CA2351664A1

CA2351664A1 - 2-acylamino-2-deoxy-glucono-1,5-lactones, procede d'obtention, c ompositions les comportant et utilisations

Info

Publication number: CA2351664A1
Application number: CA002351664A
Authority: CA
Inventors: Chadi Khoury; Michel Minier; Francois Le Goffic
Original assignee: Individual
Current assignee: Universite Pierre et Marie Curie Paris 6
Priority date: 1998-11-19
Filing date: 1999-11-19
Publication date: 2000-06-02
Also published as: WO2000031059A1; US6624190B2; JP2002530395A; FR2786187B1; FR2786187A1; US20020028954A1; AU1278100A; EP1131311A1

Abstract

La présente invention concerne les composés de formule (I) dans laquelle A représente R1 ou -C(O)R1 ou R1 représente un groupement alkyle comportant de 1 à 30 atomes de carbone, linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, pouvant êtr e substitué partiellement ou totalement par -Hal où Hal signifie -Cl, -Br, -I ou -F, et pouvant être interrompu par un ou plusieurs motifs choisis parmi -O-, - S-, -C(O)-, -NR3C(O)-, -Ph(R4)n- et -(CH2-CH2-O)n'-, dans lesquels R3 représente -H ou -(CH2)n"-CH3 où n" vaut de 0 à 17, R4 représente -H, -CH3, - C2H5, -C3H7 et n vaut de 0 à 4 et n' vaut 1,2 ou 3, ou R1 représente un radical cyclanique à racine diterpénique ou triterpénique, R2 représente un groupement alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C11. Elle concerne également leur procédé d'obtention, les compositions les comportant, et leur utilisati on à titre de tensioactif, et dans des processus enzymatiques mettant en oeuvre une chitinase, notamment la N-acétylglucosaminidase.

Description

2-ACYLAMINO-2-DEOXY-GLUCONO-I,5-LACTONES, PROCEDE D'OBTENTION, C OMPOS1TIONS
LES COM-PORTANT ET UTILISATIONS
La présente invention concerne de nouveaux composés du type 2-acyfamino-2-déoxy-glucono-1,5-lactone substitués, des compositions comportant de tels composés, tensioactives etlou biologiquement actives, des procédés d'obtention de ces composés ainsi que des composés intermédiaires pour leur obtention.
Des exemples de tensioactifs glycosylés comportant une fonction lactone sont cités dans la littérature. Pocaiyko et al. (1996) (5) et Kwoh et al. (1995) (3) décrivent la synthèse enzymatique de la 6-O-dodecyl gluconolactone, tandis que Kida et al. (1994) (1 ) passent par l'intermédiaire de la fonction lactone afin de synthétiser des tensioactifs dégradabies en milieu acide.
Toutefois, ces lactones ne comportent pas de motif N-acyl ou N-acetyl-glucosamine ; ce motif est important pour la reconnaissance de certaines enzymes.
Des exemples de synthèse d'inhibiteurs de N-acétyl glucosaminidase ont été cités dans la littérature par Pokorny et al., 1974 (6); Wolk et al. (7), 1992; Knapp et al. (2), 1996; Panday et al., 1998 (4).
Ces inhibiteurs présentent des inconvénients majeurs notamment leur faible constante de dissociation (entre 0,13 et 0,45 ~M) fait d'eux de puissants inhibiteurs inutilisables dans le cadre d'une séparation par affinité
car la récupération de l'enzyme nécessiterait des conditions opératoires qui pourraient entraîner sa dénaturation. Aucune des molécules concernées ne possède de propriétés tensioactives, et c'est le cas notamment pour la 2-acétamido-2-déoxy-glucono-1,5-lactone (Pokorny et al., 1974). Par conséquent, leur caractère purement hydrophile ne leur permet pas d'interagir avec des membranes biologiques en vue d'une éventuelle pénétration ou désorganisation cellulaire, ou avec des amphiphiles organisés en micelles ou liposomes en vue d'une vectorisation ou d'une séparation liquide/liquide.
On a maintenant mis en évidence qu'une nouvelle classe de composés du type 2-acylamino-2-déoxy-glucono-1,5 lactone substitués peuvent présenter l'avantage de posséder des propriétés dans le domaine des tensioactifs, des propriétés de biodégradabilité et d'étre biologiquement actifs.
Ainsi, la présente invention concerne les composés de formule (I) HO
F
NH
O

dans laquelle A représente R, ou -C(O)R, où R, représente un groupement alkyle comportant de 1 à 30 atomes de carbone, linéaire ou ramifié, saturé
ou insaturé, pouvant ëtre substitué partiellement ou totalement par -Hal où
Hal signifie -Ci, -Br-I ou -F, et pouvant étre interrompu par un ou plusieurs motifs choisis parmi -O-, -S-, -C(O)-, -NR3C(O)-, -Ph(R,)~- et -(CHZ-CHZ-O)~.-dans lesquels R3 représente -H ou -(CH2)~..-CH3 où n" vaut de 0 à 17, R4 représente -H, -CH3, -C2H$, -C3H, et n vaut de 0 à 4 et n' vaut 1, 2 ou 3, ou R, représente un radical cyclanique à racine diterpénique ou triterpénique, et R2 représente un groupement alkyle linéaire ou ramifié en C, à C".
Les composés de l'invention ont notamment les avantages des _ tensioactifs glycosylés à base de glucosamine comme la biodégradabilité.

