FR2930063A1 - Procede de marquage d'un produit, procede d'identification du marquage et produit marque - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé de marquage d'un produit, à un procédé d'identification du marquage et à un produit marqué par le procédé de l'invention. Le marquage utilisé dans la présente invention est à base d'acides nucléiques simples brins.Le procédé de marquage de la présente invention comprend une étape d'addition sur ou dans ledit produit d'une pluralité de polynucléotides simples brins, ladite pluralité de polynucléotides comprenant : au moins un polynucléotide cible constitué d'un polynucléotide simple brin de longueur et de séquence déterminée, et des polynucléotides leurres qui sont de longueurs déterminées identiques ou différentes et de séquences déterminées identiques ou différentes, lesdits polynucléotides leurres étant de longueur(s) identique(s) ou différente(s) et de séquences différentes de la séquence dudit, au moins un, polynucléotide cible, dans lequel chacun des polynucléotides cible(s) et leurres ne s'hybride avec aucun des autres polynucléotides de ladite pluralité de polynucléotides.Le procédé de l'invention permet par exemple de marquer les parfums, les cosmétiques, les produits pour l'hygiène, les produits alimentaires, les arômes, les extraits de plante(s), le tabac, les boissons, textiles, les cuirs, les médicaments, les poudres, les vernis, les encres, produits alimentaires, les hydrocarbures, les papiers, les peintures, les produits et composés chimiques.

Description

PROCEDE DE MARQUAGE D'UN PRODUIT, PROCEDE D'IDENTIFICATION DU MARQUAGE ET PRODUIT MARQUE

DESCRIPTION 5 Domaine technique 10 La présente invention se rapporte à un procédé de marquage d'un produit, à un procédé d'identification du marquage et à un produit rnarqué par le procédé de l'invention. Le marquage utillisé dans la présente invention est à base d'acides nucléiques simples brins. La présente invention permet de distinguer un produit 15 authentique d'une contrefaçon. Il permet en particulier de marquer le produit authentique de façon à pouvoir le tracer et l'identifier. La contrefaçon ou reproduction illégale d'objets, notamment de produits à haute valeur ajoutée, ou produits de luxe, entraîne de graves conséquences financières pour les entreprises, mais également en terme 20 d'emplois, de sécurité sanitaire ou même de vie sociale. C'est pourquoi les industriels s'emploient à lutter contre ce fléau, en développant de nouvelles techniques de marquages et d'authentification de leurs produits, afin de traquer et de détruire les produits contrefaits. Les références entre crochets ([x]) renvoient à la liste des 25 références à la fin des exemples.

Etat de la technique Une des méthodes souvent utilisées pour détecter et identifier un produit authentique est le marquage dudit produit "dans la masse", en 30 incorporant à ce produit un corps ou composé chimique identifiable de manière unilatérale.

Ce genre de marquage doit présenter des propriétés particulières : le marquage doit se faire de manière transparente vis-à-vis de l'utilisateur final du produit, il ne doit pas altérer les propriétés physico-chimiques de ce produit et ne doit pas présenter de danger pour l'utilisateur final du produit. Il doit aussi être, autant que faire se peut, indécelable et/ou infalsifiable pour ne pas être lui-même falsifié en même temps que le produit. II n'existe pas aujourd'hui de technique fiable, stable dans le temps en particulier pour les très nombreuses substances chimiques réputées agressives pour les marqueurs, telles que des parfums, des crèmes cosmétiques ou sur des matières telles que le cuir, le tissu, etc. Il n'existe pas non plus à ce jour de techniques de marquage présentant réellement de grandes difficultés de décryptage pour les contrefacteurs. II existe donc un réel besoin d'un marquage et d'un procédé de marquage palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur et permettant de lutter efficacement contre les contrefaçons, notamment des produits de luxe.

Exposé de l'invention La présente invention a précisément pour but de proposer une solution de marquage répondant à ce besoin et résolvant les problèmes de l'art antérieur. La présente invention se rapporte en particulier à un procédé de marquage d'un produit, ledit procédé comprenant une étape d'addition sur ou dans ledit produit d'une pluralité de polynucléotides simples brins, ladite pluralité de polynucléotides comprend : - au moins un polynucléotide cible constitué d'un polynucléotide simple brin de longueur et de séquence déterminée, et - des polynucléotides leurres qui sont de longueurs déterminées identiques ou différentes et de séquences déterminées identiques ou différentes, lesdits polynucléotides leurres étant de longueur(s) identique(s) ou différente(s) et de séquences différentes de la séquence dudit, au moins un, polynucléotide cible dans lequel chacun des polynucléotides cible(s) et leurres ne s'hybride avec aucun des autres polynucléotides de ladite pluralité de polynucléotides.

Dans un mode particulier de réalisation du procédé de la présente invention, ladite pluralité de polynucléotides comprend en outre au moins un polynucléotide de reconnaissance constitué d'un polynucléotide simple brin de longueur et de séquence déterminée d'identification de la nature et la séquence du, au moins un, polynucléotide cible, dans lequel chaque polynucléotide de reconnaissance ne s'hybride avec aucun des autres polynucléotides de ladite pluralité de polynucléotide.

La description qui suit est à considérer pour le procédé de l'invention tel qu'il est défini ci-dessus et pour le mode particulier de réalisation du procédé de l'invention. Le marquage de la présente invention est donc constitué de ladite pluralité de polynucléotides telle que définie! dans la présente description. Ces polynucléotides sont des polynucléotides simples brins Dans la présente description, on désigne également cette pluralité de polynucléotide par le terme marqueur . La présente invention se rapporte également à un produit marqué susceptible d'être obtenu par le procédé de l'invention et à un procédé de détection du marquage de ce produit. La présente invention porte notamment sur Na détermination du marqueur utilisé pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention, la fabrication de ces marqueurs, le marquage des produits, ainsi que les techniques de détection des marqueurs dans les produits marqués. La présente invention permet de distinguer une contrefaçon d'un produit authentique, ou encore d'identifier des détournements de circuits de distribution ou des circuits parallèles non autorisés. Les polynucléotides de ladite pluralité de polynucléotides peuvent être de plusieurs types : il peut s'agir de polymères de ribonucléotides ou acides ribonucléiques simple brin (ARN) ou de dlésoxyribonucléotides ou acides désoxyribonucléiques simple brin (ADN) ou un mélange de ceux-ci. Par pluralité de polynucléotides on entend dans la présente l'ensemble formé des polynucléotide(s) cible(s), leurres, et, le cas échéant, de reconnaissance. De préférence, selon la présente invention, on utilise plusieurs polynucléotides cibles, plusieurs polynucléotides leurres, et, le cas échéant, plusieurs polynucléotides de reconnaissance. Par exemple, sans que cet exemple soit limitatif, on peut utiliser de 1 à 100 polynucléotide(s) cible(s), par exemple de 1 à 50, par exemple de 5 à 50.

Par exemple aussi, sans que cet exemple soit limitatif, on peut utiliser de 2 à 100 polynucléotides leurres, par exemple de 2 à 50. Par exemple, le cas échéant, sans que cet exemple soit limitatif, on peut utiliser de 1 à 100 polynucléotides de reconnaissance, par exemple de 1 à 50. Le choix du nombre de polynucléotides dépend de la complexité souhaitée du marquage selon la présente invention. Par polynucléotide cible on entend dans la présente un polynucléotide dont la séquence a été déterminée et construite pour constituer une séquence de référence destinée à marquer le produit selon la présente invention, puis à être recherchée spécifiquement dans ce produit pour l'authentifier. De préférence, selon l'invention, le marqueur comprend plusieurs polynucléotides cibles identiques ou différents, de préférence différents. Les polynucléotides cibles sont référencés dans une base de données confidentielle cibles/produits qui établit le lient entre le ou les polynucléotide(s) cible(s) et le produit marqué.

Par base de données confidentielle , on entend une base de donnée à laquelle seul le fabriquant du marquage selon la présente invention pour un produit donné et/ou seul le fabriquant/créateur dudit produit a (ont) accès (l'un et/ou l'autre est appelé ci-après celui qui met en oeuvre la présente invention ). Il s'agit d'une base de correspondance dans laquelle, pour chaque produit ou chaque famille de produit est assignée une signature particulière déterminée selon la présente invention. Dans le cas où seuls des polynucléotides cible(s) et leurres sont utilisés pour la signature des produits, on peut appeler cette base de données, ou de correspondance, base confidentielle cibles/produits ou base cibles/produits . Ainsi, si l'on souhaite authentifier un produit suivant la présente invention, on recherche d'abord dans la base cribles/produits la ou les séquence(s) cible(s) assignée(s) audit produit, et on recherche ensuite si la ou les séquence(s) cible(s) est (sont) effectivement présente(s) dans ledit produit, par exemple en utilisant un des procédés décrits ci-dessous. Si la ou les séquence(s) cible(s) est (sont) effectivement présente(s), le produit est déclaré authentique. En revanche, si la ou les séquences cible(s) n'est (ne sont) pas présente(s), le produit est déclaré être une contrefaçon. Bien entendu, cela ne fonctionne que si tous les produits authentiques sont marqués suivant la présente invention. La base de correspondance peut être construite par le fabriquant de la signature de la présente invention et/ou par le fabriquant/créateur à partir d'une liste de signatures selon la présente inventions, par exemple en faisant correspondre à chaque signature un produit déterminé. Dans ce cas, l'authentification est directe.

Par polynucléotide leurre on entend clans la présente un polynucléotide dont la séquence a été choisie et construite pour être différente de la ou des séquence(s) cible(s). Les séquences leurres sont destinées à brouiller le marquage selon la présente invention, mais pas à être recherchées dans le produit pour l'authentifier. Les séquences leurres sont là pour compliquer le travail d'un contrefacteur à tenter de reproduire la signature de la présente invention. En effet, seul celui qui met en oeuvre la présente invention connaît la ou les séquence(s) cible(s). La distinction d'une ou plusieurs séquence(s) particulière(s), en l'occurrence de la ou des séquence(s) cible(s) en vue de leur reproduction, parmi un mélange de séquences cible(s) et leurres, en vue de leur reproduction, est rendue d'autant plus difficile voire impossible que, selon l'invention, les séquences leurres sont présentes, que cible(s) et leurres sont des séquences courtes, simples brins et ne s'hybridant pas entre elles. Plus le nombre de leurres est important, plus la reproduction de la signature dans son ensemble est difficile et, statistiquement, moins il y a de chance de déterminer par hasard la ou les séquence(s) du ou des polynucléotides cibles. Les séquences de ces polynucléotides leurres sont égallement connues par celui qui met en oeuvre la présente invention, mais ces polynucléotides ne sont pas dans une base de données pour être affectés à un produit. Par polynucléotide de reconnaissance , on entend dans la présente un polynucléotide de séquence et de longueur déterminée qui permet l'identification du ou des polynucléotide(s) cible(s). Ceux-ci peuvent présenter une nature ou être présents dans des concentrations facilitant une recherche et une identification rapide, pouvant faire office de premier test d'authentification : leur absence est un premier signe de contrefaçon. II s'agit d'un ou de plusieurs polynucléotide(s) dont la (les) séquence(s) est (ont) été choisie(s) et construite(s) pour constituer un code utilisé dans une base de donnée confidentielle d'identification du ou des polynucléotide(s) cible(s) ou base d'identification des cibles destinée à renseigner sur le nombre, la nature, la séquence et la longueur du (des) polynucléotide(s) cible(s). Lorsqu'il y a plusieurs polynucléotides de reconnaissance, on peut parler d'un ensemble de polynucléotides de reconnaissance . Dans ce cas, dans la base d'identification des cibles, pour chaque polynucléotide de reconnaissance ou ensemble de polynucléotide de reconnaissance, est assigné un polynucléotide cible ou un ensemble de polynucléotides cibles déterminé selon la présente invention. Les séquences des polynucléotides de reconnaissance sont connues seulement par celui qui met en oeuvre la présente invention. La présence de polynucléotide(s) de reconnaissance dans la signature de la présente invention est optionnelle, elle correspond à un mode particulier de réalisation du procédé de l'invention. Si un ou plusieurs polynucléotide(s) de reconnaissance est (sont) utilisé(s) dans la signature selon l'invention d'un produit, une base confidentielle d'identification des cibles est créée par celui qui met en oeuvre la présente invention. Cette base permet d'identifier le ou les polynucléotide(s) cible(s) présents dans un produit à authentifier à partir du ou des polynucléotide(s) de reconnaissance. Dans ce cas, l'authentification d'un produit est indirecte. En effet, si l'on souhaite authentifier un produit sensé comprendre une signature selon l'invention, on identifie le ou les polynucléotide(s) de reconnaissance suivant un des procédés décrits ci-dessous de la présente invention, on recherche ensuite dans la base d'identification des cibles la ou les séquence(s) cible(s) assignée(s) audit produit, et on recherche ensuite si la ou les séquence(s) cible(s) est (sont) effectivement présente(s) dans ledit produit, par exemple en utilisant un des procédés décrits ci-dessous. Si la ou les séquence(s) cible(s) est (sont) effectivement présente(s), le produit est déclaré authentique. En revanche, si la ou les séquences cible(s) n'est (ne sont) pas présente(s), le produit est déclaré être une contrefaçon. On remarque dans ce mode de réalisation de la présente invention qu'il y a deux étapes d'identification de polynucléotides avant de pouvoir authentifier un produit, ce qui complique la tâche d'éventuels contrefacteurs. Bien entendu, cela ne fonctionne que si les produits authentiques sont marqués suivant la présente invention. Selon l'invention, la séquence des polynucléotides de reconnaissance peut contenir une sous séquence portant le code qui permet à l'utilisateur de l'invention de retrouver quels sont les polynucléotides cibles, et quels sont les polynucléotides leurres à partir d'une base de reconnaissance des cibles. Ainsi, au cours du processus d'authentification d'un produit, ces polynucléotides de reconnaissance sont extraits du produit à authentifier, ou directement identifiés dans ou sur le produit. Une fois la nature des polynucléotides de reconnaissance révélée û par exemple, sans que cet exemple ne soit limitant, l'identification des polynucléotides cibles peut se faire par la lecture de la séquence d'un polynucléotide de reconnaissance, ou par l'identification d'un jeu de polynucléotides de reconnaissance présents parmi une pluralité de polynucléotides codant putatifs û l'utilisateur de la présente invention va se reporter dans une table de correspondance (base de données de reconnaissance des polynucléotides cibles), et y lire la nature des polynucléotides cibles théoriquement présents dans le produit à authentifier. Cette table peut par exemple, et sans que cet exemple ne soit limitant, être stockée dans une base de donnée sécurisée et informatisée (permettant d'assurer la confidentialité), laquelle base de donnée a été créée lors du marquage du produit, et dans laquelle figurent les couples ( code des polynucléotides de reconnaissance lu - polynucléotides cibles à rechercher ). Ainsi, après s'être référé à cette table, l'utilisateur de l'invention peut déduire la nature exacte des marqueurs cibles qui devraient être présents dans le produit à authentifier. Les polynucléotides cibles sont alors extraits, puis identifiés. Si les polynucléotides cibles détectés correspondent exactement au code théorique lu dans la table, alors le produit est authentifié. Si d'autres polynucléotides cibles sont présent, l'utilisateur de l'invention peut suspecter un mélange de produits marqués. Si les polynucléotides cibles détectés sont totalement différents de ceux attendus, il peut s'agir d'une contrefaçon. S'il n'y a pas de polynucléotide de reconnaissance utilisé clans une signature selon l'invention, seule une base de données cibles/produits est utile. Il est intéressant de noter que la pluralité de polynucléotides du rnarqueur de la présente invention à incorporer dans un produit ou une substance d'intérêt ne sont pas tous assignés dans une base de données pour authentifier directement ou indirectement un produit. Il est ainsi possible de n'utiliser qu'un nombre restreint de polynucléotides cibles, ces polynucléotides cibles étant ceux qui sont recherchés lors d'une authentification du produit, et de les incorporer dans le produit en même temps qu'un grand nombre de leurres, et, le cas échéant de polynucléotides de reconnaissance, dont les séquences ne correspondent pas à celles des polynucléotides cibles. Ainsi, le ou les polynucléotides cibles peuvent être noyés dans une masse de polynucléotides leurres brouillant de manière extraordinaire les pistes en cas de tentative de décodage malveillante des polynucléotides cibles en vue de reproduire la signature. En outre, suivant le mode particulier de réalisation de la présente invention, dans lequel des polynucléotides de reconnaissance sont utilisés, seule la lecture et le décryptage du code porté par les polynucléotides de reconnaissance peut incriminer, parmi un mélange de polynucléotides cibles et de polynucléotides leurres, lesquels correspondent effectivement aux séquences cibles, et par élimination lesquels ne sont que des leurres destinés à tromper le contrefacteur. Le procédé de marquage de la présente invention peut être réalisé au moyen de marqueurs qui sont des acides désoxy et/ou ribonucléiques. Lesdits polynucléotides de la pluralité de polynucléotides peuvent donc être des séquences d'acide désoxyribonucléique simple brin ou d'acide ribonucléique simple brin ou un mélange de séquences d'acide désoxyribonucléique et d'acide ribonucléique. Un marqueur conforme à la présente invention peut donc être composé de bases courante, appelées bases naturelles par exemple celles présentes dans l'ADN : adénine, guanine, thymine, cytosine, ou dans l'ARN : adénine, guanine, uracile, cytosine (voir par exemple Molecular Cloning, Maniatis, Cold Spring-Harbor, 2ème édition, pp C3 à C14 [1]). Un marqueur conforme à la présente invention peut aussi comprendre des composés naturels ou synthétiques moins fréquents, appelés bases modifiées , comme par exemple la dihydrouridine (DHU), l'inosine, ou la pseudo-uracile qui découlent de modifications, par exemple une désamination, effectuées sur les bases présentées précédemment. Les bases azotées peuvent être constituées à partir d'isotopes naturels et/ou à partir d'isotopes stables de niasse atomique différente et/ou être modifiées pour établir un nombre de liaisons hydrogène différent de la normale lors des processus d'hybridations.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les séquences d'acide désoxyribonucléique peuvent comprendre, dans leur séquence, la même proportion des quatre bases A, C, G et T, naturelles ou modifiées. Selon un autre mode particulier de réalisation de la présente invention, les séquences d'acide ribonucléique peuvent contenir, dans leur séquence, la même proportion des quatre bases A, C, G et U, naturelles ou modifiées. Par exemple, dans le marquage de la présente invention, un polynucléotide simple brin (ou oligomère) de 20 nucléotides, chacun des nucléotides étant choisi parmi 4 bases possibles permet de réaliser 420 séquences différentes, soit environ 1,1x1012 combinaisons, c'est-à-dire mille milliards de combinaisons. La probabilité d'extraire un marqueur cible, selon l'invention, au hasard par exemple une pluralité de polynucléotides de taille 20 dans un marquage conforme à la présente invention, et que ce marqueur soit celui qui a été assigné au produit dans une base de données cibles/produit est donc quasi nulle. En outre, le rnarquage de la présente invention est composé de plusieurs molécules cibles de séquences et de longueur déterminées, de plusieurs leurres, et, le cas échéant de plusieurs polynucléotides de reconnaissance, ce qui assure à la fois une sécurité très élevée et une inviolabilité remarquable du rnarquage. De part leur nature, les polynucléotides utilisés peuvent donc comprendre par exemple une combinaison orientée de 4 bases azotées dont la nature est à définir par celui qui met en oeuvre la présente invention. Cette combinaison, qui est à l'origine de la spécificité de chaque polynucléotide du marqueur de la présente invention, et qui peut porter l'information relative au produit marqué, peut être calculée de manière informatique, selon les besoins (complexité du code, type d'information que les marqueurs portent) ainsi que les propriétés physico chimiques que présentent ces marqueurs (propriétés d'hybridation, masse moléculaire, taille des fragments, composition en bases azotées).

