WO2009136014A1 - Procede de marquage d'un produit a l'aide d'une pluralite de polynucleotides, procede d'identification du marquage et produit marque - Google Patents

Procede de marquage d'un produit a l'aide d'une pluralite de polynucleotides, procede d'identification du marquage et produit marque Download PDF

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WO2009136014A1
WO2009136014A1 PCT/FR2009/000422 FR2009000422W WO2009136014A1 WO 2009136014 A1 WO2009136014 A1 WO 2009136014A1 FR 2009000422 W FR2009000422 W FR 2009000422W WO 2009136014 A1 WO2009136014 A1 WO 2009136014A1
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WO
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polynucleotides
product
target
polynucleotide
markers
Prior art date
Application number
PCT/FR2009/000422
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Alexandre Jacob
Carlosse Keumeugni Kwemo
Sylvain Loric
Stéphane MOUTEREAUX
Nicolas Delacotte
Original Assignee
Bioquanta
Bioquanta Corp
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Publication date
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Priority to BRPI0907271-3A priority patent/BRPI0907271A2/pt
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Priority to CN2009801223625A priority patent/CN102124127A/zh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Definitions

  • PROCESS FOR MARKING A PRODUCT USING A PLURALITY OF POLYNUCLEOTIDES METHOD FOR IDENTIFYING THE MARKING AND PRODUCT
  • the present invention relates to a method of marking a product, a method of identifying the marking and a product labeled by the method of the invention.
  • the labeling used in the present invention is based on single-stranded nucleic acids.
  • the present invention makes it possible to distinguish an authentic product from a counterfeit.
  • it makes it possible to mark the authentic product so that it can be traced and identified.
  • counterfeiting or illegal reproduction of objects entails serious financial consequences for companies, but also in terms of jobs, health security or even social life. This is why manufacturers are working to combat this scourge by developing new marking and authentication techniques for their products in order to track and destroy counterfeit products.
  • This type of marking must have particular properties: the marking must be done in a transparent manner vis-à-vis the end user of the product, it must not alter the physical properties. product and should not present a hazard to the end user of the product. It must also be, as far as possible, undetrable and / or tamper-proof to avoid being falsified at the same time as the product.
  • markers There is no reliable technique today, stable over time, in particular for the very many chemical substances known to be aggressive for markers, such as perfumes, cosmetic creams or on materials such as leather, fabric, etc. To date, there are no tagging techniques that actually have great difficulty decrypting for counterfeiters.
  • the present invention is specifically intended to provide a marking solution that meets this need and solving the problems of the prior art.
  • the present invention relates in particular to a method of labeling a product, said method comprising a step of adding to or on said product a plurality of single-stranded polynucleotides, said plurality of polynucleotides comprises:
  • At least one target polynucleotide consisting of a single-stranded polynucleotide of defined length and sequence
  • decoy polynucleotides which are of identical or different determined lengths and of identical or different determined sequences, said decoy polynucleotides being of identical length (s) or different (s) and of different sequences of the sequence of said at least one target polynucleotide wherein each of the target polynucleotides and lures does not hybridize with any of the other polynucleotides of said plurality of polynucleotides.
  • said plurality of polynucleotides further comprises at least one recognition polynucleotide consisting of a single-stranded polynucleotide of defined length and sequence of nature identification and the sequence of the at least one target polynucleotide, wherein each recognition polynucleotide does not hybridize with any of the other polynucleotides of said plurality of polynucleotides.
  • the marking of the present invention therefore consists of said plurality of polynucleotides as defined in the present description. These polynucleotides are single-stranded polynucleotides. In the present description, this polynucleotide is also designated by the term "marker”.
  • the present invention also relates to a labeled product that can be obtained by the method of the invention and to a method for detecting the marking of this product.
  • the present invention relates in particular to the determination of the marker used to implement the process of the invention, the manufacture of these markers, the marking of the products, as well as the techniques for detecting markers in the marked products.
  • the present invention makes it possible to distinguish a counterfeit from an authentic product or to identify diversions of distribution circuits or unauthorized parallel circuits.
  • the polynucleotides of said plurality of polynucleotides may be of several types: they may be single-stranded ribonucleotide or ribonucleic acid (RNA) polymers or deoxyribonucleotides or single-stranded deoxyribonucleic acid (DNA) or a mixture thereof.
  • plural of polynucleotides is meant herein the set formed polynucleotide (s) target (s), lures, and, if appropriate, recognition.
  • s target polynucleotide (s) target (s), lures, and, if appropriate, recognition are used.
  • several target polynucleotides, several decoy polynucleotides and, where appropriate, several recognition polynucleotides are used.
  • 2 to 100 polynucleotides for example from 2 to 50, can be used.
  • target polynucleotide is meant herein a polynucleotide whose sequence has been determined and constructed to constitute a reference sequence for labeling the product according to the present invention, then to be specifically sought in this product to authenticate it.
  • the marker comprises several identical or different target polynucleotides, preferably different.
  • the target polynucleotides are referenced in a confidential target / product database that establishes the link between the target polynucleotide (s) and the labeled product.
  • confidential database is meant a database to which only the manufacturer of the marking according to the present invention for a given product and / or only the manufacturer / creator of said product has (have) access (the one and / or or the other is hereinafter referred to as "the one who puts implement the present invention ").
  • This is a correspondence base in which, for each product or each product family is assigned a particular signature determined according to the present invention. In the case where only target polynucleotides and decoys are used for the signature of the products, this database or correspondence may be called “confidential target / product base” or "target / product base”.
  • the target / product base is first searched for the target sequence (s) assigned to said product, and then it is sought if the or the target sequence (s) is (are) actually present in said product, for example using one of the methods described below. If the target sequence (s) is (are) actually present, the product is declared authentic. On the other hand, if the target sequence (s) is (are) not present, the product is declared to be counterfeit. Of course, this only works if all authentic products are marked according to the present invention.
  • the correspondence database may be constructed by the signature manufacturer of the present invention and / or by the manufacturer / creator from a list of signatures according to the present invention, for example by matching each signature to a particular product. In this case, the authentication is direct.
  • decoy polynucleotide is meant herein a polynucleotide whose sequence has been chosen and constructed to be different from the target sequence (s).
  • the decoy sequences are intended to scramble the marking according to the present invention, but not to be searched in the product to authenticate it.
  • the decoy sequences are there to complicate the work of a counterfeiter to attempt to reproduce the signature of the present invention. Indeed, only one who implements the present invention knows the target sequence (s).
  • sequences (s) target (s) for reproduction are made all the more difficult or impossible that, according to the invention, the Decoy sequences are present, which target (s) and decoys are short, single stranded sequences and do not hybridize with each other.
  • the greater the number of decoys the more difficult the reproduction of the signature as a whole and, statistically, the less chance there is of randomly determining the sequence (s) of the target polynucleotide (s).
  • sequences of these decoy polynucleotides are also known to those who practice the present invention, but these polynucleotides are not in a database to be assigned to a product.
  • recognition polynucleotide is used herein to mean a polynucleotide of a sequence and of a determined length which allows the identification of the target polynucleotide (s). These may have a nature or be present in concentrations facilitating quick search and identification, which can serve as a first test of authentication: their absence is a first sign of counterfeiting. This is one or more polynucleotide (s) whose sequence (s) has (have) been chosen and constructed to constitute a code used in a confidential database of identification of the target polynucleotide (s) or "target identification base” to provide information on the number, nature, sequence and length of the target polynucleotide (s).
  • a set of recognition polynucleotides In this case, in the target identification base, for each recognition polynucleotide or recognition polynucleotide set, is assigned a target polynucleotide or a set of target polynucleotides according to the present invention.
  • the sequences of the recognition polynucleotides are known only to those who implement the present invention.
  • the presence of polynucleotide (s) of recognition in the signature of the The present invention is optional, it corresponds to a particular embodiment of the method of the invention.
  • a confidential target identification base is created by the one who implements the present invention. This base makes it possible to identify the target polynucleotide (s) present in a product to be authenticated from the recognition polynucleotide (s). In this case, the authentication of a product is indirect. Indeed, if it is desired to authenticate a product intended to include a signature according to the invention, the recognition polynucleotide (s) is identified according to one of the methods described below of the present invention, it is then sought in the database.
  • target identification (s) target (s) assigned (s) to said product and then it is sought if the target sequence (s) is (are) actually present (s) in said produced, for example using one of the methods described below. If the target sequence (s) is (are) actually present, the product is declared authentic. On the other hand, if the target sequence (s) is (are) not present, the product is declared to be counterfeit. Note in this embodiment of the present invention that there are two steps of identifying polynucleotides before being able to authenticate a product, which complicates the task of any counterfeiters. Of course, this only works if the authentic products are marked according to the present invention.
  • the sequence of the recognition polynucleotides may contain a sub-sequence bearing the code which enables the user of the invention to find which are the target polynucleotides, and which are the polynucleotides luring from a base of target recognition.
  • these recognition polynucleotides are extracted from the product to be authenticated, or directly identified in or on the product.
  • the identification of the target polynucleotides can be done by reading the sequence of a recognition polynucleotide, or by identifying a set of recognition polynucleotides present among a plurality of putative coding polynucleotides.
  • the user of the present invention will refer in a correspondence table (database of recognition of target polynucleotides), and read therein the nature of the target polynucleotides theoretically present in the product to be authenticated.
  • This table can for example, and without this example being limiting, be stored in a secure database and computerized (to ensure confidentiality), which database was created when marking the product, and in which couples ("read recognition polynucleotide code" - "target polynucleotides to be searched for").
  • the user of the invention can deduce the exact nature of the target markers that should be present in the product to be authenticated.
  • the target polynucleotides are then extracted and identified. If the detected target polynucleotides exactly match the theoretical code read in the table, then the product is authenticated. If other target polynucleotides are present, the user of the invention may suspect a mixture of labeled products.
  • the target polynucleotides detected are totally different from those expected, it may be a counterfeit. If there is no recognition polynucleotide used in a signature according to the invention, only a target / product database is useful.
  • the polynucleotides of the plurality of polynucleotides can be designed for example by methods known to those skilled in the art, for example using a software implementing an algorithm as presented below, such that, for a given polynucleotide, selected from the plurality of polynucleotides constituting the labeling, no other polynucleotide of this plurality, nor any complementary polynucleotide inverted thereof.
  • polynucleotides consists of a nucleotide sequence complementary to this given polynucleotide.
  • no double-stranded complex for example a nucleic acid double helix, such as for example a DNA double helix, nor any hybridization between the polynucleotides of the signature of the present invention can be formed even at the temperature and in the molecular environment of product conditioning, and at the temperature and molecular environment of polynucleotide discovery.
  • formation of a double-stranded complex is meant a pairing of complementary, energetically stable nucleotides, including under the conditions mentioned above.
  • inverse complementary polynucleotide of a given polynucleotide is meant a new polynucleotide, existing or theoretical, where each nucleotide of the given polynucleotide is replaced by a complementary nucleotide that can be paired with the first, such as, for example, adenine replacing a thymine. , or a thymine replacing an adenine, or a cytosine replacing a guanine, or a guanine replacing a cytosine in the case of a deoxyribonucleic acid polynucleotide.
  • hybridization is meant the association by non-covalent bonds of two complementary single-stranded polynucleotides. This hybridization can be perfect, ie the sequences are totally complementary, or imperfect, that is to say that the sequences are not totally complementary but sufficiently complementary to hybridize with each other and form a double structure. -strand.
  • non-hybridization means the non-association by non-covalent bonds of two single-stranded polynucleotides because they are not complementary and / or because the complementarity is insufficient for the formation of a double strand.
  • the plurality of polynucleotides of the tag of the present invention to be incorporated in a product or a substance of interest are not all assigned in a database to directly or indirectly authenticate a product. It is thus possible to use only a small number of target polynucleotides, these target polynucleotides being those which are sought during an authentication of the product, and to incorporate them into the product at the same time as a large number of decoys.
  • the target polynucleotide (s) can be "embedded" in a mass of decoy polynucleotides that are extraordinarily scrambling the tracks in case of attempted malicious decoding of the target polynucleotides in order to reproduce the signature.
  • recognition polynucleotides in which recognition polynucleotides are used, only reading and decryption of the code carried by the recognition polynucleotides can incriminate, among a mixture of target polynucleotides and polynucleotides lures. , which actually correspond to the target sequences, and by elimination which are only decoys intended to deceive the counterfeiter.
  • the labeling method of the present invention can be carried out using markers which are deoxy and / or ribonucleic acids.
  • the said polynucleotides of the plurality of polynucleotides may thus be single-stranded deoxyribonucleic acid or single-stranded ribonucleic acid sequences or a mixture of deoxyribonucleic acid and ribonucleic acid sequences.
  • a marker according to the present invention can therefore be composed of common bases, called “natural bases”, for example those present in DNA: adenine, guanine, thymine, cytosine, or in RNA: adenine, guanine, uracil, cytosine (see, for example, Molecular Cloning, Maniatis, Spring-Harbor CoId, 2nd Edition, pp C3-C14 [1]).
  • a marker according to the The present invention may also include less frequent natural or synthetic compounds, referred to as "modified bases”, such as, for example, dihydrouridine (DHU), inosine, or pseudouracil resulting from modifications, for example deamination, carried out on the previously presented bases.
  • DHU dihydrouridine
  • inosine inosine
  • pseudouracil resulting from modifications, for example deamination
  • the nitrogenous bases can be made from natural isotopes and / or from stable isotopes of different atomic mass and / or be modified to establish a number of hydrogen bonds different from normal during the hybridization processes.
  • the deoxyribonucleic acid sequences may comprise, in their sequence, the same proportion of the four bases A, C, G and T, natural or modified.
  • the ribonucleic acid sequences may contain, in their sequence, the same proportion of the four bases A, C, G and U, natural or modified.
  • the set of polynucleotides comprising the marking have the same number of nucleotides, and the same molecular weight.
  • This particular embodiment of the invention advantageously makes it even more difficult or impossible to separate and identify the polymers by a possible counterfeiter. For example, separation and identification as a function of size and / or molecular weight by techniques such as electrophoresis, for example on agarose or polyacrylamide gel and / or mass spectrometry is impossible to realize on a signature according to these last embodiments, in particular the last.
  • a single-stranded (or oligomeric) polynucleotide of 20 nucleotides, each of the nucleotides being selected from 4 possible bases makes it possible to make 420 different sequences, ie about 1, 1 ⁇ 10 12 combinations, that is, to say a thousand billion combinations.
  • the probability of extracting a target marker, according to the invention, at random for example a plurality of polynucleotides of size 20 in a marking according to the present invention, and that this marker is the one that has been assigned to the product in a base of target / product data is therefore almost zero.
  • the labeling of the present invention is composed of several target molecules of determined sequences and length, of several decoys, and, if appropriate, of several recognition polynucleotides, which ensures both a very high safety and an inviolability. outstanding marking.
  • the polynucleotides used may therefore comprise, for example, an oriented combination of 4 nitrogenous bases, the nature of which is to be defined by the one who implements the present invention.
  • This combination which is at the origin of the specificity of each polynucleotide of the marker of the present invention, and which can bear the information relating to the labeled product, can be calculated in a computerized manner, according to the needs (complexity of the code, type information that the markers bear) and the physico-chemical properties of these markers (hybridization properties, molecular weight, fragment size, composition of nitrogenous bases).
  • one or more target polynucleotide (s) may be used.
  • the invention therefore allows a considerable number of signature or marking variants.
  • the target polynucleotides of the first set there may be mentioned the following different forms: one or more target single-stranded polynucleotide (s) of large size (s), that is to say comprising for example 500 to 5000 nucleotides or bases; one or more target single-stranded polynucleotide (s) of small size (s), ie for example comprising from 5 to 200 nucleotides or bases, for example from 15 to 200, for example from 20 to 200, for example from 5 to 50; one or more target single-stranded polynucleotide (s) of average size (s), ie comprising, for example, from 201 to 499 nucleotides or bases; one or more target single-stranded polynucleot
  • At least two target polynucleotides can be used, one being a circular polynucleotide and the other a linear polynucleotide.
  • a plurality of circular or linear target polynucleotides or a mixture thereof may be used, depending on the chosen complexity of the labeling by the one implementing the present invention.
  • the single-stranded polynucleotides when some or all of the single-stranded polynucleotides are linear, they may comprise a variable end of one polynucleotide to another and a constant end of one polynucleotide to another .
  • constant end is meant a part of the polynucleotide sequence including one of the two ends of said sequence and having a determined and constant sequence, that is to say identical for part of the target sequences or for all the target sequences of the the present invention.
  • variable end is meant a part of the polynucleotide sequence including the other two ends of said sequence and having a variable sequence variable from one target sequence to another in the marker of the present invention.
  • a solid support for decryption can be used, on which support polynucleotides complementary to the variable ends of the target polynucleotides are fixed, as for a DNA chip.
  • the constant ends can be used to highlight the hybridization of target polynucleotides on the solid support, for example by means of biotin / streptavidin. This detection mode is described below.
  • the number and nature of the target polynucleotides, combined with their size, makes it possible to define the complexity of the marking, and in a combinatorial manner, the number of possible combinations.
  • the number of possible combinations increases exponentially with the size of these polynucleotides.
  • the labeling information may consist of: target polynucleotide sequences, each assigned in a target / product-to-product database, and / or one or more combination (s) of target polynucleotide sequences, said (said) combination (s) being assigned in a target / product database to a product.
  • target polynucleotides of determined sequences it is possible to use several target polynucleotides of determined sequences.
  • decoy polynucleotide sequences to form the label according to the present invention.
  • the decoy polynucleotides do not hybridize with the target polynucleotides and their role is to make it even more difficult for a counterfeiter to decrypt the marking of the present invention in order to copy it.
  • These decoy polynucleotides may be in linear or circular form or a mixture of circular polynucleotides and circular polynucleotides as indicated above for the target polynucleotides.
  • the number of lure polynucleotides added to the marker depends on the desired interference. Preferably this number is greater than the number of target polynucleotides. Examples are given above.
  • the decoy polynucleotides are of the same or different length (s) from one another, preferably of identical length to the one, to the one or to the target sequence (s) present in the the present invention, for example, as indicated above for the target polynucleotides, from 15 to 5000 bases, for example from 15 to 200, for example from 20 to 200, for example from 201 to 499, for example from 500 to 5000. bases, or a mixture of these lengths.
  • recognition polynucleotides allowing, by means of a database, to discriminate the target polynucleotides of the decoy polynucleotides as indicated above.
  • the number of recognition polynucleotides depends in particular on the complexity of the desired marking.
  • the recognition polynucleotides may be circular or linear. They may be of the same or different length (s) and of identical or different length (s) from those of the target polynucleotides and decoys, for example, as indicated above.
  • target polynucleotides of 5 to 5000 bases for example from 15 to 200, for example from 20 to 200, for example from 201 to 499, for example from 500 to 5000 bases, or a mixture of these lengths.
  • said polynucleotides of the plurality of polynucleotides may be circular, linear, or a mixture of circular and linear polynucleotides, for example with a free 3'OH end and a free 5 'phosphate end.
  • the length of the polynucleotides of the labeling of the present invention is from 5 to 5000 nucleotides, for example from 5 to 100 nucleotides, for example from 5 to 50 nucleotides, for example from 20 to 50 nucleotides.
  • said polynucleotides of the plurality of polynucleotides are single-stranded polynucleotides.
  • one of the peculiarities of the present invention is that the use of single strands makes it more difficult to decrypt the marking of the present invention.
  • the marking method of the present invention thus makes it possible to manufacture a very large number of markers.
  • Each marker comprises a code consisting of the target polynucleotide (s) and, if appropriate, recognition polynucleotides.
  • sequences of the polynucleotides of the marker of the present invention can be created empirically or, preferably, especially for a matter of speed, by appropriate software that can be generated for this purpose. In the latter case, it is a computer design or "Design In Silico" marker of the present invention.
  • step (1) If the set of scores does not exceed a threshold given by the user, add p in E. Return to step (1) as long as E is not of a desired size.
  • This threshold is a minimum alignment score above which two sequences are considered sufficiently identical to hybridize with each other.
  • these target polynucleotides and decoys can be manufactured by any existing method known to those skilled in the art.
  • One or more protocols may be used depending on the nature of the polynucleotides manufactured and according to the chosen marking: synthesis of ribonucleic and / or deoxyribonucleic acids, single-stranded, circular and / or linear, of a size may vary for example from 5 bases to 5000 bases. Examples of protocols that can be used to implement the present invention are those making it possible to synthesize single-strand circular polynucleotides [3] or the protocols for in silico synthesis of polynucleotides [4].
  • sequences of the recognition polynucleotides are desired for labeling, their respective sequences can be determined empirically, or using an algorithm as described above, so that the recognition polynucleotides do not hybridize with each other or with each other. with the target polynucleotides, or with the decoy polynucleotides.
  • the labeling of a solution or a compound using markers of ribonucleic acid or deoxyribonucleic acid according to the process of the invention can be done in different ways depending on the desired labeling complexity.
  • Each target polynucleotide carries specific information, inherent to its sequence.
  • Each target polynucleotide or target polynucleotide combination can be used uniquely.
  • the first possible level of coding may be that of using one or more target polynucleotides.
  • Several batches of labeled products can then be traced by one or more polynucleotide (s) of defined size (s), and of sequence (s) determined (s) but different from each other.
  • the second possible level of coding is the use of several target polynucleotides, chosen from an initial pool of target polynucleotides. The code then no longer comes from each target polynucleotide sequence but from the combination of the target polynucleotides found in a product.
  • a labeled product can be labeled with n target polynucleotides selected from a possibility of N different polynucleotides, n being in the range [0; NOT].
  • the tag of the present invention may be supplemented by a third level of coding, consisting of using recognition polynucleotides, then indicating, by means of a target recognition base, which markers among the polynucleotides.
  • the targets which may be used by the manufacturer and which may be different in nature and concentration, are present if the product is authentic and marked with the process of the present invention.
  • each step of the product marking process can be subject to specific traceability. This traceability can be ensured by introducing specific data at each stage into one or more confidential databases.
  • each batch of markers or combination of markers may for example be identified by an alphanumeric identifier.
  • This identifier may appear on the product or by any other mode of optical representation: for example barcode, datamatrix, etc., for example on the container of the batch of markers.
  • This identifier can also serve as an index in a first database where the information on the batch of markers is stored, for example: sequence of each of the markers composing the batch, respective proportions of the quantities of each marker, date of manufacture, etc. .
  • Each marker batch container followed by means of its identifier, can be attached in a database for example to the reference of a customer's order and to the delivery references of this container to said customer. A confirmation of receipt from the customer can also be entered into this database.
  • nucleic acids do not alter the physicochemical properties of marked products. In addition, the nucleic acids have no effect on their container, i.e., the labeled product. Finally, the nucleic acids have proved very stable in the numerous tests carried out by the inventors. This property of stability is demonstrated in the examples presented below.
  • the single-stranded DNA and RNA markers included in the present invention can be included in a very wide range of products and substances that are likely to be victims of illegal reproduction (counterfeiting), abusive, trafficked on a parallel market and / or where it is necessary to follow the track (tracing of products).
  • the process of the invention is applicable to the marking of any industrial or consumer product, liquid, semi-liquid or solid.
  • the invention can be applied to a whole range of products in the luxury and cosmetics industry: perfumes, perfume waters, toilet waters, essential oils, creams, masks, ointments, etc.
  • the invention can also be used to trace various substances such as inks, resins, varnishes, paints, dyes, additives, flavors, glues, powders.
  • the present invention finds application to luxury products that may be targets of counterfeiting or cheating (mixtures), such as liqueurs, spirits, wines, or any product that is important to ensure authenticity for security reasons for example.
  • Markers can also be used in the pharmaceutical industry to mark and trace drugs and other drugs.
  • the invention can also be used in tracing biological samples in a hospital context. This may involve, for example, implementing a traceability protocol for blood samples in a biochemistry laboratory, tumor samples in an anatomopathology laboratory, or in order to constitute a a bank of directly authenticated human material that can be stored and traced for many years in a biological resource center.