3 De plus, certains de ces composés peuvent présenter des propriétés antimicrobiennes et antifongiques. Enfin, ces composés peuvent étre utiles dans des processus d'inhibition enzymatique ou de reconnaissance d'enzymes.
L'invention concerne également les procédés de prépa~~tion des composés de formule I ci-dessus. Ces procédés comportent au moins les étapes suivantes a) acylation du chlorhydrate de gfucosamine par le chlorure d'acide de formule R2C(O)CI ;
b) protection de l'hydroxyle en C1 par un groupe P,, en C3 et C4 par des groupes P2, et de l'hydroxyle en C6;
c) déprotection de l'hydroxyle protégé en C6 ;
d) 6-O-acylation par un composé de formule R,C(O)CI ou 6-O
alkylation par un composé de formule R,HaI pour obtenir le composé de formule OP~
NH
O

e) déprotection de l'hydroxyle protégé en C, pour obtenir le composé de formule

4 OH
NH
O

f) oxydation du composé obtenu en e) pour obtenir le composé de formule O
g) déprotection des groupements hydroxyle protégés en C3 et C, du composé en f) pour obtenir le composé de formule I, dans lesquelles A, RZ et Hal ont les mêmes significations que précédemment, et P,, P2 sont des groupements protecteurs.
De plus, selon un autre aspect de l'invention, celle-ci concerne, à
titre de composés intermédiaires, les composés ayant les formules suivantes NH
O

OP~
NH
O

OH

5 où A, R2, P, et PZ ont la même signification que précédemment.
En outre, la présente invention concerne les compositions comportant au moins un ou plusieurs composés de l'invention, un ou NH
O

NH
O

6 plusieurs composés obtenus par les procédés de l'invention ou produits intermédiaires dans ces procédés.
Enfin, l'invention concerne les composés de formule I à titre de tensioactifs ou de composés utiles dans un processus d'inhibition enzymatique ou de reconnaissance d'enzyme.
La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée et des exemples ci-après et au vu des figures annexées.
La figure 1 représente la variation de la tension superficielle de l'eau en fonction du logarithme de la concentration (en mol/I) du composé
de l'invention de formule I où A est C(O)C,H,S et R2 est CH3.
La figure 2 illustre l'effet inhibiteur de la 2-acétamido-2-déoxy-6-O-octanoyl-glucono-1,5-lactone de formule I où A est C(O)C,H,S et R2 est CH3 sur la N-acétyl glucosaminidase bovine.
La figure 3 représente le diagramme de Dixon confirmant l'inhibition compétitive de la N-acétyl glucosaminidase par le composé de l'invention de formule I où A est C(O)C,H,S et R2 est CH3.
La figure 4 illustre l'effet inhibiteur du composé où A est C(O)C,H,S
et R2 est CH3 sur les chitinases de Serratia marcescens.
Parmi les composés de l'invention, sont préférés ceux pour lesquels A représente -C(O)R, où R, représente un groupement comportant de 1 à 21 atomes de carbone, de préférence un groupement alkyle linéaire en C5 à C2,.
Parmi les composés de l'invention, sont également préférés ceux pour lesquels R2 représente un groupement alkyle n-CpH2p" où p vaut de 1 à 7.
Un des composés préférés de l'invention est celui pour lequel A est -C(O)-n-C7H,5 et R2 est CH3.
Dans le cas préféré de la 2-acétamido-2-déoxy-6-0-octanoyl glucono-1,5-lactone une reconnaissance spécifique d'enzymes du type N
acétyl glucosaminidase a été mise en évidence et quantifiée.

7 L'intérêt et l'originalité de cette molécule se résument en deux points importants : d'abord, son caractère tensioactif, révélé par l'abaissement de la tension superficielle de l'eau de 71 à 30 mNlm et par sa concentration micellaire critique de l'ordre de 25 mM (exemple 2). Ces données sont comparables à celle de tensioactifs glycosylés commerciaux comme l'HECAMEG ou le n-octyl glucoside qui sont largement utilisés en biochimie, par exemple pour la solubilisation de protéines membranaires, la formation de liposomes ou la stabilisation de conjugués immunoenzymatiques pour ELISA. La relativement grande CMC de cette molécule (25 mM) la rend facilement éliminable par dialyse tandis que sa structure lui permet d'être titrée par HPLC.
Ensuite, la structure lactone de cette molécule lui confère des propriétés biologiques intéressantes comme la reconnaissance spécifique des N-acétyl glucosaminidases {exemple 3). Comparée à celles des inhibiteurs connus de ce type d'enzyme, sa constante d'inhibition Ki de l'ordre de 3 ~.M la rend adéquate dans un contexte de séparation par affinité. L'équilibre lactone (forme fermée) et acide gluconique (forme ouverte) peut permettre une dissociation efficace du complexe ligand/enzyme via le changement du pH par exemple.
En ce qui concerne les procédés selon l'invention, il s'agit de la préparation d'une famille de tensioactifs glycosylés à partir d'une N-acyl glucosamine.
Les composés de structure N-acyf glucosamine sont généralement obtenus à partir de chlorhydrate de glucosamine -produit de l'hydrolyse acide de la chitine et d'un chlorure d'acide. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, le produit de départ est la N-acétyl glucosamine (NAG).
Pour les étapes de protection, les groupements P, et P2 ci-dessus sont des groupements protecteurs usuels convenables des groupes hydroxyles des carbohydrates. Par exemple, on peut utiliser le groupement protecteur allyle pour P, et le groupement protecteur benzyle pour P2, sans

