3g
< COOBn 'N'''^COOBn O^NH H (CH2)17CH3
Le composé 3.3g (solide blanc, 467 mg, 0,64 mmol, 47 %) a été obtenu à partir du composé 3.2b en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,18 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 105-108°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,18-1,36 (m, 30H), 1,56-1,68 (m, 2H), 1,96-2,09 (m, 1H), 2,15-2,32 (m, 3H), 2,33-2,50 (m, 3H), 3,62 (dd, J = 9,2, 6,6 Hz, 1H), 3,89 (dd, J = 9,2, 4,0 Hz, 1H), 4,10 (dd, J = 16,0, 2,4 Hz, 1H), 4,17 (dd, J = 16,0, 2,4 Hz, 1H), 4,60-4,72 (m, 2H), 5,09 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 6,35 (d, J = 7,0 Hz, 1 H, NH), 7,05 (d, J = 7,9 Hz, 1 H, NH), 7,29-7,39 (m, 10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,2 (CH3), 22,8 (CH2), 25,6 (CH2),
27,2 (CH2), 29,4-29,8 (13xCH2), 30,1 (CH2), 32,0 (CH2), 36,6 (CH2), 52,0 (CH), 52,4 (CH), 58,7 (CH2), 66,6 (CH2), 67,5 (CH2), 69,0 (CH2), 75,5 (CH), 79,0 (C) ; 128,4-128,8 (10xCH), 135,2 (C), 135,8 (C), 169,8 (C), 171,3 (C),
172,6 (C), 173,6 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 734 (55) [M+H]+, 756 (100) [M+Na]+; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C44H64N2O?Na 755,4611, trouvée 755,4612.
Composé 3.3h
Le composé 3.3h (solide blanc, 206 mg, 0,32 mmol, 65 %) a été obtenu à partir du composé 3.2b en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,38 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 87-90°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,84 (t, J = Q,7 Hz, 3H), 0,86 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 1,15-1,32 (m, 12H), 1,32-1,46 (m, 2H), 1,51-1,67 (m, 2H), 1,94-2,14 (m, 2H), 2,37 (dd, J = 2,4, 2,4 Hz, 1H), 2,21-2,50 (m, 3H), 3,63 (dd, J = 9,2, 6,3 Hz, 1H), 3,89 (dd, J = 9,2, 4,7 Hz, 1H), 4,09 (dd, J = 16,0, 2,4 Hz, 1H), 4,14 (dd, J = 16,0, 2,4 Hz,
1H), 4,65-4,77 (m, 2H), 5,08 (s, 2H), 5,11 (d, J = 12,2 Hz, 1H), 5,15 (d, J =
12,2 Hz, 1H), 6,44 (d, J = 7,1 Hz, 1H, NH), 7,16 (d, J = 8,0 Hz, 1H, NH), 7,247,37 (m, 10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,0 (2xCH3), 22,4 (CH2),
22,5 (CH2), 27,2, 27,2 (2xCH2), 27,4 (CH2), 29,9 (CH2), 31,8 (CH2), 31,9 (CH2), 32,8 (CH2), 32,9 (CH2), 47,7 (CH), 51,6 (CH), 52,2 (CH), 58,5 (CH2),
66,4 (CH2), 67,3 (CH2), 69,1 (CH2), 75,4 (CH), 78,9 (C), 128,2-128,6 (10xCH), 135,1 (C), 135,8 (C), 169,6 (C), 171,1 (C), 172,3 (C), 176,3 (C). Masse (ESI+) m/z (%) 413 (30), 635 (40) [M+H]+, 657 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C37H5oN207Na 657,3516, trouvée 657,3532.
Composé 3.3i
Le composé 3.3i (solide blanc, 361 mg, 0,43 mmol, 40 %) a été obtenu à partir du composé 3.2b en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,52 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 91-93°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,87 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 0,88 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,11-1,33 (m, 40H), 1,35-1,47 (m, 2H), 1,50-1,65 (m, 2H), 1,94-2,14 (m, 2H), 2,37 (dd, J = 2,4, 2,4 Hz, 1H), 2,21-2,50 (m, 3H), 3,62 (dd, J = 9,2, 6,6 Hz, 1H), 3,90 (dd, J = 9,2, 4,0 Hz, 1H), 4,10 (dd, J = 16,0, 2,4 Hz, 1H), 4,18 (dd, J = 16,0, 2,4 Hz, 1H), 4,62-4,75 (m, 2H), 5,09 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 6,34 (d, J = 7,0 Hz, 1H, NH), 7,01 (d, J = 7,9 Hz, 1H, NH), 7,26-7,38 (m, 10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,2 (2xCHs), 22,8 (2xCH2), 27,5 (CH2), 27,7 (2xCH2), 29,530,0 (16xCH2), 32,0 (CH2), 32,9 (CH2), 33,1 (CH2), 47,9 (CH), 51,8 (CH),
52,2 (CH), 58,6 (CH2), 66,6 (CH2), 67,5 (CH2), 69,0 (CH2), 75,5 (CH), 79,0 (C), 128,4-128,7 (10xCH), 135,2 (C), 135,8 (C), 169,6 (C), 171,2 (C), 172,4 (C), 176,5 (C). Masse (ESI+) m/z (%) 853 (100) [M+Na]+; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C5iH78N2O7Na 853,5707, trouvée 853,5693.
Composé 3.3j
Le composé 3.3j (solide blanc, 337 mg, 0,54 mmol, 66 %) a été obtenu à partir du composé 3.2b en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,13 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 100-102°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,76-0,91 (m, 2H), 1,05-1,24 (m, 6H), 1,23-1,35 (m, 2H), 1,53-1,73 (m, 7H), 1,94-2,08 (m, 1H), 2,13-2,31 (m, 3H), 2,31-2,52 (m, 3H), 3,62 (dd, J = 9,2, 6,5 Hz, 1H), 3,89 (dd, J = 9,2, 4,1 Hz, 1H), 4,09 (dd, J = 16,0, 2,4 Hz, 1H), 4,16 (dd, J = 16,0, 2,4 Hz, 1H), 4,61-4,72 (m, 2H), 5,09 (s, 2H), 5,13 (s, 2H), 6,38 (d, J = 7,1 Hz, 1H, NH), 7,11 (d, J = 7,9 Hz, 1H, NH), 7,28-7,39 (m, 10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 25,9 (CH2), 26,5 (2xCH2), 26,6 (CH2), 26,8 (CH2), 27,2 (CH2), 30,1 (CH2), 33,4 (2xCH2), 36,6 (CH2), 37,2 (CH2), 37,5 (CH), 51,9 (CH), 52,3 (CH), 58,6 (CH2), 66,6 (CH2),
67,4 (CH2), 69,0 (CH2), 75,4 (CH), 79,0 (C), 128,3-128,7 (10xCH), 135,2 (C),
135,8 (C), 169,8 (C), 171,2 (C), 172,6 (C), 173,5 (C). Masse (ESI+) m/z (%) 619 (60) [M+H]+, 641 (100) [M+Na]+; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C36H46N2O?Na 641,3203, trouvée 641,3199.
Composé 3.3k
Le composé 3.3k (solide blanc, 506 mg, 0,70 mmol, 72 %) a été obtenu à partir du composé 3.2c en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,19 (cyclohexane/AcOEt 5:5) ; Tf = 122-123°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,87 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,15-1,35 (m, 20H), 1,54-1,69 (m, 2H), 2,01-2,29 (m, 4H), 2,39 (dd, J = 2,4, 2,4 Hz, 1H), 2,43-2,66 (m, 2H), 3,67 (dd, J = 9,3, 6,0 Hz, 1H), 3,89 (dd, J = 9,3, 4,3 Hz, 1H), 3,96 (dd, J = 17,9, 5,4 Hz, 1H), 4,10 (dd, J = 15,8, 2,4 Hz, 1H), 4,14 (dd, J = 17,9, 6,2 Hz, 1H), 4,15 (dd, J= 15,8, 2,4 Hz, 1H), 4,54-4,63 (m, 2H), 5,11 (s, 2H), 5,12 (d, J = 12,2 Hz, 1 H), 5,16 (d, J = 12,2 Hz, 1 H), 6,45 (d, J = 6,8 Hz, 1 H, NH), 7,21 (dd, J = 6,2, 5,4 Hz, 1H, NH), 7,28-7,38 (m, 10H), 7,57 (d, J = 7,7 Hz, 1H, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCb) δ ppm 14,2 (CH3), 22,8 (CH2), 25,6 (CH2),
26,7 (CH2), 29,4-29,8 (8xCH2), 30,5 (CH2), 32,0 (CH2), 36,5 (CH2), 41,4 (CH2), 53,0 (CH), 53,1 (CH), 58,8 (CH2), 66,8 (CH2), 67,2 (CH2), 69,4 (CH2),
75,6 (CH), 78,9 (C), 128,3-128,7 (10xCH), 135,4 (C), 135,7 (C), 169,6 (C), 170,0 (C), 171,1 (C), 173,9 (C), 174,2 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 720 (20) [M+H]+, 742 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C^HsyNsOeNa 742,4043, trouvée 742,4042.
Composé 3.4a
(CH2)8CH3
Le composé 3.4a (huile incolore, 468 mg, 0,48 mmol, 73 %) a été obtenu à partir du composé 3.3a en suivant le protocole général H.
Rf = 0,21 (cyclohexane/AcOEt 1:1) ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,83 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,14-1,32 (m, 12H), 1,51-1,64 (m, 2H), 1,70-1,86 (m, 2H), 1,95 (s, 3H), 1,96 (s, 3H), 1,99 (s, 3H), 2,01 (s, 3H), 1,95-2,05 (m, 1H), 2,14-2,27 (m, 3H), 2,28-2,45 (m, 2H), 2,61-2,75 (m, 2H), 3,43 (dd, J = 9,4,
6,6 Hz, 1 H), 3,48 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 3,70 (ddd, J = 9,3, 4,9, 2,4 Hz, 1 H), 3,76 (dd, J = 9,4, 4,0 Hz, 1H), 4,09 (dd, J = 12,3, 2,4 Hz, 1H), 4,21 (dd, J = 12,3,
4,9 Hz, 1H), 4,47 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 4,51-4,58 (m, 1H), 4,59-4,67 (m, 1H),
5,00 (dd, J = 10,0, 10,0 Hz, 1H), 5,00 (dd, J = 10,0, 10,0 Hz, 1H), 5,05 (s, 2H), 5,11 (s, 2H), 5,21 (dd, J =9,3, 9,3 Hz, 1 H), 6,46 (d, J = 7,0 Hz, 1 H, NH), 7,17 (d, J = 7,8 Hz, 1H, NH), 7,23-7,35 (m, 10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,0 (CH3), 20,5 (2xCH3), 20,6 (CH3), 20,7 (CH3), 22,6 (CH2),
25,5 (CH2), 26,7 (CH2), 27,1 (CH2), 29,2-29,5 (4xCH2), 29,5 (CH2), 29,9 (CH2), 31,8 (CH2), 36,4 (CH2), 51,7 (CH), 52,4 (CH), 62,1 (CH2), 66,4 (CH2),
67,3 (CH2), 68,4 (CH), 69,5 (CH2), 69,8 (CH2), 69,8 (CH), 73,8 (CH), 75,7 (CH), 83,6 (CH), 128,2-128,6 (10xCH), 135,1 (C), 135,7 (C), 169,3 (2xC), 170,0 (2xC), 170,6 (C), 171,2 (C), 172,4 (C), 173,4 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 996 (100) [M+Na]+; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C49H69N2Oi6S 973,4368, trouvée 973,4379.
Le composé 3.4b (huile incolore, 791 mg, 0,79 mmol, 71 %) a été obtenu à partir du composé 3.3b en suivant le protocole général H.
Rf = 0,18 (cyclohexane/AcOEt 1:1) ; RMN 1H (400 MHz, CDCI3) δ ppm 0,85 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,14-1,34 (m, 16H), 1,52-1,65 (m, 2H), 1,71-1,90 (m, 2H), 1,97 (s, 3H), 1,98 (s, 3H), 2,01 (s, 3H), 2,03 (s, 3H), 1,95-2,05 (m, 1H), 2,14-2,29 (m, 3H), 2,29-2,47 (m, 2H), 2,62-2,77 (m, 2H), 3,44 (dd, J = 9,4,
7,2 Hz, 1H), 3,50 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 3,72 (ddd, J = 10,1,4,9, 2,4 Hz, 1H), 3,79 (dd, J = 9,4, 4,0 Hz, 1H), 4,11 (dd, J = 12,3, 2,4 Hz, 1H), 4,23 (dd, J =
12,3,4,9 Hz, 1H), 4,48 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 4,51-4,58 (m, 1H), 4,59-4,68 (m, 1H), 5,02 (dd, J = 10,0, 9,4 Hz, 1H), 5,07 (dd, J = 10,1, 9,4 Hz, 1H), 5,07 (s, 2H), 5,14 (s, 2H), 5,22 (dd, J = 9,4, 9,4 Hz, 1 H), 6,41 (d, J = 6,9 Hz, 1 H, NH), 7,15 (d, J = 7,8 Hz, 1H, NH), 7,25-7,38 (m, 10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,1 (CH3), 20,6 (2xCH3), 20,7 (CH3), 20,8 (CH3), 22,7 (CH2),
25,6 (CH2), 26,8 (CH2), 27,2 (CH2), 29,3-29,6 (7xCH2), 30,0 (CH2), 31,9 (CH2), 36,5 (CH2), 51,8 (CH), 52,5 (CH), 62,2 (CH2), 66,5 (CH2), 67,4 (CH2),
68,4 (CH), 69,6 (CH2), 69,8 (CH2), 69,8 (CH), 73,9 (CH), 75,8 (CH), 83,7 (CH), 128,3-128,7 (10xCH), 135,2 (C), 135,8 (C), 169,4 (2xC), 170,1 (2xC),
170,7 (C), 171,3 (C), 172,5 (C), 173,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1002 (20) [M+H]+, 1024 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C5iH73N20i6S 1001,4681, trouvée 1001,4655.
Le composé 3.4c (solide blanc, 192 mg, 0,19 mmol, 70 %) a été obtenu à partir du composé 3.3c en suivant le protocole général H
Le composé 3.4c (solide blanc, 192 mg, 0,19 mmol, 70 %) a été obtenu à partir du composé 3.3c en suivant le protocole général H.
Rf = 0,13 (cyclohexane/AcOEt 1:1) ; Tf = 48-50°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,86 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,15-1,34 (m, 20H), 1,54-1,67 (m, 2H), 1,74-1,89 (m, 2H), 1,97, 1,99, 2,02, 2,04 (s, 12H), 1,95-2,09 (m, 1H), 2,142,29 (m, 3H), 2,30-2,47 (m, 2H), 2,63-2,77 (m, 2H), 3,44 (dd, J = 9,2, 6,8 Hz, 1H), 3,51 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 3,72 (ddd, J = 10,0, 4,8, 2,3 Hz, 1H), 3,80 (dd, J = 9,2, 3,9 Hz, 1H), 4,12 (dd, J = 12,3, 2,3 Hz, 1H), 4,23 (dd, J = 12,3, 4,8 Hz, 1H), 4,49 (d, J = 10,0 Hz, 1H) ; 4,52-4,58 (m, 1H), 4,61-4,68 (m, 1H), 5,02 (dd, J = 10,0, 9,3 Hz, 1H), 5,07 (dd, J = 10,0, 9,3 Hz, 1H), 5,08 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 5,23 (dd, J = 9,3, 9,3 Hz, 1 H), 6,42 (d, J = 6,8 Hz, 1 H, NH), 7,14 (d, J = 7,8 Hz, 1H, NH), 7,27-7,38 (m, 10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm
14,2 (CHs), 20,6-20,8 (4xCH3), 22,7 (CH2), 25,6 (CH2), 26,8 (CH2), 27,2 (CH2), 29,4-29,7 (9xCH2), 30,0 (CH2), 32,0 (CH2), 36,5 (CH2), 51,9 (CH), 52,5 (CH), 62,2 (CH2), 66,6 (CH2), 67,4 (CH2), 68,5 (CH), 69,6 (CH2), 69,8 (CH2),
69,9 (CH), 73,9 (CH), 75,9 (CH), 83,7 (CH), 128,3-128,7 (10xCH), 135,2 (C),
135,8 (C), 169,5 (C), 169,5 (C), 170,1 (C), 170,2 (C), 170,7 (C), 171,3 (C),
172,5 (C), 173,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 131, 199, 1030 (100) [M+H]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C53H77N2O16S 1029,4994, trouvée 1029,5011.
Composé 3.5a
Le composé 3.5a (huile jaunâtre, 541 mg, 0,53 mmol, 71 %) a été obtenu à partir du composé 3.3d en suivant le protocole général I.
Rf = 0,07 (CH2Cl2/AcOEt 1:1) ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,88 (t, J = Q,7 Hz, 3H), 1,20-1,36 (m, 12H), 1,54-1,65 (m, 2H), 1,91 (s, 3H), 1,93 (s, 3H), 1,99 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 1,96-2,09 (m, 1H), 2,15-2,30 (m, 3H), 2,342,48 (m, 2H), 3,68 (dd, J = 9,5, 5,4 Hz, 1H), 3,77 (dd, J = 9,5, 5,1 Hz, 1H),
3,85 (ddd, J = 9,6, 4,7, 1,8 Hz, 1 H), 3,90-3,99 (m, 1 H), 4,12 (dd, J = 12,5, 1,8 Hz, 1H), 4,12-4,20 (m, 1H), 4,26 (dd, J = 12,5, 4,7 Hz, 1H), 4,45-4,69 (m, 6H), 4,66 (d, J = 8,0 Hz, 1 H), 4,90 (dd, J = 9,5, 8,0 Hz, 1 H), 5,01 (dd, J = 9,6,
9,6 Hz, 1H), 5,09 (s, 2H), 5,12 (d, J= 12.5 Hz, 1H), 5,17 (d, J= 12.5 Hz, 1H), 5,23 (dd, J = 9,6, 9,6 Hz, 1H), 7,24-7,40 (m, 10H), 7,83 (s, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,5 (CH3), 20,6 (2xCH3), 20,7 (2xCH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,6 (CH2), 30,3, 30,4, 30,5, 30,6 (4xCH2), 31,0 (CH2), 33,0 (CH2), 36,8 (CH2), 51,3 (CH2), 53,1 (CH), 54,5 (CH), 63,0 (CH2), 65,2 (CH2), 67,4 (CH2), 68,0 (CH2), 69,0 (CH2), 69,7 (CH), 70,9 (CH2), 72,5 (CH),
72,9 (CH), 74,0 (CH), 101,6 (CH), 125,8 (CH), 129,2-129,6 (10xCH), 137,1 (C), 137,5 (C), 145,4 (C), 171,1 (2xC), 171,5 (C), 172,2 (2xC), 172,6 (C), 174,0 (C), 176,2 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1047 (100) [M+Na]+; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C51H70N5O17 1024,4767, trouvée 1024,4784.
Composé 3.5b
AcO
AcO
NH
OAc
COOBn
N'' COOBn H (CH2)10CH3
Le composé 3.5b (huile jaunâtre, 181 mg, 0,17 mmol, 72 %) a été obtenu à partir du composé 3.3e en suivant le protocole général I.
