CN102124127A - 使用多种多核苷酸的产品标记方法、所述标记的鉴定方法以及标记产品 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及产品标记方法、所述标记的鉴定方法和通过本发明方法标记的产品。本发明中所用的标记基于单链核酸。本发明的标记方法包括将多种单链多核苷酸添加在所述产品上或在所述产品中的步骤，所述多种多核苷酸包括：至少一种包含具有预定长度和序列的单链多核苷酸的靶多核苷酸，以及具有相同或不同预定长度和相同或不同预定序列的诱骗多核苷酸，所述诱骗多核苷酸的长度与所述至少一种靶多核苷酸相同或不同，且所述诱骗多核苷酸的序列与所述至少一种靶多核苷酸的序列不同，其中所述靶多核苷酸和诱骗多核苷酸的每一种都不与所述多种多核苷酸中的任何其它多核苷酸杂交。本发明的方法使得可以例如标记香精、化妆品、卫生洁品、食品、调味品、植物提取物、烟草制品、饮料、纺织品、皮革制品、药品、粉料、清漆、油墨、碳氢化合物、纸、涂料以及化学产品和化合物。

Description

使用多种多核苷酸的产品标记方法、所述标记的鉴定方法以及标记产品
技术领域
本发明涉及产品标记方法、所述标记的鉴定方法和通过本发明方法标记的产品。本发明中所用的标记基于单链核酸。
本发明使得可以区分真品和伪造品。本发明特别使得可以对真品进行标记，从而能够对其进行跟踪和鉴定。
物品、特别是高附加值产品或高端产品的伪造或非法复制，不仅给公司造成严重的经济损失，还对就业、食品安全甚至是社会生活造成严重的经济损失。这就是制造商通过为其产品开发新型标记和认证技术来跟踪和销毁伪造产品而努力抗击该祸害的原因。
方括号之间的参照符号([x])是指实施例末尾处的参考文献列表。
背景技术
通常用于检测和鉴定真品的方法之一是通过向该产品引入可被单方面鉴定的化学物质或化合物来对所述产品进行“整批(bulk)”标记。
这种类型的标记必须具有特定的性质：该标记必须以对于产品终端用户透明的方式进行，不应该改变该产品的物理-化学性质并且不应该对产品终端用户有害。在实践中，所述标记还应该无法被检测和/或不能被伪造，从而使得其自身不会与产品同时被伪造。
现在，特别是对于非常大量的诸如香精、美容用乳霜等已知对标记物要求苛刻的化学物质或对于诸如皮革、织物等材料而言尚无可靠的技术是经久稳定的。如今不存在对于伪造者造成确实的解密难度的标记技术。
因此，确实需要可以克服现有技术的这些缺陷、缺点和障碍的标记和标记方法，并且这使得可以有效地抗击伪造产品、特别是伪造的高端产品。
发明内容
具体而言，本发明的目的在于提出满足上述需求并且解决现有技术问题的标记方案。
本发明特别涉及一种产品标记方法，所述方法包括将多种单链多核苷酸添加在所述产品上或在所述产品中的步骤，所述多种多核苷酸包括：
-至少一种包含具有预定长度和序列的单链多核苷酸的靶多核苷酸，和
-具有相同或不同预定长度和相同或不同预定序列的诱骗多核苷酸(decoy polynucleotide)，所述诱骗多核苷酸的长度与所述至少一种靶多核苷酸相同或不同，且所述诱骗多核苷酸的序列与所述至少一种靶多核苷酸的序列不同，
其中所述靶多核苷酸和诱骗多核苷酸的每一种都不与所述多种多核苷酸中的任何其它多核苷酸杂交。
在本发明方法的一个特定实施方式中，所述多种多核苷酸还包含至少一种识别多核苷酸，所述识别多核苷酸由具有预定长度和序列的单链多核苷酸组成且用于鉴定所述至少一种靶多核苷酸的性质和序列，其中所述识别多核苷酸中的每一种都不与所述多种多核苷酸中的任何其它多核苷酸杂交。
针对如上述所定义的本发明方法，以及针对本发明方法的具体实施方式，应考虑以下具体说明。
因此，本发明的标记由如本说明书中所定义的所述多种多核苷酸组成。这些多核苷酸是单链多核苷酸。在本说明书中，所述多种多核苷酸还称为“标记物(marker)”。
本发明还涉及通过本发明方法能够获得的标记产品，和涉及用于检测该产品的标记的方法。
具体而言，本发明涉及确定用于实施本发明方法的标记物、这些标记物的制造、产品的标记以及用于检测标记产品中的标记物的技术。本发明使得可以区分伪造品和真品，甚至可以鉴定分销渠道的滥用和未被授权的平行渠道。
所述多种多核苷酸中的多核苷酸可以具有几种类型：它们可以是核糖核苷酸聚合物或单链核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核苷酸或单链脱氧核酸核酸(DNA)或这些的组合。
本发明中，“多种多核苷酸”是指靶多核苷酸、诱骗多核苷酸以及必要时的识别多核苷酸的组。优选的是，根据本发明，使用几种靶多核苷酸、几种诱骗多核苷酸、以及必要时的几种识别多核苷酸。例如但不限于，可以使用1～100种靶多核苷酸，例如1～50种，例如5～50种。此外，例如但不限于，可以使用2～100种诱骗多核苷酸，例如2～50种。例如但不限于，必要时，可以使用1～100种识别多核苷酸，例如1～50种。多核苷酸数量的选择取决于根据本发明所需要的标记复杂性。
本发明中，“靶多核苷酸”是指其序列已经确定并且构造成组成参考序列的多核苷酸，所述靶多核苷酸用于标记本发明的产品，然后在该产品对其进行特异性搜索，从而认证该产品。优选的是，根据本发明，所述标记物包含几种相同或不同的靶多核苷酸、优选不同的靶多核苷酸。所述靶多核苷酸可参考确立靶多核苷酸与标记产品之间关联的机密靶/产品数据库。
“机密数据库”是指对于给定产品仅本发明的标记制造者和/或仅所述产品的制造者/创造者能访问(下文中将所述标记制造者和/或所述产品制造者/创造者称为“本发明的实施人员”)的数据库。这是对各产品或产品家族分配根据本发明确定的特定识别特征(signature)的对应基础。
在仅使用靶多核苷酸和诱骗多核苷酸作为产品的识别特征的情况下，可以将所述数据或对应基础称为“靶/产品机密基础”或“靶/产品基础”。因此，如果我们希望对本发明的产品进行认证，首先必须在该靶/产品基础中对分配给所述产品的靶序列进行搜索，然后例如通过利用下述方法之一进行搜索来查明所述靶序列是否实际上存在于所述产品中。如果所述靶序列实际上存在，即可断定所述产品是真品。然而，如果所述靶序列实际上不存在，即可断定所述产品是伪造品。当然，只有根据本发明对所有真品进行标记，这才有效。所述对应基础可以由本发明的识别特征的制造者和/或由制造者/创造者基于本发明的识别特征列表来构建，例如通过使得每个识别特征对应于确定的产品来构建。在这种情况下，所述认证是直接的。
本发明中，“诱骗多核苷酸”是指其序列已经选定和被构建为不同于靶序列的多核苷酸。所述诱骗序列用于与本发明的标记混杂但并非用于在产品中被搜索，以便认证该产品。诱骗序列用于使试图复制本发明识别特征的伪造者的工作复杂化。事实上，靶序列仅为本发明的实施人员所已知。根据本发明，如果存在诱骗序列、靶序列和诱骗序列是单链的短序列并且不会相互杂交，为了进行复制而在靶序列和诱骗序列的混合物中进行一种或几种具体序列之间的区分(在本情形中为了复制靶序列而对靶序列的区分)变得更困难(如果不是不可能的话)。诱骗物越多，对实体中的识别特征的复制越困难，并且在统计学上，随机确定靶多核苷酸的序列的机会越低。这些诱骗多核苷酸的序列也是本发明的实施人员所已知的，然而，这些多核苷酸不在待分配给产品的数据库中。
本发明中，“识别多核苷酸”是指具有预定序列和长度的使得能够进行靶多核苷酸鉴定的多核苷酸。识别多核苷酸具有便于快速检索和鉴定的性质或以便于快速检索和鉴定的浓度存在，其充当第一认证测试：其缺失是伪造品的第一标志。识别多核苷酸是一种或几种其序列已经选定和被构建来组成代码的多核苷酸，所述代码用在用于鉴定靶多核苷酸的机密数据库或“靶鉴定基础”中，所述“靶鉴定基础”用于给出关于靶多核苷酸的数量、性质、序列和长度方面的信息。当存在几种识别多核苷酸时，可以称为“识别多核苷酸组”。在该情况下，在各识别多核苷酸或识别多核苷酸组的靶鉴定基础中，分配了根据本发明确定的靶多核苷酸或靶多核苷酸组。识别多核苷酸的序列仅为本发明实施人员所已知。本发明的识别特征中识别多核苷酸的存在是可选的，其对应于本发明方法的具体实施方式。如果产品的本发明的识别特征中使用一种或几种识别多核苷酸，则由本发明的实施人员创建用于鉴定所述靶的机密基础。该基础使得可以基于所述识别多核苷酸鉴定待认证产品中存在的靶多核苷酸。在该情况下，产品的认证是间接的。事实上，如果希望认证据假定具有本发明识别特征的产品，则根据下述本发明的方法之一鉴定识别多核苷酸，接着在靶鉴定数据库中搜索分配给所述产品的靶序列，然后例如通过使用下述方法之一搜索所述靶序列是否实际上存在于所述产品中。如果所述靶序列确实存在，即可断定所述产品是真品。然而，如果所述靶序列不存在，即可断定所述产品是伪造品。应该注意的是，在本发明的该实施方式中，在对产品进行认证之前存在两个鉴定多核苷酸的步骤，这使得可能的伪造者的任务更复杂。当然，只有在根据本发明对真品进行标记的情况下这才有效。根据本发明，识别多核苷酸的序列可以含有携带代码的子序列，所述代码使本发明的用户能够基于靶识别基础发现哪些是靶多核苷酸，哪些是诱骗多核苷酸。因此，在产品的认证过程中，从待认证产品中提取这些识别多核苷酸，或在所述产品中或所述产品上对其进行直接鉴定。一旦检测到识别多核苷酸的性质(例如但不限于，可以通过阅读识别多核苷酸的序列、或通过鉴定在多个假定的编码多核苷酸中存在的识别多核苷酸的阵列来实现靶多核苷酸的鉴定)，则本发明的用户可参考相应的表格(靶多核苷酸识别基础)，并在其中读取理论上存在于待认证产品中的靶多核苷酸的性质。所述表格可以例如但不限于储存于安全的计算机数据库中(使得能够确保机密性)，该数据库在产品进行标记期间创建，并且其中成对出现：“读取的识别多核苷酸的代码”-“代搜索的靶多核苷酸”。因此，在回头参考所述表格后，本发明的用户可以推断出应该存在于待认证产品中的靶标记物的确切性质。因此，对所述靶多核苷酸进行提取，然后鉴定。如果检测出的靶多核苷酸与在表中读取的理论代码确切相符，则该产品可能为真品。如果存在其它靶多核苷酸，本发明的用户可以怀疑是标记产品的混合物。如果检测出的靶多核苷酸完全不同于期望的多核苷酸，则其可能是伪造品。如果在本发明的识别特征中不使用识别多核苷酸，则仅靶/产品数据库是有用的。