8 que d'autres groupes de protection convenables soient exclus.
De même, la protection en C6 peut être réalisée avec un groupement trityle (Tr), sans exclure d'autres groupements protecteurs convenables ; la déprotection de l'hydroxyie protégé par Tr en C6 est réalisée en milieu acide, dans ce mode particulier de réalisation.
De préférence, la désallylation est mise en oeuvre dans des conditions douces ; enfin, la déprotection des hydroxyles en C3 et C4 se fait, dans un mode de réalisation particulier, par hydrogénation catalytique.
Dans le schéma réactionnel, Hal représente Cl, Br, 1 ou F, le chlore et le brome étant préférés dans le mode de réalisation décrit ci-après.
Le procédé de synthèse consiste à
1 ) protéger par un groupement P" par exempte allyle l'hydroxyle en C1, 2) protéger par un groupement protecteur, par exemple trityle (Tr) l'hydroxyle en C6, 3) protéger par des groupements P2, par exemple benzyle les hydroxyles en C3 et C4, 4) déprotéger l'hydroxyle en C6, 5) 6-O-acyler par un chlorure d'acide ou 6-O-alkyler par un halogénure d'alkyle, 6) déprotéger en C1, 7) oxyder en C1 pour obtenir la lactone, et 8) déprotéger les hydroxyles en C3 et C4, selon le schéma suivant

9 PCT/FR99/02861 OH
HO N-Acylation HO
h ~ f OH OH
NHZ .HC1 NH
O

OH OH
HO Allylation HO
OH
N H OAII
NH
O O

OH OTr HO Tritylation I. --~ HO
NH OAII NH OAII
O O

HO Benzylation B~O
Bi OAII
NH NH OAII
O O

OTr BnB ô ~" Déprotection en C6 Bn0 ' Br NH OAII OAfI
NH

O

S-O-acylation Bn0 6-O-alkylation Bn0 Br Br NH OAII NH OAII
O
O
R2 R . _.