  • the products can be marked either as such or as a component of a product.
  • a paper document can be marked through the ink used which has been previously marked.
  • the step of adding the marker of the present invention may be carried out by any suitable means for adding to the product to be labeled the polynucleotides constituting the marker of the present invention.
  • the products or substances to be marked can be marked in the mass, by incorporating the markers whose final concentration is studied and planned or on the surface of the product.
  • the markers are polymers of ribo or deoxyribonucleic acids having the physicochemical properties deriving from their nature: they are hydrophilic and negatively charged molecules.
  • they may be pre-diluted or added directly into the product. They can also be encapsulated. They can still be deposited or incorporated on the surface of the product.
  • This addition of the marker of the present invention to the product can be carried out by adding said plurality of polynucleotides in said product during its manufacture and / or in or on (ie on the surface) the finished product.
  • the present invention thus also relates to a labeled product that can be obtained by the marking method according to the invention.
  • the addition of the marker when the addition of the marker is carried out on the surface of the product to be marked, it may be carried out for example by soaking the finished product in a solution comprising the said marker or by spraying or spraying such a solution on the final product.
  • the solution is a protic solvent such as ethanol, methanol or diethylene glycol, or a polar aprotic solvent such as acetone or tetrahydrofuran.
  • This mode of addition is suitable for example for solid products after manufacture such as fabrics, leather, wood, paper, cardboard, tobacco, cigarettes, cigars, etc.
  • the addition can also be carried out during the manufacture of the product, by mixing said marker with the compounds or components constituting the product.
  • This introduction of the plurality of polynucleotides can be carried out on or in a component of said product.
  • This type of addition is suitable for any product or substance whose manufacture passes through a liquid or semi-liquid phase in which the markers may be incorporated. This may be the case for example for the marking in the mass of a cosmetic product or a drug.
  • a step of encapsulation of said plurality of polynucleotides in lipid vectors can be carried out prior to the addition step.
  • This encapsulation step makes it possible to maintain the polynucleotides in a favorable medium, or to facilitate their future extraction.
  • a product chosen from the group comprising a vector of cationic lipid nature such as dioleoxyloxypropyltrimethylammonium bromide (DOTMA) and dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), or polynucleotide complexes may be used as an encapsulation product. with molecules like polylysine, protamine, or polyethyleneimine (PEI) called polyplexes.
  • Bioch the technique described in Bioch can be used for this purpose.
  • a step of encapsulating and / or protecting said plurality of polynucleotides in lipid vectors or the like may be carried out prior to the addition step.
  • This step also makes it possible to ensure stability and / or facilitate its recovery.
  • the term "protection" herein refers to the protection of the polynucleotides of the present invention, in particular any physicochemical attack originating from the medium in which the signature of the present invention (perfume, food) is found, for example in charged polymers or carbon nanotubes.
  • the marker of the present invention is preferably added to the product for its labeling at very small concentrations ranging from micro-molar to femto-molar.
  • the respective concentrations of each target polynucleotide of the first set may be different and compose a coding subset.
  • the concentration of the plurality of polynucleotides after its addition in said product can be, but is not limited to, 10 -6 moles to 10 -18 moles / dm- 3 .
  • this corresponds to the amount of markers mixed with the product per unit volume.
  • this corresponds to the amount of markers mixed in the product per unit volume or deposited on the surface of the product. reduced to the product surface, this amount can also be defined per unit area, or 10 "6 moles to 10" 18 moles / dm 2.
  • concentrations can be obtained by dilution of a more concentrated solution. the solution may be as defined above.
  • the present invention also relates to a method for detecting the labeling of a product that can be obtained by the labeling method of the invention, said method comprising a step of analyzing the plurality of polynucleotides making it possible to specifically detect the at least one target polynucleotide.
  • the invention further provides several methods for detecting markers of the present invention. The detection can be carried out laboratory or laboratory, for example by means of a portable system, for example by means of a DNA chip specially designed for the detection of target polynucleotides of the marker of the present invention.
  • the analysis step can be carried out for example by immunodetection.
  • the analysis step may comprise, for example, a step of sequencing the coding polynucleotides.
  • the analysis step may comprise, for example, a retro-transcription of the ribonucleic acid into deoxyribonucleic acid, in particular when the target polynucleotides are ribonucleic acid.
  • the analysis step can comprise a colorimetric or luminescent detection, or fluorimetric, coupled to a specific hybridization. In other words, the analysis step may use a specific means for detecting the target polynucleotides.
  • the analysis technique used can implement the physico-chemical properties, the code and the specificity of the marker.
  • This may be, for example, a sandwich assay technique, a detection technique using microarrays, or any other technique known to those skilled in the art to reveal the presence of polynucleotides and / or identify them.
  • target polynucleotides and decoys can be polynucleotides of small size, that is to say 8 to 30 nucleotides / nucleosides and single strands.
  • these polynucleotides by their nature can not be used as a template strand to be amplified and detected by exponential amplification techniques such as chain polymerization reactions (" PCR ", Polymerase Chain Reaction). Thus, their detection by PCR amplification is impossible.
  • the detection of the polynucleotides can be carried out by hybridization methods and direct revelation without amplification is achievable only by the user who knows the signature used.
  • the counterfeiter who would try to extract, amplify and reproduce the plurality of polynucleotides present in the labeled product will be held in check.
  • the revelation methods comprising only hybridization and revelation stages of this hybridization can be implemented much more rapidly (a chain polymerization reaction takes several hours, whereas simple hybridization polynucleotides is almost instantaneously) insofar as the detection is specific to the polynucleotides to be revealed.
  • the analysis technique used can be based on the physicochemical properties, the code and the specificity of the marker. It can include amplification of the target polynucleotides, exponentially or linearly, any other technique can be used to reveal the presence of the markers.
  • the analysis step may comprise a step of linear extension of the target polynucleotides.
  • the method of the invention may further comprise the following steps, prior to the analysis step: (a) taking a sample of the product; and
  • the extraction step (b) can be carried out by any technique known to those skilled in the art to extract the polynucleotides from a sample.
  • the polynucleotides can be extracted according to a protocol depending on the nature of the labeled product. Any type of ribonucleic or deoxyribonucleic acid extraction technique existing or future, can be used to extract the polynucleotides from the mass of the labeled product. It may be for example a phenol chloroform extraction. Extraction techniques that can be used in the present invention are for example described in Molecular Cloning.Maniatis, CoId Spring-Harbor, 2nd edition, pp E3 to E4 [8].
  • the methods of analysis of the labeled products can therefore consist in extracting the polynucleotides of these products, in detecting the code carried by the recognition polynucleotides, in referring to the database of recognition of the target polynucleotides, in thus decrypting the code carried.
  • the recognition polynucleotides then exploiting this information in order to find the target polynucleotides among the plurality of target polynucleotides, including the decoy polynucleotides, and then to detect the presence of the target polynucleotides, which is characteristic of the labeled product (in case of detection of the marking) or to conclude that a counterfeit product (in the absence of the target polynucleotides, or of non-conforming marking to the target / product database).
  • the specific detection of the analysis step can comprise for example the following successive steps:
  • step (ii) removing non-hybridized polynucleotides by step (i); and (iii) detecting the presence on the support of the target polynucleotides.
  • the detection carried out in step (iii) may be carried out by a suitable specific means, for example it may be for example it may be a detection using a fluorescent molecule, or a detection using a luminescent molecule, or detection using an enzyme whose reaction product may be colored, or detection using an enzyme whose catalyzed reaction is exothermic, or detection using an enzyme whose catalyzed reaction releases light, or detection using a specific protein target polynucleotides, such as an antibody, an enzyme.
  • the specific detection may furthermore comprise, between steps (i) and (ii), a step of capturing the plurality of polynucleotides on a support, by at least one specific capture system of the polynucleotide (s).
  • the method of this particular embodiment may further comprise, before step (i), a step (x) for identifying these recognition polynucleotides and a step (y) of choice of a solid support, according to the identified recognition polynucleotides, solid support chosen because it comprises the complementary probe sequences of the target sequences identified by the recognition polynucleotides.
  • This detection method may advantageously be used with a marker according to the invention which comprises target polynucleotides having a constant end and a variable end. These target polynucleotides are defined above.
  • the polynucleotides complementary to the target polynucleotides can be fixed on the solid support by any means known to those skilled in the art.
  • These techniques of detection on support and the types of supports that can be used in the present invention are, for example, those described in Molecular Cloning, Maniatis, CoId Spring Harbor, 2nd Edition, pp. 9.47 to 9.57 [9].
  • the fixing of the probe sequences on the support can be carried out by means of a biotin / streptavidin binding, the probe being coupled to a biotin molecule and the support having streptavidin molecules.
  • the attachment of the probe sequences can also be accomplished by covalent bonding to a charged nylon membrane, said membrane forming the solid support.
  • a charged nylon membrane said membrane forming the solid support.
  • It may be, for example, a detection by means of polynucleotides labeled with a labeling agent and complementary at the other end of the target polynucleotides, the labeling agent being able to be chosen from the group comprising a fluorochrome, a d colloidal gold and an enzyme.
  • the detection method of the invention may furthermore comprise a step of comparing the results of the step of analysis of the target polynucleotides with the content of a database which makes it possible to identify the target polynucleotides, and of analysis target polynucleotides which makes it possible to identify and authenticate said product, and which can also make it possible to determine the origin of said product.
  • the database and the decryption of the code carried by the Coding polynucleotides can identify a counterfeit of an original product.
  • the user manufacturer of a marker according to the present invention can associate with the identifier of the marker batch container references relating for example to a production lot labeled with the help from this lot of markers. This association can be done for example in a database identical or separate from previous databases.
  • the information inserted in this database and relating to the production batch is preferably sufficient, depending on the information system implemented at this user, to allow to trace this lot unequivocally.
  • the revelation of the identified polynucleotide sequences can be compared with the data entered into the databases during the production and delivery of markers. Counterfeiting is for example characterized if no marker is identified. Counterfeiting can also be demonstrated if at least one marker in the marker set that has been partly revealed and whose precise composition has been obtained by querying the database is missing. Counterfeiting can still be characterized if all the markers are present the batch of markers, but that the goods tested do not come from the manufacturer who took delivery of the batch of markers which has just been revealed.
  • the products are authentic and the batches of markers revealed actually correspond to batches of markers delivered to the manufacturer of the tested product.
  • the method of the invention makes it possible to obtain, by query in the manufacturing database, markers of the identifier of the batch of markers.
  • this identifier advantageously allows the manufacturer to compare the theoretical allocation of the marked production batch to one of his customers with the actual allocation found during the taking of a product sample suspected of parallelism. If the theoretical assignment of the products does not correspond to the actual allocation, there may be diversion of the distribution channel.
  • FIG. 2 represents an addressing of the probes on the chip.
  • FIG. 3 represents emission and absorption spectra of Cy5.
  • FIG. 4 appended represents a method for detecting the markers according to the present invention on a support:
  • the markers M1 and M2 are present in a mixture. They make "bridge” between the probe attached to the chip, and the Universal probes: the signal (Cy5 fluorescence) is then detected.
  • the signal Cy5 fluorescence
  • FIG. 5 reveals a revelation of the markers with the NanoChip station (registered trademark) (Nanogen Inc.).
  • FIG. 8 represents a detection scheme of a marking according to the invention and authentication of a labeled product according to the invention.
  • the target polynucleotides and decoys used are single-stranded sequences of deoxyribonucleic acid with a size of 28 nucleotides.
  • the encoding polynucleotide is a circularized DNA sequence, 4.3 kilobase (kb) in size.
  • the marked product is a perfumed solution: J'Adore perfume (registered trademark, perfumes Christian Dior).
  • Three markings are made, illustrating three possible scenarios during the authentication process: an example where the product is authenticated, as well as two examples where the product is not authenticated.
  • Ten single-stranded deoxyribonucleic acid polynucleotides are generated as follows: The ten 5 'nucleotides are all identical, defined by the user. This is the sequence GCAACTCCAG. The eighteen nucleotides at 3 'are then generated using the algorithm presented in the "Presentation of the invention" section, using the following parameters: a length of words equal to 18 nucleotides, five nucleotides G, five nucleotides C, four nucleotides A and four nucleotides T.
  • Each new polynucleotide is then generated in a random manner, so that it contains this determined number of each of the bases.
  • An alignment score between this new polynucleotide and the set of polynucleotides already validated, as well as the polynucleotides resulting from the concatenation of each of the two by two polynucleotides of this set, this step not having any place if it is is the first polynucleotide. is calculated according to the Smith and Waterman algorithm, with the following parameters:
  • the minimum score selected is 3, which means that if the new polynucleotide aligns with a polynucleotide of the set, or a concatenation of two polynucleotides of the set with a score greater than 3, it is discarded. Otherwise, it is validated and then added to all the polynucleotides. This step is repeated until ten polynucleotides are obtained.
  • Primer- 1 5 1 -GCAACTCCAGGCACTCCATGAGTCATGG-3 I (SEQ ID NO :: 1)
  • Primer-2 5'-GCAACTCCAGGTGGCGACTCATACGTCA-3 1 (SEQ ID NO: 2)
  • Primer-3 5 I -GCAACTCCAGCTCAGGGGGACTCTATCA-3 1
  • Primer-4 5 I -GCAACTCCAGGCTCTAGGGCAAGTCTCA-3 I
  • Primer-5 5'-GCAACTCCAGGCAGACTCTGGATCTCAG-3 1
  • Primer-6 5 1 -GCAACTCCAGGCAGCATGAGGTCTCATC-3 I
  • Primer-7 5 I -GCAACTCCAGGCAGCAGGAGTCTCATTC-3 1
  • Primer-8 5 1 -GCAACTCCAGGGTGGCTCAGCAATACTC-3 1
  • Primer-9 5 I -GCAACTCCAGCTCAGGGCAGTGATCTCA-3 I
  • the first five polynucleotides (Primer-1 to Primer-5) are considered as target polynucleotides.
  • the last five (Primer-6 to Primer-5) are considered as target polynucleotides.
  • Primer-10 are considered lure polynucleotides. These markers are then injected at a final concentration of 10-12 moles per dm 3 into the perfume, along with the coding marker.
  • the ten polynucleotides are mixed in three pre-labeling solutions, diluted in deionized water, without nuclease, to a final concentration of 10 -9 moles of markers per liter, per label (ie 5.10 9 mol / l of total markers). .
  • each label is pre-diluted twice to 1/100 in water without nuclease (1 .mu.l using a P10 pipette, in 99 .mu.l using a P100 pipette) or an intermediate dilution at 1/10000.
  • each intermediate solution is added to a 1.5 ml tube (Eppendorf, registered trademark), and the mixture is then added to 100 ⁇ L by addition of 50 ⁇ L of water (using a pipette P100).
  • Table 1.2 shows the three pre-labeling solutions (A, B, C) each containing a combination of five target polynucleotides selected from ten possible, target or decoys.
  • the encoding polynucleotide is a circular single-stranded nucleic acid sequence of 4.3 kilobases (kb) in length. It is, for the example, synthesized from a plasmid pBR322. This polynucleotide contains within it a specific sequence following nucleotides (A, T, G, C), known to the user of the invention. It constitutes a unique code, which subsequently allows the user to know which combination of target markers is in theory present in the marked product.
  • the coding sequence is a portion of 20 nucleotides located exactly 50 bases upstream (5 'side) of a known and universal sequence which remains constant regardless of the coding sequence, and whose sequence is: 5' -CTGTAAGCGGATGCC-3 '(SEQ ID NO: 11).
  • the user has an associative table that allows him to link the coding polynucleotide coding sequence, and the target polynucleotide combination expected in the labeled product.
  • the plasmid is first digested with the restriction enzyme Nb.BpuiOI, which cuts a single strand of the DNA molecule, recognizing the restriction site shown in Figure 1: NbBpuiOI cleavage site.
  • the polynucleotide is then digested a second time with exonuclease III, releasing the nucleotides from the free 3 'hydroxyl end of the cut strand by Nb.BpuiOI.
  • the strand which has not been digested with Nb.BpuiOI is then spared, because circular.
  • Plasmid pBR322 Invitrogen (registered trademark)
  • Buffer R 10 X (buffer Nb.BpuiOI) reference # BR5, (Fermentas) - Exonuclease III (1200 U) reference # EN0191, (Fermentas)
  • the markers taken up in 20 ⁇ L are assayed using a Nanodrop spectrophotometer (registered trademark).
  • the concentration is then reduced to 10-9 mol / L by adding a suitable volume of demineralized water without nuclease using a P10.
  • the polynucleotides are injected into the mass of the products, at a final concentration of 10 -12 M for the target polynucleotides and decoys, and 10 -12 M for the coding polynucleotides.
  • the first solution is labeled with the pre-labeling solution A, containing the target polynucleotides 1 and 2 as well as the decoy polynucleotides 8, 9, 10 and the encoding polynucleotide.
  • This solution corresponds to normal labeling, where the encoding polynucleotide is present, and where the combination of the target polynucleotides present actually correspond to the information carried by the encoding polynucleotide.
  • the second solution is labeled with the pre-labeling solution B, containing the target polynucleotides 3, 4 and 5, as well as the decoy polynucleotides 6 and 7 and the encoding polynucleotide.
  • This solution is an example of incoherent labeling: although the coding polynucleotide is present, the combination of target polynucleotides does not correspond to the information it contains.
  • the third solution is labeled with the pre-labeling solution C, containing the target polynucleotides 1, 2, 3, 4 and 5, no decoy polynucleotide, and no coding polynucleotide.
  • This solution is also an example of incoherent labeling: on the one hand it does not comprise coding polynucleotides, and on the other hand, although it has the target polynucleotides 1 and 2 of the normal labeling, it contains other unexpected polynucleotides.
  • the solutions are stored at room temperature or at 4 ° C.
  • the markers are extracted from their alcoholic medium (perfume) and then recovered in an aqueous medium in order to then be able to use molecular identification techniques.
  • the extraction should preferably not only have a good yield (recover a maximum of markers, ideally: 100% yield), but it should also preferably rid the markers of any "polluting" substances that can interfere with the detection techniques .
  • the technique used is that of phenol chloroform extraction.
  • the markers are extracted from 500 ⁇ L of labeled perfume.
  • Vi volume of water is 250 ⁇ l using a P1000 (Gilson Pipetman, registered trademark) and then vortex for 10 seconds. Centrifuge for 5 minutes at 10,000 rcf (in Centrifuge 5415 R centrifuge, Eppendorf, registered trademark).
  • the information carried by the polynucleotides coding, relative to the target polynucleotides, is read in the nucleotide sequence of these first (by a sequencing technique). It then allows the user of the invention to know the exact nature of the target polynucleotides carrying the product authentication information by referring to the associative table presented in 1.b.1.
  • Matrix extracted polynucleotide solution.
  • sequence reaction is carried out from the solution of markers extracted in a 200 ⁇ L tube (Eppendorf, registered trademark), according to the protocol set forth in Table 1.5.
  • the reactions are then sequenced on an ABI3100 capillary sequencer 16 (Applied Biosystem). Analysis of the results then enables the user of the invention to read the nucleotide sequences of interest, and to correlate the read sequences with the target polynucleotides theoretically present in the labeled product.
  • a support (or DNA chip) is used to detect the presence of target polynucleotides.
  • This support has a battery of several probes, fixed in a covalent manner, and complementary complementary inverse 3 'variable regions of the markers.
  • the appended FIG. 2 represents the addressing of the probes on the chip. When the extracted solution, containing the putative markers, is brought into contact with this support, the present markers hybridize with their inverse complementary on the chip. After washing, the support is then brought into contact with a solution containing probes (polynucleotides) coupled to a fluorophore (Cy5), thus the sequence is the exact complementary inverse of the 5 'universal region of the markers.
  • the appended FIG. 3 represents the emission (667 nm) and excitation (650 nm) spectra of the Cy5.
  • FIG. 4 represents the principle of detection of the markers.
  • Anti-1 probe SEQ ID NO: 14
  • Anti-3 probe SEQ ID NO: 16
  • Anti-4 probe SEQ ID NO: 17
  • Anti-5 probe (SEQ ID NO: 18) 5 '(B) -TGGATCCCGCACACGACTGACTGAGATCCAGAGTCTGC 3'
  • Anti-6 probe SEQ ID NO: 19
  • Anti-8 probe SEQ ID NO: 21
  • AntMO probe SEQ ID NO: 23
  • NanoChip (registered trademark) Electronic Microarray, 100-Site NanoChip (Trademark) Cartridge)
  • Nanochip processing station registered trademark
  • Molecular biology Workstation Nanochip (registered trademark) Reader, Nanochip (registered trademark) Loader
  • High salinity buffer 500 mM sodium phosphate, 500 mM sodium chloride, Nanogen TM
  • Low salinity buffer 50 mM sodium phosphate, Nanogen®
  • the probes complementary to the specific regions of the markers are purified on the Multiscreen filtration system (from Millipore (registered trademark)) and then taken up in 60 ⁇ l of 50 mM L-histidine buffer. They are then transferred to the cartridge. Each of them is then addressed to a specific site of the cartridge for a period of 120 seconds (protocol managed by the workstation). The 5 'biotin binds to the streptavidin of the support.
  • the user After reading the information carried by the encoding polynucleotide present in the first and the second product, the user refers to the associative table indicating that the code of the encoding polynucleotide corresponds to the presence of the target polynucleotides 1 and 2 (no matter the lure polynucleotides present). These polynucleotides are well detected in the first labeled solution, and only these two polynucleotides: the first solution can be authenticated. As for the second solution, the unexpected presence of the target polynucleotides 3, 4 and 5 does not make it possible to authenticate the product.
  • This example illustrates a labeling using several single-stranded deoxyribonucleic acid polynucleotides, injected into a skin cream, and detected according to the technique presented in Example 1.
  • the markers are first prepared nuclease-free distilled water and then incorporated the cream, to a final concentration of 10-12 moles per tablet of dm 3 cream for target markers and decoys, and at a concentration of 10 " 14 moles per dm 3 of cream for the coding markers.
  • a preliminary mixture of target, coding and decoy polynucleotides is injected using a P10 pipette (Gilson Pipetman, registered trademark) into 1 cm 3 samples of Thermal Fix (registered trademark) creams, leading to a final concentration of 10-12 moles of marker per dm 3 for target markers and decoys, and a final concentration of 10-14 moles per dm3 for the encoding polynucleotides, the samples are then stored for identification.
  • P10 pipette Gilson Pipetman, registered trademark
  • Thermal Fix registered trademark
  • the markers are detected in the same way as in Example 1, except for the extraction step of the polynucleotides.
  • the markers are extracted from the cream by breaking the emulsion and recovering the aqueous phase.
  • a high temperature above 80 ° C. is sufficient to reduce the emulsion constituting the cream and thus separate the aqueous and lipid phases.
  • the markers, very polar, are found in the aqueous phase from which they are extracted.
  • the labeled cream is heated for 15 minutes at a temperature of 95 ° C. and then centrifuged for 5 minutes at 10,000 rcf.
  • the aqueous phase is recovered, and is used for the detection of markers.
  • the polynucleotides can then be detected according to the method described in Example 1.
  • This example illustrates a technique for labeling a spirit with a mixture of target, coding and decoy polynucleotides.
  • the first type of marker (target polynucleotides) consists of a pool of 20 single-stranded deoxyribonucleic acids of a size of 20 bases.
  • the second marker is a single-stranded circular nucleic acid, 1000 bases in size, whose sequence contains the target marker search instructions.
  • this sequence makes it possible to know which target markers, among the 20, are significant for the coding of the spirits, the other markers being lures added in a semi-random manner.
  • markers of single-stranded deoxyribonucleic acid are generated by means of the algorithm presented in the description of the invention. These markers differ from each other, do not self-hybridize, and do not are not likely to hybridize each other. They constitute the target polynucleotides.
  • the polynucleotide encoding is a 1000 base deoxyribonucleic acid, circular.
  • the sequence of this nucleic acid contains, at a given location, a cassette containing the combination of target polynucleotides to be searched in the product.