本发明中，可以例如通过本领域技术人员已知的方法，例如使用执行例如下文提出的算法的软件来设计所述多种多核苷酸的多核苷酸，以使得对于选自组成所述标记的多种多核苷酸中的给定多核苷酸而言，所述多种多核苷酸中的其它多核苷酸或者任何这些多核苷酸的反向互补多核苷酸都不是由与该给定多核苷酸互补的多核苷酸的序列构成的。因此，包括在产品的温度和分子调节环境下、以及在该温度和所述多核苷酸分子开发环境下，本发明识别特征的多核苷酸之间不会形成双链复合体、例如核酸双链体(诸如DNA双螺旋)，也不会形成任何杂交。
“双链复合体的形成”是指包括在上述条件下热力学稳定的互补核苷酸的配对。
给定多核苷酸的“反向互补多核苷酸”是指存在的或理论上的新型多核苷酸，其中给定多核苷酸的各核苷酸被能够与该核苷酸配对的互补核苷酸替换，例如在脱氧核糖核酸多核苷酸的情形中，腺嘌呤替换胸腺嘧啶、胸腺嘧啶替换腺嘌呤、胞嘧啶替换鸟嘌呤、或鸟嘌呤替换胞嘧啶。
“杂交”是指两个互补的单链多核苷酸通过非共价键而结合。该杂交可以是完全的，即序列全部互补，或不完全的，即序列不全部互补、但是互补至足以使相互杂交并且形成双链结构。
本发明中，“非杂交”是指由于两个单链多核苷酸不互补和/或互补性不足以形成双链，因而两个单链多核苷酸未通过非共价键结合。
值得注意的是，并非将待引入所关注产品或物质中的本发明的标记物的多种多核苷酸都分配到用于直接或间接认证产品的数据库。因此，可以仅使用受限数量的靶多核苷酸，这些靶多核苷酸为产品认证过程中要寻找的多核苷酸，并且将它们同时与大量诱骗物以及必要时与识别多核苷酸一起引入产品中，所述诱骗物和识别多核苷酸的序列不与所述靶多核苷酸的序列对应。因此，靶多核苷酸可以“淹没”在大量诱骗多核苷酸中，在以复制所述识别特征为目的的恶意试图解码靶多核苷酸的情况下，这会使问题变得格外困惑。另外，根据其中使用识别多核苷酸的本发明的具体实施方式，仅对识别多核苷酸所携带的编码的阅读和解密可以断定在靶多核苷酸和诱骗多核苷酸的组合中哪些实际上对应于靶序列，并且通过排除断定哪些仅是旨在误导伪造者的诱骗物。
可以利用作为脱氧核糖核酸和/或核糖核酸的标记物实现本发明的标记方法。因此所述多种多核苷酸的多核苷酸可以是单链脱氧核糖核酸序列或单链核糖核酸序列，或脱氧核糖核酸序列和核糖核酸序列的组合。因此本发明的标记物可由称为“天然碱基”的普通碱基组成，例如，在DNA中存在的碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶；或在RNA中存在的碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶(参见例如Molecular Cloning，Maniatis，Cold Spring-Harbor，第二版，第C3～C14页[1])。本发明的标记物还可以包含出现频率较低的称为“修饰碱基”的天然或合成化合物，例如由对前述碱基进行诸如脱氨基等修饰而产生的二氢尿苷(DHU)、肌苷或假尿嘧啶。含氮碱基可由原子质量不同的天然同位素和/或稳定同位素构成，和/或对其进行修饰从而在杂交过程期间建立许多与正常氢键不同的氢键。
根据本发明的具体实施方式，脱氧核糖核酸的序列可以在其序列内包含相同比例的四种天然或修饰的碱基A、C、G和T。根据本发明的另一具体实施方式，核糖核酸的序列可以在其序列内含有相同比例的四种天然或修饰的碱基A、C、G和U。根据本发明的另一具体实施方式(包括前述两个实施方式或不是两个之前的实施方式)，包含所述标记的多核苷酸组具有相同数量的核苷酸和相同的分子量。有利的是，本发明的该具体实施方式能够使得可能的伪造者对所述聚合物的分离和鉴定更加困难(如果不是不可能的话)。例如，不可能对上述后面的实施方式、特别是最后一个实施方式的识别特征进行如下的分离和鉴定：所述分离和鉴定借助于电泳(例如在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺上进行的电泳)和/或质谱法等技术根据分子尺寸和/或分子量进行。
例如，在本发明的标记中，20个核苷酸的单链多核苷酸(或寡聚物)(每个核苷酸选自4种可能的碱基)能够实现420种不同的序列，即约1.1×1012种组合，这是1万亿种组合。因此，根据本发明，随机地从本发明标记中尺寸为20个核苷酸的多种多核苷酸中提取出靶标记物、并且该标记物是已经分配给靶/产品数据库中的产品的标记物的可能性几乎等于零。另外，本发明的标记由具有预定长度和序列的几种靶分子、几种诱骗物和必要时的几种识别多核苷酸组成，这同时确保了标记的极高安全性和显著的不可侵犯性。
因此，所用的多核苷酸由于其性质而可包含例如4种含氮碱基的定向组合，所述组合的性质由本发明的实施人员限定。可以根据需要(编码复杂性、标记物携带的信息类型)和这些标记物展现的物理化学性质(杂交性、分子量、片段尺寸、含氮碱基的组成)以计算机化方式来计算所述组合，该组合是本发明标记物的每种多核苷酸的特异性的来源，并且该组合可以携带与标记产品有关的信息。
根据待标记产品和所考虑的标记的检测技术，可以使用一种或几种靶多核苷酸。因此，本发明允许相当大数量的识别特征或标记变化形式/替代形式。借助于非限制性实例，可以列举第一组靶核苷酸的以下不同形式：
-一种或几种大尺寸的单链靶多核苷酸，所述大尺寸即包含例如约500～5000个核苷酸或碱基；
-一种或几种小尺寸的单链靶多核苷酸，所述小尺寸即包含例如约5～200个核苷酸或碱基，例如5～50个核苷酸或碱基；
-一种或几种平均尺寸的单链靶多核苷酸，所述平均尺寸即包含例如约201～499个核苷酸或碱基；
-一种或几种具有恒定末端序列和可变末端序列的单链靶多核苷酸，
-一种或几种在大尺寸多核苷酸中插入(或在其中确定)的单链靶多核苷酸，因此这些插入的靶多核苷酸形成多核苷酸的较大部分，
-一种或几种单链环状多核苷酸，或
-这些不同形式的组合。
根据本发明，可以使用至少两种靶多核苷酸，一种是环状多核苷酸，另一种是直链多核苷酸。根据本发明的实施人员选定的标记复杂性，可以使用多个靶环状多核苷酸或直链多核苷酸、或其混合物。
根据本发明的具体实施方式，当某些或一组单链多核苷酸是直链时，它们可包含在不同多核苷酸之间为可变的可变末端和在不同多核苷酸之间为恒定的恒定末端。“恒定末端”是指包括多核苷酸序列的两个末端之一并展示出预定和恒定的序列的所述多核苷酸序列的一部分，也就是说对于本发明标记物的部分靶序列或所有靶序列是相同的。“可变末端”是指包括多核苷酸序列的两个末端的另一个并且展示预定序列的所述多核苷酸序列的部分，所述预定序列在本发明标记物中的不同靶序列之间是可变的。这提出了所述靶多核苷酸的一个特定优点。事实上，如下文所述，为了以鉴定真品为目的而检测和解密所述标记，对于微DNA阵列而言可以使用解密用固相基质，所述基质上固定有与靶多核苷酸的可变末端互补的多核苷酸。所述恒定末端自身可用于例如借助于生物素/链亲和素来突显靶多核苷酸在固相基质上的杂交。该检测模式描述于下文。
靶多核苷酸的数量和性质以及其尺寸使得可以限定标记复杂性，并以组合方式限定可能的组合的数量。可能的组合的数量随着这些多核苷酸的尺寸以指数方式增加。通过选择由所有尺寸相同的多核苷酸中的一种或几种多核苷酸组成的识别特征，可以设想大量组合。在所有可能的组合中随机复制识别特征的可能性几乎是零。
根据本发明，标记信息可以存在于：
-靶多核苷酸序列，各靶多核苷酸序列在靶/产品数据库中分配给产品；
和/或
-在靶多核苷酸序列的一种或几种组合中，所述组合在靶/产品数据库中分配给产品。
因此，可以使用几种具有预定序列的靶多核苷酸。还可以例如选择20种都具有不同预定序列的多核苷酸的群或“库”，并且针对每种产品选择这些20种序列中的例如10种序列的组合来标记一组给定产品。
向这些靶序列添加诱骗多核苷酸序列从而构成本发明的标记物。根据本发明，诱骗多核苷酸不与靶多核苷酸杂交，并且它们的作用在于使得为复制本发明的标记而对其进行的解密对于伪造者而言更加困难。如同上文对于靶多核苷酸所指出，这些诱骗多核苷酸可以处于直链或环状形式，或环状多核苷酸与直链多核苷酸的混合物。添加到所述标记物的诱骗多核苷酸的数量取决于所需的干扰性。优选的是，该数量高于靶多核苷酸的数量。实例如上文所给出。所述诱骗多核苷酸具有彼此相同或不同的长度，优选的是具有与在本发明的标记物中存在的靶序列相同的长度，例如如上文对于靶多核苷酸所指出，长度为15～5000个碱基，例如15～200个碱基、例如20～200个碱基、例如201～499个碱基、例如500～5000个碱基，或这些长度的混合物。
可以向这些靶序列和诱骗序列添加识别多核苷酸，从而使得能够如上所述借助于数据库来区分靶多核苷酸和诱骗多核苷酸。识别多核苷酸的数量具体取决于所需标记的复杂性。识别多核苷酸可以是环状或直链的。它们可以具有彼此相同或不同的长度，或具有与靶多核苷酸和诱骗多核苷酸的长度相同或不同的长度，如同上文对于靶多核苷酸所指出，长度可以为5～5000个碱基，例如15～200个碱基、例如20～200个碱基、例如201～499个碱基、例如500～5000个碱基，或这些长度的混合物。
因此，在本发明的标记中，多种多核苷酸中的所述多核苷酸可以是环状的、直链的或环状多核苷酸与直链多核苷酸的混合物，例如具有游离3’OH末端和游离磷酸5’末端。优选的是，本发明的标记的多核苷酸的长度是5～5000个核苷酸，例如5～100个核苷酸，例如5～50个核苷酸，例如20～50个核苷酸。
根据本发明，多种多核苷酸中的所述多核苷酸是单链多核苷酸。事实上，本发明的特点之一在于使用能够使得解密本发明的标记更困难的单链。
因此，本发明的标记方法能够制造极为大量的标记物。各标记物包含由靶多核苷酸和必要时的识别多核苷酸组成的编码。
本发明标记物的多核苷酸的序列可以根据经验创建，或优选的是，特别是为快速起见，通过为此目的而能够生成的合适软件创建。在后一种情况下，其为本发明标记物的计算机设计或“电子设计(Design In Silico)”。
为了确定本发明标记物的靶多核苷酸和诱骗多核苷酸以及必要时的识别多核苷酸的序列，可以利用以下算法：
-(0)创建组E，所述组E含有由所述标记产生的多核苷酸组。