Rf = 0,11 (CH2CI2/AcOEt 1:1) ; RMN 1H (400 MHz, CDsOD) δ ppm 0,89 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,20-1,36 (m, 12H), 1,54-1,65 (m, 2H), 1,91 (s, 3H), 1,93 (s, 3H), 1,99 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 1,94-2,06 (m, 1H), 2,15-2,31 (m, 3H), 2,362,44 (m, 2H), 3,65-3,73 (m, 1H), 3,73-3,81 (m, 1H), 3,85 (ddd, J = 10,0, 4,7,
2,4 Hz, 1H), 3,91-3,99 (m, 1H), 4,12 (dd, J = 12,4, 2,4 Hz, 1H), 4,14-4,20 (m, 1H), 4,26 (dd, J = 12,4, 4,7 Hz, 1H), 4,48-4,64 (m, 6H), 4,66 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,89 (dd, J = 9,7, 8,0 Hz, 1H), 5,01 (dd, J = 10,1, 9,7 Hz, 1H), 5,09 (s, 2H), 5,12 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 5,17 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 5,23 (dd, J = 9,7, 9,7 Hz, 1H), 7,26-7,37 (m, 10H), 7,83 (s, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,5 (CH3), 20,6 (2xCHs), 20,7 (2xCH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,6 (CH2), 30,3-30,7 (6xCH2), 31.0 (CH2), 33,0 (CH2), 36,8 (CH2), 51,2 (CH2),
53.2 (CH), 54,5 (CH), 63,0 (CH2), 65,2 (CH2), 67,4 (CH2), 68,0 (CH2), 69,0 (CH2), 69,7 (CH), 70,9 (CH2), 72,5 (CH), 72,9 (CH), 74,0 (CH), 101,6 (CH),
125,8 (CH), 129,2-129,6 (10xCH), 137,1 (C), 137,5 (C), 145,3 (C), 171,1 (C),
171.2 (C), 171,5 (C), 172,2 (C), 172,6 (C), 174,0 (C), 176,2 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1075 (100) [M+Na]+; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C53H74N5O17 1052,5080, trouvée 1052,5117.
Composé 3.5c
Le composé 3.5c (huile jaunâtre, 568 mg, 0,53 mmol, 77 %) a été obtenu à partir du composé 3.3f en suivant le protocole général I.
Rf = 0,08 (CH2CI2/AcOEt 1:1) ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,89 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,21-1,34 (m, 20H), 1,53-1,65 (m, 2H) ; 1,91, 1,93, 1,99, 2,02 (s, 12H), 1,86-1,99 (m, 1H), 2,15-2,31 (m, 3H), 2,34-2,48 (m, 2H), 3,69 (dd, J = 9,6, 5,4 Hz, 1H), 3,77 (dd, J = 9,6, 5,1 Hz, 1H), 3,85 (ddd, J = 10,1, 4,7, 2,4 Hz, 1H), 3,92-3,99 (m, 1H), 4,12 (dd, J = 12,3, 2,4 Hz, 1H), 4,13-4,20 (m, 1H), 4,26 (dd, J = 12,3, 4,7 Hz, 1H), 4,47-4,64 (m, 6H), 4,66 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,88 (dd, J = 9,5, 7,9 Hz, 1H), 5,01 (dd, J = 10,1, 9,5 Hz, 1H), 5,10 (s, 2H), 5,11-5,20 (m, 2H), 5,23 (dd, J = 9,5, 9,5 Hz, 1H), 7,27-7,37 (m, 10H), 7,84 (s, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,5 (CH3), 20,6 (CH3),
20,7 (2xCH3), 20,9 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,6 (CH2), 30,4-30,8 (8xCH2), 33,1 (CH2), 31,0 (CH2), 36,8 (CH2), 51,3 (CH2), 53,2 (CH), 54,6 (CH), 61,5 (CH2), 65,2 (CH2), 67,4 (CH2), 68,0 (CH2), 69,0 (CH2), 69,7 (CH),
70,9 (CH2), 72,6 (CH), 72,9 (CH), 74,0 (CH), 101,6 (CH), 125,8 (CH), 129,2129,6 (10xCH), 137,2 (C), 137,5 (C), 145,4 (C), 171,1 (C), 171,2 (C), 171,5 (C), 172,3 (C), 172,6 (C), 173,0 (C), 174,1 (C), 176,3 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%)130 (35), 199 (40), 1081 (100) [M+H]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C55H78N5O17 1080,5393, trouvée 1080,5375.
Composé 3.5d
O < COOBn
OAc
OAc
Ο/γ¥' OOOBn O^NH H (CH2)17CH3
Le composé 3.5d (solide blanc, 160 mg, 0,14 mmol, 87 %) a été obtenu à partir du composé 3.3f en suivant le protocole général I.
Rf = 0,09 (CH2CI2/AcOEt 1:1) ; Tf = 58-60°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,83 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,08-1,30 (m, 30H), 1,49-1,64 (m, 2H), 1,87, 1,93, 1,96, 2,02 (s, 12H), 1,86-1,99 (m, 1H), 2,11-2,85 (m, 3H), 2,26-2,45 (m, 2H), 3,51-3,60 (m, 1H), 3,66 (ddd, J = 10,1, 4,7, 1,9 Hz, 1H), 3,78-3,97 (m, 2H), 4,08 (dd, J = 12,4, 1,9 Hz, 1H), 4,11-4,18 (m, 1H), 4,21 (dd, J = 12,4, 4,7 Hz, 1H), 4,33-4,69 (m, 6H), 4,43 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,95 (dd, J = 9,5, 8,0 Hz, 1H), 5,03 (dd, J = 10,1,9,5 Hz, 1H), 5,03 (s, 2H), 5,10 (s, 2H), 5,13 (dd, J = 9,5, 9,5 Hz, 1H), 6,80 (bs, 1H), 7,18-7,35 (m, 10H), 7,39 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 7,58 (s, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,1 (CH3), 20,5, 20,5, 20,5 (3xCH3), 20,6 (CH3), 22,6 (CH2), 25,5 (CH2), 26,9 (CH2), 29,3-29,6 (13xCH2), 30,0 (CH2), 31,8 (CH2), 36,3 (CH2), 49,9 (CH2),
51,8 (CH), 52,5 (CH), 61,7 (CH2), 64,6 (CH2), 66,4 (CH2), 67,1 (CH2), 67,7 (CH2), 68,1 (CH), 69,7 (CH2), 70,9 (CH), 71,9 (CH), 72,4 (CH), 100,4 (CH), 124,0 (CH), 128,1-128,5 (10xCH), 135,2 (C), 135,8 (C), 144,1 (C), 169,3 (C),
169,5 (C), 170,0 (C), 170,0 (C), 170,5 (C), 171,2 (C), 172,4 (C), 173,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1151 (100) [M+H]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C60H88N5O171150,6175, trouvée 1150,6163.
Composé 3.5e
Le composé 3.5e (solide blanc, 302 mg, 0,22 mmol, 74 %) a été obtenu à partir du composé 3.3f en suivant le protocole général I.
Rf = 0,06 (CH2CI2/AcOEt 1:1) ; Tf = 78-80°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,89 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,22-1,37 (m, 20H), 1,54-1,65 (m, 2H), 1,89, 1,96, 1,98, 2,00, 2,01,2,05, 2,09 (s, 21 H), 1,91-2,03 (m, 1H), 2,152,29 (m, 3H), 2,39-2,42 (m, 2H), 3,68 (dd, J = 9,6, 5,5 Hz, 1H), 3,76 (dd, J = 9,6, 5,1 Hz, 1H), 3,79-3,83 (m, 1H), 3,92-4,00 (m, 2H), 4,03-4,07 (m, 1H), 4,12 (dd, J = 6,3, 2,5 Hz, 1H), 4,14-4,17 (m, 1H), 4,20-4,28 (m, 2H), 4,484,63 (m, 7H), 4,66 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,76 (dd, J = 9,1, 7,9 Hz, 1H) ; 4,814,85 (m, 1H), 5,04 (dd, J = 10,0, 10,0 Hz, 1H), 5,10 (s, 2H), 5,11-5,20 (m, 2H), 5,27 (dd, J = 9,1, 9,1 Hz, 1H), 5,33-5,38 (m, 2H), 7,26-7,39 (m, 10H), 7,83 (s, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,5 (CH3), 20,5-21,2 (7xCH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,6 (CH2), 30,3-30,8 (8xCH2), 31,0 (CH2),
33.1 (CH2), 36,8 (CH2), 51,3 (CH2), 53,1 (CH), 54,5 (CH), 63,0 (CH2), 64,1 (CH2), 65,2 (CH2), 67,4 (CH2), 68,0 (CH2), 69,0 (CH2) ; 69,6 (CH), 69,8 (CH),
70,7 (CH), 70,9 (CH2), 71,6 (CH), 73,3 (CH), 73,5 (CH), 74,7 (CH), 76,3 (CH),
97.1 (CH), 101,4 (CH), 125,8 (CH), 129,2-129,6 (10xCH), 145,5 (C), 137,2 (C), 137,6 (C), 171,1-172,2 (7xC), 172,2 (C), 172,6 (C), 174,1 (C), 176,3 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1369 (100) [M+H]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour 067Η94Νδ025 1368,6238, trouvée 1368,6237.
Composé 3.5f
Le composé 3.5f (solide blanc, 192 mg, 0,13 mmol, 83 %) a été obtenu à partir du composé 3.3f en suivant le protocole général I.
Rf = 0,10 (CH2CI2/AcOEt 4:6) ; Tf = 90-94°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,84 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,14-1,31 (m, 30H), 1,52-1,62 (m, 2H), 1,87, 1,94, 1,96, 1,98, 1,99, 2,05, 2,09 (s, 21 H), 1,91-2,03 (m, 1H), 2,13-2,26 (m, 3H), 2,26-2,43 (m, 2H), 3,50-3,59 (m, 1H), 3,60-3,66 (m, 1H), 3,80-3,99 (m, 4H), 4,02 (dd, J = 12,4, 2,2 Hz, 1H), 4,09-4,25 (m, 3H), 4,33-4,70 (m, 7H), 4,46 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,75-4,85 (m, 2H), 5,02 (dd, J = 9,8, 9,8 Hz, 1H), 5,04 (s, 2H), 5,09 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 5,13 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 5,19 (dd, J = 9,2, 9,2 Hz, 1H), 5,32 (dd, J = 10,3, 9,8 Hz, 1H), 5,36 (d, J = 4,0 Hz, 1 H), 6,70 (d, J = 6,0 Hz, 1 H, NH), 7,23-7,37 (m, 11 H), 7,55 (s, 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,1 (CHs), 20,5-20,8 (7xCHs), 22,7 (CH2), 25,5 (CH2), 27,0 (CH2), 29,3-29,7 (13xCH2), 30,0 (CH2), 31,9 (CH2), 36,4 (CH2),
49,9 (CH2), 51,9 (CH), 52,5 (CH), 61,5 (CH2), 62,5 (CH2), 64,6 (CH2), 66,4 (CH2), 67,2 (CH2), 67,8 (CH2), 68,0 (CH), 68,5 (CH), 69,3 (CH), 69,6 (CH2), 70,0 (CH), 71,8 (CH), 72,4 (CH), 72,5 (CH), 75,0 (CH), 95,6 (CH), 100,2 (CH), 123,9 (CH), 128,1-128,6 (CH of Ph), 135,3 (C), 135,8 (C), 144,3 (C), 169,4-170,5 (7xC), 170,0 (C), 171,2 (C), 172,5 (C), 173,5 (C); Masse (ESI+) m/z (%) 1439 (100) [M+H]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C72H104N5O25 1438,7020, trouvée 1438,7031.
Composé 3.5g
Le composé 3.5g (cire blanc, 207 mg, 0,21 mmol, 85 %) a été obtenu à partir du composé 3.3f en suivant le protocole général I (purification : colonne chromatographique sur gel de silice, éluant : CH2Cl2/MeOH 99 :1 à 97:3).
Rf = 0,18 (CH2Cl2/MeOH 97:3) ; Tf = 50-52°C ; RMN 1H (500 MHz, CD3OD) δ ppm 0,89 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,22-1,36 (m, 20H), 1,53-1,65 (m,
2H), 1,91-2,01 (m, 1H), 2,15-2,29 (m, 3H), 2,34-2,46 (m, 2H), 3,33 (s, 3H),
3,49-3,53 (m, 2H), 3,54-3,64 (m, 18H), 3,64-3,70 (m, 1H), 3,71-3,77 (m, 1H),
3,85 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 4,49-4,63 (m, 6H), 5,09 (s, 2H), 5,12 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 5,16 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 7,25-7,37 (m, 10H), 7,96 (s, 1H) ; RMN 13C (125 MHz, CD3OD) δ ppm 14,5 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,6 (CH2),
30,3-30,8 (8xCH2), 31,0 (CH2), 33,1 (CH2), 36,8 (CH2), 51,5 (CH2), 53,1 (CH),
54,5 (CH), 59,1 (CH3), 65,1 (CH2), 67,4 (CH2), 68,0 (CH2), 70,2 (CH2), 70,8 (CH2), 71,3-71,5 (9xCH2), 73,0 (CH2), 125,9 (CH), 129,2-129,6 (10xCH),
137,1 (C), 137,5 (C), 145,4 (C), 172,5 (C), 174,0 (2xC), 176,2 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 985 (20) [M+H]+, 1007 (100) [M+Na]+; SMHR (ESI+) m/z
5 calculée pour C52H82N5O13 984,5909, trouvée 984,5892.
Composé 3.5h
N'
H
COOBn
OOOBn
(CH2)17CH3
Le omposé 3.5h (solide blanc, 91 mg 0,09 mmol, 88 %) a été obtenu à partir du composé 3.3g en suivant le protocole général I (purification : colonne chromatographique sur gel de silice, éluant : CH2CI2/MeOH 99 :1 à 97:3).
Rf = 0,20 (CH2CI2/MeOH 97:3) ; Tf = 61-63°C ; RMN 1H (500 MHz, CDCIs) δ ppm 0,85 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,17-1,32 (m, 30H), 1,53-1,64 (m, 2H), 1,93-2,04 (m, 1H), 2,14-2,26 (m, 3H), 2,26-2,43 (m, 2H), 3,33 (s, 3H), 3,483,52 (m, 2H), 3,52-3,66 (m, 19H), 3,81 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 3,88-3,95 (m, 1H), 4,46 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 4,53-4,69 (m, 4H), 5,05 (s, 2H), 5,10 (d, J = 12,3 Hz, 1H), 5,13 (d, J = 12,3 Hz, 1H), 6,65 (d, J = 5,9 Hz, 1H, NH), 7,24-7,35 (m, 10H), 7,42 (d, J = 7,7 Hz, 1H, NH), 7,71 (s, 1H) ; RMN 13C (125 MHz, CDCIs) δ ppm 14,1 (CHs), 22,7 (CH2), 25,5 (CH2), 26,9 (CH2), 29,3-29,7 (13xCH2), 30,0 (CH2), 31,9 (CH2), 36,4 (CH2), 50,3 (CH2), 51,9 (CH), 52,5 (CH), 59,0 (CHs), 65,1 (CH2), 66,4 (CH2), 67,2 (CH2), 70,2 (CH2), 70,8 (CH2), 70,5-70,6 (9xCH2), 71,9 (CH2), 123,8 (CH), 128,2-128,6 (10xCH), 135,3 (C), 135,8 (C),
144,1 (C), 170,1 (C), 171,2 (C), 172,5 (C), 173,6 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 892 (100), 1077 (70) [M+Na]+; SMHR (ESI+) m/z calculée pour
C57H92N5O13 1054,6692, trouvée 1054,6696.
Composé 3.5i
Le composé 3.5i (cire jaunâtre, 115 mg, 0,11 mmol, 38%) a été obtenu à partir du composé 3.3h en suivant le protocole général I.
Rf = 0,40 (CH2CI2/AcOEt 1:1) ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,84,
0,87 (t, J = 6,9 Hz, 6H), 1,15-1,39 (m, 12H), 1,31-1,44 (m, 2H), 1,47-1,63 (m,
2H), 1,91, 1,93, 1,99, 2,02 (s, 12H), 1,89-2,05 (m, 1H), 2,14-2,25 (m, 1H),
2,26-2,35 (m, 1H), 2,34-2,46 (m, 2H), 3,68 (dd, J = 9,6, 5,7 Hz, 1H), 3,76 (dd,
J = 9,6, 5,3 Hz, 1H), 3,85 (ddd, J = 9,7, 4,7, 2,4 Hz, 1H), 3,90-3,99 (m, 1H), 4,12 (dd, J = 12,4, 2,4 Hz, 1H), 4,13-4,20 (m, 1H), 4,26 (dd, J = 12,4, 4,7 Hz,
H), 4,49-4,62 (m, 6H), 4,66 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,89 (dd, J = 9,7, 8,0 Hz,
1H), 5,02 (dd, J = 9,7, 9,5 Hz, 1H), 5,09 (s, 2H), 5,13, 5,17 (d, J = 12,4 Hz,
2H), 5,23 (dd, J = 9,7, 9,5 Hz, 1H), 7,27-7,37 (m, 10H), 7,83 (s, 1H), 8,12 (d,
J = 7,5 Hz, 1H, NH), 8,13 (d, J = 7,8 Hz, 1H, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDsOD) δ ppm 14,4 (CH3), 14,5 (CH3), 20,6 (CH3), 20,6 (CH3), 20,7 (CH3),
20,7 (CH3), 23,5 (CH2), 23,6 (CH2), 27,9 (CH2), 28,2 (CH2), 28,3 (CH2), 30,9 (CH2), 32,9 (CH2), 33,0 (CH2), 34,0 (CH2), 34,1 (CH2), 47,9 (CH), 51,3 (CH2), 53,0 (CH), 54,2 (CH), 63,0 (CH2), 65,2 (CH2), 67,4 (CH2), 68,0 (CH2), 69,0 (CH2), 69,7 (CH), 71,0 (CH2), 72,5 (CH), 72,9 (CH), 74,0 (CH), 101,6 (CH),
125,8 (CH), 129,2-129,6 (10xCH), 137,1 (C), 137,5 (C), 145,4 (C), 171,1 (C),
171,2 (C), 171,5 (C), 172,0 (C), 172,2 (C), 172,5 (C), 173,8 (C), 179,0 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1075 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour CssHysNsOiyNa 1074,4899, trouvée 1074,4904.
Composé 3.5j
Le composé 3.5j (solide blanc, 190 mg, 0,15 mmol, 90%) a été obtenu à partir du composé 3.3i en suivant le protocole général I.
Rf = 0,40 (CH2CI2/AcOEt 1:1) ; RMN 1H (400 MHz, CDCI3) δ ppm 0,84, 0,85 (t, J = 6,9 Hz, 6H), 1,13-1,31 (m, 40H), 1,33-1,44 (m, 2H), 1,48-1,63 (m, 2H), 1,90, 1,95, 1,99, 2,04 (s, 12H), 1,93-2,03 (m, 1H), 2,06-2,15 (m, 1H), 2,16-2,45 (m, 3H), 3,50-3,60 (m, 1H), 3,67 (ddd, J = 9,7, 4,7, 2,2 Hz, 1H), 3,81-3,90 (m, 1H), 3,90-3,99 (m, 1H), 4,10 (dd, J = 12,3, 2,2 Hz, 1H), 4,144,20 (m, 1H), 4,23 (dd, J = 12,3, 4,7 Hz, 1H), 4,35-4,71 (m, 6H), 4,44 (d, J =
7,9 Hz, 1H), 4,97 (dd, J = 9,7, 7,9 Hz, 1H), 5,05 (dd, J = 9,7, 9,7 Hz, 1H),
5,05 (s, 2H), 5,13 (s, 2H), 5,15 (dd, J = 9,7, 9,7 Hz, 1H), 6,69 (d, J = 6,0 Hz, 1H, NH), 7,23-7,40 (m, 11 H), 7,57 (s, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,1 (2xCH3), 20,5 (CH3), 20,6 (2xCH3), 20,7 (CH3), 22,7 (2xCH2), 27,3 (CH2), 27,7 (2xCH2), 29,4-30,3 (16xCH2), 31,9 (CH2), 32,9 (CH2), 33,0 (CH2),
47,7 (CH), 50,0 (CH2), 51,8 (CH), 52,4 (CH), 61,8 (CH2), 64,6 (CH2), 66,4 (CH2), 67,2 (CH2), 67,7 (CH2), 68,3 (CH), 69,8 (CH2), 71,0 (CH), 72,0 (CH),
72,5 (CH), 100,6 (CH), 124,0 (CH), 128,2-128,6 (10xCH), 135,3 (C), 135,9 (C), 144,4 (C), 169,4 (C), 169,5 (C), 170,0 (2xC), 170,6 (C), 171,2 (C), 172,3 (C), 176,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1271 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C67HioiNsOi7Na 1270,7090, trouvée 1270,7128.