Selon le produit à marquer et la technique de détection du marquage envisagée, un ou plusieurs polynucléotide(s) cible(s) peuvent être utilisés. L'invention permet donc un nombre considérable de variantes de signature ou marquage. On peut citer à titre d'exemple non limitatif pour les polynucléotides cibles du premier ensemble les différentes formes suivantes : un ou plusieurs polynucléotide(s) simple brin(s) cible(s) de grande(s) taille(s), c'est à dire comportant par exemple de 500 à 5000 nucléotides ou bases ; - un ou plusieurs polynucléotide(s) simple brin(s) cible(s) de petite(s) taille(s), c'est à dire comportant par exemple de 5 à 200 nucléotides ou bases, par exemple de 15 à 200, par exemple de 20 à 200, par exemple de 5 à 50 ; un ou plusieurs polynucléotide(s) simple brin(s) cible(s) de taille(s) moyenne(s), c'est à dire comportant par exemple de 201 à 499 nucléotides ou bases ; - un ou plusieurs polynucléotide(s) simple brin(s) cible(s) possédant une extrémité de séquence constante et une extrémité de séquence variable, un ou plusieurs polynucléotide(s) simple brin(s) cible(s) insérés (ou déterminés) dans des polynucléotides de plus grandes tailles, ces polynucléotides cibles insérés formant donc une partie de polynucléotides plus grands, - un ou plusieurs polynucléotide(s) simple brin(s) circulaires, ou une combinaison de ces différentes formes.30 Selon l'invention, au moins deux polynucléotides cibles peuvent être utilisés, l'un étant un polynucléotide circulaire et l'autre un polynucléotide linéaire. Une pluralité de polynucléotides cibles circulaires ou linéaires ou un mélange de ceux-ci peuvent être utilisés, suivant la complexité choisie du marquage par celui qui met en oeuvre la présente invention. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, lorsque certains ou l'ensemble des polynucléotides simple brin sont linéaires, ils peuvent comprendre une extrémité variable d'un polynucléotide à l'autre et une extrémité constante d'un polynucléotide à l'autre. Par extrémité constante on entend une partie de la séquence polynucléotidique incluant une des deux extrémités de ladite séquence et présentant une séquence déterminée et constante, c'est à dire identique pour une partie des séquences cibles ou pour toutes les séquences cibles du marqueur de la présente invention. Par extrémité variable on entend une partie de la séquence polynucléotidique incluant l'autre des deux extrémités de ladite séquence et présentant une séquence déterminée variable d'une séquence cible à l'autre dans le marqueur de la présente invention. Ceci présente un avantage particulier pour les polynucléotides cibles. En effet, pour détecter ou décrypter le marquage dans le but d'identifier un produit authentique, comme décrit ci-dessous, on peut utiliser un support solide pour le décryptage, support sur lequel des polynucléotides complémentaires aux extrémités variables des polynucléotides cibles sont fixés, comme pour une puce ADN. Les extrémités constantes peuvent quant à elles être utilisées pour mettre en évidence l'hybridation des polynucléotides cibles sur le support solide, par exemple au moyen de biotine/streptavidine. Ce mode de détection est décrit ci-dessous. Le nombre et la nature des polynucléotides cibles, combinés à leur taille, permet de définir la complexité du marquage, et de manière combinatoire, le nombre de combinaisons possibles. Le nombre de combinaisons possibles augmente de manière exponentielle avec la taille de ces polynucléotides. En choisissant une signature composée d'un ou plusieurs polynucléotides parmi tous les polynucléotides de même taille, un grand nombre de combinaisons est envisageable. La probabilité de reproduire une signature parmi toutes les celles qui sont possibles, au hasard, est quasiment nulle. Selon l'invention, l'information de marquage peut consister en : - des séquences polynucléotides cibles, chacune assignée dans une base de données cibles/produits à un produit, et/ou - en une ou plusieurs combinaison(s) de séquences polynucléotides cibles, ladite (lesdites) combinaison(s) étant assignée(s) dans une base de données cibles/produits à un produit.

Ainsi, on peut utiliser plusieurs polynucléotides cibles de séquences déterminées. On peut également choisir par exemple un groupe ou pool de 20 séquences polynucléotidiques de séquences toutes différentes et déterminées, et choisir, pour marquer une série de produits donnés, une combinaison par exemple de 10 séquences parmi ces 20 pour chaque produit. A ces séquences cibles sont ajoutées des séquences polynucléotidiques leurres pour constituer le marqueur conforme à la présente invention. Selon l'invention, les polynucléotides leurres ne s'hybrident pas avec les polynucléotides cibles et ont pour rôle de rendre encore plus difficile pour un contrefacteur le décryptage du marquage de la présente invention pour le copier. Ces polynucléotides leurres peuvent être sous forme linéaire ou circulaire ou un mélange de polynucléotides circulaires et de polynucléotides circulaires comme indiqué ci-dessus pour les polynucléotides cibles. Le nombre de polynucléotides leurres ajouté au marqueur dépend du brouillage souhaité. De préférence ce nombre est supérieur au nombre de polynucléotides cibles. Des exemples sont donnés ci-dessus. Les polynucléotides leurres sont de longueur(s) identique ou différente(s) les uns des autres, de préférence de longueur identique à la, à l'une, à des ou aux séquence(s) cible(s) présentes dans le marqueur de la présente invention, par exemple, comme indiqué ci- dessus pour les polynucléotides cibles, de 15 à 5000 bases, par exemple de 15 à 200, par exemple de 20 à 200, par exemple de 201 à 499, par exemple de 500 à 5000 bases, ou un mélange de ces longueurs. A ces séquences cibles et leurres peuvent être ajoutés des polynucléotides de reconnaissance, permettant, au moyen d'une base de données, de discriminer les polynucléotides cibles des polynucléotides leurres comme indiqué ci-dessus. Le nombre de polynucléotides de reconnaissance dépend notamment de la complexité du marquage souhaitée. Les polynucléotides de reconnaissance peuvent être circulaires ou linéaires. Ils peuvent être de longueur(s) identique ou différente(s) les uns des autres et de longueur identique ou différente(s) de celles des polynucléotides cible(s) et leurres, par exemple, comme indiqué ci-dessus pour les polynucléotides cibles de 5 à 5000 bases, par exemple de 15 à 200, par exemple de 20 à 200, par exemple de 201 à 499, par exemple de 500 à 5000 bases, ou un mélange de ces longueurs.

Ainsi, dans le marquage de la présente invention, lesdits polynucléotides de la pluralité de polynucléotides peuvent être circulaires, linéaires, ou un mélange de polynucléotides circulaire et linéaires, par exemple avec une extrémité 3'OH libre et une extrémité 5' phosphate libre. De manière préférée, la longueur des polynucléotides du marquage de la présente invention est de 5 à 5000 nucléotides, par exemple de 5 à 100 nucléotides, par exemple de 5 à 50 nucléotides, par exemple de 20 à 50 nucléotides. Selon l'invention, lesdits polynucléotides de la pluralité de polynucléotides sont des polynucléotides simples brins. En effet, une des particularités de la présente invention est que l'utilisation de simples brins permet de rendre plus difficile encore le décryptage du marquage de la présente invention. Le procédé de marquage de la présente invention permet donc de fabriquer un nombre très important de marqueur. Chaque marqueur comporte un code constitué du ou des polynucléotide(s) cible(s), et le cas échéant, des polynucléotides de reconnaissance. Les séquences des polynucléotides du marqueur de la présente invention peuvent être créées de manière empirique ou, de préférence, notamment pour une question de rapidité, par un logiciel approprié qui peut être généré à cette fin. Dans ce dernier cas, il s'agit d'une conception informatique ou Design ln Silico du marqueur de la présente invention. Pour la détermination des séquences des polynucléotides cibles et leurres, et, le cas échéant de reconnaissance, du marqueur de la présente invention, on peut par exemple utiliser les algorithmes suivants : - (0) Création d'un ensemble E qui contient l'ensemble des polynucléotides générés pour le marquage.

- (1) Génération aléatoire d'un premier polynucléotide p, dont la taille ainsi le nombre de nucléotides peuvent être définis par l'utilisateur, p n'appartenant pas déjà à E.

(2) Calcul du score d'hybridation selon l'algorithme de Smith et Waterman [2] entre : le polynucléotide résultant de la concaténation de deux polynucléotides p, d'une part, et chaque polynucléotide résultant de la concaténation de deux polynucléotides choisis dans l'ensemble des polynucléotides de E ainsi que leur complémentaire inversé d'autre part.

30 - (3) Si l'ensemble des scores ne dépasse pas un seuil donné par l'utilisateur, ajout de p dans E. Retour à l'étape 25 (1) tant que E n'est pas de taille voulue. Ce seuil est un score d'alignement minimal au-dessus duquel deux séquences sont considérées comme suffisamment identiques pour s'hybrider entre elles.

Une fois les séquences des polynucléotides cibles et leurres déterminées, ces polynucléotides cibles et leurres peuvent être fabriqués, et ce par tout procédé existant connu de l'homme du métier. Un ou plusieurs protocole(s) peut (peuvent) être utilisé(s) suivant la nature des polynucléotides fabriqués et suivant le marquage choisi : synthèse d'acides ribonucléiques et/ou désoxyribonucléiques simple brin, circulaires et/ou linéaires, d'une taille pouvant varier par exemple de 5 bases à 5000 bases. On peut citer à titre d'exemple de protocoles utilisables pour mettre en oeuvre la présente invention ceux permettant de synthétiser des polynucléotides circulaires simples brins [3] ou les protocoles de synthèse in silico de polynucléotides [4]. Lorsque des séquences des polynucléotides de reconnaissance sont souhaitées pour le marquageä leurs séquences respectives peuvent être déterminées de manière empirique, ou en utilisant un algorithme tel que décrit précédemment, de telle sorte que les polynucléotides de reconnaissance ne s'hybrident pas entre eux, ni avec les polynucléotides cible, ni avec les polynucléotides leurres.

Le marquage d'une solution ou d'un composé à l'aide de marqueurs d'acide ribonucléique ou d'acide désoxyribonucléique selon le procédé de l'invention peut se faire de différentes façons suivant la complexité de marquage souhaitée. Chaque polynucléotide cible porte une information spécifique, inhérente à sa séquence. Chaque polynucléotide cible ou combinaison de polynucléotide cible peut être utilisée de façon unique.

Le premier niveau de codage possible peut être celui consistant à utiliser un ou plusieurs polynucléotides cibles. Plusieurs lots de produits marqués peuvent alors être tracés par un ou plusieurs polynucléotide(s) de taille(s) définie(s), et de séquence(s) déterminée(s) mais différentes les unes des autres. Le second niveau de codage possible est l'utilisation de plusieurs polynucléotides cibles, choisis dans un pool initial de polynucléotides cibles. Le code ne provient alors plus de chaque séquence de polynucléotide cible mais dans la combinaison des polynucléotides cibles retrouvés dans un produit. Ainsi, selon l'invention, un produit marqué peut être marqué par n polynucléotides cibles choisis parmi une possibilité de N polynucléotides différents, ri étant compris dans l'intervalle [0 ; N]. Dans tous les cas, le marquage de la présente invention peut être complété par un troisième niveau de codage, consistant à utiliser des polynucléotides de reconnaissance, indiquant alors, au moyen d'une base de reconnaissance des cibles, quels marqueurs parmi les polynucléotides cibles susceptibles d'être utilisés par le fabriquant et qui peuvent être de nature et de concentration différente, sont présents si le produit est authentique et marqué avec le procédé de la présente invention. Selon l'invention, chaque étape du procédé de marquage des produits peut faire l'objet d'une traçabilité spécifique. Cette traçabilité peut être assurée par introduction de données spécifiques à chaque étape dans une ou plusieurs bases de données confidentielles.

Ainsi, selon l'invention, chaque lot de marqueurs ou combinaison de marqueurs peut par exemple être identifié par un identifiant alphanumérique. Cet identifiant peut apparaître sur le produit ou par tout autre mode de représentation optique : par exemple code barre, datamatrix, etc., par exemple sur le contenant du lot de marqueurs. Cet identifiant peut également servir d'index dans une première base de données où sont stockées les informations sur le lot de marqueurs, par exemple : séquence de chacun des marqueurs composant le lot, proportions respectives des quantités de chaque marqueur, date de fabrication, etc. Chaque contenant de lot de marqueurs, suivi au moyen de son identifiant, peut être rattaché dans une base de données par exemple à la référence de la commande d'un client et aux références de livraison de ce contenant au dit client. Une confirmation de réception de la part du client peut également être introduite dans cette base de données. Les acides nucléiques n'altèrent en rien les propriétés physico- chimiques des produits marqués. En outre, les acides nucléiques n'ont aucun effet sur leur contenant, c'est-à-dire le produit marqué. Enfin, les acides nucléiques se sont montrés très stables dans les nombreux tests réalisés par les inventeurs. Cette propriété de stabilité est démontrée dans les exemples présentés ci-dessous.

