JP2020510026A - 膜タンパク質の抽出及び溶液中での安定化のための表面活性剤化合物−クリップ - Google Patents

膜タンパク質の抽出及び溶液中での安定化のための表面活性剤化合物−クリップ Download PDF

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Abstract

本発明は式(I)の化合物に関する。(I)は本明細書に規定した通りである。本発明は、生体膜に結合している膜タンパク質の水溶液を少なくとも1つの本発明の化合物と接触させる工程を含む、生体膜に結合している膜タンパク質を抽出する方法にも関する。本発明は、溶液中の膜タンパク質の水溶液を少なくとも1つの本発明の化合物と接触させることからなる工程(i)を含む、水溶液中で溶液中の膜タンパク質を安定化する方法にも関する。

Description

(発明の詳細な説明)
本発明は、表面活性剤化合物、並びに抽出、及び水溶液中の抽出された膜タンパク質の溶液中での安定化のためのその使用に関する。
本発明は、生化学の分野において、また医療分野において、特に構造ベースの薬物設計の分野において産業上利用可能である。
以下明細書では、角括弧([])内の参照番号は、本テキストの末尾にある参照文献リストに対応する。
膜タンパク質(MP)の構造は、これらを取り巻く脂質膜の外では不安定である。これは、抽出後に膜タンパク質を精製し、結晶化し、又は抗原として使用するために、界面活性剤を使用して膜から膜タンパク質を抽出する場合である。しかし、この構造が実際に、この元の膜内でMPが取っていた構造であることと、この構造が、界面活性剤を使用して行う抽出プロセスにより多少とも変化しないことが肝要である。
MPを抽出するために、100種を超える界面活性剤が市場に提案されている。界面活性剤は、その中にMPが埋め込まれている脂質に対する優れた競合物質であり、高い有効性でこのMPを抽出する。これは一つには、界面活性剤は、脂質と異なり、非常に急速に媒体と交換されることによる(Israelachvili, J.N.、Mitchell, D.J. & Ninham, B.W. Theory of self-assembly of lipid bilayers and vesicles. Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Biomembranes 470、185-201頁(1977)([1]))。しかし、この高い交換能はMPの膜ドメインの不安定化を招き、脂質との場合と比べ維持されにくいため、MPは経時的に破壊される傾向がある。したがって、MPの疎水性領域が一時的に露出され、水性媒体から互いに保護するために集合するために、MPの凝集が観察される。
薬物設計の点で、これは、構造ベースの薬物設計アプローチを採用する産業の重要な挑戦である。実際、これまでに同定された324種の薬理学的標的のうち、60%超がMPであり、標的の数は最終的に3000を超え、そのうちの80%が膜ベースであろうと推定されている(Overington, J.P.、Al-Lazikani, B. & Hopkins, A.L. How many drug targets are there? Nat Rev Drug Discov 5、993-996頁(2006)([2]))。この戦略は、構造ベースで最適化される一つの型のモジュレータを開発するために、そのリガンドと結合しているかいないかに関わらず、標的の3D構造を知ることを含んでいる(Mason, J.S.、Bortolato, A.、Congreve, M. & Marshall, F.H. New insights from structural biology into the druggability of G protein-coupled receptors. Trends in Pharmacological Sciences 33、249-260頁(2012)([3]); Schaffhausen, J. Advances in Structure-based drug design. Trends in Pharmacological Sciences 33、223頁(2012)([4]);Shoichet, B.K. & Kobilka, B.K. Structure-based drug screening for G-protein-coupled receptors. Trends in Pharmacological Sciences 33、268-272頁(2012)([5]))。とはいえ、タンパク質の天然の状態を実際に表す構造データを有することが必要である。このことは、標的が膜ベースの場合、顕著により限定的であり、この状況では、この限定を取り除く新規な手段は、この種のアプローチに対して大きな影響を有する。
ワクチン接種に関しては、標的は主として病原体の表面で利用可能であり、それゆえ細胞膜中に固定又は埋め込まれている。抗体の有効性は注入するタンパク質の構造的一体性と直接関連しているため、免疫系が対処している間に、場合によってホモ及び/又はヘテロのオリゴマーである天然の状態の標的MPを抽出し維持することによって、抗体の質を向上させることができる。これは、正しい立体構造で、より低い用量で注入できる抗原の生産の点においても、スケールメリットを可能にするため重要である。
より安定化させる界面活性剤の設計は、非常に活発な研究領域である。したがって、最も安定化させる界面活性剤としては、脂質を模倣するための2つの短い脂肪鎖を含むラウリルマルトースネオペンチルグリコール(LMNG)が最近開発された(Chae, P.S.らMaltose-neopentyl glycol(MNG) amphiphiles for solubilisation, stabilization and crystallization of membrane proteins. Nat Meth 7、1003-1008頁、(2010)([6]))。胆汁酸に基づいた界面活性剤も開発されている(Chae, P.S.らTandem Facial Amphiphiles for Membrane Protein Stabilization. Journal of the American Chemical Society 132、16750-16752頁(2010)([7]); Zhang, Q.らDesigning Facial Amphiphiles for the Stabilization of Integral Membrane Proteins. Angewandte Chemie International Edition 46、7023-7025頁(2007)([8]); Lee, S.C.らSteroid-based facial amphiphiles for stabilization and crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110、E1203-1211頁(2013)([9]))。これらの分子の設計は、親水性と疎水性のバランス等の従来のコンセプトに基づくものであり、これらの可能性には限界がある。弱酸官能基を含むもう1つの型の界面活性剤は、カリックス[4]アレーン骨格に基づいて安定性を増加させることができた(Suwinska, K.らTri-Anionic Calix[4]arene Monoalkyl Derivatives: Synthesis、So
lid-State Structures and Self-Assembly Properties. New Journal of Chemistry 32、1988-1998頁、(2008)([10]);Matar-Merheb, R.らStructuring detergents for extracting and stabilizing functional membrane proteins. PLoS One 6、e18036頁、(2011)([11]))。これらの酸官能基は、タンパク質のどの部分よりも膜-細胞質界面に多く位置するアミノ酸との複数の塩架橋の形成を促進する(von Heijne, G. The distribution of positively charged residues in bacterial inner membrane proteins correlates with the trans-membrane topology. Embo J5、3021-3027頁(1986)([12]); Nilsson, J.、Persson, B.& von Heijne, G. Comparative analysis of amino acid distributions in integral membrane proteins from 107 genomes. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 60、606-616頁、(2005)([13]); von Heijne, G. Membrane-protein topology. Nat Rev Mol Cell Biol 7、909-918頁(2006)([14]))。これらのカリックス[4]アレーン界面活性剤は、UV範囲、特にタンパク質が最も一般的に検出される280nmにて強く吸収し、二価金属とキレート結合し、このことは望ましくはないことがある。
国際公開特許第02090533号 国際公開特許第2009144419号
Israelachvili, J.N.、Mitchell, D.J. & Ninham, B.W. Theory of self-assembly of lipid bilayers and vesicles. Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Biomembranes 470、185〜201頁(1977) Overington, J.P.、Al-Lazikani, B. & Hopkins, A.L. How many drug targets are there? Nat Rev Drug Discov 5、993〜996頁(2006) Mason, J.S.、Bortolato, A.、Congreve, M. & Marshall, F.H. New insights from structural biology into the druggability of G protein-coupled receptors. Trends in Pharmacological Sciences 33、249〜260頁(2012) Schaffhausen, J. Advances in Structure-based drug design. Trends in Pharmacological Sciences 33、223頁(2012) Shoichet, B.K. & Kobilka, B.K. Structure-based drug screening for G-protein-coupled receptors. Trends in Pharmacological Sciences 33、268〜272頁(2012) Chae, P.S.らMaltose-neopentyl glycol(MNG) amphiphiles for solubilisation, stabilization and crystallization of membrane proteins. Nat Meth 7、1003〜1008頁、(2010) Chae, P.S.らTandem Facial Amphiphiles for Membrane Protein Stabilization. Journal of the American Chemical Society 132、16750〜16752頁(2010) Zhang, Q.らDesigning Facial Amphiphiles for the Stabilization of Integral Membrane Proteins. Angewandte Chemie International Edition 46、7023〜7025頁(2007) Lee, S.C.らSteroid-based facial amphiphiles for stabilization and crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110、E1203〜1211頁(2013) Suwinska, K.らTri-Anionic Calix[4]arene Monoalkyl Derivatives: Synthesis、Solid-State Structures and Self-Assembly Properties. New Journal of Chemistry 32、1988〜1998頁、(2008) Matar-Merheb, R.らStructuring detergents for extracting and stabilizing functional membrane proteins. PLoS One 6、e18036頁、(2011) von Heijne, G. The distribution of positively charged residues in bacterial inner membrane proteins correlates with the trans-membrane topology. Embo J5、3021〜3027頁(1986) Nilsson, J.、Persson, B.& vonHeijne, G. Comparative analysis of amino acid distributions in integral membrane proteins from 107 genomes. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 60、606〜616頁、(2005) von Heijne, G. Membrane-protein topology. Nat Rev Mol Cell Biol 7、909〜918頁(2006) Baiceanu Eら:「2-Indolylmethylenebenzofuranones as first effective inhibitors of ABCC2」、Eur J Med Chem. 2016 Oct 21;122:408〜18頁 Corzana, F.ら、New Insights into α-GalNAc-Ser Motif: Influence of Hydrogen Bonding versus Solvent Interactions on the Preferred Conformation. Journal of the American Chemical Society 128、14640〜14648頁(2006) Christensen, C.A. & Meldal, M. Efficient solid-phase synthesis of peptide-based phosphine ligands: towards combinatorial libraries of selective transition metal catalysts. Chemistry 11、4121〜4131頁、doi:10.1002/chem.200500105(2005) Munteanu, M.、Choi, S. & Ritter, H. Cyclodextrin Methacrylate via Microwave-Assisted Click Reaction. Macromolecules 41、9619〜9623頁(2008) Ward, A. B.ら Structures of P-glycoprotein reveal its conformational flexibility and an epitope on the nucleotide-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110、13386〜13391頁 (2013) Martinez, L. ら Understanding polyspecificity within the substrate-binding cavity of the human multidrug resistance P-glycoprotein. FEBS Journal 281、673〜682頁 (2014) Seeger, M. A.らStructural asymmetry of AcrB trimer suggests a peristaltic pump mechanism. Science 313、1295〜1298頁(2006) Chattopadhyay, A. & London, E. Fluorimetric determination of critical micelle concentration avoiding interference from detergent charge. Anal Biochem 139、408〜412頁(1984) Chaptal, V. ら Quantification of detergents complexed with membrane proteins. Scientific Reports in press (2017) Psakis, G.、Polaczek, J. & Essen, L.-O. AcrBら: Obstinate contaminants in a picogram scale. One more bottleneck in the membrane protein structure pipeline. Journal of Structural Biology 166、107〜111頁(2009) Centeno, Fら。Expression of the sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase in yeast. FEBS Lett 354、117〜122頁(1994) Rasmussen, S. G.ら Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature 477、549〜555頁(2011) Smith, P. K. ら Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry 150、76〜85頁(1985) Y. Ashok、R. Nanekar、V.-P. Jaakola、Protein Eng. Des. Sel. 2015、28、539〜542頁 M. Das、Y. Du、O. Ribeiro、P. Hariharan、J. S. Mortensen、D. Patra、G. Skiniotis、C. J. Loland、L. Guan、B. K. Kobilkaら、J. Am. Chem. Soc. 2017、139、3072〜3081頁
それゆえ、従来技術のこれらの欠点、不都合な点及び障害となる点を解決する新規な手段、特に、膜タンパク質を抽出し、水溶液中でその安定性を増加させることができる新規な手段が真に必要とされている。
相当量の研究により、本出願人は、この技術的課題を解決できる新規な化合物を設計した。
本発明の化合物は、膜タンパク質(MP)の天然の状態及び機能状態に対してわずかな影響しか有さないが、MPの抽出を可能にする一連の両親媒性表面活性剤からなる。
有利には、本発明の化合物は、抽出されたMPの水溶液中での安定性を著しく上昇させる。
これらの分子は、相互作用の3つの能力:1/タンパク質の膜結合領域の残基と界面活性剤の脂肪鎖との間の疎水性相互作用、2/糖又はポリエーテル鎖の存在により特に強化される、水素結合型の相互作用、及び3/界面活性剤の極性頭部の弱酸型の官能基と、MPの膜-細胞質界面で特に豊富な塩基性残基との間のイオン性相互作用により、クリップのようにMPの疎水性領域を取り囲むユニークな性質を有する。
本発明の分子は、4℃において、MPを抽出し、短期間及び長期間(数十日)安定化させることもできる。
これらの分子は、UV範囲にて吸収しない性質及び二価カチオンをキレートしない性質も有している。
したがって、本発明の最初の主題は、式(I)の化合物:
(式中、
・Xは、-OH、
、-S(CH2)nCH3、
、-CO2R2又は
を表し、
・Yは、-(CH2)nCH3、
、-(CH2)2OR1又は
を表し、
・Zは、-NHCO(CH2)nCH3、
を表し、
式中、
・R1は、単糖、二糖又はポリエチレングリコールを表し、
・R2は、H、Na又はKを表し、
・mは、4から21の範囲の整数であり、
・nは、4から21の範囲の整数であり、
・pは、1から3の範囲の整数であり、
・qは、1から5の範囲の整数であり、
・rは、1から10の範囲の整数であり、
・Cyは、シクロヘキシルを表す)
又は薬学的に許容されるその塩に関する。
本発明の目的では、「単糖」は、3から14個の炭素原子を含む炭水化物モノマーを意味する意図がある。これは、例えば、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン、エリトロース、トレオース、エリトルロース、デオキシリボース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、リブロース、キシルロース、アロース、アルトロース、ガラクトース、グルコース、グロース、イドース、マンノース、タロース、フルクトース、プシコース、ソルボース、タガトース、フコース、ラムノース、セドヘプツロース、マンノヘプツロース、ヘプタヒドロキシオクタナール、ノイラミン酸及びシアル酸から選択される単糖、並びにこれらの誘導体であってよい。これは好ましくはグルコースであってよい。これは環状又は非環状単糖であってよい。環状単糖の中で、これはピラン型又はフラン型の単糖、例えばβ-D-グルコピラノースであってよい。
本発明の目的では、「二糖」は、グリコシド結合を介して2つの炭水化物モノマーにより形成された二糖を意味する意図がある。これはホモ二糖又はヘテロ二糖であってよい。ホモ二糖である場合、例えば、フルクトースのホモ二糖、例えばイヌロビオース、又はマンノースのホモ二糖、例えば2α-マンノビオース若しくは3α-マンノビオース、又はグルコースのホモ二糖、例えばトレハロース、コウジビオース、ニゲロース、マルトース、イソマルトース、ソホロース、ラミナリビオース、セロビオース若しくはゲンチオビオース等、又はこれらの誘導体であってよい。これは例えば、エチルマルトシドであってよい。代替として、ヘテロ二糖である場合、例えば、トレハルロース、スクロース、ツラノース、マルツロース、ロイクロース、イソマルツロース及びゲンチオビウロース並びにそれらの誘導体から選択されるグルコース-フルクトースのヘテロ二糖、又はメリビオース、ラクツロース、ラクトース及びルチノース並びにそれらの誘導体から選択される他のヘテロ二糖であってよい。
本発明の文脈において、mは、整数4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20及び21から選択できる。
本発明の文脈において、nは、整数4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20及び21から選択できる。これは例えば数値10、12又は14であってよい。
本発明の文脈において、pは、整数1、2及び3から選択できる。
本発明の文脈において、qは、整数1、2、3、4及び5から選択できる。
本発明の文脈において、rは、整数1、2、3、4、5、6、7、8、9及び10から選択できる。
整数m、n、p、q及びrは互いに独立しており、これらの整数の全ての組み合わせは本発明に含まれる。
本発明の文脈において、用語「薬学的に許容される塩」は、化合物上に存在する置換基に応じて酸又は塩基を用いて調製された非毒性の塩を含む。本発明の化合物が酸官能基を含む場合、対応する塩は、任意選択的で、好ましくは不活性溶媒の存在下、化合物に有機又は無機塩基を加えて、中和された形態で得ることが可能である。塩基の付加塩の例は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、(有機)アミノ又はマグネシウム塩でありうる。
したがって、本発明は例えば式(I)の化合物
(式中、
・Xは、
を表し、
・Yは、
を表し、
・Zは、-NHCO(CH2)nCH3又は
を表し、
・R1は、例えばグルコース等の単糖、例えばマルトース等の二糖、又はポリエチレングリコールを表し、
・R2は、H、Na又はKを表し、
・mは、4から21の範囲、例えば11と同等の整数であり、
・nは、4から21の範囲、例えば8、10、11、12、14又は17と同等の整数であり、
・pは、1から3と同等、例えば2と同等の整数である)
又は薬学的に許容されるその塩である。
この場合、例えば、下記「実施例」項にて記載しているように、例えば、3.7b、3.7c、3.7e、3.7g、3.7j、3.7l等の群3.7又は例えば4.6b若しくは4.6d等の群4.6の化合物であってよい。
代替として、本発明は、例えば式(I)の化合物
(式中、
・Xは、-S(CH2)nCH3を表し、
・Yは、-(CH2)2OR1を表し、
・Zは、
を表し、
・R1は、単糖、例えばマルトース等の二糖、又はポリエチレングリコールを表し、
・R2は、H、Na又はKを表し、
・nは、4から21の範囲、例えば11、13、15又は17と同等の整数であり、
・pは、1から3の範囲、例えば2と同等の整数である)
又は薬学的に許容されるその塩である。
この場合、例えば、下記「実施例」項にて記載しているように、例えば5.3a、b、c又はd等の群5.3の化合物、特に化合物5.3aであってよい。
一般的に言えば、式(I)に対応する各化合物並びに「実施例」項、特に「実施例」項の表1及び表2に記載されている各化合物は、本発明の主題をなす分子である。
有利には、本発明の分子は、220から500nm(及びそれ以上)で吸収しないか又は無視できるほどの吸収しかせず、それゆえ280nmでのタンパク質の検出を妨害しない。
有利には、本発明の分子は、二価の金属と不溶性の錯体を形成しない。この金属との相互作用が無いことは例えば、ニッケル又はコバルトを使用し、本発明の分子とは異なる高濃度の従来の界面活性剤を用いては実行できない、金属アフィニティ型クロマトグラフィーのステップの間に非常に有用である。これは、生存している生物中で通常遭遇するタンパク質補助因子であるカルシウム及びマグネシウムの存在下で、錯体の沈殿を避けるためにも非常に有用である。
本発明者らは、例えば高いCMC(臨界ミセル濃度)を有する界面活性剤を透析若しくは限外濾過により容易に除去する、又は低いCMCを有する化合物を用いることにより当該界面活性剤を維持するという所期の目的の機能として、これらの置換基を変えることにより、例えば脂肪族鎖の長さ及び/又は極性頭部の大きさを変えることにより、本発明の化合物のCMCを変えることができることを実験的に証明した。
本発明者らは、特に、従来の技術を使用して目的の膜タンパク質を不純物と共に一般的に共精製する場合、本発明の分子の技術特性、特にこれらの置換基を変えることにより、本発明の分子を使用して、抽出すべき膜タンパク質に応じて、選択的な抽出を行うことができることを実験的に証明した。
有利には、本発明の分子による膜タンパク質の抽出は、抽出されたときに、MPの機能活性の減少を引き起こさない。任意選択で、本発明の分子による抽出は、抽出すべきMPの性質に依存して、抽出されたMPの機能活性を上昇されることができる。
本発明者らは、本発明の分子は、膜タンパク質を溶液中で、従来の界面活性剤よりも少なくとも2倍の長さ、例えば2倍、3倍、4倍、5倍又はそれ以上の長さ安定化させることも実験的に証明した。
本発明の化合物は、ペプチドカップリング、Fmoc(フルオレニルメトキシカルボニル)基の脱保護、アミド形成、触媒的水素化、tBu(tert-ブチル)基の脱保護、メチル又はエチルエステルの脱保護、Boc基の脱保護、ヒュスゲン環化付加、脱アセチル化反応、(Na、K)カルボン酸塩の形成、及びトリチル脱保護並びにチオール-エンカップリングを含む方法の少なくとも1つを含む、当業者に公知のいずれかの適切な方法を用いることにより調製できる。本発明の各化合物の合成プロトコルを、例えば以下の「実施例」項に記載する。
本発明の第2の主題は、生体膜に結合している膜タンパク質の水溶液を上記に定義した通りの少なくとも1つの式(I)の化合物と接触させるステップを含む、生体膜に結合している膜タンパク質を抽出する方法に関する。
本発明の目的では、「生体膜」とは、その環境から細胞を分離する二層の親油性分子の集合体を意味することが意図され、これは両親媒性脂質、特にリン脂質の二重層であり、各膜脂質は膜の外側に向いた親水性極性頭部と内側に向いた疎水性尾部から成る。これは、原核細胞又は真核細胞、ヒト胚性幹細胞以外の動物細胞、又は植物細胞又はウイルスの膜であってよい。真核細胞である場合、例えば形質膜、及び核膜、リソソーム、エキソソーム、プロテオリポソーム、滑面若しくは粗面小胞体膜又はゴルジ体膜等の細胞内膜であってよいが、このリストに限定されるものではない。これは、例えば組換えRNA若しくはDNAの遺伝子工学技術により、又は1つ若しくはそれ以上の目的ワクチン抗原を発現するウイルスベクターで細胞を感染させることにより、1つ又はそれ以上の目的抗原を発現させる細胞株に由来する単離された遺伝子導入宿主細胞であってもよい。細胞で導入遺伝子を発現できる、当業者に公知の如何なる遺伝子工学技術も使用できる。これは、例えば電気穿孔法、微量注入法、超音波、感染又は遺伝子導入による形質導入により細胞に導入された、DNA又は例えば合成的コーディングmRNAのRNAの発現を含む技術であってよい。発現は、例えば資料WO02090533([29])に記載されている通りに、少なくとも1つの目的抗原の一過性及び/又は誘発性及び/又は恒常的発現であってよい。細胞は更に、例えばヒト胚性幹細胞以外の単離されたヒト細胞又は単離された動物細胞、非ヒト細胞若しくは植物細胞、特にヒト胚性幹細胞以外の如何なる単離された細胞であってよい。単離された細胞は、Vero76(ATCC No.CRL-1587)等のVero(ATCC No.CCL-81)、CHO-Kl(CCL61、ATCC)等のCHO、BHK-21[C-13](ATCC(登録商標)CCL-10(商標))等のBHK、HELA、perC6(登録商標)(Crucell社)、HEK293(ATCC(登録商標)CRL-1573(商標))、Sf9(ATCC、CRL-1711),例えばMDCK(NBL-2)(ATCC(登録商標)CCL-34(商標))のMDCKから選択される細胞株に由来するが、このリストで制限されるものではない。
生体膜は全体、即ちインタクトであってよく、又は生体膜画分、即ち生体膜の一部であってよい。
本発明の目的では、「膜タンパク質」は、生体膜に結合しているタンパク質、即ち、固定化されるか又は複合化されており、水性媒体中で自由に拡散しないタンパク質を意味することが意図されている。タンパク質膜としては、例えば、血漿膜タンパク質及び例えばミトコンドリア膜タンパク質、核膜タンパク質又はリソソーム膜タンパク質の細胞内膜タンパク質を挙げることができる。例えば、これは、P-糖タンパク質(Pgp/ABCB1)、MRP1/ABCC1、MRP2/ABCC2、BCRP/ABCG2及びBmrAからなる群より任意選択で選択された、例えばABCトランスポーター等の輸送タンパク質であってよい。代わりとしてこれは、例えば上記したタンパク質等の生体膜中で遺伝子導入で発現された目的タンパク質並びにABCB1、C1、C2及びG2に関してBaiceanuら(Baiceanu Eら:“2-Indolylmethylenebenzofuranones as first effective inhibitors of ABCC2”、Eur J Med Chem. 2016 Oct 21;122:408-18頁([30]))、又はバクテリア中で発現するBmrA (Matar-Merheb, R.ら([11]))により記載されている通り真核細胞中で発現された目的タンパク質であってよい。
生体膜を、少なくとも1つの上記定義した式(I)の化合物、又は少なくとも2つ、若しくは少なくとも3つのこれらの化合物、又はそれ以上と接触させることができる。有利には、1つ又は複数の本発明の化合物を複数選択することにより、例えば不純物を除去するための膜タンパク質の選択的抽出を可能にすることができる。
本発明の文脈において、生体膜を、予め、例えば緩衝液の水溶液中に置くことができる。
抽出すべき膜タンパク質を含む水溶液を少なくとも1つの式(I)の化合物とを接触させるステップは、分子のクリップ効果を最大化するために、本発明の分子のカルボン酸基がイオン化されるpHで行うことができる。有利にはpHは、5.0と12との間のpH、例えば5.0又は6.0又は7.0又は8.0又は9.0又は10.0又は11.0又は12.0のpHである。
本発明に従う抽出プロセスは、膜タンパク質と本発明の化合物をインキュベートするステップを更に含むことができる。抽出すべき膜タンパク質の全て又は一部が溶液中にあるように、インキュベーション時間を合わせることができる。インキュベーション時間は、安定化すべき膜及び/又は抽出すべきタンパク質及び/又は所望の抽出収率の関数として如何に合わせるかを知っている当業者により決定できる。インキュベーション時間は、例えば15分又は30分又は1時間又は2時間又は3時間又は3時間以上であってよい。
インキュベーションステップは、抽出すべきタンパク質に合った温度、特に加熱による、特にこれらの変性を回避するような温度で行うことができる。温度は当業者により結果として合わせることができ、通常熱安定性のないタンパク質の場合は4℃と40℃との間であり、熱安定性のタンパク質の場合は40℃〜90℃であろう。
本発明の抽出プロセスは、所望のタンパク質を含む画分を得るための分離ステップを更に含むことができる。これは当業者に公知の如何なる方法でもよく、例えば遠心分離等である。分離ステップの最後に、膜から抽出されたタンパク質を含む画分が得られる。
有利には、抽出の最後に、少なくとも1つの本発明の化合物を含む溶液中にタンパク質が保持されていてもよい。有利には、本発明の化合物は、特にタンパク質がこれらの膜から抽出された後、タンパク質を機能的に安定化できる。
それゆえ、本発明の他の主題は、溶液中で、即ち、最初にタンパク質がその中に存在していた生体膜の外部で、水溶液中で膜タンパク質を安定化させる方法であって、(i)溶液中の膜タンパク質の水溶液を少なくとも1つの本発明の式(I)の化合物と接触させるステップを含む、方法に関する。
タンパク質の安定化とは、その天然の状態と比較して、その機能特性の全て又は一部が保存されていることであってよい。タンパク質の安定化は、その天然の状態と比較して、タンパク質の活性の少なくとも50%、又はこの活性の少なくとも60%、若しくは少なくとも70%、若しくは少なくとも80%、若しくは少なくとも90%、若しくは100%が保存されていることであってよい。