Composé 3.5k
Le composé 3.5k (gomme jaunâtre, 200 mg, 0,19 mmol, 80%) a été obtenu à partir du composé 3.3j en suivant le protocole général I.
Rf = 0,16 (CH2CI2/MeOH 97,5:2,5) ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,77-0,92 (m, 2H), 1,10-1,25 (m, 6H), 1,25-1,37 (m, 2H), 1,51-1,73 (m, 7H), 1,91, 1,93, 1,98, 2,02 (s, 12H), 1,94-2,08 (m, 1H), 2,14-2,30 (m, 3H), 2,342,48 (m, 2H), 3,69 (dd, J = 9,6, 5,5 Hz, 1H), 3,78 (dd, J = 9,6, 5,2 Hz, 1H),
3,85 (ddd, J = 9,7, 4,6, 2,1 Hz, 1H), 3,95 (m, 1H), 4,12 (dd, J= 12,4, 2,1 Hz, 1H), 4,12-4,20 (m, 1H), 4,26 (dd, J = 12,4, 4,6 Hz, 1H), 4,48-4,64 (m, 6H), 4,66 (d, J = 7,9 Hz, 1 H), 4,89 (dd, J = 9,5, 7,9 Hz, 1 H), 5,02 (dd, J = 9,7, 9,5 Hz, 1H), 5,09 (s, 2H), 5,12 (d, J = 12,5 Hz, 1H), 5,17 (d, J = 12,5 Hz, 1H), 5,23 (dd, J = 9,5, 9,5 Hz, 1H), 7,25-7,38 (m, 10H), 7,82 (s, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 20,6 (2xCH3), 20,7 (2xCH3), 27,0 (CH2), 27,4 (2xCH2), 27,5 (CH2), 27,6 (CH2), 27,7 (CH2), 31,0 (CH2), 34,5 (2xCH2), 36,8 (CH2), 38,3 (CH2), 38,7 (CH), 51,2 (CH2), 53,1 (CH), 54,4 (CH), 63,0 (CH2),
65.1 (CH2), 67,4 (CH2), 68,0 (CH2), 68,9 (CH2), 69,7 (CH), 70,9 (CH2), 72,5 (CH), 72,8 (CH), 73,9 (CH), 101,6 (CH), 125,7 (CH), 129,1-129,6 (10xCH),
137.1 (C), 137,5 (C), 145,3 (C), 171,1 (2xC), 171,4 (C), 172,1 (C), 172,2 (C),
172,5 (C), 174,0 (C), 176,1 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1059 (100) [M+Na]+ ;
SMHR (ESI+) m/z calculée pour C52H70N5O17 1036,4767, trouvée 1036,4760.
Composé 3.5I
AcO
AcO
NH
OAc
O
COOBn
O
HN .COOBn (CH2)12CH3
Le composé 3.5I (solide jaunâtre, 153 mg, 0,13 mmol, 61 %) a été obtenu à partir du composé 3.3k en suivant le protocole général I.
Rf = 0,21 (CH2CI2/MeOH 97,5:2,5) ; Tf = 60-63°C ; RMN 1H (400 MHz,
CD3OD) δ ppm 0,89 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,21-1,34 (m, 20H), 1,53-1,65 (m, 2H), 1,92, 1,94, 1,99, 2,02 (s, 12H), 1,93-2,10 (m, 1H), 2,15-2,31 (m, 3H), 2,42-2,52 (m, 2H), 3,71 (dd, J = 9,6, 5,2 Hz, 1H), 3,79-3,88 (m, 2H), 3,914,00 (m, 3H), 4,09-4,20 (m, 2H), 4,26 (dd, J = 12,4, 4,7 Hz, 1H), 4,47-4,64 (m, 6H), 4,66 (d, J = 8,0 Hz, 1 H), 4,88 (dd, J = 9,6, 8,0 Hz, 1 H), 5,01 (dd, J =
9,6, 9,6 Hz, 1H), 5,11 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 5,23 (dd, J = 9,6, 9,6 Hz, 1H),
7,25-7,40 (m, 10H), 7,84 (s, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,6 (CH3), 20,7 (CH3), 20,7 (CH3), 20,8 (CH3), 20,8 (CH3), 23,8 (CH2), 26,8 (CH2),
28,1 (CH2), 30,5-30,9 (8xCH2), 31,2 (CH2), 33,1 (CH2), 36,8 (CH2), 42,2 (CH2), 51,3 (CH2), 53,7 (CH), 55,2 (CH), 63,1 (CH2), 65,3 (CH2), 67,4 (CH2),
68,0 (CH2), 69,0 (CH2), 69,8 (CH), 70,9 (CH2), 72,6 (CH), 73,0 (CH), 74,1 (CH), 101,7 (CH), 125,9 (CH), 129,3-129,7 (10xCH), 137,2 (C), 137,7 (C),
145,3 (C), 171,0 (C), 171,2 (C), 171,3 (C), 171,6 (C), 172,3 (C), 172,3 (C),
173,8 (C), 174,4 (C), 176,9 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1160 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C57H81N6O18 1137,5607, trouvée 1137,5610.
Composé 3.6a
(CH2)8CH3
Le composé 3.6a (solide blanc, 193 mg, 0,31 mmol, 64 %) a été obtenu à partir du composé 3.4a en suivant les protocoles généraux J puis F.
Tf = 63-70°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) : δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,22-1,41 (m, 12H), 1,55-1,68 (m, 2H), 1,82-2,01 (m, 3H), 2,15-2,26 (m, 1H), 2,29 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,35-2,45 (m, 2H), 2,69-2,87 (m, 2H), 3,20 (dd, J = 9,6, 8,6 Hz, 1H), 3,26-3,41 (m, 3H), 3,53-3,75 (m, 5H), 3,86 (dd, J = 12,0, 1,0 Hz, 1H), 4,36 (d, J = 9,7 Hz, 1H), 4,44-4,52 (m, 1H), 4,56-4,64 (m, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,6 (CH2),
27,9 (CH2), 30,3, 30,4, 30,4, 30,5 (4xCH2), 30,9 (2xCH2), 33,0 (CH2), 36,8 (CH2), 52,9 (CH), 54,5 (CH), 62,9 (CH2), 70,7 (CH), 71,3 (CH2), 71,4 (CH2),
74,3 (CH), 79,5 (CH), 81,8 (CH), 87,1 (CH), 172,2 (C), 174,5 (C), 176,4 (C), 176,4 (C); Masse (ESI-) m/z (%) 623 (100) [M-Hp ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C27H47N2Oi2S 623,2850, trouvée 623,2833.
Composé 3.6b
(CH2)10CH3
Le composé 3.6b (solide blanc, 150 mg, 0,23 mmol, 37 %) a été obtenu à partir du composé 3.4b en suivant les protocoles généraux J puis F.
Tf = 97-102°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,89 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,22-1,39 (m, 16H), 1,55-1,66 (m, 2H), 1,83-2,01 (m, 3H), 2,14-2,25 (m, 1 H), 2,28 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,35-2,43 (m, 2H), 2,69-2,86 (m, 2H), 3,21 (dd, J = 9,7, 8,7 Hz, 1H), 3,27-3,40 (m, 3H), 3,52-3,73 (m, 5H), 3,86 (dd, J = 11,9, 1,0 Hz, 1H), 4,36 (d, J = 9,7 Hz, 1H), 4,44-4.51 (m, 1H), 4,56-4,64 (m, 1H) ;
RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,7 (CH2), 27,9 (CH2), 30,3-30,7 (6xCH2), 31,0 (CH2), 33,0 (CH2), 36,8 (CH2), 53,0 (CH), 54,5 (CH), 62,9 (CH2), 70,7 (CH), 71,3 (CH2), 71,4 (CH2), 74,3 (CH), 79,5 (CH), 81,8 (CH), 87,1 (CH), 172,2 (C), 174,5 (C), 176,4 (2xC) ;
Masse (ESI-) m/z (%) 651 (100) [M-Hp ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C29H5iN20i2S 651,3163, trouvée 651,3187.
Composé 3.6c
(CH2)12CH3
Le composé 3.6c (solide blanc, 712 mg, 1,05 mmol, 62 %) a été obtenu à partir du composé 3.4c en suivant les protocoles généraux J puis F.
Tf = 104-106°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = Q,7 Hz,
3H), 1,23-1,38 (m, 20H), 1,57-1,68 (m, 2H), 1,83-2,01 (m, 3H), 2,15-2,25 (m, 1 H), 2,29 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,37-2,44 (m, 2H), 2,70-2,86 (m, 2H), 3,21 (dd, J = 9,7, 9,1 Hz, 1H), 3,26-3,40 (m, 3H), 3,53-3,74 (m, 5H), 3,87 (dd, J = 11,9, 1,0 Hz, 1H), 4,36 (d, J = 9,7 Hz, 1H), 4,45-4,52 (m, 1H), 4,56-4,64 (m, 1H) ;
RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,7 (CH2), 28,0 (CH2), 30,3-30,8 (8xCH2), 31,0 (2xCH2), 33,0 (CH2), 36,8 (CH2), 53,0 (CH), 54,5 (CH), 63,0 (CH2), 70,7 (CH), 71,3 (CH2), 71,5 (CH2), 74,3 (CH), 79,5 (CH), 81,9 (CH), 87,2 (CH), 172,2 (C), 174,5 (C), 176,4 (2xC) ; Masse (ESI-) m/z (%) 679 (100) [M-Hp ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour
C3iH55N20i2S 679,3476, trouvée 679,3497.
Composé 3.7a
Le composé 3.7a (solide blanc, 81 mg, 0,12 mmol, 70 %) a été obtenu à partir du composé 3.5a en suivant les protocoles généraux J puis F.
Tf = 72-75°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) : δ ppm 0,89 (t, J = 6,2 Hz, 3H), 1,20-1,38 (m, 12H), 1,54-1,67 (m, 2H), 1,86-1,99 (m, 1H), 2,10-2,24 (m, 1H), 2,24-2,40 (m, 4H), 3,21 (dd, J = 8,9, 8,0 Hz, 1H), 3,25-3,41 (m, 3H), 3,62-3,75 (m, 2H), 3,80 (dd, J = 9,6, 5,2 Hz, 1H), 3,87 (dd, J = 11,8, 1,3 Hz, 1H), 3,94-4,06 (m, 1H), 4,20-4,29 (m, 1H), 4,32 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,45 (dd, J = 8,7, 4,6 Hz, 1H), 4,57-4,71 (m, 5H), 8,14 (s, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) : δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,8 (CH2), 30,3, 30,4, 30,4, 30,5 (4xCH2), 30,9 (CH2), 33,0 (CH2), 36,8 (CH2), 51,6 (CH2), 53,0 (CH), 54,5 (CH), 62,6 (CH2), 65,0 (CH2), 69,0 (CH2), 70,8 (CH2), 71,5 (CH),
74,9 (CH), 77,9 (2xCH), 104,4 (CH), 126,2 (CH), 145,2 (C), 172,1 (C), 174,5 (C), 176,4 (2xC) ; Masse (ESI-) m/z (%) 674 (100) [M-Hp ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C29H5oNsOi3 676,3405, trouvée 676,3409.
Composé 3.7b
Le composé 3.7b (solide blanc, 108 mg, 0,15 mmol, 93 %) a été obtenu à partir du composé 3.5b en suivant les protocoles généraux J puis F.
Tf = 118-120°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) : δ ppm 0,89 (t, J = 5,9 Hz, 3H), 1,16-1,38 (m, 16H), 1,52-1,67 (m, 2H), 1,85-2,00 (m, 1H), 2,10-2,25 (m, 1H), 2,22-2,42 (m, 4H), 3,21 (dd, J = 8,4, 7,8 Hz, 1H), 3,23-3,42 (m, 3H), 3,63-3,74 (m, 2H), 3,79 (dd, J = 9,6, 5,2 Hz, 1H), 3,87 (dd, J = 11,8, 1,3 Hz, 1H), 3,94-4,06 (m, 1H), 4,17-4,28 (m, 1H), 4,32 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,46 (dd, J = 8,8, 4,6 Hz, 1H), 4,55-4,70 (m, 5H), 8,10 (s, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) : δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 30,3-30,7 (6xCH2), 31,0 (CH2), 33,0 (CH2), 36,8 (CH2), 51,6 (CH2), 53,2 (CH), 54,5 (CH), 62,6 (CH2), 65,0 (CH2), 69,0 (CH2), 70,8 (CH2), 71,4 (CH), 74,9 (CH),
77,8 (CH), 77,9 (CH), 104,4 (CH), 126,2 (CH), 145,2 (C), 172,0 (C), 174,8 (C), 176,4 (C), 176,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 702 (100) [M-Hp ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C3iH54N5Oi3704,3718, trouvée 704,3703.
Composé 3.7c
Le composé 3.7c (solide blanc, 358 mg, 0,49 mmol, 75 %) a été obtenu à partir du composé 3.5c en suivant les protocoles généraux J puis F
Tf = 154-156°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,21-1,37 (m, 20H), 1,54-1,67 (m, 2H), 1,86-1,99 (m, 1H), 2,13-2,25 (m, 1H), 2,25-2,31 (m, 2H), 2,31-2,38 (m, 2H), 3,19 (dd, J = 9,7, 8,0 Hz, 1H), 3,24-3,38 (m, 3H), 3,62-3,68 (m, 1H), 3,71 (dd, J = 9,5, 5,4 Hz, 1H), 3,78 (dd, J = 9,5, 5,4 Hz, 1H), 3,87 (dd, J = 11,8, 1,5 Hz, 1H), 3,96-4,03 (m, 1H), 4,214,28 (m, 1H), 4,30 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,47 (dd, J = 9,1, 4,7 Hz, 1H), 4,584,67 (m, 5H), 8,09 (s, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,4 (CH3),
23,7 (CH2), 26,9 (CH2), 27,9 (CH2), 30,4-30,8 (8xCH2), 31,0 (CH2), 33,1 (CH2), 36,8 (CH2), 51,6 (CH2), 53,1 (CH), 54,5 (CH), 62,7 (CH2), 65,1 (CH2),
69,1 (CH2), 70,8 (CH2), 71,5 (CH), 74,9 (CH), 77,9 (CH), 78,1 (CH), 104,5 (CH), 126,2 (CH), 145,3 (C), 172,1 (2xC), 176,4 (C), 176,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 365 (30) [M-2H]2’, 550 (20), 730 (100) [M-H], 752 (20) ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C33H56N5O13 730,3875, trouvée 730,3886.
Composé 3.7d
COOH
OH
Ό^ΧγΧ^Ν'' COOH O^NH H (CH2)17CH3
Le composé 3.7d (solide blanc, 74 mg, 0,09 mmol, 77 %) a été obtenu à partir du composé 3.5d en suivant les protocoles généraux J puis F. (LiOH/Dioxane-H2O).
Tf = 175-185°C ; RMN 1H (500 MHz, DMSO-de) δ ppm 0,85 (t, J = 6,6 Hz, 3H), 1,11-1,32 (m, 30H), 1,39-1,51 (m, 2H), 1,68-1,83 (m, 1H), 1,90-2,04 (m, 1H), 2,07-2,16 (m, 2H), 2,18-2,29 (m, 2H), 2,96 (dd, J = 8,3, 8,3 Hz, 1H), 3,03 (dd, J = 8,8, 8,8 Hz, 1H), 3,08-3,17 (m, 2H), 3,34-3,46 (m, 1H), 3,513,60 (m, 2H), 3,64-3,70 (m, 1H), 3,85-3,93 (m, 1H), 4,03-4,12 (m, 1H), 4,174,28 (m, 2H), 4,44-4,63 (m, 5H), 7,93 (d, J = 8,1 Hz, 1H, NH), 8,09 (s, 1H), 8,20 (d, J = 7,8 Hz, 1H, NH) ; RMN 13C (125 MHz, DMSO-de) δ ppm 14,0 (CH3), 22,1 (CH2), 25,2 (CH2), 26,5 (CH2), 28,7-29,1 (13xCH2), 29,8 (CH2), 31,3 (CH2), 35,1 (CH2), 49,6 (CH2), 51,1 (CH), 52,2 (CH), 61,1 (CH2), 63,6 (CH2), 67,3 (CH2), 69,9 (CH2), 70,0 (CH), 73,3 (CH), 76,6 (CH), 77,0 (CH), 102,9 (CH), 124,7 (CH), 143,5 (C), 169,6 (C), 172,3 (C), 173,0 (C),
173,8 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 399 (95) [M-2H]2, 620 (70), 638 (30), 800 (100) [M-H]’, 822 (85) [M+Na-2H]’ ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C38H66N5O13 800,4657, trouvée 800,4636.
Composé 3.7e
OH
Le composé 3.7e (solide blanc, 163 mg, 0,18 mmol, 79 %) a été obtenu à partir du composé 3.5d en suivant les protocoles généraux J puis F.
Tf = 167-169°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,22-1,39 (m, 20H), 1,57-1,67 (m, 2H), 1,86-1,98 (m, 1H), 2,13-2,24 (m, 1H), 2,28 (t, J = 7,1 Hz, 2H), 2,31-2,40 (m, 2H), 3,22-3,33 (m, 2H), 3,39 (ddd, J = 9,2, 4,7, 1,9 Hz, 1H), 3,44 (dd, J = 9,7, 3,8 Hz, 1H), 3,53 (dd, J = 9,2, 9,2 Hz, 1H), 3,56-3,73 (m, 5H), 3,74-3,92 (m, 4H), 3,95-4,03 (m, 1H), 4,19-4,29 (m, 1 H), 4,33 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 4,46 (dd, J = 9,0, 4,6 Hz, 1 H), 4,56-4,68 (m,
5H), 5,16 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 8,09 (s, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, CDsOD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 28,0 (CH2), 30,3-30,8 (8xCH2), 31,0 (CH2), 33,1 (CH2), 36,8 (CH2), 51,6 (CH2), 53,2 (CH), 54,6 (CH), 62,1 (CH2),
62,8 (CH2), 65,1 (CH2), 69,1 (CH2), 70,8 (CH2), 71,5 (CH), 74,1 (CH), 74,5 (CH), 74,8 (CH), 75,0 (CH), 76,7 (CH), 77,7 (CH), 81,1 (CH), 102,9 (CH),
104,5 (CH), 126,2 (CH), 145,3 (C), 172,1 (C), 174,7 (C), 176,4 (C), 176,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 446 (100) [M-H]2, 892 (100) [M-H]- ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C39H66N5O18 892,4403, trouvée 892,4398.
Composé 3.7f
Le composé 3.7f (solide blanc, 101 mg, 0,10 mmol, 92 %) a été obtenu à partir du composé 3.5e en suivant les protocoles généraux J puis F (LiOH/Dioxane-H2O).