WO 00!31059 PCT/F'R99/02861 Bn0 rotection en C1 Bn0 Br ~ Bi NH NH
O O

OA OA
Bn0 Oxydation Bn0 Bi ~ Br OH
NH NH
O O

O Déprotection en C3 et BnBnO O > HO
NH
NH
O

La structure et fa pureté des produits obtenus peuvent étre déterminées par spectrométrie de masse, par RMN ~ H et ~ 3C, et par analyse élémentaire, comme cela apparaîtra dans les exemples.
Les propriétés tensioactives de cet exemple particulier ont été
déterminées par mesure de la tension superficielle de solutions de S différentes concentrations. La concentration micellaire critique (CMC) a été
ainsi évaluée.
De plus, l'affinité de cette molécule pour différentes enzymes de type glycosidase a été estimée par l'étude de l'inhibition de leur activité.
Les enzymes testées sont par exemple la N-acétyl glucosaminidase bovine, les chitinases de S. marcescens ayant une activité chitobiase et le lysozyme.
De plus, selon un autre aspect de l'invention, celle-ci concerne les compositions comportant les composés de l'invention. En effet, les composés ci-dessus peuvent être utilisés du tait des propriétés suivantes etlou dans les applications suivantes - ligand tensioactif pour une séparation liquide /liquide par affinité, - effet bactéricide ou fongicide résultant de propriétés inhibitrices en association avec une pénétration cellulaire facilitée, - inclusion dans des vésicules ou liposomes pour transporter des , enzymes ou des substances actives, - incorporation possible dans des préparations cosmétiques ou dermatologiques, - activité biologique par inhibition d'enzymes, notamment des enzymes réalisant des réactions impliquant la N-acétyiglucosamine, telles que les chitinases et les N-acétyl glucosaminidases.
C'est pourquoi l'invention concerne les compositions comportant au moins un ou plusieurs composés de l'invention, un ou plusieurs composés obtenus par le procédé de l'invention ou un ou plusieurs composés intermédiaires.
Ces compositions peuvent être prévues notamment pour un usage cosmétique ou pharmaceutique et comporter alors un support acceptable pour ces applications. Elles peuvent aussi être envisagées pour une application pesticide, antibactérienne, antifongique, insecticide ou antivirale, et comporter alors un support acceptable pour ces applications.
Les compositions de l'invention peuvent aussi être des compositions détergentes, par exemple destinées au milieu industriel.
Les compositions détergentes selon l'invention sont caractérisées en ce qu'elles contiennent de 0,1 à 60% en poids d'un ou plusieurs composés de l'invention, ainsi que 40 à 99,9% d'un support acceptable pour cette application, par exemple une base détergente. La base détergente est usuellement choisie parmi tes tensioactifs anioniques, non ioniques, cationiques ou amphotères et les mélanges de ces composés.
L'adjuvant est usuellement choisi parmi les adjuvants ou les mélanges d'adjuvants connus dans le domaine des lessives.
Les compositions cosmétiques selon l'invention sont caractérisées en ce qu'elles contiennent de 0,1 à 50%, de préférence 5 à 35%, en poids d'un ou plusieurs composés de l'invention et un excipient etlou une base détergente et/ou un adjuvant.
Les compositions cosmétiques peuvent se présenter sous la forme de savon liquide doux, shampooing, bain moussant, gel douche ou formule de soins, notamment pommade, crème et lait, solution aqueuse ou hydroalcoolique.
Lorsque la composition de l'invention est un savon liquide doux, elle peut comporter de 5 à 35% en poids d'un composé de l'invention et de 70 à 95% en poids d'un excipient.
Certains excipients, bases détergentes et adjuvants sont généralement choisis parmi les composés connus de l'homme du métier.
On peut citer notamment les composés décrits dans la demande de brevet EP 769499.
Lorsqu'elles sont utilisées pour le traitement de la peau ou des cheveux, elles peuvent se présenter sous forme de crème, de lait, d'émulsion (eau dans l'huile ou huile dans l'eau), de gel, de solution aqueuse ou hydroalcoolique. Elles contiennent alors en plus des adjuvants tels que les parfums, colorants, agents conservateurs, agents épaississants et agents émulsifiants, tout autre produit usuel et connu dans l'état de la technique et couramment utilisé pour formuler des compositions de ce type.
Les compositions destinées au nettoyage des cheveux peuvent se présenter sous la forme de solution aqueuse ou hydroalcoolique, d'émulsion, de crème, de lait, de gel et éventuellement être conditionnées sous forme d'aérosol avec un agent propulseur.
Lorsque les compositions sont prévues pour un usage pharmaceutique, elles comportent un support pharmaceutiquement acceptables et peuvent être sous forme de solution aqueuse, hydroalcoolique, gel, crème, sirop ou aérosol et contenir des adjuvants usuels et pharmaceutiquement acceptables pour l'application prévue.
Des formulations où les composés de l'invention sont sous forme de micelles inverses peuvent être utiles, pour leur application à l'extraction liquide-liquide de N-acétyl glucosaminidase notamment. On peut envisager de préparer des solutions dans un solvant apolaire comme l'isoctane par exemple, et comportant de 50 à 250 mM d'AOT (Dioctyle sulfosuccinate de sodium), de 1 à 2,5 mM d'un ou plusieurs composés de l'invention, et de 0,5 à 6 M d'eau, éventuellement additionnée de sel, et comportant éventuellement par exemple un tampon (90% KCI 0,1 M/10% tampon phosphate 0,01 M pH 7), et éventuellement un ou plusieurs co-solvants et/ou co-tensioactifs.
Pour certaines applications, il est possible de préparer des liposomes unilamellaires comportant par exemple, en milieu aqueux, des phospholipides et un ou plusieurs composés de l'invention.
De plus, les compositions de l'invention peuvent être utilisées pour les propriétés biologiques des composés de l'invention, notamment dans des processus d'inhibition enzymatique ou de reconnaissance d'enzyme.
Les exemples ci-après comportent de telles compositions. De façon générale, elles comportent outre un ou plusieurs composés de l'invention, de l'eau, un tampon aqueux par exemple un tampon acétate pH 4,5 (0,2 M) ou phosphate pH 6,6 (0,2 M) ; un support hydroalcoolique comportant un ou plusieurs alcools et adjuvants usuels et convenables pour l'application 5 donnée.
Les compositions peuvent aussi être sous forme d'émulsions ou pré-émulsions, comportant par exemple des émulsifiants, adjuvants et épaississants usuels et convenables pour l'application envisagée, ou encore sous forme de gel.
Matériel et méthodes Détermination de la Concentration Micellaire Critique La tension superficielle y du liquide au contact de l'air est mesurée à 25°C par la méthode de la plaque de Wilhelmy (tensiomètre TENSIMAT
n3-Prolabo). Celle-ci consiste à plonger verticalement dans un liquide une lame en platine (de largeur 19,54 mm), puis de la retirer progressivement en suivant la tension exercée par le film liquide sur la lame. La valeur maximale lue avant l'arrachement complet de la lame représente la tension superficielle exprimée en mN/m. Après étalonnage de l'appareil (étalonnage en deux points : la valeur zéro avec la lame à l'air et !a valeur 50,2 mN/m avec la lame lestée d'un poids de 200 mg), les tensions superfcielles de solutions contenant des quantités croissantes du produit tensioactif sont lues (mesures répétées trois fois). La concentration micellaire critique est obtenue à partir des diagrammes classiques y = f(Log C) où C représente la concentration exprimée en mol/l.
Étude de l'inhibition en~matioue a) Cas de la N-acétylglucosaminidase (NaGase) L'enzyme utilisée comme témoin est la ~-N-acétylglucosaminidase (EC 3.2.1.52) de rein bovin (Sigma A-2415) et son substrat est le p-nitrophényl 2-acétamide-2-déoxy glucopyranoside (Acros 22941-1000) (pNphNAG). L'enzyme commerciale, sous forme de suspension dans une solution 3,2M de (NH4)2S04, est centrifugée à 13000 rpm pendant 5 minutes et le culot est repris dans 1 ml d'eau. La solution obtenue sera la S solution enzymatique mère.
Protocole : 100 pl de la solution enzymatique diluée au 1/10 sont mélangés à 100 ~I de tampon citrate pH 4,2 et à 300 pl de la solution d'inhibiteur (ou d'eau pour la référence) et l'ensemble est incubé à
37°C
pendant 5 minutes dans une cuve de spectrophotomètre. Après addition de 500 ~I de substrat (à 5 mM ou à 2,5 mM), l'incubation est continuée pendant 8 minutes à 37°C et la densité optique à 400 nm est suivie. La quantité de p-nitrophénol libérée par la réaction enzymatique est déterminée par la corrélation de la densité optique à une courbe étalon D0400nm = f([p-nitrophénol]). L'unité d'activité N-acétylglucosaminidase est définie par la quantité d'enzyme nécessaire pour libérer une mole de p-nitrophénol par minute dans les conditions sus-citées.
b) Cas des chitinases de Serratia marcescens On étudie ici l'activité chitobiase d'une solution de chitinases partiellement purifiées sur une colonne échangeuse d'anions (Pharmacia) Mono P 5/20. Le substrat utilisé dans ce cas est le pNphNAG à 5 mM.
Protocole : 100 ~I de la solution enzymatique diluée 4 fois sont mélangés à 100 pl de tampon citrate pH 4,2 et à 300 ~I de solution d'inhibiteur (ou d'eau pour la référence) dans une cuve de spectrophotomètre. Après incubation pendant 5 minutes à 37°C, sont ajoutés au mélange 500 ~I de la solution de pNphNAG à 5 mM. Les cinétiques d'évolution de la densité optique à 400 nm sont suivies pendant 8 minutes. Les quantités de p-nitrophénol libérées sont comparées entre les échantillons contenant des quantités croissantes d'inhibiteur.