有利には、タンパク質はこのように、0℃から10℃の温度で、1日以上、例えば5日以上、又は10日以上、又は20日以上、又は30日以上、又は40日以上の期間安定化される。
膜タンパク質は、前記定義の通り、本発明の化合物による抽出のステップにより、又は他の界面活性剤、即ち市販界面活性剤、例えばDDM(n-ドデシルβ-d-マルトシド)、LMNG(ラウリルマルトースネオペンチルグリコール)、トリトンX100若しくはFA3(フェイシャル両親媒性物質3)による抽出のステップにより、溶液中に置くことができた。
他の有利な点は、添付した図により説明され、説明図により示されている以下の実施例を読むことで当業者には更に明らかになるであろう。
図1は、ABCトランスポーターBmrAのトポロジー及び形質膜を通して基質を輸送するサイクルを示す図である。S=基質;NBD=ヌクレオチド結合ドメイン;ATP=アデノシン三リン酸。 図2は、本発明の分子-クリップの吸収スペクトルと比較したカリックス[4]アレーン界面活性剤(C4C7で例証した)の吸収スペクトルを示す図である。波長はnmで表す。パネルA:DDM(1mM)の吸収スペクトルは実線で表し、C4C7(1mM)の吸収スペクトルは点線で表す。パネルB:化合物2.3b(1mM)の吸収スペクトルは で表し、化合物2.3c(1mM)の吸収スペクトルは実線で表し、化合物2.3d(1mM)の吸収スペクトルは
で表す。パネルC:化合物3.7e(1mM)の吸収スペクトルは
で表し、化合物3.7f(1mM)の吸収スペクトルは
で表し、化合物3.7g(1mM)の吸収スペクトルは
で表し、化合物3.7h(1mM)の吸収スペクトルは
で表し、化合物3.7j(1mM)の吸収スペクトルは実線で表す。パネルD:化合物4.6b(1mM)の吸収スペクトルは
で表し、化合物4.6c(1mM)の吸収スペクトルは実線で表し、化合物4.6d(1mM)の吸収スペクトルは
で表す。パネルF:化合物3.9a(1mM)の吸収スペクトルは実線で表す。パネルG:化合物3.7a(1mM)の吸収スペクトルは
で表し、化合物3.7b(1mM)の吸収スペクトルは
で表し、化合物3.7k(1mM)の吸収スペクトルは
で表し、化合物3.7l(1mM)の吸収スペクトルは実線で表し、化合物3.7c(1mM)の吸収スペクトルは
で表し、化合物3.7d(1mM)の吸収スペクトルは
で表す。
図3(A及びB)は、カリックス[4]アレーン界面活性剤に対する、本発明の分子と二価カチオンとの相互作用を表し、ここでC4C12を事例として、カリックス[4]アレーン界面活性剤に対して本発明の分子と二価カチオンとの相互作用が無いことを示す図である。吸光度は、異なるMgCl2濃度(mM)に関して600nmにて測定する。パネルA:濃度0.45mM(円形)、1.5mM(正方形)及び4.5mM(三角形)での化合物3.7bの吸収。パネルB:濃度0.2mM(十字形)、0.5mM(円形)、2mM(正方形)及び6mM(三角形)での化合物3.7cの吸収。パネルC:濃度0.0045mM(円形)、0.0015mM(正方形)及び0.045mM(三角形)での化合物3.7dの吸収。パネルD:濃度0.2mM(十字形)、0.5mM(円形)、2mM(正方形)及び6mM(三角形)での化合物3.7eの吸収。パネルE:濃度0.006mM(円形)、0.02mM(正方形)及び0.06mM(三角形)での化合物3.7fの吸収。パネルF:濃度0.003mM(円形)、0.01mM(正方形)及び0.03mM(三角形)での化合物3.7gの吸収。パネルG:濃度0.003mM(円形)、0.01mM(正方形)及び0.05mM(三角形)での化合物3.7hの吸収。パネルH:濃度0.3mM(円形)、1mM(正方形)及び3mM(三角形)での化合物3.7iの吸収。パネルI:濃度0.006mM(円形)、0.02mM(正方形)及び0.06mM(三角形)での化合物3.7jの吸収。パネルJ:濃度0.3mM(円形)、1mM(正方形)及び3mM(三角形)での化合物3.7kの吸収。パネルK:濃度0.3mM(円形)、1mM(正方形)及び3mM(三角形)での化合物3.7lの吸収。パネルL:濃度0.24mM(円形)、0.8mM(正方形)及び2.4mM(三角形)での化合物2.3fの吸収。パネルM:濃度0.03mM(円形)、0.1mM(正方形)及び0.3mM(三角形)での化合物2.3gの吸収。パネルN:濃度0.15mM(円形)、0.5mM(正方形)及び1.5mM(三角形)での化合物2.3hの吸収。パネルO:濃度0.3mM(円形)、1mM(正方形)及び3mM(三角形)での化合物4.5cの吸収。パネルP:濃度0.15mM(円形)、0.5mM(正方形)及び1.5mM(三角形)での化合物4.5dの吸収。パネルQ:濃度1.5mM(円形)、5mM(正方形)及び15mM(三角形)での化合物4.6cの吸収。パネルR:濃度1mM(円形)、3mM(正方形)及び9mM(三角形)での化合物4.6dの吸収。パネルS:濃度0.01mM(円形)、0.1mM(正方形)及び1mM(三角形)での化合物3.9aの吸収。パネルT:濃度0.03mM(円形)、0.1mM(正方形)及び0.3mM(三角形)での化合物C4C12の吸収。 図4は、化合物番号3.7e(C13、四角で表したポイント)及び3.7f(C18、円で表したポイント)を例として、濃度(0.0001mM、0.001mM、0.01mM、0.1mM、1mM、及び10mM)が上昇するクリップ(本発明の化合物)の存在下でのDPH(1,6-ジフェニル-1,3,5-ヘキサトリエン)の蛍光発光(%)を表す図である。実験は3回行う。Chattopadhyay, A. & London, E([22])に従って、CMCは、傾斜の折れが観察される濃度に対応しており、ここで3.7fでは20μM及び3.7eでは2mM(黒色シンボル)である。 図5は、波長(nm)の関数として、強度(%、左にカラムA)で及び数(%、右にカラムB)で、クリップの動的光散乱(DLS)を示す図である。推定直径を各パネル上に示す(カラムA)。カラムA及びB、上から順に:化合物3.7c(10mM、5xCMC)、化合物3.7d(10mM、5xCMC)、化合物3.7e(2mM、5xCMC)、化合物3.7f(10mM、500xCMC)、化合物3.7h(1mM、100xCMC)、化合物3.7j(2mM、100xCMC)、化合物3.9a(1mM、50xCMC)。 図6は、市販されている界面活性剤及び本発明の分子(パネルA及びB、左から右に)を使用する膜タンパク質BmrA(パネルA及びC)及びAcrB(パネルB及びD)の抽出を示す図である:SDS、DDM、FC12、TX100、本発明の化合物1.4、1.5、2.3a、2.3b、2.3c、2.3d、2.3e、2.3f、2.3g、2.3h、2.3i、3.7a、3.7b;パネルC:本発明の化合物3.7c 0.8%、3.7d 0.16%、3.7e 0.8%、3.7f 0.3%、3.7g 0.4%、3.7h 0.2%、3.7i 0.07%、3.7j 0.09%、3.7k、3.7l 0.25%、3.9a、4.5a、4.5b、4.5c、4.5d 0.34%、4.6a、4.6b、4.6c、4.6d、5.3a、5.3b、5.3c 0.3%、5.3d 0.3%; パネルD:3.7c、3.7d、3.7e、3.7f、3.7h、3.7i 0.1%、3.7j、3.7k、3.7l、3.9a、4.5a、4.5b、4.5c、4.5d、4.6a、4.6b、4.6c、4.6d。特に記載しない限り、界面活性剤を10g/l(1%)で加える。100000xgで30分間遠心分離した後、抽出した画分の当量のタンパク質20μgを10%SDS-PAGEにデポジットし、移動させた後クーマシーブルーで染色する。BmrAは単量体型で55kDaバンドのレベルに移動し、AcrBは単量体型で100kDaバンドのレベルに移動する。SDS=ドデシル硫酸ナトリウム; DDM=β-D-ドデシルマルトシド; FC12=フォスコリン-12; TX100=トリトンX-100。 図7は、BmrAの機能性(ATP分解酵素活性、%)に対する本発明の界面活性剤の効果を示す図である。2g/lに希釈したBmrA(約25%)中で濃縮した膜画分は、示された濃度(mM)でこれに加えた化合物を有する(パネルA、上から下に:3.7e 10.7mM、3.7e 8.6mM、3.7e 6.4mM、3.7e 4.3mM、3.7e 2.2mM、3.7e 1.1mM、3.7d 4mM、3.7d 3mM、3.7d 2mM、3.7d 1mM、3.7d 0.8mM、3.7d 0.6mM、3.7d 0.05mM、3.7d 0.03mM、3.7d 0.02mM、3.7c 13mM、3.7c 10.4mM、3.7c 10mM、3.7b 1.5mM、3.7b 0.7mM、3.7b 0.5mM、2.3gNa2 20.5mM、2.3gK2 19.3mM、2.3f 21.1mM、2.3e 22mM、2.3d 23.2mM、2.3a 3.2mM、1.5a 22mM、DDM 20mM、DDM 2mM、DDM 10mM、DDM 2mM、DDM 1mM、LMNG 10mM、LMNG 1mM、LMNG 0.1mM、LMNG 0.01mM、FA3 27mM、FA3 9mM、FA3 2mM、FA3 1mM、TX100 16mM;パネルB、上から下に:本発明の化合物5.3d 3.2mM、5.3c 3.3mM、5.3b 11.7mM、5.3b 2.9mM、5.3a 3mM、4.6c 14.6mM、4.6b 15.2mM、4.5c 18.6mM、4.5b 19.6mM、3.9a 8mM、3.9a 0.51mM、3.9a 0.31mM、3.9a 0.11mM、3.7l 12.01mM、3.7l 6.01mM、3.7l 3mM、3.7l 1mM、3.7k 10mM、3.7k 3mM、3.7j 3mM、3.7j 2mM、3.7j 1mM、3.7j 0.6mM、3.7j 0.03mM、3.7j 0.02mM、3.7j 1mM、3.7i 0.3mM、3.7h 3mM、3.7h 2mM、3.7h 1mM、3.7h 0.6mM、3.7h 0.58mM、3.7h 0.5mM、3.7h 0.35mM、3.7h 0.1mM、3.7h 0.5mM、3.7h 0.35mM、3.7h 0.1mM、3.7h 0.05mM、3.7h 0.03mM、3.7h 0.02mM、3.7g 12.5mM、3.7g 9mM、3.7g 7.5mM、3.7g 5mM、3.7g 3mM、3.7g 1mM、3.7f 3.2mM、3.7f 2mM、3.7f 1mM、3.7f 0.061mM、3.7f 0.031mM、3.7f 0.015mM)。4℃で2時間インキュベートした後、ATP分解酵素活性を測定する。次いで、溶液を4℃、100000xgで1時間遠心分離し、上清を10%SDS-PAGEにデポジットする(図8を参照のこと)。灰色及び黒色のヒストグラムは、これらのSDS-PAGEに従って、部分的に(灰色)又は全体的に(黒色)BmrAが抽出される濃度に対応する。ATP分解酵素活性は、0.7μmolの加水分解されたATP/分/タンパク質mgにて、化合物を含まないタンパク質の活性に対する相対%である。 図8は、異なる界面活性剤(DDM、LMNG及びFA3)並びに図7に示した本発明の分子(3.7b、3.7c、3.7d、3.7e、3.7f、3.7h、3.7g、3.7j、3.7l、3.9a、4.3d、5.3b)の異なる濃度(mMで及びxCMCで表した)で試験したBmrAの抽出を示す図である。図7にて調製した溶液の合計(T)及び可溶(S)画分を、100000xgで30分間、4℃にて遠心分離することにより分離した後、10%SDS-PAGEにデポジットする。DDM=β-D-ドデシルマルトシド;LMNG:ラウリルマルトースネオペンチルグリコール(Chae、P.S.ら([6]))。FA3=フェイシャル両親媒性物質番号3(Lee, S.C.ら([9]))。 図9は、DDM中で精製したBmrA(円で表されるポイント)及びこれに加えられた本発明の化合物(3.7c、四角で表されるポイント、及び3.7g、ダイヤモンド形で表されるポイント)又はこれに加えられたFA3(三角で表されるポイント)の経時安定性を示す図である。ATP分解酵素活性(%)は、実施例13にて説明した精製後のインキュベーションの日数の関数として測定する。 図10は、DDM(点線)の又は本発明の化合物3.7c(実線)の存在下のいずれかで、ABC膜タンパク質BmrAのSuperdex S2005/150カラム上での排除クロマトグラフィーによる分離を示す図である。膜画分を、Ni-NTA金属アフィニティ及びSuperdex 200サイズ排除によりDDM中で抽出し精製した後、DDMをそれ自体又は化合物3.7cのいずれかで変換するため、Ni-NTA上で再度装填した。次いで、各プールを3mlのSuperdex S2005/150サイズ排除カラム上に装填し、示したように2CMCの同一界面活性剤の存在下で溶出する。タンパク質を280nmでの吸収により検出する。 図11は、本発明の化合物の存在下での膜タンパク質BmrAの熱安定性を示す図である。A.界面活性剤及び本発明の化合物によるBmrAの熱安定性(左から右へ:DDM、LMNG、3.7d、3.7c、3.7b、3.7a、3.7i、3.7j、3.7k、3.7f及び3.7e)。膜画分を、1mMの界面活性剤及び本発明の化合物を用いて又は用いずに10mM DDMで抽出し、30分間清澄化し、示された温度に、続いて残っている膜タンパク質を定量するために上清を遠心分離し、SDS-PAGE及びウエスタンブロットを行った(2〜4の実験)。B:DDM及び3.7cを用いた実施例。
(実施例1)
本発明の化合物を調製する方法
式(I)に属する界面活性剤の異なる実施例を以下のプロトコルに従って調製する:
一般プロトコルA:ペプチドカップリング
Corzanaら、2006年(Corzana, F.ら、New Insights into α-GalNAc-Ser Motif: Influence of Hydrogen Bonding versus Solvent Interactions on the Preferred Conformation. Journal of the American Chemical Society 128、14640-14648頁(2006)([15]))に従う。遊離アミン官能基を有するか又はトシレート塩の形態のアミノ酸(2当量)、DIEA(5当量)及びTBTU(1.2当量)を、遊離カルボン酸官能基を有するアミノ酸誘導体(1当量)の無水DMF中溶液(15ml/mmol)に加える。反応混合物を不活性雰囲気下室温(RT)で3時間撹拌する。水(15ml/mmol)を加えた後、反応媒体をエチルエーテルで抽出する。有機相を合わせ、蒸留水及び飽和NaCl水溶液で洗浄し、MgSO4で脱水し、濾過し、次いで真空下で濃縮する。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製する。
一般プロトコルB1:Fmoc基の脱保護
ジエチルアミン(20当量)を、Fmocの形態で保護化されたアミン(1当量)の無水CH2Cl2(20ml/mmol)中溶液に加える。N2下室温で終夜撹拌した後、反応媒体を真空下で濃縮する。残渣をCH2Cl2に溶解させる。この溶液をNaHCO3の飽和溶液で洗浄し、K2CO3で脱水し、次いで真空下で濃縮する。
一般プロトコルB2:Fmoc基の脱保護
ジエチルアミンをピペリジンで置き換えた以外は、B1と同一のプロトコル。
一般プロトコルC:アミド形成
酸塩化物(2当量)、DMAP(0.5当量)及びピリジン(34当量)を、脱保護アミン(1当量)の無水CH2Cl2(30ml/mmol)中溶液に加える。N2下室温で終夜撹拌した後、反応媒体を10%HClの水溶液を加えることにより酸性化する(pH=3)。反応媒体をCH2Cl2で抽出する。有機相を合わせ、飽和NaCl水溶液で洗浄し、MgSO4で脱水し、濾過し、次いで真空下で濃縮する。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製する。
一般プロトコルD1:触媒的水素化
10%Pd/C(200mg/mmol)をベンジルエステル(1当量)のMeOH(100ml/mmol)中溶液に加える。H2下室温で4時間から1晩撹拌した後、反応媒体をセライト(登録商標)上で濾過し、次いで真空下で濃縮する。得られた粗生成物を精製せずに引き続くステップに直接使用する。PEG化された界面活性剤の場合、残渣をシクロヘキサン及び/又はCH2Cl2で洗浄する。
一般プロトコルD2:触媒的水素化
5%Pd/C(120mg/mmol)をベンジルエステル(1当量)のTHF(30ml/mmol)中溶液に加える。H2下室温で終夜撹拌した後、反応媒体をセライト(登録商標)上で濾過し、次いで真空下で濃縮する。得られた粗生成物を精製せずに引き続くステップに直接使用する。
一般プロトコルE:tert-ブチル(tBu)基の脱保護
Christensenら、2005年(Christensen, C.A. & Meldal, M. Efficient solid-phase synthesis of peptide-based phosphine ligands: towards combinatorial libraries of selective transition metal catalysts. Chemistry 11、4121-4131頁、doi:10.1002/chem.200500105(2005)([16]))に従う。トリフルオロ酢酸TFA(4ml/mmol)を、0℃でt-ブチルエーテルの形態で保護化されたアルコール(1当量)のCH2Cl2(12ml/mmol)中溶液に加える。N2下室温で終夜撹拌した後、反応媒体を真空下で濃縮する。残渣をCH2Cl2に溶解させ、次いでNaOHの2M水溶液を加える(pH=11〜12)。水性相をEtOAcで洗浄し、次いで濃HCl溶液(pH=1〜2)で酸性化した後、EtOAcで抽出する。有機相を合わせ、MgSO4で脱水し、濾過し、真空下で濃縮する。残渣をCH2Cl2で洗浄して、残っている脂肪酸を除去する。
一般プロトコルF:メチル又はエチルエステルの脱保護
LiOH(5当量)の水(10.4ml/mmol)中溶液を、メチル又はエチルエステルの形態で保護化された酸(1当量)のTHF(10.4ml/mmol)中溶液に加える。反応媒体を室温で4時間撹拌する。5%H3PO4水溶液(pH=1〜2)を加えた後、反応媒体をEtOAcで抽出する(所望の化合物が沈殿しない限りであり、沈殿する場合、これを蒸留水で洗浄し、予め冷却する)。有機相を合わせ、飽和NaCl水溶液で洗浄し、MgSO4で脱水し、濾過し、次いで真空下で濃縮する。粗生成物を次いで、C18逆相カラムクロマトグラフィー(溶出液:H2O次いでMeOH)により精製する。
一般プロトコルG:Boc基の脱保護
TFA(2.5ml/g)を、0℃でBoc基により保護化されたアミン(1当量)の無水CH2Cl2(5ml/g)中溶液に加える。N2下室温で4〜5時間撹拌した後、反応媒体を真空下で濃縮する。残渣をCH2Cl2に溶解させ、NaOHの水溶液(2M)を加える(pH=11〜12)。水性相をEtOAcで洗浄し、濃HCl溶液(pH=1〜2)で酸性化し、CH2Cl2で洗浄し、次いでEtOAcで抽出する。有機相を合わせ、MgSO4で脱水し、濾過し、次いで真空下で濃縮する。得られた粗生成物を精製せずに引き続くステップに直接使用する。
一般プロトコルI:ヒュスゲン環化付加
Munteanuら、2008年(Munteanu, M.、Choi, S. & Ritter, H. Cyclodextrin Methacrylate via Microwave-Assisted Click Reaction. Macromolecules 41、9619-9623頁(2008)([18]))に従う。数滴の水を、アルキン(1当量)の、酢酸塩又はアジド-PEGの形態で保護化されたアジドサッカリド(1〜1.5当量)の、CuSO4.5H2O(0.1当量)の、及びアスコルビン酸ナトリウム(0.2当量)のDMF(6ml/mmol)中溶液に加える。反応混合物をマイクロ波照射下140℃で1時間撹拌する。水を加えた後、反応媒体をEtOAcで抽出する。有機相を合わせ、MgSO4で脱水し、濾過し、次いで真空下で濃縮する。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製する。
一般プロトコルJ:脱アセチル化反応
Chae, P.S.ら、2010年([6])に従う。MeONa(0.2当量)を、酢酸塩の形態で保護化されたサッカリド誘導体(1当量)のMeOH(16.7ml/mmol)中溶液に加える。室温で終夜撹拌した後、プロトン交換樹脂(Dowex-H+)を加え、反応媒体を30分間撹拌した後、濾過する。濾液を真空下で濃縮し、得られた粗生成物を精製せずに引き続くステップに直接使用する。
一般プロトコルK:(Na、K)カルボン酸塩の形成
MeONa又はMeOK(塩化されるカルボン酸官能基当たり1当量)を、カルボン酸(1当量)の最少量のMeOH中溶液に加える。5分撹拌した後、溶媒を蒸発させ、最終生成物を固体形態で回収する。
一般プロトコルL:トリチル脱保護及びチオール-エンカップリング
TFA(5ml/g)を、0℃でEt3SiH(1.5当量)の存在下L-Fmoc-Cys(Trt)-OH(1当量)のCH2Cl2(10ml/g)中懸濁液に加える。3時間撹拌した後、反応媒体を真空下で濃縮して灰色固体を得る。この残渣、アルケン(1.2当量)及びDMPA光開始剤(0.5当量)をTHF(7.5ml/g)に溶解させる。媒体をUV下室温で3時間撹拌する。真空下で濃縮した後、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製する。
(実施例2)
化合物1.1から1.5の実施例
i.CH3(CH2)11NH2、TBTU、DIEA、DMF; ii.ピペリジン/DMF20:80; iii.アクリル酸エチル、MeOH; iv.アクリル酸ベンジル、70℃; v.LiOH、THF、H2O、RT; vi.TFA、CH2Cl2、RT; vii.H2、Pd/C10%、MeOH。
化合物1.1
ドデシルアミン(2.9g、15.64mmol、2当量)次いでDIEA(6.8ml、39.11mmol、5当量)及びTBTU(3.01g、9.38mmol、1.2当量)を、Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.0g、7.82mmol、1当量)のDMF(300ml)中溶液に加える。室温で4時間撹拌した後、反応媒体を真空下で濃縮し、エーテルで希釈する。有機相をNaClの飽和溶液、HClの溶液(0.1N)で、次いでNaHCO3の溶液(5%)で順次洗浄した後、Na2SO4で脱水し、濾過し、真空下で濃縮する。得られた残渣をピペリジン/DMFの混合物(20:80、300ml)に溶解させる。室温で1時間撹拌した後、反応媒体を真空下で次いで、濃縮する。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2/MeOH 98:2)により精製して、所望の化合物(2.44g、7.43mmol、95%)を黄色油状物の形態で得る。Rf=0.45(CH2Cl2/MeOH 95:5); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.89 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.20 (s, 9H), 1.26-1.35 (m, 22H), 3.25 (q, J = 4.4 Hz, 2H), 3.42-3.51 (m, 2H), 3.62 (dd, J = 4.0, 4.0 Hz, 1H), 7.39 (m, 1H); 13C NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 14.4 (CH3), 23.0 (CH2), 27.3 (CH2), 27.8 (3xCH3), 29.6 (2xCH2), 29.9 (3xCH2), 30.0 (CH2), 32.0 (CH2), 36.8 (CH2), 39.4 (CH2), 55.7 (CH), 64.3 (CH2), 73.7 (C), 173.2 (C); 質量(ESI+): m/z (%) 329 [M+H]+ (100).
化合物1.2
アクリル酸エチル(1.37ml、12.9mmol、2.5当量)を、中間体1.1(1.06g、3.22mmol、1当量)のメタノール(3.5ml)中溶液に加えた。混合物を窒素でフラッシュし、アルミニウム箔で覆い、室温で5日間撹拌した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2/MeOH 95:5)により精製して、所望の化合物(1.24g、2.90mmol、83%)を黄色油状物の形態で得る。Rf=0.56(CH2Cl2/MeOH 98:2); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.13 (s, 9H), 1.22-1.25 (m, 25H), 1.46-1.49 (m, 2H), 2.04 (m, 1H), 2.44 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.79-2.83 (m, 2H), 3.16 (dd, J = 4.0, 4.0 Hz, 1H), 3.20 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 3.29 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 3.62 (dd, J = 4.0, 4.0 Hz, 1H), 4.12 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 7.46 (t, J = 4.8 Hz, 1H); 13C NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 14.3 (CH3), 14.4 (CH3), 22.8 (CH2), 27.1 (CH2), 27.7 (3xCH3), 29.5-29.8 (7xCH2), 32.1 (CH2), 35.0 (CH2), 39.2 (CH2), 44.0 (CH2), 60.7 (CH2), 62.6 (CH), 63.5 (CH2), 73.5 (C), 172.0 (C), 172.7 (C); 質量(ESI+): m/z (%) 429 [M+H]+ (100); HRMS (ESI+) m/z C24H49N2O4の計算値429.3692, 実測値429.3696.
化合物1.3
中間体1.2(1.40g、3.26mmol、1当量)及びアクリル酸ベンジル(1.32g、8.16mmol、2.5当量)の溶液を70℃で7日間撹拌し、次いで反応媒体を真空下で濃縮する。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2100%)により精製して、所望の化合物(640mg、1.07mmol、33%)を黄色油状物の形態で得る。Rf=0.47(CH2Cl2/MeOH 98:2); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.80 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.10 (s, 9H), 1.13-1.25 (m, 22H), 1.40 (m, 2H), 2.30-2.52 (m, 4H), 2.87-3.04 (m, 4H), 3.09 (q, J = 6.4 Hz, 2H), 3.38 (dd, J = 8.8, 4.4 Hz, 1H), 3.57 (ddd, J = 19.2, 12.8, 3.2 Hz, 1H), 3.89 (dd, J = 6.0, 2.4 Hz, 1H), 4.04 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 5.04 (s, 2H), 7.23-7.33 (m, 5H), 7.51 (t, J = 6.0 Hz, 1H),; 13C NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 14.1 (CH3), 14.2 (CH3), 22.7 (CH2), 27.0 (CH2), 27.5 (3xCH3), 29.4-29.7 (7xCH2), 31.9 (2xCH2), 33.5 (CH2), 39.2 (CH2), 47.0 (2xCH2), 60.0 (CH2), 60.4 (CH2), 65.1 (CH), 66.3 (CH2), 73.3 (C), 128.3-128.6 (5xCH), 136.3 (C), 171.6 (C), 172.4 (C), 172.5 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 613 (46) [M+Na]+, 591 (100) [M+H]+; HRMS (ESI+) m/z C34H59N2O6の計算値591.4373, 実測値591.4384.
化合物1.4
一般プロトコルF次いでK(しかしながら酸-塩基洗浄は行わず)に従うことにより、化合物1.2(59mg、0.13mmol)から化合物1.4(黄色油状物、17mg、0.05mmol、38%)を得た; 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ ppm 0.64 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 1.06-1.07 (m, 18H), 1.27-1.31 (m, 2H), 2.55 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.00 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.04-3.05 (m, 2H), 3.60 (dd, J = 8.0, 8.0 Hz, 1H), 3.69-3.77 (m, 2H); 13C NMR(100 MHz, MeOD) δ ppm 14.3 (CH3), 23.6 (CH2), 27.4 (CH2), 27.8 (CH2), 30.1 (CH2), 30.2 (CH2), 30.3 (CH2), 30.5 (CH2), 30.6 (3xCH2), 32.9 (CH2), 40.8 (CH2), 43.5 (CH2), 60.4 (CH), 60.9 (CH2), 167.0 (2xC); 質量(ESI+) m/z (%) 345 (100) [M+H]+; HRMS (ESI+) m/z C18H37N2O4の計算値345.2747, 実測値345.2746.
化合物1.5
一般プロトコルD1、F次いでK(しかしながら酸-塩基洗浄は行わず)に従うことにより、化合物1.3(300mg、0.50mmol)から化合物1.5(黄色油状物、147mg、0.35mmol、72%)を得た; 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ ppm 0.90 (t, 3H, J = 8.0 Hz), 1.22-1.37 (m, 22H), 1.53-1.57 (m, 2H), 2.90 (t, J = 8.0 Hz, 4H), 3.18-3.29 (m, 3H), 3.64 (m, J = 8.0 Hz, 4H), 4.08 (t, J = 4.0 Hz, 1H), 4.16-4.18 (m, 1H), 8.42 (t, J = 4.0 Hz, NH); 13C NMR (100 MHz, MeOD) δ ppm 14.5 (CH3), 17.9 (CH2), 23.8 (CH2), 24.3 (CH2), 28.1 (CH2), 29.8 (CH2), 30.2 (CH2), 30.5 (CH2), 30.6 (CH2), 30.8 (2xCH2), 33.2 (2xCH2), 41.0 (CH2), 54.9 (2xCH2), 59.4 (CH), 69.2 (CH2), 173.8 (3xC); 質量(ESI+) m/z (%) 417 (100) [M+H]+; HRMS (ESI+) m/z C21H41N2O6の計算値417.2959, 実測値417.2956.
(実施例3)
化合物2.1から2.3
i.TBTU、DIEA、DMF; ii.Et2NH、CH2Cl2; iii.RCOCl、DMAP、ピリジン、CH2Cl2; iv.RCOOH、TBTU、DIEA、DMF; v.H2、Pd/C、MeOH; vi.TFA、CH2Cl2。
(実施例2.1a)
一般プロトコルA(精製:シリカゲルカラムクロマトグラフィー、構成分子:シクロヘキサン/EtOAc 9:1から7:3)に従うことにより、市販されている化合物Fmoc-L-Ser(t-Bu)-OH(2.00g、5.22mmol)及びH-D-Asp(OBn)-OBn.p-トシレート(5.07g、10.43mmol)から化合物2.1a(白色固体、2.95g、4.34mmol、83%)を得た。
Rf=0.32(シクロヘキサン/EtOAc 7:3); Tm=115〜117℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.15 (s, 9H), 2.82-2.96 (m, 1H), 3.06 (dd, J = 17.1, 4.6 Hz, 1H), 3.38 (dd, J = 8.3, 8.3 Hz, 1H), 3.74-3.77 (m, 1H), 4.19-4.26 (m, 2H), 4.35-4.37 (m, 2H), 4.88-4.93 (m, 1H), 5.01 (s, 2H), 5.12 (s, 2H), 5.74 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 7.25-7.34 (m, 12H, H3''), 7.38 (dd, J = 7.5, 7.5 Hz, 2H), 7.59-7.61 (m, 2H), 7.65 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 7.5 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 27.5 (3xCH3), 36.6 (CH2), 47.3 (CH), 49.0 (CH), 54.8 (CH), 61.7 (CH2), 66.9 (CH2), 67.3 (CH2), 67.7 (CH2), 74.4 (C), 120.1 (2xCH), 125.3 (2xCH), 127.3 (2xCH), 127.9 (2xCH), 128.4 (CH), 128.5 (CH), 128.6 (CH), 128.6 (CH), 128.7 (CH), 135.3 (C), 135.5 (C), 141.5 (2xC), 143.9 (2xC), 156.2 (C), 170.3 (2xC), 170.6 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 426 (100), 701 (60) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C40H43N2O8の計算値679.3019, 実測値679.3013.