De manière non exhaustive, les marqueurs d'ADN et d'ARN simple brin compris dans la présente invention peuvent être inclus dans un très large panel de produits et substances susceptibles d'être victimes de reproduction illégale (contrefaçon), abusives, victimes de trafics sur un marché parallèle et/ou dont il est nécessaire de suivre la piste (traçage des produits). Le procédé de l'invention s'applique au marquage de tout produit industriel ou de consommation, liquides, semi liquides ou solides. C)n peut citer par exemple, sans que cette liste soit limitative : les parfums, les cosmétiques, les produits pour l'hygiène, les produits alimentaires, les arômes, les extraits de plante(s), le tabac, les boissons, les textiles, les cuirs, les médicaments, les poudres, les vernis, les encres, les peintures, les produits et composés chimiques, et plus généralement tous les biens et produits susceptibles d'être contrefaits. L'invention peut s'appliquer à tout une gamme de produits de l'industrie du luxe et de la cosmétique : parfums, eaux de parfums, eaux de toilettes, huiles essentielles, crèmes, masques, pommades, etc.

Dans les domaines des produits industriels et de consommation, l'invention peut aussi servir à tracer diverses substances telles que les encres, les résines, les vernis, les peintures, les colorants, les additifs, les arômes, les colles, les poudres.

Dans le domaine alimentaire, la présente invention trouve une application aux produits de luxe pouvant être cibles de contrefaçon ou de tricheries (mélanges), tels que notamment les liqueurs, spiritueux, grands crus, ou encore tout produit dont il est important de s'assurer de l'authenticité pour des raisons de sécurité par exemple.

Les marqueurs peuvent également être utilisés dans l'industrie pharmaceutique pour marquer et tracer des médicaments et autres drogues. L'invention peut également être utilisée dans le traçage des échantillons biologiques dans un contexte hospitalier. Il peut s'agir par exemple de mettre en oeuvre un protocole de traçabilité des échantillons sanguins dans un laboratoire de biochimie, des échantillons tumoraux dans un laboratoire d'anatomopathologie, ou en vue de constituer une banque de matériel humain directement authentifiée qui puisse être conservée et tracée durant de longues années clans un centre de ressources biologiques. D'une manière générale, les produits peuvent être marqués, soit en tant que tels, soit en tant que composant d'un produit. Par exemple, un document en papier peut être marqué par le biais de l'encre utilisée qui est été préalablement marquée.

Selon l'invention, l'étape d'addition du marqueur de la présente invention peut être réalisée par tout moyen approprié permettant d'ajouter au produit à marquer les polynucléotides constituant le marqueur de la présente invention. Les produits ou substances à marquer peuvent être marqués dans la masse, en y incorporant les marqueurs dont la concentration finale est étudiée et prévue ou en surface du produit. Les marqueurs sont des polymères d'acides ribo ou désoxyribonucléiques ayant les propriétés physicochimiques découlant de leur nature : ce sont dies molécules hydrophiles et chargées négativement. Selon la nature du produit à marquer, ils peuvent être pré-dilués ou ajoutés directement dans le produit. Ils peuvent également être encapsulés. Ils peuvent encore être déposés ou incorporés à la surface du produit. Cette addition du marqueur de la présente invention au produit peut être réalisée par addition de ladite pluralité de polynucléotides dans ledit produit lors de sa fabrication et/ou dans ou sur (c'est à dire à la surface) le produit fini. La présente invention se rapporte donc également à un produit marqué susceptible d'être obtenu par le procédé de marquage selon l'invention. Selon l'invention, lorsque l'addition du marqueur est réalisée à la surface du produit à marquer, elle peut être réalisée par exemple par trempage du produit fini dans une solution comprenant ledit marqueur ou par pulvérisation ou vaporisation d'une telle solution sur le produit fini. De préférence, la solution est un solvant protique tel que l'éthanol, le méthanol ou le Diéthylèneglycol, ou un solvant aprotique polaire tel que l'acétone ou le tétrahydrofurane. Ce mode d'addition convient par exemple pour des produits solides après leur fabrication tels que des tissus, du cuir, bois, papiers, cartons, tabac, cigarettes, cigares, etc. L'addition peut également être réalisée lors de la fabrication du produit, par mélange dudit marqueur avec les composés ou composants constituant le produit. Cette introduction de la pluralité de polynucléotides peut être réalisée sur ou dans un composant dudit produit. Ce type d'addition convient pour tout produit ou substance dont la fabrication passe par une phase liquide ou semi liquide dans laquelle les marqueurs peuvent être incorporés. Ce peut être le cas par exemple pour le marquage dans la masse d'un produit cosmétique ou d'un médicament. Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, une étape d'encapsulation de ladite pluralité de polynucléotides dans des vecteurs lipidiques peut être réalisée préalablement à l'étape d'addition. Cette étape d'encapsulation permet de maintenir les polynucléotides dans un milieu favorable, ou de faciliter leur future extraction. On peut utiliser par exemple comme produit d'encapsulation, un produit choisi dans le groupe comprenant un vecteur de nature lipidique cationique, tel que le bromure de dioléoxyloxy-propyl-triméthylammonium (DOTMA) et la dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), ou les complexes de polynucléotides avec des molécules comme la polylysine, la protamine, ou le polyéthylèneimine (PEI) appelés polyplexes. On peut par exemple utiliser pour cela la technique décrite dans E3ioch. Biophys. Acta 1280:1. [5] , J. Biol. Chem. 269:2550 [6] ou AAPS PharmSci. 2001;3(3):E21 [7]. Quel que soit le mode d'addition choisi, le marqueur de la présente invention est de préférence ajouté dans le produit pour son marquage à de très petites concentrations allant du micro-molaire au femto-molaire. Selon la technique de détection envisagée, existante ou à venir, et la taille des marqueurs, ceux-ci sont ajoutés à une concentration finale variable, les concentrations respectives de chaque polynucléotide cible du premier ensemble pouvant être différentes et composer un sous-ensemble codant. Selon l'invention, la concentration de la pluralité de polynucléotides après son addition dans ledit produit peut être, mais sans y être limitée, de 10 6 moles à 10"18 moles/dm3. Cette quantité par volume est indiquée pour un volume liquide ou solide. Pour un liquide, cela correspond à la quantité de marqueurs mélangés au produit par unité de volume. Pour un solide, cela correspond à la quantité de marqueurs mélangés dans le produit par unité de volume ou déposés à la surface du produit. Ramenée à la surface du produit, cette quantité peut également être définie par unité de surface, soit 10-6 moles à 10-'$ moles/dm2. Ces concentrations peuvent être obtenues par dilution d'une solution plus concentrée. La solution peut être telle que définie ci-dessus.30 La présente invention se rapporte également à un procédé de détection du marquage d'un produit susceptible d'être obtenu par le procédé marquage de l'invention, ledit procédé comprenant une étape d'analyse de la pluralité de polynucléotides permettant de détecter spécifiquement le, au moins un, polynucléotide cible. L'invention fournit d'ailleurs plusieurs procédés de détection de marqueurs de la présente invention. La détection peut être réalisée hors laboratoire ou en laboratoire, par exemple au moyen d'un système portatif, par exemple au moyen d'une puce à ADN spécialement conçue pour la détection des polynucléotides cibles du marqueur de la présente invention. Selon l'invention, l'étape d'analyse peut être réalisée par exemple par immunodétection. Selon l'invention, l'étape d'analyse peut comprendre par exemple une étape de séquençage des polynucléotides codants. Selon l'invention, l'étape d'analyse peut comprendre par exemple une rétro-transcription de l'acide ribonucléique en acide désoxyribonucléique, en particulier lorsque les polynucléotides cibles sont de l'acide ribonucléique. Selon l'invention l'étape d'analyse peut comprendre une détection colorimétrique ou luminescente, ou fluorimétrique, couplée à une hybridation spécifique.

Selon l'invention, la technique d'analyse utilisée peut se baser sur les propriétés physico chimiques, le code et la spécificité du marqueur. Elle peut comprendre une amplification des polynucléotides cibles, exponentielle ou linéaire, par exemple une Réaction de Polymérisation en Chaîne (PCR) ou toute autre technique dérivée, un séquençage sirnple brin, ou une amplification en cercle ( rolling circle amplification ), et/ou une détection très sensible des marqueurs (techniques de dosage en sandwich, puces à ADN). Toute autre technique peut être utilisée pour révéler la présence des marqueurs. Le procédé de l'invention peut comprendre en outre les étapes suivantes, avant l'étape d'analyse : (a) prélèvement d'un échantillon du produit ; et (b) extraction de la pluralité de polynucléotides dudit échantillon. Il s'agit là d'un moyen permettant de mettre en oeuvre de la détection du marquage de la présente invention par prélèvement d'un échantillon du produit.

Après avoir été extrait, la présence des marqueurs peut être analysée comme indiquée ci-dessus. Selon l'invention, l'étape d'extraction (b) peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier pour extraire les polynucléotides d'un échantillon. Les polynucléotides peuvent être extraits suivant un protocole dépendant de la nature du produit marqué. Tout type de technique d'extraction d'acide ribonucléique ou désoxyribonucléique existante ou à venir, peut être utilisée afin d'extraire les polynucléotides de la masse du produit marqué. Il peut s'agir par exemple d'une extraction au phénol chloroforme. Des techniques d'extraction utilisables dans la présente invention sont par exemple décrites dans Molecular Cloning,Maniatis, Cold Spring-Harbor, 2ème édition, pp E3 à E4 [8]. Les méthodes d'analyse des produits marqués peuvent donc consister à extraire les polynucléotides de ces produits, à détecter le code porté par les polynucléotides de reconnaissance, à se référer à la base de données de reconnaissance des polynucléotides cibles, à décrypter ainsi le code porté par les polynucléotides de reconnaissance, puis à exploiter cette information afin de retrouver les polynucléotides cibles parmi la pluralité de polynucléotides cibles, incluant les polynucléotides leurres, puis à détecter la présence des polynucléotides cibles, qui est caractéristiques du produit marqué (en cas de détection du marquage) ou de conclure à un produit contrefait (en cas d'absence des polynucléotides cibles, ou de marquage non conforme à la base de données cibles/produits). Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, la détection spécifique de l'étape d'analyse peut comprendre par exemple les étapes successives suivantes : (i) mettre en contact la pluralité de polynucléotides avec un support solide sur lequel des séquences sondes sont fixées, ces séquences sondes étant complémentaires à une des extrémités dudit, au moins un, polynucléotide cible de la pluralité de polynucléotides du marquage du produit, la mise en contact permettant aux polynucléotides cibles de se fixer sur le support par hybridation avec les séquences complémentaires sondes fixées sur le support ; (ii) éliminer les polynucléotides non hybridés par l'étape (i); et (iii) détecter la présence sur le support des polynucléotides cibles.

Lorsque le marquage selon l'invention comprend des polynucléotides de reconnaissance, le procédé de ce mode particulier de réalisation peut comprendre en outre, avant l'étape (i), une étape (x) d'identification de ces polynucléotides de reconnaissance et une étape (y) de choix d'un support solide, en fonction des polynucléotides de reconnaissance identifiés, support solide choisi car il comporte les séquences sondes complémentaires des séquences cibles identifiées grâce aux polynucléotides de reconnaissance.

Ce procédé de détection peut avantageusement être utilisé avec un marqueur selon l'invention qui comprend des polynucléotides cibles ayant une extrémité constante et une extrémité variable. Ces polynucléotides cibles sont définis ci-dessus. Selon l'invention, les polynucléotides complémentaires aux polynucléotides cibles, appelés séquences sondes, peuvent être fixés sur le support solide par tout moyen connu de l'homme du métier. Ces techniques de détection sur support et les types de supports utilisables dans la présente invention sont par exemple celles décrites dans Molecular Cloning, Maniatis, Cold Spring-Harbor, 2ème édition pp 9.47 à 9.57 [9]. Par exemple, la fixation des séquences sondes sur le support peut être réalisée au moyen d'une liaison biotine/streptavidine, la sonde étant couplée à une molécule de biotine et le support présentant des molécules de streptavidine. Par exemple, la fixation des séquences sondes peut également être réalisée par formation de liaison covalente à une membrane de nylon chargée, ladite membrane formant le support solide. Ces techniques, utilisables dans la présente invention, sont par exemple celles décrites dans les publications [10], [11] et [12]. Selon l'invention, les polynucléotides cibles fixés sur le support par hybridation aux séquences sondes peuvent être détectés par tout moyen approprié connu de l'homme du métier. II peut s'agir par exemple d'une détection au moyen de polynucléotides marqués par un agent de marquage et complémentaires à l'autre extrémité des polynucléotides cibles, l'agent de marquage pouvant être choisi dans le groupe comprenant un fluorochrome, une particule d'or colloïdal et une enzyme. Ce mode de détection sur support solide permet une détection facilitée, reproductible et immédiate du marqueur de la présente invention. II peut avantageusement être utilisé dans la présente invention. Le procédé de détection de l'invention peut comprendre en outre une étape de comparaison des résultats de l'étape d'analyse des polynucléotides cibles avec le contenu d'une base de données qui permet d'identifier les polynucléotides cibles, et d'analyse des polynucléotides cibles qui permet d'identifier et d'authentifier ledit produit, et qui peut également permettre de déterminer l'origine dudit produit. En d'autres termes, la base de données et le décryptage du code porté par les polynucléotides codants permettent d'identifier une contrefaçon d'un produit original. C'est en retrouvant par la technique d'analyse utilisée les polynucléotides cibles contenus dans un produit marqué que l'information relative à ce produit peut être retrouvée. L'absence des polynucléotides cibles qui devraient être présents dans un produit testé indique une possible contrefaçon du produit. La révélation de plusieurs marqueurs différents selon l'invention ou de polynucléotides de reconnaissance dans un même produit peut indiquer que celui-ci est le résultat d'un mélange initial anormal. Au cours de ses étapes de fabrication du produit à marquer, le fabricant utilisateur d'un marqueur conforme à la présente invention peut associer à l'identifiant du contenant de lot de marqueurs des références relatives par exemple à un lot de production marqué à l'aide de ce lot de marqueurs. Cette association peut se faire par exempte dans une base de données identique ou séparée des bases de données précédentes. Les informations insérées dans cette base de données et relatives au lot de production sont de préférence suffisantes, en fonction du système d'information en oeuvre chez cet utilisateur, pour permettre de tracer ce lot de façon non équivoque. Lorsqu'un échantillon de produit soupçonné de contrefaçon est analysé, la révélation des séquences polynucléotidiques identifiées peut être comparée avec les données introduites dans les bases de données lors de la production et la livraison de marqueurs. La contrefaçon est par exemple caractérisée si aucun marqueur n'est identifié. La contrefaçon peut également être mise en évidence si au moins un marqueur figurant dans le lot de marqueurs ayant été en partie révélé et dont la composition précise a été obtenue par interrogation de la base de donnée est manquant. La contrefaçon peut encore être caractérisée si l'intégralité des marqueurs est présente devant figurer dans le lot de marqueurs, mais que la marchandise testée ne provient pas du fabricant ayant pris livraison du lot de marqueurs qui vient d'être révélé.

Dans le cas de détournement de canaux de distribution ou de parallélisme, les produits sont authentiques et les lots de marqueurs révélés correspondent effectivement à des lots de marqueurs livrés au fabricant du produit testé. Le procédé de l'invention permet d'obtenir par requête dans la base de donnée de fabrication des marqueurs de l'identifiant du lot de marqueurs. Dans la mesure où son système de traçabilité le permet, cet identifiant permet avantageusement au fabricant cle comparer l'affectation théorique du lot de production marqué à un de ses clients de l'affectation réelle constatée lors de la prise d'échantillon de produit soupçonné de parallélisme. Si l'affectation théorique des produits rie correspond pas à l'affectation réelle, il peut y avoir détournement de canal de distribution.