Tf = 214-216°C ; RMN 1H (500 MHz, CDsOD) δ ppm 0,90 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 1,23-1,39 (m, 30H), 1,56-1,66 (m, 2H), 1,88-1,97 (m, 1H), 2,15-2,24 (m, 1H), 2,25-2,31 (m, 2H), 2,31-2,39 (m, 2H), 3,22-3,29 (m, 2H), 3,39 (ddd, J = 9,4, 4,7, 1,9 Hz, 1H), 3,44 (dd, J = 9,7, 3,8 Hz, 1H), 3,53 (dd, J = 9,4, 9,2 Hz, 1H), 3,57-3,74 (m, 5H), 3,75-3,85 (m, 3H), 3,89 (dd, J = 12,1, 1,9 Hz, 1H), 3,96-4,03 (m, 1H), 4,21-4,27 (m, 1H), 4,33 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,47 (dd, J = 9,1, 4,7 Hz, 1H), 4,57-4,69 (m, 5H), 5,16 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 8,09 (s, 1H) ; RMN 13C (125 MHz, CDsOD) : δ ppm 14,4 (CHs), 23,7 (CH2), 26,9 (CH2),
27.9 (CH2), 30,4-30,8 (13xCH2), 31,0 (CH2), 33,1 (CH2), 36,8 (CH2), 51,6 (CH2), 53,1 (CH), 54,5 (CH), 62,1 (CH2), 62,8 (CH2), 65,1 (CH2), 69,2 (CH2),
70.9 (CH2), 71,5 (CH), 74,2 (CH), 74,5 (CH), 74,8 (CH), 75,1 (CH), 76,7 (CH),
77,7 (CH), 81,2 (CH), 102,9 (CH), 104,5 (CH), 126,2 (CH), 145,3 (C), 172,2 (C), 174,5 (C), 176,4 (C), 176,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 481 (55) [M-2H]2;
963 (100) [Μ-H]’ ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C44H76N5O18 962,5185, trouvée 962,5211.
Composé 3.7q
Le composé 3.7g (cire blanc, 41 mg, 0,05 mmol, quantitatif) a été obtenu à partir du composé 3.5g en suivant le protocole général D1.
Tf = 54-57°C ; RMN 1H (500 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 1,23-1,37 (m, 20H), 1,55-1,66 (m, 2H), 1,88-1,98 (m, 1H), 2,13-2,22 (m, 1H), 2,23-2,39 (m, 4H), 3,35 (s, 3H), 3,51-3,55 (m, 2H), 3,56-3,66 (m, 18H), 3,71 (dd, J = 9,7, 5,2 Hz, 1H), 3,79 (dd, J = 9,7, 5,4 Hz, 1H), 3,90 (t, J = 5,1 Hz, 2H), 4,40 (dd, J = 8,1,4,7 Hz, 1H), 4,55-4,67 (m, 5H), 8,03 (s, 1H) ; RMN 13C (125 MHz, CD3OD) : δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 28,4 (CH2), 30,4-30,8 (8xCH2), 31,2 (CH2), 33,1 (CH2), 36,8 (CH2), 51,4 (CH2),
53,9 (CH), 54,7 (CH), 59,1 (CH3), 65,1 (CH2), 70,3 (CH2), 70,8 (CH2), 71,171,3 (9xCH2), 72,8 (CH2), 125,9 (CH), 145,5 (C), 171,7 (2xC), 176,4 (2xC) ; Masse (ESI+) m/z (%) 827 (100) [M+Na]+; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C38H7oN50i3 804,4970, trouvée 804,4975.
Composé 3.7h
Le composé 3.7h (solide blanc, 58 mg, 0,07 mmol, 89 %) a été obtenu à partir du composé 3.5h en suivant le protocole général D1.
Tf = 76-79°C ; RMN 1H (500 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,23-1,38 (m, 30H), 1,56-1,66 (m, 2H), 1,88-1,98 (m, 1H), 2,13-2,22 (m, 1H), 2,23-2,39 (m, 4H), 3,35 (s, 3H), 3,50-3,55 (m, 2H), 3,56-3,67 (m, 18H), 3,71 (dd, J = 9,6, 5,3 Hz, 1H), 3,79 (dd, J = 9,6, 5,3 Hz, 1H), 3,90 (t, J = 5,1 Hz, 2H), 4,42 (dd, J = 8,5, 4,8 Hz, 1H), 4,55-4,67 (m, 5H), 8,03 (s, 1H) ; RMN 13C (125 MHz, CD3OD) : δ ppm 14,5 (CH3), 23,7 (CH2), 26,9 (CH2), 28,2 (CH2), 30,4-30,9 (13xCH2), 31,1 (CH2), 33,1 (CH2), 36,8 (CH2), 51,4 (CH2), 53,6 (CH), 54,6 (CH), 59,1 (CH3), 65,1 (CH2), 70,3 (CH2), 70,9 (CH2), 71,271,4 (9xCH2), 72,9 (CH2), 125,9 (CH), 145,4 (C), 171,8 (C), 175,1 (C), 176,4 (C), 176,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 231 (50), 897 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C43H8oN50i3 874,5753, trouvée 874,5761.
Composé 3.7i
Le composé 3.7i (solide blanc, 31 mg, 0,04 mmol, 46 %) a été obtenu à partir du composé 3.5i en suivant les protocoles généraux J puis F.
Tf = 100-103°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,88 (t, J = 6,5 Hz, 6H), 1,18-1,36 (m, 12H), 1,33-1,46 (m, 2H), 1,47-1,68 (m, 2H), 1,86-1,97 (m, 1H), 2,13-2,24 (m, 1H), 2,24-2,40 (m, 3H), 3,20 (dd, J = 9,0, 7,9 Hz, 1H), 3,31-3,39 (m, 3H), 3,62-3,73 (m, 2H,), 3,79 (dd, J = 9,5, 5,3 Hz, 1H), 3,87 (d, J = 11,5, 1,3 Hz, 1H), 3,96-4,04 (m, 1H), 4,21-4,28 (m, 1H), 4,32 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,42 (dd, J = 7,8, 4,7 Hz, 1H), 4,59-4,71 (m, 5H), 8,10 (s, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) : δ ppm 14,4 (2xCH3), 23,5 (CH2), 23,6 (CH2), 28,2 (CH2), 28,3 (CH2), 28,5 (CH2), 31,1 (CH2), 32,9 (CH2), 33,1 (CH2), 34,1 (CH2), 48,0 (CH), 51,6 (CH2), 53,5 (CH), 54,4 (CH), 62,7 (CH2), 65,1 (CH2), 69,0 (CH2), 70,9 (CH2), 71,5 (CH), 74,9 (CH), 77,9 (CH), 78,0 (CH), 104,5 (CH), 126,2 (CH), 145,3 (C), 171,7 (C), 175,1 (C), 176,5 (C), 179,2 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 351 (25) [M-2H]2; 702 (100) [M-Hp ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C31H52N5O13 702,3562, trouvée 702,3550.
Le composé 3.7j (solide blanc, 40 mg, 0,04 mmol, quantitatif) a été obtenu à partir du composé 3.5j en suivant les protocoles généraux J puis F (LiOH/Dioxane-H2O).
Tf > 160°C (avec décomposition) ; RMN 1H (500 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,9 Hz, 6H), 1,20-1,36 (m, 40H), 1,36-1,47 (m, 2H), 1,49-1,65 (m, 2H), 1,86-1,97 (m, 1H), 2,14-2,23 (m, 1H), 2,26-2,38 (m, 3H), 3,20 (dd, J = 9,1, 7,8 Hz, 1H), 3,26-3,39 (m, 3H), 3,64-3,69 (m, 1H), 3,70 (dd, J = 9,7, 5,7 Hz, 1 H), 3,78 (dd, J = 9,7, 5,3 Hz, 1 H), 3,87 (dd, J = 11,5, 1,3 Hz, 1 H), 3,974,03 (m, 1H), 4,21-4,28 (m, 1H), 4,32 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,44 (dd, J = 8,3,
4,9 Hz, 1H), 4,61-4,70 (m, 5H), 8,10 (s, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) : δ ppm 14,5 (2xCH3), 23,7 (2xCH2), 28,5 (2xCH2), 28,6 (CH2), 30,5-30,8 (14xCH2), 31,1 (CH2), 33,1 (2x- CH2), 34,0 (2xCH2), 47,9 (CH), 51,6 (CH2),
53,5 (CH), 54,4 (CH), 62,7 (CH2), 65,1 (CH2), 69,0 (CH2), 70,9 (CH2), 71,5 (CH), 74,9 (CH), 77,9 (CH), 78,0 (CH), 104,5 (CH), 126,1 (CH), 145,3 (C),
171,7 (C), 175,0 (C), 176,5 (C), 179,2 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 449 (40) [M-2H]2', 899 (100) [M-Hp; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C45H80N5O13 898,5753, trouvée 898,5754.
Le composé 3.7k (solide blanc, 60 mg, 0,09 mmol, 82 %) a été obtenu à partir du composé 3.5k en suivant les protocoles généraux J puis F.
Tf = 114-116°C ; RMN 1H (500 MHz, CD3OD) δ ppm 0,81-0,94 (m, 2H) ;
1,12-1,28 (m, 6H) ; 1,27-1,38 (m, 2H) ; 1,53-1,76 (m, 7H) ; 1,86-1,98 (m, 1H) ; 2,13-2,23 (m, 1H) ; 2,28 (t, J = 7,7 Hz, 2H) ; 2,31-2,39 (m, 2H) ; 3,20 (dd, J = 9,1, 7,8 Hz, 1 H) ; 3,27-3,39 (m, 3H) ; 3,64-3,68 (m, 1H);3,70 (dd, J = 9,6,
5,5 Hz, 1 H) ; 3,79 (dd, J = 9,6, 5,3 Hz, 1 H) ; 3,87 (dd, J = 11,7, 1,1 Hz, 1 H) ;
3,96-4,04 (m, 1 H) ; 4,21-4,28 (m, 1 H) ; 4,32 (d, J = 7,8 Hz, 1 H) ; 4,47 (dd, J =
9,1,4,7 Hz) ; 4,61-4,69 (m, 5H) ; 8,09 (s, 1H) ; RMN 13C (125 MHz, CD3OD) : δ ppm 27,1 (CH2) ; 27,5 (CH2) ; 27,5 (CH2) ; 27,5 (CH2) ; 27,8 (CH2) ; 27,9 (CH2) ; 31,0 (CH2) ; 34,5 (CH2) ; 34,5 (CH2) ; 36,8 (CH2) ; 38,3 (CH2) ; 38,8 (CH) ; 51,6 (CH2) ; 53,0 (CH) ; 54,5 (CH) ; 62,7 (CH2) ; 65,0 (CH2) ; 69,0 (CH2) ; 70,8 (CH2) ; 71,5 (CH) ; 74,9 (CH) ; 77,9 (CH) ; 78,0 (CH) ; 104,5 (CH) ; 126,2 (CH) ; 145,3 (C) ; 172,1 (C) ; 174,5 (C) ; 176,4 (C) ; 176,4 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 343 (30) [M-2H]2’, 506 (25), 686 (100) [M-Hp ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C3oH48N50-i3 686,3249, trouvée 686,3229.
0 Composé 3.7I
OH
(CH2)12CH3
5 Le composé 3.7I (solide blanc, 70 mg, 0,09 mmol, 94 %) a été obtenu à partir du composé 3.5I en suivant les protocoles généraux J puis F.
Tf > 170°C (avec décomposition) ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm
0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,23-1,38 (m, 20H), 1,54-1,67 (m, 2H), 1,86-2,03 (m,
1H), 2,13-2,43 (m, 5H), 3,19 (dd, J = 8,9, 7,9 Hz, 1H), 3,25-3,38 (m, 3H),
3,62-3,69 (m, 1H), 3,72 (dd, J = 9,7, 4,8 Hz, 1H), 3,82 (dd, J = 9,7, 5,3 Hz, 1H), 3,84-3,94 (m, 3H), 3,95-4,05 (m, 1H), 4,20-4,28 (m, 1H), 4,31 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,40-4,70 (m, 6H), 8,11 (s, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm
14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 28,6 (CH2), 30,4-30,8 (8xCH2), 32,8 (CH2), 33,1 (CH2), 36,8 (CH2), 41,9 (CH2), 51,6 (CH2), 53,2 (CH), 54,9 (CH),
62,7 (CH2), 65,1 (CH2), 69,0 (CH2), 70,8 (CH2), 71,5 (CH), 74,9 (CH), 78,0 (CH), 78,0 (CH), 104,5 (CH), 126,3 (CH), 145,3 (C), 172,2 (C), 173,1 (C),
174,5 (C), 175,4 (C), 176,6 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 393 (100) [M-H]2; 787 (80) [M-Hp ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C35H61N6O14 789,4246, trouvée
789,4238.
Composé 3.8a
Le composé 3.8a (cire blanche, 162 mg, 0,10 mmol, 43 %) a été obtenu à partir du composé 3.3f et du 1,17-diazido-3,6,9,12,15pentaoxaheptadecane (non décrit) en suivant le protocole général I.
Rf = 0,15 (CH2CI2/MeOH 96:4) ; RMN 1H (500 MHz, CDCIs) δ ppm 0,87 20 (t, J = 6,9 Hz, 6H), 1,18-1,34 (m, 40H), 1,53-1,67 (m, 4H), 1,94-2,08 (m, 2H),
2,13-2,29 (m, 6H), 2,29-2,51 (m, 4H), 3,49-3,66 (m, 18H), 3,79-3,89 (m, 4H), 3,87-4,06 (m, 2H), 4,39-4,53 (m, 4H), 4,53-4,79 (m, 8H), 5,07 (s, 4H), 5,12 (d, J = 12,5 Hz, 2H), 5,15 (d, J = 12,5 Hz, 2H), 6,67 (bs, 2H, NH), 7,24-7,39 (m, 20H), 7,45 (s, 2H), 7,73 (bs, 2H, NH) ; RMN 13C (125 MHz, CDCIs) δ ppm
5 14,2 (2xCH3), 22,8 (2xCH2), 25,7 (2xCH2), 27,1 (2xCH2), 29,4-29,8 (16xCH2),
30,1 (2xCH2), 32,0 (2xCH2), 36,6 (2xCH2), 50,5 (2xCH2), 52,0 (2xCH), 52,6 (2xCH), 64,5 (2xCH2), 66,6 (2xCH2), 67,3 (2xCH2), 69,4 (2xCH2), 69,6 (2xCH2), 70,6 (8xCH2), 123,9 (2xCH), 128,3-128,7 (20xCH), 135,4 (2xC),
135,9 (2xC), 144,2 (2xC), 170,2 (2xC), 171,3 (2xC), 172,6 (2xC), 173,7 (2xC) ; Masse (ESI+) m/z (%) 721 (30), 1072 (100), 1680 (75) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C90H133N10O19 1657,9748, trouvée 1657,9785.
Composé 3.9a
Le composé 3.9a (solide blanc, 107 mg, 0,08 mmol, 95 %) a été obtenu à partir du composé 3.8a en suivant le protocole général D1.
Tf = 74-76°C ; RMN 1H (500 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,9 Hz, 6H), 1,22-1,37 (m, 40H), 1,56-1,66 (m, 4H), 1,85-2,00 (m, 2H), 2,13-2,25 (m, 2H), 2,24-2,32 (m, 4H), 2,29-2,42 (m, 4H), 3,53-3,66 (m, 16H), 3,68-3,75 (m, 2H), 3,75-3,83 (m, 2H), 3,89 (t, J = 4,9 Hz, 4H), 4,37-4,51 (m, 2H), 4,57 (t, J =
4,9 Hz, 4H), 4,59-4,69 (m, 6H), 8,04 (s, 2H) ; RMN 13C (125 MHz, CD3OD) δ ppm 14,5 (2xCH3), 23,7 (2xCH2), 26,8 (2xCH2), 28,1 (2xCH2), 29,3-29,7 (16xCH2), 31,1 (2xCH2), 33,1 (2xCH2), 36,8 (2xCH2), 51,4 (2xCH2), 52,2 (2xCH), 54,6 (2xCH), 65,1 (2xCH2), 70,3 (2xCH2), 70,9 (2xCH2), 71,4-71,5 (8xCH2), 126,0 (2xCH), 145,4 (2xC), 171,9 (2xC), 174,9 (2xC), 176,4 (2xC),
0 176,4 (2xC) ; Masse (ESI-) m/z (%) 647 (100) [M-2H]2’ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C62H109N10O19 1297,7870, trouvée 1297,7860.
Exemple 5: Composés 4.1 à 4.6
i. H-D-Glu(OBn)-OBn.p-tosylate (2 équiv.), TBTU (1,2 équiv.), DIEA (5 équiv.), DMF ; ii. H-D-Glu(OBn)-OBn.p-tosylate (3 équiv.), TBTU (1,2 équiv.),
DIEA (10 équiv.), DMF; iii. TFA, CH2CI2 ; iv. CH3(CH2)nCOCI, DMAP, pyridine, CH2CI2 ; v. Pd/C 5%, THF.
Composé 4.1
Ο
BnOOC
COOBn
COOBn
L’ensemble des réactifs, acide /V-Boc-L-aspartique 4-benzyl ester (2,00 g, 6,19 mmol), H-D-Glu(OBn)-OBn.p-tosylate (6,18 g, 12,37 mmol, 2 équiv.), TBTU (2,39 g, 7,43 mmol, 1,2 équiv.) et DIEA (4,0 g, 30,9 mmol, 5 équiv.), est solubilisé dans du DMF (80 mL). Après 16 h d’agitation à TA, le milieu réactionnel est dilué avec de l’eau et extrait à l’AcOEt. Les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée de NaHCO3, à l’eau, avec une solution aqueuse saturée de NaCl puis séchées sur MgSCL et concentrées sous vide. Le résidu est dissous dans un minimum de CH2CI2 et le produit est précipité avec de l’éther à froid. Le précipité est récupéré par filtration sur Buchner en utilisant un papier filtre pour donner 2,07 g d’un solide blanc avec 53% de rendement.
Rf = 0,44 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 102 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCI3) δ ppm 1,44 (s, 9H), 1,95-2,06 (m, 1 H), 2,18-2,47 (m, 3H), 2,72 (dd, J = 17,0, 5,9 Hz, 1H), 3,01 (dd, J = 17,1, 4,0 Hz, 1H), 4,50-4,59 (m, 1H), 4,594,66 (m, 1H), 5,05-5,20 (m, 6H), 5,63 (d, J = 8,1 Hz, NH), 7,16 (d, J = 7,3 Hz, NH), 7,28-7,41 (m, 15H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 27,2 (CH2),
28,2 (3xCH3), 30,0 (CH2), 35,8 (CH2), 50,6 (CH), 51,8 (CH), 66,5 (CH2), 66,8 (CH2), 67,3 (CH2), 80,7 (C), 128,1-128,7 (15xCH), 135,1 (C), 135,4 (C), 135,7 (C), 155,6 (C), 170,7 (C), 171,1 (C), 171,5 (C), 172,4 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 655 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour CssH^OgNa 655,2632 [M+Na]+, trouvée 655,2624.
Composé 4.2
L’ensemble des réactifs, acide /V-Boc-L-aspartique (1,00 g, 4,28 mmol),
H-D-Glu(OBn)-OBn.p-tosylate (6,22 g, 12,84 mmol, 3 équiv.), TBTU (3,3 g,
10,27 mmol, 1,2 équiv.) et DIPEA (5,54 g, 42,8 mmol, 10 équiv.), est solubilisé dans du DMF (60 mL). Après 16 h d’agitation à TA, le milieu réactionnel est dilué avec de l’eau et extrait à l’AcOEt. Les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée de NaHCO3, à l’eau, avec une solution aqueuse saturée de NaCl puis séchées sur MgSCU et concentrées sous vide. Le résidu est dissous dans un minimum de CH2CI2 et le produit est précipité avec de l’éther à froid. Le précipité est récupéré par filtration sur Buchner en utilisant un papier filtre pour donner 3,13 g d’un solide blanc avec 86% de rendement.