(実施例2.1b)
一般プロトコルA(変更:水を加えた後、所望の化合物は沈殿し、CH2Cl2/Et2O混合物中で再結晶することにより精製した)に従うことにより、市販されている化合物Fmoc-L-Ser(t-Bu)-OH(3.5g、9.12mmol)及びH-D-Glu(OBn)-OBn.p-トシレート(9g、18.24mmol)から化合物2.1b(白色固体、5.14g、7.42mmol、81%)を得た。
Rf=0.50(シクロヘキサン/EtOAc 7:3); Tm=126〜128℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.19 (s, 9H), 1.99-2.11 (m, 1H), 2.22-2.35 (m, 1H), 2.32-2.55 (m, 2H), 3.41 (dd, J = 8.3, 8.3 Hz, 1H), 3.75-3.87 (m, 1H), 4.23 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 4.24-4.33 (m, 1H), 4.40 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 4.68-4.76 (m, 1H), 5.09 (s, 2H), 5.17 (s, 2H), 5.78 (bs, 1H), 7.21-7.46 (m, 15H), 7.61 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.76 (d, J = 7.5 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 27.4 (3xCH3), 27.5 (CH2), 30.0 (CH2), 47.1 (CH), 51.8 (CH), 54.6 (CH), 61.7 (CH2), 66.5 (CH2), 67.2 (CH2), 67.4 (CH2), 74.3 (C), 120.0 (2xCH), 125.1 (2xCH), 127.1 (2xCH), 127.7 (2xCH), 128.2-128.7 (10xCH), 135.1 (C), 135.7 (C), 141.3 (2xC), 143.7 (2xC), 156.1 (C), 170.1 (C), 171.2 (C), 172.3 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 426 (100), 570 (3), 715 (1) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C41H45N2O8の計算値693.3176, 実測値693.3156.
(実施例2.2a)
一般プロトコルB次いでCに従うことにより、化合物2.1aから化合物2.2a(白色固体、105mg、0.16mmol、27%)を得た。
Rf=0.30(シクロヘキサン/EtOAc 7:3); Tm=59〜61℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.16 (s, 9H), 1.18-1.36 (m, 20H), 1.56-1.67 (m, 2H), 2.20 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.89 (dd, J = 17.1, 4.7 Hz, 1H), 3.07 (dd, J = 17.1, 4.7 Hz, 1H), 3.27 (dd, J = 8.6, 8.6 Hz, 1H), 3.79 (dd, J = 8.6, 4.1 Hz, 1H), 4.43-4.50 (m, 1H), 4.87-4.93 (m, 1H), 5.06 (s, 2H), 5.13 (s, 2H), 6.36 (d, J = 6.3 Hz, 1H, NH), 7.26-7.38 (m, 10H), 7.60 (d, J = 8.1 Hz, NH); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.2 (CH3), 22.8 (CH2), 25.6 (CH2), 27.4 (3xCH3), 29.4-29.8 (8xCH2), 32.0 (CH2), 36.5 (CH2), 36.7 (CH2), 48.9 (CH), 53.1 (CH), 61.3 (CH2), 66.9 (CH2), 67.6 (CH2), 74.3 (C), 128.5-128.8 (10xCH), 135.3 (C), 135.5 (C), 170.3 (C), 170.6 (C), 170.6 (C), 173.4 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 690 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C39H59N2O7の計算値667.4322, 実測値667.4318.
(実施例2.2b)
一般プロトコルB次いでCに従うことにより、化合物2.1bから化合物2.2b(白色固体、67mg、0.11mmol、39%)を得た。
Rf=0.35(シクロヘキサン/EtOAc 7:3); Tm=86℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.87 (t, 3H, J = 7.0 Hz), 1.17 (s, 9H), 1.23-1.38 (m, 8H), 1.57-1.72 (m, 2H), 1.98-2.11 (m, 1H), 2.19-2.35 (m, 3H), 2.35-2.53 (m, 2H), 3.38 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 3.78 (dd, J = 8.8, 4.2 Hz, 1H), 4.53-4.60 (m, 1H), 4.67-4.75 (m, 1H), 5.10 (s, 2H), 5.15 (s, 2H), 6.66 (d, J = 6.9 Hz, 1H, NH), 7.27-7.38 (m, 10H), 7.45 (d, J = 7.9 Hz, 1H, NH); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.1 (CH3), 22.6 (2xCH2), 27.4 (3xCH3), 27.5 (CH2), 29.0-30.0 (3xCH2), 31.7 (CH2), 36.6 (CH2), 51.8 (CH), 53.0 (CH), 61.3 (CH2), 66.5 (CH2), 67.41 (CH2), 74.4 (3xCH3), 128.3-128.7 (10xCH), 135.1 (C), 135.8 (C), 170.36 (C), 171.23 (C), 172.34 (C), 173.34 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 597 (100) [M+H]+; HRMS (ESI+) m/z C34H49N2O7の計算値597.3540, 実測値597.3538.
(実施例2.2c)
一般プロトコルB次いでCに従うことにより、化合物2.1bから化合物2.2c(白色固体、69mg、0.11mmol、39%)を得た。
Rf=0.38(シクロヘキサン/EtOAc 7:3); Tm=91℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.87 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 1.17 (s, 9H), 1.22-1.38 (m, 10H), 1.56-1.70 (m, 2H), 1.98-2.10 (m, 1H), 2.18-2.34 (m, 3H), 2.36-2.53 (m, 2H), 3.41 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 3.76 (dd, J = 8.9, 4.1 Hz, 1H), 4.57-4.64 (m, 1H), 4.68-4.76 (m, 1H), 5.09 (s, 2H), 5.14 (s, 2H), 6.75 (d, J = 6.9 Hz, 1H, NH), 7.26-7.38 (m, 10H), 7.53 (d, J = 7.9 Hz, 1H, NH); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.2 (CH3), 22.8 (2xCH2), 27.5 (3xCH3), 27.7 (CH2), 29.3-30.1 (4xCH2), 32.0 (CH2), 36.7 (CH2), 51.9 (CH), 53.1 (CH), 61.4 (CH2), 66.7 (CH2), 67.5 (CH2), 74.5 (C), 128.4-128.8 (10xCH), 135.2 (C), 135.9 (C), 170.5 (C), 171.3 (C), 172.5 (C), 173.5 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 633 (100) [M+H]+; HRMS (ESI+) m/z C35H51N2O7の計算値611.3696, 実測値611.3681.
(実施例2.2d)
一般プロトコルB次いでCに従うことにより、化合物2.1bから化合物2.2d(白色固体、195mg、0.31mmol、45%)を得た。
Rf=0.18(シクロヘキサン/EtOAc 7:3); Tm=82〜85℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.16 (s, 9H), 1.19-1.35 (m, 12H), 1.55-1.66 (m, 2H), 1.96-2.07 (m, 1H), 2.21 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.21-2.30 (m, 1H), 2.32-2.50 (m, 2H), 3.31 (dd, J = 8.7, 8.7 Hz, 1H), 3.80 (dd, J = 8.7, 4.2 Hz, 1H), 4.44-4.50 (m, 1H), 4.65-4.72 (m, 1H), 5.08 (s, 2H), 5.15 (s, 2H), 6.40 (d, J = 6.4 Hz, 1H, NH), 7.27-7.36 (m, 11H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.1 (CH3), 22.7 (2xCH2), 25.6 (CH2), 27.4 (3xCH3), 27.5 (CH2), 29.3-29.44 (4xCH2), 30.0 (CH2), 31.9 (CH2), 36.6 (CH2), 51.8 (CH), 53.0 (CH), 61.3 (CH2), 66.5 (CH2), 67.3 (CH2), 74.3 (C), 128.3-128.7 (10xCH), 135.2 (C), 135.8 (C), 170.4 (C), 171.2 (C), 172.3 (C), 173.3 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 626 (30) [M+H]+, 648 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C36H53N2O7の計算値625.3853, 実測値625.3846.
(実施例2.2e)
一般プロトコルB次いでCに従うことにより、化合物2.1bから化合物2.2e(白色固体、182mg、0.28mmol、48%)を得た。
Rf=0.12(シクロヘキサン/EtOAc 8:2); Tm=67〜69℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.17 (s, 9H), 1.19-1.35 (m, 16H), 1.56-1.67 (m, 2H), 1.96-2.08 (m, 1H), 2.21 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.21-2.32 (m, 1H), 2.32-2.50 (m, 2H), 3.30 (dd, J = 8.7, 8.7 Hz, 1H), 3.81 (dd, J = 8.7, 4.2 Hz, 1H), 4.42-4.49 (m, 1H), 4.64-4.72 (m, 1H), 5.09 (s, 2H), 5.16 (s, 2H), 6.38 (d, J = 6.3 Hz, 1H, NH), 7.23-7.39 (m, 11H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.2 (CH3), 22.8 (CH2), 25.6 (CH2), 27.5 (3xCH3), 27.6 (CH2), 29.4-29.7 (6xCH2), 30.0 (CH2), 32.0 (CH2), 36.7 (CH2), 51.9 (CH), 53.1 (CH), 61.4 (CH2), 66.6 (CH2), 67.5 (CH2), 74.4 (C), 128.4-128.8 (10xCH), 135.2 (C), 135.9 (C), 170.4 (C), 171.3 (C), 172.4 (C), 173.4 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 131 (30), 199 (40), 654 (50) [M+H]+, 677 (100), 699 (20); HRMS (ESI+) m/z C38H57N2O7の計算値653.4166, 実測値653.4158.
(実施例2.2f)
一般プロトコルB次いでCに従うことにより、化合物2.1bから化合物2.2f(白色固体、233mg、0.35mmol、50%)を得た。
Rf=0.24(シクロヘキサン/EtOAc 7:3); Tm=68〜71℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.17 (s, 9H), 1.20-1.36 (m, 18H), 1.55-1.67 (m, 2H), 1.96-2.08 (m, 1H), 2.21 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.21-2.32 (m, 1H), 2.32-2.50 (m, 2H), 3.31 (dd, J = 8.7, 8.7 Hz, 1H), 3.80 (dd, J = 8.7, 4.2 Hz, 1H), 4.44-4.50 (m, 1H), 4.63-4.73 (m, 1H), 5.08 (s, 2H), 5.15 (s, 2H), 6.41 (d, J = 6.4 Hz, 1H, NH), 7.25-7.37 (m, 11H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.1 (CH3), 22.7 (CH2), 25.5 (CH2), 27.4 (3xCH3), 27.5 (CH2), 29.3-29.7 (7xCH2), 29.9 (CH2), 31.9 (CH2), 36.5 (CH2), 51.8 (CH), 53.0 (CH), 61.3 (CH2), 66.5 (CH2), 67.3 (CH2), 74.2 (C), 128.3-128.6 (10xCH), 135.2 (C), 135.8 (C), 170.4 (C), 171.2 (C), 172.3 (C), 173.3 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 668 (20) [M+H]+, 690 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C39H59N2O7の計算値667.4322, 実測値667.4334.
(実施例2.2g)
一般プロトコルB次いでCに従うことにより、化合物2.1bから化合物2.2g(白色固体、187mg、0.27mmol、48%)を得た。
Rf=0.07(シクロヘキサン/EtOAc 8:2); Tm=71〜73℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.17 (s, 9H), 1.20-1.36 (m, 20H), 1.56-1.67 (m, 2H), 1.97-2.08 (m, 1H), 2.21 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.23-2.50 (m, 3H), 3.29 (dd, J = 8.7, 8.7 Hz, 1H), 3.80 (dd, J = 8.7, 4.2 Hz, 1H), 4.41-4.49 (m, 1H), 4.63-4.72 (m, 1H), 5.09 (s, 2H), 5.14 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 5.18 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 7.25-7.39 (m, 11H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.2 (CH3), 22.8 (CH2), 25.6 (CH2), 27.5 (3xCH3), 27.6 (CH2), 29.4-29.8 (8xCH2), 30.0 (CH2), 32.0 (CH2), 36.7 (CH2), 51.9 (CH), 53.1 (CH), 61.4 (CH2), 66.6 (CH2), 67.5 (CH2), 74.4 (C), 128.4-128.8 (10xCH), 135.2 (C), 135.8 (C), 170.5 (C), 171.3 (C), 172.4 (C), 173.4 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 131 (65), 199 (100), 682 (60) [M+H]+; HRMS (ESI+) m/z C40H61N2O7の計算値681.4479, 実測値681.4447.
(実施例2.2h)
一般プロトコルB次いでCに従うことにより、化合物2.1bから化合物2.2h(白色固体、93mg、0.13mmol、30%)を得た。Rf=0.11(シクロヘキサン/EtOAc 8:2); Tm=69〜71℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.15 (s, 9H), 1.19-1.31 (m, 24H), 1.56-1.63 (m, 2H), 1.96-2.05 (m, 1H), 2.19 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.23-2.47 (m, 3H), 3.27 (dd, J = 8.7, 8.7 Hz, 1H), 3.79 (dd, J = 8.7, 4.2 Hz, 1H), 4.41-4.45 (m, 1H), 4.63-4.68 (m, 1H), 5.07 (s, 2H), 5.14 (s, 2H), 7.22-7.37 (m, 10H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.3 (CH3), 22.9 (CH2), 25.7 (CH2), 27.6 (3xCH3), 27.7 (CH2), 29.5-30.2 (11xCH2), 32.1 (CH2), 36.8 (CH2), 52.0 (CH), 53.2 (CH), 61.5 (CH2), 66.7 (CH2), 67.6 (CH2), 74.6 (C), 128.5-128.9 (10xCH), 135.3 (C), 136.0 (C), 170.5 (C), 171.4 (C), 172.5 (C), 173.5 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 199 (15), 710 (100) [M+H]+, 732 (15) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C42H65N2O7の計算値709.4792, 実測値709.4805.
(実施例2.2i)
一般プロトコルA(精製:シリカゲルカラムクロマトグラフィー、溶出液:シクロヘキサン/EtOAc 9:1から7:3)に従うことにより、化合物2.1bから化合物2.2i(白色固体、162mg、0.24mmol、83%)を得た。
Rf=0.28(シクロヘキサン/EtOAc 7:3); Tm=70〜72℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.15 (s, 9H), 1.94-2.06 (m, 1H), 2.17-2.29 (m, 1H), 2.29-2.48 (m, 2H), 3.29 (dd, J = 8.6, 8.6 Hz, 1H), 3.78 (dd, J = 8.6, 4.1 Hz, 1H), 4.39-4.48 (m, 1H), 4.60-4.71 (m, 1H), 5.06 (s, 2H), 5.13 (s, 2H), 6.36 (d, J = 6.4 Hz, 1H, NH), 7.22-7.35 (m, 11H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 13.1 (st, JC,D = 18.6 Hz, CD3), 21.4 (qt, JC,D = 18.4 Hz, CD2), 24.5 (qt, JC,D = 19.2 Hz, CD2), 27.4 (3xCH3), 27.5 (CH2), 27.2-28.8 (6xCD2), 30.0 (CH2), 30.5 (qt, J = 18.7 Hz, CD2), 35.7 (qt, J = 19.5 Hz, CD2), 51.8 (CH), 53.0 (CH), 61.4 (CH2), 66.5 (CH2), 67.4 (CH2), 74.3 (C), 128.3-128.7 (10xCH), 135.2 (C), 135.8 (C), 170.4 (C), 171.2 (C), 172.3 (C), 173.4 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 199 (40), 265 (100), 677 (80) [M+H]+; HRMS (ESI+) m/z C38H34D23N2O7の計算値676.5610, 実測値676.5610.
(実施例2.3a)
一般プロトコルD1次いでKに従うことにより、化合物2.2aから化合物2.3a(白色固体、55mg、0.13mmol、98%)を得た。
Tm=125〜135℃; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0.90 (t, J = 6.2 Hz, 3H), 1.19-1.42 (m, 20H), 1.54-1.71 (m, 2H), 2.23-2.33 (m, 2H), 2.76-2.93 (m, 2H), 3.71-3.83 (m, 2H), 4.47 (dd, J = 5.4, 5.4 Hz, 1H), 4.74 (dd, J = 5.4, 5.4 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14.4 (CH3), 23.7 (CH2), 26.8 (CH2), 30.4-30.9 (8xCH2), 33.1 (CH2), 36.9 (CH2), 37.0 (CH2), 50.3 (CH), 56.7 (CH), 63.0 (CH2), 172.2 (C), 174.3 (C), 176.5 (C), 176.5 (C); 質量(ESI-) m/z (%) 429 (100) [M-H]-; HRMS (ESI-) m/z C21H37N2O7の計算値429.2601, 実測値429.2591.
(実施例2.3b)
一般プロトコルD1次いでKに従うことにより、化合物2.2bから化合物2.3b(吸湿性無色固体、27mg、0.07mmol、定量的)を得た。
Tm=39〜40℃; 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ ppm 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 1.23-1.39 (m, 8H), 1.57-1.67 (m, 2H), 1.90-2.02 (m, 1H), 2.16-2.32 (m, 3H), 2.40 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.72-3.84 (m, 2H), 4.42-4.50 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, MeOD) δ ppm 14.4 (CH3), 23.6 (CH2), 26.8 (CH2), 27.9 (CH2), 30.1-31.1 (3xCH2), 32.8 (CH2), 36.9 (CH2), 53.3 (CH), 56.7 (CH), 63.0 (CH2), 172.6 (C), 175.0 (C), 176.5 (C), 176.6 (C); 質量(ESI-) m/z (%) 360 (100) [M-H]-; HRMS (ESI-) m/z C16H27N2O7の計算値359.1818, 実測値359.1803.
(実施例2.3c)
一般プロトコルD1次いでKに従うことにより、化合物2.2cから化合物2.3c(吸湿性無色固体、31mg、0.08mmol、定量的)を得た。
Tm=46℃; 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ ppm 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 1.22-1.40 (m, 10H), 1.56-1.68 (m, 2H), 1.90-2.02 (m, 1H), 2.15-2.32 (m, 3H), 2.40 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 3.73-3.83 (m, 2H), 4.43-4.50 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, MeOD) δ ppm 14.4 (CH3), 23.7 (CH2), 26.8 (CH2), 27.9 (CH2), 30.2-31.1 (4xCH2), 33.0 (CH2), 36.9 (CH2), 53.3 (CH), 56.7 (CH), 63.0 (CH2), 172.6 (C), 175.1 (C), 176.5 (C), 176.6 (C); 質量(ESI-) m/z (%) 373 (100) [M-H]-; HRMS (ESI-) m/z C17H29N2O7の計算値373.1975, 実測値373.1992.
(実施例2.3d)
一般プロトコルD1次いでKに従うことにより、化合物2.2dから化合物2.3d(白色固体、182mg、0.47mmol、94%)を得た。
Tm=53〜57℃; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.22-1.38 (m, 12H), 1.56-1.69 (m, 2H), 1.90-2.03 (m, 1H), 2.14-2.26 (m, 1H), 2.29 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.36-2.43 (m, 2H), 3.73-3.84 (m, 2H), 4.42-4.52 (m, 2H). 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14.4 (CH3), 23.7 (CH2), 26.8 (CH2), 27.9 (CH2), 30.3-30.5 (4xCH2), 31.1 (CH2), 33.0 (CH2), 36.9 (CH2), 53.3 (CH), 56.6 (CH), 63.1 (CH2), 172.5 (C), 174.9 (C), 176.5 (C), 176.5 (C); 質量(ESI-) m/z (%) 387 (100) [M-H]-, 404 (20); HRMS (ESI-) m/z C18H31N2O7の計算値387.2131, 実測値387.2140.
(実施例2.3e)
一般プロトコルD1次いでKに従うことにより、化合物2.2eから化合物2.3e(白色固体、1.683g、4.04mmol、70%)を得た。
Tm=100〜102℃; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0.90 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.22-1.38 (m, 16H), 1.57-1.67 (m, 2H), 1.91-2.01 (m, 1H), 2.15-2.26 (m, 1H), 2.29 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.37-2.44 (m, 2H), 3.72-3.81 (m, 2H), 4.43-4.51 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14.4 (CH3), 23.7 (CH2), 26.8 (CH2), 27.9 (CH2), 30.4-30.7 (6xCH2), 31.0 (CH2), 33.1 (CH2), 36.9 (CH2), 53.1 (CH), 56.6 (CH), 63.1 (CH2), 172.6 (C), 174.6 (C), 176.4 (C), 176.5 (C); 質量(ESI-) m/z (%)157 (40), 199 (30), 387 (80), 415 (100) [M-H]-; HRMS (ESI-) m/z C20H35N2O7の計算値415.2444, 実測値415.2447.
(実施例2.3f)
一般プロトコルD1次いでKに従うことにより、化合物2.2fから化合物2.3f(白色固体、115mg、0.27mmol、89%)を得た。
Tm=58〜63℃; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.21-1.41 (m, 16H), 1.54-1.68 (m, 2H), 1.90-2.04 (m, 1H), 2.14-2.27 (m, 1H), 2.29 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.36-2.48 (m, 2H), 3.71-3.83 (m, 2H), 4.43-4.53 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14.4 (CH3), 23.7 (CH2), 26.8 (CH2), 27.8 (CH2), 30.3-30.9 (7xCH2), 31.0 (CH2), 33.0 (CH2), 36.9 (CH2), 53.1 (CH), 56.6 (CH), 63.1 (CH2), 172.6 (C), 174.6 (C), 176.4 (C), 176.5 (C); 質量(ESI-) m/z (%) 429 (100) [M-H]-, 446; HRMS (ESI-) m/z C21H37N2O7の計算値429.2601, 実測値429.2599.
(実施例2.3g)
一般プロトコルD1次いでKに従うことにより、化合物2.2gから化合物2.3g(白色固体、57mg、0.13mmol、定量的)を得た。
Tm=109〜112℃; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.19-1.39 (m, 20H), 1.57-1.67 (m, 2H), 1.90-2.02 (m, 1H), 2.16-2.26 (m, 3H), 2.29 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.36-2.45 (m, 2H), 3.71-3.84 (m, 2H), 4.43-4.52 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14.4 (CH3), 23.7 (CH2), 26.8 (CH2), 27.9 (CH2), 30.4-30.9 (8xCH2), 31.1 (CH2), 33.0 (CH2), 36.9 (CH2), 53.3 (CH), 56.6 (CH), 63.1 (CH2), 172.6 (C), 174.9 (C), 176.5 (C), 176.5 (C). 質量(ESI-) m/z (%) 443 (100) [M-H]-; HRMS (ESI-) m/z C22H39N2O7の計算値443.2757, 実測値443.2754.
(実施例2.3h)
一般プロトコルD1次いでKに従うことにより、化合物2.2hから化合物2.3h(白色固体、36mg、0.08mmol、65%)を得た。
Tm=111〜113℃; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.19-1.37 (m, 24H), 1.55-1.68 (m, 2H), 1.90-2.03 (m, 1H), 2.15-2.26 (m, 1H), 2.29 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.36-2.44 (m, 2H), 3.72-3.82 (m, 2H), 4.43-4.52 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14.4 (CH3), 23.7 (CH2), 26.8 (CH2), 27.9 (CH2), 30.4-30.8 (10xCH2), 31.1 (CH2), 33.1 (CH2), 36.9 (CH2), 53.2 (CH), 56.6 (CH), 63.1 (CH2), 172.6 (C), 174.7 (C), 176.5 (C), 176.5 (C); 質量(ESI-) m/z (%) 471 (100) [M-H]-; HRMS (ESI-) m/z C24H43N2O7の計算値471.3070, 実測値471.3057.
(実施例2.3i)
一般プロトコルD1次いでKに従うことにより、化合物2.2iから化合物2.3i(白色固体、33mg、0.08mmol、75%)を得た。
Tm>80℃(分解); 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 1.90-2.03 (m, 1H), 2.14-2.27 (m, 1H), 2.33-2.48 (m, 2H), 3.72-3.84 (m, 2H), 4.41-4.54 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ ppm 13.3 (st, JC,D = 19.8 Hz, CD3), 22.4 (qt, JC,D = 19.6, Hz, CD2), 25.7 (qt, JC,D = 20.2 Hz, CD2), 27.9 (CH2), 28.6-29.9 (6xCD2), 31.1 (CH2), 31.7 (qt, JC,D = 16.9 Hz, CD2), 36.1 (qt, JC,D = 21.1 Hz, CD2), 53.2 (CH), 56.6 (CH), 63.1 (CH2), 172.6 (C), 174.8 (C), 176.5 (C), 176.6 (C); 質量(ESI-) m/z (%) 438 (100) [M-H]-; HRMS (ESI-) m/z C20H12D23N2O7の計算値438.3888, 実測値438.3889.
(実施例4)
化合物3.1から3.9
i.アリル又はプロパルギルブロミド、NaH、DMF; ii.H-D-Glu(OBn)-OBn.p-トシレート又はH-L-Glu(OBn)-Gly-OBn、TBTU、DIEA、DMF; iii.TFA、CH2Cl2; iv.R3COCl、DMAP、ピリジン、CH2Cl2; vi.アジドサッカリド(酢酸塩)又はPEG-N3若しくはN3-PEG-N3、CuSO4.5H2O、アスコルビン酸ナトリウム、DMF、H2O; vii.MeONa、MeOH次いでDowex; viii.LiOH、THF/H2O; ix.H2,Pd/C、MeOH。R1=Ac-サッカリド又はPEG; R1a=サッカリド又はPEGR2=-OBn又は-NHCH2COOBn; R2a=-OH又は-NHCH2COOH; R3=-(CH2)nCH3、-CH[(CH2)nCH3]2又は-(CH2)nシクロヘキシルを用いる。
化合物3.1b
臭化プロパルギルを使用し、上記プロトコル(実施例3.1a)に従って、生成物3.1b(黄色がかった油状物、915mg、3.76mmol、77%)を得た。得られた粗生成物(無色油状物)を引き続くステップに直接使用する。
化合物3.2b
一般プロトコルA(精製:シリカゲルカラムクロマトグラフィー、溶出液:シクロヘキサン/EtOAc 9:1から7:3)に従うことにより、化合物3.1aから化合物3.2b(黄色がかった油状物、1.91g、3.45mmol、77%)を得た。
Rf=0.33(シクロヘキサン/EtOAc 7:3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.44 (s, 9H), 1.95-2.08 (m, 1H), 2.22-2.32 (m, 1H), 2.32-2.53 (m, 3H), 3.66 (dd, J = 9.3, 6.1 Hz, 1H), 3.87 (dd, J = 9.3, 4.0 Hz, 1H), 4.08 (dd, J = 15.9, 2.4 Hz, 1H), 4.15 (dd, J = 15.9, 2.4 Hz, 1H), 4.25-4.38 (m, 1H), 4.66-4.74 (m, 1H), 5.08 (s, 2H), 5.15 (s, 2H), 5.38 (s, 1H, NH), 6.98 (d, J = 7.9 Hz, 1H, NH), 7.26-7.39 (m, 10H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 27.4 (CH2), 28.3 (3xCH3), 30.0 (CH2), 51.7 (CH), 54.0 (CH), 58.6 (CH2), 66.5 (CH2), 67.4 (CH2), 69.3 (CH2), 75.4 (CH), 79.0 (C), 80.4 (C), 128.3-128.7 (10xCH), 135.2 (C), 135.8 (C), 155.6 (C), 170.0 (C), 171.4 (C), 172.5 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 453 (40), 497 (35), 553 (100) [M+H]+; HRMS (ESI+) m/z C30H37N2O8の計算値553.2550, 実測値553.2528.
化合物3.2c
一般プロトコルA(精製:シリカゲルカラムクロマトグラフィー、溶出液:シクロヘキサン/EtOAc 9:1から7:3)に従うことにより、化合物3.1b及びH-L-Glu(OBn)-Gly-OBn(記載していない)から化合物3.2c(黄色がかった油状物、886mg、1.45mmol、65%)を得た。
Rf=0.28(シクロヘキサン/EtOAc 5:5); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.43 (s, 9H), 1.99-2.13 (m, 1H), 2.15-2.27 (m, 1H), 2.39 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 2.42-2.54 (m, 1H), 2.54-2.66 (m, 1H), 3.69 (dd, J = 9.2, 5.6 Hz, 1H), 3.86 (dd, J = 9.3, 4.4 Hz, 1H), 3.95 (dd, J = 17.9, 5.1 Hz, 1H), 4.12 (dd, J = 17.9, 6.0 Hz, 1H), 4.09 (dd, J = 15.8, 2.4 Hz, 1H), 4.14 (dd, J = 15.8, 2.4 Hz, 1H), 4.22-4.32 (m, 1H), 4.52-4.61 (m, 1H), 5.11 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 5.12 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 5.14 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 5.17 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 5.41 (d, J = 5.3 Hz, 1H, NH), 7.15 (bs, 1H, NH), 7.28-7.43 (m, 10H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 26.9 (CH2), 28.4 (3xCH3), 30.5 (CH2), 52.9 (CH), 54.7 (CH), 58.8 (CH2), 66.8 (CH2), 67.2 (CH2), 69.5 (CH2), 75.6 (CH), 78.9 (C), 80.8 (C), 128.4-128.7 (10xCH), 135.4 (C), 135.8 (C), 155.9 (C), 169.5 (C), 170.3 (C), 171.2 (C), 174.0 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 610 (15) [M+H]+, 632 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C32H40N3O9の計算値610.2765, 実測値610.2764.