  • FIG. 6 shows the principle of coupled labeling: the coding marker, in circular form, contains a general information site, as well as a site allowing to know which of the target markers, also present in the mixture, carry the information. code (the others are only decoys).
  • the sequence of the coding marker therefore contains a coding box whose position is hidden. Reading this sequence allows the user to know which markers are to be searched in the target marker pool via cross-referencing in a lookup table.
  • the combination of the target markers makes it possible to identify the product unitarily: only one possible combination for a possible product.
  • a second sequence codes for general product information, such as the batch, year of production, etc.
  • the markers are then injected into the spirits to be marked.
  • the detection then takes place in two phases. The first is to detect the specific sequences of the coding marker.
  • the first information that comes out of it is: • Product authentication. In case of coarse counterfeiting, no coding marker is present • Product information: Batch number, date of manufacture, ...
  • Target markers consist of 20 different polynucleotides, obtained by chemical synthesis (Eurofins MWG GmbH). This example is realized with the marking of 5 different products. In each of these products, the markers can be used:
  • Primer-1 5 1 -AGTCGAGAGCCGATTCCGCT-3 1 (SEQ ID NO: 25)
  • Primer-2 ⁇ '-GTCCGAGCAAAGGCTTCCGT-S 1 (SEQ ID NO: 26)
  • Primer-3 5 I -AGACCCGTGGGCTCCATTAG 3-1 (SEQ ID NO: 27)
  • primer-4 5 I -CCACCCAGAGGGCTTAGGTT ⁇ 3 1 (SEQ ID NO: 28)
  • primer-5 5 I -ATCCCACGAGGGTGATCTCG 3-1 (SEQ ID NO: 29)
  • Primer-6 5 I -GGAATCCGACCGTGCATGTC 3-1 (SEQ ID NO: 30)
  • Primer-7 5 I -CAGAGACGTGACCCGCTGTT 3-1 (SEQ ID NO: 31)
  • Primer-8 5 -GACCCAGGGGTACATTCTCG I-3 I ( SEQ ID NO: 32)
  • Primer-9 5 I -AAACGAGCCCGTTCCGTGTG-3 1 (SEQ ID NO: 33)
  • the products 1 to 4 are samples of Mo ⁇ t et Chandon Champagne, cuvée Im Southernale 2005 (registered trademark), the product number 5 is a sample of Mo ⁇ t et Chandon Champagne, vintage Imperiale 2002 (registered trademark).
  • Table 3.1 illustrates the marking of the 5 products.
  • the dash indicates that the marker is not injected.
  • the letter M indicates that the marker is injected, and that it serves in the signature of the marking.
  • the letter L means that the marker is injected, but acts as a decoy.
  • products 1 and 2 even if they contain different lures, contain the same markers. They present the same signature.
  • products 3 and 4 have the same decoys, but the markers are different. They have a different signature.
  • the product 5 has the same signature as the product 1. Only the coding marker makes the difference between the two products.
  • the markers are injected at the rate of 100 ⁇ L (using a Pipette P100) so as to obtain a final concentration of
  • the final volume is, for example, 10 ml_.
  • the product thus contains 10 -8 moles of labels per liter, ie a total of 10 -10 moles of labels in 10 ml.
  • the coding markers are single-stranded deoxyribonucleic acids with a total length of 1000 bases. Their sequence is as follows (SEQ ID NO: 45):
  • Mark 1 codes for the combination of target markers to look for in the product.
  • the mark 2 codes for a generic information such as the vintage from which the samples originate. Below (Table 3.2), the legend of type 1 marks.
  • Table 3.2 Coding of the target markers according to the variable sites of the coding markers
  • Table 3.3 Coding of the product type according to the secondary information of coding markers
  • a specific coding marker which indicates which are the target authentication markers coding for the information, and which indicates, in our example, the vintage from which the sample originates, at a final concentration. 10 ⁇ 11 mol / L according to the technique described in Example 1. They contain the following variable sequences:
  • the detection is done in two steps.
  • the first is to detect coding markers. It allows a first authentication of products, thanks to the second mark. Reading the first mark then makes it possible to know the combination of target markers to be searched.
  • the markers are extracted from their environment (here, a Champagne wine), then recovered in an aqueous medium in order to then be able to use molecular identification techniques.
  • the extraction should preferably not only have a good performance
  • the technique used is that of phenol chloroform extraction.
  • the markers are extracted from 500 ⁇ l_ of product (Champagne).
  • - In a 2 mL tube (Eppendorf, registered trademark) containing 500 ⁇ l_ labeled product, add ⁇ A phenol volumes (250 ⁇ l_), ⁇ A volume of chloroform (250 ⁇ l_) with the aid of a P1000 pipette, then vortex for 10 seconds. Centrifuge for 5 minutes at 10000 rcf.
  • the coding marker is detected by a chain polymerization technique. Two primers are needed to do this.
  • a first type of primer is complementary to a region located 5 'of the variable sequence 1. This primer is called universal because it does not depend on the variability of the target markers (it recognizes a site common to all these markers).
  • the second primer is in turn complementary to the variable sites 2.
  • variable sequence types 2 here, two pairs).
  • FIG. 7 represents the detection of the primary labeling of the coding markers by PCR. This figure shows the two types of primers, the matrix as well as the complementary strand that is generated during the first PCR cycle.
  • a chain polymerization reaction is carried out on the markers extracted from the products.
  • the specific amplification of the marker coding for a primer pair reveals the presence of a type 2 sequence.
  • the absence of amplification is indicative of an unlabeled product, which is therefore probably counterfeited.
  • An amplification of the marker with the wrong pair of primer, or with several pairs of primers reveals a cheating on the product (cheating on the vintage, mixtures, ...)
  • variable sequences V2 the antisense primers are their reverse counterparts
  • Eurofins MWG GmbH 100 pmol / ⁇ L
  • the chain polymerization reactions are then launched on a GeneAmp PCR System 9700 device (Applied Biosystem) by respecting the following cycles:
  • the polymerase chain reaction products are then deposited on a 0.5% agarose gel prepared in 0.5X TBE and migrated in 0.5 X TBE buffer at 10 V.cm- 1 . migration is carried out, the gel is put in a bath containing BET, rinsed and then revealed with UV.For each product, the absence of band reveals that the marker was not detected, or that the sequence 2 does not correspond to the type of primer used A band (358 bp in size) corresponds to an amplification, thus to the detection of a specific sequence of the coding marker.
  • the amplicons are conserved for possible detection of target markers.
  • Target markers are searched in the product for further detection of the mark. Only the reading of the coding marker makes it possible to detect the target markers. This detection is done on the amplicons obtained previously by polymerization chain reaction.
  • the first step is to read the information contained on the coding markers, and thus on the amplicons.
  • This information (sequences 1) makes it possible to know, thanks to a correlation table, which are the target markers present in the product whose presence carries the information of the marking. Knowing this, a detection of the total target markers is performed, using a DNA chip. After revealing this detection, the user is able to know which target markers are present or not in the product, and can compare these results to theoretically expected results obtained by reading the information on the coding markers.
  • the sequence reaction is carried out on each of the amplicons, in a 200 ⁇ l tube (Eppendorf, registered trademark), according to the protocol set out in Table 3.6.
  • variable sequences 1 or Marques 1).
  • the target markers are then detected according to the technique described in Example 1. This detection reveals, of course, the ten or so markers present in each product, but it is by comparing with the coding markers that it is possible to remove the relevant information. .
  • Example 4 Labeling According to the Process of the Invention of a Medicament
  • This example shows how to label drugs in the form of tablets such as those used for many drug formulations, according to the labeling method of the present invention.
  • the protocol of Example 1 is used.
  • the markers are first put in an ethanolic solution (80%) and then incorporated during the tableting process, to a final concentration of 10-12 moles per 400 mg tablet for the target markers and lures, and at a concentration of 10-14 moles per tablet for the coding markers.
  • the tablets do not contain any active ingredient.
  • the markers are prepared in the same manner as in Example 1.
  • Preliminary mixing is however carried out in an 80% ethanolic solution for the incorporation of the polynucleotides into the tablets.
  • the tablets are prepared from 300 g of grains.
  • the different powders composing the grains are first weighed and then mixed ("Lodigge” type swirling and blasting mixer), according to the following formula:
  • the wetting solution is then prepared from 100 g of sugar syrup and 750 ⁇ l of the marker solution. Gradually add this wetting solution to the powder mixture until a moist mass is obtained which looks like a coarse semolina, then granulate the preceding mixture to obtain a grain having the appearance of a moist vermiculate ( using an oscillating Granulator).
  • the grain is then dried at a temperature of 60 ° C. until a hygrometry of 4 to 6% is obtained and then sieved on a sieve column to remove the fine particles. After lubrication with 1% magnesium stearate, the grains are pressed and compressed in press.
  • the markers are extracted by grinding the tablets and then recovering the polynucleotides in the aqueous phase.
  • the tablets are crushed using a mortar and pestle, so as to obtain a very fine powder. This powder is then mixed with
  • Example 1 1 mL of distilled water, in a 1.5 mL tube (Eppendorf, registered trademark). After heating for 15 minutes at 70 ° C., the tube is centrifuged for 5 minutes at 5000 rcf in order to remove the solid particles. The aqueous phase is then taken up in a new tube for the polynucleotide authentication step. The polynucleotides can then be detected according to the method described in Example 1.
  • This example shows how to mark and extract markers in a food product, such as pizza dough.
  • the markers are injected into the fresh dough and being prepared. They can be detected later in the finished product, ready for consumption, cooked or not.
  • the markers are pre-diluted in deionized water. Mixtures of target, coding and decoy polynucleotides are used, as shown in Example 1. They are then incorporated into a pizza dough recipe, which is then cooked.
  • a preliminary solution of target markers, coders and decoys is added, prepared as described in Example 1, is added using a P200 pipette (Gilson Pipetman, registered trademark) to the pizza dough during its manufacture, in sufficient quantity to obtain a final marker concentration of 1 E- 10 mol / kg (for each non-decoying marker, ie at 2 E- 9 mol / kg of polynucleotides).
  • the following table shows the different amounts of ingredients to obtain 828 grams of raw pizza dough.
  • the dough is then baked for 15 minutes at an average temperature of 240 ° C.
  • the markers are extracted by dissolving a cooked portion of dough in demineralized water: 1 gram of cooked dough is reduced to powder and then taken up in 10 ml of water. The whole is then mixed vigorously and then heated for 15 minutes at 94 ° C. After centrifugation for 5 minutes at 10,000 rcf, the aqueous phase recovered and stored at 4 ° C. for the detection of the markers. These markers were detected according to the technique presented in Example 1.
  • Example 6 Marking according to the process of the present invention of tobacco
  • This example shows how to mark tobacco. It is labeled with polynucleotides as presented in Example 1 by direct adsorption on tobacco.
  • the marking is on one of the cigarettes of cigarettes called “blondes”. On this sample is adsorbed a mixture of target polynucleotides, coding polynucleotides and decoy polynucleotides as described in Example 1.
  • the tobacco is labeled with the solution of polynucleotides prepared according to the method described in Example 1.
  • One gram of tobacco extracted from cigarettes is labeled so as to obtain, in the end, 10 -12 moles of label per gram of tobacco: a sufficient quantity of pre-marking solution is injected using a P200 pipette ( Gilson Pipetman, registered trademark) directly on the tobacco, then the whole is mixed vigorously, at a temperature of 37 ° C for 15 minutes.
  • a P200 pipette Gilson Pipetman, registered trademark
  • the tobacco thus labeled is then stored at a temperature of 160 ° C. and 70% hygrometry.
  • the markers are extracted by soaking marked tobacco
  • This example shows how to mark a hydrocarbon (crude oil) and what technique can be used to extract the markers and reveal the marking.
  • a crude oil sample is labeled with polynucleotides previously prepared in a polar organic solvent.
  • the labeling is composed of target polynucleotides, coding polynucleotides and decoy polynucleotides as described in Example 1.
  • a solution of target, coding and decoy single-stranded polynucleotides are prepared as described in Example 1.
  • a second preliminary mixture is then carried out in DMSO before inserting the markers into the oil.
  • the second preliminary solution of markers is then mixed with the oil, using a precision pipette (Gilson Pipetman, registered trademark) in sufficient quantity to obtain a final marker concentration of 10 -10 mol / l.
  • the labeled oil is then stored at room temperature for the purpose of identifying the markers.
  • the markers are extracted from their apolar medium and then recovered in an aqueous medium in order to then be able to use an identification technique.
  • the technique used is that of phenol chloroform extraction.
  • the markers are extracted from 500 ⁇ l of crude oil.
  • Example 8 Labeling according to the method of the invention of a fresh food product
  • a fresh food product is labeled with a polynucleotide mixture.
  • the product is a dairy product: a yoghurt.
  • the markers are pre-diluted in deionized water.
  • the labeling is composed of target polynucleotides, coding polynucleotides and decoy polynucleotides as described in Example 1.
  • a preliminary solution of target, coding and decoy polynucleotides is added to the yogurt, in the mass, in an amount sufficient to obtain a final marker concentration of 1 E- 10 mol / kg (for each non-decoying marker, ie at 2 E- 9 moles / kilogram of polynucleotides) using a P10 pipette (Gilson Pipetman, registered trademark), 2 ⁇ L of preliminary solution are then injected into the mass of the product. Everything is well homogenized using a sterile spatula. The marked yogurt is then stored at 4 ° C pending identification of the markers.
  • the markers are extracted by dissolving a portion of yoghurt in demineralised water: 1 gram of yoghurt is taken up in 10 ml of water. The whole is then mixed vigorously and then allowed to warm 15 minutes at 94 C C. After centrifugation for 5 minutes at 10,000 rcf, the aqueous phase recovered and stored at 4 ° C for the revelation of the markers. These markers can be detected according to the technique presented in Example 1.
  • a non-alcoholic soft drink is labeled with polynucleotides as described in Example 1: Orangina (registered trademark), Schweppes International Limited.
  • Target, coding and decoy markers are pre-diluted in demineralized water. They are then mixed directly into the drink.
  • Preliminary mixing is performed in deionized water before inserting the markers into the beverage.
  • the preliminary solution of markers is mixed with the beverage, in an amount sufficient to obtain a final marker concentration of 1 E- 10 mol / L (for each non-decoying marker, ie at 2 E- 9 mol / l of polynucleotides).
  • the labels are extracted using the phenol-chloroform technique presented in Example 1.
  • This example shows how to mark and extract markers in a paper form.
  • the markers are directly adsorbed on the paper. They are subsequently detected by dissolving the marked paper.
  • Example 1 10. a.1 Principles
  • the target, coding and decoy polynucleotides as described in Example 1 are pre-diluted in demineralized water. A drop is then adsorbed on the surface of a sheet of paper.
  • Preliminary mixing as set forth in Example 1 is carried out in deionized water prior to deposition on the paper sheet.
  • the preliminary solution of markers is then deposited on the paper, so that 1 E-12 moles of labels are deposited. 1 ⁇ l of preliminary solution is deposited using a precision pipette
  • the paper is then dried in the open air and then stored for the detection of markers.
  • the markers are extracted by dissolving a section of paper in demineralized water: 1 cm 2 of paper containing the marker disk is cut into very small pieces, and then immersed in 10 ml of water. Everything is then heated to 15 minutes at 94 ° C.
  • the paper pulp is mixed very vigorously, then homogenized by suction-discharge using a pipette.
  • the aqueous phase recovered and stored at 4 ° C. for revealing the markers. These markers can be detected according to the technique presented in Example 1.
  • Stability and aging tests were carried out jointly with a cosmetics manufacturer. Olfactory tests have made it possible to verify that the addition of target polynucleotides, coding agents and decoys by carrying out a marking according to the present invention does not in any way alter the physicochemical and olfactory properties of the perfumes. These tests were carried out in parallel on several perfumes, and according to several conditions: a month at 5 ° C which served as a reference, a month at 50 c C, which simulated an accelerated aging of the perfume, as well as a month exposed to the light of day.
  • FIG. 8 represents a detection scheme of a marking according to the invention and of authentication of a labeled product according to the invention.
  • the coding markers are identified.
  • the first level of authentication of the product lies in their presence. If the product does not contain a coding marker, the product is counterfeit.
  • the target markers and decoys are not differentiated (it is impossible to say that a polynucleotide is a target polynucleotide or a decoy polynucleotide).
  • the nature of the coding polynucleotide detected during the first step (here the polynucleotide A) is then sent to the supplier of the marking.
  • the tagging provider retrieves from a database the tag decryption key, which will define, in the series of polynucleotides lures and targets, which are decoys and which are target.
  • the user is interested in target polynucleotides only. It can then read the code that makes up the presence or absence of target polynucleotides (in this example, the code is -, -, + and -). - Reading the code then allows the user to check, using a secure database, if the identification code corresponds to the product of interest. Otherwise, it may be illegal reproduction, mixing or misappropriation of the product.

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Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé de marquage d'un produit, à un procédé d'identification du marquage et à un produit marqué par le procédé de l'invention. Le marquage utilisé dans la présente invention est à base d'acides nucléiques simples brins. Le procédé de marquage de la présente invention comprend une étape d'addition sur ou dans ledit produit d'une pluralité de polynucléotides simples brins, ladite pluralité de polynucléotides comprenant : au moins un polynucléotide cible constitué d'un polynucléotide simple brin de longueur et de séquence déterminée, et des polynucléotides leurres qui sont de longueurs déterminées identiques ou différentes et de séquences déterminées identiques ou différentes, lesdits polynucléotides leurres étant de longueur(s) identique(s) ou différente(s) et de séquences différentes de la séquence dudit, au moins un, polynucléotide cible, dans lequel chacun des polynucléotides cible(s) et leurres ne s'hybride avec aucun des autres polynucléotides de ladite pluralité de polynucléotides. Le procédé de l'invention permet par exemple de marquer les parfums, les cosmétiques, les produits pour l'hygiène, les produits alimentaires, les arômes, les extraits de plante(s), le tabac, les boissons, textiles, les cuirs, les médicaments, les poudres, les vernis, les encres, produits alimentaires, les hydrocarbures, les papiers, les peintures, les produits et composés chimiques.

Description

PROCEDE DE MARQUAGE D'UN PRODUIT A L'AIDE D'UNE PLURALITE DE POLYNUCLEOTIDES, PROCEDE D'IDENTIFICATION DU MARQUAGE ET PRODUIT
MARQUE
DESCRIPTION
Domaine technique
La présente invention se rapporte à un procédé de marquage d'un produit, à un procédé d'identification du marquage et à un produit marqué par le procédé de l'invention. Le marquage utilisé dans la présente invention est à base d'acides nucléiques simples brins.
La présente invention permet de distinguer un produit authentique d'une contrefaçon. Il permet en particulier de marquer le produit authentique de façon à pouvoir le tracer et l'identifier.
La contrefaçon ou reproduction illégale d'objets, notamment de produits à haute valeur ajoutée, ou produits de luxe, entraîne de graves conséquences financières pour les entreprises, mais également en terme d'emplois, de sécurité sanitaire ou même de vie sociale. C'est pourquoi les industriels s'emploient à lutter contre ce fléau, en développant de nouvelles techniques de marquages et d'authentification de leurs produits, afin de traquer et de détruire les produits contrefaits.
Les références entre crochets ([x]) renvoient à la liste des références à la fin des exemples.
Etat de la technique Une des méthodes souvent utilisées pour détecter et identifier un produit authentique est le marquage dudit produit "dans la masse", en incorporant à ce produit un corps ou composé chimique identifiable de manière unilatérale.
Ce genre de marquage doit présenter des propriétés particulières : le marquage doit se faire de manière transparente vis-à-vis de l'utilisateur final du produit, il ne doit pas altérer les propriétés physico- chimiques de ce produit et ne doit pas présenter de danger pour l'utilisateur final du produit. Il doit aussi être, autant que faire se peut, indécelable et/ou infalsifiable pour ne pas être lui-même falsifié en même temps que le produit. II n'existe pas aujourd'hui de technique fiable, stable dans le temps en particulier pour les très nombreuses substances chimiques réputées agressives pour les marqueurs, telles que des parfums, des crèmes cosmétiques ou sur des matières telles que le cuir, le tissu, etc. Il n'existe pas non plus à ce jour de techniques de marquage présentant réellement de grandes difficultés de décryptage pour les contrefacteurs.
Il existe donc un réel besoin d'un marquage et d'un procédé de marquage palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur et permettant de lutter efficacement contre les contrefaçons, notamment des produits de luxe.
Exposé de l'invention
La présente invention a précisément pour but de proposer une solution de marquage répondant à ce besoin et résolvant les problèmes de l'art antérieur. La présente invention se rapporte en particulier à un procédé de marquage d'un produit, ledit procédé comprenant une étape d'addition sur ou dans ledit produit d'une pluralité de polynucléotides simples brins, ladite pluralité de polynucléotides comprend :
- au moins un polynucléotide cible constitué d'un polynucléotide simple brin de longueur et de séquence déterminée, et
- des polynucléotides leurres qui sont de longueurs déterminées identiques ou différentes et de séquences déterminées identiques ou différentes, lesdits polynucléotides leurres étant de longueur(s) identique(s) ou différente(s) et de séquences différentes de la séquence dudit, au moins un, polynucléotide cible dans lequel chacun des polynucléotides cible(s) et leurres ne s'hybride avec aucun des autres polynucléotides de ladite pluralité de polynucléotides.
Dans un mode particulier de réalisation du procédé de la présente invention, ladite pluralité de polynucléotides comprend en outre au moins un polynucléotide de reconnaissance constitué d'un polynucléotide simple brin de longueur et de séquence déterminée d'identification de la nature et la séquence du, au moins un, polynucléotide cible, dans lequel chaque polynucléotide de reconnaissance ne s'hybride avec aucun des autres polynucléotides de ladite pluralité de polynucléotide.
La description qui suit est à considérer pour le procédé de l'invention tel qu'il est défini ci-dessus et pour le mode particulier de réalisation du procédé de l'invention.
Le marquage de la présente invention est donc constitué de ladite pluralité de polynucléotides telle que définie dans la présente description. Ces polynucléotides sont des polynucléotides simples brins Dans la présente description, on désigne également cette pluralité de polynucléotide par le terme « marqueur ».
La présente invention se rapporte également à un produit marqué susceptible d'être obtenu par le procédé de l'invention et à un procédé de détection du marquage de ce produit.
La présente invention porte notamment sur la détermination du marqueur utilisé pour mettre en œuvre le procédé de l'invention, la fabrication de ces marqueurs, le marquage des produits, ainsi que les techniques de détection des marqueurs dans les produits marqués. La présente invention permet de distinguer une contrefaçon d'un produit authentique, ou encore d'identifier des détournements de circuits de distribution ou des circuits parallèles non autorisés. Les polynucléotides de ladite pluralité de polynucléotides peuvent être de plusieurs types : il peut s'agir de polymères de ribonucléotides ou acides ribonucléiques simple brin (ARN) ou de désoxyribonucléotides ou acides désoxyribonucléiques simple brin (ADN) ou un mélange de ceux-ci.
Par « pluralité de polynucléotides » on entend dans la présente l'ensemble formé des polynucléotide(s) cible(s), leurres, et, le cas échéant, de reconnaissance. De préférence, selon la présente invention, on utilise plusieurs polynucléotides cibles, plusieurs polynucléotides leurres, et, le cas échéant, plusieurs polynucléotides de reconnaissance. Par exemple, sans que cet exemple soit limitatif, on peut utiliser de 1 à 100 polynucléotide(s) cible(s), par exemple de 1 à 50, par exemple de 5 à 50. Par exemple aussi, sans que cet exemple soit limitatif, on peut utiliser de 2 à 100 polynucléotides leurres, par exemple de 2 à 50. Par exemple, le cas échéant, sans que cet exemple soit limitatif, on peut utiliser de 1 à 100 polynucléotides de reconnaissance, par exemple de 1 à 50. Le choix du nombre de polynucléotides dépend de la complexité souhaitée du marquage selon la présente invention.