Rf = 0,56 (CH2CI2/AcOEt 8:2) ; Tf = 89 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 1,43 (s, 9H), 1,93-2,05 (m, 2H), 2,15-2,28 (m, 2H), 2,29-2,45 (m, 4H), 2,47-2,56 (m, 1H), 2,79-2,89 (m, 1H), 4,47 (m, 1H), 4,54-4,62 (m, 2H), 5,07 (s, 4H), 5,11 (s, 4H), 5,96 (d, J = 5,5 Hz, NH), 6,78 (d, J = 7,4 Hz, NH), 7,387,27 (m, 20H), 7,41 (d, J = 7,0 Hz, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm
26,8 (CH2), 27,0 (CH2), 28,4 (3xCH3), 30,2 (CH2), 30,3 (CH2), 37,5 (CH2),
51,5 (CH), 52,0 (CH), 52,1 (CH), 66,6 (CH2), 66,7 (CH2), 67,4 (CH2), 67,6 (CH2), 80,6 (C), 128,3-128,8 (20xCH), 135,2 (C), 135,3 (C), 135,8 (C), 135,9 (C), 155,9 (C), 170,8 (2xC), 171,4 (C), 171,7 (C), 172,5 (C), 172,6 (C) ;
Masse (ESI-) m/z (%) 850,4 [M-Hp, 886,4 (100) [M+CIp ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C47Hs2N30i2 850,3551 [M-Hp, trouvée 850,3510.
Composé 4.3a
COOBn
BnOOC
COOBn (CH2)8CH3
CDCI3) δ ppm 0,88 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,15-1,36 (m, 12H), 1,50-1,64 (m, 2H),
Le composé 4.3a (solide blanc, 431 mg, 0,63 mmol, 79 %) a été obtenu à partir du composé 4.1 en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,30 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 87 °C ; RMN 1H (400 MHz,
1,94-2,05 (m, 1H), 2,14 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,14-2,45 (m, 3H), 2,76-2,92 (m, 2H, H3’), 4,59-4,67 (m, 1H), 4,96-5,02 (m, 1H), 5,03-5,16 (m, 6H), 7,13 (d, J = 7,7 Hz, NH), 7,20-7,36 (m, 15H), 7,60 (d, J = 7,5 Hz, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 13,9 (CH3), 22,5 (CH2), 25,3 (CH2), 26,7 (CH2), 29,8 (CH2), 29,0-29,3 (4xCH2), 31,7 (CH2), 35,8 (CH2), 36,0 (CH2), 49,0 (CH), 51,7 (CH), 66,2 (CH2), 66,4 (CH2), 66,9 (CH2), 127,9-128,4 (15xCH), 135,1 (C),
135,4 (C), 135,6 (C), 170,6 (C), 170,8 (C), 170,9 (C), 172,2 (C), 173,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 687 [M+H]+, 709 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C4oH5iN2OsNa 709,3465 [M+Na]+, trouvée 709,3461.
Composé 4.3b
Le composé 4.3b (solide blanc, 424 mg, 0,59 mmol, 75 %) a été obtenu à partir du composé 4.1 en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,31 (cyclohexane/AcOEt7:3) ; Tf = 75 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,15-1,36 (m, 16H), 1,50-1,64 (m, 2H), 1,93-2,04 (m, 1H), 2,13 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 2,14-2,45 (m, 3H), 2,73-2,93 (m, 2H), 4,57-4.66 (m, 1H), 4,91-5,00 (m, 1H), 5,01-5,16 (m, 6H), 7,01 (bs, NH), 7,22-7,36 (m, 15H), 7,50 (bs, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,0 (CH3), 22,5 (CH2), 25,4 (CH2), 26,8 (CH2), 29,0-29,6 (6xCH2), 29,9 (CH2),
31,8 (CH2), 35,7 (CH2), 36,1 (CH2), 49,1 (CH), 51,7 (CH), 66,3 (CH2), 66,6 (CH2), 67,0 (CH2), 127,9-128,5 (15xCH), 135,2 (C), 135,4 (C), 135,7 (C),
170,5 (C), 171,0 (2xC), 172,3 (C), 173,6 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 715 [M+H]+, 737 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C42H54N2O8Na 737.3778 [M+Na]+, trouvée 737,3781.
Composé 4.3c
O COOBn
BnOOC
COOBn
ΟγΝΗ (CH2)12CH3
Le composé 4.3c (solide blanc, 523 mg, 0,71 mmol, 86 %) a été obtenu à partir du composé 4.1 en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,34 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 75 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,16-1,36 (m, 20H), 1,49-1,65 (m, 2H), 1,93-2,04 (m, 1H), 2,13 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 2,16-2,45 (m, 3H), 2,74-2,91 (m, 2H), 4,57-4,65 (m, 1H), 4,95-5,02 (m, 1H), 5,02-5,14 (m, 6H), 7,17 (d, J = 8,4 Hz, NH), 7,20-7,34 (m, 15H), 7,61 (d, J = 8,0 Hz, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,0 (CH3), 22,6 (CH2), 25,4 (CH2), 26,7 (CH2), 29,0-29,6 (8xCH2), 29,9 (CH2), 31,8 (CH2), 35,8 (CH2), 36,1 (CH2), 49,1 (CH), 51,8 (CH), 66,3 (CH2), 66,5 (CH2), 67,0 (CH2), 127,9-128,5 (15xCH), 135,2 (C),
135,4 (C), 135,7 (C), 170,7 (C), 170,9 (2xC), 172,3 (C), 173,7 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 743 [M+H]+, 765 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C44H58N20sNa 765,4091 [M+Na]+, trouvée 765,4079.
Composé 4.3d
(CH2)14CH3
Le composé 4.3d (solide blanc, 523 mg, 0,68 mmol, 89 %) a été obtenu à partir du composé 4.1 en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,37 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 85-86°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,15-1,35 (m, 24H), 1,49-1,63 (m, 2H), 1,92- 2,04 (m, 1H), 2,12 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 2,13-2,45 (m, 3H), 2,73-2,93 (m, 2H), 4,57-4,65 (m, 1H), 4,92-5,01 (m, 1H), 5,01-5,14 (m, 6H), 7,17 (bs, NH), 7,19-7,36 (m, 15H), 7,61 (bs, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,0 (CH3), 22,5 (CH2), 25,4 (CH2), 26,7 (CH2), 29,0-29,6 (11xCH2), 29,9 (CH2),
31,8 (CH2), 35,7 (CH2), 36,1 (CH2), 49,1 (CH), 51,7 (CH), 66,1 (CH2), 66,5 (CH2), 67,0 (CH2), 127,9-128,5 (15xCH), 135,2 (C), 135,4 (C), 135,7 (C),
170,6 (C), 171,0 (2xC), 172,2 (C), 173,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 793 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C46H62N2O8Na 793,4404 [M+Na]+, trouvée 793,4420.
Composé 4.4a
BnOOC
BnOOC
Le composé 4.4a (solide blanc, 437 mg, 0,48 mmol, 82 %) a été obtenu à partir du composé 4.2 en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,27 (CH2CI2/AcOEt 8:2) ; Tf = 130-133 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,18-1,38 (m, 12H), 1,56-1,67 (m, 2H),
1,94-2,06 (m, 2H), 2,16-2,28 (m, 4H), 2,30-2,48 (m, 5H), 2,88 (dd, J = 14,9,
3,2 Hz, 1H), 4,52-4,63 (m, 2H), 4,73-4,80 (m, 1H), 5,04-5,17 (m, 8H), 6,93 (d, J = 7,5 Hz, NH), 7,13 (d, J = 7,5 Hz, NH), 7,27-7,38 (m, 10H), 7,51 (d, J = 7,6 Hz, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,1 (CHs), 22,7 (CH2), 25,5 (CH2), 26,6 (CH2), 26,8 (CH2), 29,2-29,5 (3xCH2), 30,1 (CH2), 30,2 (CH2),
31,9 (2xCH2), 36,4 (CH2), 37,1 (CH2), 49,9 (CH), 51,9 (CH), 52,1 (CH), 66,5 (2xCH2), 67,2 (CH2), 67,4 (CH2), 128,1-128,7 (20xCH), 135,2 (C), 135,3 (C), 135,8 (2xC), 170,0 (C), 171,1 (C), 171,3 (C), 171,8 (C), 172,3 (C), 172,5 (C), 174,1 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 907 [M+H]+ , 929 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour CszHôsNsOnNa 928,4360 [M+Na]+, trouvée 928,4380.
Composé 4.4b
BnOOC
BnOOC
COOBn
COOBn (CH2)10CH3
Le composé 4.4b (solide blanc, 430 mg, 0,46 mmol, 78 %) a été obtenu à partir du composé 4.2 en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,33 (CH2CI2/AcOEt 8:2) ; Tf = 112-114°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,87 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,17-1,37 (m, 16H), 1,56-1,67 (m, 2H),
1,94-2,07 (m, 2H), 2,16-2,28 (m, 4H), 2,30-2,47 (m, 5H), 2,87 (dd, J = 14,9,
3,3 Hz, 1H), 4,52-4,63 (m, 2H), 4,74-4,80 (m, 1H), 5,04-5,17 (m, 8H), 6,96 (d, J = 7,5 Hz, NH), 7,14 (d, J = 7,5 Hz, NH), 7,27-7,38 (m, 10H), 7,52 (d, J = 7,6 Hz, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,1 (CH3), 22,6 (CH2), 25,5 (CH2), 26,7 (2xCH2), 29,2-29,7 (5xCH2), 30,0 (CH2), 30,2 (CH2), 31,8 (2xCH2), 36,3 (CH2), 37,1 (CH2), 49,9 (CH), 51,8 (CH), 52,0 (CH), 66,4 (2xCH2), 67,1 (CH2), 67,2 (CH2), 128,0-128,6 (20xCH), 135,1 (C), 135,2 (C),
135,7 (C), 135,8 (C), 170,9 (C), 171,0 (C), 171,3 (C), 171,7 (C), 172,3 (C),
172,4 (C), 174,0 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 935 [M+H]+, 957 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C54H67N30nNa 956,4673 [M+Na]+, trouvée 956,4682.
Composé 4.4c
Le composé 4.4c (solide blanc, 437 mg, 0,45 mmol, 77 %) a été obtenu à partir du composé 4.2 en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,39 (CH2CI2/AcOEt 8:2) ; Tf = 112-116 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 7,0 Hz, 3H) , 1,16-1,35 (m, 20H), 1,56-1,65 (m, 2H), 1,93-2,06 (m, 2H), 2,15-2,28 (m, 4H), 2,30-2,47 (m, 5H), 2,87 (dd, J = 14,9, 3,0 Hz, 1H), 4,51-4,63 (m, 2H), 4,72-4,80 (m, 1H), 5,05-5,14 (m, 8H), 6,94 (d, J = 7,4 Hz, NH), 7,11 (d, J = 7,5 Hz, NH), 7,27-7,38 (m, 10H), 7,50 (d, J = 7,7 Hz, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,3 (CH3), 22,8 (CH2), 25,6 (CH2), 26,7 (CH2), 26,9 (CH2), 29,3-29,9 (7xCH2), 30,3 (CH2),
30,4 (CH2), 32,1 (2xCH2), 36,6 (CH2), 37,2 (CH2), 49,9 (CH), 52,2 (CH), 52,3 (CH), 66,7 (2xCH2), 67,4 (CH2), 67,6 (CH2), 128,3-128,9 (20xCH), 135,2 (C),
135,3 (C), 135,9 (2xC), 171,2 (2xC), 171,3 (C), 171,9 (C), 172,5 (C), 172,6 (C), 174,1 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 963 (100) [M+H]+, 985 [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour CseHy-iNsOnNa 984,4986 [M+Na]+, trouvée
984,4996.
Composé 4.4d
BnOOC
BnOOC
Le composé 4.4d (solide blanc, 436 mg, 0,44 mmol, 75 %) a été obtenu à partir du composé 4.2 en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0.42 (CH2CI2/AcOEt 8:2) ; Tf = 120-124 °C ; RMN 1H (400 MHz,
CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J =7,0 Hz, 3H), 1,19-1,35 (m, 24H), 1,55-1,66 (m, 2H),
1,94-2,07 (m, 2H), 2,16-2,28 (m, 4H), 2,29-2,50 (m, 5H), 2,88 (dd, J = 14,9,
3,3 Hz, 1H), 4,52-4,64 (m, 2H), 4,73-4,81 (m, 1H), 5,04-5,17 (m, 8H), 6,99 (d, J = 7,5 Hz, NH), 7,16 (d, J = 7,5 Hz, NH), 7,27-7,38 (m, 20H), 7,53 (d, J = 7,6
Hz, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,3 (CHs), 22,8 (CH2), 25,6 (CH2), 26,7 (CH2), 26,9 (CH2), 29,3-29,9 (11xCH2), 30,3 (CH2), 30,4 (CH2), 32,1 (2xCH2), 36,6 (CH2), 37,2 (CH2), 49,9 (CH), 52,2 (2xCH), 66,6 (CH2),
66,7 (CH2), 67,4 (CH2), 67,6 (CH2), 128,3-128,8 (20xCH), 135,2 (C), 135,3 (C), 135,8 (C), 135,9 (C), 171,2 (2xC), 171,3 (C), 171,9 (C), 172,5 (C), 172,6 (C), 174,2 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 991 (100) [M+H]+, 1013 [M+Na]+ ;
SMHR (ESI+) m/z calculée pour CssHysNsOnNa 1012,5299 [M+Na]+, trouvée 1012,5296.
Composé 4.5a
(CH2)gCH3
Le composé 4.5a (solide blanc, 175 mg, 0,42 mmol, 72 %) a été obtenu à partir du composé 4.3a en suivant le protocole général D2.
Tf = 160-162°C ; RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,22-1,39 (m, 12H), 1,55-1,68 (m, 2H), 1,90-2,02 (m, 1H), 2,14-2,24 (m, 1H), 2,25 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,36-2,42 (m, 2H), 2,66 (dd, J = 16,7, 7,3 Hz, 1 H), 2,85 (dd, J = 16,7, 6,4 Hz, 1 H), 4,43 (dd, J = 8,8, 4,8 Hz, 1 H), 4,79 (dd, J = 7,3, 6,4 Hz, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, MeOD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 33,0 (CH2), 30,2-31,1 (4xCH2), 36,7 (CH2),
36,9 (CH2), 51,1 (CH), 53,2 (CH), 173,0 (C), 173,8 (C), 174,5 (C), 176,4 (C), 176,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 397 (100) [M-Fp, 415 [M-Hp, 437 [M+Na2Hp ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour Ci9H3iN2O8 415,2080 [M-Hp, trouvée 415,2093.
Composé 4.5b
(CH2)10CH3
Le composé 4.5b (solide blanc, 190 mg, 0,43 mmol, 77 %) a été obtenu à partir du composé 4.3b en suivant le protocole général D2.
Tf = 151 °C ; RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ ppm 0,90 (t, J = Q,7 Hz, 3H), 1,20-1,41 (m, 16H), 1,55-1,68 (m, 2H), 1,90-2,02 (m, 1H), 2,14-2,24 (m, 1H), 2,25 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,36-2,42 (m, 2H), 2,66 (dd, J = 16,7, 7,2 Hz, 1H), 2,85 (dd, J = 16,7, 6,5 Hz, 1H), 4,43 (dd, J = 8,7, 4,8 Hz, 1H), 4,79 (dd, J = 7,2, 6,5 Hz, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, MeOD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2),
26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 30,2-31,1 (6xCH2), 33,06 (CH2), 36,7 (CH2), 36,9 (CH2), 51,1 (CH), 53,2 (CH), 173,0 (C), 173,8 (C), 174,5 (C), 176,5 (2xC) ; Masse (ESI-) m/z (%) 425 [M-Fp, 443 (100) [M-Hp, 465 [M+Na-2Hp ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C2iH35N20s 443,2393 [M-Hp, trouvée 443,2396.
Composé 4.5c
(CH2)12CH3
Le composé 4.5c (solide blanc, 194 mg, 0,41 mmol, 76 %) a été obtenu à partir du composé 4.3c en suivant le protocole général D2.
Tf = 145-148°C ; RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,20-1,40 (m, 20H), 1,56-1,67 (m, 2H), 1,91-2,02 (m, 1H), 2,14-2,24 (m, 1H), 2,25 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,36-2,43 (m, 2H), 2,66 (dd, J = 16,7, 7,2 Hz, 1 H), 2,85 (dd, J = 16,7, 6,4 Hz, 1 H), 4,43 (dd, J = 8,8, 4,8 Hz, 1 H), 4,79 (dd, J = 7,2, 6,4 Hz, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, MeOD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 30,2-31,1 (10xCH2), 33,1 (CH2), 36,7 (CH2),
36,9 (CH2), 51,1 (CH), 53,2 (CH), 173,0 (C), 173,8 (C), 174,5 (C), 176,5 (2xC) ; Masse (ESI-) m/z (%) 453 [M-Fp, 471 (100) [M-Hp, 493 [M+Na-2Hp ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C23H39N20s 471,2706 [M-Hp, trouvée 471,2686.
Composé 4.5d
Le composé 4.5d (solide blanc, 243 mg, 0,49 mmol, 93 %) a été obtenu à partir du composé 4.3d en suivant le protocole général D2.
Tf = 138-141°C ; RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,9 Hz,
3H), 1,23-1,38 (m, 24H), 1,56-1,67 (m, 2H), 1,91-2,02 (m, 1H), 2,15-2,24 (m,
1H), 2,25 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,36-2,43 (m, 2H), 2,66 (dd, J = 16,6, 7,2 Hz,
H), 2,86 (dd, J = 16,6, 6,3, 1 H), 4,43 (dd, J = 8,8, 4,8, Hz, 1 H), 4,79 (dd, J =
7,2, 6,3 Hz, 1H); RMN 13C (100 MHz, MeOD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2),
26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 30,2-31,1 (12xCH2), 33,1 (CH2), 36,7 (CH2), 36,9 (CH2), 51,1 (CH), 53,2 (CH), 173,0 (C), 173,9 (C), 174,5 (C), 176,5 (2xC) ; Masse (ESI-) m/z (%) 481 [M-Fp, 499 (100) [M-Hp, 521 [M+Na-2Hp ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C25H43N20s 499,3019 [M-Hp, trouvée 499,3027.
Composé 4.6a
Le composé 4.6a (solide blanc, 221 mg, 0,40 mmol, 93 %) a été obtenu à partir du composé 4.4a en suivant le protocole général D2.
Tf = 170-175°C ; RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,21-1,37 (m, 12H), 1,54-1,66 (m, 2H), 1,87-2,02 (m, 2H), 2,13-2,28 (m, 4H), 2,35-2,44 (m, 4H), 2,63 (dd, J= 15,1, 8,0 Hz, 1H), 2,80 (dd, J= 15,1,6,1 Hz, 1H), 4,40-4,48 (m, 2H), 4,80 (dd, J = 8,0 6,1 1H) ; RMN 13C (100 MHz, MeOD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 28,0 (CH2),
30,4 (2xCH2), 30,5 (CH2), 30,6 (CH2), 31,1 (CH2), 31,2 (CH2), 33,0 (CH2),
36,9 (CH2), 38,4 (CH2), 51,6 (CH), 53,0 (CH), 53,2 (CH), 172,1 (C), 173,1 (C), 174,6 (C), 175,0 (C), 176,4 (C), 176,5 (2xC) ; Masse (ESI-) m/z (%) 544 (100) [M-Hp, 566 [M+Na-2Hp ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C24H38N30n 544,2506 [M-Hp, trouvée 544,2514.
Composé 4.6b
(CH2)10CH3
Le composé 4.6b (solide blanc, 247 mg, 0,43 mmol, 98 %) a été obtenu à partir du composé 4.4b en suivant le protocole général D2.