化合物3.3d
一般プロトコルG次いでCに従うことにより、化合物3.2bから化合物3.3d(白色固体、813mg、1.34mmol、67%)を得た。
Rf=0.13(シクロヘキサン/EtOAc 7:3); Tm=93〜94℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.19-1.35 (m, 12H), 1.56-1.67 (m, 2H), 1.97-2.10 (m, 1H), 2.16-2.32 (m, 3H), 2.32-2.51 (m, 3H), 3.62 (dd, J = 9.2, 6.6 Hz, 1H), 3.88 (dd, J = 9.2, 4.0 Hz, 1H), 4.10 (dd, J = 16.0, 2.4 Hz, 1H), 4.18 (dd, J = 16.0, 2.4 Hz, 1H), 4.58-4.72 (m, 2H), 5.09 (s, 2H), 5.15 (s, 2H), 6.32 (d, J = 7.0 Hz, 1H, NH), 7.02 (d, J = 7.8 Hz, 1H, NH), 7.28-7.40 (m, 10H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.2 (CH3), 22.8 (CH2), 25.6 (CH2), 27.3 (CH2), 29.4-29.5 (4xCH2), 30.1 (CH2), 32.0 (CH2), 36.7 (CH2), 52.0 (CH), 52.4 (CH), 58.7 (CH2), 66.7 (CH2), 67.5 (CH2), 69.0 (CH2), 75.5 (CH), 79.0 (C), 128.4-128.8 (10xCH), 135.2 (C), 135.9 (C), 169.8 (C), 171.3 (C), 172.6 (C), 173.5 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 491 (100), 608 (20) [M+H]+, 630 (95) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C35H47N2O7の計算値607.3383, 実測値607.3373.
化合物3.3e
一般プロトコルG次いでCに従うことにより、化合物3.2bから化合物3.3e(白色固体、651mg、1.03mmol、77%)を得た。
Rf=0.16(シクロヘキサン/EtOAc 7:3); Tm=99〜100℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.19-1.35 (m, 16H), 1.56-1.67 (m, 2H), 1.96-2.09 (m, 1H), 2.16-2.31 (m, 3H), 2.32-2.50 (m, 3H), 3.62 (dd, J = 9.2, 6.6 Hz, 1H), 3.89 (dd, J = 9.2, 4.0 Hz, 1H), 4.10 (dd, J = 16.0, 2.4 Hz, 1H), 4.18 (dd, J = 16.0, 2.4 Hz, 1H), 4.59-4.72 (m, 2H), 5.09 (s, 2H), 5.15 (s, 2H), 6.32 (d, J = 7.0 Hz, 1H, NH), 7.02 (d, J = 7.8 Hz, 1H, NH), 7.27-7.39 (m, 10H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.2 (CH3), 22.8 (CH2), 25.6 (CH2), 27.3 (CH2), 29.4-29.7 (6xCH2), 30.1 (CH2), 32.0 (CH2), 36.7 (CH2), 52.0 (CH), 52.4 (CH), 58.7 (CH2), 66.7 (CH2), 67.5 (CH2), 69.0 (CH2), 75.5 (CH), 79.0 (C), 128.4-128.8 (10xCH), 135.2 (C), 135.9 (C), 169.8 (C), 171.3 (C), 172.6 (C), 173.5 (C1'); 質量(ESI+) m/z (%) 636 (25) [M+H]+, 658 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C37H51N2O7の計算値635.3696, 実測値635.3697.
化合物3.3f
一般プロトコルG次いでCに従うことにより、化合物3.2bから化合物3.3f(白色固体、1.085g、1.64mmol、84%)を得た。
Rf=0.21(シクロヘキサン/EtOAc 7:3); Tm=101〜103℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.17-1.37 (m, 20H), 1.56-1.66 (m, 2H), 1.97-2.08 (m, 1H), 2.14-2.32 (m, 3H), 2.32-2.50 (m, 3H), 3.62 (dd, J = 9.2, 6.6 Hz, 1H), 3.89 (dd, J = 9.2, 4.1 Hz, 1H), 4.10 (dd, J = 16.0, 2.4 Hz, 1H), 4.17 (dd, J = 16.0, 2.4 Hz, 1H), 4.62-4.72 (m, 2H), 5.09 (s, 2H), 5.15 (s, 2H), 6.39 (d, J = 7.1 Hz, 1H, NH), 7.10 (d, J = 7.9 Hz, 1H, NH), 7.28-7.39 (m, 10H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.2 (CH3), 22.8 (CH2), 25.6 (CH2), 27.2 (CH2), 29.4-29.8 (8xCH2), 30.1 (CH2), 32.0 (CH2), 36.6 (CH2), 51.9 (CH), 52.4 (CH), 58.7 (CH2), 66.6 (CH2), 67.5 (CH2), 69.0 (CH2), 75.5 (CH), 79.0 (C), 128.4-128.8 (10xCH), 135.2 (C), 135.8 (C), 169.8 (C), 171.3 (C), 172.6 (C), 173.5 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 199 (15), 664 (100) [M+H]+, 686 (20) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C39H55N2O7の計算値663.4009, 実測値663.4006.
化合物3.3g
一般プロトコルG次いでCに従うことにより、化合物3.2bから化合物3.3g(白色固体、467mg、0.64mmol、47%)を得た。
Rf=0.18(シクロヘキサン/EtOAc 7:3); Tm=105〜108℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.18-1.36 (m, 30H), 1.56-1.68 (m, 2H), 1.96-2.09 (m, 1H), 2.15-2.32 (m, 3H), 2.33-2.50 (m, 3H), 3.62 (dd, J = 9.2, 6.6 Hz, 1H), 3.89 (dd, J = 9.2, 4.0 Hz, 1H), 4.10 (dd, J = 16.0, 2.4 Hz, 1H), 4.17 (dd, J = 16.0, 2.4 Hz, 1H), 4.60-4.72 (m, 2H), 5.09 (s, 2H), 5.15 (s, 2H), 6.35 (d, J = 7.0 Hz, 1H, NH), 7.05 (d, J = 7.9 Hz, 1H, NH), 7.29-7.39 (m, 10H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.2 (CH3), 22.8 (CH2), 25.6 (CH2), 27.2 (CH2), 29.4-29.8 (13xCH2), 30.1 (CH2), 32.0 (CH2), 36.6 (CH2), 52.0 (CH), 52.4 (CH), 58.7 (CH2), 66.6 (CH2), 67.5 (CH2), 69.0 (CH2), 75.5 (CH), 79.0 (C); 128.4-128.8 (10xCH), 135.2 (C), 135.8 (C), 169.8 (C), 171.3 (C), 172.6 (C), 173.6 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 734 (55) [M+H]+, 756 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C44H64N2O7Naの計算値755.4611, 実測値755.4612.
化合物3.3h
一般プロトコルG次いでCに従うことにより、化合物3.2bから化合物3.3h(白色固体、206mg、0.32mmol、65%)を得た。
Rf=0.38(シクロヘキサン/EtOAc 7:3); Tm=87〜90℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.84 (t, J = 6.7 Hz, 3H), 0.86 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 1.15-1.32 (m, 12H), 1.32-1.46 (m, 2H), 1.51-1.67 (m, 2H), 1.94-2.14 (m, 2H), 2.37 (dd, J = 2.4, 2.4 Hz, 1H), 2.21-2.50 (m, 3H), 3.63 (dd, J = 9.2, 6.3 Hz, 1H), 3.89 (dd, J = 9.2, 4.7 Hz, 1H), 4.09 (dd, J = 16.0, 2.4 Hz, 1H), 4.14 (dd, J = 16.0, 2.4 Hz, 1H), 4.65-4.77 (m, 2H), 5.08 (s, 2H), 5.11 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 5.15 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 6.44 (d, J = 7.1 Hz, 1H, NH), 7.16 (d, J = 8.0 Hz, 1H, NH), 7.24-7.37 (m, 10H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.0 (2xCH3), 22.4 (CH2), 22.5 (CH2), 27.2, 27.2 (2xCH2), 27.4 (CH2), 29.9 (CH2), 31.8 (CH2), 31.9 (CH2), 32.8 (CH2), 32.9 (CH2), 47.7 (CH), 51.6 (CH), 52.2 (CH), 58.5 (CH2), 66.4 (CH2), 67.3 (CH2), 69.1 (CH2), 75.4 (CH), 78.9 (C), 128.2-128.6 (10xCH), 135.1 (C), 135.8 (C), 169.6 (C), 171.1 (C), 172.3 (C), 176.3 (C). 質量(ESI+) m/z (%) 413 (30), 635 (40) [M+H]+, 657 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C37H50N2O7Naの計算値657.3516, 実測値657.3532.
化合物3.3i
一般プロトコルG次いでCに従うことにより、化合物3.2bから化合物3.3i(白色固体、361mg、0.43mmol、40%)を得た。
Rf=0.52(シクロヘキサン/EtOAc 7:3); Tm=91〜93℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.11-1.33 (m, 40H), 1.35-1.47 (m, 2H), 1.50-1.65 (m, 2H), 1.94-2.14 (m, 2H), 2.37 (dd, J = 2.4, 2.4 Hz, 1H), 2.21-2.50 (m, 3H), 3.62 (dd, J = 9.2, 6.6 Hz, 1H), 3.90 (dd, J = 9.2, 4.0 Hz, 1H), 4.10 (dd, J = 16.0, 2.4 Hz, 1H), 4.18 (dd, J = 16.0, 2.4 Hz, 1H), 4.62-4.75 (m, 2H), 5.09 (s, 2H), 5.15 (s, 2H), 6.34 (d, J = 7.0 Hz, 1H, NH), 7.01 (d, J = 7.9 Hz, 1H, NH), 7.26-7.38 (m, 10H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.2 (2xCH3), 22.8 (2xCH2), 27.5 (CH2), 27.7 (2xCH2), 29.5-30.0 (16xCH2), 32.0 (CH2), 32.9 (CH2), 33.1 (CH2), 47.9 (CH), 51.8 (CH), 52.2 (CH), 58.6 (CH2), 66.6 (CH2), 67.5 (CH2), 69.0 (CH2), 75.5 (CH), 79.0 (C), 128.4-128.7 (10xCH), 135.2 (C), 135.8 (C), 169.6 (C), 171.2 (C), 172.4 (C), 176.5 (C). 質量(ESI+) m/z (%) 853 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C51H78N2O7Naの計算値853.5707, 実測値853.5693.
化合物3.3j
一般プロトコルG次いでCに従うことにより、化合物3.2bから化合物3.3j(白色固体、337mg、0.54mmol、66%)を得た。
Rf=0.13(シクロヘキサン/EtOAc 7:3); Tm=100〜102℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.76-0.91 (m, 2H), 1.05-1.24 (m, 6H), 1.23-1.35 (m, 2H), 1.53-1.73 (m, 7H), 1.94-2.08 (m, 1H), 2.13-2.31 (m, 3H), 2.31-2.52 (m, 3H), 3.62 (dd, J = 9.2, 6.5 Hz, 1H), 3.89 (dd, J = 9.2, 4.1 Hz, 1H), 4.09 (dd, J = 16.0, 2.4 Hz, 1H), 4.16 (dd, J = 16.0, 2.4 Hz, 1H), 4.61-4.72 (m, 2H), 5.09 (s, 2H), 5.13 (s, 2H), 6.38 (d, J = 7.1 Hz, 1H, NH), 7.11 (d, J = 7.9 Hz, 1H, NH), 7.28-7.39 (m, 10H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 25.9 (CH2), 26.5 (2xCH2), 26.6 (CH2), 26.8 (CH2), 27.2 (CH2), 30.1 (CH2), 33.4 (2xCH2), 36.6 (CH2), 37.2 (CH2), 37.5 (CH), 51.9 (CH), 52.3 (CH), 58.6 (CH2), 66.6 (CH2), 67.4 (CH2), 69.0 (CH2), 75.4 (CH), 79.0 (C), 128.3-128.7 (10xCH), 135.2 (C), 135.8 (C), 169.8 (C), 171.2 (C), 172.6 (C), 173.5 (C). 質量(ESI+) m/z (%) 619 (60) [M+H]+, 641 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C36H46N2O7Naの計算値641.3203, 実測値641.3199.
化合物3.3k
一般プロトコルG次いでCに従うことにより、化合物3.2cから化合物3.3k(白色固体、506mg、0.70mmol、72%)を得た。
Rf=0.19(シクロヘキサン/EtOAc 5:5); Tm=122〜123℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.15-1.35 (m, 20H), 1.54-1.69 (m, 2H), 2.01-2.29 (m, 4H), 2.39 (dd, J = 2.4, 2.4 Hz, 1H), 2.43-2.66 (m, 2H), 3.67 (dd, J = 9.3, 6.0 Hz, 1H), 3.89 (dd, J = 9.3, 4.3 Hz, 1H), 3.96 (dd, J = 17.9, 5.4 Hz, 1H), 4.10 (dd, J = 15.8, 2.4 Hz, 1H), 4.14 (dd, J = 17.9, 6.2 Hz, 1H), 4.15 (dd, J = 15.8, 2.4 Hz, 1H), 4.54-4.63 (m, 2H), 5.11 (s, 2H), 5.12 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 5.16 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 6.45 (d, J = 6.8 Hz, 1H, NH), 7.21 (dd, J = 6.2, 5.4 Hz, 1H, NH), 7.28-7.38 (m, 10H), 7.57 (d, J = 7.7 Hz, 1H, NH); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.2 (CH3), 22.8 (CH2), 25.6 (CH2), 26.7 (CH2), 29.4-29.8 (8xCH2), 30.5 (CH2), 32.0 (CH2), 36.5 (CH2), 41.4 (CH2), 53.0 (CH), 53.1 (CH), 58.8 (CH2), 66.8 (CH2), 67.2 (CH2), 69.4 (CH2), 75.6 (CH), 78.9 (C), 128.3-128.7 (10xCH), 135.4 (C), 135.7 (C), 169.6 (C), 170.0 (C), 171.1 (C), 173.9 (C), 174.2 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 720 (20) [M+H]+, 742 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C41H57N3O8Naの計算値742.4043, 実測値742.4042.
化合物3.5a
一般プロトコルIに従うことにより、化合物3.3dから化合物3.5a(黄色がかった油状物、541mg、0.53mmol、71%)を得た。
Rf=0.07(CH2Cl2/EtOAc 1:1); 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 3H), 1.20-1.36 (m, 12H), 1.54-1.65 (m, 2H), 1.91 (s, 3H), 1.93 (s, 3H), 1.99 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.96-2.09 (m, 1H), 2.15-2.30 (m, 3H), 2.34-2.48 (m, 2H), 3.68 (dd, J = 9.5, 5.4 Hz, 1H), 3.77 (dd, J = 9.5, 5.1 Hz, 1H), 3.85 (ddd, J = 9.6, 4.7, 1.8 Hz, 1H), 3.90-3.99 (m, 1H), 4.12 (dd, J = 12.5, 1.8 Hz, 1H), 4.12-4.20 (m, 1H), 4.26 (dd, J = 12.5, 4.7 Hz, 1H), 4.45-4.69 (m, 6H), 4.66 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.90 (dd, J = 9.5, 8.0 Hz, 1H), 5.01 (dd, J = 9.6, 9.6 Hz, 1H), 5.09 (s, 2H), 5.12 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 5.17 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 5.23 (dd, J = 9.6, 9.6 Hz, 1H), 7.24-7.40 (m, 10H), 7.83 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14.5 (CH3), 20.6 (2xCH3), 20.7 (2xCH3), 23.7 (CH2), 26.8 (CH2), 27.6 (CH2), 30.3, 30.4, 30.5, 30.6 (4xCH2), 31.0 (CH2), 33.0 (CH2), 36.8 (CH2), 51.3 (CH2), 53.1 (CH), 54.5 (CH), 63.0 (CH2), 65.2 (CH2), 67.4 (CH2), 68.0 (CH2), 69.0 (CH2), 69.7 (CH), 70.9 (CH2), 72.5 (CH), 72.9 (CH), 74.0 (CH), 101.6 (CH), 125.8 (CH), 129.2-129.6 (10xCH), 137.1 (C), 137.5 (C), 145.4 (C), 171.1 (2xC), 171.5 (C), 172.2 (2xC), 172.6 (C), 174.0 (C), 176.2 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 1047 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C51H70N5O17の計算値1024.4767, 実測値1024.4784.
化合物3.5b
一般プロトコルIに従うことにより、化合物3.3eから化合物3.5b(黄色がかった油状物、181mg、0.17mmol、72%)を得た。
Rf=0.11(CH2Cl2/EtOAc 1:1); 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.20-1.36 (m, 12H), 1.54-1.65 (m, 2H), 1.91 (s, 3H), 1.93 (s, 3H), 1.99 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.94-2.06 (m, 1H), 2.15-2.31 (m, 3H), 2.36-2.44 (m, 2H), 3.65-3.73 (m, 1H), 3.73-3.81 (m, 1H), 3.85 (ddd, J = 10.0, 4.7, 2.4 Hz, 1H), 3.91-3.99 (m, 1H), 4.12 (dd, J = 12.4, 2.4 Hz, 1H), 4.14-4.20 (m, 1H), 4.26 (dd, J = 12.4, 4.7 Hz, 1H), 4.48-4.64 (m, 6H), 4.66 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.89 (dd, J = 9.7, 8.0 Hz, 1H), 5.01 (dd, J = 10.1, 9.7 Hz, 1H), 5.09 (s, 2H), 5.12 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 5.17 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 5.23 (dd, J = 9.7, 9.7 Hz, 1H), 7.26-7.37 (m, 10H), 7.83 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14.5 (CH3), 20.6 (2xCH3), 20.7 (2xCH3), 23.7 (CH2), 26.8 (CH2), 27.6 (CH2), 30.3-30.7 (6xCH2), 31.0 (CH2), 33.0 (CH2), 36.8 (CH2), 51.2 (CH2), 53.2 (CH), 54.5 (CH), 63.0 (CH2), 65.2 (CH2), 67.4 (CH2), 68.0 (CH2), 69.0 (CH2), 69.7 (CH), 70.9 (CH2), 72.5 (CH), 72.9 (CH), 74.0 (CH), 101.6 (CH), 125.8 (CH), 129.2-129.6 (10xCH), 137.1 (C), 137.5 (C), 145.3 (C), 171.1 (C), 171.2 (C), 171.5 (C), 172.2 (C), 172.6 (C), 174.0 (C), 176.2 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 1075 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C53H74N5O17の計算値1052.5080, 実測値1052.5117.
化合物3.5c
一般プロトコルIに従うことにより、化合物3.3fから化合物3.5c(黄色がかった油状物、568mg、0.53mmol、77%)を得た。
Rf=0.08(CH2Cl2/EtOAc 1:1); 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.21-1.34 (m, 20H), 1.53-1.65 (m, 2H); 1.91, 1.93, 1.99, 2.02 (s, 12H), 1.86-1.99 (m, 1H), 2.15-2.31 (m, 3H), 2.34-2.48 (m, 2H), 3.69 (dd, J = 9.6, 5.4 Hz, 1H), 3.77 (dd, J = 9.6, 5.1 Hz, 1H), 3.85 (ddd, J = 10.1, 4.7, 2.4 Hz, 1H), 3.92-3.99 (m, 1H), 4.12 (dd, J = 12.3, 2.4 Hz, 1H), 4.13-4.20 (m, 1H), 4.26 (dd, J = 12.3, 4.7 Hz, 1H), 4.47-4.64 (m, 6H), 4.66 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.88 (dd, J = 9.5, 7.9 Hz, 1H), 5.01 (dd, J = 10.1, 9.5 Hz, 1H), 5.10 (s, 2H), 5.11-5.20 (m, 2H), 5.23 (dd, J = 9.5, 9.5 Hz, 1H), 7.27-7.37 (m, 10H), 7.84 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14.5 (CH3), 20.6 (CH3), 20.7 (2xCH3), 20.9 (CH3), 23.7 (CH2), 26.8 (CH2), 27.6 (CH2), 30.4-30.8 (8xCH2), 33.1 (CH2), 31.0 (CH2), 36.8 (CH2), 51.3 (CH2), 53.2 (CH), 54.6 (CH), 61.5 (CH2), 65.2 (CH2), 67.4 (CH2), 68.0 (CH2), 69.0 (CH2), 69.7 (CH), 70.9 (CH2), 72.6 (CH), 72.9 (CH), 74.0 (CH), 101.6 (CH), 125.8 (CH), 129.2-129.6 (10xCH), 137.2 (C), 137.5 (C), 145.4 (C), 171.1 (C), 171.2 (C), 171.5 (C), 172.3 (C), 172.6 (C), 173.0 (C), 174.1 (C), 176.3 (C); 質量(ESI+) m/z (%)130 (35), 199 (40), 1081 (100) [M+H]+; HRMS (ESI+) m/z C55H78N5O17の計算値1080.5393, 実測値1080.5375.
化合物3.5d
一般プロトコルIに従うことにより、化合物3.3fから化合物3.5d(白色固体、160mg、0.14mmol、87%)を得た。
Rf=0.09(CH2Cl2/EtOAc 1:1); Tm=58〜60℃; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0.83 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.08-1.30 (m, 30H), 1.49-1.64 (m, 2H), 1.87, 1.93, 1.96, 2.02 (s, 12H), 1.86-1.99 (m, 1H), 2.11-2.85 (m, 3H), 2.26-2.45 (m, 2H), 3.51-3.60 (m, 1H), 3.66 (ddd, J = 10.1, 4.7, 1.9 Hz, 1H), 3.78-3.97 (m, 2H), 4.08 (dd, J = 12.4, 1.9 Hz, 1H), 4.11-4.18 (m, 1H), 4.21 (dd, J = 12.4, 4.7 Hz, 1H), 4.33-4.69 (m, 6H), 4.43 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.95 (dd, J = 9.5, 8.0 Hz, 1H), 5.03 (dd, J = 10.1, 9.5 Hz, 1H), 5.03 (s, 2H), 5.10 (s, 2H), 5.13 (dd, J = 9.5, 9.5 Hz, 1H), 6.80 (bs, 1H), 7.18-7.35 (m, 10H), 7.39 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.58 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14.1 (CH3), 20.5, 20.5, 20.5 (3xCH3), 20.6 (CH3), 22.6 (CH2), 25.5 (CH2), 26.9 (CH2), 29.3-29.6 (13xCH2), 30.0 (CH2), 31.8 (CH2), 36.3 (CH2), 49.9 (CH2), 51.8 (CH), 52.5 (CH), 61.7 (CH2), 64.6 (CH2), 66.4 (CH2), 67.1 (CH2), 67.7 (CH2), 68.1 (CH), 69.7 (CH2), 70.9 (CH), 71.9 (CH), 72.4 (CH), 100.4 (CH), 124.0 (CH), 128.1-128.5 (10xCH), 135.2 (C), 135.8 (C), 144.1 (C), 169.3 (C), 169.5 (C), 170.0 (C), 170.0 (C), 170.5 (C), 171.2 (C), 172.4 (C), 173.5 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 1151 (100) [M+H]+; HRMS (ESI+) m/z C60H88N5O17の計算値1150.6175, 実測値1150.6163.
化合物3.5e
一般プロトコルIに従うことにより、化合物3.3fから化合物3.5e(白色固体、302mg、0.22mmol、74%)を得た。
Rf=0.06(CH2Cl2/EtOAc 1:1); Tm=78〜80℃; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.22-1.37 (m, 20H), 1.54-1.65 (m, 2H), 1.89, 1.96, 1.98, 2.00, 2.01, 2.05, 2.09 (s, 21H), 1.91-2.03 (m, 1H), 2.15-2.29 (m, 3H), 2.39-2.42 (m, 2H), 3.68 (dd, J = 9.6, 5.5 Hz, 1H), 3.76 (dd, J = 9.6, 5.1 Hz, 1H), 3.79-3.83 (m, 1H), 3.92-4.00 (m, 2H), 4.03-4.07 (m, 1H), 4.12 (dd, J = 6.3, 2.5 Hz, 1H), 4.14-4.17 (m, 1H), 4.20-4.28 (m, 2H), 4.48-4.63 (m, 7H), 4.66 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.76 (dd, J = 9.1, 7.9 Hz, 1H); 4.81-4.85 (m, 1H), 5.04 (dd, J = 10.0, 10.0 Hz, 1H), 5.10 (s, 2H), 5.11-5.20 (m, 2H), 5.27 (dd, J = 9.1, 9.1 Hz, 1H), 5.33-5.38 (m, 2H), 7.26-7.39 (m, 10H), 7.83 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14.5 (CH3), 20.5-21.2 (7xCH3), 23.7 (CH2), 26.8 (CH2), 27.6 (CH2), 30.3-30.8 (8xCH2), 31.0 (CH2), 33.1 (CH2), 36.8 (CH2), 51.3 (CH2), 53.1 (CH), 54.5 (CH), 63.0 (CH2), 64.1 (CH2), 65.2 (CH2), 67.4 (CH2), 68.0 (CH2), 69.0 (CH2); 69.6 (CH), 69.8 (CH), 70.7 (CH), 70.9 (CH2), 71.6 (CH), 73.3 (CH), 73.5 (CH), 74.7 (CH), 76.3 (CH), 97.1 (CH), 101.4 (CH), 125.8 (CH), 129.2-129.6 (10xCH), 145.5 (C), 137.2 (C), 137.6 (C), 171.1-172.2 (7xC), 172.2 (C), 172.6 (C), 174.1 (C), 176.3 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 1369 (100) [M+H]+; HRMS (ESI+) m/z C67H94N5O25の計算値1368.6238, 実測値1368.6237.
化合物3.5f
一般プロトコルIに従うことにより、化合物3.3fから化合物3.5f(白色固体、192mg、0.13mmol、83%)を得た。
Rf=0.10(CH2Cl2/EtOAc 4:6); Tm=90〜94℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.84 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.14-1.31 (m, 30H), 1.52-1.62 (m, 2H), 1.87, 1.94, 1.96, 1.98, 1.99, 2.05, 2.09 (s, 21H), 1.91-2.03 (m, 1H), 2.13-2.26 (m, 3H), 2.26-2.43 (m, 2H), 3.50-3.59 (m, 1H), 3.60-3.66 (m, 1H), 3.80-3.99 (m, 4H), 4.02 (dd, J = 12.4, 2.2 Hz, 1H), 4.09-4.25 (m, 3H), 4.33-4.70 (m, 7H), 4.46 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.75-4.85 (m, 2H), 5.02 (dd, J = 9.8, 9.8 Hz, 1H), 5.04 (s, 2H), 5.09 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 5.13 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 5.19 (dd, J = 9.2, 9.2 Hz, 1H), 5.32 (dd, J = 10.3, 9.8 Hz, 1H), 5.36 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 6.70 (d, J = 6.0 Hz, 1H, NH), 7.23-7.37 (m, 11H), 7.55 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.1 (CH3), 20.5-20.8 (7xCH3), 22.7 (CH2), 25.5 (CH2), 27.0 (CH2), 29.3-29.7 (13xCH2), 30.0 (CH2), 31.9 (CH2), 36.4 (CH2), 49.9 (CH2), 51.9 (CH), 52.5 (CH), 61.5 (CH2), 62.5 (CH2), 64.6 (CH2), 66.4 (CH2), 67.2 (CH2), 67.8 (CH2), 68.0 (CH), 68.5 (CH), 69.3 (CH), 69.6 (CH2), 70.0 (CH), 71.8 (CH), 72.4 (CH), 72.5 (CH), 75.0 (CH), 95.6 (CH), 100.2 (CH), 123.9 (CH), 128.1-128.6 (PhのCH), 135.3 (C), 135.8 (C), 144.3 (C), 169.4-170.5 (7xC), 170.0 (C), 171.2 (C), 172.5 (C), 173.5 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 1439 (100) [M+H]+; HRMS (ESI+) m/z C72H104N5O25の計算値1438.7020, 実測値1438.7031.
化合物3.5g
一般プロトコルI(精製:シリカゲルカラムクロマトグラフィー、溶出液:CH2Cl2/MeOH 99:1から97:3)に従うことにより、化合物3.3fから化合物3.5g(白色ワックス、207mg、0.21mmol、85%)を得た。
Rf=0.18(CH2Cl2/MeOH 97:3); Tm=50〜52℃; 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.22-1.36 (m, 20H), 1.53-1.65 (m, 2H), 1.91-2.01 (m, 1H), 2.15-2.29 (m, 3H), 2.34-2.46 (m, 2H), 3.33 (s, 3H), 3.49-3.53 (m, 2H), 3.54-3.64 (m, 18H), 3.64-3.70 (m, 1H), 3.71-3.77 (m, 1H), 3.85 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 4.49-4.63 (m, 6H), 5.09 (s, 2H), 5.12 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 5.16 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 7.25-7.37 (m, 10H), 7.96 (s, 1H); 13C NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm 14.5 (CH3), 23.7 (CH2), 26.8 (CH2), 27.6 (CH2), 30.3-30.8 (8xCH2), 31.0 (CH2), 33.1 (CH2), 36.8 (CH2), 51.5 (CH2), 53.1 (CH), 54.5 (CH), 59.1 (CH3), 65.1 (CH2), 67.4 (CH2), 68.0 (CH2), 70.2 (CH2), 70.8 (CH2), 71.3-71.5 (9xCH2), 73.0 (CH2), 125.9 (CH), 129.2-129.6 (10xCH), 137.1 (C), 137.5 (C), 145.4 (C), 172.5 (C), 174.0 (2xC), 176.2 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 985 (20) [M+H]+, 1007 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C52H82N5O13の計算値984.5909, 実測値984.5892.