c) Cas du lysozyme L'enzyme étudiée est le lysozyme de poule (Sigma, L-6876) à 0,5 g/I dans du tampon phosphate 100 mM pH 6,5 et le substrat est constitué
de parois de Micrococcus lysodeikticus (Sigma) à 17 mg/100 ml en suspension dans le même tampon.
Protocole : 100 ~I de solution enzymatique sont dilués avec 400 pl de la solution d'inhibiteur. L'ensemble est laissé à température ambiante pendant 5 ou 10 minutes. Ensuite, 40 pl du mélange sont ajoutés à 3 ml de la suspension de substrat dans une cuve de spectrophotomètre. La densité
optique est lue à 450 nm toutes les 10 secondes pendant 3 minutes.
On définit 150 comme la concentration de composé capable d'inhibé r 50% de l'activité enzymatique dans les conditions du dosage.
Exemple 1 : Synthèse chimique de la 2-acétamido-2-déoxy-6-O-octanoyl-glucono-1,5-lactone à partir de N-acétyl glucosamine (NAG).
L'étape 1 consiste en ta préparation de l'allyl 2-acétamido-2-déoxy-glucopyranoside (b) à partir du NAG
35 g de NAG et 3,5 ml de BF3,Et20 ont été ajoutés sous Argon à
350 ml d'alcool allylique. L'ensemble a été porté à reflux pendant 3 h.
Après refroidissement, les solvants ont été évaporés pour donner un gel solide de couleur jaune clair. Ce dernier a été lavé pendant une nuit dans de l'éther puis recueilli par filtration. Après broyage et séchage des agrégats, une poudre blanche a été obtenue : 40 g (Rendement 97%).
L'étape 2 consiste en la préparation de l'allyl 2-acétamido-2-déoxy-6-O-trityl-glucopyranoside (c):
8,4 g de (b) ont été ajoutés à 90 ml de pyridine contenant 12 g de chlorure de triphénylméthane (TrCI). Après 24 h de réaction à température ambiante, le mélange réactionnel a été chauffé à 90°C pendant 1 h.
Après refroidissement, ie mélange a été versé dans de l'eau glacée puis extrait avec du chloroforme. Après lavage à l'eau, séchage, puis évaporation des WO 00/31059 _ PCT/FR99/02861 solvants, on a obtenu une gomme épaisse. Cette demiére a été reprise dans l'éthanol absolu puis reprécipitée dans de l'éther pour donner un solide de couleur brune: 10,5 g (Rendement = 65%).
L'étape 3 consiste en la préparation de l'allyl 2-acétamido-2-déoxy-6-O-trityl-3,4-O-dibenzyl-glucopyranoside (d) g de (c), 12 g de KOH et 7 ml de bromure de benzyle dans 340 ml de toluène ont été portés à reflux pendant 3 h. La suspension obtenue a été alors filtrée à chaud sur célite et les résidus solides ont été lavés au toluène chaud. Les filtrats ont été rassemblés et lavés. Après séchage,