D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif.

Brève description des figures - La figure 1 annexée représente un site de coupure de NbBpu101. - La figure 2 représente un adressage des sondes sur la puce. - La figure 3 représente des spectres d'émission et d'absorption du Cy5. - La figure 4 annexée représente une méthode de détection des marqueurs selon la présente invention sur un support : Les marqueurs M1 et M2 sont présents dans un mélange. Ils font pont entre la sonde fixée sur la puce, et les sondes Universelles : le signal (fluorescence du Cy5) est alors détecté. - La figure 5 annexée présente une révélation des marqueurs avec la station NanoChip (marque déposée) (Nanogen Inc.). - La figure 6 annexée présente un principe du marquage couplé. - La figure 8 annexée représente un schéma de détection d'un marquage selon l'invention et d'authentification d'un produit marqué selon l'invention.30 EXEMPLES

Exemple 1: fabrication d'un marquaqe selon le procédé de l'invention et marquage d'un produit Dans cet exemple, les polynucléotides cibles et leurres utilisés sont des séquences simple brin d'acide désoxyribonucléique d'une taille de 28 nucléotides. Le polynucléotide codant est une séquence d'ADN circularisée, d'une taille de 4,3 kilo bases (kb).

Le produit marqué est une solution parfumée : parfum J'Adore (marque déposée, Parfums Christian Dior). Trois marquages sont réalisés, illustrant trois cas de figures possibles lors du procédé d'authentification : un exemple où le produit est authentifié, ainsi que deux exemples où le produit n'est pas authentifié.

I.A. Mise au point des marqueurs cibles et des polynucléotides leurres

1. a.1 Principe Dix polynucléotides d'acide désoxyribonucléique simple brin sont générés de la manière suivante : Les dix nucléotides en 5' sont tous identiques, définis par l'utilisateur. Il s'agit de la séquence GCAACTCCAG. Les dix-huit nucléotides en 3' sont alors générés à l'aide de l'algorithme présenté dans la section Exposé de l'invention , en utilisant les paramètres suivants : une longueur de mots égale à 18 nucléotides, cinq nucléotides G, cinq nucléotides C, quatre nucléotides A et quatre nucléotides T. Chaque nouveau polynucléotide est alors généré de manière aléatoire, de façon à ce qu'il contienne ce nombre déterminé de chacune des bases. Un score d'alignement entre ce nouveau polynucléotide et l'ensemble des polynucléotides déjà validés, ainsi que les polynucléotides résultants de la concaténation de chacun des polynucléotides deux à deux de cet ensemble, cette étape n'ayant pas lieu d'être si il s'agit du premier polynucléotide,est calculé selon l'algorithme de Smith et Waterman, avec les paramètres suivants : - Score d'un match AT : 1 - Score d'un match GC : 1,5 - Pénalité de mismatch : -3 - Pénalité de Gap : -2 Le score minimal sélectionné est de 3, ce qui signifie que si le nouveau polynucléotide s'aligne avec un polynucléotide de l'ensemble, ou une concaténation de deux polynucléotides de l'ensemble avec un score supérieur à 3, il est écarté. Sinon, il est validé puis ajouté à l'ensemble des polynucléotides. Cette étape est répétée jusqu'à l'obtention de dix polynucléotides.

Le tableau 1.1 présente la liste de ces marqueurs. Tableau 1.1 : Séquences des marqueurs Primer-1 : 5'-GCAACTCCAGGCACTCCATGAGTCATGG-3' (SEQ ID NO::1) Primer-2 : 5'-•GCAACTCCAGGTGGCGACTCATACGTCA-3' (SEQ ID NO:::2) Primer-3 : 5'-•GCAACTCCAGCTCAGGGGGACTCTATCA-3' (SEQ ID NO:::3) Primer-4 : 5'-GCAACTCCAGGCTCTAGGGCAAGTCTTCA-3' (SEQ ID NO:::4) Primer-5 : 5'-•GCAACTCCAGGCAGACTCTGGATCTCAG-3' (SEQ ID NO:::5) Primer-6 : 5'-•GCAACTCCAGGCAGCATGAGGTCTCATC-3' (SEQ ID NO::6) Primer-7 : 5'-GCAACTCCAGGCAGCAGGAGTCTCATTC-3' (SEQ ID NO::7) Primer-8 : 5'-GCAACTCCAGGGTGGCTCAGCAATACTC-3' (SEQ ID NO::8) Primer-9 : 5'-GCAACTCCAGCTCAGGGCAGTGATCTCA-3' (SEQ ID NO::9) Primer-10 : 5'-GCAACTCCAGGGGGGCACACATTCTATC-3' (SEQ ID NO::10) Les cinq premiers polynucléotides (Primer-1 à Primer-5) sont considérés comme polynucléotides cibles. Les cinq derniers (Primer-6 à Primer-10) sont considérés comme polynucléotides leurres. Ces marqueurs sont alors injectés à une concentration finale de 10-12 moles par dm3 dans le parfum, en même temps que le marqueur codant.

1.a.2 Matériels Polynucléotides de synthèse (Eurofins MWG GmbH), 100 pmoles/pL - H2O déionisée, sans nucléase

1.a.3 Méthodes

Les dix polynucléotides sont mélangés dans trois solutions de pré marquage, dilués dans de l'eau déionisée, sans nucléase, à une concentration finale de 10"9 moles de marqueurs par litre, par marqueur (soit 5.10-9 moles/L de marqueurs totaux). Pour chaque solution, chaque marqueur est pré-dilué deux fois au 1/100 dans de l'eau sans nucléase (1 pL à l'aide d'une pipette P10, dans 99 pL à l'aide d'une pipette P100) soit une dilution intermédiaire au 1/10000. Ensuite, 10 pL de chaque solution intermédiaire sont ajoutés dans un tube de 1,5 mL (Eppendorf, marque déposée), puis le mélange est complété à 100 pL par ajout de 50 pL d'eau (à l'aide d'une pipette P100). Le tableau 1.2 présente les trois solutions de pré marquage (A, B, C) contenant chacune une combinaison de cinq polynucléotides cibles sélectionnés parmi dix possibles, cibles ou leurres. Tableau 1.2 : Combinaisons de marqueurs 10 A B C Primer-1 x x Primer-2 x x Primer-3 x x Primer-4 x x 15 Primer-5 x x Primer-6 x Primer-7 x I.B. Mise au point des polynucléotides codants

1. b.1 Principe Le polynucléotide codant est une séquence d'acide nucléique 25 simple brin, circulaire, d'une longueur égale à 4,3 kilo bases (kb). II est, pour l'exemple, synthétisé à partir d'un plasrnide pBR322. Ce polynucléotide contient en son sein, une séquence spécifique suite de nucléotides (A, T, G, C), connue de l'utilisateur de l'invention. Elle constitue un code unique, qui permet par la suite à l'utilisateur, de savoir 30 quelle combinaison de marqueurs cibles est en théorie présente dans le produit marqué. 20 Dans cet exemple, la séquence codante est une portion de 20 nucléotides, située exactement à 50 bases en amont (côté 5') d'une séquence connue et universelle qui reste constante quelque soit la séquence codante, et dont la séquence est : 5'-CTGTAAGCGGATGCC-3' (SEQ ID NO: 11). L'utilisateur dispose d'une table associative qui lui permet de faire le lien entre la séquence codante du polynucléotide codant, et la combinaison de polynucléotides cible attendue dans le produit marqué. Séquence codante portée par le Combinaison de polynucléotide codant polynucléotides cibles attendue 5'-CCTCGCGCGTTTCGGTGATG-3' 1,2 (SEQ ID NO::12) Le plasmide est d'abord digéré par l'enzyme de restriction Nb.Bpu101 , qui coupe un seul brin de la molécule d'ADN, reconnaissant le site de restriction représenté sur la figure 1 : site de coupure de NbBpu101. Le polynucléotide est alors digéré une seconde fois par l'exonucléase III, libérant les nucléotides à partir de l'extrémité 3' hydroxyle libre du brin coupé par Nb.Bpu101, Le brin qui n'a pas été digéré par Nb.Bpu101 est alors épargné, car circulaire.

1. b.2 Matériels - Plasmide pBR322, Invitrogen (marque déposée) - Nb.Bpu101 (20 U) référence : Fermentas, #ER1681 - Tampon R 10 X (tampon Nb.Bpu10l) référence #BR5, (Fermentas) - Exonucléase III (1200 U) référence #EN0191, (Fermentas) - Tampon de réaction pour Exonucléase III ; référence #EN0191, (Fermentas) - Phénol UltraPure (marque de commerce) Buffer-Saturated Phénol, Invitrogen. - Chloroforme/alcool isoamylique (24:1) - Acétate de sodium 3M - Ethanol glacé 95%, 75% - Eau déionisée, sans nucléases.

1. b.3 Méthodes • Diqestion Dans un tube de 1,5 mL (Eppendorf, marque déposée), ajouter le plasmide (5 pg soit 20 pL), le tampon de réaction dix fois concentré (40 pL) à l'aide d'une pipette P100 (Gilson Pipetman, marque déposée) l'eau (339 pL) à l'aide d'une pipette P1000 (Gilson Pipetman, marque déposée) ainsi que l'enzyme (1 pL) à l'aide d'une pipette P10 (Gilson Pipetman, marque déposée).

Tableau 1.3 : digestion de pBR322 Plasmide pBR322 20 pL Tampon R 10X 40 pL Nb.Bpu101 (20U) 1 pL H20 339 pL Vortexer à l'aide d'un vortex VTX-400 (Labo Moderne) puis incuber le tube 1 heure à 37 °C. Extraire l'ADN au phénol chloroforme selon le protocole suivant : - Ajouter dans le tube '/2 volume de phénol (200 pL) et'/2 volume de 25 chloroforme (200 pL) à l'aide d'une pipette P200 (Gilson Pipetman, marque déposée), puis vortexer 10 secondes. Centrifuger 5 minutes à 10 000 rcf (dans une centrifugeuse à tubes 1,5 mL Centrifuge 5415 R , Eppendorf, marque déposée). - Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube de 1,5 mL (Eppendorf, marque déposée), et ajouter 1 volume (400 pL) de chloroforme. Vortexer et centrifuger 5 minutes à 10 000 rcf. Répéter cette étape 5 fois. - Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube de 1,5 mL, puis ajouter 1/10 de volume d'acétate de sodium 3M (40 pL, à l'aide d'une P20) et 2,5 volumes (1000 pL à l'aide d'une P1000) 1 o d'éthanol glacé. Mixer puis incuber 1 heure à -.20 °C - Centrifuger 10 minutes à 10 000 rcf. Jeter le surnageant et laver délicatement le culot avec 200 pL d'éthanol gllacé à 75 %. Sécher ensuite le culot à l'air libre. Le reprendre dans 50 pL (à l'aide d'une pipette P100) d'eau déionisée sans nucléases. 15

• Traitement à l'Exonucléase Dans un tube de 1,5 mL (Eppendorf) contenant les 50 pL d'extrait, ajouter à l'aide de pipettes P100, P20 et P200 les réactifs selon 20 le tableaul. 4. Tableau 1.4 : Linéarisation de pBR322 Tampon de réaction pour Exolll 25 pL Exonucléase III (1200 U) 6 pL H20, sans nucléase 110 pL - Mélanger le tube, puis incuber 10 minutes à 30 °C. Arrêter la réaction en chauffant 10 minutes à 70 °C. 25 - Extraire l'ADN au phénol Chloroforme comme décrit dans l'étape 1.b.3, précipiter l'ADN comme décrit dans l'étape 1.b.3 puis reprendre les polynucléotides dans 20 pL d'eau déminéralisée sans nucléase.

Les marqueurs repris dans 20 pL sont dosés à l'aide d'un spectrophotomètre Nanodrop (Marque déposée). La concentration est alors ramenée à 10-9 mol/L en ajoutant un volume adéquat d'eau déminéralisée sans nucléase à l'aide d'une P10.

I.C. Marquage des solutions Trois solutions parfumées J'Adore (marque déposée, Parfums Christian Dior) sont alors marquées. Les polynucléotides sont injectés dans la masse des produits, à une concentration finale de 10"12 M pour les polynucléotides cibles et leurres, et 10-12 M pour les polynucléotides codants. La première solution est marquée avec la solution de pré-marquage A, contenant les polynucléotides cibles 1 et 2 ainsi que les polynucléotides leurres 8, 9, 10 et le polynucléotide codant. Cette solution correspond à un marquage normal, où le polynucléotide codant est présent, et ou la combinaison des polynucléotides cibles présents correspondent effectivement à l'information que porte le polynucléotide codant. La seconde solution est marquée avec la solution de pré- marquage B, contenant les polynucléotides cibles 3, 4 et 5, ainsi que les polynucléotides leurres 6 et 7 et le polynucléotide codant. Cette solution fait exemple de marquage incohérent : bien que le polynucléotide codant est présent, la combinaison de polynucléotides cibles ne correspond pas à l'information qu'il contient.

La troisième solution est marquée avec la solution de pré-marquage C, contenant les polynucléotides cibles 1, 2, 3, 4 et 5, aucun polynucléotide leurre, et aucun polynucléotide codant. Cette solution fait également exemple de marquage incohérent : d'une part elle ne comprend pas de polynucléotides codants, et d'autre part bien qu'elle présente les polynucléotides cibles 1 et 2 du marquage normal, elle contient d'autres polynucléotides non attendus.

Après marquage, les solutions sont stockées à température ambiante ou à 4°C.

I.D. Extraction des polynucléotides Avant de commencer l'identification des polynucléotides codant et cibles, il est conseillé d'extraire les marqueurs du milieu alcoolique que constitue le produit marqué (parfum).

10 1. d.1 Principe Les marqueurs sont extraits de leur milieu alcoolique (parfum), puis récupérés en milieu aqueux dans le but de pouvoir ensuite utiliser les techniques de biologie moléculaire d'identification. L'extraction doit donc de préférence non seulement avoir un bon rendement (récupérer un 15 maximum de marqueurs, idéalement : rendement de 100 %), mais elle doit aussi de préférence débarrasser les marqueurs de toutes substances polluantes pouvant interférer avec les techniques de détection.

1. d.2 Matériels 20 - Phénol : UltraPure (marque de commerce) Buffer-Saturated Phénol, Invitrogen. - chloroforme/alcool isoamylique (24:1) - acétate de sodium 3M - éthanol glacé 95% (Carlo Erba Rectapur), 75% 25 - eau déionisée, sans nucléases

1. d.3 Méthodes La technique utilisée est celle de l'extraction au phénol chloroforme. Pour l'exemple, les marqueurs sont extraits à partir de 500 pL 30 de parfum marqué.5 - Aux 500 pL de parfum marqué dans un tube de 2 mL (Eppendorf, marque déposée), ajouter '/2 volumes de phénol soit 250 pL à l'aide d'une pipette P1000 (Gilson Pipetman, marque déposée), puis '/2 volumes de chloroforme soit 250 pL à l'aide d'une P1000 (Gilson Pipetman, marque déposée), et '/2 volume d'eau soit 250 pL à l'aide d'une P1000 (Gilson Pipetman, marque déposée) puis vortexer 10 secondes. Centrifuger 5 minutes à 10 000 rcf (dans une centrifugeuse Centrifuge 5415 R , Eppendorf, marque déposée). - Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube de 2mL (Eppendorf, marque déposée), et ajouter 1 volume de chloroforme. Vortexer et centrifuger 5 minutes à 10 000 rcf. Répéter cette étape 5 fois. - Transférer la phase aqueuse (au dessus) dans un nouveau tube, puis ajouter 1/10 de volume d'acétate de sodium 3M (soit 50 pL à l'aide d'une pipette P100) et 2,5 volumes d'éthanol glacé (soit 1250 pL, ajouté en deux fois à l'aide d'une P1000). Mixer puis incuber 1 heure à -20 °C. - Centrifuger 10 minutes à 10 000 rcf. Jeter le surnageant et laver délicatement le culot avec 200 pL d'éthanol glacé à 75 %. Sécher ensuite le culot. Le reprendre dans 20 pL d'eau déionisée, sans nucléase, à l'aide d'une pipette P20.

l'.E Détection des polynucléotides codants 1. e.1 Principe L'information portée par les polynucléotides codants, relative aux polynucléotides cibles, est lue dans la séquence nucléotidique de ces premiers (par une technique de séquençage). Elle permet ensuite à l'utilisateur de l'invention, de connaître la nature exacte des polynucléotides cibles portant l'information d'authentification du produit en se reportant à la table associative présentée en 1.b.1. 1. e.2 Matériels Amorce sens Universelle (Eurofins MWG GmbH), 100 pmoles/p L) 5'-GGCATCCGCTTACAG-3' (SEQ ID NO: 13) BigDye (marque déposée) Terminator V3.1 (Applied Biosystems) Matrice : solution de polynucléotides extraits. - H20 déionisée sans nucléases. 11. e.3 Méthodes La réaction de séquence est effectuée à partir de la solution de marqueurs extraits dans un tube de 200 pL (Eppendorf, marque déposée), selon le protocole exposé dans le tableau 1.5.