化合物3.5h
一般プロトコルI(精製:シリカゲルカラムクロマトグラフィー、溶出液:CH2Cl2/MeOH 99:1から97:3)に従うことにより、化合物3.3gから化合物3.5h(白色固体、91mg、0.09mmol、88%)を得た。
Rf=0.20(CH2Cl2/MeOH 97:3); Tm=61〜63℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm 0.85 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.17-1.32 (m, 30H), 1.53-1.64 (m, 2H), 1.93-2.04 (m, 1H), 2.14-2.26 (m, 3H), 2.26-2.43 (m, 2H), 3.33 (s, 3H), 3.48-3.52 (m, 2H), 3.52-3.66 (m, 19H), 3.81 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.88-3.95 (m, 1H), 4.46 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 4.53-4.69 (m, 4H), 5.05 (s, 2H), 5.10 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 5.13 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 6.65 (d, J = 5.9 Hz, 1H, NH), 7.24-7.35 (m, 10H), 7.42 (d, J = 7.7 Hz, 1H, NH), 7.71 (s, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm 14.1 (CH3), 22.7 (CH2), 25.5 (CH2), 26.9 (CH2), 29.3-29.7 (13xCH2), 30.0 (CH2), 31.9 (CH2), 36.4 (CH2), 50.3 (CH2), 51.9 (CH), 52.5 (CH), 59.0 (CH3), 65.1 (CH2), 66.4 (CH2), 67.2 (CH2), 70.2 (CH2), 70.8 (CH2), 70.5-70.6 (9xCH2), 71.9 (CH2), 123.8 (CH), 128.2-128.6 (10xCH), 135.3 (C), 135.8 (C), 144.1 (C), 170.1 (C), 171.2 (C), 172.5 (C), 173.6 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 892 (100), 1077 (70) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C57H92N5O13の計算値1054.6692, 実測値1054.6696.
化合物3.5i
一般プロトコルIに従うことにより、化合物3.3hから化合物3.5i(黄色がかったワックス、115mg、0.11mmol、38%)を得た。
Rf=0.40(CH2Cl2/EtOAc 1:1); 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0.84, 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 6H), 1.15-1.39 (m, 12H), 1.31-1.44 (m, 2H), 1.47-1.63 (m, 2H), 1.91, 1.93, 1.99, 2.02 (s, 12H), 1.89-2.05 (m, 1H), 2.14-2.25 (m, 1H), 2.26-2.35 (m, 1H), 2.34-2.46 (m, 2H), 3.68 (dd, J = 9.6, 5.7 Hz, 1H), 3.76 (dd, J = 9.6, 5.3 Hz, 1H), 3.85 (ddd, J = 9.7, 4.7, 2.4 Hz, 1H), 3.90-3.99 (m, 1H), 4.12 (dd, J = 12.4, 2.4 Hz, 1H), 4.13-4.20 (m, 1H), 4.26 (dd, J = 12.4, 4.7 Hz, 1H), 4.49-4.62 (m, 6H), 4.66 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.89 (dd, J = 9.7, 8.0 Hz, 1H), 5.02 (dd, J = 9.7, 9.5 Hz, 1H), 5.09 (s, 2H), 5.13, 5.17 (d, J = 12.4 Hz, 2H), 5.23 (dd, J = 9.7, 9.5 Hz, 1H), 7.27-7.37 (m, 10H), 7.83 (s, 1H), 8.12 (d, J = 7.5 Hz, 1H, NH), 8.13 (d, J = 7.8 Hz, 1H, NH); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14.4 (CH3), 14.5 (CH3), 20.6 (CH3), 20.6 (CH3), 20.7 (CH3), 20.7 (CH3), 23.5 (CH2), 23.6 (CH2), 27.9 (CH2), 28.2 (CH2), 28.3 (CH2), 30.9 (CH2), 32.9 (CH2), 33.0 (CH2), 34.0 (CH2), 34.1 (CH2), 47.9 (CH), 51.3 (CH2), 53.0 (CH), 54.2 (CH), 63.0 (CH2), 65.2 (CH2), 67.4 (CH2), 68.0 (CH2), 69.0 (CH2), 69.7 (CH), 71.0 (CH2), 72.5 (CH), 72.9 (CH), 74.0 (CH), 101.6 (CH), 125.8 (CH), 129.2-129.6 (10xCH), 137.1 (C), 137.5 (C), 145.4 (C), 171.1 (C), 171.2 (C), 171.5 (C), 172.0 (C), 172.2 (C), 172.5 (C), 173.8 (C), 179.0 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 1075 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C53H73N5O17Naの計算値1074.4899, 実測値1074.4904.
化合物3.5j
一般プロトコルIに従うことにより、化合物3.3iから化合物3.5j(白色固体、190mg、0.15mmol、90%)を得た。
Rf=0.40(CH2Cl2/EtOAc 1:1); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.84, 0.85 (t, J = 6.9 Hz, 6H), 1.13-1.31 (m, 40H), 1.33-1.44 (m, 2H), 1.48-1.63 (m, 2H), 1.90, 1.95, 1.99, 2.04 (s, 12H), 1.93-2.03 (m, 1H), 2.06-2.15 (m, 1H), 2.16-2.45 (m, 3H), 3.50-3.60 (m, 1H), 3.67 (ddd, J = 9.7, 4.7, 2.2 Hz, 1H), 3.81-3.90 (m, 1H), 3.90-3.99 (m, 1H), 4.10 (dd, J = 12.3, 2.2 Hz, 1H), 4.14-4.20 (m, 1H), 4.23 (dd, J = 12.3, 4.7 Hz, 1H), 4.35-4.71 (m, 6H), 4.44 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.97 (dd, J = 9.7, 7.9 Hz, 1H), 5.05 (dd, J = 9.7, 9.7 Hz, 1H), 5.05 (s, 2H), 5.13 (s, 2H), 5.15 (dd, J = 9.7, 9.7 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 6.0 Hz, 1H, NH), 7.23-7.40 (m, 11H), 7.57 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.1 (2xCH3), 20.5 (CH3), 20.6 (2xCH3), 20.7 (CH3), 22.7 (2xCH2), 27.3 (CH2), 27.7 (2xCH2), 29.4-30.3 (16xCH2), 31.9 (CH2), 32.9 (CH2), 33.0 (CH2), 47.7 (CH), 50.0 (CH2), 51.8 (CH), 52.4 (CH), 61.8 (CH2), 64.6 (CH2), 66.4 (CH2), 67.2 (CH2), 67.7 (CH2), 68.3 (CH), 69.8 (CH2), 71.0 (CH), 72.0 (CH), 72.5 (CH), 100.6 (CH), 124.0 (CH), 128.2-128.6 (10xCH), 135.3 (C), 135.9 (C), 144.4 (C), 169.4 (C), 169.5 (C), 170.0 (2xC), 170.6 (C), 171.2 (C), 172.3 (C), 176.5 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 1271 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C67H101N5O17Naの計算値1270.7090, 実測値1270.7128.
化合物3.5k
一般プロトコルIに従うことにより、化合物3.3jから化合物3.5k(黄色がかったゴム状物、200mg、0.19mmol、80%)を得た。
Rf=0.16(CH2Cl2/MeOH 97.5:2.5); 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0.77-0.92 (m, 2H), 1.10-1.25 (m, 6H), 1.25-1.37 (m, 2H), 1.51-1.73 (m, 7H), 1.91, 1.93, 1.98, 2.02 (s, 12H), 1.94-2.08 (m, 1H), 2.14-2.30 (m, 3H), 2.34-2.48 (m, 2H), 3.69 (dd, J = 9.6, 5.5 Hz, 1H), 3.78 (dd, J = 9.6, 5.2 Hz, 1H), 3.85 (ddd, J = 9.7, 4.6, 2.1 Hz, 1H), 3.95 (m, 1H), 4.12 (dd, J = 12.4, 2.1 Hz, 1H), 4.12-4.20 (m, 1H), 4.26 (dd, J = 12.4, 4.6 Hz, 1H), 4.48-4.64 (m, 6H), 4.66 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.89 (dd, J = 9.5, 7.9 Hz, 1H), 5.02 (dd, J = 9.7, 9.5 Hz, 1H), 5.09 (s, 2H), 5.12 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 5.17 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 5.23 (dd, J = 9.5, 9.5 Hz, 1H), 7.25-7.38 (m, 10H), 7.82 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 20.6 (2xCH3), 20.7 (2xCH3), 27.0 (CH2), 27.4 (2xCH2), 27.5 (CH2), 27.6 (CH2), 27.7 (CH2), 31.0 (CH2), 34.5 (2xCH2), 36.8 (CH2), 38.3 (CH2), 38.7 (CH), 51.2 (CH2), 53.1 (CH), 54.4 (CH), 63.0 (CH2), 65.1 (CH2), 67.4 (CH2), 68.0 (CH2), 68.9 (CH2), 69.7 (CH), 70.9 (CH2), 72.5 (CH), 72.8 (CH), 73.9 (CH), 101.6 (CH), 125.7 (CH), 129.1-129.6 (10xCH), 137.1 (C), 137.5 (C), 145.3 (C), 171.1 (2xC), 171.4 (C), 172.1 (C), 172.2 (C), 172.5 (C), 174.0 (C), 176.1 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 1059 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C52H70N5O17の計算値1036.4767, 実測値1036.4760.
化合物3.5l
一般プロトコルIに従うことにより、化合物3.3kから化合物3.5l(黄色がかった固体、153mg、0.13mmol、61%)を得た。
Rf=0.21(CH2Cl2/MeOH 97.5:2.5); Tm=60〜63℃; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.21-1.34 (m, 20H), 1.53-1.65 (m, 2H), 1.92, 1.94, 1.99, 2.02 (s, 12H), 1.93-2.10 (m, 1H), 2.15-2.31 (m, 3H), 2.42-2.52 (m, 2H), 3.71 (dd, J = 9.6, 5.2 Hz, 1H), 3.79-3.88 (m, 2H), 3.91-4.00 (m, 3H), 4.09-4.20 (m, 2H), 4.26 (dd, J = 12.4, 4.7 Hz, 1H), 4.47-4.64 (m, 6H), 4.66 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.88 (dd, J = 9.6, 8.0 Hz, 1H), 5.01 (dd, J = 9.6, 9.6 Hz, 1H), 5.11 (s, 2H), 5.15 (s, 2H), 5.23 (dd, J = 9.6, 9.6 Hz, 1H), 7.25-7.40 (m, 10H), 7.84 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.6 (CH3), 20.7 (CH3), 20.7 (CH3), 20.8 (CH3), 20.8 (CH3), 23.8 (CH2), 26.8 (CH2), 28.1 (CH2), 30.5-30.9 (8xCH2), 31.2 (CH2), 33.1 (CH2), 36.8 (CH2), 42.2 (CH2), 51.3 (CH2), 53.7 (CH), 55.2 (CH), 63.1 (CH2), 65.3 (CH2), 67.4 (CH2), 68.0 (CH2), 69.0 (CH2), 69.8 (CH), 70.9 (CH2), 72.6 (CH), 73.0 (CH), 74.1 (CH), 101.7 (CH), 125.9 (CH), 129.3-129.7 (10xCH), 137.2 (C), 137.7 (C), 145.3 (C), 171.0 (C), 171.2 (C), 171.3 (C), 171.6 (C), 172.3 (C), 172.3 (C), 173.8 (C), 174.4 (C), 176.9 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 1160 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C57H81N6O18の計算値1137.5607, 実測値1137.5610.
化合物3.7a
一般プロトコルJ次いでFに従うことにより、化合物3.5aから化合物3.7a(白色固体、81mg、0.12mmol、70%)を得た。
Tm=72〜75℃; 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ ppm 0.89 (t, J = 6.2 Hz, 3H), 1.20-1.38 (m, 12H), 1.54-1.67 (m, 2H), 1.86-1.99 (m, 1H), 2.10-2.24 (m, 1H), 2.24-2.40 (m, 4H), 3.21 (dd, J = 8.9, 8.0 Hz, 1H), 3.25-3.41 (m, 3H), 3.62-3.75 (m, 2H), 3.80 (dd, J = 9.6, 5.2 Hz, 1H), 3.87 (dd, J = 11.8, 1.3 Hz, 1H), 3.94-4.06 (m, 1H), 4.20-4.29 (m, 1H), 4.32 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.45 (dd, J = 8.7, 4.6 Hz, 1H), 4.57-4.71 (m, 5H), 8.14 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ ppm 14.4 (CH3), 23.7 (CH2), 26.8 (CH2), 27.8 (CH2), 30.3, 30.4, 30.4, 30.5 (4xCH2), 30.9 (CH2), 33.0 (CH2), 36.8 (CH2), 51.6 (CH2), 53.0 (CH), 54.5 (CH), 62.6 (CH2), 65.0 (CH2), 69.0 (CH2), 70.8 (CH2), 71.5 (CH), 74.9 (CH), 77.9 (2xCH), 104.4 (CH), 126.2 (CH), 145.2 (C), 172.1 (C), 174.5 (C), 176.4 (2xC); 質量(ESI-) m/z (%) 674 (100) [M-H]-; HRMS (ESI+) m/z C29H50N5O13の計算値676.3405, 実測値676.3409.
化合物3.7b
一般プロトコルJ次いでFに従うことにより、化合物3.5bから化合物3.7b(白色固体、108mg、0.15mmol、93%)を得た。
Tm=118〜120℃; 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ ppm 0.89 (t, J = 5.9 Hz, 3H), 1.16-1.38 (m, 16H), 1.52-1.67 (m, 2H), 1.85-2.00 (m, 1H), 2.10-2.25 (m, 1H), 2.22-2.42 (m, 4H), 3.21 (dd, J = 8.4, 7.8 Hz, 1H), 3.23-3.42 (m, 3H), 3.63-3.74 (m, 2H), 3.79 (dd, J = 9.6, 5.2 Hz, 1H), 3.87 (dd, J = 11.8, 1.3 Hz, 1H), 3.94-4.06 (m, 1H), 4.17-4.28 (m, 1H), 4.32 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.46 (dd, J = 8.8, 4.6 Hz, 1H), 4.55-4.70 (m, 5H), 8.10 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ ppm 14.4 (CH3), 23.7 (CH2), 26.8 (CH2), 27.9 (CH2), 30.3-30.7 (6xCH2), 31.0 (CH2), 33.0 (CH2), 36.8 (CH2), 51.6 (CH2), 53.2 (CH), 54.5 (CH), 62.6 (CH2), 65.0 (CH2), 69.0 (CH2), 70.8 (CH2), 71.4 (CH), 74.9 (CH), 77.8 (CH), 77.9 (CH), 104.4 (CH), 126.2 (CH), 145.2 (C), 172.0 (C), 174.8 (C), 176.4 (C), 176.5 (C); 質量(ESI-) m/z (%) 702 (100) [M-H]-; HRMS (ESI+) m/z C31H54N5O13の計算値704.3718, 実測値704.3703.
化合物3.7c
一般プロトコルJ次いでFに従うことにより、化合物3.5cから化合物3.7c(白色固体、358mg、0.49mmol、75%)を得た。
Tm=154〜156℃; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0.90 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.21-1.37 (m, 20H), 1.54-1.67 (m, 2H), 1.86-1.99 (m, 1H), 2.13-2.25 (m, 1H), 2.25-2.31 (m, 2H), 2.31-2.38 (m, 2H), 3.19 (dd, J = 9.7, 8.0 Hz, 1H), 3.24-3.38 (m, 3H), 3.62-3.68 (m, 1H), 3.71 (dd, J = 9.5, 5.4 Hz, 1H), 3.78 (dd, J = 9.5, 5.4 Hz, 1H), 3.87 (dd, J = 11.8, 1.5 Hz, 1H), 3.96-4.03 (m, 1H), 4.21-4.28 (m, 1H), 4.30 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.47 (dd, J = 9.1, 4.7 Hz, 1H), 4.58-4.67 (m, 5H), 8.09 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14.4 (CH3), 23.7 (CH2), 26.9 (CH2), 27.9 (CH2), 30.4-30.8 (8xCH2), 31.0 (CH2), 33.1 (CH2), 36.8 (CH2), 51.6 (CH2), 53.1 (CH), 54.5 (CH), 62.7 (CH2), 65.1 (CH2), 69.1 (CH2), 70.8 (CH2), 71.5 (CH), 74.9 (CH), 77.9 (CH), 78.1 (CH), 104.5 (CH), 126.2 (CH), 145.3 (C), 172.1 (2xC), 176.4 (C), 176.5 (C); 質量(ESI-) m/z (%) 365 (30) [M-2H]2-, 550 (20), 730 (100) [M-H]-, 752 (20); HRMS (ESI-) m/z C33H56N5O13の計算値730.3875, 実測値730.3886.
化合物3.7d
一般プロトコルJ次いでF(LiOH/ジオキサン-H2O)に従うことにより、化合物3.5dから化合物3.7d(白色固体、74mg、0.09mmol、77%)を得た。
Tm=175〜185℃; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.85 (t, J = 6.6 Hz, 3H), 1.11-1.32 (m, 30H), 1.39-1.51 (m, 2H), 1.68-1.83 (m, 1H), 1.90-2.04 (m, 1H), 2.07-2.16 (m, 2H), 2.18-2.29 (m, 2H), 2.96 (dd, J = 8.3, 8.3 Hz, 1H), 3.03 (dd, J = 8.8, 8.8 Hz, 1H), 3.08-3.17 (m, 2H), 3.34-3.46 (m, 1H), 3.51-3.60 (m, 2H), 3.64-3.70 (m, 1H), 3.85-3.93 (m, 1H), 4.03-4.12 (m, 1H), 4.17-4.28 (m, 2H), 4.44-4.63 (m, 5H), 7.93 (d, J = 8.1 Hz, 1H, NH), 8.09 (s, 1H), 8.20 (d, J = 7.8 Hz, 1H, NH); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ ppm 14.0 (CH3), 22.1 (CH2), 25.2 (CH2), 26.5 (CH2), 28.7-29.1 (13xCH2), 29.8 (CH2), 31.3 (CH2), 35.1 (CH2), 49.6 (CH2), 51.1 (CH), 52.2 (CH), 61.1 (CH2), 63.6 (CH2), 67.3 (CH2), 69.9 (CH2), 70.0 (CH), 73.3 (CH), 76.6 (CH), 77.0 (CH), 102.9 (CH), 124.7 (CH), 143.5 (C), 169.6 (C), 172.3 (C), 173.0 (C), 173.8 (C); 質量(ESI-) m/z (%) 399 (95) [M-2H]2-, 620 (70), 638 (30), 800 (100) [M-H]-, 822 (85) [M+Na-2H]-; HRMS (ESI-) m/z C38H66N5O13の計算値800.4657, 実測値800.4636.
化合物3.7e
一般プロトコルJ次いでFに従うことにより、化合物3.5dから化合物3.7e(白色固体、163mg、0.18mmol、79%)を得た。
Tm=167〜169℃; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.22-1.39 (m, 20H), 1.57-1.67 (m, 2H), 1.86-1.98 (m, 1H), 2.13-2.24 (m, 1H), 2.28 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.31-2.40 (m, 2H), 3.22-3.33 (m, 2H), 3.39 (ddd, J = 9.2, 4.7, 1.9 Hz, 1H), 3.44 (dd, J = 9.7, 3.8 Hz, 1H), 3.53 (dd, J = 9.2, 9.2 Hz, 1H), 3.56-3.73 (m, 5H), 3.74-3.92 (m, 4H), 3.95-4.03 (m, 1H), 4.19-4.29 (m, 1H), 4.33 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.46 (dd, J = 9.0, 4.6 Hz, 1H), 4.56-4.68 (m, 5H), 5.16 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 8.09 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14.4 (CH3), 23.7 (CH2), 26.8 (CH2), 28.0 (CH2), 30.3-30.8 (8xCH2), 31.0 (CH2), 33.1 (CH2), 36.8 (CH2), 51.6 (CH2), 53.2 (CH), 54.6 (CH), 62.1 (CH2), 62.8 (CH2), 65.1 (CH2), 69.1 (CH2), 70.8 (CH2), 71.5 (CH), 74.1 (CH), 74.5 (CH), 74.8 (CH), 75.0 (CH), 76.7 (CH), 77.7 (CH), 81.1 (CH), 102.9 (CH), 104.5 (CH), 126.2 (CH), 145.3 (C), 172.1 (C), 174.7 (C), 176.4 (C), 176.5 (C); 質量(ESI-) m/z (%) 446 (100) [M-H]2-, 892 (100) [M-H]-; HRMS (ESI+) m/z C39H66N5O18の計算値892.4403, 実測値892.4398.
化合物3.7f
一般プロトコルJ次いでF(LiOH/ジオキサン-H2O)に従うことにより、化合物3.5eから化合物3.7f(白色固体、101mg、0.10mmol、92%)を得た。
Tm=214〜216℃; 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm 0.90 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 1.23-1.39 (m, 30H), 1.56-1.66 (m, 2H), 1.88-1.97 (m, 1H), 2.15-2.24 (m, 1H), 2.25-2.31 (m, 2H), 2.31-2.39 (m, 2H), 3.22-3.29 (m, 2H), 3.39 (ddd, J = 9.4, 4.7, 1.9 Hz, 1H), 3.44 (dd, J = 9.7, 3.8 Hz, 1H), 3.53 (dd, J = 9.4, 9.2 Hz, 1H), 3.57-3.74 (m, 5H), 3.75-3.85 (m, 3H), 3.89 (dd, J = 12.1, 1.9 Hz, 1H), 3.96-4.03 (m, 1H), 4.21-4.27 (m, 1H), 4.33 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.47 (dd, J = 9.1, 4.7 Hz, 1H), 4.57-4.69 (m, 5H), 5.16 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 8.09 (s, 1H); 13C NMR (125 MHz, CD3OD): δ ppm 14.4 (CH3), 23.7 (CH2), 26.9 (CH2), 27.9 (CH2), 30.4-30.8 (13xCH2), 31.0 (CH2), 33.1 (CH2), 36.8 (CH2), 51.6 (CH2), 53.1 (CH), 54.5 (CH), 62.1 (CH2), 62.8 (CH2), 65.1 (CH2), 69.2 (CH2), 70.9 (CH2), 71.5 (CH), 74.2 (CH), 74.5 (CH), 74.8 (CH), 75.1 (CH), 76.7 (CH), 77.7 (CH), 81.2 (CH), 102.9 (CH), 104.5 (CH), 126.2 (CH), 145.3 (C), 172.2 (C), 174.5 (C), 176.4 (C), 176.5 (C); 質量(ESI-) m/z (%) 481 (55) [M-2H]2-, 963 (100) [M-H]-; HRMS (ESI-) m/z C44H76N5O18の計算値962.5185, 実測値962.5211.
化合物3.7g
一般プロトコルD1に従うことにより、化合物3.5gから化合物3.7g(白色ワックス、41mg、0.05mmol、定量的)を得た。
Tm=54〜57℃; 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm 0.90 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 1.23-1.37 (m, 20H), 1.55-1.66 (m, 2H), 1.88-1.98 (m, 1H), 2.13-2.22 (m, 1H), 2.23-2.39 (m, 4H), 3.35 (s, 3H), 3.51-3.55 (m, 2H), 3.56-3.66 (m, 18H), 3.71 (dd, J = 9.7, 5.2 Hz, 1H), 3.79 (dd, J = 9.7, 5.4 Hz, 1H), 3.90 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 4.40 (dd, J = 8.1, 4.7 Hz, 1H), 4.55-4.67 (m, 5H), 8.03 (s, 1H); 13C NMR (125 MHz, CD3OD): δ ppm 14.4 (CH3), 23.7 (CH2), 26.8 (CH2), 28.4 (CH2), 30.4-30.8 (8xCH2), 31.2 (CH2), 33.1 (CH2), 36.8 (CH2), 51.4 (CH2), 53.9 (CH), 54.7 (CH), 59.1 (CH3), 65.1 (CH2), 70.3 (CH2), 70.8 (CH2), 71.1-71.3 (9xCH2), 72.8 (CH2), 125.9 (CH), 145.5 (C), 171.7 (2xC), 176.4 (2xC); 質量(ESI+) m/z (%) 827 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C38H70N5O13の計算値804.4970, 実測値804.4975.
化合物3.7h
一般プロトコルD1に従うことにより、化合物3.5hから化合物3.7h(白色固体、58mg、0.07mmol、89%)を得た。
Tm=76〜79℃; 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm 0.90 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.23-1.38 (m, 30H), 1.56-1.66 (m, 2H), 1.88-1.98 (m, 1H), 2.13-2.22 (m, 1H), 2.23-2.39 (m, 4H), 3.35 (s, 3H), 3.50-3.55 (m, 2H), 3.56-3.67 (m, 18H), 3.71 (dd, J = 9.6, 5.3 Hz, 1H), 3.79 (dd, J = 9.6, 5.3 Hz, 1H), 3.90 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 4.42 (dd, J = 8.5, 4.8 Hz, 1H), 4.55-4.67 (m, 5H), 8.03 (s, 1H); 13C NMR (125 MHz, CD3OD): δ ppm 14.5 (CH3), 23.7 (CH2), 26.9 (CH2), 28.2 (CH2), 30.4-30.9 (13xCH2), 31.1 (CH2), 33.1 (CH2), 36.8 (CH2), 51.4 (CH2), 53.6 (CH), 54.6 (CH), 59.1 (CH3), 65.1 (CH2), 70.3 (CH2), 70.9 (CH2), 71.2-71.4 (9xCH2), 72.9 (CH2), 125.9 (CH), 145.4 (C), 171.8 (C), 175.1 (C), 176.4 (C), 176.5 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 231 (50), 897 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C43H80N5O13の計算値874.5753, 実測値874.5761.
化合物3.7i
一般プロトコルJ次いでFに従うことにより、化合物3.5iから化合物3.7i(白色固体、31mg、0.04mmol、46%)を得た。
Tm=100〜103℃; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0.88 (t, J = 6.5 Hz, 6H), 1.18-1.36 (m, 12H), 1.33-1.46 (m, 2H), 1.47-1.68 (m, 2H), 1.86-1.97 (m, 1H), 2.13-2.24 (m, 1H), 2.24-2.40 (m, 3H), 3.20 (dd, J = 9.0, 7.9 Hz, 1H), 3.31-3.39 (m, 3H), 3.62-3.73 (m, 2H,), 3.79 (dd, J = 9.5, 5.3 Hz, 1H), 3.87 (d, J = 11.5, 1.3 Hz, 1H), 3.96-4.04 (m, 1H), 4.21-4.28 (m, 1H), 4.32 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.42 (dd, J = 7.8, 4.7 Hz, 1H), 4.59-4.71 (m, 5H), 8.10 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ ppm 14.4 (2xCH3), 23.5 (CH2), 23.6 (CH2), 28.2 (CH2), 28.3 (CH2), 28.5 (CH2), 31.1 (CH2), 32.9 (CH2), 33.1 (CH2), 34.1 (CH2), 48.0 (CH), 51.6 (CH2), 53.5 (CH), 54.4 (CH), 62.7 (CH2), 65.1 (CH2), 69.0 (CH2), 70.9 (CH2), 71.5 (CH), 74.9 (CH), 77.9 (CH), 78.0 (CH), 104.5 (CH), 126.2 (CH), 145.3 (C), 171.7 (C), 175.1 (C), 176.5 (C), 179.2 (C); 質量(ESI-) m/z (%) 351 (25) [M-2H]2-, 702 (100) [M-H]-; HRMS (ESI-) m/z C31H52N5O13の計算値702.3562, 実測値702.3550.
化合物3.7j
一般プロトコルJ次いでF(LiOH/ジオキサン-H2O)に従うことにより、化合物3.5jから化合物3.7j(白色固体、40mg、0.04mmol、定量的)を得た。
Tm>160℃(分解と共に); 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm 0.90 (t, J = 6.9 Hz, 6H), 1.20-1.36 (m, 40H), 1.36-1.47 (m, 2H), 1.49-1.65 (m, 2H), 1.86-1.97 (m, 1H), 2.14-2.23 (m, 1H), 2.26-2.38 (m, 3H), 3.20 (dd, J = 9.1, 7.8 Hz, 1H), 3.26-3.39 (m, 3H), 3.64-3.69 (m, 1H), 3.70 (dd, J = 9.7, 5.7 Hz, 1H), 3.78 (dd, J = 9.7, 5.3 Hz, 1H), 3.87 (dd, J = 11.5, 1.3 Hz, 1H), 3.97-4.03 (m, 1H), 4.21-4.28 (m, 1H), 4.32 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.44 (dd, J = 8.3, 4.9 Hz, 1H), 4.61-4.70 (m, 5H), 8.10 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ ppm 14.5 (2xCH3), 23.7 (2xCH2), 28.5 (2xCH2), 28.6 (CH2), 30.5-30.8 (14xCH2), 31.1 (CH2), 33.1 (2x- CH2), 34.0 (2xCH2), 47.9 (CH), 51.6 (CH2), 53.5 (CH), 54.4 (CH), 62.7 (CH2), 65.1 (CH2), 69.0 (CH2), 70.9 (CH2), 71.5 (CH), 74.9 (CH), 77.9 (CH), 78.0 (CH), 104.5 (CH), 126.1 (CH), 145.3 (C), 171.7 (C), 175.0 (C), 176.5 (C), 179.2 (C); 質量(ESI-) m/z (%) 449 (40) [M-2H]2-, 899 (100) [M-H]-; HRMS (ESI-) m/z C45H80N5O13の計算値898.5753, 実測値898.5754.