Par « polynucléotide cible » on entend dans la présente un polynucléotide dont la séquence a été déterminée et construite pour constituer une séquence de référence destinée à marquer le produit selon la présente invention, puis à être recherchée spécifiquement dans ce produit pour l'authentifier. De préférence, selon l'invention, le marqueur comprend plusieurs polynucléotides cibles identiques ou différents, de préférence différents. Les polynucléotides cibles sont référencés dans une base de données confidentielle cibles/produits qui établit le lient entre le ou les polynucléotide(s) cible(s) et le produit marqué.
Par « base de données confidentielle », on entend une base de donnée à laquelle seul le fabriquant du marquage selon la présente invention pour un produit donné et/ou seul le fabriquant/créateur dudit produit a (ont) accès (l'un et/ou l'autre est appelé ci-après « celui qui met en œuvre la présente invention »). Il s'agit d'une base de correspondance dans laquelle, pour chaque produit ou chaque famille de produit est assignée une signature particulière déterminée selon la présente invention. Dans le cas où seuls des polynucléotides cible(s) et leurres sont utilisés pour la signature des produits, on peut appeler cette base de données, ou de correspondance, « base confidentielle cibles/produits » ou « base cibles/produits ». Ainsi, si l'on souhaite authentifier un produit suivant la présente invention, on recherche d'abord dans la base cibles/produits la ou les séquence(s) cible(s) assignée(s) audit produit, et on recherche ensuite si la ou les séquence(s) cible(s) est (sont) effectivement présente(s) dans ledit produit, par exemple en utilisant un des procédés décrits ci-dessous. Si la ou les séquence(s) cible(s) est (sont) effectivement présente(s), le produit est déclaré authentique. En revanche, si la ou les séquences cible(s) n'est (ne sont) pas présente(s), le produit est déclaré être une contrefaçon. Bien entendu, cela ne fonctionne que si tous les produits authentiques sont marqués suivant la présente invention. La base de correspondance peut être construite par le fabriquant de la signature de la présente invention et/ou par le fabriquant/créateur à partir d'une liste de signatures selon la présente inventions, par exemple en faisant correspondre à chaque signature un produit déterminé. Dans ce cas, l'authentification est directe.
Par « polynucléotide leurre » on entend dans la présente un polynucléotide dont la séquence a été choisie et construite pour être différente de la ou des séquence(s) cible(s). Les séquences leurres sont destinées à brouiller le marquage selon la présente invention, mais pas à être recherchées dans le produit pour l'authentifier. Les séquences leurres sont là pour compliquer le travail d'un contrefacteur à tenter de reproduire la signature de la présente invention. En effet, seul celui qui met en œuvre la présente invention connaît la ou les séquence(s) cible(s). La distinction d'une ou plusieurs séquence(s) particulière(s), en l'occurrence de la ou des séquence(s) cible(s) en vue de leur reproduction, parmi un mélange de séquences cible(s) et leurres, en vue de leur reproduction, est rendue d'autant plus difficile voire impossible que, selon l'invention, les séquences leurres sont présentes, que cible(s) et leurres sont des séquences courtes, simples brins et ne s'hybridant pas entre elles. Plus le nombre de leurres est important, plus la reproduction de la signature dans son ensemble est difficile et, statistiquement, moins il y a de chance de déterminer par hasard la ou les séquence(s) du ou des polynucléotides cibles. Les séquences de ces polynucléotides leurres sont également connues par celui qui met en œuvre la présente invention, mais ces polynucléotides ne sont pas dans une base de données pour être affectés à un produit.
Par « polynucléotide de reconnaissance », on entend dans la présente un polynucléotide de séquence et de longueur déterminée qui permet l'identification du ou des polynucléotide(s) cible(s). Ceux-ci peuvent présenter une nature ou être présents dans des concentrations facilitant une recherche et une identification rapide, pouvant faire office de premier test d'authentification : leur absence est un premier signe de contrefaçon. Il s'agit d'un ou de plusieurs polynucléotide(s) dont la (les) séquence(s) est (ont) été choisie(s) et construite(s) pour constituer un code utilisé dans une base de donnée confidentielle d'identification du ou des polynucléotide(s) cible(s) ou « base d'identification des cibles » destinée à renseigner sur le nombre, la nature, la séquence et la longueur du (des) polynucléotide(s) cible(s). Lorsqu'il y a plusieurs polynucléotides de reconnaissance, on peut parler « d'un ensemble de polynucléotides de reconnaissance ». Dans ce cas, dans la base d'identification des cibles, pour chaque polynucléotide de reconnaissance ou ensemble de polynucléotide de reconnaissance, est assigné un polynucléotide cible ou un ensemble de polynucléotides cibles déterminé selon la présente invention. Les séquences des polynucléotides de reconnaissance sont connues seulement par celui qui met en œuvre la présente invention. La présence de polynucléotide(s) de reconnaissance dans la signature de la présente invention est optionnelle, elle correspond à un mode particulier de réalisation du procédé de l'invention. Si un ou plusieurs polynucléotide(s) de reconnaissance est (sont) utilisé(s) dans la signature selon l'invention d'un produit, une base confidentielle d'identification des cibles est créée par celui qui met en œuvre la présente invention. Cette base permet d'identifier le ou les polynucléotide(s) cible(s) présents dans un produit à authentifier à partir du ou des polynucléotide(s) de reconnaissance. Dans ce cas, l'authentification d'un produit est indirecte. En effet, si l'on souhaite authentifier un produit sensé comprendre une signature selon l'invention, on identifie le ou les polynucléotide(s) de reconnaissance suivant un des procédés décrits ci-dessous de la présente invention, on recherche ensuite dans la base d'identification des cibles la ou les séquence(s) cible(s) assignée(s) audit produit, et on recherche ensuite si la ou les séquence(s) cible(s) est (sont) effectivement présente(s) dans ledit produit, par exemple en utilisant un des procédés décrits ci-dessous. Si la ou les séquence(s) cible(s) est (sont) effectivement présente(s), le produit est déclaré authentique. En revanche, si la ou les séquences cible(s) n'est (ne sont) pas présente(s), le produit est déclaré être une contrefaçon. On remarque dans ce mode de réalisation de la présente invention qu'il y a deux étapes d'identification de polynucléotides avant de pouvoir authentifier un produit, ce qui complique la tâche d'éventuels contrefacteurs. Bien entendu, cela ne fonctionne que si les produits authentiques sont marqués suivant la présente invention. Selon l'invention, la séquence des polynucléotides de reconnaissance peut contenir une sous séquence portant le code qui permet à l'utilisateur de l'invention de retrouver quels sont les polynucléotides cibles, et quels sont les polynucléotides leurres à partir d'une base de reconnaissance des cibles. Ainsi, au cours du processus d'authentification d'un produit, ces polynucléotides de reconnaissance sont extraits du produit à authentifier, ou directement identifiés dans ou sur le produit. Une fois la nature des polynucléotides de reconnaissance révélée - par exemple, sans que cet exemple ne soit limitant, l'identification des polynucléotides cibles peut se faire par la lecture de la séquence d'un polynucléotide de reconnaissance, ou par l'identification d'un jeu de polynucléotides de reconnaissance présents parmi une pluralité de polynucléotides codant putatifs - l'utilisateur de la présente invention va se reporter dans une table de correspondance (base de données de reconnaissance des polynucléotides cibles), et y lire la nature des polynucléotides cibles théoriquement présents dans le produit à authentifier. Cette table peut par exemple, et sans que cet exemple ne soit limitant, être stockée dans une base de donnée sécurisée et informatisée (permettant d'assurer la confidentialité), laquelle base de donnée a été créée lors du marquage du produit, et dans laquelle figurent les couples (« code des polynucléotides de reconnaissance lu » - « polynucléotides cibles à rechercher »). Ainsi, après s'être référé à cette table, l'utilisateur de l'invention peut déduire la nature exacte des marqueurs cibles qui devraient être présents dans le produit à authentifier. Les polynucléotides cibles sont alors extraits, puis identifiés. Si les polynucléotides cibles détectés correspondent exactement au code théorique lu dans la table, alors le produit est authentifié. Si d'autres polynucléotides cibles sont présent, l'utilisateur de l'invention peut suspecter un mélange de produits marqués. Si les polynucléotides cibles détectés sont totalement différents de ceux attendus, il peut s'agir d'une contrefaçon. S'il n'y a pas de polynucléotide de reconnaissance utilisé dans une signature selon l'invention, seule une base de données cibles/produits est utile. Dans la présente invention, les polynucléotides de la pluralité de polynucléotides peuvent être conçus par exemple par des méthodes connues de l'homme de l'art, par exemple à l'aide d'un logiciel implémentant un algorithme tel que présenté ci-après, de manière à ce que, pour un polynucléotide donné, sélectionné parmi la pluralité de polynucléotides constituant le marquage, aucun autre polynucléotide de cette pluralité, ni aucun polynucléotide complémentaire inversé de ces polynucléotides ne soit constitué d'une séquence de nucléotides complémentaires de ce polynucléotide donné. Ainsi, aucun complexe double brin, par exemple une double hélice d'acide nucléique, comme par exemple une double hélice d'ADN, ni aucune hybridation entre les polynucléotides de la signature de la présente invention ne peut se former y compris à la température et dans l'environnement moléculaire de conditionnement du produit, et à la température et dans l'environnement moléculaire de révélation des polynucléotides.
Par « formation d'un complexe double brin », on entend un appariement des nucléotides complémentaires, énergiquement stables, y compris dans les conditions citées ci-dessus.
Par « polynucléotide complémentaire inversé » d'un polynucléotide donné, on entend un nouveau polynucléotide, existant ou théorique, où chaque nucléotide du polynucléotide donné est remplacé par un nucléotide complémentaire pouvant s'apparier avec le premier, comme par exemple une adénine remplaçant une thymine, ou une thymine remplaçant une adénine, ou une cytosine remplaçant une guanine, ou une guanine remplaçant une cytosine dans le cas d'un polynucléotide d'acide désoxyribonucléique. Par « hybridation » on entend l'association par des liaisons non covalentes de deux polynucléotides simple brin complémentaires. Cette l'hybridation peut être parfaite, c'est à dire que les séquences sont totalement complémentaires, ou imparfaite, c'est à dire que les séquences ne sont pas totalement complémentaires mais suffisamment complémentaires pour s'hybrider entre elles et former une structure double-brin.
Dans la présente invention, par « non hybridation » on entend la non association par des liaisons non covalentes de deux polynucléotides simple brin car il ne sont pas complémentaires et/ou car la complémentarité est insuffisante pour la formation d'un double brin. II est intéressant de noter que la pluralité de polynucléotides du marqueur de la présente invention à incorporer dans un produit ou une substance d'intérêt ne sont pas tous assignés dans une base de données pour authentifier directement ou indirectement un produit. Il est ainsi possible de n'utiliser qu'un nombre restreint de polynucléotides cibles, ces polynucléotides cibles étant ceux qui sont recherchés lors d'une authentification du produit, et de les incorporer dans le produit en même temps qu'un grand nombre de leurres, et, le cas échéant de polynucléotides de reconnaissance, dont les séquences ne correspondent pas à celles des polynucléotides cibles. Ainsi, le ou les polynucléotides cibles peuvent être « noyés » dans une masse de polynucléotides leurres brouillant de manière extraordinaire les pistes en cas de tentative de décodage malveillante des polynucléotides cibles en vue de reproduire la signature. En outre, suivant le mode particulier de réalisation de la présente invention, dans lequel des polynucléotides de reconnaissance sont utilisés, seule la lecture et le décryptage du code porté par les polynucléotides de reconnaissance peut incriminer, parmi un mélange de polynucléotides cibles et de polynucléotides leurres, lesquels correspondent effectivement aux séquences cibles, et par élimination lesquels ne sont que des leurres destinés à tromper le contrefacteur.
Le procédé de marquage de la présente invention peut être réalisé au moyen de marqueurs qui sont des acides désoxy et/ou ribonucléiques. Lesdits polynucléotides de la pluralité de polynucléotides peuvent donc être des séquences d'acide désoxyribonucléique simple brin ou d'acide ribonucléique simple brin ou un mélange de séquences d'acide désoxyribonucléique et d'acide ribonucléique. Un marqueur conforme à la présente invention peut donc être composé de bases courante, appelées « bases naturelles » par exemple celles présentes dans l'ADN : adénine, guanine, thymine, cytosine, ou dans l'ARN : adénine, guanine, uracile, cytosine (voir par exemple Molecular Cloning, Maniatis, CoId Spring- Harbor, 2ème édition, pp C3 à C14 [1]). Un marqueur conforme à la présente invention peut aussi comprendre des composés naturels ou synthétiques moins fréquents, appelés « bases modifiées », comme par exemple la dihydrouridine (DHU), l'inosine, ou la pseudo-uracile qui découlent de modifications, par exemple une désamination, effectuées sur les bases présentées précédemment. Les bases azotées peuvent être constituées à partir d'isotopes naturels et/ou à partir d'isotopes stables de masse atomique différente et/ou être modifiées pour établir un nombre de liaisons hydrogène différent de la normale lors des processus d'hybridations. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les séquences d'acide désoxyribonucléique peuvent comprendre, dans leur séquence, la même proportion des quatre bases A, C, G et T, naturelles ou modifiées. Selon un autre mode particulier de réalisation de la présente invention, les séquences d'acide ribonucléique peuvent contenir, dans leur séquence, la même proportion des quatre bases A, C, G et U, naturelles ou modifiées. Selon un autre mode de réalisation de l'invention encore, incluant ou non les deux modes de réalisation précédent, l'ensemble des polynucléotides composant le marquage ont le même nombre de nucléotides, et le même poids moléculaire. Ce mode particulier de réalisation de l'invention permet de manière avantageuse de rendre encore plus difficile voir impossible la séparation et l'identification des polymères par un éventuel contrefacteur. Par exemple, la séparation et l'identification en fonction de la taille et/ou du poids moléculaire grâce à des techniques telles que l'électrophorèse, par exemple sur gel d'agarose ou de polyacrylamide et/ou la spectrométrie de masse est impossible à réaliser sur une signature suivant ces derniers modes de réalisation, en particulier le dernier.
Par exemple, dans le marquage de la présente invention, un polynucléotide simple brin (ou oligomère) de 20 nucléotides, chacun des nucléotides étant choisi parmi 4 bases possibles permet de réaliser 420 séquences différentes, soit environ 1 ,1x1012 combinaisons, c'est-à-dire mille milliards de combinaisons. La probabilité d'extraire un marqueur cible, selon l'invention, au hasard par exemple une pluralité de polynucléotides de taille 20 dans un marquage conforme à la présente invention, et que ce marqueur soit celui qui a été assigné au produit dans une base de données cibles/produit est donc quasi nulle. En outre, le marquage de la présente invention est composé de plusieurs molécules cibles de séquences et de longueur déterminées, de plusieurs leurres, et, le cas échéant de plusieurs polynucléotides de reconnaissance, ce qui assure à la fois une sécurité très élevée et une inviolabilité remarquable du marquage.
De part leur nature, les polynucléotides utilisés peuvent donc comprendre par exemple une combinaison orientée de 4 bases azotées dont la nature est à définir par celui qui met en œuvre la présente invention. Cette combinaison, qui est à l'origine de la spécificité de chaque polynucléotide du marqueur de la présente invention, et qui peut porter l'information relative au produit marqué, peut être calculée de manière informatique, selon les besoins (complexité du code, type d'information que les marqueurs portent) ainsi que les propriétés physico chimiques que présentent ces marqueurs (propriétés d'hybridation, masse moléculaire, taille des fragments, composition en bases azotées).
Selon le produit à marquer et la technique de détection du marquage envisagée, un ou plusieurs polynucléotide(s) cible(s) peuvent être utilisés. L'invention permet donc un nombre considérable de variantes de signature ou marquage. On peut citer à titre d'exemple non limitatif pour les polynucléotides cibles du premier ensemble les différentes formes suivantes : un ou plusieurs polynucléotide(s) simple brin(s) cible(s) de grande(s) taille(s), c'est à dire comportant par exemple de 500 à 5000 nucléotides ou bases ; - un ou plusieurs polynucléotide(s) simple brin(s) cible(s) de petite(s) taille(s), c'est à dire comportant par exemple de 5 à 200 nucléotides ou bases, par exemple de 15 à 200, par exemple de 20 à 200, par exemple de 5 à 50 ; un ou plusieurs polynucléotide(s) simple brin(s) cible(s) de taille(s) moyenne(s), c'est à dire comportant par exemple de 201 à 499 nucléotides ou bases ; un ou plusieurs polynucléotide(s) simple brin(s) cible(s) possédant une extrémité de séquence constante et une extrémité de séquence variable, un ou plusieurs polynucléotide(s) simple brin(s) cible(s) insérés (ou déterminés) dans des polynucléotides de plus grandes tailles, ces polynucléotides cibles insérés formant donc une partie de polynucléotides plus grands, un ou plusieurs polynucléotide(s) simple brin(s) circulaires, ou une combinaison de ces différentes formes.
Selon l'invention, au moins deux polynucléotides cibles peuvent être utilisés, l'un étant un polynucléotide circulaire et l'autre un polynucléotide linéaire. Une pluralité de polynucléotides cibles circulaires ou linéaires ou un mélange de ceux-ci peuvent être utilisés, suivant la complexité choisie du marquage par celui qui met en œuvre la présente invention.
Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, lorsque certains ou l'ensemble des polynucléotides simple brin sont linéaires, ils peuvent comprendre une extrémité variable d'un polynucléotide à l'autre et une extrémité constante d'un polynucléotide à l'autre. Par « extrémité constante » on entend une partie de la séquence polynucléotidique incluant une des deux extrémités de ladite séquence et présentant une séquence déterminée et constante, c'est à dire identique pour une partie des séquences cibles ou pour toutes les séquences cibles du marqueur de la présente invention. Par « extrémité variable » on entend une partie de la séquence polynucléotidique incluant l'autre des deux extrémités de ladite séquence et présentant une séquence déterminée variable d'une séquence cible à l'autre dans le marqueur de la présente invention. Ceci présente un avantage particulier pour les polynucléotides cibles. En effet, pour détecter ou décrypter le marquage dans le but d'identifier un produit authentique, comme décrit ci-dessous, on peut utiliser un support solide pour le décryptage, support sur lequel des polynucléotides complémentaires aux extrémités variables des polynucléotides cibles sont fixés, comme pour une puce ADN. Les extrémités constantes peuvent quant à elles être utilisées pour mettre en évidence l'hybridation des polynucléotides cibles sur le support solide, par exemple au moyen de biotine/streptavidine. Ce mode de détection est décrit ci-dessous.
Le nombre et la nature des polynucléotides cibles, combinés à leur taille, permet de définir la complexité du marquage, et de manière combinatoire, le nombre de combinaisons possibles. Le nombre de combinaisons possibles augmente de manière exponentielle avec la taille de ces polynucléotides. En choisissant une signature composée d'un ou plusieurs polynucléotides parmi tous les polynucléotides de même taille, un grand nombre de combinaisons est envisageable. La probabilité de reproduire une signature parmi toutes les celles qui sont possibles, au hasard, est quasiment nulle.
Selon l'invention, l'information de marquage peut consister en : des séquences polynucléotides cibles, chacune assignée dans une base de données cibles/produits à un produit, et/ou en une ou plusieurs combinaison(s) de séquences polynucléotides cibles, ladite (lesdites) combinaison(s) étant assignée(s) dans une base de données cibles/produits à un produit. Ainsi, on peut utiliser plusieurs polynucléotides cibles de séquences déterminées. On peut également choisir par exemple un groupe ou « pool » de 20 séquences polynucléotidiques de séquences toutes différentes et déterminées, et choisir, pour marquer une série de produits donnés, une combinaison par exemple de 10 séquences parmi ces 20 pour chaque produit. A ces séquences cibles sont ajoutées des séquences polynucléotidiques leurres pour constituer le marqueur conforme à la présente invention. Selon l'invention, les polynucléotides leurres ne s'hybrident pas avec les polynucléotides cibles et ont pour rôle de rendre encore plus difficile pour un contrefacteur le décryptage du marquage de la présente invention pour le copier. Ces polynucléotides leurres peuvent être sous forme linéaire ou circulaire ou un mélange de polynucléotides circulaires et de polynucléotides circulaires comme indiqué ci-dessus pour les polynucléotides cibles. Le nombre de polynucléotides leurres ajouté au marqueur dépend du brouillage souhaité. De préférence ce nombre est supérieur au nombre de polynucléotides cibles. Des exemples sont donnés ci-dessus. Les polynucléotides leurres sont de longueur(s) identique ou différente(s) les uns des autres, de préférence de longueur identique à la, à l'une, à des ou aux séquence(s) cible(s) présentes dans le marqueur de la présente invention, par exemple, comme indiqué ci- dessus pour les polynucléotides cibles, de 15 à 5000 bases, par exemple de 15 à 200, par exemple de 20 à 200, par exemple de 201 à 499, par exemple de 500 à 5000 bases, ou un mélange de ces longueurs.
A ces séquences cibles et leurres peuvent être ajoutés des polynucléotides de reconnaissance, permettant, au moyen d'une base de données, de discriminer les polynucléotides cibles des polynucléotides leurres comme indiqué ci-dessus. Le nombre de polynucléotides de reconnaissance dépend notamment de la complexité du marquage souhaitée. Les polynucléotides de reconnaissance peuvent être circulaires ou linéaires. Ils peuvent être de longueur(s) identique ou différente(s) les uns des autres et de longueur identique ou différente(s) de celles des polynucléotides cible(s) et leurres, par exemple, comme indiqué ci-dessus pour les polynucléotides cibles de 5 à 5000 bases, par exemple de 15 à 200, par exemple de 20 à 200, par exemple de 201 à 499, par exemple de 500 à 5000 bases, ou un mélange de ces longueurs.
Ainsi, dans le marquage de la présente invention, lesdits polynucléotides de la pluralité de polynucléotides peuvent être circulaires, linéaires, ou un mélange de polynucléotides circulaire et linéaires, par exemple avec une extrémité 3'OH libre et une extrémité 5' phosphate libre.
De manière préférée, la longueur des polynucléotides du marquage de la présente invention est de 5 à 5000 nucléotides, par exemple de 5 à 100 nucléotides, par exemple de 5 à 50 nucléotides, par exemple de 20 à 50 nucléotides.
Selon l'invention, lesdits polynucléotides de la pluralité de polynucléotides sont des polynucléotides simples brins. En effet, une des particularités de la présente invention est que l'utilisation de simples brins permet de rendre plus difficile encore le décryptage du marquage de la présente invention.
Le procédé de marquage de la présente invention permet donc de fabriquer un nombre très important de marqueur. Chaque marqueur comporte un code constitué du ou des polynucléotide(s) cible(s), et le cas échéant, des polynucléotides de reconnaissance.
Les séquences des polynucléotides du marqueur de la présente invention peuvent être créées de manière empirique ou, de préférence, notamment pour une question de rapidité, par un logiciel approprié qui peut être généré à cette fin. Dans ce dernier cas, il s'agit d'une conception informatique ou « Design In Silico » du marqueur de la présente invention.
Pour la détermination des séquences des polynucléotides cibles et leurres, et, le cas échéant de reconnaissance, du marqueur de la présente invention, on peut par exemple utiliser les algorithmes suivants :
- (0) Création d'un ensemble E qui contient l'ensemble des polynucléotides générés pour le marquage. - (1) Génération aléatoire d'un premier polynucléotide p, dont la taille ainsi le nombre de nucléotides peuvent être définis par l'utilisateur, p n'appartenant pas déjà à E.
- (2) Calcul du score d'hybridation selon l'algorithme de Smith et Waterman [2] entre : le polynucléotide résultant de la concaténation de deux polynucléotides p, d'une part, et chaque polynucléotide résultant de la concaténation de deux polynucléotides choisis dans l'ensemble des polynucléotides de E ainsi que leur complémentaire inversé d'autre part.