10 évaporation des solvants, un solide blanc jaune a été obtenu : 12 g (Rendement = 88%).
L'étape 4 consiste en la préparation de l'allyl 2-acétamido-2-déoxy-3,4-O-dibenzyl-glucopyranoside (e) 5 g de (d) ont été dissous dans 125 ml d'un mélange méthanol/dichlorométhane (30 :70) contenant 4% (m/v) d'acide para toluène sulfonique (APTS). L'ensemble a été agité à température ambiante pendant 3 h. Le mélange réactionnel a été ensuite neutralisé, lavé à Peau puis séché. Après évaporation des solvants, le produit brut obtenu a été
purifié sur silice pour donner un solide blanc : 2 g (Rendement = 62%).
L'étape 5 consiste en la préparation de l'allyl 2-acétamido-2-déoxy-6-0-octanoyl-3,4-O-dibenzyl-glucopyranoside (f):
9,5 g de (e) et 5 g de chlorure d'octanoyle dans 150 ml de toluène ont été portés à reflux à 90-95°C pendant 4 h. Après refroidissement, le mélange réactionnel a été versé dans 600 ml d'eau et extrait avec du toluène. Les phases organiques ont été rassemblées, lavées au NaHC03 puis à l'eau. Finalement, après séchage et évaporation des solvants, le produit brut a été purifié sur silice pour récupérer 8,6 g de (f) (Rendement =
70%).
L'étape 6 consiste en la préparation du 2-acétamido-2-déoxy-6-O-octanoyl-3,4-O-dibenzyl-glucopyranose (g) 8 g de (f), 1,2 g de Diazabicyclooctane (DABCO) et 3 g de chlorure de Tris triphényl phosphine Rhodium (Rh(PPh3)3C1) dans 400 ml d'une solution aqueuse de méthanol à 90% (v/v) ont été portés à reflux pendant 4 heures. Après filtration sur papier filtre et concentration, l'ensemble a été
repris dans 250 ml de chloroforme, lavé à l'acide citrique 5% (m/v) puis à
l'eau. Après séchage et évaporation des solvants, le mélange brut a été
repris dans 150 ml d'une solution aqueuse d'acétone à 90% (v/v). On y a ajouté 3 g de HgCl2 et on a laissé l'ensemble sous agitation à température ambiante pendant 60 minutes.
Les solvants ont été ensuite évaporés et les résidus ont été repris dans du chloroforme. La phase organique a été lavée avec une solution saturée de KI puis avec de l'eau. Après séchage, l'évaporation des solvants a fourni une huile épaisse. La chromatographie sur cotonne de silice a donné un produit pur : 5 g (Rendement = 67%).
L'étape 7 consiste en la préparation du 2-acétamido-2-déoxy-6-O-octanoyl-3,4-O-dibenzyl-glucono-1,5-lactone (h) Dans un tricot muni d'une ampoule à brome et d'une entrée / sortie d'Argon, 5 ml de dichlorométhane (DCM) contenant 0,16 ml de chlorure d'oxalyle ont été refroidis à -70°C. 0,26 ml de diméthylsulfoxide dilués dans 4 ml de DCM ont été ajoutés goutte à goutte et le mélange a été laissé à -70°C sous agitation pendant 10 minutes. 200 mg de (g) ont été dissous dans du DCM puis ajoutés goutte à goutte au mélange. Après 45 minutes de réaction, 1 rnl de triéthylamine (TEA) a été rajouté et l'ensemble a été
gardé à -70°C pendant 30 minutes. Le mélange a été amené à
température ambiante et lavé à l'eau. Les deux phases ont été séparées et la phase aqueuse a été extraite 2 fois avec du DCM. Les phases organiques ont été rassemblées et lavées avec une solution d'HCI 1 N, une solution de NaHC03 5% puis trois fois à l'eau. La concentration de la phase organique a .produit une huile claire de masse 187 mg.
Rendementt= 94%.
L'étape 8 consiste en la préparation du 2-acétamido-2-déoxy-6-O-octanoyl-glucono-1,5-iactone (i) WO 00/31059 PCTlFR99/02861 160 mg de (h) ont été dissous dans 10 ml de méthanol contenant 180 mg de Palladium sur charbon 10%. La suspension a été agitée sous atmosphère d'hydrogène pendant une nuit. Le catalyseur a été enlevé par filtration sur papier filtre et le filtrat a été refiltré sur coton.
L'évaporation du 5 solvant a fourni un gel solide de masse 92 'mg (rendement 87%).
Formule brute C16H27N07. Masse molaire : 345.
Spectrométrie de masse [M+H]+ = 346 10 [M+NH4~+ = 363 RMN 1 H (solvant DMSO deutéré) 8(ppm) = 0,82 (t, 3H, CH3); 1,21 (m, 8H, CH2); 1,48 (m, 2H, CH2); 1,89 (s, 3H, CH3); 2,29 (t, 2H, CH2); 3,2-4,87 (m, 8H, OH, CH, CH2); 7,99 (d, 1 H, 15 NH).
RMN 13C (solvant DMSO deutéré) 8(ppm) = 14,0; 22,1; 22,5; 24,5; 28,5; 28,5; 31,2; 33,6; 55,8; 65,9; 68,5;
69,3; 71,6; 169,6; 171,4; 173,1.
Analyse élémentaire Calculé : Trouvé
C : 55,6% C : 51,8%
H : 7,82% H : 7,72%
N : 4,05% N : 4,08%
Exemple 2 : Propriétés tensioactives. Détermination de la concentration micellaire critique (CMC).
On a suivi l'évolution de la tension superficielle y(en mN/m) d'une solution aqueuse (volume = 10 ml) en fonction des quantités de produit (C
en Molll) (A = C(O)C,H,S et RZ = CH3) dissous. Les résultats obtenus sont illustrés dans la figure 1. La concentration micellaire critique correspond à
la concentration au dessus de laquelle la tension superficielle devient constante.
On note tout d'abord le caractère tensioactif de la molécule, confirmé par l'abaissement de ia tension supeficielle de 71 à 30 mN/m pour des concentrations allant de 0 à 25 mM (soit 8,6 g/l).
La CMC du 2-acétamido-2-déoxy-6-0-octanoyi glucono-1,5-lactone est égale à 25 mM, et est du même ordre de grandeur que celles de l'HECAMEG (22 mM) et de l'octyl glucoside (18 mM).
Exemple 3 : Propriétés biologiques : inhibitions enzymatiques.
On a testé l'affinité de la 2-acétamido-2-déoxy-6-O-octanoyl glucono-1,5-lactone de l'exemple 2 pour trois sortes de gfycosidases, la N-acétyl glucosaminidase bovine, les chitinases de Serratia marcescens et le lysozyme de poule en évaluant le pouvoir inhibiteur de cette molécule sur ces enzymes.
a) Cas de la N-acétyl glucosaminidase bovine Nous avons suivi colorimétriquement les quantités de p-nitrophénol libéré (en 10'3 ~mol/mn) par l'action de la N-acétyl glucosaminidase (NaGase) sur le pNphNAG (à 2,5 mM) en présence de quantités croissantes de (i) (concentration C en ~M). Les résultats illustrant l'activité
NaGase obtenus sont montrés dans la figure 2.
L'inhibition de la N-acétyl glucosaminidase par (i) se trouve donc démontrée. La 150 de (i) est de l'ordre de 7 ~M.
Pour déterminer la constante d'inhibition Ki, nous avons utilisé la méthode graphique de Dixon qui consiste à tracer l'inverse de la vitesse initiale (1/vo) de la réaction enzymatique en fonction de la concentration d'inhibiteur (C en pM) pour deux concentrations différentes de substrat.
L'abscisse du point d'intersection des deux droites correspond à - Ki.
Avec fes deux concentrations de substrat 2,5 et 5 mM nous avons obtenu les droites de la figure 3. Ces résultats confirment le caractère d'inhibition compétitive de (i), propre aux analogues de l'état de transition, et donnent une estimation de Ki de l'ordre de 3 pM.
b) Cas des chitinases de Serratia marcescens De la mëme façon, les quantités de p-nitrophénol libérées par l'activité chitobiase des chitinases de S. marcescens sur le p-nitrophényl-NAG e;~ présence de concentrations (C en ~M) de (i) allant de 0 à 1,3 mM
ont été mesurées.
Les résultats représentés sur la figure 4 montrent que ta 2-acétamide-2-déoxy-6-O-octanoyl-glucono-1,5-lactone a une affinité pour certaines chitinases de Serratia marcescens puisque cette molécule peut inhiber l'activité chitobiase d'un échantillon partiellement purifié de ces enzymes.
La 150 dans ce cas est de l'ordre de 1,2 mM.
c) Cas du iysozyme Aucune différence n'a été décelée entre l'activité d'une solution de lysozyme à 0,1 mg/ml en présence ou non de (i) à une concentration égale à 1,8 mM.
En résumé, on peut conclure que la 2-acétamide-2-déoxy-6-O-octanoyl-glucono-1,5-lactone {i) est plus affine pour !a N-acétyl giucosaminidase bovine que pour les chitinases de S. marcescens, et n'est pas du tout affine pour le lysozyme.