化合物3.7k
一般プロトコルJ次いでFに従うことにより、化合物3.5kから化合物3.7k(白色固体、60mg、0.09mmol、82%)を得た。
Tm=114〜116℃; 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm 0.81-0.94 (m, 2H); 1.12-1.28 (m, 6H); 1.27-1.38 (m, 2H); 1.53-1.76 (m, 7H); 1.86-1.98 (m, 1H); 2.13-2.23 (m, 1H); 2.28 (t, J = 7.7 Hz, 2H); 2.31-2.39 (m, 2H); 3.20 (dd, J = 9.1, 7.8 Hz, 1H); 3.27-3.39 (m, 3H); 3.64-3.68 (m, 1H); 3.70 (dd, J = 9.6, 5.5 Hz, 1H); 3.79 (dd, J = 9.6, 5.3 Hz, 1H); 3.87 (dd, J = 11.7, 1.1 Hz, 1H); 3.96-4.04 (m, 1H); 4.21-4.28 (m, 1H); 4.32 (d, J = 7.8 Hz, 1H); 4.47 (dd, J = 9.1, 4.7 Hz); 4.61-4.69 (m, 5H); 8.09 (s, 1H); 13C NMR (125 MHz, CD3OD): δ ppm 27.1 (CH2); 27.5 (CH2); 27.5 (CH2); 27.5 (CH2); 27.8 (CH2); 27.9 (CH2); 31.0 (CH2); 34.5 (CH2); 34.5 (CH2); 36.8 (CH2); 38.3 (CH2); 38.8 (CH); 51.6 (CH2); 53.0 (CH); 54.5 (CH); 62.7 (CH2); 65.0 (CH2); 69.0 (CH2); 70.8 (CH2); 71.5 (CH); 74.9 (CH); 77.9 (CH); 78.0 (CH); 104.5 (CH); 126.2 (CH); 145.3 (C); 172.1 (C); 174.5 (C); 176.4 (C); 176.4 (C); 質量(ESI-) m/z (%) 343 (30) [M-2H]2-, 506 (25), 686 (100) [M-H]-; HRMS (ESI+) m/z C30H48N5O13の計算値686.3249, 実測値686.3229.
化合物3.7l
一般プロトコルJ次いでFに従うことにより、化合物3.5lから化合物3.7l(白色固体、70mg、0.09mmol、94%)を得た。
Tm>170℃(分解と共に); 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.23-1.38 (m, 20H), 1.54-1.67 (m, 2H), 1.86-2.03 (m, 1H), 2.13-2.43 (m, 5H), 3.19 (dd, J = 8.9, 7.9 Hz, 1H), 3.25-3.38 (m, 3H), 3.62-3.69 (m, 1H), 3.72 (dd, J = 9.7, 4.8 Hz, 1H), 3.82 (dd, J = 9.7, 5.3 Hz, 1H), 3.84-3.94 (m, 3H), 3.95-4.05 (m, 1H), 4.20-4.28 (m, 1H), 4.31 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.40-4.70 (m, 6H), 8.11 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14.4 (CH3), 23.7 (CH2), 26.8 (CH2), 28.6 (CH2), 30.4-30.8 (8xCH2), 32.8 (CH2), 33.1 (CH2), 36.8 (CH2), 41.9 (CH2), 51.6 (CH2), 53.2 (CH), 54.9 (CH), 62.7 (CH2), 65.1 (CH2), 69.0 (CH2), 70.8 (CH2), 71.5 (CH), 74.9 (CH), 78.0 (CH), 78.0 (CH), 104.5 (CH), 126.3 (CH), 145.3 (C), 172.2 (C), 173.1 (C), 174.5 (C), 175.4 (C), 176.6 (C); 質量(ESI-) m/z (%) 393 (100) [M-H]2-, 787 (80) [M-H]-; HRMS (ESI+) m/z C35H61N6O14の計算値789.4246, 実測値789.4238.
化合物3.8a
一般プロトコルIに従うことにより、化合物3.3f及び1,17-ジアジド-3,6,9,12,15-ペンタオキサヘプタデカン(記載していない)から化合物3.8a(白色ワックス、162mg、0.10mmol、43%)を得た。
Rf=0.15(CH2Cl2/MeOH 96:4); 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 6H), 1.18-1.34 (m, 40H), 1.53-1.67 (m, 4H), 1.94-2.08 (m, 2H), 2.13-2.29 (m, 6H), 2.29-2.51 (m, 4H), 3.49-3.66 (m, 18H), 3.79-3.89 (m, 4H), 3.87-4.06 (m, 2H), 4.39-4.53 (m, 4H), 4.53-4.79 (m, 8H), 5.07 (s, 4H), 5.12 (d, J = 12.5 Hz, 2H), 5.15 (d, J = 12.5 Hz, 2H), 6.67 (bs, 2H, NH), 7.24-7.39 (m, 20H), 7.45 (s, 2H), 7.73 (bs, 2H, NH); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm 14.2 (2xCH3), 22.8 (2xCH2), 25.7 (2xCH2), 27.1 (2xCH2), 29.4-29.8 (16xCH2), 30.1 (2xCH2), 32.0 (2xCH2), 36.6 (2xCH2), 50.5 (2xCH2), 52.0 (2xCH), 52.6 (2xCH), 64.5 (2xCH2), 66.6 (2xCH2), 67.3 (2xCH2), 69.4 (2xCH2), 69.6 (2xCH2), 70.6 (8xCH2), 123.9 (2xCH), 128.3-128.7 (20xCH), 135.4 (2xC), 135.9 (2xC), 144.2 (2xC), 170.2 (2xC), 171.3 (2xC), 172.6 (2xC), 173.7 (2xC); 質量(ESI+) m/z (%) 721 (30), 1072 (100), 1680 (75) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C90H133N10O19の計算値1657.9748, 実測値1657.9785.
化合物3.9a
一般プロトコルD1に従うことにより、化合物3.8aから化合物3.9a(白色固体、107mg、0.08mmol、95%)を得た。
Tm=74〜76℃; 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm 0.90 (t, J = 6.9 Hz, 6H), 1.22-1.37 (m, 40H), 1.56-1.66 (m, 4H), 1.85-2.00 (m, 2H), 2.13-2.25 (m, 2H), 2.24-2.32 (m, 4H), 2.29-2.42 (m, 4H), 3.53-3.66 (m, 16H), 3.68-3.75 (m, 2H), 3.75-3.83 (m, 2H), 3.89 (t, J = 4.9 Hz, 4H), 4.37-4.51 (m, 2H), 4.57 (t, J = 4.9 Hz, 4H), 4.59-4.69 (m, 6H), 8.04 (s, 2H); 13C NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm 14.5 (2xCH3), 23.7 (2xCH2), 26.8 (2xCH2), 28.1 (2xCH2), 29.3-29.7 (16xCH2), 31.1 (2xCH2), 33.1 (2xCH2), 36.8 (2xCH2), 51.4 (2xCH2), 52.2 (2xCH), 54.6 (2xCH), 65.1 (2xCH2), 70.3 (2xCH2), 70.9 (2xCH2), 71.4-71.5 (8xCH2), 126.0 (2xCH), 145.4 (2xC), 171.9 (2xC), 174.9 (2xC), 176.4 (2xC), 176.4 (2xC); 質量(ESI-) m/z (%) 647 (100) [M-2H]2-; HRMS (ESI+) m/z C62H109N10O19の計算値1297.7870, 実測値1297.7860.
(実施例5)
化合物4.1から4.6
i.H-D-Glu(OBn)-OBn.p-トシレート(2当量)、TBTU(1.2当量)、DIEA(5当量)、DMF; ii.H-D-Glu(OBn)-OBn.p-トシレート(3当量)、TBTU(1.2当量)、DIEA(10当量)、DMF; iii.TFA、CH2Cl2;iv.CH3(CH2)nCOCl、DMAP、ピリジン、CH2Cl2; v.Pd/C5%、THF。
化合物4.1
全ての試薬、N-Boc-L-アスパラギン酸4-ベンジルエステル(2.00g、6.19mmol)、H-D-Glu(OBn)-OBn.p-トシレート(6.18g、12.37mmol、2当量)、TBTU(2.39g、7.43mmol、1.2当量)及びDIEA(4.0g、30.9mmol、5当量)をDMF(80ml)に溶解させる。室温で16時間撹拌した後、反応媒体を水で希釈し、EtOAcで抽出する。合わせた有機相をNaHCO3の水中飽和溶液で、NaClの飽和水溶液で洗浄し、次いでMgSO4で脱水し、真空下で濃縮する。残渣を最少量のCH2Cl2に溶解させ、生成物を冷却条件下エーテルを用いて沈殿させる。沈殿物を濾紙を使用するブフナー漏斗上で濾過により回収して、白色固体2.07gを収率53%で得る。
Rf=0.44(シクロヘキサン/EtOAc 7:3); Tm=102℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.44 (s, 9H), 1.95-2.06 (m, 1H), 2.18-2.47 (m, 3H), 2.72 (dd, J = 17.0, 5.9 Hz, 1H), 3.01 (dd, J = 17.1, 4.0 Hz, 1H), 4.50-4.59 (m, 1H), 4.59-4.66 (m, 1H), 5.05-5.20 (m, 6H), 5.63 (d, J = 8.1 Hz, NH), 7.16 (d, J = 7.3 Hz, NH), 7.28-7.41 (m, 15H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 27.2 (CH2), 28.2 (3xCH3), 30.0 (CH2), 35.8 (CH2), 50.6 (CH), 51.8 (CH), 66.5 (CH2), 66.8 (CH2), 67.3 (CH2), 80.7 (C), 128.1-128.7 (15xCH), 135.1 (C), 135.4 (C), 135.7 (C), 155.6 (C), 170.7 (C), 171.1 (C), 171.5 (C), 172.4 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 655 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C35H40N2O9Naの計算値655.2632 [M+Na]+, 実測値655.2624.
化合物4.2
全ての試薬、N-Boc-L-アスパラギン酸(1.00g、4.28mmol)、H-D-Glu(OBn)-OBn.p-トシレート(6.22g、12.84mmol、3当量)、TBTU(3.3g、10.27mmol、1.2当量)及びDIPEA(5.54g、42.8mmol、10当量)をDMF(60ml)に溶解させる。室温で16時間撹拌した後、反応媒体を水で希釈し、EtOAcで抽出する。合わせた有機相をNaHCO3の水中飽和溶液で、NaClの飽和水溶液で洗浄し、次いでMgSO4で脱水し、真空下で濃縮する。残渣を最少量のCH2Cl2に溶解させ、生成物を冷却条件下エーテルを用いて沈殿させる。沈殿物を濾紙を使用するブフナー漏斗上で濾過により回収して、白色固体3.13gを収率86%で得る。
Rf=0.56(CH2Cl2/EtOAc 8:2); Tm=89℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.43 (s, 9H), 1.93-2.05 (m, 2H), 2.15-2.28 (m, 2H), 2.29-2.45 (m, 4H), 2.47-2.56 (m, 1H), 2.79-2.89 (m, 1H), 4.47 (m, 1H), 4.54-4.62 (m, 2H), 5.07 (s, 4H), 5.11 (s, 4H), 5.96 (d, J = 5.5 Hz, NH), 6.78 (d, J = 7.4 Hz, NH), 7.38-7.27 (m, 20H), 7.41 (d, J = 7.0 Hz, NH); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 26.8 (CH2), 27.0 (CH2), 28.4 (3xCH3), 30.2 (CH2), 30.3 (CH2), 37.5 (CH2), 51.5 (CH), 52.0 (CH), 52.1 (CH), 66.6 (CH2), 66.7 (CH2), 67.4 (CH2), 67.6 (CH2), 80.6 (C), 128.3-128.8 (20xCH), 135.2 (C), 135.3 (C), 135.8 (C), 135.9 (C), 155.9 (C), 170.8 (2xC), 171.4 (C), 171.7 (C), 172.5 (C), 172.6 (C); 質量(ESI-) m/z (%) 850.4 [M-H]-, 886.4 (100) [M+Cl]-; HRMS (ESI-) m/z C47H52N3O12の計算値850.3551 [M-H]-, 実測値850.3510.
化合物4.3a
一般プロトコルG次いでCに従うことにより、化合物4.1から化合物4.3a(白色固体、431mg、0.63mmol、79%)を得た。
Rf=0.30(シクロヘキサン/EtOAc 7:3); Tm=87℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.15-1.36 (m, 12H), 1.50-1.64 (m, 2H), 1.94-2.05 (m, 1H), 2.14 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.14-2.45 (m, 3H), 2.76-2.92 (m, 2H, H3'), 4.59-4.67 (m, 1H), 4.96-5.02 (m, 1H), 5.03-5.16 (m, 6H), 7.13 (d, J = 7.7 Hz, NH), 7.20-7.36 (m, 15H), 7.60 (d, J = 7.5 Hz, NH); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 13.9 (CH3), 22.5 (CH2), 25.3 (CH2), 26.7 (CH2), 29.8 (CH2), 29.0-29.3 (4xCH2), 31.7 (CH2), 35.8 (CH2), 36.0 (CH2), 49.0 (CH), 51.7 (CH), 66.2 (CH2), 66.4 (CH2), 66.9 (CH2), 127.9-128.4 (15xCH), 135.1 (C), 135.4 (C), 135.6 (C), 170.6 (C), 170.8 (C), 170.9 (C), 172.2 (C), 173.5 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 687 [M+H]+, 709 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C40H51N2O8Naの計算値709.3465 [M+Na]+, 実測値709.3461.
化合物4.3b
一般プロトコルG次いでCに従うことにより、化合物4.1から化合物4.3b(白色固体、424mg、0.59mmol、75%)を得た。
Rf=0.31(シクロヘキサン/EtOAc 7:3); Tm=75℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.15-1.36 (m, 16H), 1.50-1.64 (m, 2H), 1.93-2.04 (m, 1H), 2.13 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.14-2.45 (m, 3H), 2.73-2.93 (m, 2H), 4.57-4.66 (m, 1H), 4.91-5.00 (m, 1H), 5.01-5.16 (m, 6H), 7.01 (bs, NH), 7.22-7.36 (m, 15H), 7.50 (bs, NH); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.0 (CH3), 22.5 (CH2), 25.4 (CH2), 26.8 (CH2), 29.0-29.6 (6xCH2), 29.9 (CH2), 31.8 (CH2), 35.7 (CH2), 36.1 (CH2), 49.1 (CH), 51.7 (CH), 66.3 (CH2), 66.6 (CH2), 67.0 (CH2), 127.9-128.5 (15xCH), 135.2 (C), 135.4 (C), 135.7 (C), 170.5 (C), 171.0 (2xC), 172.3 (C), 173.6 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 715 [M+H]+, 737 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C42H54N2O8Naの計算値737.3778 [M+Na]+, 実測値737.3781.
化合物4.3c
一般プロトコルG次いでCに従うことにより、化合物4.1から化合物4.3c(白色固体、523mg、0.71mmol、86%)を得た。
Rf=0.34(シクロヘキサン/EtOAc 7:3); Tm=75℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.16-1.36 (m, 20H), 1.49-1.65 (m, 2H), 1.93-2.04 (m, 1H), 2.13 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 2.16-2.45 (m, 3H), 2.74-2.91 (m, 2H), 4.57-4.65 (m, 1H), 4.95-5.02 (m, 1H), 5.02-5.14 (m, 6H), 7.17 (d, J = 8.4 Hz, NH), 7.20-7.34 (m, 15H), 7.61 (d, J = 8.0 Hz, NH); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.0 (CH3), 22.6 (CH2), 25.4 (CH2), 26.7 (CH2), 29.0-29.6 (8xCH2), 29.9 (CH2), 31.8 (CH2), 35.8 (CH2), 36.1 (CH2), 49.1 (CH), 51.8 (CH), 66.3 (CH2), 66.5 (CH2), 67.0 (CH2), 127.9-128.5 (15xCH), 135.2 (C), 135.4 (C), 135.7 (C), 170.7 (C), 170.9 (2xC), 172.3 (C), 173.7 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 743 [M+H]+, 765 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C44H58N2O8Naの計算値765.4091 [M+Na]+, 実測値765.4079.
化合物4.3d
一般プロトコルG次いでCに従うことにより、化合物4.1から化合物4.3d(白色固体、523mg、0.68mmol、89%)を得た。
Rf=0.37(シクロヘキサン/EtOAc 7:3); Tm=85〜86℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.15-1.35 (m, 24H), 1.49-1.63 (m, 2H), 1.92- 2.04 (m, 1H), 2.12 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.13-2.45 (m, 3H), 2.73-2.93 (m, 2H), 4.57-4.65 (m, 1H), 4.92-5.01 (m, 1H), 5.01-5.14 (m, 6H), 7.17 (bs, NH), 7.19-7.36 (m, 15H), 7.61 (bs, NH); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.0 (CH3), 22.5 (CH2), 25.4 (CH2), 26.7 (CH2), 29.0-29.6 (11xCH2), 29.9 (CH2), 31.8 (CH2), 35.7 (CH2), 36.1 (CH2), 49.1 (CH), 51.7 (CH), 66.1 (CH2), 66.5 (CH2), 67.0 (CH2), 127.9-128.5 (15xCH), 135.2 (C), 135.4 (C), 135.7 (C), 170.6 (C), 171.0 (2xC), 172.2 (C), 173.5 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 793 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C46H62N2O8Naの計算値793.4404 [M+Na]+, 実測値793.4420.
化合物4.4a
一般プロトコルG次いでCに従うことにより、化合物4.2から化合物4.4a(白色固体、437mg、0.48mmol、82%)を得た。
Rf=0.27(CH2Cl2/EtOAc 8:2); Tm=130〜133℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.18-1.38 (m, 12H), 1.56-1.67 (m, 2H), 1.94-2.06 (m, 2H), 2.16-2.28 (m, 4H), 2.30-2.48 (m, 5H), 2.88 (dd, J = 14.9, 3.2 Hz, 1H), 4.52-4.63 (m, 2H), 4.73-4.80 (m, 1H), 5.04-5.17 (m, 8H), 6.93 (d, J = 7.5 Hz, NH), 7.13 (d, J = 7.5 Hz, NH), 7.27-7.38 (m, 10H), 7.51 (d, J = 7.6 Hz, NH); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.1 (CH3), 22.7 (CH2), 25.5 (CH2), 26.6 (CH2), 26.8 (CH2), 29.2-29.5 (3xCH2), 30.1 (CH2), 30.2 (CH2), 31.9 (2xCH2), 36.4 (CH2), 37.1 (CH2), 49.9 (CH), 51.9 (CH), 52.1 (CH), 66.5 (2xCH2), 67.2 (CH2), 67.4 (CH2), 128.1-128.7 (20xCH), 135.2 (C), 135.3 (C), 135.8 (2xC), 170.0 (C), 171.1 (C), 171.3 (C), 171.8 (C), 172.3 (C), 172.5 (C), 174.1 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 907 [M+H]+ , 929 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C52H63N3O11Naの計算値928.4360 [M+Na]+, 実測値928.4380.
化合物4.4b
一般プロトコルG次いでCに従うことにより、化合物4.2から化合物4.4b(白色固体、430mg、0.46mmol、78%)を得た。
Rf=0.33(CH2Cl2/EtOAc 8:2); Tm=112〜114℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.17-1.37 (m, 16H), 1.56-1.67 (m, 2H), 1.94-2.07 (m, 2H), 2.16-2.28 (m, 4H), 2.30-2.47 (m, 5H), 2.87 (dd, J = 14.9, 3.3 Hz, 1H), 4.52-4.63 (m, 2H), 4.74-4.80 (m, 1H), 5.04-5.17 (m, 8H), 6.96 (d, J = 7.5 Hz, NH), 7.14 (d, J = 7.5 Hz, NH), 7.27-7.38 (m, 10H), 7.52 (d, J = 7.6 Hz, NH); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.1 (CH3), 22.6 (CH2), 25.5 (CH2), 26.7 (2xCH2), 29.2-29.7 (5xCH2), 30.0 (CH2), 30.2 (CH2), 31.8 (2xCH2), 36.3 (CH2), 37.1 (CH2), 49.9 (CH), 51.8 (CH), 52.0 (CH), 66.4 (2xCH2), 67.1 (CH2), 67.2 (CH2), 128.0-128.6 (20xCH), 135.1 (C), 135.2 (C), 135.7 (C), 135.8 (C), 170.9 (C), 171.0 (C), 171.3 (C), 171.7 (C), 172.3 (C), 172.4 (C), 174.0 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 935 [M+H]+, 957 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C54H67N3O11Naの計算値956.4673 [M+Na]+, 実測値956.4682.
化合物4.4c
一般プロトコルG次いでCに従うことにより、化合物4.2から化合物4.4c(白色固体、437mg、0.45mmol、77%)を得た。
Rf=0.39(CH2Cl2/EtOAc 8:2); Tm=112〜116℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 3H) , 1.16-1.35 (m, 20H), 1.56-1.65 (m, 2H), 1.93-2.06 (m, 2H), 2.15-2.28 (m, 4H), 2.30-2.47 (m, 5H), 2.87 (dd, J = 14.9, 3.0 Hz, 1H), 4.51-4.63 (m, 2H), 4.72-4.80 (m, 1H), 5.05-5.14 (m, 8H), 6.94 (d, J = 7.4 Hz, NH), 7.11 (d, J = 7.5 Hz, NH), 7.27-7.38 (m, 10H), 7.50 (d, J = 7.7 Hz, NH); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.3 (CH3), 22.8 (CH2), 25.6 (CH2), 26.7 (CH2), 26.9 (CH2), 29.3-29.9 (7xCH2), 30.3 (CH2), 30.4 (CH2), 32.1 (2xCH2), 36.6 (CH2), 37.2 (CH2), 49.9 (CH), 52.2 (CH), 52.3 (CH), 66.7 (2xCH2), 67.4 (CH2), 67.6 (CH2), 128.3-128.9 (20xCH), 135.2 (C), 135.3 (C), 135.9 (2xC), 171.2 (2xC), 171.3 (C), 171.9 (C), 172.5 (C), 172.6 (C), 174.1 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 963 (100) [M+H]+, 985 [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C56H71N3O11Naの計算値984.4986 [M+Na]+, 実測値984.4996.
化合物4.4d
一般プロトコルG次いでCに従うことにより、化合物4.2から化合物4.4d(白色固体、436mg、0.44mmol、75%)を得た。
Rf=0.42(CH2Cl2/EtOAc 8:2); Tm=120〜124℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 1.19-1.35 (m, 24H), 1.55-1.66 (m, 2H), 1.94-2.07 (m, 2H), 2.16-2.28 (m, 4H), 2.29-2.50 (m, 5H), 2.88 (dd, J = 14.9, 3.3 Hz, 1H), 4.52-4.64 (m, 2H), 4.73-4.81 (m, 1H), 5.04-5.17 (m, 8H), 6.99 (d, J = 7.5 Hz, NH), 7.16 (d, J = 7.5 Hz, NH), 7.27-7.38 (m, 20H), 7.53 (d, J = 7.6 Hz, NH); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.3 (CH3), 22.8 (CH2), 25.6 (CH2), 26.7 (CH2), 26.9 (CH2), 29.3-29.9 (11xCH2), 30.3 (CH2), 30.4 (CH2), 32.1 (2xCH2), 36.6 (CH2), 37.2 (CH2), 49.9 (CH), 52.2 (2xCH), 66.6 (CH2), 66.7 (CH2), 67.4 (CH2), 67.6 (CH2), 128.3-128.8 (20xCH), 135.2 (C), 135.3 (C), 135.8 (C), 135.9 (C), 171.2 (2xC), 171.3 (C), 171.9 (C), 172.5 (C), 172.6 (C), 174.2 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 991 (100) [M+H]+, 1013 [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C58H75N3O11Naの計算値1012.5299 [M+Na]+, 実測値1012.5296.
化合物4.5a
一般プロトコルD2に従うことにより、化合物4.3aから化合物4.5a(白色固体、175mg、0.42mmol、72%)を得た。
Tm=160〜162℃; 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ ppm 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.22-1.39 (m, 12H), 1.55-1.68 (m, 2H), 1.90-2.02 (m, 1H), 2.14-2.24 (m, 1H), 2.25 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.36-2.42 (m, 2H), 2.66 (dd, J = 16.7, 7.3 Hz, 1H), 2.85 (dd, J = 16.7, 6.4 Hz, 1H), 4.43 (dd, J = 8.8, 4.8 Hz, 1H), 4.79 (dd, J = 7.3, 6.4 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, MeOD) δ ppm 14.4 (CH3), 23.7 (CH2), 26.8 (CH2), 27.9 (CH2), 33.0 (CH2), 30.2-31.1 (4xCH2), 36.7 (CH2), 36.9 (CH2), 51.1 (CH), 53.2 (CH), 173.0 (C), 173.8 (C), 174.5 (C), 176.4 (C), 176.5 (C); 質量(ESI-) m/z (%) 397 (100) [M-F]-, 415 [M-H]-, 437 [M+Na-2H]-; HRMS (ESI-) m/z C19H31N2O8の計算値415.2080 [M-H]-, 実測値415.2093.
化合物4.5b
一般プロトコルD2に従うことにより、化合物4.3bから化合物4.5b(白色固体、190mg、0.43mmol、77%)を得た。
Tm=151℃; 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ ppm 0.90 (t, J = 6.7 Hz, 3H), 1.20-1.41 (m, 16H), 1.55-1.68 (m, 2H), 1.90-2.02 (m, 1H), 2.14-2.24 (m, 1H), 2.25 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.36-2.42 (m, 2H), 2.66 (dd, J = 16.7, 7.2 Hz, 1H), 2.85 (dd, J = 16.7, 6.5 Hz, 1H), 4.43 (dd, J = 8.7, 4.8 Hz, 1H), 4.79 (dd, J = 7.2, 6.5 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, MeOD) δ ppm 14.4 (CH3), 23.7 (CH2), 26.8 (CH2), 27.9 (CH2), 30.2-31.1 (6xCH2), 33.06 (CH2), 36.7 (CH2), 36.9 (CH2), 51.1 (CH), 53.2 (CH), 173.0 (C), 173.8 (C), 174.5 (C), 176.5 (2xC); 質量(ESI-) m/z (%) 425 [M-F]-, 443 (100) [M-H]-, 465 [M+Na-2H]-; HRMS (ESI-) m/z C21H35N2O8の計算値443.2393 [M-H]-, 実測値443.2396.
化合物4.5c
一般プロトコルD2に従うことにより、化合物4.3cから化合物4.5c(白色固体、194mg、0.41mmol、76%)を得た。
Tm=145〜148℃; 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ ppm 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.20-1.40 (m, 20H), 1.56-1.67 (m, 2H), 1.91-2.02 (m, 1H), 2.14-2.24 (m, 1H), 2.25 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.36-2.43 (m, 2H), 2.66 (dd, J = 16.7, 7.2 Hz, 1H), 2.85 (dd, J = 16.7, 6.4 Hz, 1H), 4.43 (dd, J = 8.8, 4.8 Hz, 1H), 4.79 (dd, J = 7.2, 6.4 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, MeOD) δ ppm 14.4 (CH3), 23.7 (CH2), 26.8 (CH2), 27.9 (CH2), 30.2-31.1 (10xCH2), 33.1 (CH2), 36.7 (CH2), 36.9 (CH2), 51.1 (CH), 53.2 (CH), 173.0 (C), 173.8 (C), 174.5 (C), 176.5 (2xC); 質量(ESI-) m/z (%) 453 [M-F]-, 471 (100) [M-H]-, 493 [M+Na-2H]-; HRMS (ESI-) m/z C23H39N2O8の計算値471.2706 [M-H]-, 実測値471.2686.
化合物4.5d
一般プロトコルD2に従うことにより、化合物4.3dから化合物4.5d(白色固体、243mg、0.49mmol、93%)を得た。
Tm=138〜141℃; 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ ppm 0.90 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.23-1.38 (m, 24H), 1.56-1.67 (m, 2H), 1.91-2.02 (m, 1H), 2.15-2.24 (m, 1H), 2.25 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.36-2.43 (m, 2H), 2.66 (dd, J = 16.6, 7.2 Hz, 1H), 2.86 (dd, J = 16.6, 6.3, 1H), 4.43 (dd, J = 8.8, 4.8, Hz, 1H), 4.79 (dd, J = 7.2, 6.3 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, MeOD) δ ppm 14.4 (CH3), 23.7 (CH2), 26.8 (CH2), 27.9 (CH2), 30.2-31.1 (12xCH2), 33.1 (CH2), 36.7 (CH2), 36.9 (CH2), 51.1 (CH), 53.2 (CH), 173.0 (C), 173.9 (C), 174.5 (C), 176.5 (2xC); 質量(ESI-) m/z (%) 481 [M-F]-, 499 (100) [M-H]-, 521 [M+Na-2H]-; HRMS (ESI-) m/z C25H43N2O8の計算値499.3019 [M-H]-, 実測値499.3027.