-(1)随机产生第一多核苷酸p，其中所述第一多核苷酸的尺寸和多核苷酸数量可以由用户定义，p不属于E。
-(2)根据Smith和Waterman[2]的算法计算以下多核苷酸之间的杂交评分：一方面由两个多核苷酸p的链接(concatenation)产生的多核苷酸，另一方面由选自多核苷酸组E中的两个多核苷酸及其反向互补物的链接产生的各多核苷酸。
-(3)如果一组评分未超过用户给定的阈值，在E中添加p。返回步骤(1)，条件是E并非所需尺寸。这些阈值是最小比对评分，在该评分之上的两个序列被认为具有足以相互杂交的同一性。
一旦确定靶多核苷酸和诱骗多核苷酸的序列，可以通过技术人员已知的任何现有方法制造这些靶多核苷酸和诱骗多核苷酸。根据所制造多核苷酸的性质和根据所选标记，可以使用一种或几种策略：合成具有例如5个碱基～5000个碱基的可变尺寸的环状和/或直链的单链核糖核酸和/或脱氧核糖核酸。借助于实施本发明的可用策略的实例，可以引用能够合成环状单链多核苷酸的策略[3]或多核苷酸的电子合成策略[4]。
当识别多核苷酸序列为标记所需时，其各自的序列可以根据经验确定，或通过如前所述的算法确定，以使得识别多核苷酸既相互之间不杂交，又不与靶多核苷酸或诱骗多核苷酸杂交。
根据所需标记的复杂性，可以以各种方式来实现使用核糖核酸或脱氧核糖核酸标记物根据本发明方法对溶液或化合物进行标记。每种靶多核苷酸携带其序列固有的具体信息。可以以独特方式使用每种靶多核苷酸或靶多核苷酸的组合。
第一种可能的编码水平可以是使用一种或多种靶多核苷酸的水平。因此可以通过一种或几种具有规定尺寸和预定序列的但彼此不同的多核苷酸跟踪几批标记产品。
第二种可能的编码水平是使用在靶多核苷酸的初始库中选择的几种靶多核苷酸。因此，编码不再来自靶多核苷酸的各序列，而是来自产品中所发现的靶多核苷酸的组合。因此，根据本发明，标记产品可以由n种靶多核苷酸标记，所述n种靶多核苷酸选自可能的N种不同的多核苷酸，n包括在区间[0；N]中。
在所有情况下，可以通过主要在于使用识别多核苷酸的第三种编码水平完成本发明的标记，由此，如果产品是真品并且采用本发明方法标记，借助于靶识别数据库可以表明存在哪些在靶多核苷酸中易于为制造者所用并且可以具有不同的性质和浓度的标记物。
根据本发明，所述产品的标记方法的各步骤可以是具有特定示踪能力的对象。可以通过在一个或几个机密数据库中对各步骤引入特定信息来确保所述示踪能力。
因此，根据本发明，例如可以通过字母数字混合标识符鉴定各批次标记物或标记物的组合。该标识符可以出现在产品上或通过任何光学表现模式出现：例如在标记物批次的容器上的例如条形码、数据矩阵等。该标识符还可以充当其中储存有标记物批次的信息的第一数据库中的索引，例如：组成标记物批次的每一种标记物的序列、各标记物数量的各自比例、制造日期等。
可以将借助于标记物批次的标识符来跟踪的标记物批次的各容器在数据库中与例如客户订单的参考信息相关联，或与将该容器投递给所述客户的投递参考信息相关联。也可以将来自所述客户的接收确认输入该数据库。
核酸不会改变标记产品的任何物理化学性质。另外，核酸对其容器、即标记产品不具有任何影响。最后，已经证明核酸在本发明人进行的许多实验中是非常稳定的。在下文实例中该稳定性得以证明。
以非穷举方式，本发明中包含的单链DNA和RNA标记物可以包括在大范围的产品和物质中，所述产品和物质易于成为非法、滥用性复制(伪造)、黑市上的违法交易的目标，和/或包括在跟踪轨迹至关重要的产品和物质中(产品跟踪)。
本发明的方法适用于所有液体、半液体或固体工业产品或消费品的标记。可以列举但不限于以下产品，例如：香料、化妆品、卫生洁品、食品、调味品、植物提取物、烟草制品、饮料、纺织品、皮革制品、药品、粉料、清漆、油墨、涂料、化学产品和化合物，更一般而言，所有易于被伪造的货物和产品。
本发明还可以适用于来自高端工业和化妆品工业的整个范围的产品：香料、淡香水(eaux de parfum)、古龙水(eaux de toilette)、香精油、乳膏、面膜、发蜡等。
在工业产品和消费产品领域，本发明还可用于跟踪诸如油墨、树脂、清漆、涂料、染料、添加剂、芳香剂(aroma)、胶、粉料等各种物质。
在食品工业领域，本发明可应用于高端产品，所述高端产品可能是伪造或欺诈(混合)的目标，例如特别是酒精饮料、烈酒、特级葡萄酒，或甚至是出于例如安全原因而确保真实性较为重要的任何产品。
标记物还可用于医药工业以标记和跟踪药品和其它药物。
本发明还可用于跟踪医院环境中的生物样品。例如对于生化实验室中的血液样品、病理解剖学实验室中的肿瘤样品实施可跟踪性策略，或目的在于构建直接认证的可以在生物资源中心中保持和跟踪多年的人类组织银行的策略。
通常而言，可以将产品标记为其所代表的物品，或作为组成部分而进行标记。例如，可以通过已经在纸质文件上使用并且已预先被标记的油墨对纸质文件进行标记。
根据本发明，可以通过任何合适的手段来实现添加本发明标记物的步骤，从而使得能够向待标记的产品添加组成本发明标记物的多核苷酸。待标记的产品和物质可以大批通过向其引入最终浓度经研究和提供的标记物进行标记，或在产品的表面进行标记。所述标记物是具有源自核糖核酸或脱氧核糖核酸性质的物理化学性质的核糖核酸或脱氧核糖核酸的聚合物：它们是带负电荷的亲水性分子。根据待标记产品的性质，可以将它们预先稀释或直接添加到产品。还可以将它们封装。甚至还将它们沉积到或整合到所述产品的表面。
可以通过在产品制造期间将所述多种多核苷酸添加至所述产品中或添加在最终产品中或添加在最终产品上(即表面上)来实现向所述产品添加本发明的标记物。因此本发明还涉及通过本发明的标记方法可以获得的产品。
根据本发明，当在待标记产品的表面处实现标记物的添加时，可以通过例如将最终产品浸入包含所述标记物的溶液或通过将所述溶液喷涂或蒸发在最终产品上来进行。优选的是，所述溶液是诸如乙醇、甲醇或二乙二醇等质子溶剂，或诸如丙酮或四氢呋喃等极性非质子溶剂。该添加模式适合于例如制造后的固体产品，例如织物、皮革、木材、纸、纸板、烟草制品、香烟、雪茄等。
还可以在产品制造期间通过将所述标记物与组成所述产品的化合物或成分混合来进行添加。可以在所述产品的成分上或在所述产品的成分中实现多种多核苷酸的引入。这种类型的添加适合于制造中经历液相或半液相的任何产品和物质，标记物可以被加入所述液相或半液相中。可以是如下情形，例如，对化妆品或药品进行整体标记。
根据本发明的具体实施方式，可以在添加步骤之前执行将所述多种多核苷酸包封在脂质载体中的步骤。该包封步骤使得能够将所述多核苷酸保持在有利的环境下，或有助于其将来的提取。例如，作为包封产品，可以使用选自包含阳离子脂质载体的组中的产品，例如二油酰氧基丙基三甲基溴化铵(DOTMA)和二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)，或称为聚合复合物(polypex)的具有诸如聚赖氨酸、鱼精蛋白或聚亚乙基亚胺(PEI)等分子的多核苷酸复合物。例如，为此目的可以使用Bioch.Biophys.Acta 1280：1.[5]，J.Biol.Chem.269：2550[6]或AAPS PharmSci.2001；3(3)：E21[7]中所述技术。
根据本发明的另一实施方式，可以在添加步骤之前执行将所述多种多核苷酸包封和/或保护在脂质载体或其它载体中的步骤。该步骤进一步确保了稳定性和/或促进其回收。
本发明中，“保护”是指保护本发明中的多核苷酸，特别是使其免受任何来自环境的物理化学攻击，其中发现例如在这些聚合物中本发明的识别特征(香料、食品)填充在碳纳米管中。
无论选择何种添加模式，优选以从微摩尔到飞摩尔的极低浓度将本发明的标记物添加到产品中以对其进行标记。根据所考虑的现有或即将出现的检测技术以及标记物的尺寸，将这些标记物以可变的终浓度添加，第一组的各靶多核苷酸的各自的浓度可以不同并组成编码亚组。根据本发明，所述多种多核苷酸在被添加到产品后的浓度可以是但不限于10-6摩尔/dm3～10-18摩尔/dm3。对于液体或固体体积，建议采用这种量/体积。对于液体，其对应于以体积单位计的与产品混合的标记物的量。对于固体，其对应于以体积单位计的与产品混合的标记物的量或沉积在产品表面处的标记物的量。涉及产品表面时，还通过单位/面积即10-6摩尔/dm2～10-1摩尔/dm2来限定所述量。这些浓度可以通过将浓度更高的溶液进行稀释而获得。所述溶液可以如上文所定义。
本发明还涉及用于检测通过本发明的标记方法能够获得的产品标记的方法，所述方法包括多种多核苷酸的分析步骤，该分析步骤使得能够特异性检测至少一种靶多核苷酸。
另外，本发明提供了几种用于检测本发明的标记物的方法。所述检测可以在实验室外或在实验室内实现，例如借助于便携式系统(例如借助于特别为检测本发明标记物的靶多核苷酸而设计的DNA微阵列)而实现。
根据本发明，可以例如通过免疫检测进行所述分析步骤。根据本发明，所述分析步骤可以包括例如对编码多核苷酸进行测序的步骤。根据本发明，特别是当所述靶多核苷酸是核糖核酸时，所述分析步骤可以例如包括将核糖核酸逆转录成脱氧核糖核酸。根据本发明，所述分析步骤可以包括与特异性杂交联合的比色检测、发光检测或荧光检测。换言之，所述分析步骤可以使用检测靶多核苷酸的特定手段。
根据本发明，所用的分析技术可以利用标记物的物理化学性质、编码和特异性。所述分析技术可以与夹心测试技术、使用DNA微阵列的检测技术或本领域技术人员已知的可以检测多核苷酸的存在和/或对其进行鉴定的任何其它技术相关。
在本发明的具体实施方式中，靶多核苷酸和诱骗多核苷酸可以是小尺寸的多核苷酸，即长度为8～30个核苷酸/核苷，并且是单链的。根据该实施方式且有利的是，根据这些多核苷酸的性质，它们不能用作可被扩增并且通过诸如聚合链式反应(“PCR”，聚合酶链式反应)的指数扩增技术进行检测的模板链。因此，不能通过PCR扩增对其进行检测。在该实施方式中，多核苷酸的检测可以在没有扩增的情况下通过杂交法和直接检测而进行，并且仅能由知道所用识别特征的用户完成。另外，试图提取、扩增和复制标记产品中存在的多种多核苷酸的伪造者会受到阻止。另外，有利的是，可以更加快得多地实施仅包括杂交步骤和所述杂交的检测步骤的检测方法。聚合链式反应需要几个小时，而只要检测对于待检测的多核苷酸是特异性的，则多核苷酸的简单杂交几乎瞬间完成。