Tableau 1.5 : Réaction de séquence Réactif 1 séquence BigDye (marque déposée) 2 pl- Polynucléotides (matrice) 5 pL Amorce 10 pM 1,6 pL H2O q.s.p. 10 pL Les réactions sont alors lancées sur un appareil GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystem) en respectant les cycles suivants : -96°C 1' -96°C 10"I - 50 °C 5" I => 25 cycles - 60 °C 4' 1

Après purification sur colonne (Qiagen, marque déposée), les réactions sont alors séquencées sur un séquenceur 16 capillaires ABI3100 (Applied Biosystem). L'analyse des résultats permet alors à l'utilisateur de l'invention de lire les séquences nucléotidiques d'intérêt, et de faire la corrélation entre les séquences lues et les polynucléotides cibles théoriquement présents dans le produit marqué. l.F Détection des polynucléotides cibles. 11. f.1 Principes Un support (ou puce à ADN), est utilisé pour détecter la présence des polynucléotides cibles. Ce support présente une batterie de plusieurs sondes, fixées de manière covalente, et exactes complémentaires inverses des régions 3' variables des marqueurs. La figure 2 annexée représente l'adressage des sondes sur la puce.

Quand la solution extraite, contenant les marqueurs putatifs, est mise en contact avec ce support, les marqueurs présents s'hybrident avec leurs complémentaires inverses sur la puce. Après lavage, le support est alors mis en contact avec une solution contenant des sondes (polynucléotides) couplée à un fluorophore (le Cy5), donc la séquence est l'exact complémentaire inverse de la région 5' Universelle des marqueurs. La figure 3 annexée représente les spectres d'émission (667 nm) et d'excitation (650 nm) du Cy5. Ces sondes s'y fixent, et sont détectées par la suite. Leur présence permet de révéler la présence des polynucléotides cibles correspondant dans la solution initiale. La figure 4 annexée représente le principe de détection des marqueurs. 1. f.2 Matériels

Sondes complémentaires inverses des régions spécifiques des marqueurs, (Eurofins MWG GmbH), complémentées en 5' d'un bras de 20 bases et biotinylées. Sonde anti-1 (SEQ ID NO: 14) 5' (B)-TGGATCCCGCACACGACTGACCATGACTCATGGAGTGC 3'

Sonde anti-2 (SEQ ID NO: 15) 15 5' (B)-TGGATCCCGCACACGACTGATGACGTATGAGTCGCCAC 3'

Sonde anti-3 (SEQ ID NO: 16) 5' (B)-TGGATCCCGCACACGACTGATGATAGAGTCCCCCTGAG 3'

20 Sonde anti-4 (SEQ ID NO: 17) 5' (B)-TGGATCCCGCACACGACTGATGAGACTTGCCCTAGAGC 3'

Sonde anti-.5 (SEQ ID NO: 18) 5' (B)-TGGATCCCGCACACGACTGACTGAGATCCAGAGTCTGC 3' Sonde anti-6 (SEQ ID NO: 19) 5' (B)-TGGATCCCGCACACGACTGAGATGAGACCTCATGCTGC 3'

Sonde anti-7 (SEQ ID NO: 20) 30 5' (B)-TGGATCCCGCACACGACTGAGAATGAGACTCCTGCTGC 3'

Sonde anti-8 (SEQ ID NO: 21) 5' (B)-TGGATCCCGCACACGACTGAGAGTATTGCTGAGCCACC 3'

35 Sonde anti-9 (SEQ ID NO: 22) 5' (B)-TGGATCCCGCACACGACTGATGAGATCACTGCCCTGAG 3'

Sonde anti10 (SEQ ID NO: 23) 5' (B)-TGGATCCCGCACACGACTGAGATAGAATGTGTGCCCCC 3' 40 10 25 40 Polynucléotides complémentaires inverses de la région 5' Universelle des marqueurs, couplés à un fluorophore (Cy5) en 3' ;(Eurofins MWG GmbH) : UnivFluo 5' CTGGAGTTGC-(CY5*) 3' (SEQ ID NO: 24) 5 Solution de marqueurs extraits Puce et Cartouche pour automate Nanogen (marque de commerce) spottée avec les complémentaires des régions variables des sondes (NanoChip (marque déposée) Electronic Microarray, 100-Site 10 NanoChip (marque déposée) Cartridge) Station de traitement Nanochip (marque déposée) Molecular biology Workstation (Nanochip (marque déposée) Reader, Nanochip (marque déposée) Loader) L-histidine (Invitrogen, référence: 0955061 IX) 15 -. Multiscreen Filtration system (Millipore (marque déposée)) Tampon de salinité élevée (phosphate de sodium 500 mM, chlorure de sodium 500 mM, Nanogen (marque déposée)) Tampon de salinité faible (phosphate de sodium 50 mM, Nanogen (marque déposée)) 20 NaOH 0,1 M 1. f.3 Méthodes

Préparation de la cartouche 25 Les sondes complémentaires aux régions spécifiques des marqueurs sont purifiées sur le système de filtration Multiscreen (de Millipore (marque déposée)) puis reprises dans 60 pL de tampon L-histidine 50 mM. Elles sont alors transférées sur la cartouche. Chacune 30 d'elle est alors adressée sur un site spécifique de la cartouche pendant une période de 1:20 secondes (protocole géré par la station de travail). La biotine en 5' se fixe sur la streptavidine du support. Tableau 1.6 : Plan de dépôt des sondes 1 2 3 4 5 1 Anti 1 Anti 2 Anti 3 Anti 4 _ Anti 5 2 Anti 6 Anti 7 Anti 8 Anti 9 Anti 10 Hybridation des marqueurs 10 Rincer la cartouche deux fois avec du tampon de salinité élevée (75 pL). Préparer un mélange contenant 5 pL d'extrait (marqueurs), ainsi que les sondes fluorescente à une concentration finale de 0,5 pM dans du tampon de salinité élevée (q.s.p. 100 pL). Prélever 75 pL de ce mélange dans la cartouche puis incuber trois minutes à température ambiante. 15 Vider la cartouche puis rincer deux fois avec 75 pL de tampon de salinité élevée. Rajouter 75 pL de tampon de salinité élevé à la fin de l'opération. Démarrer ensuite l'appareil en utilisant le protocole standard de la station de travail Nanogen (marque déposée). Régénérer la cartouche qui peut être réutilisée. 20 I.G Exploitation des résultats et interprétation L'analyse des trois produits marqués dans ce premier exemple (cf. figure 5) permet de simuler trois configurations possibles (parmi d'autres) lors des étapes d'authentification du produit. 25 Dans les premier et second produits marqués, l'utilisateur a pu détecter la présence du polynucléotide codant. La seule présence de ce polynucléotide indique que le produit est susceptible d'être authentique. En ce qui concerne le troisième produit, l'absence totale de détection du5 polynucléotide codant indique que le produit n'est pas marqué : il n'est donc pas authentifié. Après lecture de l'information portée par le polynucléotide codant présent clans le premier et le deuxième produit, l'utilisateur se reporte à la table associative lui indiquant que le code du polynucléotide codant correspond à la présence des polynucléotides cibles 1 et 2 (peu importe les polynucléotides leurres présents). Ces polynucléotides sont bien détectés dans la première solution marquée, et uniquement ces deux polynucléotides : la première solution peut être authentifiée. Quant à la deuxième solution, la présence non attendue des polynucléotides cibles 3, 4 et 5 ne permet pas d'authentifier le produit.

E=xemple 2 : marquaqe selon le procédé de l'invention d'un produit cosmétique Cette exemple illustre un marquage à l'aide de plusieurs polynucléotides d'acide désoxyribonucléiques simple brin, injectés dans une crème pour la peau, et détectés selon la technique présentée dans l'exemple 1.

II.A. Injection des polynucléotides dans la crème

2.a.1 Principe Les marqueurs sont d'abord préparés de l'eau distillée sans nucléases, puis incorporés la crème, à une concentration finale de 10-12 mole par comprimé de dm3 de crème pour les marqueurs cibles et leurres, et à une concentration de 10-14 moles par dm3 de crème pour les marqueurs codants.

2.a.2 Matériels -- Polynucléotides de synthèse (Eurofins MWG Gmbl-l), 100 pmol/pL Acide désoxyribonucléiques simple brin circulaires (marqueurs codants) - H20 déionisée. sans nucléase - crème Thermal Fix 2 (marque déposée), Laboratoires VICHY

2 .a.3 Méthodes Un mélange préliminaire de polynucléotides cibles, codants et leurres est injecté à l'aide d'une pipette P10 (Gilson Pipetman, marque déposée) dans des échantillons de 1 cm3 de crèmes Thermal Fix (marque déposée), conduisant à une concentration finale de 10-12 moles de rnarqueur par dm3 pour les marqueurs cibles et leurres, et une concentration finale de 1014 moles par dm3 pour les polynucléotides codants. Les échantillons sont alors conservés pour leur identification. PI.B. Extraction et détection des marqueurs Les marqueurs sont détectés de la mêrne façon que dans l'exemple 1, excepté l'étape d'extraction des polynucléotides.

2.b.1 Principe d'extraction Les marqueurs sont extraits de la crème par cassage de l'émulsion et récupération de la phase aqueuse. Une forte température (supérieure à 80°C) est suffisante pour réduire l'émulsion constituant la crème et ainsi séparer les phases aqueuses et lipidiques. Les marqueurs, très polaires, se retrouvent dans la phase aqueuse d'où ils sont extraits. 2.b.2 Matériel - Crème Thermal Fix (marque déposée) (Vichy) Marquée - Bloc chauffant ou bain marie. - H20 déminéralisée sans nucléases.30 2.b.3 Méthode La crème marquée est chauffée 15 minutes à une température de 95°C, puis centrifugée 5 minutes à 10 000 rcf. La phase aqueuse est récupérée, et est utilisée pour la détection des marqueurs. Les polynucléotides peuvent alors être détectés selon le procédé décrit dans l'exemple 1.

!Exemple 3 : marquage selon le procédé de l'invention d'un spiritueux Cet exemple illustre une technique de marquage d'un spiritueux à l'aide d'un mélange de polynucléotides cibles, codants et leurres. Le premier type de marqueur (polynucléotides cibles) est constitué d'un pool de 20 acides désoxyribonucléiques simple brin d'une taille de 20 bases. Le second marqueur est un acide nucléique circulaire simple brin, d'une taille de 1000 bases, dont la séquence contient les instructions de recherche des marqueurs cibles. Ainsi, cette séquence permet de savoir quels marqueurs cibles, parmi les 20, sont significatifs pour le codage du spiritueux, les autres marqueurs étant des leurres ajoutés de manière semi aléatoire. 111.A. Mise au point des marqueurs et marquage

3.a.1 Principe détaillé de la technique de marquage Vingt marqueurs d'acide désoxyribonucléique simple brin sont générés grâce à l'algorithme présenté dans la description de l'invention. Ces marqueurs diffèrent les uns les autres, ne s'autohybrident pas, et ne sont pas susceptibles de s'hybrider les uns les autres. Ils constituent les polynucléotides cibles. Le polynucléotide codant est un acide désoxyribonucléique de 1000 bases, circulaire. La séquence de cet acide nucléique contient, à un endroit donné, une cassette contenant la combinaison des polynucléotides cibles à chercher dans le produit. La figure 6 annexée présente le principe du marquage couplé : le marqueur codant, sous forme circulaire, contient un site d'informations générales, ainsi qu'un site permettant de savoir lesquels des marqueurs cibles, également présents dans le mélange, portent l'information de code (les autres n'étant que des leurres). Ainsi, seule la combinaison des marqueurs cibles désignés par le marqueur codant est significative pour l'authentification, les autres marqueurs n'étant que des leurres. La séquence du marqueur codant contient donc une boite codante, dont la position est cachée. La lecture de cette séquence permet à l'utilisateur de connaître quels marqueurs sont à rechercher dans le pool de marqueurs cibles via un recoupement dans une table de correspondance. La combinaison des marqueurs cibles permet d'identifier le produit de façon unitaire : une seule combinaison possible pour un produit possible. Dans le marqueur codant, en aval de la cassette codante pour la combinaison des marqueurs cibles à rechercher, une seconde séquence code pour des informations générales relatives au produit, telles que le lot, l'année de production, etc. Ces marqueurs sont alors injectés dans le spiritueux à marquer. La détection se déroule ensuite en deux phases. La première consiste à détecter les séquences spécifiques du marqueur codant. Les premières informations qui en sont tirées sont les suivantes : • Authentification du produit. En cas de contrefaçon grossière, aucun marqueur codant n'est présent • Informations sur le produit : N° de lot, date de fabrication, ... • Combinaison unique de marqueurs cibles à rechercher pour une détection plus fine.

Si cette première authentification n'est pas jugée suffisante, une deuxième est effectuée sur les marqueurs cibles. Cette deuxième authentification permet de déduire les informations suivantes : • Contrefaçon grossière en cas d'absence des marqueurs cibles ou mauvaise combinaison. • Produit issu d'un mélange si d'autres marqueurs sont détectés en plus de ceux prévus par le marqueur codant. • Authentification du produit de façon précise via recoupement avec une base de données. 3. a.2. Matériels Polynucléotides de synthèse (Eurofins MWG GmbH), 100 pmoles/pL (marqueurs cibles) Champagne Moêt et Chandon (marque déposée), Brut Imperial Acides désoxyribonucléiques simples brins circulaires (marqueurs codants) Eau déionisée, sans nucléases.

3. a.3 Méthode a. Marqueurs cibles Les marqueurs cibles sont constitués des 20 polynucléotides différents, obtenus par synthèse chimique (Eurofins MWG GmbH). Cet exemple est réalisé avec le marquage de 5 produits différents. Dans chacun de ces produits, les 20 marqueurs peuvent être utilisés : Primer-1 : 5'-AGTCGAGAGCCGATTCCGCT-3' (SEQ ID NO: 25) Primer-2 : 5'-GTCCGAGCAAAGGCTTCCGT-3' (SEQ ID NO: 26) Primer-3 : 5'-AGACCCGTGGGCTCCATTAG-3' (SEQ ID NO: 27) Primer-4 : 5'-CCACCCAGAGGGCTTAGGTT-3' (SEQ ID NO: 28) Primer-5 : 5'-ATCCCACGAGGGTGATCTCG-3' (SEQ ID NO: 29) Primer-6 : 5'-GGAATCCGACCGTGCATGTC-3' (SEQ ID NO: 30) Primer-7 : 5'-CAGAGACGTGACCCGCTGTT-3' (SEQ ID NO: 31) Primer-8 : 5'-GACCCAGGGGTACATTCTCG-3' (SEQ ID NO: 32) Primer- 9 : 5'-AAACGAGCCCGTTCCGTGTG-3' (SEQ ID NO: 33) Primer-10 : 5'-GGGAGCCCCAGCATTATCGT-3' (SEQ ID NO: 34) Primer-11 : 5'-GGACGTGAACGCATCCGTCT-3' (SEQ ID NO: 35) Primer-12 : 5'-GGCTGAAGGCCACTACTCTG-3' (SEQ ID NO: 36) Primer-13 : 5'-GTAGGTAGCACACCGTCGCT-3' (SEQ ID NO: 37) Primer-14 : 5'-CAGCCAGGAGATGTCCGTCT-3' (SEQ ID NO: 38) Primer-15 : 5'-GTCCCCAGGTGAGATCATCG-3' (SEQ ID NO: 39) Primer-16 : 5'-CGAGGGACCAGCTTCCGTAT-3' (SEQ ID NO: 40) Primer-17 : 5'-GCCAGTCGCAGGCATGATTC-3' (SEQ ID NO: 41) Primer-18 : 5'-CGCCAGGGTCTCAGTCGTAA-3' (SEQ ID NO: 42) Primer-19 : 5'-GAGCATAGCCGACGTCTTCG-3' (SEQ ID NO: 43) Primer-20 : 5'-GTAGAGTGACACGTCGCTCC-3' (SEQ ID NO: 44) Sur ces 20 marqueurs cibles, 10 seulement sont effectivement injectés dans les produits. Sur ces 10 Marqueurs, 5 sont des leurres, et 5 constituent le marquage effectif du produit. Seule la séquence du marqueur codant permet de retrouver quels sont les marqueurs codants, et quels sont les leurres. En outre, les produits 1 à 4 sont des échantillons de Champagne Moêt et Chandon, cuvée impériale 2005 (marque déposée), le produit numéro 5 est un échantillon de Champagne Moet et Chandon, cuvée impériale 2002 (marque déposée).