Tf = 165-170 °C ; RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H) 1,20-1,38 (m, 16H), 1,54-1,66 (m, 2H), 1,88-2,02 (m, 2H), 2,13-2,28 (m, 4H), 2,35-2,44 (m, 4H), 2,63 (dd, J= 15,1 8,1 Hz, 1H), 2,80 (dd, J= 15,1,6,1 Hz, 1H), 4,39-4,48 (m, 2H), 4,79 (dd, J = 8,1, 6,1 1H) ; RMN 13C (100 MHz, MeOD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 28,0 (CH2), 28,1 (CH2), 30,3-31,3 (8xCH2), 33,1 (CH2), 36,9 (CH2), 38,4 (CH2), 51,7 (CH), 53,2 (CH),
53,3 (CH), 172,1 (C), 173,1 (C), 174,7 (C), 175,2 (C), 176,5 (C), 176,6 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 572 [M-Hp, 594 (100) [M+Na-2Hp ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C26H42N3O11 572,2819 [M-Hp, trouvée 572,2817.
Composé 4.6c
Le composé 4.6c (solide blanc, 208 mg, 0,35 mmol, 80 %) a été obtenu à partir du composé 4.4c en suivant le protocole général D2.
Tf = 155-160 °C ; RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,22-1,38 (m, 20H), 1,54-1,67 (m, 2H), 1,87-2,02 (m, 2H), 2,13-2,29 (m, 4H), 2,36-2,44 (m, 4H), 2,63 (dd, J= 15,0, 8,0 Hz, 1H), 2,81 (dd, J= 15,0, 6,1 Hz, 1H), 4,40-4,48 (m, 2H), 4,77-4,83 (dd, J = 8,0, 6,1, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, MeOD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 28,0 (CH2), 31,3-30,3 (10xCH2), 33,1 (CH2), 36,9 (CH2), 38,4 (CH2), 51,6 (CH), 53,0 (CH), 53,2 (CH), 172,1 (C), 173,1 (C), 174,6 (C), 175,0 (C), 176,4 (C),
176,5 (2xC) ; Masse (ESI-) m/z (%) 600 (100) [M-Hp, 622 [M+Na-2Hp ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C28H46N3O11 600,3132 [M-Hp ; trouvée 600,3108.
Composé 4.6d
Le composé 4.6d (solide blanc, 208 mg, 0,33 mmol, 75 %) a été obtenu 5 à partir du composé 4.4d en suivant le protocole général D2.
Tf = 158-160 °C ; RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H) , 1,22-1,37 (m, 24H), 1,54-1,66 (m, 2H), 1,85-2,02 (m, 2H), 2,13-2,28 (m, 4H), 2,35-2,44 (m, 4H), 2,63 (dd, J= 15,1, 8,0 Hz, 1H), 2,80 (dd, J= 15,1,6,1 Hz, 1H), 4,42-4,48 (m, 2H), 4,79 (dd, J = 8,0, 6,1 1H) ; RMN 13C (100 MHz,
MeOD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 28,0 (CH2), 30,3-31,3 (12xCH2), 33,1 (CH2), 36,9 (CH2), 38,4 (CH2), 51,7 (CH), 53,1 (CH), 53,2 (CH), 172,1 (C), 173,1 (C), 174,6 (C), 175,0 (C), 176,4 (C), 176,5 (2xC) ; Masse (ESI-) m/z (%) 628 (100) [M-H]’, 650 [M+Na-2Hp ; SMHR (ESI) m/z calculée pour C30H50N3O11 628,3445 [M-Hp ; trouvée 628,3448.
Exemple 6: Composés 5.1 à 5.3 hox γ ετη NHFmoc
HO2C
i. EtsSiH, TFA, CH2CI2 puis CH3(CH2)n-2CHCH2, DMPA, THF ; ii. Ethylaminomaltoside (acétate), TBTU, DIEA, DMF ; iii. Et2NH, CH2CI2 ; iv. RCOOH (R = EtO2C(CH2)2CHCO2Me), TBTU, DIEA, DMF ; v. MeONa, MeOH puis Dowex ; vi. LiOH, THF/H2O.
Composé 5.1a o
NHFmoc
Le composé 5.1a (solide blanc, 1,051 g, 2,06 mmol, 60 %) a été obtenu à partir de L-Fmoc-Cys(Trt)-OH et du dodécène en suivant le protocole général L.
Rf = 0,16 (CH2CI2/MeOH/AcOH 99:0,5:0,5) ; Tf = 66-68°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,17-1,40 (m, 18H), 1,57 (m, 2H), 2,56 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 3,03 (d, J = 4,7 Hz, 2H), 4,24 (t, J = 7,0 Hz,
1H), 4,41 (d, J = 6,9 Hz, 2H), 4,63 (m, 1H), 5,65 (d, J = 7,8 Hz, NHFmoc), 7,32 (m, 2H), 7,40 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 7,60 (d, J = 6,6 Hz, 2H), 7,76 (d, J =
7,5 Hz, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,3 (CH3), 22,8 (CH2), 28,832,1 (9xCH2), 33,1 (CH2), 34,2 (CH2), 47,2 (CH), 53,6 (CH), 67,6 (CH2),
120,2 (2xCH), 125,3 (2xCH), 127,3 (2xCH), 127,9 (2xCH), 141,5 (2xC), 143,8 (C), 143,9 (C), 156,1 (C), 175,0 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 512 (100) [M+H]+ ; HRMS (ESI+) m/z calculée pour C3oH42N04S 512,2829, trouvée 512,2823.
Composé 5.1b o
NHFmoc
Le composé 5.1b (solide blanc, 1,050 g, 1,95 mmol, 57 %) a été obtenu à partir de L-Fmoc-Cys(Trt)-OH et du tetradécène en suivant le protocole général L.
Rf = 0,16 (CH2CI2/MeOH/AcOH 99:0,5:0,5) ; Tf = 71-72°C; RMN 1H 5 (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,17-1,40 (m, 22H), 1,57 (m, 2H), 2,55 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 3,03 (d, J = 4,3 Hz, 2H), 4,24 (t, J = 7,0 Hz, 1H), 4,41 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 4,63 (m, 1H), 5,65 (d, J = 7,8 Hz, NHFmoc), 7,31 (m, 2H), 7,40 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 7,60 (d, J = 6,7 Hz, 2H), 7,76 (d, J =
7,5 Hz, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,2 (CHs), 22,8 (CH2), 28,810 32,1 (11xCH2), 33,1 (CH2), 34,3 (CH2), 47,2 (CH), 53,6 (CH), 67,6 (CH2),
120,1 (2xCH), 125,2 (2xCH), 127,2 (2xCH), 127,9 (2xCH), 141,4 (2xC), 143,8 (C), 143,9 (C), 156,1 (C), 175,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 316 (100), 538 (40) [M+H]’ ; HRMS (ESI-) m/z calculée pour C32H44NO4S 538,2991 [M-H]’, trouvée 538,2970.
Composé 5.1c o
NHFmoc
0 Le composé 5.1c (solide blanc, 1,248 g, 2,20 mmol, 64 %) a été obtenu à partir de L-Fmoc-Cys(Trt)-OH et de l’hexadécène en suivant le protocole général L.
Rf = 0,16 (CH2CI2/MeOH/AcOH 99:0,5:0,5) ; Tf = 70°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,14-1,40 (m, 26H), 1,57 (m,
2H), 2,56 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 3,03 (d, J = 4,5 Hz, 2H), 4,24 (t, J = 7,0 Hz, 1 H),
4,41 (d, J = 6,6 Hz, 2H), 4,62 (m, 1H), 5,65 (d, J = 7,7 Hz, NHFmoc), 7,31 (m, 2H,), 7,40 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 7,60 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 7,76 (d, J = 7,5 Hz, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,3 (CHs), 22,8 (CH2), 28,8-32,1 (13xCH2), 33,1 (CH2), 34,2 (CH2), 47,3 (CH), 53,6 (CH), 67,6 (CH2), 120,2 (2xCH), 125,3 (2xCH), 127,3 (2xCH), 127,9 (2xCH), 141,5 (2xC), 143,8 (C), 143,9 (C), 156,1 (C), 174,9 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 568 (100) [M+H]+ ; HRMS (ESI+) m/z calculée pour C34H50NO4S 568,3455 [M+H]+, trouvée 568,3451.
Composé 5.1d
Le composé 5.1d (solide blanc, 1,230 g, 2,07 mmol, 60 %) a été obtenu à partir de L-Fmoc-Cys(Trt)-OH et de l’octadécène en suivant le protocole général L.
Rf = 0,16 (CH2CI2/MeOH/AcOH 99:0,5:0,5) ; Tf = 74°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,13-1,40 (m, 30H), 1,57 (m, 2H),
2,56 (t, J = Q,7 Hz, 2H), 3,03 (d, J = 4,4 Hz, 2H), 4,24 (t, J = 7,0 Hz, 1 H), 4,42 (d, J = Q,7 Hz, 2H), 4,62 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,64 (d, J = 7,Q Hz, NHFmoc), 7,32 (m, 2H), 7,40 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 7,60 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,77 (d, J =
7,5 Hz, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,3 (CHs), 22,8 (CH2), 28,932,1 (15xCH2), 33,1 (CH2), 34,2 (CH2), 47,2 (CH), 53,6 (CH), 67,6 (CH2),
120,2 (2xCH), 125,3 (2xCH), 127,3 (2xCH), 127,9 (2xCH), 141,5 (2xC), 143,8 (C), 143,9 (C), 156,1 (C), 174,8 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 596 (100) [M+H]+ ; HRMS (ESI+) m/z calculée pour C36H54NO4S 596,3768 [M+H]+, trouvée 596,3762.
5 Composé 5.2a
Le composé 5.2a (solide incolore, 1,036 g, 0,87 mmol, 60 %) a été obtenu à partir du composé 5.1a et du 2'-aminoéthyl-4-O-(2,3,4,6-tetra-Oacétyl-a-D-glucopyranosyl)-2,3,6-tri-O-acétyl-3-D-glucopyranoside (non décrit) en suivant le protocole général A.
Rf = 0,29 (Cyclohexane/AcOEt 5:5) ; Tf = 84-85°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,86 (t, J =7,0 Hz, 3H), 1,16-1,38 (m, 18H), 1,50-1,62 (m, 2H), 1,99, 1,99, 2,01,2,01,2,03, 2,08, 2,11 (s, 21 H), 2,45-2,60 (m, 2H), 2,76-2,96 (m, 2H), 3,32-3,44 (m, 1H), 3,46-3,56 (m, 1H), 3,61-3,71 (m, 2H), 3,75-3,84 (m, 1H), 3,90-3,98 (m, 2H), 4,03 (dd, J= 12,4, 2,2 Hz, 1H), 4,15 (dd, J= 12,2, 4,4 Hz, 1H), 4,18-4,28 (m, 3H), 4,34-4,47 (m, 2H), 4,51 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,52 (dd, J = 12,2, 2,5 Hz, 1H), 4,79 (dd, J = 9,3, 7,8 Hz, 1H), 4,84 (dd, J = 10,4, 4,0 Hz, 1 H), 5,05 (t, J = 9,7 Hz, 1 H), 5,23 (t, J = 9,3 Hz, 1 H), 5,35 (dd, J = 10,4, 9,7 Hz, 1H), 5,39 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 5,77 (s, NH), 6,66 (s, NH), 7,277,33 (m, 2H), 7,41-7,47 (m, 2H), 7,59 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,75 (d, J = 7,4 Hz, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,3 (CHs), 20,6-21,1 (7xCHs), 22,8 (CH2), 28,9-32,1 (9xCH2), 32,8 (CH2), 34,8 (CH2), 39,7 (CH2), 47,3 (CH), 54,5 (CH), 61,6 (CH2), 62,7 (CH2), 67,3 (CH2), 68,2 (CH), 68,6 (CH2), 68,7 (CH),
69.5 (CH), 70,2 (CH), 72,3 (CH), 72,6 (2xCH), 75,3 (CH), 95,7 (CH), 100,5 (CH), 120,2 (2xCH), 125,2 (CH), 125,3 (CH), 127,2 (2xCH), 127,9 (2xCH),
141.5 (2xC), 143,9 (2xC), 156,0 (C), 169,6 (C), 170,0 (C), 170,1 (C), 170,3 (C), 170,5 (C), 170,7 (3xC) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1196 (100) [M+Na]+ ; HRMS (ESI+) m/z calculée pour C58HsiN2O2iS 1195,4872 [M+Na]+, trouvée 1195,4875.
Composé 5.2b
OAc
AcO
AcO
NHFmoc
OAc
Le composé 5.2b (solide incolore, 708 mg, 0,60 mmol, 63 %) a été obtenu à partir du composé 5.1b et du 2'-aminoéthyl-4-O-(2,3,4,6-tetra-Oacétyl-a-D-glucopyranosyl)-2,3,6-tri-O-acétyl-3-D-glucopyranoside (non décrit) en suivant le protocole général A.
Rf = 0,29 (Cyclohexane/AcOEt 5:5) ; Tf = 90-91 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,87 (t, J =7,0 Hz, 3H), 1,18-1,39 (m, 22H), 1,52-1.62 (m, 2H), 2,00, 2,00, 2,02, 2,02, 2,04, 2,09, 2,12 (s, 21 H), 2,48-2,60 (m, 2H), 2,77-2,97 (m, 2H), 3,31-3,45 (m, 1H), 3,49-3,58 (m, 1H), 3,62-3,73 (m, 2H), 3,77-3,85 (m, 1H), 3,91-3,99 (m, 2H), 4,04 (dd, J= 12,4, 2,2 Hz, 1H), 4,16 (dd, J= 12,1,
4,4 Hz, 1H), 4,20-4,28 (m, 3H), 4,35-4,48 (m, 2H), 4,53 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,54 (dd, J = 12,1, 2,5 Hz, 1H), 4,80 (dd, J = 9,3, 7,8 Hz, 1H), 4,85 (dd, J = 10,4, 4,0 Hz, 1 H), 5,05 (t, J = 9,7 Hz, 1 H), 5,25 (t, J = 9,3 Hz, 1 H), 5,35 (dd, J = 10,4, 9,7 Hz, 1H), 5,39 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 5,75 (s, NH), 6,66 (s, NH), 7,2815 7,34 (m, 2H), 7,3-7,43 (m, 2H), 7,60 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,77 (d, J = 7,5 Hz,
2H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,3 (CHs), 20,6-21,1 (7xCH3), 22,8 (CH2), 28,9-32,1 (11xCH2), 32,8 (CH2), 34,7 (CH2), 39,7 (CH2), 47,3 (CH),
54.5 (CH), 61,6 (CH2), 62,7 (CH2), 67,3 (CH2), 68,1 (CH), 68,6 (CH2), 68,7 (CH), 69,5 (CH), 70,2 (CH), 72,3 (CH), 72,6 (2xCH), 75,3 (CH), 95,7 (CH),
100,5 (CH), 120,2 (2xCH), 125,2 (2xCH), 127,2 (2xCH), 127,9 (2xCH), 141,5 (2xC), 143,9 (2xC), 156,0 (C), 169,6 (C), 170,0 (C), 170,1 (C), 170,3 (C),
170.5 (C), 170,7 (3xC) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1201 (100) [M+H]+ ; HRMS (ESI+) m/z calculée pour C6oH8sN202iS 1201.5360 [M+H]+, trouvée 1201.5359.
Composé 5.2c
Le composé 5.2c (solide incolore, 331 mg, 0,27 mmol, 31 %) a été obtenu à partir du composé 5.1c et du 2'-aminoéthyl-4-O-(2,3,4,6-tetra-Oacétyl-a-D-glucopyranosyl)-2,3,6-tri-O-acétyl-3-D-glucopyranoside (non décrit) en suivant le protocole général A.
Rf = 0,29 (Cyclohexane/AcOEt 5:5) ; Tf = 98-99°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,87 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,16-1,40 (m, 26H), 1,52-1.62 (m, 2H), 2,00, 2,00, 2,02, 2,02, 2,04, 2,09, 2,12 (s, 21 H), 2,49-2,59 (m, 2H), 2,77-2,97 (m, 2H), 3,34-3,45 (m, 1H), 3,47-3,58 (m, 1H), 3,62-3,73 (m, 2H), 3,77-3,85 (m, 1H), 3,91-3,99 (m, 2H), 4,04 (dd, J= 12,4, 2,2 Hz, 1H), 4,15 (dd, J= 12,1, 4,4 Hz, 1H), 4,20-4,28 (m, 3H), 4,35-4,47 (m, 2H), 4,53 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,54 (dd, J = 12,1, 2,5 Hz, 1H), 4,80 (dd, J = 9,3, 7,9 Hz, 1H), 4,85 (dd, J = 10,4, 4,0 Hz, 1 H), 5,05 (t, J = 9,6 Hz, 1 H), 5,24 (t, J = 9,3 Hz, 1 H), 5,35 (dd, J = 10,4, 9,6 Hz, 1H), 5,39 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 5,75 (s, NH), 6,66 (s, NH), 7,287,34 (m, 2H), 7,37-7,43 (m, 2H), 7,60 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,76 (d, J = 7,4 Hz, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,3 (CHs), 20,6-21,1 (7xCH3), 22,8 (CH2), 28,9-32,1 (13xCH2), 32,8 (CH2), 34,7 (CH2), 39,6 (CH2), 47,3 (CH), 54,6 (CH), 61,6 (CH2), 62,6 (CH2), 67,3 (CH2), 68,1 (CH), 68,6 (CH2), 68,7 (CH), 69,5 (CH), 70,2 (CH), 72,3 (CH), 72,6 (2xCH), 75,3 (CH), 95,7 (CH),
100.5 (CH), 120,2 (2xCH), 125,2 (2xCH), 127,2 (2xCH), 127,9 (2xCH), 141,5 (2xC), 143,9 (2xC), 156,0 (C), 169,6 (C), 170,0 (C), 170,1 (C), 170,3 (C),
170.5 (C), 170,7 (3xC) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1230 (100) [M+Na]+ ; HRMS (ESI+) m/z calculée pour C62Hs9N2O2iS 1229,5673 [M+H]+, trouvée 1229,5680.
Composé 5.2d
OAc
AcO
AcO
NHFmoc
OAc
Le composé 5.2d (solide incolore, 679 mg, 0,54 mmol, 63 %) a été obtenu à partir du composé 5.1d et du 2'-aminoéthyl-4-O-(2,3,4,6-tetra-O5 acétyl-a-D-glucopyranosyl)-2,3,6-tri-O-acétyl-3-D-glucopyranoside (non décrit) en suivant le protocole général A.
Rf = 0,29 (Cyclohexane/AcOEt 5:5) ; Tf = 100°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,17-1,40 (m, 30H), 1,52-1.63 (m, 2H), 2,00, 2,00, 2,02, 2,02, 2,04, 2,09, 2,13 (s, 21 H), 2,48-2,60 (m, 2H), 2,77-2,97 (m, 2H), 3,34-3,46 (m, 1H), 3,47-3,58 (m, 1H), 3,63-3,73 (m, 2H), 3,77-3,85 (m, 1H), 3,91-3,99 (m, 2H), 4,04 (dd, J= 12,4, 2,2 Hz, 1H), 4,16 (dd, J= 12,2,
4,4 Hz, 1H), 4,20-4,29 (m, 3H), 4,36-4,48 (m, 2H), 4,52 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,54 (dd, J = 12,2, 2,6 Hz, 1H), 4,80 (dd, J = 9,3, 7,8 Hz, 1H), 4,85 (dd, J = 10,5, 4,0 Hz, 1 H), 5,06 (t, J = 9,7 Hz, 1 H), 5,25 (t, J = 9,3 Hz, 1 H), 5,36 (dd, J = 10,5, 9,7 Hz, 1H), 5,39 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 5,75 (s, NH), 6,64 (s, NH), 7,297,34 (m, 2H), 7,40 (m, 2H), 7,60 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,77 (d, J = 7,5 Hz, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,3 (CHs), 20,5-21,1 (7xCH3), 22,8 (CH2), 28,9-32,1 (15xCH2), 32,8 (CH2), 34,7 (CH2), 39,6 (CH2), 47,3 (CH), 54,6 (CH), 61,6 (CH2), 62,7 (CH2), 67,3 (CH2), 68,1 (CH), 68,6 (CH2), 68,7 (CH), 69,5 (CH), 70,2 (CH), 72,3 (CH), 72,6 (2xCH), 75,3 (CH), 95,7 (CH),
100.5 (CH), 120,2 (2xCH), 125,2 (2xCH), 127,2 (2xCH), 127,9 (2xCH), 141,5 (2xC), 143,9 (2xC), 156,0 (C), 169,6 (C), 170,0 (C), 170,1 (C), 170,3 (C),
170.5 (C), 170,7 (3xC) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1258 (100) [M+H]+ ; HRMS (ESI+) m/z calculée pour C64H93N2O2iS 1257,5986 [M+H]+, trouvée
5 1257,5984.