根据本发明，所用的分析技术可以基于标记物的物理化学性质、编码和特异性。其可以包含靶多核苷酸的指数或线性扩增，可以使用任何其它技术来检测所述标记物的存在。换言之，分析步骤可以包括靶多核苷酸的线性扩增步骤。
在所述分析步骤之前，本发明的方法还可以包括以下步骤：
(a)对产品进行取样；和
(b)提取所述产品的多种多核苷酸。
这里，所述方法由使得能够通过对产品进行取样而对本发明的标记实施检测的方法构成。
提取后，可以如上所述对标记物的存在进行分析。
根据本发明，提取步骤(b)可以通过技术人员已知的任何技术实现，从而从样品中提取多核苷酸。可以根据取决于标记产品的性质的策略对所述多核苷酸进行提取。可以使用已知的或即将出现的任何类型的核糖核酸或脱氧核糖核酸提取技术来从大量标记产品中提取多核苷酸。其可以是例如苯酚-氯仿提取。本发明中能够使用的提取技术例如Molecular Cloning，Maniatis，Cold Spring-harbor，第二版，第E3～E4页[8]所记载。
因此标记产品的分析方法可以由以下步骤组成：从这些产品中提取多核苷酸，检测由识别多核苷酸携带的编码，访问数据库以识别靶多核苷酸，由此对由靶多核苷酸携带的编码进行解密，接着利用该信息以在包括诱骗多核苷酸的多个靶多核苷酸中发现靶多核苷酸，然后检测靶多核苷酸的存在，靶多核苷酸的存在是标记产品的特点(在检测到标记的情况下)或推断出产品是伪造品(在靶多核苷酸不存在或标记与靶/产品数据库不一致的情况下)。
根据本发明的具体实施方式，对分析步骤具有特异性的检测可以包括例如以下连续步骤：
(1)使多种多核苷酸与其上固定有探针序列的固相基质接触，这些探针序列与所述产品的标记的多种多核苷酸中的所述至少一种靶多核苷酸的所述末端中的一个末端互补，所述接触使得能够将靶多核苷酸通过与固定在所述基质上的互补性探针序列杂交而固定在所述载体上；
(2)除去未由步骤(i)杂交的多核苷酸；和
(3)检测所述基质上的靶多核苷酸的存在。
本发明中，步骤(iii)执行的检测可以通过经改进的特定手段实现，例如其可以涉及使用荧光分子的检测、使用发光分子的检测、使用其反应产物可以着色的酶的检测、使用所催化的反应是放热反应的酶的检测、使用所催化的反应会发光的酶的检测、或使用对靶多核苷酸具有特异性的蛋白(例如抗体、酶)的检测。
根据一个具体实施方式，特异性检测还在步骤(i)和(ii)之间包括通过至少一种特异性的靶多核苷酸捕获系统将所述多种多核苷酸捕获在基质上的步骤，在所述系统上固定有所述产品的标记的多种多核苷酸的至少一种靶多核苷酸。
当本发明的标记包含识别多核苷酸时，该具体实施方式的方法还可以在步骤(i)之前包括鉴定这些识别多核苷酸的步骤(x)和根据所鉴定的识别多核苷酸选择固相基质的步骤(y)，这样选择的固相基质包含与根据识别多核苷酸鉴定的靶序列互补的探针序列。
有利的是，该检测方法可以与包括具有恒定末端和可变末端的靶多核苷酸的本发明的标记物一起使用。这些靶多核苷酸如上文所定义。根据本发明，可以通过技术人员已知的任何手段将与靶多核苷酸互补的多核苷酸(称为探针序列)固定在固相基质上。这些基质上检测技术和本发明中可使用的基质的类型记载于Molecular Cloning，Maniatis，Cold Spring-Harbor，第二版，第9.47～9.57页[9]。例如，可以借助于生物素/链霉亲和素连接进行所述探针序列在基质上的固定，探针与生物素分子偶联，而所述基质展示链霉亲和素分子。例如，还可以通过与带电尼龙膜形成共价键来实现探针序列的固定，所述膜形成固相基质。本发明中能够使用的这些技术是例如记载于出版物[10]、[11]和[12]中的那些技术。换言之，与靶多核苷酸互补的多核苷酸是对所寻找的靶多核苷酸具有特异性的捕获系统的实例。
根据本发明，通过与探针序列杂交固定在基质上的靶多核苷酸可以通过技术人员已知的任何合适手段进行检测。其可以例如是利用由标记试剂标记且与靶多核苷酸的另一末端互补的多核苷酸的检测，所述标记试剂能够从包含荧光色素、胶体金颗粒和酶的组中选择。
这种固相基质上的检测模式使得能够容易地、可再现地以及立即地进行对本发明标记物的检测。其可以有利地用于本发明。
本发明的检测方法还可以包括将对靶多核苷酸进行分析的步骤的结果与使得能够鉴定靶多核苷酸的数据库的内容进行比较的步骤，以及使得能够鉴定和认证所述产品并且还能够确定所述产品的来源的靶多核苷酸分析。换言之，数据库和对由编码多核苷酸所携带的编码的解密使得能够从原始产品中鉴定伪造品。
通过使用利用使用包含于标记产品中的靶多核苷酸的所用分析技术发现包含于标记产品中的靶多核苷酸，可以发现与该产品有关的信息。应该存在于所测试产品中的靶多核苷酸的不存在缺失表明可能是所述产品的伪造品。在相同产品中检测到几种本发明的不同标记物或识别多核苷酸可以表明，这是异常的起始混合初始混合物(abnormal initial mixture)的结果。
在待标记的产品的制造步骤期间，可以使本发明标记物的制造商用户与标记物批次的容器的标识符、与例如使用该标记物批次标记的产品批次有关的参考信息相关联。可以例如在与前述数据库相同或不同的数据库中进行该关联。取决于该用户使用的信息系统，优选的是，输入该数据库并且与生产批次相关的所述信息足以能够明确地跟踪该批次。
当对疑似伪造品的产品样品进行分析时，可以将对所鉴定的多核苷酸序列的检测与在标记物的制造和投递期间输入数据库的信息进行比较。
例如如果未鉴定出标记物则可以表征为伪造。如果在已通过询查数据库获得确切组成且已经被部分披露的标记物批次中的至少一种标记物丢失，也可以醒目标记为伪造。如果在批次标记物中应该出现的标记物具有完整性，但所测试的货物并非来自已经接收刚被披露的标记物批次的定单的制造商，也可以表征为伪造。
在滥用分销渠道或平行市场的情形中，产品是真品，并且所披露的标记物的批次实际上对应于投递到所测试产品的制造商的标记物的批次。本发明的方法在收到请求时能够从制造数据库标记物获得标记物批次的标识符。只要示踪性系统允许，该标识符有利地使制造商能够将所标记的产品批次对其客户之一的理论分配与在对产品取样期间所注意到的疑似为平行操作(parallelism)的实际分配进行比较。如果产品的理论分配与实际分配不相符，可能存在分销渠道的滥用。
阅读由经由图示给出的附图进行说明的以下实施例后，对本领域技术人员而言其它优点会变得更显而易见。
附图说明
图1显示NbBpu 10I的切割位点。
图2显示探针在微阵列上的寻址。
图3显示Cy5的发射光谱和吸收光谱。
图4显示基质上的本发明标记物的检测方法：标记物M1和M2以混合物形式存在。它们在固定在微阵列上的探针和通用探针之间建立了一座“桥”：因而检测到信号(Cy5的荧光)。
图5显示用NanoChip工作站(注册商标)(Nanogen Inc.)进行的标记物检测。
图6显示偶联标记的原理。
图8显示检测本发明的标记和认证本发明的标记产品的图。
具体实施方式
实施例
实施例1：根据本发明方法的标记的制造和产品的标记
在该实施例中，所用的靶多核苷酸和诱骗多核苷酸是大小为28个核苷酸的单链脱氧核糖核酸序列。编码多核苷酸是大小为4.3千碱基(kb)的环状DNA序列。
标记产品是香精溶液：J’Adore香水(注册商标，Christian Dior香水)。
完成3种标记，说明在认证方法中有3种可能的假定情况：其中所述产品得到认证的实例和两个其中所述产品未被认证的实例。
I.A靶标记物和诱骗多核苷酸的设计
1.a.1原理
以如下方式产生单链脱氧核糖核酸的10种多核苷酸：10种多核苷酸的5’核苷酸都是相同的，这由用户定义。其大体为GCAACTCCAG序列。然后使用“发明内容”中展示的算法，通过使用以下参数产生18个3’核苷酸：长度等于18个核苷酸的字符串(word)，5个G核苷酸、5个C核苷酸、4个A核苷酸和4个T核苷酸。
然后随机产生各新型多核苷酸，以使得其含有该预定数量的每种碱基。根据Smith和Waterman算法，使用以下参数计算该新型多核苷酸和已经验证的多核苷酸组以及由在该组中将各多核苷酸两两链接所产生的多核苷酸之间的比对评分(对于第一多核苷酸不必进行该步骤)：
AT评分：1匹配
GC评分：1.5匹配
错配罚分：-3
空位(gap)罚分：-2
最小的选择评分为3，这意味着将新型多核苷酸与来自组中的多核苷酸、或来自组中的两个多核苷酸的链接物进行比对，如果评分大于3，则将其排除。否则，其得到验证并将其添加到所述多核苷酸组。重复该步骤直到获得10种多核苷酸。
表1.1显示这些标记物的列表。
表1.1：标记物的序列
Figure BPA00001277201100181
将前5个多核苷酸(引物-1～引物-5)视为靶多核苷酸。将后5个(引物-6～引物-10)视为诱骗多核苷酸。然后将这些标记物与编码标记物一起注入香水中，至最终浓度为10-12摩尔/dm3。
1.a.2材料
-合成多核苷酸(Eurofins MWG GmbH)，100皮摩尔/μL
-H2O，去离子化，无核酸酶
1.a.3方法
将所述10种多核苷酸于三种预标记溶液中混合，在不含核酸酶的去离子水中稀释至每种标记物的最终浓度为10-9摩尔标记物/升(即，总标记物为5×10-9摩尔/L)。对于每种溶液，在不含核酸酶的水中将各标记物以1/100预稀释两次(即使用P10移液管移液1μL，使用P100移液管移液99μL)，即1/10000的中间稀释液。然后，将10μL的每种中间稀释液添加到1.5mL的试管(Eppendorf，注册商标)中，然后添加50μL水(使用P100移液管)而获得100μL的混合物。表1.2展示各自含有选自10种可能的多核苷酸(靶多核苷酸或诱骗多核苷酸)的5种靶多核苷酸的组合的三种预标记溶液(A、B、C)。
表1.2：标记物的组合
  A   B   C
  引物-1   x   x
  引物-2   x   x
  引物-3   x   x
  引物-4   x   x
  引物-5   x   x
  引物-6   x
  引物-7   x
I.B.编码多核苷酸的设计
1.b.1原理