- (3) Si l'ensemble des scores ne dépasse pas un seuil donné par l'utilisateur, ajout de p dans E. Retour à l'étape (1) tant que E n'est pas de taille voulue. Ce seuil est un score d'alignement minimal au-dessus duquel deux séquences sont considérées comme suffisamment identiques pour s'hybrider entre elles.
Une fois les séquences des polynucléotides cibles et leurres déterminées, ces polynucléotides cibles et leurres peuvent être fabriqués, et ce par tout procédé existant connu de l'homme du métier. Un ou plusieurs protocole(s) peut (peuvent) être utilisé(s) suivant la nature des polynucléotides fabriqués et suivant le marquage choisi : synthèse d'acides ribonucléiques et/ou désoxyribonucléiques simple brin, circulaires et/ou linéaires, d'une taille pouvant varier par exemple de 5 bases à 5000 bases. On peut citer à titre d'exemple de protocoles utilisables pour mettre en œuvre la présente invention ceux permettant de synthétiser des polynucléotides circulaires simples brins [3] ou les protocoles de synthèse in silico de polynucléotides [4]. Lorsque des séquences des polynucléotides de reconnaissance sont souhaitées pour le marquage, leurs séquences respectives peuvent être déterminées de manière empirique, ou en utilisant un algorithme tel que décrit précédemment, de telle sorte que les polynucléotides de reconnaissance ne s'hybrident pas entre eux, ni avec les polynucléotides cible, ni avec les polynucléotides leurres.
Le marquage d'une solution ou d'un composé à l'aide de marqueurs d'acide ribonucléique ou d'acide désoxyribonucléique selon le procédé de l'invention peut se faire de différentes façons suivant la complexité de marquage souhaitée. Chaque polynucléotide cible porte une information spécifique, inhérente à sa séquence. Chaque polynucléotide cible ou combinaison de polynucléotide cible peut être utilisée de façon unique. Le premier niveau de codage possible peut être celui consistant à utiliser un ou plusieurs polynucléotides cibles. Plusieurs lots de produits marqués peuvent alors être tracés par un ou plusieurs polynucléotide(s) de taille(s) définie(s), et de séquence(s) déterminée(s) mais différentes les unes des autres. Le second niveau de codage possible est l'utilisation de plusieurs polynucléotides cibles, choisis dans un pool initial de polynucléotides cibles. Le code ne provient alors plus de chaque séquence de polynucléotide cible mais dans la combinaison des polynucléotides cibles retrouvés dans un produit. Ainsi, selon l'invention, un produit marqué peut être marqué par n polynucléotides cibles choisis parmi une possibilité de N polynucléotides différents, n étant compris dans l'intervalle [0 ; N].
Dans tous les cas, le marquage de la présente invention peut être complété par un troisième niveau de codage, consistant à utiliser des polynucléotides de reconnaissance, indiquant alors, au moyen d'une base de reconnaissance des cibles, quels marqueurs parmi les polynucléotides cibles susceptibles d'être utilisés par le fabriquant et qui peuvent être de nature et de concentration différente, sont présents si le produit est authentique et marqué avec le procédé de la présente invention.
Selon l'invention, chaque étape du procédé de marquage des produits peut faire l'objet d'une traçabilité spécifique. Cette traçabilité peut être assurée par introduction de données spécifiques à chaque étape dans une ou plusieurs bases de données confidentielles.
Ainsi, selon l'invention, chaque lot de marqueurs ou combinaison de marqueurs peut par exemple être identifié par un identifiant alphanumérique. Cet identifiant peut apparaître sur le produit ou par tout autre mode de représentation optique : par exemple code barre, datamatrix, etc., par exemple sur le contenant du lot de marqueurs. Cet identifiant peut également servir d'index dans une première base de données où sont stockées les informations sur le lot de marqueurs, par exemple : séquence de chacun des marqueurs composant le lot, proportions respectives des quantités de chaque marqueur, date de fabrication, etc.
Chaque contenant de lot de marqueurs, suivi au moyen de son identifiant, peut être rattaché dans une base de données par exemple à la référence de la commande d'un client et aux références de livraison de ce contenant au dit client. Une confirmation de réception de la part du client peut également être introduite dans cette base de données.
Les acides nucléiques n'altèrent en rien les propriétés physicochimiques des produits marqués. En outre, les acides nucléiques n'ont aucun effet sur leur contenant, c'est-à-dire le produit marqué. Enfin, les acides nucléiques se sont montrés très stables dans les nombreux tests réalisés par les inventeurs. Cette propriété de stabilité est démontrée dans les exemples présentés ci-dessous.
De manière non exhaustive, les marqueurs d'ADN et d'ARN simple brin compris dans la présente invention peuvent être inclus dans un très large panel de produits et substances susceptibles d'être victimes de reproduction illégale (contrefaçon), abusives, victimes de trafics sur un marché parallèle et/ou dont il est nécessaire de suivre la piste (traçage des produits).
Le procédé de l'invention s'applique au marquage de tout produit industriel ou de consommation, liquides, semi liquides ou solides. On peut citer par exemple, sans que cette liste soit limitative : les parfums, les cosmétiques, les produits pour l'hygiène, les produits alimentaires, les arômes, les extraits de plante(s), le tabac, les boissons, les textiles, les cuirs, les médicaments, les poudres, les vernis, les encres, les peintures, les produits et composés chimiques, et plus généralement tous les biens et produits susceptibles d'être contrefaits.
L'invention peut s'appliquer à tout une gamme de produits de l'industrie du luxe et de la cosmétique : parfums, eaux de parfums, eaux de toilettes, huiles essentielles, crèmes, masques, pommades, etc. Dans les domaines des produits industriels et de consommation, l'invention peut aussi servir à tracer diverses substances telles que les encres, les résines, les vernis, les peintures, les colorants, les additifs, les arômes, les colles, les poudres.
Dans le domaine alimentaire, la présente invention trouve une application aux produits de luxe pouvant être cibles de contrefaçon ou de tricheries (mélanges), tels que notamment les liqueurs, spiritueux, grands crus, ou encore tout produit dont il est important de s'assurer de l'authenticité pour des raisons de sécurité par exemple.
Les marqueurs peuvent également être utilisés dans l'industrie pharmaceutique pour marquer et tracer des médicaments et autres drogues.
L'invention peut également être utilisée dans le traçage des échantillons biologiques dans un contexte hospitalier. Il peut s'agir par exemple de mettre en œuvre un protocole de traçabilité des échantillons sanguins dans un laboratoire de biochimie, des échantillons tumoraux dans un laboratoire d'anatomopathologie, ou en vue de constituer une banque de matériel humain directement authentifiée qui puisse être conservée et tracée durant de longues années dans un centre de ressources biologiques.
D'une manière générale, les produits peuvent être marqués, soit en tant que tels, soit en tant que composant d'un produit. Par exemple, un document en papier peut être marqué par le biais de l'encre utilisée qui est été préalablement marquée.
Selon l'invention, l'étape d'addition du marqueur de la présente invention peut être réalisée par tout moyen approprié permettant d'ajouter au produit à marquer les polynucléotides constituant le marqueur de la présente invention. Les produits ou substances à marquer peuvent être marqués dans la masse, en y incorporant les marqueurs dont la concentration finale est étudiée et prévue ou en surface du produit. Les marqueurs sont des polymères d'acides ribo ou désoxyribonucléiques ayant les propriétés physicochimiques découlant de leur nature : ce sont des molécules hydrophiles et chargées négativement. Selon la nature du produit à marquer, ils peuvent être pré-dilués ou ajoutés directement dans le produit. Ils peuvent également être encapsulés. Ils peuvent encore être déposés ou incorporés à la surface du produit. Cette addition du marqueur de la présente invention au produit peut être réalisée par addition de ladite pluralité de polynucléotides dans ledit produit lors de sa fabrication et/ou dans ou sur (c'est à dire à la surface) le produit fini. La présente invention se rapporte donc également à un produit marqué susceptible d'être obtenu par le procédé de marquage selon l'invention.
Selon l'invention, lorsque l'addition du marqueur est réalisée à la surface du produit à marquer, elle peut être réalisée par exemple par trempage du produit fini dans une solution comprenant ledit marqueur ou par pulvérisation ou vaporisation d'une telle solution sur le produit fini. De préférence, la solution est un solvant protique tel que l'éthanol, le méthanol ou le Diéthylèneglycol, ou un solvant aprotique polaire tel que l'acétone ou le tétrahydrofurane. Ce mode d'addition convient par exemple pour des produits solides après leur fabrication tels que des tissus, du cuir, bois, papiers, cartons, tabac, cigarettes, cigares, etc.
L'addition peut également être réalisée lors de la fabrication du produit, par mélange dudit marqueur avec les composés ou composants constituant le produit. Cette introduction de la pluralité de polynucléotides peut être réalisée sur ou dans un composant dudit produit. Ce type d'addition convient pour tout produit ou substance dont la fabrication passe par une phase liquide ou semi liquide dans laquelle les marqueurs peuvent être incorporés. Ce peut être le cas par exemple pour le marquage dans la masse d'un produit cosmétique ou d'un médicament.
Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, une étape d'encapsulation de ladite pluralité de polynucléotides dans des vecteurs lipidiques peut être réalisée préalablement à l'étape d'addition. Cette étape d'encapsulation permet de maintenir les polynucléotides dans un milieu favorable, ou de faciliter leur future extraction. On peut utiliser par exemple comme produit d'encapsulation, un produit choisi dans le groupe comprenant un vecteur de nature lipidique cationique, tel que le bromure de dioléoxyloxy-propyl-triméthylammonium (DOTMA) et la dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), ou les complexes de polynucléotides avec des molécules comme la polylysine, la protamine, ou le polyéthylèneimine (PEI) appelés polyplexes. On peut par exemple utiliser pour cela la technique décrite dans Bioch. Biophys. Acta 1280:1. [5] , J. Biol. Chem. 269:2550 [6] ou AAPS PharmSci. 2001 ;3(3):E21 [7].
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, une étape d'encapsulation et/ou de protection de ladite pluralité de polynucléotides dans des vecteurs lipidiques ou autre peut être réalisée préalablement à l'étape d'addition. Cette étape permet en outre d'assurer la stabilité et/ou faciliter son recouvrement. Dans la présente par « protection », il est entendu la protection des polynucléotides de la présente invention, en particulier de toute attaque physico-chimique provenant du milieu dans lequel se trouve la signature de la présente invention (parfum, aliment) par exemple dans des polymères chargés on des nanotubes de carbone.
Quel que soit le mode d'addition choisi, le marqueur de la présente invention est de préférence ajouté dans le produit pour son marquage à de très petites concentrations allant du micro-molaire au femto-molaire. Selon la technique de détection envisagée, existante ou à venir, et la taille des marqueurs, ceux-ci sont ajoutés à une concentration finale variable, les concentrations respectives de chaque polynucléotide cible du premier ensemble pouvant être différentes et composer un sous- ensemble codant. Selon l'invention, la concentration de la pluralité de polynucléotides après son addition dans ledit produit peut être, mais sans y être limitée, de 10"6 moles à 10~18 moles/dm3. Cette quantité par volume est indiquée pour un volume liquide ou solide. Pour un liquide, cela correspond à la quantité de marqueurs mélangés au produit par unité de volume. Pour un solide, cela correspond à la quantité de marqueurs mélangés dans le produit par unité de volume ou déposés à la surface du produit. Ramenée à la surface du produit, cette quantité peut également être définie par unité de surface, soit 10"6 moles à 10"18 moles/dm2. Ces concentrations peuvent être obtenues par dilution d'une solution plus concentrée. La solution peut être telle que définie ci-dessus.
La présente invention se rapporte également à un procédé de détection du marquage d'un produit susceptible d'être obtenu par le procédé marquage de l'invention, ledit procédé comprenant une étape d'analyse de la pluralité de polynucléotides permettant de détecter spécifiquement le, au moins un, polynucléotide cible. L'invention fournit d'ailleurs plusieurs procédés de détection de marqueurs de la présente invention. La détection peut être réalisée hors laboratoire ou en laboratoire, par exemple au moyen d'un système portatif, par exemple au moyen d'une puce à ADN spécialement conçue pour la détection des polynucléotides cibles du marqueur de la présente invention.
Selon l'invention, l'étape d'analyse peut être réalisée par exemple par immunodétection. Selon l'invention, l'étape d'analyse peut comprendre par exemple une étape de séquençage des polynucléotides codants. Selon l'invention, l'étape d'analyse peut comprendre par exemple une rétro-transcription de l'acide ribonucléique en acide désoxyribonucléique, en particulier lorsque les polynucléotides cibles sont de l'acide ribonucléique. Selon l'invention l'étape d'analyse peut comprendre une détection colorimétrique ou luminescente, ou fluorimétrique, couplée à une hybridation spécifique. En d'autres termes, l'étape d'analyse peut utiliser un moyen spécifique de détection des polynucléotides cibles. Selon l'invention, la technique d'analyse utilisée peut mettre en oeuvre les propriétés physico-chimiques, le code et la spécificité du marqueur. Il peut s'agir par exemple d'une technique de dosage en sandwich, une technique de détection à l'aide de puces à ADN, ou tout autre technique connue de l'homme du métier permettant de révéler la présence de polynucléotides et/ou les identifier.
Dans un mode particulier de l'invention, des polynucléotides cibles et leurres peuvent être des polynucléotides de petite taille, c'est à dire de 8 à 30 nucléotides/nucléosides et simple brins. Suivant ce mode de réalisation et de manière avantageuse, ces polynucléotides de par leur nature, ne peuvent pas être utilisés en tant que brin matrice pour pouvoir être amplifiés et détectés par des techniques d'amplification exponentielles telles que les réactions de polymérisations en chaînes ( « PCR », Polymerase Chain Reaction). Ainsi, leur détection par amplification PCR est impossible. Dans ce mode de réalisation, la détection des polynucléotides peut être réalisée par des procédés d'hybridation et de révélation directe sans amplification est réalisable uniquement par l'utilisateur qui connaît la signature utilisée. Aussi le contrefacteur qui tenterait d'extraire, amplifier et reproduire la pluralité de polynucléotides présente dans le produit marqué sera tenu en échec. De plus et de manière avantageuse, les procédés de révélation ne comprenant que des étapes d'hybridation et de révélation de cette hybridation peuvent être mis en œuvre beaucoup plus rapidement (une réaction de polymérisation en chaîne demande plusieurs heures, alors que l'hybridation simple de polynucléotides se fait de manière quasi instantanée) dans la mesure où la détection est spécifique aux polynucléotides à révéler.
Selon l'invention, la technique d'analyse utilisée peut se baser sur les propriétés physico chimiques, le code et la spécificité du marqueur. Elle peut comprendre une amplification des polynucléotides cibles, exponentielle ou linéaire, toute autre technique peut être utilisée pour révéler la présence des marqueurs. En d'autres termes, l'étape d'analyse peut comprendre une étape d'extension linéaire des polynucléotides cibles.
Le procédé de l'invention peut comprendre en outre les étapes suivantes, avant l'étape d'analyse : (a) prélèvement d'un échantillon du produit ; et
(b) extraction de la pluralité de polynucléotides dudit échantillon.
Il s'agit là d'un moyen permettant de mettre en œuvre de la détection du marquage de la présente invention par prélèvement d'un échantillon du produit. Après avoir été extrait, la présence des marqueurs peut être analysée comme indiquée ci-dessus.
Selon l'invention, l'étape d'extraction (b) peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier pour extraire les polynucléotides d'un échantillon. Les polynucléotides peuvent être extraits suivant un protocole dépendant de la nature du produit marqué. Tout type de technique d'extraction d'acide ribonucléique ou désoxyribonucléique existante ou à venir, peut être utilisée afin d'extraire les polynucléotides de la masse du produit marqué. Il peut s'agir par exemple d'une extraction au phénol chloroforme. Des techniques d'extraction utilisables dans la présente invention sont par exemple décrites dans Molecular Cloning.Maniatis, CoId Spring-Harbor, 2ème édition, pp E3 à E4 [8].
Les méthodes d'analyse des produits marqués peuvent donc consister à extraire les polynucléotides de ces produits, à détecter le code porté par les polynucléotides de reconnaissance, à se référer à la base de données de reconnaissance des polynucléotides cibles, à décrypter ainsi le code porté par les polynucléotides de reconnaissance, puis à exploiter cette information afin de retrouver les polynucléotides cibles parmi la pluralité de polynucléotides cibles, incluant les polynucléotides leurres, puis à détecter la présence des polynucléotides cibles, qui est caractéristiques du produit marqué (en cas de détection du marquage) ou de conclure à un produit contrefait (en cas d'absence des polynucléotides cibles, ou de marquage non conforme à la base de données cibles/produits).
Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, la détection spécifique de l'étape d'analyse peut comprendre par exemple les étapes successives suivantes :
(i) mettre en contact la pluralité de polynucléotides avec un support solide sur lequel des séquences sondes sont fixées, ces séquences sondes étant complémentaires à une des extrémités dudit, au moins un, polynucléotide cible de la pluralité de polynucléotides du marquage du produit, la mise en contact permettant aux polynucléotides cibles de se fixer sur le support par hybridation avec les séquences complémentaires sondes fixées sur le support ;
(ii) éliminer les polynucléotides non hybrides par l'étape (i); et (iii) détecter la présence sur le support des polynucléotides cibles. Dans la présente invention, la détection effectuée à l'étape (iii) peut être réalisée par un moyen spécifique adapté, par exemple il peut s'agir de par exemple il peut s'agir d'une détection utilisant une molécule fluorescente, ou une détection utilisant une molécule luminescente, ou une détection utilisant une enzyme dont le produit de réaction peut être coloré, ou une détection utilisant une enzyme dont la réaction catalysée est exothermique, ou une détection utilisant une enzyme dont la réaction catalysée libère de la lumière, ou une détection à l'aide d'une protéine spécifique des polynucléotides cibles, comme par exemple un anticorps, une enzyme.
Selon un mode particulier de réalisation, la détection spécifique peut comprendre en outre entre les étapes (i) et (ii), une étape de captation de la pluralité de polynucléotides sur un support, par au moins un système de capture spécifique du ou des polynucléotide(s) cible(s), système sur lequel se fixe, le au moins un, polynucléotide cible de la pluralité de polynucléotides du marquage du produit.
Lorsque le marquage selon l'invention comprend des polynucléotides de reconnaissance, le procédé de ce mode particulier de réalisation peut comprendre en outre, avant l'étape (i), une étape (x) d'identification de ces polynucléotides de reconnaissance et une étape (y) de choix d'un support solide, en fonction des polynucléotides de reconnaissance identifiés, support solide choisi car il comporte les séquences sondes complémentaires des séquences cibles identifiées grâce aux polynucléotides de reconnaissance. Ce procédé de détection peut avantageusement être utilisé avec un marqueur selon l'invention qui comprend des polynucléotides cibles ayant une extrémité constante et une extrémité variable. Ces polynucléotides cibles sont définis ci-dessus. Selon l'invention, les polynucléotides complémentaires aux polynucléotides cibles, appelés séquences sondes, peuvent être fixés sur le support solide par tout moyen connu de l'homme du métier. Ces techniques de détection sur support et les types de supports utilisables dans la présente invention sont par exemple celles décrites dans Molecular Cloning, Maniatis, CoId Spring- Harbor, 2ème édition pp 9.47 à 9.57 [9]. Par exemple, la fixation des séquences sondes sur le support peut être réalisée au moyen d'une liaison biotine/streptavidine, la sonde étant couplée à une molécule de biotine et le support présentant des molécules de streptavidine. Par exemple, la fixation des séquences sondes peut également être réalisée par formation de liaison covalente à une membrane de nylon chargée, ladite membrane formant le support solide. Ces techniques, utilisables dans la présente invention, sont par exemple celles décrites dans les publications [10], [11] et [12]. En d'autres termes, les polynucléotides complémentaires aux polynucléotides cibles sont des exemples de systèmes de capture spécifique de la ou des polynucléotides(s) cibles recherchée(s). Selon l'invention, les polynucléotides cibles fixés sur le support par hybridation aux séquences sondes peuvent être détectés par tout moyen approprié connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'une détection au moyen de polynucléotides marqués par un agent de marquage et complémentaires à l'autre extrémité des polynucléotides cibles, l'agent de marquage pouvant être choisi dans le groupe comprenant un fluorochrome, une particule d'or colloïdal et une enzyme.
Ce mode de détection sur support solide permet une détection facilitée, reproductible et immédiate du marqueur de la présente invention. Il peut avantageusement être utilisé dans la présente invention. Le procédé de détection de l'invention peut comprendre en outre une étape de comparaison des résultats de l'étape d'analyse des polynucléotides cibles avec le contenu d'une base de données qui permet d'identifier les polynucléotides cibles, et d'analyse des polynucléotides cibles qui permet d'identifier et d'authentifier ledit produit, et qui peut également permettre de déterminer l'origine dudit produit. En d'autres termes, la base de données et le décryptage du code porté par les polynucléotides codants permettent d'identifier une contrefaçon d'un produit original.
C'est en retrouvant par la technique d'analyse utilisée les polynucléotides cibles contenus dans un produit marqué que l'information relative à ce produit peut être retrouvée. L'absence des polynucléotides cibles qui devraient être présents dans un produit testé indique une possible contrefaçon du produit. La révélation de plusieurs marqueurs différents selon l'invention ou de polynucléotides de reconnaissance dans un même produit peut indiquer que celui-ci est le résultat d'un mélange initial anormal.
Au cours de ses étapes de fabrication du produit à marquer, le fabricant utilisateur d'un marqueur conforme à la présente invention peut associer à l'identifiant du contenant de lot de marqueurs des références relatives par exemple à un lot de production marqué à l'aide de ce lot de marqueurs. Cette association peut se faire par exemple dans une base de données identique ou séparée des bases de données précédentes. Les informations insérées dans cette base de données et relatives au lot de production sont de préférence suffisantes, en fonction du système d'information en œuvre chez cet utilisateur, pour permettre de tracer ce lot de façon non équivoque.
Lorsqu'un échantillon de produit soupçonné de contrefaçon est analysé, la révélation des séquences polynucléotidiques identifiées peut être comparée avec les données introduites dans les bases de données lors de la production et la livraison de marqueurs. La contrefaçon est par exemple caractérisée si aucun marqueur n'est identifié. La contrefaçon peut également être mise en évidence si au moins un marqueur figurant dans le lot de marqueurs ayant été en partie révélé et dont la composition précise a été obtenue par interrogation de la base de donnée est manquant. La contrefaçon peut encore être caractérisée si l'intégralité des marqueurs est présente devant figurer dans le lot de marqueurs, mais que la marchandise testée ne provient pas du fabricant ayant pris livraison du lot de marqueurs qui vient d'être révélé.
Dans le cas de détournement de canaux de distribution ou de parallélisme, les produits sont authentiques et les lots de marqueurs révélés correspondent effectivement à des lots de marqueurs livrés au fabricant du produit testé. Le procédé de l'invention permet d'obtenir par requête dans la base de donnée de fabrication des marqueurs de l'identifiant du lot de marqueurs. Dans la mesure où son système de traçabilité le permet, cet identifiant permet avantageusement au fabricant de comparer l'affectation théorique du lot de production marqué à un de ses clients de l'affectation réelle constatée lors de la prise d'échantillon de produit soupçonné de parallélisme. Si l'affectation théorique des produits ne correspond pas à l'affectation réelle, il peut y avoir détournement de canal de distribution.
D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif.
Brève description des figures
- La figure 1 annexée représente un site de coupure de NbBpuiOI.
- La figure 2 représente un adressage des sondes sur la puce.
- La figure 3 représente des spectres d'émission et d'absorption du Cy5.
- La figure 4 annexée représente une méthode de détection des marqueurs selon la présente invention sur un support : Les marqueurs M1 et M2 sont présents dans un mélange. Ils font « pont » entre la sonde fixée sur la puce, et les sondes Universelles : le signal (fluorescence du Cy5) est alors détecté. - La figure 5 annexée présente une révélation des marqueurs avec la station NanoChip (marque déposée) (Nanogen Inc.).