Composé 5.3a
Le composé 5.3a (solide blanc, 50 mg, 0,06 mmol, 35 %) a été obtenu sous forme d’un mélange de diastéréoisomères à partir du composé 5.2a et de l’acide 5-éthoxy-2-(méthoxycarbonyl)-5-oxopentanoïque (non décrit) en suivant les protocoles généraux B, puis A, J et enfin F.
Tf = 96-98°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,21-1,44 (m, 18H), 1,53-1,63 (m, 2H), 1,70-1,82 (m, 1H), 1,84-1,98 (m, 1H), 2,08-2,22 (m, 2H), 2,34-2,43 (m, 2H), 2,52-2,60 (m, 2H), 2,70-2,89 (m,
1H), 2,90-3,07 (m, 1H), 3,22-3,31 (m, 2H), 3,33-3,43 (m, 2H), 3,46 (dd, J =
9,8, 3,8 Hz, 1H), 3,48-3,58 (m, 2H), 3,58-3,73 (m, 5H), 3,77-3,95 (m, 4H), 4,29-4,35 (m, 1H), 4,46-4,58 (m, 1H), 5,16 (d, J = 3,7 Hz, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (2xCH2), 24,7-25,6 (CH2), 29,8-30,8 (9xCH2), 32,1-32,3 (CH2), 33,0 (CH2), 33,0-33,2 (CH2), 34,3-34,8 (CH2), 40,615 40,8 (CH2), 52,0-52,5 (CH), 54,4-55,0 (CH), 62,0-62,2 (CH2), 62,7 (CH2),
69,1-69,4 (CH2), 71,4 (CH), 74,1 (CH), 74,6-74,7 (CH), 74,7 (CH), 75,0 (CH), 76,4-76,6 (CH), 77,5-77,7 (CH), 81,0-81,3 (CH), 102,8 (CH), 104,1-104,4 (CH), 171,3-171,6 (C), 172,6-172,8 (C), 172,9-173,2 (C), 176,3-176,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 384 (25) [M-CO2H]2-, 813 (100) [M-H]’ ; HRMS (ESI-)
0 m/z calculée pour C3sH6iN20i7S 813,3686 [M-Hp, trouvée 813,3651.
Le composé 5.3b (solide blanc, 52 mg, 0,06 mmol, 26 %) a été obtenu sous forme d’un mélange de diastéréoisomères à partir du composé 5.2b et de l’acide 5-éthoxy-2-(méthoxycarbonyl)-5-oxopentanoïque (non décrit) en suivant les protocoles généraux B, puis A, J et enfin F.
Tf > 130°C (décomposition) ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,21-1,44 (m, 22H), 1,53-1,63 (m, 2H), 1,72-1,83 (m, 1H),
1,82-2,00 (m, 1H), 2,07-2,23 (m, 2H), 2,35-2,45 (m, 2H), 2,52-2,61 (m, 2H),
2,70-2,90 (m, 1H), 2,90-3,07 (m, 1H), 3,22-3,30 (m, 2H), 3,33-3,43 (m, 2H),
3,43-3,48 (m, 1H), 3,48-3,58 (m, 2H), 3,58-3,73 (m, 5H), 3,77-3,95 (m, 4H),
4,29-4,35 (m, 1H), 4,46-4,58 (m, 1H), 5,16 (d, J = 3,7 Hz, 1H). RMN 13C (100 MHz, CDsOD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (2xCH2), 24,7-25,6 (CH2), 29,8-30,8 (11xCH2), 32,1-32,3 (CH2), 33,0 (CH2), 33,0-33,2 (CH2), 34,3-34,8 (CH2),
40,6-40,8 (CH2), 52,0-52,5 (CH), 54,4-55,0 (CH), 62,0-62,2 (CH2), 62,7 (CH2), 69,1-69,4 (CH2), 71,5 (CH), 74,1 (CH), 74,6 (CH), 74,7 (CH), 75,0 (CH), 76,4-76,6 (CH), 77,6-77,7 (CH), 81,0-81,1 (CH), 102,9 (CH), 104,2104,4 (CH), 171,0-171,7 (C), 172,6-172,8 (C), 172,9-173,2 (C), 176,3-176,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 841 (100) [M-Hp ; HRMS (ESI-) m/z calculée pour
C37H65N2Oi7S 841,4004 [M-Hp, trouvée 841,4025.
Composé 5.3c
Le composé 5.3c (solide blanc, 82 mg, 0,09 mmol, 41 %) a été obtenu 2 5 sous forme d’un mélange de diastéréoisomères à partir du composé 5.2c et de l’acide 5-éthoxy-2-(méthoxycarbonyl)-5-oxopentanoïque (non décrit) en suivant les protocoles généraux B, puis A, J et enfin F.
Tf > 145°C (décomposition) ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t,
J = 6,8 Hz, 3H), 1,21-1,44 (m, 26H), 1,53-1,63 (m, 2H), 1,72-1,82 (m, 1H),
100
1,82-2,00 (m, 1H), 2,08-2,23 (m, 2H), 2,32-2,45 (m, 2H), 2,52-2,61 (m, 2H), 2,70-2,90 (m, 1H), 2,90-3,07 (m, 1H), 3,22-3,31 (m, 2H), 3,33-3,43 (m, 2H), 3,46 (dd, J = 9,7, 3,7 Hz, 1H), 3,48-3,58 (m, 2H), 3,58-3,74 (m, 5H), 3,783,95 (m, 4H), 4,30-4,35 (m, 1H), 4,46-4,57 (m, 1H), 5,16 (d, J = 3,7 Hz, 1H).
RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,5 (CH3), 23,7 (2xCH2), 24,7-25,6 (CH2), 29,8-30,9 (13xCH2), 32,1-32,3 (CH2), 33,0 (CH2), 33,0-33,2 (CH2),
34,2-34,7 (CH2), 40,6-40,9 (CH2), 52,0-52,5 (CH), 54,3-54,9 (CH), 61,9-62,1 (CH2), 62,7 (CH2), 69,0-69,4 (CH2), 71,4 (CH), 74,1 (CH), 74,6 (CH), 74,7 (CH), 75,0 (CH), 76,4-76,5 (CH), 77,6 (CH), 81,0-81,2 (CH), 102,8 (CH),
104,1-104,3 (CH), 171,0-171,7 (C), 172,6-172,8 (C), 172,9-173,2 (C), 176,3176,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 412 (25) [M-CO2H]2-, 869 (100) [M-Hp ; HRMS (ESI-) m/z calculée pour C39H69N2Oi7S 869,4317 [M-Hp, trouvée 869,4340.
Composé 5.3d
0 Le composé 5.3d (solide blanc, 81 mg, 0,09 mmol, 30 %) a été obtenu sous forme d’un mélange de diastéréoisomères à partir du composé 5.2d et de l’acide 5-éthoxy-2-(méthoxycarbonyl)-5-oxopentanoïque (non décrit) en suivant les protocoles généraux B, puis A, J et enfin F.
Tf > 155 °C (décomposition) ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,21-1,43 (m, 30H), 1,53-1,63 (m, 2H), 1,71-1,82 (m, 1H),
1,86-1,98 (m, 1H), 2,07-2,22 (m, 2H), 2,32-2,43 (m, 2H), 2,52-2,60 (m, 2H), 2,69-2,90 (m, 1H), 2,90-3,07 (m, 1H), 3,22-3,30 (m, 2H), 3,33-3,43 (m, 2H), 3,45 (dd, J = 9,7, 3,7 Hz, 1H), 3,48-3,58 (m, 2H), 3,58-3,74 (m, 5H), 3,773,95 (m, 4H), 4,29-4,35 (m, 1H), 4,46-4,57 (m, 1H), 5,17 (d, J = 3,5 Hz, 1H).
101
RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,5 (CH3), 23,7 (2xCH2), 24,7-25,6 (CH2), 29,8-30,9 (15xCH2), 32,1-32,3 (CH2), 33,0 (CH2), 33,0-33,2 (CH2),
34.3- 34,7 (CH2), 40,6-40,9 (CH2), 52,0-52,5 (CH), 54,4-54,9 (CH), 61,9-62,2 (CH2), 62,7 (CH2), 69,0-69,4 (CH2), 71,5 (CH), 74,1 (CH), 74,6 (CH), 74,7 (CH), 75,0 (CH), 76,4-76,6 (CH), 77,6 (CH), 81,0-81,2 (CH), 102,7-102,9 (CH), 104,1-104,4 (CH), 171,1-171,7 (C), 172,6-172,8 (C), 172,9-173,2 (C),
176.3- 176,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 426 (40) [M-CO2H]2-, 898 (100) [M-Hp ; HRMS (ESI-) m/z calculée pour C4iH73N20i7S 897,4630 [M-Hp, trouvée 897,4646.
Exemple 7: Tests d’absorbance à 280 nm des molécules de l’invention
Les molécules de l’invention ont été testées et comparées en utilisant BmrA et AcrB, 2 protéines membranaires polytopiques bactériennes. BmrA est caractérisée par une topologie fonctionnelle sensible à l’extraction avec des détergents. BmrA est une protéine membranaire polytopique organisée en 3 domaines, cytosolique, membranaire et extracellulaire (Figure 1).
Le domaine cytosolique est formé de 2 parties appelées nucleotidebinding domains, NBD, qui lorsqu’elles sont réunies lient puis hydrolysent ΙΆΤΡ. Le domaine membranaire est lui aussi formé de 2 parties appelées trans-membrane domains, TMD, chacune connectée à un NBD. Les TMDs adoptent différentes conformations orientées vers l’intérieur ou l’extérieur de la cellule en fonction du cycle catalytique. Cela permet à BmrA de capter des substrats (S dans la Figure 1) présents dans l’espace intracellulaire (ou dans la membrane plasmique) et les évacuer à l’extérieur. Ce type de pompe d’efflux est ubiquitaire. Elles appartiennent à la famille des transporteurs ABC que les cellules surexpriment en cas de stress chimiques occasionnés par les traitements antibiotiques, anticancéreux, antifongiques ou antiviraux. Ce transport est effectué par l’intermédiaire d’un changement de conformation qui change l’orientation interne ou externe des sites de liaison des drogues situés dans la région membranaire de la protéine (Figure 1). Après transport,
102 la protéine reprend sa conformation initiale en utilisant l’énergie provenant de l’hydrolyse d’ATP (Ward, A. B. et al. Structures of P-glycoprotein reveal its conformational flexibility and an epitope on the nucleotide-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110, 13386-13391 (2013) ([19]); Martinez, L. et al. Understanding polyspecificity within the substrate-binding cavity of the human multidrug résistance P-glycoprotein. FEBS Journal 281, 673-682 (2014) ([20])). L’hydrolyse d’ATP n’est possible qu’avec une protéine fonctionnelle dont la topologie, notamment au niveau de la région membranaire, est native. L’extraction par des détergents est en général délétère, par exemple avec le dodecyl maltoside (Matar-Merheb, R. et al. ([11])).
Certains tests ont aussi été réalisés avec la protéine AcrB, un trimère procaryotique de 3x100 kDa enchâssé dans la membrane interne des bactéries Gram- dont la structure 3D a été résolue (Seeger, M. A. et al. Structural asymmetry of AcrB trimer suggests a peristaltic pump mechanism. Science 313, 1295-1298 (2006) ([21])).
Mode opératoire. Les molécules de l’invention ainsi que le C4C7 (Matar-Merheb, R. et al. ([11])) (fourni par la société CALIXAR) ont été préparés aux concentrations indiquées dans la Figure 2, dans 50 mM TrisHCI, pH 8.0 et neutralisés à ce pH. Leur spectre d’absorption a été enregistré comme indiqué à l’aide d’un spectrophotomètre Xenius SAFAS.
Résultats. Le concept des clips est dérivé de celui des calix[4]arènes aliphatiques, C4Cn, développé dans le document WO2009144419 ([28]) et le document Matar-Merheb, R. et al. ([11]). Malgré leur intérêt, démontré dans leur capacité à stabiliser les protéines membranaires, ces détergents absorbent fortement dans les basses longueurs d’onde, notamment de 220 à 330 nm. Ceci est illustré avec le C4C7 dans le 1er panneau de la Figure 2. Leur coefficient d’absorption molaire à 280 nm est très élevé, 15 000 mol/L/cm. Tous les détergents C4Cn étant bâtis sur le même support calix[4]arénique, ils présentent tous cette caractéristique. Dès lors, ils écrantent l’absorption des protéines que l’on détecte aussi à 280 nm et
103 empêchent donc de les suivre ou de les quantifier par ce moyen très communément utilisé en biochimie, notamment dans un protocole de purification.
En revanche, les molécules de la présente invention n’absorbent pas, ou de façon négligeable, de 220 à 500 nm (et au-delà), comme mis en évidence à la Figure 2. Ils n’empêchent donc pas la détection des protéines à 280 nm.
Exemple 8 : Test de chélation des métaux divalents par les molécules de l’invention
La structure calix[4]arénique associée à 3 fonctions acide fait que les détergents correspondants chélatent très efficacement les métaux divalents. Le nouveau design des molécules de l’invention supprime cet effet.
Mode opératoire. Les molécules de l’invention ainsi que le C4C12 (Matar-Merheb, R. et al. ([11])) ont été préparés aux concentrations indiquées dans la Figure 3, dans 50 mM Tris-HCI, pH 8.0 et neutralisées à ce pH. Une solution concentrée de MgCI2 a été ensuite ajoutée jusqu’à 0, 5 et 10 mM. La turbidité de la solution résultante a été enregistrée à 600 nm.
Résultats. La capacité de chélation des cations divalents des détergents calix[4]aréniques précédemment développés est illustrée dans la Figure 3 cidessous. Elle montre que l’addition de concentration croissante de MgCI2 en présence de C4C12 entraîne une augmentation de la turbidité de la solution qui traduit une précipitation du complexe C4C12-magnésium. La précipitation est complète dès 5 mM de MgCI2. Cette interaction peut être un inconvénient pour les réactions enzymatiques qui requièrent la présence de métaux, calcium, magnésium, comme par exemple la mesure de l’activité ATPasique des ATPases telles que BmrA qui nécessite plus de 7 mM de MgCI2. Les molécules de la présente invention, malgré le fait qu’elles possèdent de 2 à 4 fonctions carboxyliques, surmontent ce problème technique. En effet, comme illustré dans la Figure 3, testées dans les mêmes conditions que le C4C12,
104 elles ne forment pas un complexe insoluble avec le magnésium quand celuici est ajouté, même jusqu’à 10 mM.
Cette absence d’interaction avec des métaux est aussi très utile lors des étapes de chromatographie de type affinité-métal, qui utilisent du Nickel ou du Cobalt, et qui ne peuvent être mises en oeuvre avec des fortes concentrations de C4Cn, contrairement aux molécules de l’invention.
Exemple 9 : Mesure de la concentration micellaire critique (CMC) des molécules de l’invention.
Mode opératoire. Les molécules de l’invention ont été préparées dans une gamme de concentrations allant de 0.1 pM à 10 mM dans 50 mM TrisHCI, pH 8.0 et neutralisées à ce pH. A 80 pL de chaque solution (triplicat) est ajouté le même volume de 10 pM 1,6-diphényl-1,3,5-hexatriene (DPH, Sigma, D208000), préparé à 100 pM dans du tétrahydrofurane puis dilué 10x dans H2O. L’augmentation de la fluorescence du DPH survient quand celui-ci trouve des micelles de clips dans lesquelles s’insérer (Chattopadhyay, A. & London, E. Fluorimetric détermination of critical micelle concentration avoiding interférence from detergent charge. Anal Biochem 139, 408-412 (1984) ([22])). La lecture de la fluorescence est réalisée avec un fluorimètre Xenius SAFAS en excitant à 358 nm et en enregistrant l’émission de fluorescence à 430 nm, avec des fentes de 9 à 10 nm pour l’excitation et l’émission et un gain de 100 à 150, selon les cas.
Résultats. La CMC des détergents est la concentration à partir de laquelle ils s’associent pour former des micelles, dans lesquelles, en solution aqueuse, les parties hydrophobes sont regroupées au centre et les régions hydrophiles exposées au solvant. Cette CMC a été mesurée ici en suivant l’augmentation de fluorescence d’un composé, le DPH, dont la fluorescence augmente significativement lorsqu’il s’insère dans les micelles (Chattopadhyay, A. & London, E. ([22])). Un résultat typique obtenu avec un composé 3.7 doté d’une chaîne aliphatique en C13 (3.7e) ou en C18 (3.7h)
105 est illustré dans la Figure 4. Le tableau 1 qui suit résume les valeurs obtenues pour les molécules de l’invention.
Tableau 1
| Clip | (CH2)n | CMC, mM | 0, nm | Clip | (CH2)n | CMC, mM | 0, nm | |
| 1.5 | C11 | 2.5 | 3.7g | C13 | 1 | - | ||
| 2.3a | C13 | 2 | 3.7h | C18 | 0.01 | 3-4 | ||
| 2.3b | C7 | 5 | - | 3.7Î | C(C5)2 | 1 | - | |
| 2.3c | C8 | 3.5 | - | 3.7j | C(C12)2 | 0.02 | 60 | |
| 2.3d | C9 | 2 | - | 3.7k | C4Hex | 1 | - | |
| 2.3e | C11 | 1 | - | 3.7I | C13 | 1 | - | |
| 2.3f | C12 | 0.8 | - | 3.9a | (C13)2 | 0.01 | 3 | |
| 2.3g Na2 | C13 | 1 | - | 4.5a | C9 | 3 | - | |
| 2.3g K2 | C13 | 1 | - | 4.5b | C11 | 2 | - | |
| 2.3h | C15 | 0.5 | - | 4.5c | C13 | 1.5 | - | |
| 3.6a | C9 | 3 | - | 4.5d | C15 | 1 | - | |
| 3.6b | C11 | 2 | - | 4.6a | C9 | 1 | - | |
| 3.6c | C13 | 1 | - | 4.6b | C11 | 1 | - | |
| 3.7a | C9 | 2 | - | 4.6c | C13 | 1 | - | |
| 3.7b | C11 | 1.5 | - | 4.6d | C15 | 1 | - | |
| 3.7c | C13 | 1 | 3.8 | 5.3a | C12 | 0.1 | - | |
| 3.7d | C18 | 0.02 | 5.5 | 5.3b | C14 | 0.05 | - | |
| 3.7e | C13 | 2 | 3.5 | 5.3c | C16 | 0.01 | - | |
| 3.7f | C18 | 0.02 | 4.0 | 5.3d | C18 | 0.005 | - |
On observe, classiquement, que la CMC diminue avec la longueur de la chaîne aliphatique pour les composés 2.3b-g, 3.6a-c et 3.7a-d. C’est moins vrai pour les composés de la série 4 dont la CMC est élevée et varie peu (#4.5-4.6), suggérant que leur tête polaire contribue trop à l’hydrophilicité de l’ensemble. Ces composés portent en effet 3 à 4 fonctions carboxyliques. Compte tenu de la grande taille des têtes polaires, ces CMC sont relativement élevées. Ainsi, l’utilisateur pourra faire varier la longueur de la chaîne en fonction du but recherché, par exemple éliminer facilement par dialyse ou ultrafiltration un détergent à CMC élevée ou bien conserver celui-ci en utilisant des composés à CMC plus faible.