(1) Kida T., Morishima N. Masuyama A; et Nakatsuji N. (1994) New cleavable surfactants derived from glucono-1,5-lactone. J. Am. Oil Chem. Soc. 71, (7), 705-710.
(2) Knapp S., Vocadlo D., Gao Z., Kirk B., Lou J. et Withers S. (1996) NAG-Thiazoline, an N-acetyl-b-hexosaminidase inhibitor that implicates acetamido participation. J. Am. Chem. Soc. 118, 6804-6805.
(3) Kwoh D., Pocalyko D., Carchi A., Harirchian B., Hargiss L. Et Wong T.
(1995) Regioselective synthesis and characterization of 6-O-alkanoylgluconolactones, Carb. Res. 274, 111-121.
(4) Panday N., Granier T. et Vasella A. (1998) Synthesis and evaluation of indolizine-type inhibitors of N-acetyl-b-D-glucosaminidases. Helv. Chim.
Acta 81, 475-490.
(5) Pocalyko D., Carchi A., Harirchian B. Et Vem~eer R. (1996) Straight chain saturated C8-18 alkyl aldonolactone esters and an enzymic process for their preparation. U.S. patent n° 5,505,938.
(6) Pokomy M., Zissis E., Fletcher H.G. et Pravdic N. (1974) The inhibitory activity of 2-acetamido-2-deoxy-D-giuconolactones and their isopropylidene derivatives on 2-acetamido-2-deoxy-b-D-glucosidase.
Carb. Res. 37, 321-329.
(7) Wolk D., Vasella A., Schweikart F. et Peter M. (1992) Synthesis and enzyme-inhibition studies of phenyisemicarbazones derived from D-glucono-1,5-lactone and 2-acetamido-2-deoxy-D-glucono-1,5-lactone.
Helv. Chim. Acta 75, 323-334.