编码多核苷酸是长度等于4.3千碱基(Kb)的单链环状核酸序列。例如，基于质粒pBR322合成该编码多核苷酸。该多核苷酸含有本发明用户已知的连续核苷酸(A、T、G、C)的特定序列。这组成独特编码，该独特编码能够使用户稍后知道理论上靶标记物的哪些组合存在于标记产品中。
该实施例中，编码序列是20个核苷酸的部分，确切地位于已知的通用序列的50个碱基的上游(5’侧)，所述通用序列无论编码序列为何都保持恒定，并且其序列为5’-CTGTAAGCGGATGCC-3’(SEQ ID NO：11)。用户拥有能够使自己将编码多核苷酸的编码序列与标记产品中预期的靶多核苷酸的组合相联系的关联表。
将质粒首先通过限制性酶Nb.Bpu10I消化，该限制性酶切割单链DNA分子，从而识别图1中表示的识别位点：Nb.Bpu10I的切割位点。然后将多核苷酸用核酸外切酶III进行第二次消化，释放来自由Nb.Bpu10I切割的链的3’羟基末端的核苷酸(该核苷酸是环状的)，剩下未经Nb.Bpu10I消化的链。
1.a.2材料
-质粒pBR322，Invitrogen(注册商标)
-NbBpu 10I.(20U)编号：Fermentas，#ER1681
-×R 10缓冲液(缓冲液Nb.Bpu 101)编号#BR5(Fermentas)
-外切核酸酶III(1200U)编号#ENO191(Fermentas)
-核酸外切酶III用反应缓冲液；编号#ENO191(Fermentas)
-UltraPure Phenol(商标)缓冲液饱和苯酚，Invitrogen
-氯仿/戊醇(24∶1)
-3M乙酸钠
-95％、75％冰冻乙醇
-不含核酸酶的去离子水。
1.a.3方法
●消化
在1.5mL试管(Eppendorf，注册商标)中，添加所述质粒(5μg即20μL)、使用移液管P100(Gilson Pipetman，注册商标)添加10倍浓缩的反应缓冲液(40μL)、使用移液管P1000(Gilson Pipetman，注册商标)添加水(399μL)，和使用移液管P10(Gilson Pipetman，注册商标)添加所述酶(1μL)。
表1.3：pBR322的消化
  质粒   20μL
  X 10缓冲液R   40μL
  Nb.Bpu10I(20U)   1μL
  H2O   339μL
使用VTX-400旋转仪(Labo Moderne)进行旋转，然后在37℃将试管温育1小时。用苯酚-氯仿根据以下策略提取DNA：
-使用移液管P200(Gilson Pipetman，注册商标)在试管中添加1/2体积的苯酚(200μL)和1/2体积的氯仿(200μL)，然后旋转10秒。然后以10,000rcf离心5分钟(在具有1.5ml试管“Centrifuge 5415R”(Eppendorf，注册商标)的离心机中)。
-将水相转移到新的1.5mL试管(Eppendorf，注册商标)中，并添加1体积(400μL)的氯仿。以10,000rcf旋转和离心5分钟。重复该步骤5次。
-将水相转移到新的1.5mL试管，然后添加1/10体积的3M乙酸钠(40μL，使用P20)和2.5体积的冰冻乙醇(1000μL，使用P1000)。混合然后在-20℃温育1小时。
-以10,000rcf离心10分钟。弃去上清液并用200μL的75％冰冻乙醇仔细洗涤沉淀。然后露天干燥沉淀。使其返回50μL(使用移液管P100)的不含核酸酶的去离子水中。
用核酸外切酶的处理
在含有50μL提取物的1.5mL试管(Eppendorf)中，使用移液管p100、p20和P200添加表1.4的试剂。
表1.4：pBR322的线性化
  用于ExoIII的反应缓冲液   25μL
  外切核苷酸III(1200U)   6μL
  H2O，不含核酸酶   119μL
-将试管混合然后在30℃温育10分钟。通过在70℃加热10分钟终止反应。
-用苯酚氯仿如步骤1.b.3所述提取DNA，如步骤1.b.3所述使DNA沉淀，然后将多核苷酸吸纳至20μL不含核酸酶的脱矿水中。
使用Nanodrop分光光度计(注册商标)分配吸纳于20μL水中的标记物。然后通过使用P10添加足够体积的不含核酸酶的脱矿水使浓度返回10-9mol/L。
I.C.标记溶液
如此对三种香精J’Adore溶液(注册商标，Christian Dior香水)进行标记。将多核苷酸注入大量产品，最终浓度对于靶多核苷酸和诱骗多核苷酸而言是10-12M，对于编码多核苷酸而言是10-12M。
将第一溶液用预标记溶液A进行标记，预标记溶液A含有靶多核苷酸1和2以及诱骗多核苷酸8、9、10和编码多核苷酸。该溶液对应于其中存在编码多核苷酸的正常标记，和/或该靶多核苷酸的组合实际上对应于由编码多核苷酸携带的信息。
将第二溶液用预标记溶液B进行标记，预标记溶液B含有靶多核苷酸3、4和5以及诱骗多核苷酸6和7以及编码多核苷酸。该溶液充当不相干标记的实例：尽管存在编码多核苷酸，靶多核苷酸的组合与编码多核苷酸含有的信息不一致。
将第三溶液用预标记溶液C进行标记，预标记溶液C含有靶多核苷酸1、2、3、4和5，无诱骗多核苷酸且无编码多核苷酸。该溶液也充当不相干标记的实例：一方面其不包含编码多核苷酸，另一方面虽然其含有正常标记的靶多核苷酸1和2，其含有其它未预期的多核苷酸。
标记后，将溶液贮存于室温或4℃。
I.D多核苷酸的提取
开始鉴定编码多核苷酸和靶多核苷酸之前，建议从组成标记产品(香精)的醇介质中提取标记物。
1.d.1原理
将标记物从其醇介质(香水)中提取，然后为了使用分子生物学鉴定技术的目的使其在水性介质中回收。因此优选的是提取必须具有高产率(回收最大数量的标记物，理想的是：100％产率)，但是此外其必须优选使标记摆脱所有可能会干扰检测技术的“污染”物质。
1.d.2材料
-苯酚：UltraPure(商标)缓冲液饱和苯酚，Invitrogen
-氯仿/戊醇(24∶1)
-3M乙酸钠
-95％冰冻乙醇(Carlo Erba Rectapur)，75％
-不含核酸酶的去离子水。
1.d.3方法
所用的技术是苯酚-氯仿提取技术。对于该实施例，从500μL标记的香水中提取标记物。
-向2mL试管(Eppendorf，注册商标)中的500μL标记香水中，使用移液管P1000(Gilson Pipetman，注册商标)添加1/2体积即250μL的苯酚，然后使用P1000(Gilson Pipetman，注册商标)添加1/2体积即250μL的氯仿，然后使用P1000(GilsonPipetman，注册商标)添加1/2体积即250μL的水，然后旋转10秒。以10,000rcf离心5分钟(在”Centrifuge 5415R”中，离心机，Eppendorf，注册商标)。
-将水相转移到新的2mL试管(Eppendorf，注册商标)中，并添加1体积的氯仿。以10,000rcf旋转和离心5分钟。重复该步骤5次。
-将水相(上方)转移到新试管，然后添加1/10体积的3M乙酸钠(即使用移液管P100添加50μL)和2.5体积的冰冻乙醇(即1250μL，使用P1000分两部分添加)。混合然后在-20℃温育1小时。
-以10,000rcf离心10分钟。弃去上清液并用200μL的75％冰冻乙醇仔细洗涤沉淀。然后干燥沉淀。使用移液管P20将沉淀置于20μL不含核酸酶的去离子水中。
I.E编码多核苷酸的检测
1.e.1原理
首先阅读这些编码多核苷酸的核酸序列中由编码多核苷酸携带的与靶多核苷酸相关的信息(通过测序技术)。这使本发明用户能够通过参考1.b.1中的关联表知道携带产品认证信息的靶多核苷酸的确切性质。
1.d.2材料
-通用正义引物(Eurofins MWG GmbH)，100皮摩尔/μL。
-5’-GGCATCCGCTTACAG-3’(SEQ ID NO：13)
-Big Dye(注册商标)终止剂V3.1(Applied Biosystems)
-模板：所提取的多核苷酸的溶液
-不含核酸酶的去离子H2O。
1.e.3方法
根据表1.5中总结的策略在200μL试管(Eppendorf，注册商标)中基于所提取的标记物的溶液进行测序反应。
表15：测序反应
 试剂   1个序列
 Big Dye(注册商标)   2μL
 多核苷酸(模板)   5μL
 引物10pM   1.6μL
 H2O   q.s 10μL
然后在装置GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystem)上同时使用以下循环进行反应：
-96℃    1’
-96℃    10”|
-50℃    5” |  ＝＞25个循环
-60℃    4’ |
在基于柱的纯化(Qiagen，注册商标)后，在16-毛细管测序仪AB13100(Applied Biosystem)上对反应物进行测序。对结果的分析由此使得本发明的用户能够读取所关注的核苷酸序列，并且进行所读取序列与理论上存在于标记产品中的靶多核苷酸之间的关联。
I.F靶核苷酸的检测
1.f.1原理
使用基质(或DNA微阵列)来检测靶多核苷酸的存在。该基质展示一连串的几个经共价固定的探针、以及标记物的3’可变区的完全反向互补物。附图2表示探针在芯片上的位置。
当使含有假定标记物的提取溶液与该基质接触时，该标记物与其反向互补物在芯片上杂交。洗涤后，使基质然后与含有与荧光素(Cy5)偶联的探针(多核苷酸)的溶液接触，所述探针的序列是标记物的5’通用区的完全反向互补物。
附图3显示Cy5的发射光谱(667nm)和激发(650nm)光谱。
这些探针将自身固定于基质上，并且稍后进行检测。它们的存在使得能够检测起始溶液中相应靶多核苷酸的存在。附图4显示标记物的检测原理。
1.f.2材料
-标记物特异性区域的反向互补探针(Eurofins MWG GmbH)，5’延伸有20个碱基的臂并且被生物素化。
探针 抗-1(SEQ ID NO：14)
5’(B)-TGGATCCCGCACACGACTGACCATGACTCATGGAGTGC 3’
探针 抗-2(SEQ ID NO：15)
5′(B)-TGGATCCCGCACACGACTGATGACGTATGAGTCGCCAC 3′
探针 抗-3(SEQ ID NO：16)