化合物4.6a
一般プロトコルD2に従うことにより、化合物4.4aから化合物4.6a(白色固体、221mg、0.40mmol、93%)を得た。
Tm=170〜175℃; 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ ppm 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.21-1.37 (m, 12H), 1.54-1.66 (m, 2H), 1.87-2.02 (m, 2H), 2.13-2.28 (m, 4H), 2.35-2.44 (m, 4H), 2.63 (dd, J = 15.1, 8.0 Hz, 1H), 2.80 (dd, J = 15.1, 6.1 Hz, 1H), 4.40-4.48 (m, 2H), 4.80 (dd, J = 8.0 6.1 1H); 13C NMR (100 MHz, MeOD) δ ppm 14.4 (CH3), 23.7 (CH2), 26.8 (CH2), 27.9 (CH2), 28.0 (CH2), 30.4 (2xCH2), 30.5 (CH2), 30.6 (CH2), 31.1 (CH2), 31.2 (CH2), 33.0 (CH2), 36.9 (CH2), 38.4 (CH2), 51.6 (CH), 53.0 (CH), 53.2 (CH), 172.1 (C), 173.1 (C), 174.6 (C), 175.0 (C), 176.4 (C), 176.5 (2xC); 質量(ESI-) m/z (%) 544 (100) [M-H]-, 566 [M+Na-2H]-; HRMS (ESI-) m/z C24H38N3O11の計算値544.2506 [M-H]-, 実測値544.2514.
化合物4.6b
一般プロトコルD2に従うことにより、化合物4.4bから化合物4.6b(白色固体、247mg、0.43mmol、98%)を得た。
Tm=165〜170℃; 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ ppm 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 3H) 1.20-1.38 (m, 16H), 1.54-1.66 (m, 2H), 1.88-2.02 (m, 2H), 2.13-2.28 (m, 4H), 2.35-2.44 (m, 4H), 2.63 (dd, J = 15.1 8.1 Hz, 1H), 2.80 (dd, J = 15.1, 6.1 Hz, 1H), 4.39-4.48 (m, 2H), 4.79 (dd, J = 8.1, 6.1 1H); 13C NMR (100 MHz, MeOD) δ ppm 14.4 (CH3), 23.7 (CH2), 26.8 (CH2), 28.0 (CH2), 28.1 (CH2), 30.3-31.3 (8xCH2), 33.1 (CH2), 36.9 (CH2), 38.4 (CH2), 51.7 (CH), 53.2 (CH), 53.3 (CH), 172.1 (C), 173.1 (C), 174.7 (C), 175.2 (C), 176.5 (C), 176.6 (C); 質量(ESI-) m/z (%) 572 [M-H]-, 594 (100) [M+Na-2H]-; HRMS (ESI-) m/z C26H42N3O11の計算値572.2819 [M-H]-, 実測値572.2817.
化合物4.6c
一般プロトコルD2に従うことにより、化合物4.4cから化合物4.6c(白色固体、208mg、0.35mmol、80%)を得た。
Tm=155〜160℃; 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ ppm 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.22-1.38 (m, 20H), 1.54-1.67 (m, 2H), 1.87-2.02 (m, 2H), 2.13-2.29 (m, 4H), 2.36-2.44 (m, 4H), 2.63 (dd, J = 15.0, 8.0 Hz, 1H), 2.81 (dd, J = 15.0, 6.1 Hz, 1H), 4.40-4.48 (m, 2H), 4.77-4.83 (dd, J = 8.0, 6.1, 1H); 13C NMR (100 MHz, MeOD) δ ppm 14.4 (CH3), 23.7 (CH2), 26.8 (CH2), 27.9 (CH2), 28.0 (CH2), 31.3-30.3 (10xCH2), 33.1 (CH2), 36.9 (CH2), 38.4 (CH2), 51.6 (CH), 53.0 (CH), 53.2 (CH), 172.1 (C), 173.1 (C), 174.6 (C), 175.0 (C), 176.4 (C), 176.5 (2xC); 質量(ESI-) m/z (%) 600 (100) [M-H]-, 622 [M+Na-2H]-; HRMS (ESI-) m/z C28H46N3O11の計算値600.3132 [M-H]-; 実測値600.3108.
化合物4.6d
一般プロトコルD2に従うことにより、化合物4.4dから化合物4.6d(白色固体、208mg、0.33mmol、75%)を得た。
Tm=158〜160℃; 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ ppm 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 3H) , 1.22-1.37 (m, 24H), 1.54-1.66 (m, 2H), 1.85-2.02 (m, 2H), 2.13-2.28 (m, 4H), 2.35-2.44 (m, 4H), 2.63 (dd, J = 15.1, 8.0 Hz, 1H), 2.80 (dd, J = 15.1, 6.1 Hz, 1H), 4.42-4.48 (m, 2H), 4.79 (dd, J = 8.0, 6.1 1H); 13C NMR (100 MHz, MeOD) δ ppm 14.4 (CH3), 23.7 (CH2), 26.8 (CH2), 27.9 (CH2), 28.0 (CH2), 30.3-31.3 (12xCH2), 33.1 (CH2), 36.9 (CH2), 38.4 (CH2), 51.7 (CH), 53.1 (CH), 53.2 (CH), 172.1 (C), 173.1 (C), 174.6 (C), 175.0 (C), 176.4 (C), 176.5 (2xC); 質量(ESI-) m/z (%) 628 (100) [M-H]-, 650 [M+Na-2H]-; HRMS (ESI-) m/z C30H50N3O11の計算値628.3445 [M-H]-; 実測値628.3448.
(実施例6)
化合物5.1から5.3
i. Et3SiH、TFA、CH2Cl2次いでCH3(CH2)n-2CHCH2、DMPA、THF; ii. エチルアミノマルトシド(酢酸塩)、TBTU、DIEA、DMF; iii. Et2NH、CH2Cl2; iv. RCOOH(R=EtO2C(CH2)2CHCO2Me)、TBTU、DIEA、DMF; v. MeONa、MeOH次いでDowex; vi. LiOH、THF/H2O。
化合物5.1a
一般プロトコルLに従うことにより、L-Fmoc-Cys(Trt)-OH及びドデセンから化合物5.1a(白色固体、1.051g、2.06mmol、60%)を得た。
Rf=0.16(CH2Cl2/MeOH/AcOH 99:0.5:0.5); Tm=66〜68℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.17-1.40 (m, 18H), 1.57 (m, 2H), 2.56 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.03 (d, J = 4.7 Hz, 2H), 4.24 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 4.41 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 4.63 (m, 1H), 5.65 (d, J = 7.8 Hz, NHFmoc), 7.32 (m, 2H), 7.40 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.60 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 7.76 (d, J = 7.5 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.3 (CH3), 22.8 (CH2), 28.8-32.1 (9xCH2), 33.1 (CH2), 34.2 (CH2), 47.2 (CH), 53.6 (CH), 67.6 (CH2), 120.2 (2xCH), 125.3 (2xCH), 127.3 (2xCH), 127.9 (2xCH), 141.5 (2xC), 143.8 (C), 143.9 (C), 156.1 (C), 175.0 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 512 (100) [M+H]+; HRMS (ESI+) m/z C30H42NO4Sの計算値512.2829, 実測値512.2823.
化合物5.1b
一般プロトコルLに従うことにより、L-Fmoc-Cys(Trt)-OH及びテトラデセンから化合物5.1b(白色固体、1.050g、1.95mmol、57%)を得た。
Rf=0.16(CH2Cl2/MeOH/AcOH 99:0.5:0.5); Tm=71〜72℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.17-1.40 (m, 22H), 1.57 (m, 2H), 2.55 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.03 (d, J = 4.3 Hz, 2H), 4.24 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 4.41 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 4.63 (m, 1H), 5.65 (d, J = 7.8 Hz, NHFmoc), 7.31 (m, 2H), 7.40 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.60 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 7.76 (d, J = 7.5 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.2 (CH3), 22.8 (CH2), 28.8-32.1 (11xCH2), 33.1 (CH2), 34.3 (CH2), 47.2 (CH), 53.6 (CH), 67.6 (CH2), 120.1 (2xCH), 125.2 (2xCH), 127.2 (2xCH), 127.9 (2xCH), 141.4 (2xC), 143.8 (C), 143.9 (C), 156.1 (C), 175.5 (C); 質量(ESI-) m/z (%) 316 (100), 538 (40) [M+H]-; HRMS (ESI-) m/z C32H44NO4Sの計算値538.2991 [M-H]-, 実測値538.2970.
化合物5.1c
一般プロトコルLに従うことにより、L-Fmoc-Cys(Trt)-OH及びヘキサデセンから化合物5.1c(白色固体、1.248g、2.20mmol、64%)を得た。
Rf=0.16(CH2Cl2/MeOH/AcOH 99:0.5:0.5); Tm=70℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.14-1.40 (m, 26H), 1.57 (m, 2H), 2.56 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.03 (d, J = 4.5 Hz, 2H), 4.24 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 4.41 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 4.62 (m, 1H), 5.65 (d, J = 7.7 Hz, NHFmoc), 7.31 (m, 2H,), 7.40 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.60 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.76 (d, J = 7.5 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.3 (CH3), 22.8 (CH2), 28.8-32.1 (13xCH2), 33.1 (CH2), 34.2 (CH2), 47.3 (CH), 53.6 (CH), 67.6 (CH2), 120.2 (2xCH), 125.3 (2xCH), 127.3 (2xCH), 127.9 (2xCH), 141.5 (2xC), 143.8 (C), 143.9 (C), 156.1 (C), 174.9 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 568 (100) [M+H]+; HRMS (ESI+) m/z C34H50NO4Sの計算値568.3455 [M+H]+, 実測値568.3451.
化合物5.1d
一般プロトコルLに従うことにより、L-Fmoc-Cys(Trt)-OH及びオクタデセンから化合物5.1d(白色固体、1.230g、2.07mmol、60%)を得た。
Rf=0.16(CH2Cl2/MeOH/AcOH 99:0.5:0.5); Tm=74℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.13-1.40 (m, 30H), 1.57 (m, 2H), 2.56 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.03 (d, J = 4.4 Hz, 2H), 4.24 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 4.42 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 4.62 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 5.64 (d, J = 7.6 Hz, NHFmoc), 7.32 (m, 2H), 7.40 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.60 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.77 (d, J = 7.5 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.3 (CH3), 22.8 (CH2), 28.9-32.1 (15xCH2), 33.1 (CH2), 34.2 (CH2), 47.2 (CH), 53.6 (CH), 67.6 (CH2), 120.2 (2xCH), 125.3 (2xCH), 127.3 (2xCH), 127.9 (2xCH), 141.5 (2xC), 143.8 (C), 143.9 (C), 156.1 (C), 174.8 (C); 質量(ESI+) m/z (%) 596 (100) [M+H]+; HRMS (ESI+) m/z C36H54NO4Sの計算値596.3768 [M+H]+, 実測値596.3762.
化合物5.2a
一般プロトコルAに従うことにより、化合物5.1a及び2'-アミノエチル-4-O-(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル)-2,3,6-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシド(記載していない)から化合物5.2a(無色固体、1.036g、0.87mmol、60%)を得た。
Rf=0.29(シクロヘキサン/EtOAc 5:5); Tm=84〜85℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.86 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 1.16-1.38 (m, 18H), 1.50-1.62 (m, 2H), 1.99, 1.99, 2.01, 2.01, 2.03, 2.08, 2.11 (s, 21H), 2.45-2.60 (m, 2H), 2.76-2.96 (m, 2H), 3.32-3.44 (m, 1H), 3.46-3.56 (m, 1H), 3.61-3.71 (m, 2H), 3.75-3.84 (m, 1H), 3.90-3.98 (m, 2H), 4.03 (dd, J = 12.4, 2.2 Hz, 1H), 4.15 (dd, J = 12.2, 4.4 Hz, 1H), 4.18-4.28 (m, 3H), 4.34-4.47 (m, 2H), 4.51 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.52 (dd, J = 12.2, 2.5 Hz, 1H), 4.79 (dd, J = 9.3, 7.8 Hz, 1H), 4.84 (dd, J = 10.4, 4.0 Hz, 1H), 5.05 (t, J = 9.7 Hz, 1H), 5.23 (t, J = 9.3 Hz, 1H), 5.35 (dd, J = 10.4, 9.7 Hz, 1H), 5.39 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.77 (s, NH), 6.66 (s, NH), 7.27-7.33 (m, 2H), 7.41-7.47 (m, 2H), 7.59 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.75 (d, J = 7.4 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.3 (CH3), 20.6-21.1 (7xCH3), 22.8 (CH2), 28.9-32.1 (9xCH2), 32.8 (CH2), 34.8 (CH2), 39.7 (CH2), 47.3 (CH), 54.5 (CH), 61.6 (CH2), 62.7 (CH2), 67.3 (CH2), 68.2 (CH), 68.6 (CH2), 68.7 (CH), 69.5 (CH), 70.2 (CH), 72.3 (CH), 72.6 (2xCH), 75.3 (CH), 95.7 (CH), 100.5 (CH), 120.2 (2xCH), 125.2 (CH), 125.3 (CH), 127.2 (2xCH), 127.9 (2xCH), 141.5 (2xC), 143.9 (2xC), 156.0 (C), 169.6 (C), 170.0 (C), 170.1 (C), 170.3 (C), 170.5 (C), 170.7 (3xC); 質量(ESI+) m/z (%) 1196 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C58H81N2O21Sの計算値1195.4872 [M+Na]+, 実測値1195.4875.
化合物5.2b
一般プロトコルAに従うことにより、化合物5.1b及び2'-アミノエチル-4-O-(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル)-2,3,6-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシド(記載していない)から化合物5.2b(無色固体、708mg、0.60mmol、63%)を得た。
Rf=0.29(シクロヘキサン/EtOAc 5:5); Tm=90〜91℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.87 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 1.18-1.39 (m, 22H), 1.52-1.62 (m, 2H), 2.00, 2.00, 2.02, 2.02, 2.04, 2.09, 2.12 (s, 21H), 2.48-2.60 (m, 2H), 2.77-2.97 (m, 2H), 3.31-3.45 (m, 1H), 3.49-3.58 (m, 1H), 3.62-3.73 (m, 2H), 3.77-3.85 (m, 1H), 3.91-3.99 (m, 2H), 4.04 (dd, J = 12.4, 2.2 Hz, 1H), 4.16 (dd, J = 12.1, 4.4 Hz, 1H), 4.20-4.28 (m, 3H), 4.35-4.48 (m, 2H), 4.53 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.54 (dd, J = 12.1, 2.5 Hz, 1H), 4.80 (dd, J = 9.3, 7.8 Hz, 1H), 4.85 (dd, J = 10.4, 4.0 Hz, 1H), 5.05 (t, J = 9.7 Hz, 1H), 5.25 (t, J = 9.3 Hz, 1H), 5.35 (dd, J = 10.4, 9.7 Hz, 1H), 5.39 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.75 (s, NH), 6.66 (s, NH), 7.28-7.34 (m, 2H), 7.3-7.43 (m, 2H), 7.60 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.77 (d, J = 7.5 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.3 (CH3), 20.6-21.1 (7xCH3), 22.8 (CH2), 28.9-32.1 (11xCH2), 32.8 (CH2), 34.7 (CH2), 39.7 (CH2), 47.3 (CH), 54.5 (CH), 61.6 (CH2), 62.7 (CH2), 67.3 (CH2), 68.1 (CH), 68.6 (CH2), 68.7 (CH), 69.5 (CH), 70.2 (CH), 72.3 (CH), 72.6 (2xCH), 75.3 (CH), 95.7 (CH), 100.5 (CH), 120.2 (2xCH), 125.2 (2xCH), 127.2 (2xCH), 127.9 (2xCH), 141.5 (2xC), 143.9 (2xC), 156.0 (C), 169.6 (C), 170.0 (C), 170.1 (C), 170.3 (C), 170.5 (C), 170.7 (3xC); 質量(ESI+) m/z (%) 1201 (100) [M+H]+; HRMS (ESI+) m/z C60H85N2O21Sの計算値1201.5360 [M+H]+, 実測値1201.5359.
化合物5.2c
一般プロトコルAに従うことにより、化合物5.1c及び2'-アミノエチル-4-O-(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル)-2,3,6-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシド(記載していない)から化合物5.2c(無色固体、331mg、0.27mmol、31%)を得た。
Rf=0.29(シクロヘキサン/EtOAc 5:5); Tm=98〜99℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.16-1.40 (m, 26H), 1.52-1.62 (m, 2H), 2.00, 2.00, 2.02, 2.02, 2.04, 2.09, 2.12 (s, 21H), 2.49-2.59 (m, 2H), 2.77-2.97 (m, 2H), 3.34-3.45 (m, 1H), 3.47-3.58 (m, 1H), 3.62-3.73 (m, 2H), 3.77-3.85 (m, 1H), 3.91-3.99 (m, 2H), 4.04 (dd, J = 12.4, 2.2 Hz, 1H), 4.15 (dd, J = 12.1, 4.4 Hz, 1H), 4.20-4.28 (m, 3H), 4.35-4.47 (m, 2H), 4.53 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.54 (dd, J = 12.1, 2.5 Hz, 1H), 4.80 (dd, J = 9.3, 7.9 Hz, 1H), 4.85 (dd, J = 10.4, 4.0 Hz, 1H), 5.05 (t, J = 9.6 Hz, 1H), 5.24 (t, J = 9.3 Hz, 1H), 5.35 (dd, J = 10.4, 9.6 Hz, 1H), 5.39 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.75 (s, NH), 6.66 (s, NH), 7.28-7.34 (m, 2H), 7.37-7.43 (m, 2H), 7.60 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.76 (d, J = 7.4 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.3 (CH3), 20.6-21.1 (7xCH3), 22.8 (CH2), 28.9-32.1 (13xCH2), 32.8 (CH2), 34.7 (CH2), 39.6 (CH2), 47.3 (CH), 54.6 (CH), 61.6 (CH2), 62.6 (CH2), 67.3 (CH2), 68.1 (CH), 68.6 (CH2), 68.7 (CH), 69.5 (CH), 70.2 (CH), 72.3 (CH), 72.6 (2xCH), 75.3 (CH), 95.7 (CH), 100.5 (CH), 120.2 (2xCH), 125.2 (2xCH), 127.2 (2xCH), 127.9 (2xCH), 141.5 (2xC), 143.9 (2xC), 156.0 (C), 169.6 (C), 170.0 (C), 170.1 (C), 170.3 (C), 170.5 (C), 170.7 (3xC); 質量(ESI+) m/z (%) 1230 (100) [M+Na]+; HRMS (ESI+) m/z C62H89N2O21Sの計算値1229.5673 [M+H]+, 実測値1229.5680.
化合物5.2d
一般プロトコルAに従うことにより、化合物5.1d及び2'-アミノエチル-4-O-(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル)-2,3,6-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシド(記載していない)から化合物5.2d(無色固体、679mg、0.54mmol、63%)を得た。
Rf=0.29(シクロヘキサン/EtOAc 5:5); Tm=100℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.17-1.40 (m, 30H), 1.52-1.63 (m, 2H), 2.00, 2.00, 2.02, 2.02, 2.04, 2.09, 2.13 (s, 21H), 2.48-2.60 (m, 2H), 2.77-2.97 (m, 2H), 3.34-3.46 (m, 1H), 3.47-3.58 (m, 1H), 3.63-3.73 (m, 2H), 3.77-3.85 (m, 1H), 3.91-3.99 (m, 2H), 4.04 (dd, J = 12.4, 2.2 Hz, 1H), 4.16 (dd, J = 12.2, 4.4 Hz, 1H), 4.20-4.29 (m, 3H), 4.36-4.48 (m, 2H), 4.52 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.54 (dd, J = 12.2, 2.6 Hz, 1H), 4.80 (dd, J = 9.3, 7.8 Hz, 1H), 4.85 (dd, J = 10.5, 4.0 Hz, 1H), 5.06 (t, J = 9.7 Hz, 1H), 5.25 (t, J = 9.3 Hz, 1H), 5.36 (dd, J = 10.5, 9.7 Hz, 1H), 5.39 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.75 (s, NH), 6.64 (s, NH), 7.29-7.34 (m, 2H), 7.40 (m, 2H), 7.60 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.77 (d, J = 7.5 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm 14.3 (CH3), 20.5-21.1 (7xCH3), 22.8 (CH2), 28.9-32.1 (15xCH2), 32.8 (CH2), 34.7 (CH2), 39.6 (CH2), 47.3 (CH), 54.6 (CH), 61.6 (CH2), 62.7 (CH2), 67.3 (CH2), 68.1 (CH), 68.6 (CH2), 68.7 (CH), 69.5 (CH), 70.2 (CH), 72.3 (CH), 72.6 (2xCH), 75.3 (CH), 95.7 (CH), 100.5 (CH), 120.2 (2xCH), 125.2 (2xCH), 127.2 (2xCH), 127.9 (2xCH), 141.5 (2xC), 143.9 (2xC), 156.0 (C), 169.6 (C), 170.0 (C), 170.1 (C), 170.3 (C), 170.5 (C), 170.7 (3xC); 質量(ESI+) m/z (%) 1258 (100) [M+H]+; HRMS (ESI+) m/z C64H93N2O21Sの計算値1257.5986 [M+H]+, 実測値1257.5984.
化合物5.3a
一般プロトコルB、次いでA、J最後にFに従うことにより、化合物5.2a及び5-エトキシ-2-(メトキシカルボニル)-5-オキソペンタン酸(記載していない)から化合物5.3a(白色固体、50mg、0.06mmol、35%)を、ジアステレオマーの混合物の形態で得た。
Tm=96〜98℃; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.21-1.44 (m, 18H), 1.53-1.63 (m, 2H), 1.70-1.82 (m, 1H), 1.84-1.98 (m, 1H), 2.08-2.22 (m, 2H), 2.34-2.43 (m, 2H), 2.52-2.60 (m, 2H), 2.70-2.89 (m, 1H), 2.90-3.07 (m, 1H), 3.22-3.31 (m, 2H), 3.33-3.43 (m, 2H), 3.46 (dd, J = 9.8, 3.8 Hz, 1H), 3.48-3.58 (m, 2H), 3.58-3.73 (m, 5H), 3.77-3.95 (m, 4H), 4.29-4.35 (m, 1H), 4.46-4.58 (m, 1H), 5.16 (d, J = 3.7 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14.4 (CH3), 23.7 (2xCH2), 24.7-25.6 (CH2), 29.8-30.8 (9xCH2), 32.1-32.3 (CH2), 33.0 (CH2), 33.0-33.2 (CH2), 34.3-34.8 (CH2), 40.6-40.8 (CH2), 52.0-52.5 (CH), 54.4-55.0 (CH), 62.0-62.2 (CH2), 62.7 (CH2), 69.1-69.4 (CH2), 71.4 (CH), 74.1 (CH), 74.6-74.7 (CH), 74.7 (CH), 75.0 (CH), 76.4-76.6 (CH), 77.5-77.7 (CH), 81.0-81.3 (CH), 102.8 (CH), 104.1-104.4 (CH), 171.3-171.6 (C), 172.6-172.8 (C), 172.9-173.2 (C), 176.3-176.5 (C); 質量(ESI-) m/z (%) 384 (25) [M-CO2H]2-, 813 (100) [M-H]-; HRMS (ESI-) m/z C35H61N2O17Sの計算値813.3686 [M-H]-, 実測値813.3651.
化合物5.3b
一般プロトコルB、次いでA、J最後にFに従うことにより、化合物5.2b及び5-エトキシ-2-(メトキシカルボニル)-5-オキソペンタン酸(記載していない)から化合物5.3b(白色固体、52mg、0.06mmol、26%)を、ジアステレオマーの混合物の形態で得た。
Tm>130℃(分解); 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.21-1.44 (m, 22H), 1.53-1.63 (m, 2H), 1.72-1.83 (m, 1H), 1.82-2.00 (m, 1H), 2.07-2.23 (m, 2H), 2.35-2.45 (m, 2H), 2.52-2.61 (m, 2H), 2.70-2.90 (m, 1H), 2.90-3.07 (m, 1H), 3.22-3.30 (m, 2H), 3.33-3.43 (m, 2H), 3.43-3.48 (m, 1H), 3.48-3.58 (m, 2H), 3.58-3.73 (m, 5H), 3.77-3.95 (m, 4H), 4.29-4.35 (m, 1H), 4.46-4.58 (m, 1H), 5.16 (d, J = 3.7 Hz, 1H). 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14.4 (CH3), 23.7 (2xCH2), 24.7-25.6 (CH2), 29.8-30.8 (11xCH2), 32.1-32.3 (CH2), 33.0 (CH2), 33.0-33.2 (CH2), 34.3-34.8 (CH2), 40.6-40.8 (CH2), 52.0-52.5 (CH), 54.4-55.0 (CH), 62.0-62.2 (CH2), 62.7 (CH2), 69.1-69.4 (CH2), 71.5 (CH), 74.1 (CH), 74.6 (CH), 74.7 (CH), 75.0 (CH), 76.4-76.6 (CH), 77.6-77.7 (CH), 81.0-81.1 (CH), 102.9 (CH), 104.2-104.4 (CH), 171.0-171.7 (C), 172.6-172.8 (C), 172.9-173.2 (C), 176.3-176.5 (C); 質量(ESI-) m/z (%) 841 (100) [M-H]-; HRMS (ESI-) m/z C37H65N2O17Sの計算値841.4004 [M-H]-, 実測値841.4025.
化合物5.3c
一般プロトコルB、次いでA、J最後にFに従うことにより、化合物5.2c及び5-エトキシ-2-(メトキシカルボニル)-5-オキソペンタン酸(記載していない)から化合物5.3c(白色固体、82mg、0.09mmol、41%)を、ジアステレオマーの混合物の形態で得た。
Tm>145℃(分解); 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.21-1.44 (m, 26H), 1.53-1.63 (m, 2H), 1.72-1.82 (m, 1H), 1.82-2.00 (m, 1H), 2.08-2.23 (m, 2H), 2.32-2.45 (m, 2H), 2.52-2.61 (m, 2H), 2.70-2.90 (m, 1H), 2.90-3.07 (m, 1H), 3.22-3.31 (m, 2H), 3.33-3.43 (m, 2H), 3.46 (dd, J = 9.7, 3.7 Hz, 1H), 3.48-3.58 (m, 2H), 3.58-3.74 (m, 5H), 3.78-3.95 (m, 4H), 4.30-4.35 (m, 1H), 4.46-4.57 (m, 1H), 5.16 (d, J = 3.7 Hz, 1H). 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14.5 (CH3), 23.7 (2xCH2), 24.7-25.6 (CH2), 29.8-30.9 (13xCH2), 32.1-32.3 (CH2), 33.0 (CH2), 33.0-33.2 (CH2), 34.2-34.7 (CH2), 40.6-40.9 (CH2), 52.0-52.5 (CH), 54.3-54.9 (CH), 61.9-62.1 (CH2), 62.7 (CH2), 69.0-69.4 (CH2), 71.4 (CH), 74.1 (CH), 74.6 (CH), 74.7 (CH), 75.0 (CH), 76.4-76.5 (CH), 77.6 (CH), 81.0-81.2 (CH), 102.8 (CH), 104.1-104.3 (CH), 171.0-171.7 (C), 172.6-172.8 (C), 172.9-173.2 (C), 176.3-176.5 (C); 質量(ESI-) m/z (%) 412 (25) [M-CO2H]2-, 869 (100) [M-H]-; HRMS (ESI-) m/z C39H69N2O17Sの計算値869.4317 [M-H]-, 実測値869.4340.
化合物5.3d
一般プロトコルB、次いでA、J最後にFに従うことにより、化合物5.2d及び5-エトキシ-2-(メトキシカルボニル)-5-オキソペンタン酸(記載していない)から化合物5.3d(白色固体、81mg、0.09mmol、30%)を、ジアステレオマーの混合物の形態で得た。
Tm>155℃(分解); 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.21-1.43 (m, 30H), 1.53-1.63 (m, 2H), 1.71-1.82 (m, 1H), 1.86-1.98 (m, 1H), 2.07-2.22 (m, 2H), 2.32-2.43 (m, 2H), 2.52-2.60 (m, 2H), 2.69-2.90 (m, 1H), 2.90-3.07 (m, 1H), 3.22-3.30 (m, 2H), 3.33-3.43 (m, 2H), 3.45 (dd, J = 9.7, 3.7 Hz, 1H), 3.48-3.58 (m, 2H), 3.58-3.74 (m, 5H), 3.77-3.95 (m, 4H), 4.29-4.35 (m, 1H), 4.46-4.57 (m, 1H), 5.17 (d, J = 3.5 Hz, 1H). 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14.5 (CH3), 23.7 (2xCH2), 24.7-25.6 (CH2), 29.8-30.9 (15xCH2), 32.1-32.3 (CH2), 33.0 (CH2), 33.0-33.2 (CH2), 34.3-34.7 (CH2), 40.6-40.9 (CH2), 52.0-52.5 (CH), 54.4-54.9 (CH), 61.9-62.2 (CH2), 62.7 (CH2), 69.0-69.4 (CH2), 71.5 (CH), 74.1 (CH), 74.6 (CH), 74.7 (CH), 75.0 (CH), 76.4-76.6 (CH), 77.6 (CH), 81.0-81.2 (CH), 102.7-102.9 (CH), 104.1-104.4 (CH), 171.1-171.7 (C), 172.6-172.8 (C), 172.9-173.2 (C), 176.3-176.5 (C); 質量(ESI-) m/z (%) 426 (40) [M-CO2H]2-, 898 (100) [M-H]-; HRMS (ESI-) m/z C41H73N2O17Sの計算値897.4630 [M-H]-, 実測値897.4646.