- La figure 6 annexée présente un principe du marquage couplé.
- La figure 8 annexée représente un schéma de détection d'un marquage selon l'invention et d'authentification d'un produit marqué selon l'invention.
EXEMPLES
Exemple 1 : fabrication d'un marquage selon le procédé de l'invention et marquage d'un produit
Dans cet exemple, les polynucléotides cibles et leurres utilisés sont des séquences simple brin d'acide désoxyribonucléique d'une taille de 28 nucléotides. Le polynucléotide codant est une séquence d'ADN circularisée, d'une taille de 4,3 kilo bases (kb).
Le produit marqué est une solution parfumée : parfum J'Adore (marque déposée, Parfums Christian Dior).
Trois marquages sont réalisés, illustrant trois cas de figures possibles lors du procédé d'authentification : un exemple où le produit est authentifié, ainsi que deux exemples où le produit n'est pas authentifié.
LA. Mise au point des marqueurs cibles et des polynucléotides leurres
1. a.1 Principe
Dix polynucléotides d'acide désoxyribonucléique simple brin sont générés de la manière suivante : Les dix nucléotides en 5' sont tous identiques, définis par l'utilisateur. Il s'agit de la séquence GCAACTCCAG. Les dix-huit nucléotides en 3' sont alors générés à l'aide de l'algorithme présenté dans la section « Exposé de l'invention », en utilisant les paramètres suivants : une longueur de mots égale à 18 nucléotides, cinq nucléotides G, cinq nucléotides C, quatre nucléotides A et quatre nucléotides T.
Chaque nouveau polynucléotide est alors généré de manière aléatoire, de façon à ce qu'il contienne ce nombre déterminé de chacune des bases. Un score d'alignement entre ce nouveau polynucléotide et l'ensemble des polynucléotides déjà validés, ainsi que les polynucléotides résultants de la concaténation de chacun des polynucléotides deux à deux de cet ensemble, cette étape n'ayant pas lieu d'être si il s'agit du premier polynucléotide.est calculé selon l'algorithme de Smith et Waterman, avec les paramètres suivants :
- Score d'un match AT : 1
- Score d'un match GC : 1 ,5
- Pénalité de mismatch : -3 - Pénalité de Gap : -2
Le score minimal sélectionné est de 3, ce qui signifie que si le nouveau polynucléotide s'aligne avec un polynucléotide de l'ensemble, ou une concaténation de deux polynucléotides de l'ensemble avec un score supérieur à 3, il est écarté. Sinon, il est validé puis ajouté à l'ensemble des polynucléotides. Cette étape est répétée jusqu'à l'obtention de dix polynucléotides.
Le tableau 1.1 présente la liste de ces marqueurs.
Tableau 1.1 : Séquences des marqueurs
Primer- 1 : 51-GCAACTCCAGGCACTCCATGAGTCATGG-3I (SEQ ID NO::1)
Primer-2 : 5'-GCAACTCCAGGTGGCGACTCATACGTCA-31 (SEQ ID NO::2) Primer-3 : 5I-GCAACTCCAGCTCAGGGGGACTCTATCA-31
(SEQ ID NO::3)
Primer-4 : 5I-GCAACTCCAGGCTCTAGGGCAAGTCTCA-3I
(SEQ ID NO::4)
Primer-5 : 5'-GCAACTCCAGGCAGACTCTGGATCTCAG-31
(SEQ ID NO::5)
Primer-6 : 51-GCAACTCCAGGCAGCATGAGGTCTCATC-3I
(SEQ ID NO::6)
Primer-7 : 5I-GCAACTCCAGGCAGCAGGAGTCTCATTC-31
(SEQ ID NO::7)
Primer-8 : 51-GCAACTCCAGGGTGGCTCAGCAATACTC-31
(SEQ ID NO::8)
Primer-9 : 5I-GCAACTCCAGCTCAGGGCAGTGATCTCA-3I
(SEQ ID NO::9)
Primer-10 : 5'-GCAACTCCAGGGGGGCACACATTCTATC-3I
(SEQ ID NO::10)
Les cinq premiers polynucléotides (Primer-1 à Primer-5) sont considérés comme polynucléotides cibles. Les cinq derniers (Primer-6 à
Primer-10) sont considérés comme polynucléotides leurres. Ces marqueurs sont alors injectés à une concentration finale de 10-12 moles par dm3 dans le parfum, en même temps que le marqueur codant.
1.a.2 Matériels
- Polynucléotides de synthèse (Eurofins MWG GmbH), 100 pmoles/μL - H2O déionisée, sans nucléase
1.a.3 Méthodes Les dix polynucléotides sont mélangés dans trois solutions de pré marquage, dilués dans de l'eau déionisée, sans nucléase, à une concentration finale de 10~9 moles de marqueurs par litre, par marqueur (soit 5.109 moles/L de marqueurs totaux). Pour chaque solution, chaque marqueur est pré-dilué deux fois au 1/100 dans de l'eau sans nucléase (1 μl_ à l'aide d'une pipette P10, dans 99 μl_ à l'aide d'une pipette P100) soit une dilution intermédiaire au 1/10000. Ensuite, 10 μL de chaque solution intermédiaire sont ajoutés dans un tube de 1 ,5 ml_ (Eppendorf, marque déposée), puis le mélange est complété à 100 μL par ajout de 50 μL d'eau (à l'aide d'une pipette P100). Le tableau 1.2 présente les trois solutions de pré marquage (A, B, C) contenant chacune une combinaison de cinq polynucléotides cibles sélectionnés parmi dix possibles, cibles ou leurres.
Tableau 1.2 : Combinaisons de marqueurs
Figure imgf000036_0001
I. B. Mise au point des polynucléotides codants
1. b.1 Principe Le polynucléotide codant est une séquence d'acide nucléique simple brin, circulaire, d'une longueur égale à 4,3 kilo bases (kb). Il est, pour l'exemple, synthétisé à partir d'un plasmide pBR322. Ce polynucléotide contient en son sein, une séquence spécifique suite de nucléotides (A, T, G, C), connue de l'utilisateur de l'invention. Elle constitue un code unique, qui permet par la suite à l'utilisateur, de savoir quelle combinaison de marqueurs cibles est en théorie présente dans le produit marqué.
Dans cet exemple, la séquence codante est une portion de 20 nucléotides, située exactement à 50 bases en amont (côté 5') d'une séquence connue et universelle qui reste constante quelque soit la séquence codante, et dont la séquence est : 5'-CTGTAAGCGGATGCC-3' (SEQ ID NO: 11). L'utilisateur dispose d'une table associative qui lui permet de faire le lien entre la séquence codante du polynucléotide codant, et la combinaison de polynucléotides cible attendue dans le produit marqué.
Figure imgf000037_0001
Le plasmide est d'abord digéré par l'enzyme de restriction Nb.BpuiOI , qui coupe un seul brin de la molécule d'ADN, reconnaissant le site de restriction représenté sur la figure 1 : site de coupure de NbBpuiOI.
Le polynucléotide est alors digéré une seconde fois par l'exonucléase III, libérant les nucléotides à partir de l'extrémité 3' hydroxyle libre du brin coupé par Nb.BpuiOI, Le brin qui n'a pas été digéré par Nb.BpuiOI est alors épargné, car circulaire. 1. b.2 Matériels
- Plasmide pBR322, Invitrogen (marque déposée)
- Nb.BpuiOI (20 U) référence : Fermentas, #ER1681
- Tampon R 10 X (tampon Nb.BpuiOI) référence #BR5, (Fermentas) - Exonucléase III (1200 U) référence #EN0191, (Fermentas)
- Tampon de réaction pour Exonucléase III ; référence #EN0191 , (Fermentas)
- Phénol UltraPure (marque de commerce) Buffer-Saturated Phénol,
Invitrogen. - Chloroforme/alcool isoamylique (24:1)
- Acétate de sodium 3M
- Ethanol glacé 95%, 75%
- Eau déionisée, sans nucléases.
1. b.3 Méthodes
• Digestion
Dans un tube de 1 ,5 mL (Eppendorf, marque déposée), ajouter le plasmide (5 μg soit 20 μl_), le tampon de réaction dix fois concentré (40 μl_) à l'aide d'une pipette P100 (Gilson Pipetman, marque déposée) l'eau (339 μl_) à l'aide d'une pipette P1000 (Gilson Pipetman, marque déposée) ainsi que l'enzyme (1 μl_) à l'aide d'une pipette P10 (Gilson Pipetman, marque déposée).
Tableau 1.3 : digestion de pBR322
Figure imgf000038_0001
Vortexer à l'aide d'un vortex VTX-400 (Labo Moderne) puis incuber le tube 1 heure à 37 0C. Extraire l'ADN au phénol chloroforme selon le protocole suivant :
- Ajouter dans le tube ΛA volume de phénol (200 μl_) et ΛA volume de chloroforme (200 μl_) à l'aide d'une pipette P200 (Gilson
Pipetman, marque déposée), puis vortexer 10 secondes. Centrifuger 5 minutes à 10 000 rcf (dans une centrifugeuse à tubes 1 ,5 ml_ « Centrifuge 5415 R », Eppendorf, marque déposée). - Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube de 1 ,5 ml_
(Eppendorf, marque déposée), et ajouter 1 volume (400 μl_) de chloroforme. Vortexer et centrifuger 5 minutes à 10 000 rcf. Répéter cette étape 5 fois.
- Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube de 1 ,5 ml_, puis ajouter 1/10 de volume d'acétate de sodium 3M (40 μl_, à l'aide d'une P20) et 2,5 volumes (1000 μl_ à l'aide d'une P1000) d'éthanol glacé. Mixer puis incuber 1 heure à -20 0C - Centrifuger 10 minutes à 10 000 rcf. Jeter le surnageant et laver délicatement le culot avec 200 μL d'éthanol glacé à 75 %. Sécher ensuite le culot à l'air libre. Le reprendre dans 50 μL (à l'aide d'une pipette P100) d'eau déionisée sans nucléases.
• Traitement à l'Exonucléase Dans un tube de 1,5 mL (Eppendorf) contenant les 50 μL d'extrait, ajouter à l'aide de pipettes P100, P20 et P200 les réactifs selon le tableau 1. 4.
Tableau 1.4 : Linéarisation de pBR322
Figure imgf000039_0001
- Mélanger le tube, puis incuber 10 minutes à 30 0C. Arrêter la réaction en chauffant 10 minutes à 70 0C.
- Extraire l'ADN au phénol Chloroforme comme décrit dans l'étape 1.b.3, précipiter l'ADN comme décrit dans l'étape 1.b.3 puis reprendre les polynucléotides dans 20 μl_ d'eau déminéralisée sans nucléase.
Les marqueurs repris dans 20 μL sont dosés à l'aide d'un spectrophotomètre Nanodrop (Marque déposée). La concentration est alors ramenée à 10-9 mol/L en ajoutant un volume adéquat d'eau déminéralisée sans nucléase à l'aide d'une P10.
I. C. Marquage des solutions
Trois solutions parfumées J'Adore (marque déposée, Parfums Christian Dior) sont alors marquées. Les polynucléotides sont injectés dans la masse des produits, à une concentration finale de 10~12 M pour les polynucléotides cibles et leurres, et 10'12 M pour les polynucléotides codants.
La première solution est marquée avec la solution de pré- marquage A, contenant les polynucléotides cibles 1 et 2 ainsi que les polynucléotides leurres 8, 9, 10 et le polynucléotide codant. Cette solution correspond à un marquage normal, où le polynucléotide codant est présent, et ou la combinaison des polynucléotides cibles présents correspondent effectivement à l'information que porte le polynucléotide codant.
La seconde solution est marquée avec la solution de prémarquage B, contenant les polynucléotides cibles 3, 4 et 5, ainsi que les polynucléotides leurres 6 et 7 et le polynucléotide codant. Cette solution fait exemple de marquage incohérent : bien que le polynucléotide codant est présent, la combinaison de polynucléotides cibles ne correspond pas à l'information qu'il contient. La troisième solution est marquée avec la solution de prémarquage C, contenant les polynucléotides cibles 1 , 2, 3, 4 et 5, aucun polynucléotide leurre, et aucun polynucléotide codant. Cette solution fait également exemple de marquage incohérent : d'une part elle ne comprend pas de polynucléotides codants, et d'autre part bien qu'elle présente les polynucléotides cibles 1 et 2 du marquage normal, elle contient d'autres polynucléotides non attendus.
Après marquage, les solutions sont stockées à température ambiante ou à 4°C.
I. D. Extraction des polynucléotides
Avant de commencer l'identification des polynucléotides codant et cibles, il est conseillé d'extraire les marqueurs du milieu alcoolique que constitue le produit marqué (parfum).
1. d.1 Principe
Les marqueurs sont extraits de leur milieu alcoolique (parfum), puis récupérés en milieu aqueux dans le but de pouvoir ensuite utiliser les techniques de biologie moléculaire d'identification. L'extraction doit donc de préférence non seulement avoir un bon rendement (récupérer un maximum de marqueurs, idéalement : rendement de 100 %), mais elle doit aussi de préférence débarrasser les marqueurs de toutes substances « polluantes » pouvant interférer avec les techniques de détection.
1. d.2 Matériels
- Phénol : UltraPure (marque de commerce) Buffer-Saturated Phénol,
Invitrogen.
- chloroforme/alcool isoamylique (24:1) - acétate de sodium 3M
- éthanol glacé 95% (Carlo Erba Rectapur), 75% - eau déionisée, sans nucléases
1. d.3 Méthodes
La technique utilisée est celle de l'extraction au phénol chloroforme. Pour l'exemple, les marqueurs sont extraits à partir de 500 μL de parfum marqué.
- Aux 500 μl_ de parfum marqué dans un tube de 2 ml_ (Eppendorf, marque déposée), ajouter V2 volumes de phénol soit 250 μl_ à l'aide d'une pipette P1000 (Gilson Pipetman, marque déposée), puis 1/4 volumes de chloroforme soit 250 μl_ à l'aide d'une P 1000
(Gilson Pipetman, marque déposée), et Vi volume d'eau soit 250 μl_ à l'aide d'une P1000 (Gilson Pipetman, marque déposée) puis vortexer 10 secondes. Centrifuger 5 minutes à 10 000 rcf (dans une centrifugeuse « Centrifuge 5415 R », Eppendorf, marque déposée).
- Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube de 2mL
(Eppendorf, marque déposée), et ajouter 1 volume de chloroforme. Vortexer et centrifuger 5 minutes à 10 000 rcf. Répéter cette étape 5 fois. - Transférer la phase aqueuse (au dessus) dans un nouveau tube, puis ajouter 1/10 de volume d'acétate de sodium 3M (soit 50 μl_ à l'aide d'une pipette P100) et 2,5 volumes d'éthanol glacé (soit 1250 μL, ajouté en deux fois à l'aide d'une P1000). Mixer puis incuber 1 heure à -20 0C. - Centrifuger 10 minutes à 10 000 rcf. Jeter le surnageant et laver délicatement le culot avec 200 μL d'éthanol glacé à 75 %. Sécher ensuite le culot. Le reprendre dans 20 μL d'eau déionisée, sans nucléase, à l'aide d'une pipette P20.
LE Détection des polynucléotides codants 1. e.1 Principe
L'information portée par les polynucléotides codants, relative aux polynucléotides cibles, est lue dans la séquence nucléotidique de ces premiers (par une technique de séquençage). Elle permet ensuite à l'utilisateur de l'invention, de connaître la nature exacte des polynucléotides cibles portant l'information d'authentification du produit en se reportant à la table associative présentée en 1.b.1.
1. e.2 Matériels
Amorce sens Universelle (Eurofins MWG GmbH), 100 pmoles/μL)
5'-GGCATCCGCTTACAG-3' (SEQ ID NO: 13)
BigDye (marque déposée) Terminator V3.1 (Applied
Biosystems)
Matrice : solution de polynucléotides extraits.
H2O déionisée sans nucléases.
1. e.3 Méthodes
La réaction de séquence est effectuée à partir de la solution de marqueurs extraits dans un tube de 200 μL (Eppendorf, marque déposée), selon le protocole exposé dans le tableau 1.5.
Tableau 1.5 : Réaction de séquence
Figure imgf000043_0001
Les réactions sont alors lancées sur un appareil GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystem) en respectant les cycles suivants :
- 96 0C r
- 96 0C 10" I
- 50 0C 5" I => 25 cycles
- 60 0C 4' I
Après purification sur colonne (Qiagen, marque déposée), les réactions sont alors séquencées sur un séquenceur 16 capillaires ABI3100 (Applied Biosystem). L'analyse des résultats permet alors à l'utilisateur de l'invention de lire les séquences nucléotidiques d'intérêt, et de faire la corrélation entre les séquences lues et les polynucléotides cibles théoriquement présents dans le produit marqué.
LF Détection des polynucléotides cibles.
1. f.1 Principes Un support (ou puce à ADN), est utilisé pour détecter la présence des polynucléotides cibles. Ce support présente une batterie de plusieurs sondes, fixées de manière covalente, et exactes complémentaires inverses des régions 3' variables des marqueurs. La figure 2 annexée représente l'adressage des sondes sur la puce. Quand la solution extraite, contenant les marqueurs putatifs, est mise en contact avec ce support, les marqueurs présents s'hybrident avec leurs complémentaires inverses sur la puce. Après lavage, le support est alors mis en contact avec une solution contenant des sondes (polynucléotides) couplée à un fluorophore (le Cy5), donc la séquence est l'exact complémentaire inverse de la région 5' Universelle des marqueurs. La figure 3 annexée représente les spectres d'émission (667 nm) et d'excitation (650 nm) du Cy5.
Ces sondes s'y fixent, et sont détectées par la suite. Leur présence permet de révéler la présence des polynucléotides cibles correspondant dans la solution initiale. La figure 4 annexée représente le principe de détection des marqueurs.
1. f.2 Matériels
- Sondes complémentaires inverses des régions spécifiques des marqueurs, (Eurofins MWG GmbH), complémentées en 5' d'un bras de 20 bases et biotinylées.
Sonde anti-1 (SEQ ID NO: 14)
5' (B)-TGGATCCCGCACACGACTGACCATGACTCATGGAGTGC 3' Sonde anti-2 (SEQ ID NO: 15)
5' (B)-TGGATCCCGCACACGACTGATGACGTATGAGTCGCCAC 3'
Sonde anti-3 (SEQ ID NO: 16)
5' (B)-TGGATCCCGCACACGACTGATGATAGAGTCCCCCTGAG 3'
Sonde anti-4 (SEQ ID NO: 17)
5' (B)-TGGATCCCGCACACGACTGATGAGACTTGCCCTAGAGC 3'
Sonde anti-5 (SEQ ID NO: 18) 5' (B)-TGGATCCCGCACACGACTGACTGAGATCCAGAGTCTGC 3'
Sonde anti-6 (SEQ ID NO: 19)
5' (B)-TGGATCCCGCACACGACTGAGATGAGACCTCATGCTGC 3' Sonde anti-7 (SEQ ID NO: 20)
5' (B)-TGGATCCCGCACACGACTGAGAATGAGACTCCTGCTGC 3'
Sonde anti-8 (SEQ ID NO: 21)
5' (B)-TGGATCCCGCACACGACTGAGAGTATTGCTGAGCCACC 3" Sonde anti-9 (SEQ ID NO: 22)
5' (B)-TGGATCCCGCACACGACTGATGAGATCACTGCCCTGAG 3'
Sonde antMO (SEQ ID NO: 23)
5' (B)-TGGATCCCGCACACGACTGAGATAGAATGTGTGCCCCC 3'
- Polynucléotides complémentaires inverses de la région 5' Universelle des marqueurs, couplés à un fluorophore (Cy5) en 3' ;(Eurofins MWG GmbH) :
UnivFluo 5' CTGGAGTTGC-(CY5*) 3' (SEQ ID NO: 24)
- Solution de marqueurs extraits
- Puce et Cartouche pour automate Nanogen (marque de commerce) spottée avec les complémentaires des régions variables des sondes
(NanoChip (marque déposée) Electronic Microarray, 100-Site NanoChip (marque déposée) Cartridge)
- Station de traitement Nanochip (marque déposée) Molecular biology Workstation (Nanochip (marque déposée) Reader, Nanochip (marque déposée) Loader)
- L-histidine (Invitrogen, référence: 0955061 IX)
- Multiscreen Filtration System (Millipore (marque déposée))
- Tampon de salinité élevée (phosphate de sodium 500 mM, chlorure de sodium 500 mM, Nanogen (marque déposée)) - Tampon de salinité faible (phosphate de sodium 50 mM, Nanogen (marque déposée))
- NaOH 0,1 M
1. f.3 Méthodes
Préparation de la cartouche Les sondes complémentaires aux régions spécifiques des marqueurs sont purifiées sur le système de filtration Multiscreen (de Millipore (marque déposée)) puis reprises dans 60 μl_ de tampon L-histidine 50 mM. Elles sont alors transférées sur la cartouche. Chacune d'elle est alors adressée sur un site spécifique de la cartouche pendant une période de 120 secondes (protocole géré par la station de travail). La biotine en 5' se fixe sur la streptavidine du support.
Tableau 1.6 : Plan de dépôt des sondes
Figure imgf000047_0001
Hybridation des marqueurs
Rincer la cartouche deux fois avec du tampon de salinité élevée (75 μL). Préparer un mélange contenant 5 μL d'extrait (marqueurs), ainsi que les sondes fluorescente à une concentration finale de 0,5 μM dans du tampon de salinité élevée (q.s.p. 100 μL). Prélever 75 μL de ce mélange dans la cartouche puis incuber trois minutes à température ambiante. Vider la cartouche puis rincer deux fois avec 75 μL de tampon de salinité élevée. Rajouter 75 μL de tampon de salinité élevé à la fin de l'opération. Démarrer ensuite l'appareil en utilisant le protocole standard de la station de travail Nanogen (marque déposée). Régénérer la cartouche qui peut être réutilisée.
LG Exploitation des résultats et interprétation
L'analyse des trois produits marqués dans ce premier exemple (cf. figure 5) permet de simuler trois configurations possibles (parmi d'autres) lors des étapes d'authentification du produit. Dans les premier et second produits marqués, l'utilisateur a pu détecter la présence du polynucléotide codant. La seule présence de ce polynucléotide indique que le produit est susceptible d'être authentique. En ce qui concerne le troisième produit, l'absence totale de détection du polynucléotide codant indique que le produit n'est pas marqué : il n'est donc pas authentifié.
Après lecture de l'information portée par le polynucléotide codant présent dans le premier et le deuxième produit, l'utilisateur se reporte à la table associative lui indiquant que le code du polynucléotide codant correspond à la présence des polynucléotides cibles 1 et 2 (peu importe les polynucléotides leurres présents). Ces polynucléotides sont bien détectés dans la première solution marquée, et uniquement ces deux polynucléotides : la première solution peut être authentifiée. Quant à la deuxième solution, la présence non attendue des polynucléotides cibles 3, 4 et 5 ne permet pas d'authentifier le produit.
Exemple 2 : marquage selon le procédé de l'invention d'un produit cosmétique
Cette exemple illustre un marquage à l'aide de plusieurs polynucléotides d'acide désoxyribonucléiques simple brin, injectés dans une crème pour la peau, et détectés selon la technique présentée dans l'exemple 1.
ILA. Injection des polynucléotides dans la crème
2.a.1 Principe
Les marqueurs sont d'abord préparés de l'eau distillée sans nucléases, puis incorporés la crème, à une concentration finale de 10"12 mole par comprimé de dm3 de crème pour les marqueurs cibles et leurres, et à une concentration de 10"14 moles par dm3 de crème pour les marqueurs codants. 2.a.2 Matériels
- Polynucléotides de synthèse (Eurofins MWG GmbH), 100 pmol/μL
- Acide désoxyribonucléiques simple brin circulaires (marqueurs codants) - H2O déionisée, sans nucléase
- crème Thermal Fix 2 (marque déposée), Laboratoires VICHY
2 .a.3 Méthodes
Un mélange préliminaire de polynucléotides cibles, codants et leurres est injecté à l'aide d'une pipette P10 (Gilson Pipetman, marque déposée) dans des échantillons de 1 cm3 de crèmes Thermal Fix (marque déposée), conduisant à une concentration finale de 10~12 moles de marqueur par dm3 pour les marqueurs cibles et leurres, et une concentration finale de 10"14 moles par dm3 pour les polynucléotides codants. Les échantillons sont alors conservés pour leur identification.