5′(B)-TGGATCCCGCACACGACTGATGATAGAGTCCCCCTGAG 3′
探针 抗-4(SEQ ID NO：17)
5′(B)-TGGATCCCGCACACGACTGATGAGACTTGCCCTAGAGC 3′
探针 抗-5(SEQ ID NO：18)
5′(B)-TGGATCCCGCACACGACTGACTGAGATCCAGAGTCTGC 3′
探针 抗-6(SEQ ID NO：19)
5′(B)-TGGATCCCGCACACGACTGAGATGAGACCTCATGCTGC 3′
探针 抗-7(SEQ ID NO：20)
5′(B)-TGGATCCCGCACACGACTGAGAATGAGACTCCTGCTGC 3′
探针 抗-8(SEQ ID NO：21)
5′(B)-TGGATCCCGCACACGACTGAGAGTATTGCTGAGCCACC 3’
探针 抗-9(SEQ ID NO：22)
5′(B)-TGGATCCCGCACACGACTGATGAGATCACTGCCCTGAG 3′
探针 抗-10(SEQ ID NO：23)
5′(B)-TGGATCCCGCACACGACTGAGATAGAATGTGTGCCCCC 3′
-标记物5’通用区域的多核苷酸反向互补物，在3’处与荧光素(Cy5)偶联；(Eurofins MWG GmbH)：
UnivFluo 5′CTGGAGTTGC-(CY5*)3′(SEQ ID NO：24)
-所提取标记物的溶液
-印迹有探针的可变区的互补物的Nanogen自动处理(商标)芯片和盒(NanoChip(注册商标)Electronic Microarray，100-Site NanoChip(注册商标)Cartridge)
-NanoChip工作站(注册商标)分子生物学工作站(NanoChip(注册商标)Reader，NanoChip(注册商标)Loader)
-L-组胺酸(Invitrogen，编号：0955061IX)
-多分选过滤系统(Millipore(注册商标))
-高盐度缓冲液(磷酸钠500mM，氯化钠500mM，Nanogen(注册商标))
-低盐度缓冲液(磷酸钠50mM，Nanogen(注册商标))
-NaOH 0.1M
1.f.3方法
盒的制备
通过多分选过滤系统(通过Millipore(注册商标))对与标记物的特定区域互补的探针进行纯化，然后使其吸纳至60μL 50mM的缓冲液L-组胺酸中。然后将其转移到盒中。在120秒期间使它们中每一个都寻址到盒的特定位置(由工作站管理策略)。5’中的生物素固定于基质的链霉亲和素上。
表1.6：探针印迹图
  1   2   3   4   5
  1   抗1   抗2   抗3   抗4   抗5
  2   抗6   抗7   抗8   抗9   抗10
标记物的杂交
用高盐度缓冲液(75μL)冲洗盒两次。制备在高盐度缓冲液中(s.a.t 100μL)含有5μL提取物(标记物)以及最终浓度为0.5μM的荧光探针的混合物。从盒中取75μL该混合物的样品，然后在室温使其温育3分钟。倒空盒，然后用75μL高盐度缓冲液冲洗2次。在操作结束时添加75μL高盐度缓冲液。然后使用Nanogen工作站(注册商标)的标准策略启动装置。使可以重新使用的盒再生。
I.G结果的利用和解读
在该第一实施例(参见图5)中对三种标记产品的分析能够刺激产品认证步骤期间尤其是三种可能的配置。
在第一和第二标记产品中，用户能够检测编码多核苷酸的存在。该多核苷酸的实际存在表明该产品可能为真品。关于第三产品，完全没有检测到编码多核苷酸表明该产品未被标记，因此，其不是真品。
阅读由存在于第一和第二产品中的编码多核苷酸所携带的信息之后，用户参考表明编码多核苷酸的编码(对应于靶多核苷酸1和2的存在)的关联表(是否存在诱骗多核苷酸没有影响)。在第一标记溶液中正确地检测出这些多核苷酸，并且仅检测出这两个多核苷酸：第一溶液可能是真品。关于第二溶液，未预期的靶多核苷酸3、4和5的存在使得不能认证所述产品。
实施例2：根据本发明方法标记化妆品
该实施例描述了使用几种单链脱氧核糖核酸多核苷酸的标记，所述标记被注入护肤霜，并根据实施例1所展示的技术进行检测。
II.A.将多核苷酸注入护肤霜
2.a.1原理
首先用不含核酸酶的蒸馏水制备所述标记物，然后以10-12摩尔/dm3霜剂囊片(caplet)的浓度引入靶标记物和诱骗标记物，并且以10-14摩尔/dm3霜剂的浓度引入编码标记物。
2.a.2材料
-合成多核苷酸(Eurofins MWG GmbH)，100pmol/μL
-环状单链脱氧核糖核酸(编码标记物)
-去离子H2O，无核酸酶
-Thermal cream Fix 2(注册商标)，VICHY Laboratories
2.a.3方法
使用移液管P10(Gilson Pipetman，注册商标)将编码靶多核苷酸和诱骗多核苷酸的预混物注入1cm3的Thermal Fix cream(注册商标)样品，产生的靶和诱骗标记物的最终浓度为10-12摩尔标记物/dm3，编码多核苷酸的最终浓度为10-14摩尔/dm3。然后保持样品用于其鉴定。
II.B.标记物的提取和检测
以与实施例1相同的方式检测所述标记物，不同之处在于多核苷酸提取步骤。
2.b.1提取原理
通过将乳液破碎和回收水相来从乳霜中提取标记物。高温(高于80℃)足以减少组成乳霜的乳液并因而分离水相和脂相。极性很强的标记物见于从中提取它们的水相中。
2.b.2材料
-Thermal Fix cream(注册商标)(Vichy)经标记
-加热块或水浴
-去矿质H2O，无核酸酶
2.b.3方法
对标记的霜剂在95℃加热15分钟，然后以10,000rcf离心5分钟。将水相回收，并用于检测所述标记物。
然后根据实施例1所述的方法检测所述多核苷酸。
实施例3：根据本发明方法标记烈酒
该实施例描述使用靶多核苷酸、编码多核苷酸和诱骗多核苷酸对烈酒(spirit)进行标记的技术。第一类标记物(靶多核苷酸)由20种大小为20个碱基的单链脱氧核糖核酸的库组成。第二标记物是大小为1000个碱基的环状单链核酸，其序列含有靶标记物的研究说明。因此，该序列使得能够知道20种靶标记物中哪些靶标记物对于烈酒的编码是有意义的，其它标记物是半随机添加的诱骗物。
III.A标记物和标记的设计
3.a.1标记技术的详细原理
根据本发明说明书中所示算法产生20种单链脱氧核糖核酸标记物。这些标记物相互不同，不会自动杂交，并且不易于相互杂交。它们组成靶多核苷酸。
所述编码多核苷酸是1000个碱基的环状脱氧核糖核酸。在一个给定时间点，该核酸的序列包含含有在产品中要检索的靶多核苷酸的组合的盒。
附图6展示了偶联标记的原理：环状的编码标记物含有通用信息的位点，以及使得能够知道靶标记物中哪些还存在于混合物中并携带编码信息的位点(其它仅是诱骗物)。
因此，仅由编码标记物指定的靶标记物的组合对于认证是有效的，其它标记物仅是诱骗物。
因此编码标记物的序列含有编码盒，其位置是隐藏的。该序列的阅读使用户能够知道哪些标记物是要通过在对应表中交叉校验而在靶标记物的库中寻找的。
靶标记物的组合能够以单一方式鉴定产品：一种唯一可能的组合针对一种可能的产品。在编码标记物中，在用于待寻找的靶标记物的组合的编码盒的下游，是用于与产品相关的通用信息(例如批次、制造年份等)的第二编码序列。
因而将这些标记物注入待标记物的烈酒中。然后在两相中开展检测。首先检测编码标记物的特异性序列。从其得到的第一信息如下：
·产品认证。在粗劣伪造品的情况下，不存在编码标记物。
·产品方面的信息：批次N°，制造日期等。
·待寻找的靶标记物的独特组合以用于更彻底的检测。
如果认为该第一认证不是充分的，对靶标记物进行第二认证。该第二认证能够推断出以下信息：
·在缺乏靶标记物或错误组合的情况下为粗劣伪造品。
·如果除了编码标记物提供的标记物之外检测到其它标记物，则为来自混合物的产品。
·通过咨询数据库获得产品的精确认证。
3.a.2材料
-合成多核苷酸(Eurofins MWG GmbH)，100皮摩尔/μL。
-et Chandon香槟酒(注册商标)，Brut Imperial
-环状单链脱氧核糖核酸(编码标记物)
-不含核酸酶的去离子水
3.a.3方法
α.靶标记物
靶标记物由20种不同的通过化学合成获得的多核苷酸组成(Eurofins MWG GmbH)。使用5个不同产品的标记进行该实施例。在这些产品的每一个中，可以使用20种标记物：
引物-1：5’-AGTCGAGAGCCGATTCCGCT-3’(SEQ ID NO：25)
引物-2：5’-GTCCGAGCAAAGGCTTCCGT-3’(SEQ ID NO：26)
引物-3：5’-AGACCCGTGGGCTCCATTAG-3’(SEQ ID NO：27)
引物-4：5’-CCACCCAGAGGGCTTAGGTT-3’(SEQ ID NO：28)
引物-5：5’-ATCCCACGAGGGTGATCTCG-3’(SEQ ID NO：29)
引物-6：5’-GGAATCCGACCGTGCATGTC-3’(SEQ ID NO：30)
引物-7：5’-CAGAGACGTGACCCGCTGTT-3’(SEQ ID NO：31)
引物-8：5’-GACCCAGGGGTACATTCTCG-3’(SEQ ID NO：32)
引物-9：5’-AAACGAGCCCGTTCCGTGTG-3’(SEQ ID NO：33)
引物-10：5’-GGGAGCCCCAGCATTATCGT-3’(SEQ ID NO：34)
引物-11：5’-GGACGTGAACGCATCCGTCT-3’(SEQ ID NO：35)
引物-12：5′-GGCTGAAGGCCACTACTCTG-3′(SEQ ID NO：36)
引物-13：5’-GTAGGTAGCACACCGTCGCT-3’(SEQ ID NO：37)
引物-14：5’-CAGCCAGGAGATGTCCGTCT-3’(SEQ ID NO：38)
引物-15：5′-GTCCCCAGGTGAGATCATCG-3’(SEQ ID NO：39)
引物-16：5’-CGAGGGACCAGCTTCCGTAT-3’(SEQ ID NO：40)