Claims

REVENDICATIONS

1. Composé de formule :

dans laquelle A représente R1 ou -C(O)R1 où R1 représente un groupement alkyle comportant de 1 à 30 atomes de carbone, linéaire ou ramifié, saturé
ou insaturé, pouvant être substitué partiellement ou totalement par -Hal où
Hal signifie -Cl, -Br, -I ou -F, et pouvant être interrompu par un ou plusieurs motifs choisis parmi -O-, -S-, -C(O)-, -NR3C(O)-, -Ph(R4)n- et -(CH2-CH2-O)n'-, dans lesquels R3 représente -H ou -(CH2)n"-CH3 où n" vaut de 0 à 17, R4 représente -H, -CH3, -C2H5, -C3H7 et n vaut de 0 à 4 et n' vaut 1, 2 ou 3, ou R1 représente un radical cyclanique à racine diterpénique ou triterpénique, et R2 représente un groupement alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C11.

2. Composé de formule I de la revendication 1, caractérisé en ce que A représente -C(O)R, où R1 représente un groupement comportant de 1 à 21 atomes de carbone, de préférence un groupement alkyle linéaire en C5 à C21.

3. Composé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que R2 représente un groupement alkyle n-C p H2p+1 où p vaut de 1 à 7.

4. Composé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que A est -C(O)-n-C7H15 et R2 est CH3.

5. Procédé de préparation d'un composé de formule I

dans laquelle A représente R, ou -C(O)R1 où R1 représente un groupement alkyle comportant de 1 à 30 atomes de carbone linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, pouvant être substitué partiellement ou totalement par -Hal où Hal signifie -Cl, -Br, -1 ou -F, et pouvant être interrompu par un ou plusieurs motifs choisis parmi -O-, -S-, -C(O)-, -NR3C(O)-, -Ph(R4)n- et -(CH2-CH2-O)n'-, dans lesquels R3 représente -H ou -(CH2)n"-CH3 où n" vaut de 0 à 17, R4 représente -H, -CH3, -C2H5, -C3H7 et n vaut de 0 à 4 et n' vaut 1, 2 ou 3, ou R1 représente un radical cyclanique à racine diterpénique ou triterpénique, et R2 représente un groupement alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C11, caractérisé en ce qu'il comporte au moins les étapes suivantes :
a) acylation du chlorhydrate de glucosamine par le chlorure d'acide de formule R2C(O)Cl ;
b) protection de l'hydroxyle en C1, C3, C4 et C6 ;
c) déprotection de l'hydroxyle en C6 ;
d) 6-O-acylation par un composé de formule R1C(O)Cl ou 6-O-alkylation par un composé de formule R1Hal pour obtenir le composé de formule e) déprotection en C1 de l'hydroxyle protégé pour obtenir le composé de formule f) oxydation du composé obtenu en e) pour obtenir le composé de formule g) déprotection des groupements hydroxyle protégés en C3 et C4 du composé obtenu en f) pour obtenir le composé de formule I, dans lesquels Hal signifie Cl, Br, I ou F et P1 et P2 des groupements protecteurs.

6. Composé intermédiaire pour la mise en oeuvre du procédé de la revendication 5, composé ayant les formules où A et R2 ont les mêmes significations que dans les revendications 1 à 4 et P1 et P2 sont des groupes protecteurs, et signifient de préférence respectivement le groupement protecteur allyle et le groupement protecteur benzyle.

7. Composition comportant au moins un composé selon l'une des revendications 1 à 4 ou un composé obtenu par le procédé de la revendication 5 ou un composé selon ta revendication 6.

8. Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre un support acceptable pour une composition cosmétique, pharmaceutique, ou détergente.

9. Composé de formule I selon l'une des revendications 1 à 4 à
titre de tensioactif ou d'inhibiteur enzymatique.

10. Utilisation d'un composé de formule I selon l'une des revendications 1 à 4 pour la préparation de compositions tensioactives.

11. Utilisation d'un composé de formule I selon l'une des revendications 1 à 4 pour la préparation de compositions utiles dans un processus d'inhibition enzymatique ou de reconnaissance d'enzyme.

12. Utilisation d'un composé de formule I selon la revendication 11, caractérisée en ce que l'enzyme est une chitinase.

13. Utilisation d'un composé de formule I selon la revendication 11 ou 12, caractérisée en ce que l'enzyme est la N-acétylglucosaminidase.