106
Exemple 10 : Diamètre des molécules de l’invention
Un autre paramètre physico-chimique des micelles de détergents est leur diamètre, assumant que celles-ci sont sphériques. Cette grandeur est obtenue par la technique de diffusion de la lumière (DLS).
Mode opératoire. Les molécules de l’invention testées ont été préparées dans une gamme de concentrations allant de 0.1 à 1000 xCMC dans 30 mM Tris-HCI, pH 8.0 et neutralisées à ce pH. Les solutions sont filtrées sur 0,22 pm. La mesure est faite sur 100 pL, en triplicat sur un Zetasizer Nano-S de Malvern Instruments.
Résultats. Les diamètres estimés des clips testés sont, à l’exception du composé 3.7j, de l’ordre de 3 à 5 nm, soit des objets de taille relativement petite pour des détergents. Les micelles ont donc des tailles réduites, indépendamment de leur CMC, qui varie pour les composés testés, de 20 pM à 2 mM. Le composé 3.7j est une exception, formant des objets de très grande taille, de l’ordre de 60 nm. Il est probable qu’il se comporte comme les lauryl maltosides néopentyl glycols (Chae, P. S. et al. ([6]) ; Chaptal, V. et al. Quantification of détergents complexed with membrane proteins. Scientific Reports in press (2017) ([23])). Des résultats sont illutrés en Figure 5.
Exemple 11 : Extraction de BmrA et AcrB avec les molécules de l’invention.
La capacité d’extraction des détergents de la série est testée sur des membranes dans lesquelles BmrA ou AcrB sont fortement exprimées. L’extraction avec les clips (molécules de l’invention) est comparée à celle obtenue avec des détergents du commerce, utilisés comme référence.
Mode opératoire. BmrA représente 25% des protéines présentes dans le système de surexpression utilisé (E. co//, C41DE3). Ces membranes sont préparées comme décrit précédemment (Matar-Merheb, R. et al. ([11])). Les membranes contenant AcrB (environ 20% des protéines membranaires, même système d’expression que BmrA) ont été préparées comme décrit précédemment (Seeger, M. A. et al. ([21])). Les détergents sont utilisés à 10
107 g/L sauf indication différente et les protéines diluées à 2 g/L dans un tampon 20 mM Tris-HCI, pH 8.0, 100 mM NaCl, 15 % glycérol, additionné d’antiprotéases (Roche) à raison d’une tablette/100 mL. L’ensemble (T) est incubé 2 h à 4°C puis centrifugé 1 h à 4°C à 100 000xg pour séparer la fraction extraite (surnageant, S) de celle qui ne l’est pas (culot). Les surnageants sont déposés sur SDSPAGE de 10 %, colorés après migration au bleu de Coomassie. La foscholine 12, le DDM et le LMNG proviennent de chez Anatrace, le SDS et le Triton X100 proviennent de chez Sigma-Aldrich.
Résultats. En absence de détergent, BmrA et AcrB sédimentent 10 lorsqu’ils sont centrifugés à haute vitesse (puits « T- » vs « S- ») ; une petite fraction résiste néanmoins à ce traitement et demeure en suspension, elle correspond à l’essai négatif (puits « S- »). En présence de SDS ou FC12, les détergents de référence utilisés pour extraire toutes les protéines membranaires, BmrA et AcrB sont efficacement extraites et se retrouvent dans les surnageants correspondants, « SDS » ou « FC12 », utilisé ici comme témoin positif d’extraction. DDM, TX100 et FC12, utilisés ici comme références commerciales, permettent de solubiliser les 2 protéines (Figure 6). Parmi les molécules de l’invention, certaines extraient les 2 protéines, d’autres partiellement et enfin d’autres pas du tout comme résumé dans le
0 Tableau 2. Pour BmrA, les composés extractants sont 1.4, 2.3[a, d, f, g, h, i], 3.6c, 3.7[c, f, g, h, I], 4.5[d], 4.6d, 5.3[a-d], Dans le groupe des partiellement extractants on trouve 1.5, 3.6b, 3.7[d, j], 4.5[b, c], et dans celui des nonextractants 2.3[b, c], 3.6a, 3.7[a, b, e, i, k], 3.9a, 4.5a et 4.6a. Pour AcrB, les composés extractants sont 1.5, 2.3[a, b, c, d, e, f, g, h, i], 3.6[a, b], 3.7[c, d, e,
5 f, h, j, I], 4.5[b, c, d], 4.6[c, d] ceux qui extraient partiellement, 3.6c, 4.5a, 4.6d, et ceux qui n’extraient pas, 3.7[a, b, i, k] et 4.6a.
Tableau 2
| # | BmrA | AcrB | # | BmrA | AcrB | # | BmrA | AcrB | ||
| 1.4 | +++ | +++ | 3.6c | +++ | + | 3.9a | - | +++ | ||
| 1.5 | + | +++ | 3.7a | - | - | 4.5a | - | + |
108
| 2.3a | +++ | ++ | 3.7b | ++ | - | 4.5b | ++ | ++ | ||
| 2.3b | - | ++ | 3.7c | +++ | +++ | 4.5c | ++ | +++ | ||
| 2.3c | - | ++ | 3.7d | ++ | +++ | 4.5d | +++ | +++ | ||
| 2.3d | +++ | ++ | 3.7e | + | ++ | 4.6a | - | - | ||
| 2.3e | +++ | +++ | 3.7f | +++ | +++ | 4.6b | +++ | + | ||
| 2.3f | +++ | +++ | 3.7g | +++ | / | 4.6c | +++ | +++ | ||
| 2.3g | +++ | +++ | 3.7h | +++ | +++ | 4.6d | +++ | + | ||
| 2.3h | +++ | +++ | 3.7i | - | - | 5.3a | +++ | / | ||
| 2.3i | +++ | +++ | 3.7j | ++ | +++ | 5.3b | +++ | / | ||
| 3.6a | - | ++ | 3.7k | - | - | 5.3c | +++ | / | ||
| 3.6b | ++ | +++ | 3.7I | +++ | +++ | 5.3d | +++ | / |
Extraction sélective. AcrB est un contaminant de cristallisation bien connu dans le domaine des protéines membranaires. Co-purifié, il cristallise à l’état de trace conduisant à de nombreux artéfacts (Psakis, G., Polaczek, J. & Essen, L.-O. AcrB et al.: Obstinate contaminants in a picogram scale. One more bottleneck in the membrane protein structure pipeline. Journal of Structural Biology 166, 107-111 (2009) ([24])). Développer un détergent qui limite cette contamination en extrayant pas ou peu cette protéine est donc d’une grande aide, d’autant plus que les détergents disponibles sur le marché ne sont pas sélectifs. Dans ce contexte, les composés 3.6c, 4.6b et 4.6d sont remarquables par leur capacité à ne pas ou peu extraire AcrB contrairement à BmrA. A l’inverse, les composés 1.5 et 3.9a extraient plus efficacement AcrB.
Exemple 12 : Stabilisation fonctionnelle des protéines membranaires après extraction avec des détergents
Les molécules de l’invention qui extraient BmrA dans l’exemple précédent ont été testées à différentes concentrations sub-solubilisantes et
0 solubilisantes, pour évaluer leur impact sur l’état natif et fonctionnel de la protéine. Ce dernier est monitoré par l’hydrolyse d’ATP que la protéine effectue au cours du cycle de transport, couplé à la translocation de soluté.
Comme reporté précédemment (Matar-Merheb, R. et al. ([11])), l’activité
109
ATPasique de BmrA est un marqueur très sensible de l’état de la protéine, cette dernière étant particulièrement sensible aux détergents utilisés lors de l’étape d’extraction où ceux-ci remplacent les lipides au contact de la protéine membranaire.
Mode opératoire. BmrA produit et enrichi dans la membrane plasmique de E. coli C41DE3 est préparé comme décrit précédemment (Matar-Merheb, R. et al. ([11])). Les membranes sont diluées à 2 g/L dans un tampon 20 mM Tris-HCI, pH 8.0, 100 mM NaCI, 15 % glycérol, additionné d’antiprotéases (Roche) à raison d’une tablette/100 mL. Les détergents sont ajoutés aux concentrations indiquées dans la Figure 7. L’ensemble (T) est incubé 2 h à 4°C et l’activité ATPasique est mesurée à l’aide du système d’enzymes couplées, en retranchant l’activité Vanadate-insensible de l’activité totale Centeno, F. et al. Expression of the sarcoplasmic réticulum Ca2+-ATPase in yeast. FEBS Lett 354, 117-122 (1994) ([25])). Les solutions sont ensuite centrifugées 1 h à 4°C à 100 000xg pour séparer la fraction extraite (surnageant, S) de celle qui ne l’est pas (culot). Les surnageants sont déposés sur SDSPAGE de 10%, colorés après migration au bleu de Coomassie (Figure 8). Le DDM, LMNG (Chae, P. S. et al. ([6])), TritonXIOO et FA3 (Lee, S. C. et al. (2013) ([9])) sont testés comme détergents de référence. Le DDM et le LMNG proviennent de chez Anatrace, le Triton X100 provient de chez Sigma-Aldrich et le FA3 de chez Avanti-Polars.
Résultats. Comme illustré dans la Figure 7, l’addition de détergent, à une concentration sub-solubilisante ou solubilisante induit des changements de structure de BmrA qui impactent sa fonctionnalité. Ainsi, parmi les détergents de référence, le LMNG, récemment développé avec succès pour résoudre la structure d’un récepteur à G-protéine (Rasmussen, S. G. et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature 477, 549-555 (2011) ([26])), impacte peu l’activité de BmrA jusqu’à 1 mM mais la réduit à 25% à 10 mM, une concentration nécessaire pour solubiliser la protéine. Le DDM, très largement utilisé dans le domaine, induit les mêmes effets, diminuant l’activité ATPasique de BmrA de 50 à 15% aux
110 concentrations qui permettent son extraction, au-delà de 5 mM. Le FA3, correspondant à 1 dimaltoside couplé à un stéroïde, récemment développé (Lee, S. C. et al. (2013) ([9])), produit le même effet en inactivant 75% et 80% de l’activité ATPasqiue de BmrA aux concentrations qui extraient la protéine.
Les composés les plus efficaces sont regroupés dans la série 3.7, dont les meilleurs sont 3.7[b,c,e,g,j,l], Ceux-ci extraient BmrA tout en préservant (3.7j,I), ou en augmentant 1,5x (3.7b,c,g) ou 2x (3 ,7e) l’activité ATPasique de la protéine. A noter que cette augmentation d’activité est une caractéristique des transporteurs ABC, dont l’activité basale peut être multipliée jusqu’à 2,5 fois en présence de solutés ; elle témoigne d’un parfait état fonctionnel. Les composés 3.7b et 3.7c partagent le même design, incluant un ose couplé à la molécule via un triazole, 2 fonctions carboxyliques et une chaîne aliphatique en C11 et C13. Les composés 3.7e et 3.7g sont une variante de 3.7c avec soit un maltoside soit une chaîne péguylée à la place de l’oside.
Exemple 13 : Etude de la stabilité dans le temps des protéines membranaires en présence des composés de l’invention
Deux des meilleurs composés de l’invention issus du test précédent, 3.7c et 3.7g, ont été évalués pour leur capacité à stabiliser une forme active de BmrA sur une très longue période de temps, après purification et stockage à 4°C. Ces 2 détergents ont été comparés au DDM, très largement utilisé pour ces étapes de purification, ainsi que le FA3 récemment développé et très prometteur sur le plan de la stabilité fonctionnelle (Lee, S. C. et al. (2013) ([9])). Pour permettre leur comparaison, les détergents ont été ajoutés à une solution de BmrA purifiée en DDM, stockée ensuite à 4°C pendant 40 jours. L’activité ATPasique de BmrA a été mesurée au cours du temps comme illustré dans la Figure 9.
Mode opératoire. BmrA produit et enrichi dans la membrane plasmique de E. coli C41DE3 est préparé comme décrit précédemment (Matar-Merheb,
R. et al. ([11])). Vingt milligrammes de cette fraction membranaire sont dilués à 4°C à 1 g/L dans 100 mM NaPi pH 8.0, 15 % glycérol, 100 mM NaCI, 10
111 mM imidazole, 1 mM DTT. La suspension est additionnée d’antiprotéases (Roche, 1 tablette/50 mL) et benzonase (Sigma, 30 U/mL)/ Les protéines membranaires sont ensuite extraites en ajoutant 1% DDM (20 mM), pendant 1h à 4°C. La solution est centrifugée 1 h à 100 OOOxg, 4°C (Optima XPN-80, 50.2TÎ). Le surnageant est chargé à 2 mL/min sur une résine Ni-NTA de 5 mL (GE healthcare, HiTrap chelating HP) équilibrée en tampon A, 100 mM NaPi pH 8.0, 10% glycérol, 100 mM NaCl, 10 mM imidazole, 0.05 % DDM (1 mM, 5xCMC). La résine est lavée une 1ère fois avec 25 mL de tampon A, puis une 2ème fois avec 25 mL de tampon B (= A avec 500 mM NaCl et 15 mM imidazole) et enfin une 3ème fois avec 20 mL de tampon A. BmrA est éluée avec un gradient de tampon A et tampon C (100 mM NaPi, 10% glycérol, 100 mM NaCl, 250 mM imidazole, 0.05% DDM (1 mM, 5xCMC)) étalé sur 10 mL et collecté par fraction de 1 mL à 3 mL/min. Les fractions du pic sont réunies (3 mL) et l’ensemble est dialysé dans un boudin de cut-off 12-14000 daltons contre 400 mL de tampon D froid (50 mM Hepes-HCI, pH 8.0), 10 % glycérol, 100 mM NaCl, 0.05% DDM (1 mM, 5xCMC) pendant 2 h 30 min à 4°C, puis contre 600 mL dans les mêmes conditions pendant 1 nuit. Le contenu protéique (0.8 g/L) du dialysat est quantifié par dosage avec l’acide bicinchoninique Smith, P. K. et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry 150, 76-85 (1985) ([27])). La solution est séparée en 4 fractions diluées à 0.2 g/L de protéines avec du tampon A sans imidazole et DDM. La [DDM] finale est de 0.25 mM. Chaque aliquot est additionné de 0.087 mM de DDM, FA3, 3.7c ou 3.7g et stocké à 4°C pendant 40 jours. L’activité ATPasique Vanadate-sensible Centeno, F. et al. ([25])) est mesurée aux temps indiqués dans la Figure 9 en duplicat.
Résultats. Comme le montre la Figure 9, BmrA une fois purifiée et en présence de faible concentration de détergent est stable pendant au moins 20 jours à 4°C. Au-delà, elle perd en activité quand elle est seulement en présence de DDM ou additionnée de FA3. Ces 2 détergents n’ont donc pas la capacité de stabiliser à long terme une protéine membranaire comme BmrA. En revanche, l’addition de 3.7c ou 3.7g dans des conditions identiques
112 permet d’aller au-delà de ces 20 jours, stabilisant BmrA au moins 2 fois plus longtemps, 40 jours. Ces 2 composés démontrent donc une propriété remarquable de stabilisation à long terme, la meilleure reportée à ce jour pour une protéine membranaire.
113
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117
Claims (13)
- REVENDICATIONS1. Composé de formule (I)10 dans laquelle :O)OR1X représente -OH, -O(CH2)2SR1, /N -och2—(' i n'-n-S(CH2)nCH3,H 9N—|— (CH2)PCO2R2CO2R2 ,-co2r2 ou —OCH 'U,M-N / M—N'Y HH 9HC-(CH2)nCH3 —C—(CH2)PCO2R2Y représente -(CH2)nCH3, (CH2)mCH3 co,r2 , -(CH2)2OR1 ouH 9 —C—(CH2)pCO2R2CONHCH2CO2R2H —N-(CH2)nCH3Z représente -NHCO(CH2)nCH3, —Γ ' h (CH2)mCH3 —N—U—(CH2)nCy —N—(CH2)pCO2R2 —N—u—|—CO2R2 —N—(CH2)pCO2R2 (CH2)qCO2R2 Q|J (CH2)pCO2R2 et dans laquelle :118 R1 représente un monosaccharide, un disaccharide ou le polyéthylène glycoi ;R2 représente H, Na ou K ;m est un nombre entier allant de 4 à 21 ;n est un nombre entier allant de 4 à 21 ;p est un nombre entier allant de 1 à 3 ;q est un nombre entier allant de 1 à 5 ;r est un nombre entier allant de 1 à 10 ;Cy représente le cyclohexyle ;ou l’un de ses sels pharmaceutiquement acceptables.
- 2. Composé selon la revendication 1, dans lequel :.OR1 n —OCH X représente -O(CH2)2SR1 ,OU co2r·H — C—(CH2)pCO2R· Y représente C°2R‘H 9-C-(CH2)pCO2R2 ou CONHCH2CO2R2 j—(CH2)nCH3 Z représente-NHCO(CH2)nCH3 ou (CH2)mCH3 R1 représente un monosaccharide, un disaccharide ou le polyéthylène glycoi ;R2 représente H, Na ou K ;m est un nombre entier allant de 4 à 21 n est un nombre entier allant de 4 à 21 ;p est un nombre entier allant de 1 à 3 ;ou l’un de ses sels pharmaceutiquement acceptables.
- 3. Composé selon la revendication 2, choisi parmi :119COOHOOHNH (CH2)12CH3OHO (CH2)i2CH3HN. .COOH ' COOHOHN'H coohCOOH (CH2)i2CH3120
- 4. Composé selon la revendication 1, dans lequel :X représente -S(CH2)nCH3 ; Y représente -(Chh^OR1 ;o H II 9 —N—u—p CO2R2 Z représente (ch2)pco2r2 .R1 représente un monosaccharide, un disaccharide ou le polyéthylène glycol ;R2 représente H, Na ou K ;n est un nombre entier allant de 4 à 21 ;p est un nombre entier allant de 1 à 3 ;ou l’un de ses sels pharmaceutiquement acceptables.
- 5. Composé selon la revendication 2, ledit composé étant le composé de formule :121
- 6. Procédé d’extraction de protéines membranaires associées à une membrane biologique, comprenant une étape de mise en contact d’une solution aqueuse de protéines membranaires associées à la membrane biologique avec au moins un composé de formule (I) tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 5.
- 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel la protéine membranaire est présente dans une fraction membranaire biologique issue d’organisme procaryotique ou eucaryotique, sain ou altéré.
- 8. Procédé selon l’une quelconque des revendications 6 ou 7, dans lequel la protéine membranaire est une protéine de transport.
- 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel la protéine de transport est un transporteur ABC, choisi dans le groupe comprenant la glycoprotéines P (Pgp/ABCB1), MRP1/ABCC1, MRP2/ABCC2, BCRP/ABCG2 et BmrA.
- 10. Procédé selon l’une quelconque des revendications 6 à 9, dans lequel l’étape de mise en contact d’une solution aqueuse comprenant la protéine membranaire à extraire avec au moins un composé de formule (I) est réalisée à un pH allant de 5.5 à 10.
- 11. Procédé de stabilisation de protéines membranaires en solution dans une solution aqueuse, comprenant une étape (i) consistant à mettre en contact une solution aqueuse d’une protéine membranaire en solution avec au moins un composé de formule (I) tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 3.
- 12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel les protéines membranaires sont mises en solution au moyen d’une étape d’extraction telle122 que définie dans l’une quelconque des revendications 6 à 10, ou au moyen d’une étape d’extraction par un autre détergent.
- 13. Procédé selon l’une quelconque des revendications 11 ou 12, dans lequel 5 ladite protéine en solution est stabilisée à une température comprise de 0°C à 10°C pendant une durée de temps supérieure à 1 jour.1/10
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