引物-17：5’-GCCAGTCGCAGGCATGATTC-3’(SEQ ID NO：41)
引物-18：5’-CGCCAGGGTCTCAGTCGTAA-3’(SEQ ID NO：42)
引物-19：5’-GAGCATAGCCGACGTCTTCG-3’(SEQ ID NO：43)
引物-20：5’-GTAGAGTGACACGTCGCTCC-3’(SEQ ID NO：44)
在这20种靶标记物中，实际上仅将10种注入产品中。对于这10种标记物，5种是诱骗物，5种组成产品的有效标记。仅编码标记物的序列能够查出哪些是编码标记物，哪些是诱骗物。另外，产品1～4是
Figure BPA00001277201100291
et Chandon champagne，cuvée impériale 2005(注册商标)的样品，产品编号5是
Figure BPA00001277201100292
et Chandon champagne，cuvée impériale 2002(注册商标)的样品。
表3.1：使用靶标记物1～20标记产品1～5
 产品1  产品2  产品3  产品4  产品5
  引物1   -   D   -   L   -
  引物2   -   D   L   -   -
  引物3   -   D   -   -   -
  引物4   L   L   -   -   L
  引物5   -   D   -   L   -
  引物6   L   L   L   -   L
  引物7   -   D   -   -   -
  引物8   L   L   D   D   L
  引物9   -   -   -   L   -
  引物10   L   L   L   -   L
  引物11   -   -   D   D   -
  引物12   L   L   D   D   L
  引物13   -   -   -   L   -
  引物14   -   -   L   -   -
  引物15   D   -   -   -   D
  引物16   D   -   -   L   D
  引物17   D   -   L   -   D
  引物18   D   -   D   D   D
  引物20   D   -   D   D   D
表3.1说明5种产品的标记。短横线表示未注入标记物。字母L说明注入标记物，并且其充当标记的识别特征。字母D意味着注入标记物，但其充当诱骗物。因此，尽管产品1和2含有不同的诱骗物，它们含有相同的标记物。它们具有相同的识别特征。相反，产品3和4具有相同的诱骗物，但所述标记物是不同的。因此，它们具有不同的识别特征。产品5与产品1具有相同的识别特征。两种产品之间仅编码标记物有区别。
在标记产品中将标记物预稀释至10-7摩尔/L的浓度(将1μL 10-4mol/L的起始溶液稀释于999μL标记产品中，然后将10μL该中间溶液稀释于999μL标记产品中)，将所述标记物以100μL的比率(使用移液管P100)注入，从而获得的产品1～5的每一个的最终浓度为10-9摩尔/L，其最终体积为例如10mL。因此所述产品含有10-8摩尔标记物/升，即10mL中总共10-10摩尔标记物。
β.编码标记物
根据实施例1的策略合成的编码标记物是总长度为1000个碱基的单链脱氧核糖核酸。其序列如下(SEQ ID NO：45)：
5’ CAGAAGAATGCACGCTCTTTAACGCTTCGCCCTAAAATGGGCCATGACTATTGAGAATACGATACCTTCCCGCGTTAGCATCCCTTCCCTGATGCTGGTA GATCTACACCATCTGTACGGGAGATAAGGCTGGCTGTGCGCTTAGACGGGAACTTGGACCGGAAGAATGCGTACAGCCTTACGCGCATCCGAGTCGTCAC CTACCACACGCTCATGCGCACTTTACGGGTAAAAAGTGTTAATCGTAACAGTGTCGGGACCACTCCTATGCTAATACCAGCGTGGTCCAGTGACGTTTTT LACATAGTAGGTGCTCTAATCTTGCAAACCACCGTTTCATTATCTGTTATTCTCCCTTGCTAATGGCCCGCTCAGCACCGGGTGTTCCCAGAGGAGAGCT
标记物1编码产品中待搜索的靶标记物的组合。标记物2编码诸如样品所取自的cuvee酒的一般信息。以下(表3.2)，类型1标记的说明。
表3.2：根据编码标记物的可变位点对靶标记物进行编码
表3.3根据编码标记物的第二信息对产品类型进行编码
Figure BPA00001277201100321
因此，根据实施例1中所述的技术，以10-11摩尔/L的终浓度将特定的编码标记物注入5种产品，指示出哪些编码靶认证标记物支持所述信息，并且指示出在本实施例中样品取自何种年份香槟酒(vintage)。它们含有以下可变序列。
表3.4：产品1～5的标记物的总结
Figure BPA00001277201100322
L＝标记
LP＝标记产品
III.B.标记物的提取
以两步法进行所述检测。第一步在于检测编码标记物。其能够借助第二标记物对产品进行第一认证。然后读取第一标记物使得能够知道要搜索的靶标记物的组合。
3.b.1提取原理
将标记物从其环境(这里为香槟酒)中提取，然后出于能够稍后使用分子生物学鉴定技术的目的，在水性环境中将其回收。所述提取优选应具有高产率(回收最大数量的标记物，理想的是：100％产率)，但是其还应该使标记摆脱任何可能会干扰检测技术的”污染”物质。另外，优选的是其应该对于两种类型的标记物是有效的。
3.b.2材料
-UltraPure Phenol(商标)缓冲液饱和苯酚，Invitrogen
-氯仿/戊醇(24∶1)
-乙酸钠3M
-95％冰冻乙醇(Carlo Erba Rectapur)，75％
-UltraPure糖原，Invitrogen(商标)20μg/μmol
-不含核酸酶的去离子水
3.b.3方法
所用的技术是使用苯酚氯仿进行提取的技术。例如，基于500μL产品(香槟酒)提取标记物。
-在含有500μL标记产品的2mL试管(Eppendorf，注册商标)中，添加1/2体积的苯酚(250μL)、使用移液管P1000添加1/2体积的的氯仿(250μL)，然后旋转10秒。以10,000rcf离心5分钟。
-将水相转移到新的2mL试管(Eppendorf，注册商标)中，并添加1体积(500μL)的氯仿。以10,000rcf旋转离心5分钟。重复该步骤5次。
-将水相转移到新试管，然后添加3μL糖原、1/10体积(50μL)的3M乙酸钠和2.5体积(1250μL)的冰冻乙醇。混合然后在-20℃温育1小时。
-以10,000rcf离心10分钟。弃去上清液并用200μL 75％的冰冻乙醇仔细地洗涤沉淀。然后干燥沉淀。使其处于20μL不含核酸酶的去离子水中。
III.C.编码标记物的检测
3.c.1原理
通过链式聚合技术对编码标记物进行检测。为此需要两种引物。第一类型的引物与位于可变序列1的5’的区域互补。将该引物称为通用(Universal)引物，因为其不依赖于靶标记物的可变性(其识别所有这些标记物共有的位点)。至于第二引物，其与可变位点2互补。因此，使用与可变序列2的类型相同数量的引物对(此处为两对)。
附图7显示通过PCR检测对编码标记物的初步标记。该图继续利用这两种类型的引物、模板以及自身为互补性并且在每个第一PCR循环期间产生的链。
对于每种类型的可变序列2，对从产品中提取的标记物进行聚合链式反应。对于一对引物的编码标记物的特异性扩增揭示了类型2序列的存在。不存在扩增表示未经标记的产品，因此可能是伪造品。使用错误引物对对标记物进行的扩增、或使用几对引物对标记物的扩增揭示了对产品的作伪(对la cuvee的作伪、混合物等)。
3.c.2材料
-Taq聚合酶(Applied Biosystems)AmpliTaq Gold
-10缓冲液×PCR缓冲液II(Applied Biosystems)
-MgCl2溶液(25mM)(Applied Biosystems)
-通用正义引物(Eurofins MWG GmbH)，100pmol/μL
5’ACGTTGCAGCGAGCG 3’(SEQ ID NO：56)
-反义引物(参见可变序列V2：反义引物是其反向互补物)(Eurofins MWG GmbH)，100pmol/μL)
-dNTP(2mM)
-琼脂糖凝胶(琼脂糖电泳级，Invitrogen，编号：15510-027)
-Tris-硼酸盐缓冲液EDTA(TBE)0.5×
-溴化乙锭
3.c.3方法
根据表3.5使用移液管P2、P10和P100在200μL试管(Eppendorf，注册商标)中添加试剂。
表3.5：聚合链式反应
  试剂  体积(μL)
  模板：提取产物   5
  通用正义引物(10pM)   0.5
  特异性反义引物(10pM)   0.5
  缓冲液10X   5
  dNTP(2mM)   2.5
  MgCL2(25mM)   2.5
  AmpliTaq Gold(5U/μL)   0.5
  H2O q.s 50μL   33.5
因此在GeneAmp PCR System 9700装置(Applied Biosystem)上使用以下循环进行聚合链式反应：
-94℃    5’
-94℃    30”|
-55℃    30”|  ＝＞40个循环
-72℃    30”|
-72℃    7’
由此，将聚合链式反应产物沉积在0.5％的制备于TBE 0.5×中的琼脂糖凝胶上，并使其在缓冲液TBE 0.5×中迁移至10V·cm-1。经过足够的迁移时间后，将凝胶置于含有BET的浴液中，冲洗然后在紫外线下显像。对于每种产品，条带的缺失揭示未检测到标记物，或序列2不与所用引物的类型相对应。条带(大小为358bp)对应于扩增，因此对应于检测到编码标记物的特异性序列。
对于每一阳性检测，保持扩增子以用于对靶标记物进行的可能检测。
III.D靶标记物的检测
3.d.1原理