11. B. Extraction et détection des marqueurs
Les marqueurs sont détectés de la même façon que dans l'exemple 1 , excepté l'étape d'extraction des polynucléotides.
2.b.1 Principe d'extraction
Les marqueurs sont extraits de la crème par cassage de l'émulsion et récupération de la phase aqueuse. Une forte température (supérieure à 8O0C) est suffisante pour réduire l'émulsion constituant la crème et ainsi séparer les phases aqueuses et lipidiques. Les marqueurs, très polaires, se retrouvent dans la phase aqueuse d'où ils sont extraits.
2.b.2 Matériel - Crème Thermal Fix (marque déposée) (Vichy) Marquée - Bloc chauffant ou bain marie. - H20 déminéralisée sans nucléases.
2.b.3 Méthode
La crème marquée est chauffée 15 minutes à une température de 950C, puis centrifugée 5 minutes à 10 000 rcf. La phase aqueuse est récupérée, et est utilisée pour la détection des marqueurs. Les polynucléotides peuvent alors être détectés selon le procédé décrit dans l'exemple 1.
Exemple 3 : marquage selon le procédé de l'invention d'un spiritueux
Cet exemple illustre une technique de marquage d'un spiritueux à l'aide d'un mélange de polynucléotides cibles, codants et leurres. Le premier type de marqueur (polynucléotides cibles) est constitué d'un pool de 20 acides désoxyribonucléiques simple brin d'une taille de 20 bases. Le second marqueur est un acide nucléique circulaire simple brin, d'une taille de 1000 bases, dont la séquence contient les instructions de recherche des marqueurs cibles. Ainsi, cette séquence permet de savoir quels marqueurs cibles, parmi les 20, sont significatifs pour le codage du spiritueux, les autres marqueurs étant des leurres ajoutés de manière semi aléatoire.
Ul. A. Mise au point des marqueurs et marquage
3.a.1 Principe détaillé de la technique de marquage
Vingt marqueurs d'acide désoxyribonucléique simple brin sont générés grâce à l'algorithme présenté dans la description de l'invention. Ces marqueurs diffèrent les uns les autres, ne s'autohybrident pas, et ne sont pas susceptibles de s'hybrider les uns les autres. Ils constituent les polynucléotides cibles.
Le polynucléotide codant est un acide désoxyribonucléique de 1000 bases, circulaire. La séquence de cet acide nucléique contient, à un endroit donné, une cassette contenant la combinaison des polynucléotides cibles à chercher dans le produit.
La figure 6 annexée présente le principe du marquage couplé : le marqueur codant, sous forme circulaire, contient un site d'informations générales, ainsi qu'un site permettant de savoir lesquels des marqueurs cibles, également présents dans le mélange, portent l'information de code (les autres n'étant que des leurres).
Ainsi, seule la combinaison des marqueurs cibles désignés par le marqueur codant est significative pour l'authentification, les autres marqueurs n'étant que des leurres. La séquence du marqueur codant contient donc une boite codante, dont la position est cachée. La lecture de cette séquence permet à l'utilisateur de connaître quels marqueurs sont à rechercher dans le pool de marqueurs cibles via un recoupement dans une table de correspondance. La combinaison des marqueurs cibles permet d'identifier le produit de façon unitaire : une seule combinaison possible pour un produit possible. Dans le marqueur codant, en aval de la cassette codante pour la combinaison des marqueurs cibles à rechercher, une seconde séquence code pour des informations générales relatives au produit, telles que le lot, l'année de production, etc.
Ces marqueurs sont alors injectés dans le spiritueux à marquer. La détection se déroule ensuite en deux phases. La première consiste à détecter les séquences spécifiques du marqueur codant. Les premières informations qui en sont tirées sont les suivantes : • Authentification du produit. En cas de contrefaçon grossière, aucun marqueur codant n'est présent • Informations sur le produit : N° de lot, date de fabrication, ...
• Combinaison unique de marqueurs cibles à rechercher pour une
H dόéttteancttiinonn n phluiQs f fiinn»e.
Si cette première authentification n'est pas jugée suffisante, une deuxième est effectuée sur les marqueurs cibles. Cette deuxième authentification permet de déduire les informations suivantes :
• Contrefaçon grossière en cas d'absence des marqueurs cibles ou mauvaise combinaison. • Produit issu d'un mélange si d'autres marqueurs sont détectés en plus de ceux prévus par le marqueur codant.
• Authentification du produit de façon précise via recoupement avec une base de données.
3. a.2. Matériels
- Polynucléotides de synthèse (Eurofins MWG GmbH), 100 pmoles/μL (marqueurs cibles)
- Champagne Moët et Chandon (marque déposée), Brut Impérial
- Acides désoxyribonucléiques simples brins circulaires (marqueurs codants)
- Eau déionisée, sans nucléases.
3. a.3 Méthode a. Marqueurs cibles Les marqueurs cibles sont constitués des 20 polynucléotides différents, obtenus par synthèse chimique (Eurofins MWG GmbH). Cet exemple est réalisé avec le marquage de 5 produits différents. Dans chacun de ces produits, les 20 marqueurs peuvent être utilisés :
Primer-1 : 51-AGTCGAGAGCCGATTCCGCT-31 (SEQ ID NO: 25)
Primer-2 : δ'-GTCCGAGCAAAGGCTTCCGT-S1 (SEQ ID NO: 26) Primer-3 : 5I-AGACCCGTGGGCTCCATTAG-31 (SEQ ID NO: 27) Primer-4 : 5I-CCACCCAGAGGGCTTAGGTTτ31 (SEQ ID NO: 28) Primer-5 : 5I-ATCCCACGAGGGTGATCTCG-31 (SEQ ID NO: 29) Primer-6 : 5I-GGAATCCGACCGTGCATGTC-31 (SEQ ID NO: 30) Primer-7 : 5I-CAGAGACGTGACCCGCTGTT-31 (SEQ ID NO: 31) Primer-8 : 5I-GACCCAGGGGTACATTCTCG-3I (SEQ ID NO: 32) Primer- 9 : 5I-AAACGAGCCCGTTCCGTGTG-31 (SEQ ID NO: 33) Primer- 10 5I-GGGAGCCCCAGCATTATCGT-31 (SEQ ID NO: 34) Primer-11 5I-GGACGTGAACGCATCCGTCT-3I (SEQ ID NO: 35) Primer-12 5'-GGCTGAAGGCCACTACTCTG-3' (SEQ ID NO: 36) Primer- 13 51-GTAGGTAGCACACCGTCGCT-3l (SEQ ID NO: 37) Primer-14 51-CAGCCAGGAGATGTCCGTCT-31 (SEQ ID NO: 38) Primer-15 5'-GTCCCCAGGTGAGATCATCG-31 (SEQ ID NO: 39) Primer-16 51-CGAGGGACCAGCTTCCGTAT-3I (SEQ ID NO: 40) Primer-17 51-GCCAGTCGCAGGCATGATTC-31 (SEQ ID NO: 41) Primer- 18 5'-CGCCAGGGTCTCAGTCGTAA-31 (SEQ ID NO: 42) Primer- 19 5I-GAGCATAGCCGACGTCTTCG-31 (SEQ ID NO: 43) Primer-20 5I-GTAGAGTGACACGTCGCTCC-3I (SEQ ID NO: 44)
Sur ces 20 marqueurs cibles, 10 seulement sont effectivement injectés dans les produits. Sur ces 10 Marqueurs, 5 sont des leurres, et 5 constituent le marquage effectif du produit. Seule la séquence du marqueur codant permet de retrouver quels sont les marqueurs codants, et quels sont les leurres. En outre, les produits 1 à 4 sont des échantillons de Champagne Moët et Chandon, cuvée Impériale 2005 (marque déposée), le produit numéro 5 est un échantillon de Champagne Moët et Chandon, cuvée Impériale 2002 (marque déposée).
Tableau 3.1 : Marquage des produits 1 à 5 avec les marqueurs cibles
1 à 20
Figure imgf000054_0001
Le tableau 3.1 illustre le marquage des 5 produits. Le tiret indique que le marqueur n'est pas injecté. La lettre M indique que le marqueur est injecté, et qu'il sert dans la signature du marquage. La lettre L signifie que le marqueur est injecté, mais qu'il fait office de leurre. Ainsi, les produits 1 et 2, même s'ils contiennent des leurres différents, contiennent les mêmes marqueurs. Ils présentent la même signature. A l'inverse, les produits 3 et 4 présentent les mêmes leurres, mais les marqueurs sont différents. Ils ont donc une signature différente. Le produit 5 présente la même signature que le produit 1. Seul le marqueur codant fait la différence entre les deux produits.
Prédilués à une concentration de 10'7 moles/L dans du produit à marquer ( 1 μl_ de solution initiale à 10-4 mol/L dilué dans 999 μl_ de produit à marquer, puis 10 μL de cette solution intermédiaire dans 990 μL de produit à marquer), les marqueurs sont injectés à raison de 100 μL (à l'aide d'une Pipette P100) de façon à obtenir une concentration finale de
10~9 moles/L dans chacun dans les produits 1 à 5 dont le volume final est, pour l'exemple, de 10 ml_. Le produit contient donc 10"8 moles de marqueurs par litre, soit au total 10"10 moles de marqueurs dans 10 mL.
β. Marqueur codant
Synthétisés suivant le protocole de l'exemple 1 , les marqueurs codants sont des acides désoxyribonucléiques simples brins d'une longueur totale de 1000 bases. Leur séquence est la suivante (SEQ ID NO: 45) :
5' CAGAAGAATGCACGCTCTTTAACGCTTCGCCCTAAAATGGGCCATG ACTATTGAGAATACGATACCTTCCCGCGTTAGCATCCCTTCCCTGATG CTGGTAGATCTACACCATCTGTACGGGAGATAAGGCTGGCTGTGCGC TTAGACGGGAACTTGGACCGGAAGAATGCGTACAGCCTTACGCGCAT CCGAGTCGTCACCTACCACACGCTCATGCGCACTTTACGGGTAAAAA GTGTTAATCGTAACAGTGTCGGGACCACTCCTATGCTAATACCAGCGT GGTCCAGTGACG I I I I LACATAGTAGGTGCTCTAATCTTGCAAACCAC CGTTTCATTATCTGTTATTCTCCCTTGCTAATGGCCCGCTCAGCACCG GGTGTTCCCAGAGGAGAGCTCCCAGCCACGTTGCAGCGAGCGGGCT
GTCGAAAGTATAAAGTTCTTAC[marq uagel ]ACATTCTATGCGTATCAT
TTCTCCTACGGATCTGGAGCTAATCCGGTACGCAGCTTACGCACAAT GGCATAAGCTGTGACGTGGGATAGATAGTACTCTCTACAAACGTACA GAGCAGTGTTATCGATACCCCCCGCAGCCAATTACTCATAAATCCGA CACAGCAACGCCCATTTTCAGTTTTCGGTATACGTGCGGGCTCCTCAT ATGTATTAACGTTGAGTGACTCTGCAGTCCGATTGGATGTTGGTTCCA TCCGCTATCGTAGAGTCCTATC[marquage2]GAAATCCACAAATCTGT
GCGATTTGACGTACATTTCGTATCGGCGGTAGTTACGCAAGCTAGCA CTACCATAGTAGTATCGTTATTCGGGCTTGACAACCTCGAAGGCGTG GGGAAGAAGCGTCAGTATCTTCGCAAGAAATGAGGAAGAGGTACCAA TAAGCGAATGGGCCCGAAACTACGTCCTCGCAGAGGGCGATCGATC GGCGATTAGAGTCTGGGGGGTAGTTCAGCACA 31
La marque 1 code pour la combinaison de marqueurs cibles à chercher dans le produit. La marque 2 code pour une information générique telle que la cuvée d'où sont issus les échantillons. Ci-dessous (tableau 3.2), la légende des marques de types 1.
Tableau 3.2 : Codage des marqueurs cibles selon les sites variables des marqueurs codants
Figure imgf000056_0001
Tableau 3.3 : Codage du type de produit selon les informations secondaires des marqueurs codants
Figure imgf000057_0001
Dans les 5 produits est alors injecté un marqueur codant spécifique, qui indique quels sont les marqueurs d'authentification cibles codant pour l'information, et qui indique, dans notre exemple, la cuvée d'où provient l'échantillon, à une concentration finale de 10~11 moles/L selon la technique décrite dans l'exemple 1. Ils contiennent les séquences variables suivantes :
Tableau 3.4 : récapitulatif des marquages des produits 1 à
Figure imgf000057_0002
M = marquage PM = Produit marqué
III. B. Extraction des marqueurs
La détection se fait en deux étapes. La première consiste à détecter les marqueurs codants. Elle permet une première authentification des produits, grâce à la deuxième marque. La lecture de la première marque permet ensuite de connaître la combinaison de marqueurs cibles à rechercher.
3. b.1 Principe de l'extraction
Les marqueurs sont extraits de leur milieu (ici, un vin de Champagne), puis récupérés en milieu aqueux dans le but de pouvoir ensuite utiliser les techniques de biologie moléculaire d'identification.
L'extraction doit de préférence non seulement avoir un bon rendement
(récupérer un maximum de marqueurs, idéalement : rendement de 100
%), mais elle doit aussi débarrasser les marqueurs de toutes substances « polluantes » pouvant interférer avec les techniques de détection. En outre, elle doit de préférence être efficace pour les deux types de marqueurs.
3. b.2 Matériel - Phénol UltraPure (marque de commerce) Buffer-Saturated Phénol, Invitrogen.
- chloroforme/alcool isoamylique (24:1)
- acétate de sodium 3M
- éthanol glacé 95% (Carlo Erba Rectapur), 75% - UltraPure Glycogen, Invitrogen (marque de commerce) 20 μg/μmol
- Eau déionisée, sans nucléases.
3. b.3 Méthode
La technique utilisée est celle de l'extraction au phénol chloroforme. Pour l'exemple, les marqueurs sont extraits à partir de 500 μl_ de produit (Champagne). - Dans un tube de 2 ml_ (Eppendorf, marque déposée) contenant 500 μl_ de produit marqué, ajouter ΛA volumes de phénol (250 μl_), ΛA volume de chloroforme (250 μl_) à l'aide d'une pipette P1000, puis vortexer 10 secondes. Centrifuger 5 minutes à 10000 rcf.
- Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube de 2 mL
(Eppendorf, marque déposée), et ajouter 1 volume (500 μl_) de chloroforme. Vortexer et centrifuger 5 minutes à 10000 rcf. Répéter cette étape 5 fois.
- Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube, puis ajouter 3μl_ de Glycogène, 1/10 de volume (50 μl_) d'acétate de sodium 3M et 2,5 volumes (1250 μl_) d'éthanol glacé. Mixer puis incuber 1 heure à -200C
- Centrifuger 10 minutes à 10 000 rcf. Jeter le surnageant et laver délicatement le culot avec 200 μl_ d'éthanol glacé à 75 %. Sécher ensuite le culot. Le reprendre dans 20 μL d'eau déionisée, sans nucléases.
III. C. Détection du marqueur codant
3. c.1 Principes Le marqueur codant est détecté par une technique de Polymérisation en Chaîne. Deux amorces sont nécessaires pour ce faire. Un premier type d'amorce est complémentaire à une région située en 5' de la séquence variable 1. Cette amorce est dite Universelle car elle ne dépend pas de la variabilité des marqueurs cibles (elle reconnaît un site commun à tous ces marqueurs). La deuxième amorce est quant à elle complémentaire aux sites variables 2. Ainsi, on utilise autant de couples d'amorces que de types de séquences variables 2 (ici, deux couples).
La figure 7 annexée représente la détection du marquage primaire des marqueurs codants par PCR. Cette figure reprend les deux types d'amorces, la matrice ainsi que le brin qui lui est complémentaire et qui est généré lors du premier cycle de PCR.
Pour chaque type de séquence variable 2, une réaction de polymérisation en chaîne est réalisée sur les marqueurs extraits des produits. L'amplification spécifique du marqueur codant pour un couple d'amorce révèle la présence d'une séquence de type 2. L'absence d'amplification est révélatrice d'un produit non marqué donc probablement contrefait. Une amplification du marqueur avec le mauvais couple d'amorce, ou avec plusieurs couples d'amorces révèle une tricherie quant au produit (tricherie sur la cuvée, mélanges, ...)
3.C.2. Matériel
- Taq Polymérase (Applied Biosystems) AmpliTaq GoId
- TamponiO X PCR Buffer II (Applied Biosystems) - MgCb Solution (25 mM) (Applied Biosystems)
- Amorce sens Universelle (Eurofins MWG GmbH), 100 pmol/μL) 5' ACGTTGCAGCGAGCG 3' (SEQ ID NO: 56)
- Amorce anti-sens (cf. séquences variables V2 : les amorces anti-sens sont leurs complémentaires inverse) (Eurofins MWG GmbH), 100 pmol/μL)
- dNTP (2 mM) - Gel d'agarose (Agarose Electrophoresis Grade, Invitrogen, référence: 15510-027)
- Tampon Tris Borate EDTA (TBE) 0,5 X
- Bromure d'Ethidium
3. c.3 Méthodes
Dans un tube de 200 μl_ (Eppendorf, marque déposée), ajouter les réactifs à l'aide d'une pipette P2, P10 et P100, selon le tableau 3.5.
Tableau 3.5 : Réaction de Polymérisation en chaîne
Figure imgf000061_0001
Les réactions de polymérisation en chaîne sont alors lancées sur un appareil GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystem) En respectant les cycles suivants :
- 94 0C 5'
- 94 0C 30" I
- 55 0C 30" ι-> 40 cycles - 72 0C 30" I
- 72 0C T
Les produits de réaction de polymérisation en chaîne sont alors déposés sur un gel d'agarose 0,5% préparé en TBE 0,5X et mis à migrer dans un tampon TBE 0,5 X à 10 V.cm"1. Après un temps de migration adéquat, le gel est mis dans un bain contenant du BET, rincé puis révélé aux UV. Pour chaque produit, l'absence de bande révèle que le marqueur n'a pas été détecté, ou que la séquence 2 ne correspond pas au type d'amorce utilisée. Une bande (de taille de 358 pb) correspond à une amplification, donc à la détection d'une séquence spécifique du marqueur codant.
Pour chaque révélation positive, les amplicons sont conservés pour une possible détection des marqueurs cibles.
I I I. D Détection des marqueurs cibles
3. d.1 Principe Les marqueurs cibles sont recherchés dans le produit pour une détection plus poussée du marquage. Seule la lecture du marqueur codant permet de détecter les marqueurs cibles. Cette détection se fait sur les amplicons obtenus précédemment par réaction de polymérisation en chaîne. La première étape consiste à lire l'information contenue sur les marqueurs codant, et donc sur les amplicons. Cette information (séquences 1) permet de connaître, grâce à une table de corrélation, quels sont les marqueurs cibles présents dans le produit dont la présence porte l'information du marquage. Connaissant ceci, une détection des marqueurs cibles totaux est réalisée, en utilisant une puce à ADN. Après révélation de cette détection, l'utilisateur est à même de savoir quels marqueurs cibles sont présents ou non dans le produit, et peut comparer ces résultats aux résultats théoriquement attendus obtenus en lisant l'information portée sur les marqueurs codants.
3. d.2 Matériels
- Amorce sens Universelle (Eurofins MWG GmbH), 100 pmol/μL) 5' ACGTTGCAGCGAGCG 3'(SEQ ID NO: 56)
- BigDye (marque déposée) Terminator V3.1 (Applied Biosystems)
- Matrice : amplicon marqueur codant
- H2O déionisée sans nucléases.
3. d.3 Méthodes
La réaction de séquence est effectuée sur chacun des amplicons, dans un tube de 200 μl_ (Eppendorf, marque déposée), selon le protocole exposé dans le tableau 3.6.
Tableau 3.6 : Réaction de séquence
Figure imgf000063_0001
Les réactions sont alors lancées sur un appareil GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystem) en respectant les cycles suivants :
96 0C r
.96 _°c 10" I
50 0C 5" I -> 25 cycles
60 0C 4' I Après purification sur colonne (Qiagen, marque déposée), les réactions sont alors séquencées sur un séquenceur 16 capillaires ABI3100 (Applied Biosystem).
Du résultat de ces séquences sont extraites les séquences variables 1 (ou Marques 1). Ces séquences permettent de retrouver quels marqueurs cibles doivent être présents dans le mélange, par recoupement dans la table suivante (tableau 3.7) :
Tableau 3.7 : Codage des marqueurs cibles selon les sites variables des marqueurs codants
Figure imgf000064_0001
Les marqueurs cibles sont alors détectés selon la technique exposée dans l'exemple 1. Cette détection révèle bien sûr la dizaine de marqueurs présents dans chaque produit, mais c'est en comparant avec les marqueurs codants que l'on sait retirer l'information pertinente.
Exemple 4 : marquage selon le procédé de l'invention d'un médicament Cet exemple montre comment marquer des médicaments se présentant sous la forme de comprimés tels que ceux employés pour de nombreuses formules médicamenteuses, selon le procédé de marquage de la présente invention. Le protocole de l'exemple 1 est utilisé.
IV. A. Injection des polynucléotides dans les capsules
4.a.1 Principe
Les marqueurs sont d'abord mis dans une solution éthanolique (80%) puis incorporés lors du processus de fabrication de comprimés, à une concentration finale de 10-12 mole par comprimé de 400 mg pour les marqueurs cibles et leurres, et à une concentration de 10-14 moles par comprimé pour les marqueurs codants. Pour cet exemple, les comprimés ne contiennent aucun principe actif.
4.a.2 Matériels - Polynucléotides de synthèse (Eurofins MWG GmbH), 100 pmol/μL
- Acide désoxyribonucléiques simple brin circulaires (marqueurs codants)
- H2O déionisée, sans nucléase
- Béta-Lactose, Sigma Aldrich (Marque déposée) #L3750-500G
- Amidon de mais, Sigma Aldrich (Marque déposée) #S4180-500G - Calcium dihydrogenphosphate, Sigma Aldrich (Marque déposée) #307645
- Sirop de sucre
- Magnésium stéarate, Sigma Aldrich (Marque déposée) #26454-1 KG
4 .a.3 Méthodes a. Préparation de la solution de marqueurs
Les marqueurs sont préparés de la même manière que dans l'exemple 1.
Un mélange préliminaire est cependant réalisé dans une solution éthanolique à 80% pour l'incorporation des polynucléotides dans les comprimés.
b. Préparation des comprimés
Les comprimés sont préparés à partir de 300 g de grains. Les différentes poudres composant les grains sont tout d'abord pesées puis mélangées (Mélangeur à projection et tourbillonnement type « Lodigge »), suivant la formule suivante :
- Béta-Lactose : 120g - Amidon de mais : 60g
- Calcium dihydrogenphosphate : 120g
La solution de mouillage est ensuite préparée à partir de 100g de sirop de sucre et de 750 μL de la solution de marqueurs. Ajouter ensuite petit à petit cette solution de mouillage au mélange de poudres, jusqu'à obtenir une masse humide ayant l'aspect d'une semoule grossière, puis granuler le mélange précédent pour obtenir un grain ayant l'aspect d'un vermiculé humide (à l'aide d'un Granulateur oscillant).
Le grain est alors séché à une température de 60 0C jusqu'à obtenir une hygrométrie de 4 à 6 % puis tamisé sur une colonne tamis pour éliminer les particules fines. Après lubrification à l'aide de stéarate de magnésium 1%, les grains sont montés en presse puis comprimés en presse.