Tableau 3.1 : Marquage des produits 1 à 5 avec les marqueurs cibles 1 à 20 Produit 1 Produit 2 Produit 3 Produit 4 Produit 5 Primer 1 - L - M - Primer 2 - L M - - Primer 3 - L - - - Primer 4 M M - - M Primer 5 - L - M - Primer 6 M M M - M Primer 7 - L - - - Primer 8 M M L L M Primer 9 - - - M - Primer 10 M M M - M Primer 11 - - L L - Primer 12 M M L L M Primer 13 - - - M - Primer 14 - - M - - Primer 15 L - - - L Primer 16 L - - M L Primer 17 L - M - L Primer 18 L - L L L Primer 20 L - L L L Le tableau 3.1 illustre le marquage des 5 produits. Le tiret indique que le marqueur n'est pas injecté. La lettre M indique que le marqueur est injecté, et qu'il sert dans la signature du marquage. La lettre L signifie que le marqueur est injecté, mais qu'il fait office de leurre. Ainsi, les produits 1 et 2, même s'ils contiennent des leurres différents, contiennent les mêmes marqueurs. Ils présentent la même signature. A l'inverse, les produits 3 et 4 présentent les mêmes leurres, mais les marqueurs sont différents. Ils ont donc une signature différente. Le produit 5 présente la même signature que le produit 1. Seul le marqueur codant fait la différence entre les deux produits. Prédilués à une concentration de 10-7 moles/L dans du produit à marquer (1 pL de solution initiale à 10-4 mol/L dilué dans 999 IJL de produit à marquer, puis 10 pL de cette solution intermédiaire dans 990 pL de produit à marquer), les marqueurs sont injectés à raison de 100 pL (à l'aide d'une Pipette P100) de façon à obtenir une concentration finale de 110-9 moles/L dans chacun dans les produits 1 à 5 dont le volume final est, pour l'exemple, de 10 mL. Le produit contient donc 10-8 moles de marqueurs par litre, soit au total 10-10 moles de marqueurs dans 10 mL.

f3. Marqueur codant Synthétisés suivant le protocole de l'exemple 1, les marqueurs codants sont des acides désoxyribonucléiques simples brins d'une longueur totale de 1000 bases. Leur séquence est la suivante (SEO ID NO: 45) :

5' CAGAAGAATGCACGCTCTTTAACGCTTCGCCCTAAAATGGGCCATG ACTATTGAGAATACGATACCTTCCCGCGTTAGCATCCCTTCCCTGATG CTGGTAGATCTACACCATCTGTACGGGAGATAAGGCTGGCTGTGCGC TTAGACGGGAACTTGGACCGGAAGAATGCGTACAGCCTTACGCGCAT CCGAGTCGTCACCTACCACACGCTCATGCGCACTTTACGGGTAAAAA GTGTTAATCGTAACAGTGTCGGGACCACTCCTATGCTAATACCAGCGT GGTCCAGTGACGTTTTTACATAGTAGGTGCTCTAATCTTGCAAACCAC CGTTTCATTATCTGTTATTCTCCCTTGCTAATGGCCCGCTCAGCACCG GGTGTTCCCAGAGGAGAGCTCCCAGCCACGTTGCAGCGAGCGGGCT GTCGAAAGTATAAAGTTCTTAC[marq uagel ]ACATT CTATGCGTATCAT TTCTC CTAC G GATCTG GAG CTAATC C G GTAC G CAG CTTAC G CACAAT GGCATAAGCTGTGACGTGGGATAGATAGTACTCTCTACAAACGTACA GAGCAGTGTTATCGATACCCCCCGCAGCCAATTACTCATAAATCCGA CACAGCAACGCCCATTTTCAGTTTTCGGTATACGTGCGGGCTCCTCAT ATGTATTAACGTTGAGTGACTCTGCAGTCCGATTGGATGTTGGTTCCA TCCGCTATCGTAGAGTCCTATC[marq uage2]GAAATCCACAAATCTGT GCGATTTGACGTACATTTCGTATCGGCGGTAGTTACGCAAGCTAGCA CTACCATAGTAGTATCGTTATTCGGGCTTGACAACCTCGAAGGCGTG GGGAAGAAGCGTCAGTATCTTCGCAAGAAATGAGGAAGAGGTACCAA TAAGCGAATGGGCCCGAAACTACGTCCTCGCAGAGGGCGATCGATC (3GCGATTAGAGTCTGGGGGGTAGTTCAGCACA 3' La marque 1 code pour la combinaison de marqueurs cibles à chercher dans le produit. La marque 2 code pour une information générique telle que la cuvée d'où sont issus les échantillons. Ci-dessous (tableau 3.2), la légende des marques de types 1.

Tableau 3.2 : Codage des marqueurs cibles selon les sites variables des marqueurs codants Premier marquage Séquence de la Marque Marqueurs cibles correspondant 5' CGAAATAATCTGCCCGGTCT 3 Primers 4, 6, 8, 10, 12 (SEQ ID NO: 46) 5' ACTCGTTTAGGGAAGCTCTA 3' Primers 2, 6, 10, 14, 17 (SEQ ID NO: 47) 5' AGCGCATGATATATAGTACC 3' Primers 1, 5, 9, 13, 16 (SEQ ID NO: 48) 5' GGTACTAAGAGTGGCATTGC 3' Primers 3, 12, 13, 14, 15 (SEQ ID NO: 49) Tableau 3.3 : Codage du type de produit selon les informations 15 secondaires des marqueurs codants Second marquage Séquence de la Marque Information 5' ATTTGGAGGCCCGAATACAA 3' Champagne Moét et 10 (SEQ ID NO: 50) Chandon, cuvée Impériale 2000 5' AGCCCCATAAGACGCGCTAA 3' Champagne Moét et (SEQ ID NO: 51) Chandon, cuvée Impériale 2002 Dans les 5 produits est alors injecté un marqueur codant spécifique, qui indique quels sont les marqueurs d'authentification cibles codant pour l'information, et qui indique, dans notre exemple, la cuvée d'où provient l'échantillon, à une concentration finale de 10"" moles/L selon la technique décrite dans l'exemple 1. Ils contiennent les séquences variables suivantes :

Tableau 3.4 : récapitulatif des marquages des produits 1 à 5 M PM Marque 1 Marque 2 5' CGAAATAATCTGCCCGGTCT 3' 5' ATTTGGAGGCCCGAATACAA 3' 1 1 (SEQ ID NO: NO 45) (SEQ ID NO: NO 50) 2 2 5' CGAAATAATCTGCCCGGTCT 3' 5' ATTTGGAGGCCCGAATACAA 3' (SEQ ID NO: NO 52) (SEQ ID NO: NO 50) 3 3 5' ACTCGTTTAGGGAAGCTCTA 3' 5' ATTTGGAGGCCCGAATACAA 3' (SEQ ID NO: NO 53) (SEQ ID NO: NO 50) 4 4 5' AGCGCATGATATATAGTACC 3' 5' ATTTGGAGGCCCGAATACAA 3' (SEQ ID NO: NO 48) (SEQ ID NO: NO 50) 5 5 5' CGAAATAATCTGCCCGGTCT 3' 5' AGCCCCATAAGACGCGCTAA 3' (SEQ ID NO: NO 48) (SEQ ID NO: NO 46) M = marquage PM = Produit marqué 15 III.B. Extraction des marqueurs La détection se fait en deux étapes. La première consiste à détecter les marqueurs codants. Elle permet une première authentification des produits, grâce à la deuxième marque. La lecture de la première rnarque permet ensuite de connaître la combinaison de marqueurs cibles à rechercher.

3. b.1 Principe de l'extraction Les marqueurs sont extraits de leur milieu (ici, un vin de Champagne), puis récupérés en milieu aqueux dans le but de pouvoir ensuite utiliser les techniques de biologie moléculaire d'identification. L'extraction doit de préférence non seulement avoir un bon rendement (récupérer un maximum de marqueurs, idéalement : rendement de 100 %), mais elle doit aussi débarrasser les marqueurs de toutes substances polluantes pouvant interférer avec les techniques de détection. En outre, elle doit de préférence être efficace pour les deux types de marqueurs. 3. b.2 Matériel Phénol UltraPure (marque de commerce) Buffer-Saturated Phénol, Invitrogen. chloroforme/alcool isoamylique (24:1) acetate de sodium 3M éthanol glacé 95% (Carlo Erba Rectapur), 75% UltraPure Glycogen, Invitrogen (marque de commerce) 20 pg/pmol Eau déionisée, sans nucléases.30 3. b.3 Méthode La technique utilisée est celle de l'extraction au phénol chloroforme. Pour l'exemple, les marqueurs sont extraits à partir de 500 pL de produit (Champagne). Dans un tube de 2 mL (Eppendorf, marque déposée) contenant 500 pL de produit marqué, ajouter '/2 volumes de phénol (250 pL), volume de chloroforme (250 pL) à l'aide d'une pipette P1000, puis vortexer 10 secondes. Centrifuger 5 minutes à 10000 rcf. - Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube de 2 mL (Eppendorf, marque déposée), et ajouter 1 volume (500 pL) de chloroforme. Vortexer et centrifuger 5 minutes à 10000 rcf. Répéter cette étape 5 fois.

Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube, puis ajouter 3pL de Glycogène, 1/10 de volume (50 pL) d'acétate de sodium 3M et 2,5 volumes (1250 pL) d'éthanol glacé. Mixer puis incuber 1 heure à -20°C - Centrifuger 10 minutes à 10 000 rcf. Jeter le surnageant et laver délicatement le culot avec 200 pL d'éthanol glacé à 75 %. Sécher ensuite le culot. Le reprendre dans 20 pL d'eau déionisée, sans nucléases.

III.C. Détection du marqueur codant 3. c.1 Principes Le marqueur codant est détecté par une technique de Polymérisation en Chaîne. Deux amorces sont nécessaires pour ce faire. Un premier type d'amorce est complémentaire à une région située en 5' de la séquence variable 1. Cette amorce est dite Universelle car elle ne dépend pas de la variabilité des marqueurs cibles (elle reconnaît un site commun à tous ces marqueurs). La deuxième amorce est quant à elle complémentaire aux sites variables 2. Ainsi, on utilise autant de couples dl'amorces que de types de séquences variables 2 (ici, deux couples). La figure 7 annexée représente la détection du marquage primaire des marqueurs codants par PCR. Cette figure reprend les deux types d'amorces, la matrice ainsi que le brin qui lui est complémentaire et qui est généré lors du premier cycle de PCR. Pour chaque type de séquence variable 2, une réaction de polymérisation en chaîne est réalisée sur les marqueurs extraits des produits. L'amplification spécifique du marqueur codant pour un couple d'amorce révèle la présence d'une séquence de type 2. L'absence d'amplification est révélatrice d'un produit non marqué donc probablement contrefait. Une amplification du marqueur avec le mauvais couple d'amorce, ou avec plusieurs couples d'amorces révèle une tricherie quant au produit (tricherie sur la cuvée, mélanges, ...)

3.c.2. Materiel Taq Polymérase (Applied Biosystems) AmpliTaq Gold Tampon10 X PCR Buffer II (Applied Biosystems) MgCl2 Solution (25 mM) (Applied Biosystems) - Amorce sens Universelle (Eurofins MWG GmbH), 100 pmol/pL) 5' ACGTTGCAGCGAGCG 3' (SEQ ID NO: 56) Amorce anti-sens (cf. séquences variables V2 : les amorces anti-sens sont leurs complémentaires inverse) (Eurofins MWG GmbH), 100 pmol/pL) - dNTP (2 mM) Gel d'agarose (Agarose Electrophoresis Grade, Invitrogen, référence: 15510-027) - Tampon Tris Borate EDTA (TBE) 0,5 X Bromure d'Ethidium 10 15 3. c.3 Méthodes Dans un tube de 200 pL (Eppendorf, marque déposée), ajouter les réactifs à l'aide d'une pipette P2, P10 et P100, selon le tableau 3.5.

Tableau 3.5 : Réaction de Polymérisation en chaîne Réactif Volume ( pL) Matrice : Produit d'Extraction 5 Amorce Sens Universelle (10 pM) 0,5 Amorce Anti-sens spécifique (10 pM) 0,5 Tampon 10X 5 dNTP (2mM) 2,5 MgCL2 (25 mM) 2,5 AmpliTaq Gold (5U / pL) 0,5 H20 qsp 50 pL 33,5 Les réactions de polymérisation en chaîne sont alors lancées sur un appareil GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystem) En respectant les cycles suivants :

- 94°C 5' - 94 °C 30" l - 55 °C 30" 1-> 40 cycles - 72°C 30"1 - 72 °C 7'

Les produits de réaction de polymérisation en chaîne sont alors déposés sur un gel d'agarose 0,5% préparé en TBE 0,5X et mis à migrer clans un tampon TBE 0,5 X à 10 V.cm-l. Après un temps de migration adéquat, le gel est mis dans un bain contenant du BET, rincé puis révélé aux UV. Pour chaque produit, l'absence de bande révèle que le marqueur n'a pas été détecté, ou que la séquence 2 ne correspond pas au type d'amorce utilisée. Une bande (de taille de 358 pb correspond à une amplification, donc à la détection d'une séquence spécifique du marqueur codant. Pour chaque révélation positive, les amplicons sont conservés pour une possible détection des marqueurs cibles. III.D Détection des marqueurs cibles

3. d.1 Principe 15 Les marqueurs cibles sont recherchés dans le produit pour une détection plus poussée du marquage. Seule la lecture du marqueur codant permet de détecter les marqueurs cibles. Cette détection se fait sur les amplicons obtenus précédemment par réaction de polymérisation en chaîne. La première étape consiste à lire l'information contenue sur les 20 marqueurs codant, et donc sur les amplicons. Cette information (séquences 1) permet de connaître, grâce à une table de corrélation, quels sont les marqueurs cibles présents dans le produit dont la présence porte l'information du marquage. Connaissant ceci, une détection des marqueurs cibles totaux est réalisée, en utilisant une puce à ADN. Après 25 révélation de cette détection, l'utilisateur est à même de savoir quels marqueurs cibles sont présents ou non dans le produit, et peut comparer ces résultats aux résultats théoriquement attendus obtenus en lisant l'information portée sur les marqueurs codants.

30 3. d.2 Matériels - Amorce sens Universelle (Eurofins MWG GmbH), 100 pmol/pL)10 5' ACGTTGCAGCGAGCG 3'(SEQ ID NO: 56) BigDye (marque déposée) Terminator V3.1 (Applied Biosystems) - Matrice : amplicon marqueur codant - H20 déionisée sans nucléases.