(実施例7)
本発明の分子の280nmでの吸光度試験
本発明の分子を、BmrA及びAcrBである2つのバクテリア由来複数回膜貫通型膜タンパク質を使用して試験し、比較した。BmrAは、界面活性剤での抽出に敏感であることが機能のトポロジーにより特徴づけられる。BmrAは、細胞質基質、膜及び細胞外の3つのドメイン中に組織化されている複数回膜貫通型膜タンパク質である(図1)。
細胞質基質ドメインは、ヌクレオチド結合ドメインNBDと呼ばれる2つの部分からなり、共に存在する場合、ATPと結合し次いで加水分解する。膜ドメインも膜貫通ドメインTMDと呼ばれる2つの部分からなり、それぞれNBDに結合している。TMDは、触媒サイクルに依存して細胞の内側又は外側に配向している異なる立体構造になっている。これによりBmrAが細胞内空間(又は形質膜中)に存在する基質(図1中のS)を捕えることができ、これらを外部に排出できる。この種の流出ポンプは偏在している。これらはABCトランスポーターのファミリーに属し、この細胞は抗生物質、抗がん、抗真菌又は抗ウイルス治療により引き起こされる化学的ストレスの場合に過剰発現する。この輸送は、タンパク質の膜領域中に位置する薬物結合サイトの内部又は外部配向を変化させる立体構造変化により行われる(図1)。輸送後、タンパク質はATPの加水分解から発生するエネルギーを使用して、この最初の立体構造に戻る(Ward, A. B.ら Structures of P-glycoprotein reveal its conformational flexibility and an epitope on the nucleotide-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110、13386-13391頁(2013) ([19]); Martinez, L.ら Understanding polyspecificity within the substrate-binding cavity of the human multidrug resistance P-glycoprotein. FEBS Journal 281、673-682頁(2014) ([20]))。ATPの加水分解は機能性タンパク質を用いてのみ可能であり、特に膜領域で、このトポロジーは天然型である。界面活性剤による抽出は、例えばドデシルマルトシドを用いる場合等、一般的に有害である(Matar-Merheb、R.ら([11]))。
いくつかの試験をグラム陰性細菌の内膜に埋め込まれた3x100kDaの原核生物三量体であるタンパク質AcrBを用いても行い、この3D構造を解明した(Seeger, M. A.らStructural asymmetry of AcrB trimer suggests a peristaltic pump mechanism. Science 313、1295-1298頁(2006) ([21]))。
手順。本発明の分子及びC4C7(Matar-Merheb, R.ら([11]))(CALIXAR社により提供されている)も、図2に示した濃度で50mMのトリス-HCl、pH8.0中にて調製し、このpHに中和した。これらの吸収スペクトルは、Xenius SAFAS分光光度計を使用して示したように記録した。
結果。クリップのコンセプトは、WO2009144419([28])及びMatar-Merheb, R.らによる文献([11])にて開発された、脂肪族カリックス[4]アレーンC4Cnのコンセプトから導かれる。膜タンパク質を安定化するこれらの能力を示す利益があるにも関わらず、これらの界面活性剤は特に220から330nmの短波長で強く吸収する。これは図2の最初のパネルでC4C7を用いて説明されている。これらの280nmでのモル減衰係数は、15000mol/l/cmと非常に高い。全てのC4Cn界面活性剤は同一のカリックス[4]アレーン担体上にあるので、これら全てはこの特性を有している。したがって、これらは280nmでも検出されるタンパク質の吸収を遮蔽し、そのため、これらのタンパク質を生化学、特に精製プロトコルにおいて非常に普通に使用されるこの方法でモニターし、定量することを妨げる。
一方、本発明の分子は、図2に示したように220から500nm(及びそれ以上)では吸収しないか又はほとんど無視できる程度の吸収しかない。そのため、これらは280nmでのタンパク質の検出を妨害しない。
(実施例8)
本発明の分子による二価金属のキレート化試験
3つの酸官能基と結合したカリックス[4]アレーン構造は、対応する界面活性剤が二価金属を非常に効率的にキレート化することを意味する。本発明の分子の新規な設計は、この影響を取り除くことである。
手順。本発明の分子及びC4C12(Matar-Merheb, R.ら([11]))も、図3に示した濃度で50mMのトリス-HCl、pH8.0中にて調製し、このpHに中和した。次いで、濃MgCl2溶液を0、5及び10mMになるまで加えた。得られた溶液の濁度は600nmで記録した。
結果。以前に開発されているカリックス[4]アレーン界面活性剤の二価金属のキレート化能を下記図3に示す。C4C12の存在下で、MgCl2を濃度を増加しながら加えると、溶液の濁度が増加していくことを示しており、これはC4C12-マグネシウム錯体が沈殿することを反映している。沈殿は5mMのMgCl2から完結している。この相互作用は、BmrA等のATP分解酵素のATP分解酵素活性を測定する場合、7mM超のMgCl2が必要になり、カルシウム、マグネシウムの金属の存在が必要である酵素反応において不利であろう。本発明の分子は、2から4個のカルボキシル基を有するにも関わらず、この技術的問題を解決している。実際、C4C12と同様の条件下で試験した図3に示すように、マグネシウムを10mMまで加えてもマグネシウムとの不溶性錯体が形成されていない。
この金属との相互作用が無いことは、ニッケル又はコバルトを使用し、本発明の分子ではなくC4Cnを高濃度では行うことができない、金属アフィニティ型クロマトグラフィーの工程においても非常に有用である。
(実施例9)
本発明の分子の臨界ミセル濃度(CMC)の測定
手順。本発明の分子を50mMのトリス-HCl、pH8.0中0.1μMから10mMまでの濃度範囲で調製し、このpHで中和した。各溶液80μl(3回)に、同一容量の1,6-ジフェニル-1,3,5-ヘキサトリエン(DPH、Sigma社、D208000)10μMを加え、テトラヒドロフラン中100μMで調製し、次いでH2O中で10倍に希釈した。DPHの蛍光増加は、自体を挿入できるミセル中にクリップのミセルが見られる場合に起こる(Chattopadhyay, A. & London, E. Fluorimetric determination of critical micelle concentration avoiding interference from detergent charge. Anal Biochem 139、408-412頁(1984) ([22]))。蛍光は、358nmで励起し、430nmにて蛍光発光を記録することにより、場合に応じて、励起及び発光において9から10nmのスリット並びに100から150のゲインを有する、Xenius SAFAS蛍光光度計で読み取る。
結果。界面活性剤のCMCは、互いに会合してミセルの形成が始まる濃度であり、水溶液中では疎水性部分が中心に集まり、親水性領域が溶媒側に露出されている。このCMCは化合物DPHの蛍光増加を追跡することにより測定し、この蛍光はミセル中にこれ自体が挿入されると顕著に増加する(Chattopadhyay, A. & London, E. ([22]))。C13(3.7e)又はC18(3.7h)脂肪族鎖を有する化合物3.7を用いて得られた典型的な結果を図4に示す。下記表1に本発明の分子について得られた値を要約する。
化合物2.3b〜g及び3.7a〜dに関して脂肪族鎖の長さと共にCMCは減少することが従来通り観察されている。このことは、このCMCが高く変化が少ないシリーズ4の化合物(番号4.5〜4.6)には適用されておらず、これらの極性頭部が集合するには親水性が高すぎることを示している。実際、これらの化合物は3から4のカルボン酸基を有している。極性頭部の大きさが大きいと、これらのCMCは相対的に高い。したがって、使用者は所望の目的の関数として鎖の長さを変化させることができ、例えば高いCMCを有する界面活性剤を透析若しくは限外濾過することにより、又は他方、低いCMCを有する化合物を用いることによって後者を保持することにより、容易に脱離できるであろう。
(実施例10)
本発明の分子の直径
界面活性剤ミセルの他の物理化学的パラメータは、これらを球とした場合の直径である。この直径は光散乱(DLS)技術により得る。
手順。試験した本発明の分子を30mMのトリス-HCl、pH8.0中0.1から1000xCMCに拡張する濃度範囲で調製し、このpHで中和した。溶液を0.22μmで濾過する。測定は、Malvern Instruments社製Zetasizer Nano-Sで3回100μlにて行う。
結果。試験したクリップの推測直径は、化合物3.7jを除いて、3から5nmの次数、即ち界面活性剤として比較的小型のものである。それゆえミセルは、試験された化合物において20μMから2mMで変化するこれらのCMCに依存して小型である。化合物3.7jは例外であり、60nmの次数の非常に大きなものを形成する。ラウリルマルトースネオペンチルグリコールのように挙動する可能性がある(Chae, P. S.ら([6]); Chaptal, V.ら Quantification of detergents complexed with membrane proteins. Scientific Reports in press (2017)([23]))。結果を図5に示す。
(実施例11)
本発明の分子を用いるBmrA及びAcrBの抽出。
一連の界面活性剤の抽出能をBmrA又はAcrBが強く発現する膜で試験する。クリップ(本発明の分子)を用いる抽出を、参照として使用した市販の界面活性剤を用いて得られた抽出と比較する。
手順。BmrAは、使用した過剰発現システムに存在するタンパク質(大腸菌(E. coli)、C41DE3)の25%である。これらの膜は以前に記載されている(Matar-Merheb、R.ら([11]))通りに調製する。AcrB(膜タンパク質の約20%、BmrAと同様の発現システム)を含む膜を以前に記載されている(Seeger、M.A.ら([21]))通りに調製した。他に明記しない限り、界面活性剤は10g/lで使用し、タンパク質を20mMトリス-HCl緩衝剤、pH8.0、100mM NaCl、15%グリセロール中2g/lで希釈し、プロテアーゼ阻害剤(Roche社)をこれに1錠剤/100mlの量で加えた。混合物(T)を4℃で2時間インキュベートし、次いで抽出されていないもの(ペレット)から抽出された画分(上清、S)を分離するために4℃で1時間100000xgにて遠心分離した。上清を10%SDS-PAGE上に載せ、移動させた後、クーマシーブルーで染色する。フォスコリン12、DDM及びLMNGはAnatrace社から入手し、SDS及びトリトンX100はSigma-Aldrich社から入手する。
結果。界面活性剤の非存在下では、高速で遠心分離するとBmrA及びAcrBは沈降する(「T-」レーン対「S-」)ものの、小さな画分はこの処理に抵抗して懸濁したままであり、これは陰性試験(「S-」レーン)に対応している。全ての膜タンパク質を抽出するために使用した参照の界面活性剤であるSDS又はFC12の存在下では、BmrA及びAcrBは効率的に抽出され、抽出の陽性対照として本明細書に使用した対応する上清「SDS」又は「FC12」中に認められる。市販されている参照として本明細書に使用したDDM、TX100及びFC12は、2つのタンパク質を安定化する可能性がある(図6)。表2に要約しているように、本発明の分子の中、一部は2つのタンパク質を抽出し、他は2つのタンパク質を部分的に抽出し、残りのその他は2つのタンパク質を全く抽出しない。BmrAに関し、抽出する化合物は、1.4、2.3[a、d、f、g、h、i]、3.7[c、f、g、h、l]、4.5[d]、4.6d、5.3[a〜d]である。部分的に抽出する化合物群は、1.5、3.7[d、j]、4.5[b、c]であり、全く抽出しない化合物群は、2.3[b、c]、3.7[a、b、e、i、k]、3.9a、4.5a及び4.6aである。AcrBに関し、抽出する化合物は、1.5、2.3[a、b、c、d、e、f、g、h、i]、3.7[c、d、e、f、h、j、l]、4.5[b、c、d]、4.6[c、d]であり、部分的に抽出する化合物は4.5a、4.6dであり、抽出しない化合物は3.7[a、b、i、k]及び4.6aである。
選択的抽出。AcrBは膜タンパク質の領域で周知の結晶化不純物である。共精製する場合、痕跡量が結晶化され、多くの人工産物に導かれる(Psakis, G.、Polaczek, J. & Essen, L.-O. AcrBら: Obstinate contaminants in a picogram scale. One more bottleneck in the membrane protein structure pipeline. Journal of Structural Biology 166、107-111頁(2009) ([24]))。それゆえ、このタンパク質を抽出しないことにより、又は極く少量しか抽出しないことにより、この不純物を制限する界面活性剤を開発することは、市場で入手できる界面活性剤が選択できないので、大変有用である。この文脈において、化合物4.6b及び4.6dは、BmrAとは異なり、AcrBを抽出しないか又は極く少量しか抽出しないため能力に関して注目すべきである。逆に言えば、化合物1.5及び3.9aはより効率的にAcrBを抽出する。
(実施例12)
界面活性剤で抽出した後の膜タンパク質の機能安定性
前の実施例にてBmrAを抽出した本発明の分子を、種々の可溶化濃度より低い濃度及び可溶化濃度で試験し、タンパク質の天然の状態及び機能状態での効果を評価した。後者は、溶質の移動を伴う、輸送サイクル間でタンパク質により行われるATPの加水分解をモニターする。以前に報告されている(Matar-Merheb、R.ら([11]))ように、BmrAのATP分解酵素活性は、タンパク質の状態の高感度なマーカーであり、後者は抽出工程の間に使用した界面活性剤に特に高感度であり、当該界面活性剤は膜タンパク質と接触して脂質を置き換える。
手順。大腸菌C41DE3の形質膜中で産生され富化されたBmrAを、以前に記載されている(Matar-Merheb, R.ら([11]))通りに調製する。膜を、20mMのトリス-HCl緩衝剤、pH8.0、100mM NaCl、15%グリセロール中2g/lで希釈し、プロテアーゼ阻害剤(Roche社)をこれに1錠剤/100mlの量で加えた。界面活性剤を図7に示した濃度で加える。混合物(T)を4℃で2時間インキュベートし、共役酵素システムを使用してATP分解酵素活性を測定し、総活性からバナジン酸非感受性活性を分離した。Centeno, Fら Expression of the sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase in yeast. FEBS Lett 354、117-122頁(1994) ([25]))。次いで、抽出されていない画分(ペレット)から抽出された画分(上清、S)を分離するため、溶液を4℃で1時間100000xgにて遠心分離する。上清を10%SDS-PAGE上に載せ、移動させた後、クーマシーブルーで染色する(図8)。DDM、LMNG(Chae, P.S.ら([6]))、トリトンX100及びFA3(Lee, S. C.ら(2013) ([9]))を参照の界面活性剤として試験する。DDM及びLMNGはAnatrace社製であり、トリトンX100はSigma-Aldrich社から及びFA3はAvanti-Polars社製である。
結果。図7に示すように、可溶化濃度より低い濃度又は可溶化濃度で界面活性剤を加えると、BmrAの機能に影響するBmrAの構造変化を引き起こす。したがって、参照の界面活性剤の中で、Gタンパク質受容体の構造を解明するために最近成功裏に開発されたLMNG(Rasmussen, S. G.ら Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature 477、549-555頁(2011) ([26]))は、1mMまではBmrAの活性には比較的低い影響を有するが、タンパク質を溶解させるのに必要な濃度である10mMでは25%にまで活性を減少させる。本分野で非常に広く使用されているDDMは同様の効果に導き、これらの抽出を可能にする5mMを超える濃度では、BmrAのATP分解酵素活性を50から15%減少させる。最近開発されたステロイドに結合した1つのジマルトシドに相当するFA3(Lee, S. C.ら(2013) ([9]))は同様の効果を生み、タンパク質を抽出する濃度でBmrAのATP分解酵素活性を75%及び80%不活性化する。
最も効果的な化合物は3.7シリーズにグループ分けされ、これらのうちの最良のものは3.7[b、c、e、g、j、l]である。タンパク質のATP分解酵素活性を維持しながら(3.7j、l)又は1.5倍(3.7b、c、g)若しくは2倍(3.7e)増加させながら、BmrAを抽出する。この活性増加はABCトランスポーターの特性であり、この基礎活性は溶質の存在下で2.5倍まで増加でき、これは完全な機能状態を反映していることに注目すべきである。化合物3.7b及び3.7cは、トリアゾールを介して分子に結合したサッカリド、2つのカルボン酸基並びにC11及びC13の脂肪族鎖を含む、同一の設計を共有している。化合物3.7e及び3.7gは、サッカリドの代わりにマルトシド又はペグ化された鎖のいずれかを有する3.7cの変形形態である。
(実施例13)
本発明の化合物の存在下膜タンパク質の経時安定性の研究
前の試験から導かれる本発明の最高の化合物のうちの2つである3.7c及び3.7gについて、精製及び4℃での保管後、非常に長期間かけてBmrAの活性型を安定化させるこれらの能力を評価した。これら2つの界面活性剤を、これらの精製工程にて非常に広く使用されているDDMと、及び最近開発され機能安定性に関して大変有望であるFA3(Lee, S.C.ら(2013)([9]))とも比較した。これらの比較を可能にするため、界面活性剤を精製したBmrAのDDM中溶液に加え、次いで、4℃で40日間保存した。BmrAのATP分解酵素活性を、図9に示すように経時的に測定した。
手順。大腸菌C41DE3の形質膜中で産出され富化されたBmrAを、以前に記載されている(Matar-Merheb, R.ら([11]))通りに調製する。この膜画分20mgを、100mM NaPi pH8.0、15%グリセロール、100mM NaCl、10mMイミダゾール、1mM DTT中4℃で1g/lに希釈する。懸濁液にプロテアーゼ阻害剤(Roche社、1錠剤/50ml)及びベンゾナーゼ(Sigma社、30U/ml)を加える。次いで、膜タンパク質を4℃で1時間1%DDM(20mM)を加えることにより抽出する。溶液を100000xg、4℃で1時間遠心分離する(Optima XPN-80、50.2Ti)。上清を、緩衝剤A、100mM NaPi pH8.0、10%グリセロール、100mM NaCl、10mMイミダゾール、0.05%DDM(1mM、5xCMC)中で平衡化されたNi-NTA樹脂(GE healthcare社、HiTrap chelating HP)5ml上に2ml/分で装填する。樹脂を最初緩衝剤A(25ml)で、次いで2回目に緩衝剤B(=500mM NaCl及び15mMイミダゾールを含むA)25mlで、及び最後3回目に緩衝剤A(20ml)で洗浄する。BmrAを、緩衝剤A及び緩衝剤C(100mM NaPi、10%グリセロール、100mM NaCl、250mMイミダゾール、0.05%DDM(1mM、5xCMC))の濃度勾配で10mlにわたり溶出し、3ml/分で1mlの画分を採取する。ピークの画分を合わせ(3ml)、混合物を、400mlの冷緩衝剤D(50mM Hepes-HCl、pH8.0)、10%グリセロール、100mM NaCl、0.05%DDM(1mM、5xCMC)を4℃で2時間30分間に対して、次いで同一条件下終夜600mlに対して、カットオフが12-14000Daのチューブで透析する。透析液のタンパク質内容量(0.8g/L)を、ビシンコニン酸を用いてアッセイすることにより定量する(Smith, P. K.ら Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry 150、76-85頁(1985) ([27]))。溶液を、イミダゾール及びDDMを含まない緩衝剤Aでタンパク質を0.2g/lに希釈した4つの画分に分ける。最終の[DDM]は0.25mMである。各アリコートに0.087mMのDDM、FA3、3.7c又は3.7gを加え、4℃で40日間保管する。バナジン酸塩感受性ATP分解酵素活性、Centeno, F.ら([25])を、図9に示した時間で繰り返し測定する。
結果。図9に示したように、精製し、低濃度の界面活性剤の存在下では、BmrAは4℃で少なくとも20日間安定である。これを超えると、DDMの存在下のみ又はFA3を加えた場合に活性が損なわれている。それゆえ、これら2つの界面活性剤は、BmrA等の膜タンパク質を長期間安定化はできない。他方、3.7c又は3.7gを加えると、同一の条件下で20日を超えて安定化可能であり、少なくとも2倍の長さ、40日間BmrAを安定化する。それゆえこれら2つの化合物は、長期間安定化の顕著な特性を示し、膜タンパク質に関して現在までに報告されている最高のものである。
(実施例14)
本発明の化合物の存在下膜タンパク質の溶液中での挙動
天然状態で膜タンパク質を維持する本発明の化合物の能力を、本発明の化合物3.7cを用いて例証し、サイズ排除クロマトグラフィーによりモニターし、参照の界面活性剤DDMと比較した。結果を図10に示す。
手順:BmrAをDDM中で抽出し、実施例13にて記載したNi-NTAアフィニティクロマトグラフィーにより精製し、次いでSuperdex 200 10/300サイズ排除カラム上に装填し、50mM Hepes-HCl pH8.0、100mM NaCl、0.4mM DDM(2xCMC)で溶出した。BmrAを含む画分をプールし、4℃で維持しながら数個のアリコート(約100μg)に分割した。次いで、1つのアリコートを、樹脂1mlを含むアフィニティカラム上に再度装填した。次いでDDMを、DDMの2 CMC(参照実験)又は化合物3.7cの2 CMC(2mM)のいずれかを含むHepes-NaCl緩衝剤10容量に交換した。次いで、BmrAを、イミダゾール100mMを添加したそれぞれの緩衝剤中に溶出させた。タンパク質を含む画分を合わせ、50kDa amicon(再生セルロース)上で50μlに濃縮し、次いで50mM Hepes-HCl pH8.0、100mM NaCl及びDDMの2 CMC(0.4mM)又は3.7cの2 CMC(2mM)中で平衡化したSuperdex 200 5/150サイズ排除カラム3ml上に載せた。次いで、溶出をそれぞれの緩衝剤中0.3ml/分で行い、BmrAを280nmで検出した。
結果。図10に示すように、最初の界面活性剤(DDM)をこれ自体又は化合物3.7cのいずれかと交換した場合、BmrAは溶液中同じ挙動を有し、約1.6mlで溶出する。それゆえ、DDMの3.7cとの交換は、溶液中でのその二量化状態を変更させず、約1.2ml(8量体)若しくは1.4ml(4量体)で最大となるピークにより反映されると考えられるその凝集、又は1.8ml(単量体)でのピークにより可視化されるその解離のいずれにも導かれない。結果として、本発明の化合物3.7cは膜タンパク質の天然のオリゴマー化状態を保存する。
(実施例15)
本発明の化合物の存在下膜タンパク質の熱安定性の獲得
本発明者らは、本発明の化合物の存在下又は非存在下での、温度に対する膜タンパク質の安定性を研究し(図11A〜B)、温度により引き起こされた撹拌にも関わらずタンパク質の分子凝集力を維持する界面活性剤の能力を評価できる実験を行った。本発明者らは、BmrA(パネルA、B)について、これらをAshokらの手順(Y. Ashok、R. Nanekar、V.-P. Jaakola、Protein Eng. Des. Sel. 2015、28、539-542頁([34])に従って試験した。本発明者らは、本発明の化合物を標準としてのDDM並びに2つの最近設計された界面活性剤であるLMNG(Chaeら、([6]))及びFA3(Leeら、([9]))と比較し、これらの条件下での安定性の特性を示した。
手順。Y. Ashokら([34])に基づく。BmrA(タンパク質2g/l)の膜は、最終容量2mlで4℃にて2時間、0.5%(約10mM)のDDMを用いて、及び1mMの3.7d、3.7c、3.7b、3.7a、3.7i、3.7k、3.7f、3.7e、DDM、LMNG又はFA3を用いて又は用いずに可溶化した。次いで、可溶化した画分を、4℃で1時間100000xgにて遠心分離することにより清澄化した。次いで、上清を50μlずつのアリコートとし、それぞれPCR装置(PeqSTAR 2x濃度勾配; Peqlab)を使用して25℃から90℃の温度に30分晒した。次いで、試験を20000xgで40分間遠心分離し、上清を、抗His抗体を使用するSDS-PAGE及びウエスタンブロットにより分析した。次いで、各温度でのBmrAに関するバンドの相対強度を、Bio-Rad Image Labソフトウェア4.1を使用して定量した。各試験を繰り返した。次いで、強度を温度の関数としてプロットし、次いで3-パラメータのシグモンド式; Sigmaplot v12によりフィットさせた。
3.7cと共にインキュベートした各タンパク質画分に関する完全な実験を図11のパネルAに示し、溶液中にBmrAの50%が残っている見かけ上の融点Tmの推定を可能にする(点線)。示したように、本発明の化合物3.7d、3.7c、3.7j、3.7f及び3.7eは、BmrAに関して20℃から29℃への温度シフトを引き起こすが、他は特段の変化を引き起こさなかった。疎水性成分に関して明確な効果が観察され、大きくなるほど良好であった。96残基のC-末端トランケーションを用いて融合タンパク質A2AR中に17個の突然変異を導入することにより予め得られた熱安定性と同様の熱安定性が得られていることは注目すべきである(Magnaniら、([32]))。この結果により、本発明の化合物が、LMNG(Chaeら、([6]))、FA3(Leeら、([9]))及び最近公開されたノルボルネンに基づくマルトシド(NBM)(M. Das、Y. Du、O. Ribeiro、P. Hariharan、J. S. Mortensen、D. Patra、G. Skiniotis、C. J. Loland、L. Guan、B. K. Kobilkaら、J. Am. Chem. Soc. 2017、139、3072-3081頁, ([35]))等の最前線の非常に小さなシリーズの安定化させる界面活性剤に位置づけられ、これは1 log Tmより大きな増加を生じさせることができる。
(参照文献リスト)

Claims (13)

  1. 式(I)の化合物:
    (式中、
    Xは、-OH、
    、-S(CH2)nCH3、
    、-CO2R2又は
    を表し、
    Yは、-(CH2)nCH3、
    、-(CH2)2OR1又は
    を表し、
    Zは、-NHCO(CH2)nCH3、
    を表し、
    式中、
    R1は、単糖、二糖又はポリエチレングリコールを表し、
    R2は、H、Na又はKを表し、
    mは、4から21の範囲の整数であり、
    nは、4から21の範囲の整数であり、
    pは、1から3の範囲の整数であり、
    qは、1から5の範囲の整数であり、
    rは、1から10の範囲の整数であり、
    Cyは、シクロヘキシルを表す)
    又は薬学的に許容されるその塩。
  2. Xが、
    を表し、
    Yが、
    を表し、
    Zが、-NHCO(CH2)nCH3又は
    を表し、
    R1が、単糖、二糖又はポリエチレングリコールを表し、
    R2が、H、Na又はKを表し、
    mが、4から21の範囲の整数であり、
    nが、4から21の範囲の整数であり、
    pが、1から3の範囲の整数である、
    請求項1に記載の化合物又は薬学的に許容されるその塩。
  3. から選択される、請求項2に記載の化合物。
  4. Xが、-S(CH2)nCH3を表し、
    Yが、-(CH2)2OR1を表し、
    Zが、
    を表し、
    R1が、単糖、二糖又はポリエチレングリコールを表し、
    R2が、H、Na又はKを表し、
    nが、4から21の範囲の整数であり、
    pが、1から3の範囲の整数である、
    請求項1に記載の化合物又は薬学的に許容されるその塩。
  5. 下式
    の化合物である、請求項4に記載の化合物。
  6. 生体膜に結合している膜タンパク質の水溶液を請求項1から5のいずれか一項に記載の少なくとも1つの式(I)の化合物と接触させる工程を含む、生体膜に結合している膜タンパク質を抽出する方法。
  7. 膜タンパク質が、健康な又は改変された原核生物又は真核生物から得られる生体膜画分中に存在する、請求項6に記載の方法。
  8. 膜タンパク質が輸送タンパク質である、請求項6又は7に記載の方法。
  9. 輸送タンパク質がP-糖タンパク質(Pgp/ABCB1)、MRP1/ABCC1、MRP2/ABCC2、BCRP/ABCG2及びBmrAからなる群より選択されるABCトランスポーターである、請求項8に記載の方法。
  10. 抽出すべき膜タンパク質を含む水溶液を少なくとも1つの式(I)の化合物と接触させる工程を、5.5から10のpH範囲で行う、請求項6から9のいずれか一項に記載の方法。
  11. 膜タンパク質の水溶液を溶液中で請求項1から3のいずれか一項に記載の少なくとも1つの式(I)の化合物と接触させることからなる工程(i)を含む、水溶液中の膜タンパク質を溶液中で安定化させる方法。
  12. 請求項6から10のいずれか一項に規定した抽出工程により又は他の界面活性剤による抽出工程により、膜タンパク質を溶解させる、請求項11に記載の方法。
  13. 溶液中の前記タンパク質が、0℃から10℃の温度で1日を超える期間、安定化される、請求項11又は12に記載の方法。
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