IV. B. Extraction et détection des marqueurs Les marqueurs sont détectés de la même façon que dans l'exemple 1 , excepté l'étape d'extraction des polynucléotides.
4.b.1 Principe d'extraction Les marqueurs sont extraits par broyage des comprimés, puis récupération des polynucléotides en phase aqueuse.
4.b.2 Matériel
- Comprimés Marqués. - Bloc chauffant ou bain marie.
- H20 déminéralisée sans nucléases.
4.b.3 Méthode
Les comprimés sont broyés à l'aide d'un mortier et d'un pilon, de façon à obtenir une très fine poudre. Cette poudre est alors mélangée à
1 mL d'eau distillée, dans un tube de 1,5 mL (Eppendorf, marque déposée). Après chauffage 15 minutes à 700C, le tube est centrifugé 5 minutes à 5000 rcf afin d'éliminer les particules solides. La phase aqueuse est ensuite reprise dans un nouveau tube pour l'étape d'authentification des polynucléotides. Les polynucléotides peuvent alors être détectés selon le procédé décrit dans l'exemple 1.
Exemple 5 : marquage selon le procédé de l'invention d'un produit alimentaire
Cet exemple montre comment marquer puis extraire des marqueurs dans un produit alimentaire, tel que de la pâte à pizzas. Les marqueurs sont injectés à la pâte fraîche et en cours de préparation. Ils peuvent être détectés par la suite dans le produit fini, prêt à la consommation, cuit ou non. V.A Marquage de la pâte
5.a.1 Principes
Les marqueurs sont pré-dilués dans de l'eau déminéralisée. Des mélanges de polynucléotides cibles, codants et leurres sont utilisés, comme présenté dans l'exemple 1. Ils sont alors incorporés à une recette de pâte à pizza, qui est mise à cuire par la suite.
5.a.2 Matériels - Polynucléotides de synthèse (Eurofins MWG GmbH), 100 pmol/μL
- Acide désoxyribonucléiques simple brin circulaires (marqueurs codants)
- H2O déionisée, sans nucléase
- Ingrédients pour pâte à pizzas : farine T45 «Farine de blé tous usages pour préparations gourmandes » Francine (Marque déposée) , huile d'olive « Huile d'olive vierge extra extraite à froid » Carapelli (Marque déposée), levure « Levure boulangère spéciale Pains » Francine (Marque déposée) , sucre « Sucre blanc en poudre » Daddy (Marque déposée), sel « Sel fin iodé blanc naturel essentiel » Cérébos (Marque déposée.)
5.a.3 Méthodes
Une solution préliminaire de marqueurs cibles, codants et leurres est ajoutée, préparés comme exposé dans l'exemple 1 , est ajoutée à l'aide d'une pipette P200 (Gilson Pipetman, marque déposée) à la pâte à pizza lors de sa fabrication, en quantité suffisante pour obtenir une concentration finale en marqueurs de 1E-10 moles/kilogramme (pour chaque marqueur non leurre, soit au 2E-9 moles/kilogramme de polynucléotides). Le tableau suivant, (tableau 5.1) indique les différentes quantités d'ingrédients pour obtenir 828 grammes de pâte à pizza crue.
Tableau 5.1 : Fabrication de pâte à pizzas marquée
Figure imgf000069_0001
La pâte est alors cuite au four, pendant 15 minutes à une température moyenne de 240 °C.
V. B Extraction des marqueurs
Les marqueurs sont extraits par dissolution d'une portion de pâte cuite dans de l'eau déminéralisée : 1 gramme de pâte cuite est réduit en poudre, puis repris dans 10 mL d'eau. Le tout est alors mélangé vigoureusement puis mis à chauffer 15 minutes à 94 0C. Après centrifugation 5 minutes à 10000 rcf, la phase aqueuse récupérée et stockée à 40C pour la révélation des marqueurs. Ces marqueurs ont été détectés selon la technique présentée dans l'exemple 1.
Exemple 6 : Marquage selon le procédé de la présente invention de tabac
Cet exemple montre comment marquer du tabac. Il est marqué à l'aide de polynucléotides tels que présentés dans l'exemple 1 par adsorption directe sur le tabac.
Vl. A Marquage du tabac 6.a.1 Principe
Le marquage porte sur un du tabac de cigarettes dites « blondes ». Sur cet échantillon est adsorbé un mélange de polynucléotides cibles, de polynucléotides codants et de polynucléotides 5 leurres tels que décrits dans l'exemple 1.
6.a.2 Matériels
10 - Polynucléotides de synthèse (Eurofins MWG GmbH), 100 pmol/μL
- Acide désoxyribonucléiques simple brin circulaires (marqueurs codants)
- Ethanol (Ethanol anhydrous, denatured, Sigma-AIdrich # 676829)
- H2O déionisée, sans nucléase
- Cigarettes Marlboro (marque déposée), Philip Morris Products S.A. 15
6.a.3 Méthodes
Le tabac est marqué par la solution de polynucléotides préparés selon le procédé décrit dans l'exemple 1.
Un gramme de tabac extrait de cigarettes est marqué de façon 20 à obtenir, au final, 10~12 moles de marqueur par gramme de tabac : une quantité suffisante de solution de pré-marquage est injectée à l'aide d'une pipette P200 (Gilson Pipetman, marque déposée) directement sur le tabac, puis le tout est mélangé vigoureusement, à une température de 37°C pendant 15 minutes.
25 Le tabac ainsi marqué est alors conservé à une température de __ 160C et à 70% d'hygrométrie.
VLB Extraction et identification des marqueurs
Les marqueurs sont extraits par trempage du tabac marqué
30 dans de l'eau déminéralisée : un gramme de tabac est mis à tremper dans
10 mL d'eau distillée déionisée, puis mis à chauffer 15 minutes à 94°C. Après centrifugation 5 minutes à 10000 rcf, la phase aqueuse récupérée et stockée à 4°C pour la révélation des marqueurs. Ces marqueurs peuvent être détectés selon la technique présentée dans l'exemple 1.
Exemple 7 : marquage selon le procédé de l'invention d'un hydrocarbure
Cet exemple montre comment marquer un hydrocarbure (pétrole brut) et quelle technique peut être utilisée pour extraire les marqueurs et révéler le marquage.
VII.A Marquage de l'hydrocarbure
7.a.1 Principes
Dans cet exemple, un échantillon de pétrole brut est marqué à l'aide de polynucléotides préalablement préparés dans un solvant organique polaire. Le marquage est composé polynucléotides cibles, de polynucléotides codants et de polynucléotides leurres tels que décrits dans l'exemple 1.
7.a.2 Matériels
- Polynucléotides de synthèse (Eurofins MWG GmbH), 100 pmol/μL
- Acide désoxyribonucléiques simple brin circulaires (marqueurs codants)
- H2O déionisée, sans nucléases
- Dimethylsulfoxide (DMSO), Euromedex Réf UD8050-A - pétrole brut (IFP) 7.a.3 Méthodes
Une solution de polynucléotides simple brin cibles, codants et leurres sont préparés tels que décrits dans l'exemple 1.
Un second mélange préliminaire est ensuite réalisé dans du DMSO avant d'insérer les marqueurs dans le pétrole.
La seconde solution préliminaire de marqueurs est alors mélangée au pétrole, à l'aide d'une pipette de précision (Gilson Pipetman, marque déposée) en quantité suffisante pour obtenir une concentration finale en marqueurs de 10~10 moles/L. Le pétrole marqué est alors stocké à température ambiante, en vue de l'identification des marqueurs.
VII. B Extraction et détection des marqueurs
7.b.1 Principe
Les marqueurs sont extraits de leur milieu apolaire, puis récupérés en milieu aqueux dans le but de pouvoir ensuite utiliser une technique d'identification.
7.b.2 Matériels
- Phénol UltraPure (marque de commerce) Buffer-Saturated Phénol, Invitrogen.
- chloroforme/alcool isoamylique (24:1) - acétate de sodium 3M
- éthanol glacé 95% (Carlo Erba Rectapur), 75%
- eau déionisée, sans nucléases.
- Hexane (Sigma, réf H9379-1 L)
7.b.3 Méthodes La technique utilisée est celle de l'extraction au phénol chloroforme. Pour l'exemple, les marqueurs sont extraits à partir de 500 μl_ de pétrole brut.
- Ajouter 2 volumes d'Hexane. - Ajouter 1/2 volume de phénol (250 μl_), 1/2 volumes de chloroforme
(250 μl_), et 1/2 volume d'eau (250 μl_) mélanger de manière très vigoureuse pendant 30 secondes. Centrifuger 30 minutes à 10 000 rcf.
- Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube, et ajouter 1 volume de chloroforme. Mélanger de manière très vigoureuse et centrifuger 20 minutes à 10 000 rcf. Répéter cette étape 5 fois.
- Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube, puis ajouter 1/10 de volume d'acétate de sodium 3M et 2,5 volumes d'éthanol glacé. Mixer puis incuber 1 heure à -20 0C - Centrifuger 10 minutes à 10 000 rcf. Jeter le surnageant et laver délicatement le culot avec 200 μl_ d'éthanol glacé à 75 %. Sécher ensuite le culot. Le reprendre dans 100 μL d'eau déionisée, sans nucléases.
Ces marqueurs peuvent être détectés selon la technique présentée dans l'exemple 1.
Exemple 8 : marquage selon le procédé de l'invention d'un produit alimentaire frais Dans cet exemple, un produit alimentaire frais est marqué à l'aide d'un mélange de polynucléotidesAe produit est un produit laitier : un yaourt.
VIII .A Marquage du yaourt
8.a.1 Principes Les marqueurs sont pré-dilués dans de l'eau déminéralisée. Le marquage est composé polynucléotides cibles, de polynucléotides codants et de polynucléotides leurres tels que décrits dans l'exemple 1.
8.a.1 Matériels
- Polynucléotides de synthèse (Eurofins MWG GmbH), 100 pmol/μL
- Acide désoxyribonucléiques simple brin circulaires (marqueurs codants)
- H2O déionisée, sans nucléases
- Yaourt Activia (Marque déposée) de Danone (Marque déposée)
8. a.2 Méthodes
Une solution préliminaire de polynucléotides cibles, codants et leurres est ajoutée au yaourt, dans la masse, en quantité suffisante pour obtenir une concentration finale en marqueurs de 1E-10 moles/kilogramme (pour chaque marqueur non leurre, soit au 2E-9 moles/kilogramme de polynucléotides) à l'aide d'une pipette P10 (Gilson Pipetman, marque déposée), 2 μL de solution préliminaire sont alors injectés dans la masse du produit. Le tout est alors bien homogénéisé à l'aide d'une spatule stérile. Le yaourt marqué est alors stocké à 4°C dans l'attente de l'identification des marqueurs.
VIII. B Extraction des marqueurs
Les marqueurs sont extraits par dissolution d'une portion de yaourt dans de l'eau déminéralisée : 1 gramme de yaourt est repris dans 10 mL d'eau. Le tout est alors mélangé vigoureusement puis mis à chauffer 15 minutes à 94 CC. Après centrifugation 5 minutes à 10000 rcf, la phase aqueuse récupérée et stockée à 4°C pour la révélation des marqueurs. Ces marqueurs peuvent être détectés selon la technique présentée dans l'exemple 1. Exemple 9 : marquage selon le procédé de l'invention d'une boisson
Une boisson gazeuse non alcoolisée est marquée à l'aide de polynucléotides tels que décrits dans l'exemple 1 : Orangina (marque déposée), Schweppes International Limited.
IX. A Marquage de la boisson
9.a.1 Principes
Les marqueurs cibles, codants et leurres sont pré-dilués dans de l'eau déminéralisé. Ils sont alors mélangés directement dans la boisson.
9.a.2 Matériels
- Polynucléotides de synthèse (Eurofins MWG GmbH), 100 pmol/μL
- Acide désoxyribonucléiques simple brin circulaires (marqueurs codants)
- H2O déionisée, sans nucléase - Orangina (Marque déposée), Schweppes International Limited
9.a.3 Méthodes
Un mélange préliminaire est réalisé dans de l'eau déionisée, avant d'insérer les marqueurs dans la boisson. La solution préliminaire de marqueurs est mélangée à la boisson, en quantité suffisante pour obtenir une concentration finale en marqueurs de 1E-10 moles/L (pour chaque marqueur non leurre, soit au 2E-9 moles/L de polynucléotides).
La boisson marquée est alors stockée à 4°C dans un récipient hermétique. IX. B Extraction des marqueurs
Les marqueurs sont extraits à l'aide de la technique au phénol- chloroforme présentée dans l'exemple 1.
Ces marqueurs peuvent être détectés selon la technique présentée en exemple 1.
Exemple 10 : marquage selon le procédé de l'invention d'un support papier
Cet exemple montre comment marquer puis extraire des marqueurs dans un support papier. Les marqueurs sont directement adsorbés sur le papier. Ils sont détectés par la suite en dissolvant le papier marqué.
X. A Marquage du papier
10. a.1 Principes Les polynucléotides cibles, codants et leurres tels que décrits dans l'exemple 1 sont pré-dilués dans de l'eau déminéralisée. Une goutte est alors adsorbée à la surface d'une feuille de papier.
10. a.2 Matériels - Polynucléotides de synthèse (Eurofins MWG GmbH), 100 pmol/μL
- Acide désoxyribonucléiques simple brin circulaires (marqueurs codants)
- H2O déionisée, sans nucléase.
- Disque de papier « 1 QUALITATIVE Filter Paper », Whatman (marque déposée). 10. a.3 Méthodes
Un mélange préliminaire tel qu'exposé dans l'exemple 1 est réalisé dans de l'eau déionisée, avant le dépôt sur la feuille de papier.
La solution préliminaire de marqueurs est alors déposée sur le papier, de telle sorte que 1 E-12 moles de marqueurs soient déposées. 1 μl_ de solution préliminaire est déposé à l'aide d'une pipette de précision
P10 (Gilson Pipetman, Marque déposée), ce qui conduit dans à la formation d'un disque de 5mm de diamètre.
Le papier est alors séché à l'air libre, puis conservé en vue de la détection des marqueurs.
X.B Extraction des marqueurs
Les marqueurs sont extraits par dissolution d'une section de papier dans de l'eau déminéralisée : 1 cm2 de papier contenant le disque de marqueurs est découpé en très petits morceaux, puis plongé dans 10 mL d'eau. Le tout est alors mis à chauffer 15 minutes à 94 0C.
La pulpe de papier est mélangée de manière très vigoureuse, puis homogénéisée par aspiration-refoulement à l'aide d'une pipette.
Après centrifugation 5 minutes à 2000 rcf, la phase aqueuse récupérée et stockée à 4°C pour la révélation des marqueurs. Ces marqueurs peuvent être détectés selon la technique présentée dans l'exemple 1.
Exemple 11 : tests olfactifs et de vieillissement sur un produit marqué selon le procédé de l'invention
Des tests de stabilité dans le temps et de vieillissement ont été réalisés conjointement avec un industriel de la cosmétique. Des tests olfactifs ont permis de vérifier que l'ajout de polynucléotides cibles, codants et leurres en réalisant un marquage selon la présente invention n'altèrent en rien les propriétés physico-chimiques et olfactives des parfums. Ces tests ont été réalisés en parallèle sur plusieurs parfums, et selon plusieurs conditions : un mois à 5°C qui a fait office de référence, un mois à 50cC, qui a simulé un vieillissement accéléré du parfum, ainsi qu'un mois exposé à la lumière du jour.
Après vieillissement, des tests ont montré que les solutions contenant des polynucléotides gardent les mêmes propriétés physicochimiques et olfactives que les solutions ne contenant pas de polynucléotide, et ce quelque soit la méthode de vieillissement. En outre, pour chaque flacon, les marqueurs ont été extraits, puis identifiés avec succès.
Exemple 12 : tests olfactifs et de vieillissement sur un produit marqué selon le procédé de l'invention
La figure 8 annexée représente un schéma de détection d'un marquage selon l'invention et d'authentification d'un produit marqué selon l'invention.
Sur cette figure :
1- Les marqueurs codants sont identifiés. Le premier niveau d'authentification du produit réside en leur présence. Si le produit ne contient pas de marqueur codant, le produit est une contrefaçon.
2- Les marqueurs leurres et cibles sont alors identifiés dans le produit. Sur cette figure, le produit a été marqué avec une_Mrie_de_20_pplyiiucléotides cibles ou leurres putatifs.
Ainsi, il contient entre 1 et 20 marqueurs sélectionnés dans ce lot. A cette étape du procédé, les marqueurs cibles et leurres ne sont pas différenciés (il est impossible de dire qu'un polynucléotide est polynucléotide cible ou polynucléotide leurre). - La nature du polynucléotide codant détecté lors de la première étape (ici le polynucléotide A) est alors envoyée au fournisseur du marquage. Grâce à cette information, le fournisseur du marquage récupère dans une base de données la clé de décryptage du marquage, qui permettra de définir, dans la série des polynucléotides leurres et cibles, lesquels sont leurres et lesquels sont cibles. - A l'aide de la clé de décryptage, l'utilisateur s'intéresse aux polynucléotides cibles seulement. Il peut alors lire le code que compose la présence ou l'absence de des polynucléotides cibles (dans cet exemple, le code est -, -, + et -). - La lecture du code permet alors à l'utilisateur de vérifier, à l'aide d'une base de données sécurisée, si le code d'identification correspond bien au produit d'intérêt. Dans le cas contraire, il peut s'agir d'une reproduction illégale, d'un mélange ou d'un détournement du produit.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de marquage d'un produit, ledit procédé comprenant une étape d'addition sur ou dans ledit produit d'une pluralité de polynucléotides simples brins, ladite pluralité de polynucléotides comprenant : au moins un polynucléotide cible constitué d'un polynucléotide simple brin de longueur et de séquence déterminée, et des polynucléotides leurres qui sont de longueurs déterminées identiques ou différentes et de séquences déterminées identiques ou différentes, lesdits polynucléotides leurres étant de longueur(s) identique(s) ou différente(s) et de séquences différentes de la séquence dudit, au moins un, polynucléotide cible, dans lequel chacun des polynucléotides cible(s) et leurres ne s'hybride avec aucun des autres polynucléotides de ladite pluralité de polynucléotides, et dans lequel les polynucléotides de la pluralité de polynucléotides sont des séquences d'acide désoxyribonucléique ou d'acide ribonucléique, comprenant respectivement la même proportion des quatre bases A, C, G et T, ou A, C, G et U, naturelles ou modifiées.
2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel ladite pluralité de polynucléotides comprend en outre au moins un polynucléotide de reconnaissance constitué d'un polynucléotide simple brin de longueur et de séquence déterminée d'identification de la nature et la séquence du, au moins un, polynucléotide cible, dans lequel chaque polynucléotide de reconnaissance ne s'hybride avec aucun des autres polynucléotides de ladite pluralité de polynucléotide,
3. Procédé de marquage selon la revendication 1 , dans lequel lesdits polynucléotides de la pluralité de polynucléotides sont circulaires ou linéaires.
4. Procédé de marquage selon la revendication 1 , dans lequel au moins deux polynucléotides cibles sont utilisés, l'un étant un polynucléotide circulaire et l'autre un polynucléotide linéaire.
5. Procédé de marquage selon la revendication 3 ou 4, dans lequel les polynucléotides linéaires comprennent une extrémité variable d'un polynucléotide à l'autre et une extrémité constante d'un polynucléotide à l'autre.
6. Procédé de marquage selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le, au moins un, polynucléotide cible de la pluralité de polynucléotides a une longueur de 5 à 50 nucléotides.
7. Procédé de marquage selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lesdits polynucléotides de la pluralité de polynucléotides ont une longueur de 5 à 5000 nucléotides.
8. Procédé de marquage selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape d'addition est réalisée par addition de ladite pluralité de polynucléotides dans ledit produit lors de sa fabrication ou dans ou sur le produit fini.
9. Procédé de marquage selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel l'étape d'addition est réalisée par addition de ladite pluralité de polynucléotides à la surface dudit produit.
10. Procédé de marquage selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel une étape d'encapsulation de ladite pluralité de polynucléotides dans des vecteurs lipidiques est réalisée préalablement à l'étape d'addition.
11. Procédé de marquage selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'introduction de ladite pluralité de polynucléotides est réalisée sur ou dans un composant dudit produit.
12. Procédé de marquage selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la concentration de la pluralité de polynucléotides après son addition dans ledit produit est de 10~6 moles à 10"18 moles/dm3.
13. Produit marqué susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12.
14. Produit marqué selon la revendication 13, ledit produit marqué étant choisi dans le groupe comprenant les parfums, les cosmétiques, les produits pour l'hygiène, les produits alimentaires, les arômes, les extraits de plante(s), le tabac, les boissons, textiles, les cuirs, les médicaments, les poudres, les vernis, les encres, produits alimentaires, les hydrocarbures, les papiers, les peintures, les produits et composés chimiques.
15. Procédé de détection du marquage d'un produit selon la revendication 13, ledit procédé comprenant une étape d'analyse de la pluralité de polynucléotides permettant de détecter spécifiquement le, au moins un, polynucléotide cible, comprenant les étapes successives suivantes : (i) mettre en contact la pluralité de polynucléotides avec un support solide sur lequel des séquences sondes sont fixées, ces séquences sondes étant complémentaires à une des extrémités dudit, au moins un, polynucléotide cible de la pluralité de polynucléotides du marquage du produit, la mise en contact permettant aux polynucléotides cibles de se fixer sur le support par hybridation avec les séquences complémentaires sondes fixées sur le support ;
(ii) éliminer les polynucléotides non hybrides par l'étape (i); (iii) détecter la présence sur le support des polynucléotides cibles; et
(iv) comparer les résultats de l'étape (iii) avec le contenu d'une base de données qui permet d'identifier et d'authentifier ledit produit.
16. Procédé selon la revendication 15, comprenant en outre les étapes suivante, avant l'étape d'analyse :
(a) prélèvement d'un échantillon du produit ; et
(b) extraction de la pluralité de polynucléotides dudit échantillon, l'étape d'analyse étant réalisée sur la pluralité de polynucléotides extraits dudit échantillon.
17. Procédé de détection selon la revendication 15 ou 16 dans laquelle l'étape d'analyse comprend une réaction de polymérisation en chaîne des polynucléotides cibles.
18. Procédé de détection selon l'une quelconque des revendications 15 à 17 dans laquelle l'étape d'analyse est réalisée par immunodétection.
19. Procédé de détection du marquage selon la revendication 15, dans lequel les polynucléotides complémentaires aux polynucléotides cibles sont fixés sur le support solide au moyen d'une liaison biotine/streptavidine.
20. Procédé de détection du marquage selon la revendication 15, dans lequel les polynucléotides complémentaires aux polynucléotides cibles sont fixés sur le support par formation de liaison covalente à une membrane de nylon chargée, ladite membrane formant le support solide.
21. Procédé de détection du marquage selon l'une quelconque des revendications 15 à 20, dans lequel les polynucléotides cibles fixés sur le support sont détectés au moyen de polynucléotides marqué par un agent de marquage et complémentaires à l'autre extrémité des polynucléotides cibles, l'agent de marquage étant choisi dans le groupe comprenant un fluorochrome, une particule d'or colloïdal et une enzyme.
22. Procédé de détection du marquage selon la revendication 15, dans lequel la base de données permet de déterminer l'origine dudit produit.
23. Procédé de détection du marquage selon la revendication 15 à 22, dans lequel la base de données permet d'identifier une contrefaçon d'un produit original.
24. Procédé de détection du marquage selon l'une quelconque des revendications 15 à 23, dans lequel l'extraction telle que définie à l'étape (b) est une extraction au phénol chloroforme.
25. Procédé de détection selon l'une quelconque des revendications 15 à 24, dans lequel l'étape d'analyse comprend une rétrotranscription de l'acide ribonucléique en acide désoxyribonucléique lorsque les polynucléotides cibles sont de l'acide ribonucléique.
26. Procédé de détection selon l'une quelconque des revendications 15 à 24, dans lequel l'étape d'analyse comprend une étape de séquençage des polynucléotides cibles.
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