3. d.3 Méthodes La réaction de séquence est effectuée sur chacun des amplicons, dans un tube de 200 pL (Eppendorf, marque déposée), selon le protocole exposé dans le tableau 3.6. Tableau 3.6 : Réaction de séquence Réactif 1 séquence BigDye (marque déposée) 2 pl_ Amplicon (matrice) 5 pl_ Amorce 10 pM 1,6 pl_ H2O q.s.p. 10 pL Les réactions sont alors lancées sur un appareil GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystem) en respectant les cycles suivants :

- 96 °C 1' - 96°C 10"I - 50 °C 5" 1 -> 25 cycles - 60 °C 4'

20 Après purification sur colonne (Qiagen, marque déposée), les réactions sont alors séquencées sur un séquenceur 16 capillaires ABI3100 (Applied Biosystem). Du résultat de ces séquences sont extraites les séquences variables 1 (ou Marques 1). Ces séquences permettent de retrouver quels 25 marqueurs cibles doivent être présents dans le mélange, par recoupement dans la table suivante (tableau 3.7) : 10 15 Tableau 3.7 : Codage des marqueurs cibles selon les sites variables des marqueurs codants Séquence de la Marque Marqueurs cible correspondant 5' CGAAATAATCTGCCCGGTCT 3' Primers 4, 6, 8, 10, 12 (SEQ ID NO: 52) 5' ACTCGTTTAGGGAAGCTCTA 3' Primers 2, 6, 10, 14, 17 (SEQ ID NO: 53) 5' AGCGCATGATATATAGTACC 3' Primers 1, 5, 9, 13, 16 (SEQ ID NO: 54) 5' GGTACTAAGAGTGGCATTGC 3' Primers :3, 12, 13, 14, 15 (SEQ ID NO: 55) Les marqueurs cibles sont alors détectés selon la technique exposée dans l'exemple 1. Cette détection révèle bien sûr la dizaine de marqueurs présents dans chaque produit, mais c'est en comparant avec 10 les marqueurs codants que l'on sait retirer l'information pertinente.

Exemple 4: marquage selon le procédé de l'invention d'un médicament Cet exemple montre comment marquer des médicaments se présentant sous la forme de comprimés tels que ceux employés pour de nombreuses formules médicamenteuses, selon le procédé de marquage de la présente invention. Le protocole de l'exemple 1 est utilisé. 15 20 IV.A. Injection des polynucléotides dans les capsules

4.a.1 Principe Les marqueurs sont d'abord mis dans une solution éthanolique (80%) puis incorporés lors du processus de fabrication de comprimés, à une concentration finale de 10-12 mole par comprimé de 400 mg pour les marqueurs cibles et leurres, et à une concentration de 10-14 moles par comprimé pour les marqueurs codants. Pour cet exemple, les comprimés ne contiennent aucun principe actif.

4.a.2 Matériels Polynucléotides de synthèse (Eurofins MWG GmbH), 100 pmol/pL Acide désoxyribonucléiques simple brin circulaires (marqueurs codants) H2O déionisée, sans nucléase Béta-Lactose, Sigma Aldrich (Marque déposée) #L.3750-500G Amidon de mais, Sigma Aldrich (Marque déposée) #S4180-500G Calcium dihydrogenphosphate, Sigma Aldrich (Marque déposée) #307645 - Sirop de sucre Magnesium stearate, Sigma Aldrich (Marque déposée) #26454-1 KG

4 .a.3 Méthodes a. Préparation de la solution de marqueurs Les marqueurs sont préparés de la même manière que dans l'exemple 1. Un mélange préliminaire est cependant réalisé dans une solution éthanolique à 80% pour l'incorporation des polynucléotides dans les comprimés. b. Préparation des comprimés Les comprimés sont préparés à partir de 300 g de grains. Les clifférentes poudres composant les grains sont tout d'abord pesées puis rnélangées (Mélangeur à projection et tourbillonnement type Lodigge ), suivant la formule suivante :

- Béta-Lactose : 120g - Amidon de mais : 60g Calcium dihydrogenphosphate : 120g La solution de mouillage est ensuite préparée à partir de 100g de sirop de sucre et de 750 pL de la solution de marqueurs. Ajouter ensuite petit à petit cette solution de mouillage au mélange de poudres, jusqu'à obtenir une masse humide ayant l'aspect d'une semoule grossière, puis granuler le mélange précédent pour obtenir un grain ayant l'aspect d'un vermiculé humide (à l'aide d'un Granulateur oscillant). Le grain est alors séché à une température de 60 °C jusqu'à obtenir une hygrométrie de 4 à 6 % puis tamisé sur une colonne tamis pour éliminer les particules fines. Après lubrification à l'aide de stéarate de magnésium 1%, les grains sont montés en presse puis comprimés en presse.

W.B. Extraction et détection des marqueurs Les marqueurs sont détectés de la même façon que dans l'exemple 1, excepté l'étape d'extraction des polynucléotides.

4.b.1 Principe d'extraction Les marqueurs sont extraits par broyage des comprimés, puis récupération des polynucléotides en phase aqueuse. 4.b.2 Matériel - Comprimés Marqués. - Bloc chauffant ou bain marie. - H20 déminéralisée sans nucléases. 4.b.3 Méthode Les comprimés sont broyés à l'aide d'un mortier et d'un pilon, de façon à obtenir une très fine poudre. Cette poudre est alors mélangée à 1 mL d'eau distillée, dans un tube de 1,5 mL (Eppendorf, marque déposée). Après chauffage 15 minutes à 70°C, le tube est centrifugé 5 minutes à 5000 rcf afin d'éliminer les particules solides. La phase aqueuse est ensuite reprise dans un nouveau tube pour l'étape d'authentification des polynucléotides. Les polynucléotides peuvent alors être détectés selon le procédé décrit dans l'exemple 1.

Exemple 5 : marquage selon le procédé de l'invention d'un produit alimentaire Cet exemple montre comment marquer puis extraire des marqueurs dans un produit alimentaire, tel que de la pâte à pizzas. Les marqueurs sont injectés à la pâte fraîche et en cours de préparation. Ils peuvent être détectés par la suite dans le produit fini, prêt à la consommation, cuit ou non.

2 5 V.A Marquage de la pâte

5.a.1 Principes Les marqueurs sont pré-dilués dans de l'eau déminéralisée. Des mélanges de polynucléotides cibles, codants et, leurres sont utilisés, 30 comme présenté dans l'exemple 1. Ils sont alors incorporés à une recette de pâte à pizza, qui est mise à cuire par la suite. 5.a.2 Matériels Polynucléotides de synthèse (Eurofins MWG GmbH), 100 pmol/pL Acide désoxyribonucléiques simple brin circulaires (marqueurs codants) H2O déionisée, sans nucléase - Ingrédients pour pâte à pizzas : farine T45 Farine de blé tous usages pour préparations gourmandes Francine (Marque déposée) , huile d'olive Huile d'olive vierge extra extraite à froid Carapelli (Marque déposée), levure Levure boulangère spéciale Pains Francine (Marque déposée) , sucre Sucre blanc en poudre Daddy (Marque déposée), sel Sel fin iodé blanc naturel essentiel Cérébos (Marque déposée.)

5.a.3 Méthodes Une solution préliminaire de marqueurs cibles, codants et leurres est ajoutée, préparés comme exposé dans l'exemple 1, est ajoutée à l'aide d'une pipette P200 (Gilson Pipetman, marque déposée) à la pâte à pizza lors de sa fabrication, en quantité suffisante pour obtenir une concentration finale en marqueurs de 1 E-10 moles/kilogramme (pour chaque marqueur non leurre, soit au 2E-9 moles/kilogramme de polynucléotides). Le tableau suivant, (tableau 5.1) indique les différentes quantités d'ingrédients pour obtenir 828 grammes de pâte à pizza crue.

Tableau 5.1 : Fabrication de pâte à pizzas marquée Ingrédient o!uantité ou Volume Farine 500 g Huile d'Olive 50 g Levure 12 g Sucre 8 g Sel 8 g Eau 250 mL Solution préliminaire de polynucléotides 166 pL La pâte est alors cuite au four, pendant 15 minutes à une température moyenne de 240 °C.

V.B Extraction des marqueurs Les marqueurs sont extraits par dissolution d'une portion de pâte cuite dans de l'eau déminéralisée : 1 gramme de pâte cuite est réduit en poudre, puis repris dans 10 mL d'eau. Le tout est alors mélangé vigoureusement puis mis à chauffer 15 minutes à 94 °C. Après 1 o centrifugation 5 minutes à 10000 rcf, la phase aqueuse récupérée et stockée à 4°C pour la révélation des marqueurs. Ces marqueurs ont été détectés selon la technique présentée dans l'exemple 1.

15 Exemple 6 : Marquage selon le procédé de la présente invention de tabac Cet exemple montre comment marquer du tabac. Il est marqué à l'aide de polynucléotides tels que présentés dans l'exemple 1 par adsorption directe sur le tabac. VI.A Marquage du tabac

6.a.1 Principe Le marquage porte sur un du tabac de cigarettes dites 25 blondes . Sur cet échantillon est adsorbé un mélange de polynucléotides cibles, de polynucléotides codants et de polynucléotides leurres tels que décrits dans l'exemple 1. 20 6.a.2 Matériels - Polynucléotides de synthèse (Eurofins MWG GmbH), 100 pmol/pL - Acide désoxyribonucléiques simple brin circulaires (marqueurs codants) - Ethanol (Ethanol anhydrous, denatured, Sigma-Aldrich # 676829) - H20 déionisée, sans nucléase - Cigarettes Marlboro (marque déposée), Philip Morris Products S.A.

6.a.3 Méthodes Le tabac est marqué par la solution de polynucléotides préparés selon le procédé décrit dans l'exemple 1. Un gramme de tabac extrait de cigarettes est marqué de façon à obtenir, au final, 10"12 moles de marqueur par gramme de tabac : une quantité suffisante de solution de pré-marquage est injectée à l'aide d'une pipette P200 (Gilson Pipetman, marque déposée) directement sur le tabac, puis le tout est mélangé vigoureusement, à une température de :37°C pendant 15 minutes. Le tabac ainsi marqué est alors conservé à une température de 16°C et à 70% d'hygrométrie.

VI.B Extraction et identification des marqueurs Les marqueurs sont extraits par trempage du tabac marqué dans de l'eau déminéralisée : un gramme de tabac est mis à tremper dans 10 mL d'eau distillée déionisée, puis mis à chauffer 15 minutes à 94°C.

Après centrifugation 5 minutes à 10000 rcf, la phase aqueuse récupérée et stockée à 4°C pour la révélation des marqueurs. Ces marqueurs peuvent être détectés selon la technique présentée dans l'exemple 1.30 Exemple 7: marquaqe selon le procédé de l'invention d'un hydrocarbure Cet exemple montre comment marquer un hydrocarbure (pétrole brut) et quelle technique peut être utilisée pour extraire les rnarqueurs et révéler le marquage. VII.A Marquage de l'hydrocarbure 7.a.1 Principes Dans cet exemple, un échantillon de pétrole brut est marqué à l'aide de polynucléotides préalablement préparés dans un solvant organique polaire. Le marquage est composé polynucléotides cibles, de polynucléotides codants et de polynucléotides leurres tels que décrits dans l'exemple 1.

7.a.2 Matériels - Polynucléotides de synthèse (Eurofins MWG GmbH), 100 pmol/pL - Acide désoxyribonucléiques simple brin circulaires (marqueurs codants) - H2O déionisée, sans nucléases - Dimethylsulfoxide (DMSO), Euromedex Réf UD8050-A - pétrole brut (IFP) 7.a.3 Méthodes Une solution de polynucléotides simple brin cibles, codants et leurres sont préparés tels que décrits dans l'exemple 1. Un second mélange préliminaire est ensuite réalisé dans du DMSO avant d'insérer les marqueurs dans le pétrole.

La seconde solution préliminaire de marqueurs est alors mélangée au pétrole, à l'aide d'une pipette de précision (Gilson Pipetman, marque déposée) en quantité suffisante pour obtenir une concentration finale en marqueurs de 10-10 moles/L. Le pétrole marqué est alors stocké à température ambiante, en vue de l'identification des marqueurs. 1/11.B Extraction et détection des marqueurs

7.b.1 Principe 10 Les marqueurs sont extraits de leur milieu apolaire, puis récupérés en milieu aqueux dans le but de pouvoir ensuite utiliser une technique d'identification.

7.b.2 Matériels 15 Phénol UltraPure (marque de commerce) Buffer-Saturated Phénol, Invitrogen. chloroforme/alcool isoamylique (24:1) acétate de sodium 3M éthanol glacé 95% (Carlo Erba Rectapur), 75% 20 eau déionisée, sans nucléases. Hexane (Sigma, réf H9379-1 L)

7.b.3 Méthodes La technique utilisée est celle de l'extraction au phénol 25 chloroforme. Pour l'exemple, les marqueurs sont extraits à partir de 500 pL de pétrole brut. Ajouter 2 volumes d'Hexane. Ajouter 1/2 volume de phénol (250 pL), 1/2 volumes de chloroforme (250 pL), et 1/2 volume d'eau (250 pL) mélanger de manière très 30 vigoureuse pendant 30 secondes. Centrifuger 30 minutes à 10 000 rcf.5 Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube, et ajouter 1 volume de chloroforme. Mélanger de manière très vigoureuse et centrifuger 20 minutes à 10 000 rcf. Répéter cette étape 5 fois. - Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube, puis ajouter 1/10 de volume d'acétate de sodium 3M et 2,5 volumes d'éthanol glacé. Mixer puis incuber 1 heure à -20 °C Centrifuger 10 minutes à 10 000 rcf. Jeter le surnageant et laver délicatement le culot avec 200 pL d'éthanol glacé à 75 %. Sécher ensuite le culot. Le reprendre dans 100 pL d'eau déionisée, sans nucléases.

Ces marqueurs peuvent être détectés selon la technique présentée dans l'exemple 1. (Exemple 8 : marquaqe selon le procédé de l'invention d'un produit alimentaire frais Dans cet exemple, un produit alimentaire frais est marqué à raide d'un mélange de polynucléotides. Le produit est un produit laitier : un yaourt.

Vlll .A Marquage du yaourt

8.a.1 Principes Les marqueurs sont pré-dilués dans de l'eau déminéralisée. Le marquage est composé polynucléotides cibles, de polynucléotides codants et de polynucléotides leurres tels que décrits dans l'exemple 1.

8.a.1 Matériels - Polynucléotides de synthèse (Eurofins MWG GmbH), 100 pmol/pL - Acide désoxyribonucléiques simple brin circulaires (marqueurs codants) - H20 déionisée, sans nucléases - Yaourt Activia (Marque déposée) de Danone (Marque déposée)

8.a.2 Méthodes Une solution préliminaire de polynucléotides cibles, codants et leurres est ajoutée au yaourt, dans la masse, en quantité suffisante pour obtenir une concentration finale en marqueurs de 1E-10 moles/kilogramme (pour chaque marqueur non leurre, soit au 2E-9 moles/kilogramme de polynucléotides) à l'aide d'une pipette P10 (Gilson Pipetman, marque déposée), 2 pL de solution préliminaire sont alors injectés dans la masse du produit. Le tout est alors bien homogénéisé à l'aide d'une spatule stérile. Le yaourt marqué est alors stocké à 4°C dans l'attente de l'identification des marqueurs.

VIII.B Extraction des marqueurs Les marqueurs sont extraits par dissolution d'une portion de yaourt dans de l'eau déminéralisée : 1 gramme de yaourt est repris dans 10 mL d'eau. Le tout est alors mélangé vigoureusement puis mis à chauffer 15 minutes à 94 °C. Après centrifugation 5 minutes à 10000 rcf, la phase aqueuse récupérée et stockée à 4°C pour la révélation des marqueurs. Ces marqueurs peuvent être détectés selon la technique présentée dans l'exemple 1.

Exemple 9 : marquage selon le procédé de l'invention d'une boisson Une boisson gazeuse non alcoolisée est marquée à l'aide de polynucléotides tels que décrits dans l'exemple 1 : Orangina (marque déposée), Schweppes International Limited.30 MA Marquage de la boisson

9.a.1 Principes Les marqueurs cibles, codants et leurres sont pré-dilués dans de l'eau déminéralisé. Ils sont alors mélangés directement dans la boisson.

9.a.2 Matériels - Polynucléotides de synthèse (Eurofins MWG GmbH), 100 pmol/pL - Acide désoxyribonucléiques simple brin circulaires (marqueurs codants) H2O déionisée, sans nucléase Orangina (Marque déposée), Schweppes International Limited 9.a.3 Méthodes Un mélange préliminaire est réalisé dans de l'eau déionisée, avant d'insérer les marqueurs dans la boisson. La solution préliminaire de marqueurs est mélangée à la boisson, en quantité suffisante pour obtenir une concentration finale en marqueurs de 1E-10 moles/L (pour chaque marqueur non leurre, soit au 2E-9 moles/L de polynucléotides). La boisson marquée est alors stockée à 4"C dans un récipient hermétique.

IX. B Extraction des marqueurs Les marqueurs sont extraits à l'aide de la technique au phénol-chloroforme présentée dans l'exemple 1. Ces marqueurs peuvent être détectés selon la technique présentée en exemple 1. 70 Exemple 10 : marquage selon le procédé de l'invention d'un support papier Cet exemple montre comment marquer puis extraire des marqueurs dans un support papier. Les marqueurs sont directement adsorbés sur le papier. Ils sont détectés par la suite en dissolvant le papier marqué.

1 o X .A Marquage du papier

10. a.1 Principes Les polynucléotides cibles, codants et leurres tels que décrits dans l'exemple 1 sont pré-dilués dans de l'eau déminéralisée. Une goutte 15 est alors adsorbée à la surface d'une feuille de papier.

10.a.2 Matériels Polynucléotides de synthèse (Eurofins MWG GmbH), 100 pmol/pL Acide désoxyribonucléiques simple brin circulaires (marqueurs codants) 20 - H20 déionisée, sans nucléase. Disque de papier 1 QUALITATIVE Filter Paper , Whatman (marque déposée).

10. a.3 Méthodes 25 Un mélange préliminaire tel qu'exposé dans l'exemple 1 est réalisé dans de l'eau déionisée, avant le dépôt sur la feuille de papier. La solution préliminaire de marqueurs est alors déposée sur le papier, de telle sorte que 1 E-12 moles de marqueurs soient déposées. 1 pL de solution préliminaire est déposé à l'aide d'une pipette de précision P10 (Gilson Pipetman, Marque déposée), ce qui conduit dans à la formation d'un disque de 5mm de diamètre. Le papier est alors séché à l'air libre, puis conservé en vue de la détection des marqueurs.

X.B Extraction des marqueurs Les marqueurs sont extraits par dissolution d'une section de papier dans de l'eau déminéralisée : 1 cm' de papier contenant le disque de marqueurs est découpé en très petits morceaux, puis plongé dans 10 rnL d'eau. Le tout est alors mis à chauffer 15 minutes à 94 °C. La pulpe de papier est mélangée de manière très vigoureuse, puis homogénéisée par aspiration-refoulement à l'aide d'une pipette. Après centrifugation 5 minutes à 2000 rcf, la phase aqueuse récupérée et stockée à 4°C pour la révélation des marqueurs. Ces marqueurs peuvent être détectés selon la technique présentée dans l'exemple 1. Exemple 11 : tests olfactifs et de vieillissement sur un produit marqué selon le procédé de l'invention Des tests de stabilité dans le temps et de vieillissement ont été réalisés conjointement avec un industriel de la cosmétique. Des tests olfactifs ont permis de vérifier que l'ajout de polynucléotides cibles, codants et leurres en réalisant un marquage selon la présente invention n'altèrent en rien les propriétés physico-chimiques et olfactives des parfums. Ces tests ont été réalisés en parallèle sur plusieurs parfums, et selon plusieurs conditions : un mois à 5°C qui a fait office de référence, un mois à 50°C, qui a simulé un vieillissement accéléré du parfum, ainsi qu'un mois exposé à la lumière du jour. Après vieillissement, des tests ont montré que les solutions 30 contenant des polynucléotides gardent les mêmes propriétés physico-chimiques et olfactives que les solutions ne contenant pas de polynucléotide, et ce quelque soit la méthode de vieillissement. En outre, pour chaque flacon, les marqueurs ont été extraits, puis identifiés avec succès.

Exemple 12: tests olfactifs et de vieillissement sur un produit marqué selon le procédé de l'invention

La figure 8 annexée représente un schéma de détection d'un marquage selon l'invention et d'authentification d'un produit marqué selon I"invention. Sur cette figure : 1- Les marqueurs codants sont identifiés. Le premier niveau d'authentification du produit réside en leur présence. Si le produit ne contient pas de marqueur codant, le produit est une contrefaçon. 2- Les marqueurs leurres et cibles sont alors identifiés dans le produit. Sur cette figure, le produit a été marqué avec une série de 20 polynucléotides cibles ou leurres putatifs.

Ainsi, il contient entre 1 et 20 marqueurs sélectionnés dans ce lot. A cette étape du procédé, les marqueurs cibles et leurres ne sont pas différenciés (il est impossible de dire qu'un polynucléotide est polynucléotide cible ou polynucléotide leurre). 3- La nature du polynucléotide codant détecté lors de la première étape (ici le polynucléotide A) est alors envoyée au fournisseur du marquage. Grâce à cette information, le fournisseur du marquage récupère dans une base de données la clé de décryptage du marquage, qui perrnettra 5 10 74 de définir, dans la série des polynucléotides leurres et cibles, lesquels sont leurres et lesquels sont cibles. 4- A l'aide de la clé de décryptage, l'utilisateur s'intéresse aux polynucléotides cibles seulement. II peut alors lire le code que compose la présence ou l'absence de des polynucléotides cibles (dans cet exemple, le code est -, -, + et -). 5- La lecture du code permet alors à l'utilisateur de vérifier, à l'aide d'une base de données sécurisée, si le code d'identification correspond bien au produit d'intérêt. Dans le cas contraire, il peut s'agir d'une reproduction illégale, d'un mélange ou d'un détournement du produit. 75 Liste des références (~ ] Molecular Cloning, Maniatis, Cold Spring-Harbor, 2ème édition, pp C3 à C14.

[2] Smith TF, Waterman MS (1981). Identification of common molecular subsequences, J Mol Biol 1981 Mar 25;147(1):195-7.

I[3] Xin W, Zhang YM, Xiao JH, Huang DW (2003). Construction of linear functional expression elements with DNA fragments created by sitespecific DNA nickase, N.Bpu10 I, and exonuclease III, Biotechnol Lett. 2003 Nov; 25(22):1913-6. [4] Caruthers MH, Beaucage SL, Efcavitch JW, Fisher EF, Matteucci MD, Stabinsky Y., (1980) New chemical methods for synthesizing polynucléotides, Nucleic Acids Symp Ser. 1980;(7):215-23.

[5] Wheeler, C. J., L. Sukhu, G. Yang, Y. Tsai, C. Bustamente, P.

Felgner, J. Norman, M. Manthorpe. (1996). Converting an alcohol to an amine in a cationic Iipid dramatically alters the co-Iipid requirement, cellular transfection activity and the ultrastructure of DNA-cytofectin complexes. Bioch. Biophys. Acta 1280:1. [6] Felgner, J. H., R. Kumar, C. N. Sridhar, C. J. Wheeler, Y. S. Tsai, R. Border, P. Ramsey, M. Martin, P. L. Felgner. (1994). Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic Iipid formulations. J. Biol. Chem. 269:2550 76 [7] Ogris M, Steinlein P, Carotta S, Brunner S, Wagner E (2001) NA/polyethylenimine transfection particles: influence of ligands, polymer sire, and PEGylation on internalization and gene expression, AAPS PharmSci. 2001; 3(3):E21. [8] Molecular Cloning,Maniatis, Cold Spring-Harbor, 2ème édition, pp E3 à E4.

[9] Molecular Cloning, Maniatis, Cold Spring-Harbor, 2ème édition pp 10 9.47 à 9.57.

[10] Kabilov MR, Pyshnyi DV, Dymshits GM, Gashnikova NM, Pokrovskii AG, Zarytova VF, Ivanova EM (2002). A new approach to detect a particular DNA sequence by UV-immobilization of its hybridization 15 complex with a highly specific probe resulting from ligation of a tandem of short oligonucleotides in solution, Mol Biol (Mosk). 2002 May-Jun; 36(3):424-31.

[11] Ramsay G (1998). DNA chips: state-of-the art. Nat Biotechnol. 20 1998 Jan; 16(1):40-4.

(12] Ivanovskaia MG, Kozlov IA, Lebedeva IV, Shabarova ZA (1994). A new method of covalent immobilization of oligodeoxyribonucleotides on nylon membranes for hybridization with nucleic acids, Mol Biol (Mosk).

25 1994 Sep-Oct; 28(5):1176-82.5

Claims (32)

1. REVENDICATIONS1. Procédé de marquage d'un produit, ledit procédé comprenant une étape d'addition sur ou dans ledit produit d'une pluralité de polynucléotides simples brins, ladite pluralité de polynucléotides comprenant : au moins un polynucléotide cible constitué d'un polynucléotide simple brin de longueur et de séquence déterminée, et des polynucléotides leurres qui sont de longueurs déterminées identiques ou différentes et de séquences déterminées identiques ou différentes, lesdits polynucléotides leurres étant de longueur(s) identique(s) ou différente(s) et de séquences différentes de la séquence dudit, au moins un, polynucléotide cible dans lequel chacun des polynucléotides cible(s) et leurres ne s'hybride avec aucun des autres polynucléotides de ladite pluralité de polynucléotides.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ladite pluralité de polynucléotides comprend en outre au moins un polynucléotide de reconnaissance constitué d'un polynucléotide simple brin de longueur et de séquence déterminée d'identification de la nature et la séquence du, au moins un, polynucléotide cible, dans lequel chaque polynucléotide de reconnaissance ne s'hybride avec aucun des autres polynucléotides de ladite pluralité de polynucléotide.
3. 3. Procédé de marquage selon la revendication 1, dans lequel lesdits polynucléotides de la pluralité de polynucléotides sont circulaires ou linéaires.
4. 4. Procédé de marquage selon la revendication 1, dans lequel au moins deux polynucléotides cibles sont utilisés, l'un étant un polynucléotide circulaire et l'autre un polynucléotide linéaire.
5. 5. Procédé de marquage selon la revendication 3 ou 4, dans lequel les polynucléotides linéaires comprennent une extrémité variable dl'un polynucléotide à l'autre et une extrémité constante d'un polynucléotide à l'autre.
6. 6. Procédé de marquage selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les polynucléotides de la pluralité de polynucléotides sont des séquences d'acide désoxyribonucléique.
7. 7. Procédé de marquage selon la revendication 6, dans lequel les polynucléotides de la pluralité de polynucléotides contiennent la même proportion des quatre bases A, C, G et T, naturelles ou modifiées.
8. 8. Procédé de marquage selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel lesdits polynucléotides de la pluralité de polynucléotides sont des séquences d'acide ribonucléique.
9. 9. Procédé de marquage selon la revendication 8, dans lequel lesdits polynucléotides de la pluralité de polynucléotides contiennent la même proportion des quatre bases A, C, G et U, naturelles ou modifiées.
10. 10. Procédé de marquage selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le, au moins un, polynucléotide cible de la pluralité de polynucléotides a une longueur de 5 à 50 nucléotides.
11. 11. Procédé de marquage selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lesdits polynucléotides de la pluralité de polynucléotides ont une longueur de 5 à 5000 nucléotides.
12. 12. Procédé de marquage selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape d'addition est réalisée par addition de ladite pluralité de polynucléotides dans leclit produit lors de sa fabrication ou dans ou sur le produit fini.
13. 13. Procédé de marquage selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel l'étape d'addition est réalisée par addition de ladite pluralité de polynucléotides à la surface dudit produit.
14. 14. Procédé de marquage selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel une étape d'encapsulation de ladite pluralité de polynucléotides dans des vecteurs lipidiques est réalisée préalablement à l'étape d'addition.
15. 15. Procédé de marquage selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'introduction de ladite pluralité de polynucléotides est réalisée sur ou dans un composant dudit produit.
16. 16. Procédé de marquage selon l'un quelconque des revendications précédentes, dans lequel la concentration de la pluralité de polynucléotides après son addition dans ledit produit est de 10-6 moles à 10-18 moles/dm3.
17. 17. Produit marqué susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16.30
18. 18. Produit marqué selon la revendication 17, ledit produit marqué étant choisi dans le groupe comprenant les parfums, les cosmétiques, les produits pour l'hygiène, les produits alimentaires, les arômes, les extraits de plante(s), le tabac, les boissons, textiles, les cuirs, les médicaments, les poudres, les vernis, les encres, produits alimentaires, les hydrocarbures, les papiers, les peintures, les produits et composés chimiques.
19. 19. Procédé de détection du marquage dl'un produit selon la revendication 17, ledit procédé comprenant une étape d'analyse de la pluralité de polynucléotides permettant de détecter spécifiquement le, au rnoins un, polynucléotide cible.
20. 20. Procédé selon la revendication 19, comprenant en outre les étapes suivante, avant l'étape d'analyse : (a) prélèvement d'un échantillon du produit ; et (b) extraction de la pluralité de polynucléotides dudit échantillon, l'étape d'analyse étant réalisée sur la pluralité de polynucléotides extraits dudit échantillon.
21. 21. Procédé de détection selon la revendication 19 ou 20 dans laquelle l'étape d'analyse comprend une réaction de polymérisation en chaîne des polynucléotides cibles.
22. 22 Procédé de détection selon l'une quelconque des revendications 19 à 20 dans laquelle l'étape d'analyse est réalisée par immunodétection.
23. 23. Procédé de détection selon l'une quelconque des revendications 19 à 22, dans laquelle la détection spécifique de l'étape d'analyse comprend les étapes successives suivantes :(i) mettre en contact la pluralité de polynucléotides avec un support solide sur lequel des séquences sondes sont fixées, ces séquences sondes étant complémentaires à une des extrémités dudit, au moins un, polynucléotide cible de la pluralité de polynucléotides du marquage du produit, la mise en contact permettant aux polynucléotides cibles de se fixer sur le support par hybridation avec les séquences complémentaires sondes fixées sur le support ; (ii) éliminer les polynucléotides non hybridés par l'étape (i); et (iii) détecter la présence sur le support des polynucléotides cibles.
24. 24. Procédé de détection du marquage selon la revendication 23, dans lequel les polynucléotides complémentaires aux polynucléotides cibles sont fixés sur le support solide au moyen d'une liaison biotine/streptavidine.
25. 25. Procédé de détection du marquage selon la revendication 23, dans lequel les polynucléotides complémentaires aux polynucléotides cibles sont fixés sur le support par formation de liaison covalente à une membrane de nylon chargée, ladite membrane formant le support solide.
26. 26. Procédé de détection du marquage selon l'une quelconque des revendications 23 à 25, dans lequel les polynucléotides cibles fixés sur le support sont détectés au moyen de polynucléotides marqué par un agent de marquage et complémentaires à l'autre extrémité des polynucléotides cibles, l'agent de marquage étant choisi dans le groupe comprenant un fluorochrome, une particule d'or colloïdal et une enzyme.
27. 27. Procédé de détection du marquage selon l'une quelconque des revendications 19 à 26 qui comprend en outre une étapede comparaison des résultats de l'étape d'analyse avec le contenu d'une base de données qui permet d'identifier et d'authentifier ledit produit.
28. 28. Procédé de détection du marquage selon la revendication 27, dans lequel la base de données permet de déterminer l'origine dudit produit.
29. 29. Procédé de détection du marquage selon la revendication 27 ou 28, dans lequel la base de données permet d'identifier une contrefaçon d'un produit original.
30. 30. Procédé de détection du marquage selon l'une quelconque des revendications 19 à 29, dans lequel l'extraction telle que définie à l'étape (b) est une extraction au phénol chloroforme.
31. 31. Procédé de détection selon l'une quelconque des revendications 20 à 30, dans lequel l'étape d'analyse comprend une rétrotranscription de l'acide ribonucléique en acide désoxyribonucléique lorsque les polynucléotides cibles sont de l'acide ribonucléique.
32. 32. Procédé de détection selon l'une quelconque des revendications 20 à 30, dans lequel l'étape d'analyse comprend une étape de séquençage des polynucléotides cibles. 20 25