在产品中搜索靶标记物以用于对标记进行更彻底的检测。仅通过阅读编码标记物才可以检测到靶标记物。通过聚合链式反应对此前所获得的扩增子进行所述检测。第一步是阅读编码标记物上含有的信息，因而阅读扩增子上含有的信息。该信息(序列1)使得能够借助关联表知道哪些靶标记物存在于产品中，所述产品的存在携带标记信息。通过知道这点，通过DNA微阵列实现了全部靶标记物的检测。在揭示所述检测后，用户能够知道哪些靶标记物存在或不存在于所述产品中，并且可以将这些结果与通过阅读编码标记物上所携带的信息而在理论上获得的结果进行比较。
3.d.2材料
-通用正义引物(Eurofins MWG GmbH)，100pmol/μL
5’ACGTTGCAGCGAGCG 3’(SEQ ID NO：56)
-Big Dye(注册商标)终止剂V3.1(Applied Biosystems)
-模板：编码扩增子标记物
-不含核酸酶的去离子H2O。
3.d.3方法
根据表3.6中总结的策略在200μL试管(Eppendorf，注册商标)中对每个扩增子进行测序反应。
表3.6：测序反应
 试剂   1序列
 Big Dye(注册商标)   2μL
 扩增子(模板)   5μL
 引物10pM   1.6μL
 H2O   sat.10μL
然后在GeneAmp PCR System 9700装置(Applied Biosystem)上使用以下循环进行反应：
-96℃    1’
-96℃    10”|
-50℃    5” |  ＝＞25个循环
-60℃    4’ |
在基于柱的纯化(Qiagen，注册商标)后，在16毛细管测序仪ABI3100(Applied Biosystem)上对反应物进行测序。
从这些序列的结果中提取可变序列(或标记1)。这些序列使得能够通过咨询下表(表3.7)发现哪些靶标记物必须存在于混合物中：
表3.7：根据编码标记物的可变位点对靶标记物进行编码
Figure BPA00001277201100361
然后根据实施例1中总结的技术对靶标记物进行检测。该检测尽管揭示约10种标记物存在于每种产品中，但是通过与编码标记物相比人们才了解如何汲取相关信息。
实施例4：根据本发明方法标记药品
该实施例显示如何根据本发明的标记方法对形式为囊片的药品(例如许多医学制剂所用的形式)进行标记。使用实施例1的策略。
IV.A.将多核苷酸注入胶囊
4.a.1原理
首先使标记物置于乙醇溶液(80％)，然后在囊片制造过程中以10-12摩/400mg囊片的最终浓度引入靶标记物和诱骗标记物，以10-14摩尔/囊片的浓度引入编码标记物。对于该实施例，囊片不含有任何活性成分。
4.a.2材料
-合成多核苷酸(Eurofins MWG GmbH)，100pmol/μL
-环状单链脱氧核糖核酸(编码标记物)
-不含核酸酶的去离子H2O
-β-乳糖，Sigma Aldrich(注册商标)#L3750-500G
-玉米淀粉，Sigma Aldrich(注册商标)#S4180-500G
-磷酸二氢钙，Sigma Aldrich(注册商标)#307645
-糖浆
-硬脂酸镁，Sigma Aldrich(注册商标)#26454-1KG
4.a.3方法
a.标记物溶液的制备
以与实施例1相同的方式制备所述标记物。
以任何方法实现将预混物置于80％乙醇溶液中，以便在囊片中引入多核苷酸。
b.囊片的制备
从300g粒料制备囊片。根据以下配方，首先将组成粒料的不同粉末称重，然后混合(“Lodigge”型筒式高速造粒机)：
-β-乳糖：120g
-玉米淀粉：60g
-磷酸二氢钙：120g
然后从100g糖浆和750μL标记物溶液制备润湿溶液。然后向粉末的混合物逐渐添加该润湿溶液，直到获得具有粗粒麦粉外观的湿润团块，然后对之前的混合物进行造粒，从而获得湿润的蠕虫状粒料(使用振动式造粒机)。
然后在60℃对粒料进行干燥直到获得的湿度为4～6％，然后在筛柱中筛分从而除去细颗粒。使用1％硬脂酸镁润滑后，将粒料加载到压力机中然后对其进行压制。
IV.B.标记物的提取和检测
与实施例1相同的方式检测所述标记物，不同之处在于多核苷酸提取步骤。
4.b.1提取原理
通过研磨所述囊片，然后回收水相中的多核苷酸来对标记物进行提取。
4.b.2材料
-经标记囊片
-加热块或水浴
-去矿质H2O，无核酸酶
4.b.3方法
使用研钵和研棒对囊片进行研磨，从而获得非常细的粉末。然后将该粉末与1mL蒸馏水在1.5mL试管(Eppendorf，注册商标)中混合。在70℃加热15分钟后，对试管以5000rcf离心5分钟，从而除去固体颗粒。将水相置于新试管以用于多核苷酸认证步骤。然后根据实施例1中所述的方法可以对所述多核苷酸进行检测。
实施例5：根据本发明方法标记食品
该实施例显示如何对诸如比萨面团等食品进行标记和从其中提取标记物。将标记物在制备期间注入新鲜的面团。其后可以在烹饪过或未烹饪过的为消费而准备的最终产品中检测标记物。
V.A面团的标记
5.a.1原理
将标记物在去矿质水中预稀释。如实施例1中所示使用靶多核苷酸、编码多核苷酸和诱骗多核苷酸的混合物。然后将它们引入该比萨面团食谱中，然后对其进行烹饪。
5.a.2材料
-合成多核苷酸(Eurofins MWG GmbH)，100pmol/μL
-环状单链脱氧核糖核酸(编码标记物)
-不含核酸酶的去离子H2O
-比萨面团成分：T45面粉“用于可口制品的通用小麦”Francine(注册商标)、橄榄油“超纯冷压橄榄油”Carapelli(注册商标)、酵母“面包用烘培酵母”Francine(注册商标)，糖“白砂糖”Daddy(注册商标)，盐“必需白细加碘盐”Cérébos(注册商标)。
5.a.3方法
添加根据实施例1中总结而制备的靶标记物、编码标记物和诱骗标记物的预备溶液，并将其以足以获得下述最终浓度的量在比萨面团制造期间使用移液管P200(Gilson Pipetman，注册商标)加至比萨面团，以使获得的标记物的最终浓度为1E-10摩尔/千克(对于每种非诱骗标记物，即2E-9摩尔/千克的多核苷酸)。下表(表5.1)指出用于获得828克比萨生面团的成分的各量。
表5.1：制造经标记的比萨面团
  成分   量或体积
  面粉   500g
  橄榄油   50g
  酵母   12g
  糖   8g
  盐   8g
  水   250mL
  多核苷酸的预备溶液   166μL
然后将面团在烘箱中在平均温度为240℃焙烘15分钟。
V.B.标记物的提取
通过将烹制的面团的一部分溶解于去矿质水来提取标记物：将1g烹制面团缩减成粉末，然后将其置于10mL水中。然后将整个混合物剧烈地混合，随后置于94℃加热15分钟。以10,000rcf离心5分钟后，回收水相，并贮存于4℃以用于检测标记物。根据实施例1中所示的技术对这些标记物进行检测。
实施例6：根据本发明方法标记烟草制品
该实施例显示如何标记烟草制品。使用诸如实施例1中所示的多核苷酸通过烟草制品的直接吸收来对烟草制品进行标记。
VI.A标记烟草制品
6.a.1原理
标记涉及称为“blondes”(Virginia香烟)的香烟的烟草制品。使该样品吸收例如实施例1中所述的靶多核苷酸、编码核苷酸和诱骗多核苷酸的混合物。
6.a.2材料
-合成多核苷酸(Eurofins MWG GmbH)，100pmol/μL
-环状单链脱氧核糖核酸(编码标记物)
-乙醇(变性无水乙醇，Sigma-Aldrich#676829)
-不含核酸酶的去离子H2O
-Marlboro香烟(注册商标)，Philip Morris Products Plc.
6.a.3方法
通过根据实施例1所述方法制备的多核苷酸溶液对烟草制品进行标记。
对1克香烟提取物进行标记从而最终获得10-12摩尔标记物/克烟草制品：使用移液管P200(Gilson Pipetman，注册商标)将足够量的预标记溶液注在烟草制品上，然后将全体在37℃剧烈地混合15分钟。
然后使这样标记的烟草制品保持在16℃的温度和70％的湿度。
VI.B标记物的提取和鉴定
通过将经标记烟草制品浸入去矿质水来提取标记物：使1克烟草制品浸入10mL去离子蒸馏水，然后置于94℃加热15分钟。
以10,000rcf离心5分钟后，回收水相，并贮存于4℃以用于检测标记物。根据实施例1所示技术对这些标记物进行检测。
实施例7：根据本发明方法标记碳氢化合物
该实施例显示如何标记碳氢化合物(原油)和可以使用哪一种技术来提取标记物和检测标记。
VII.A标记碳氢化合物
7.a.1原理
在该实施例中，使用之前在极性有机溶剂中制备的多核苷酸对原油样品进行标记。该标记由如实施例1中所述的靶多核苷酸、编码多核苷酸和诱骗多核苷酸组成。
7.a.2材料
-合成多核苷酸(Eurofins MWG GmbH)，100pmol/μL
-环状单链脱氧核糖核酸(编码标记物)
-不含核酸酶的去离子H2O
-二甲亚砜(DMSO)，Euromedex ref UD8050-A
-原油(IFP)
7.a.3方法
如实施例1中所述制备单链靶多核苷酸、编码多核苷酸和诱骗多核苷酸的溶液。
然后在将标记物插入原油之前在DMSO中实现第二次预备混合。
然后使用精密移液管(Gilson Pipetman，注册商标)将标记物的第二预备溶液与原油混合，其量足以获得最终浓度为10-10摩尔/L的标记物。
然后将经标记的原油贮存于室温，以用于鉴定标记物。
II.B.标记物的提取和检测
7.b.1原理
从标记物的非极性环境中提取标记物，然后在水性环境下回收，以用于稍后使用鉴定技术。
7.b.2材料
-UltraPure Phenol(商标)缓冲液饱和的苯酚，Invitrogen.
-氯仿/戊醇(24∶1)
-3M乙酸钠
-95％冰冻乙醇(Carlo Erba Rectapur)，75％
-不含核酸酶的去离子水
-己烷(Sigma，ref H9379-1L)
7.b.3方法
所用的技术为苯酚-氯仿提取技术。对于该实施例，从500μL原油中提取标记物。
-添加2体积的己烷。
-添加1/2体积的苯酚(250μL)、1/2体积的氯仿(250μL)和1/2体积的水(250μL)，非常剧烈地混合30秒。以10 000rcf离心30分钟。
-将水相转移到新试管，并添加1体积的氯仿。非常剧烈地混合并以10,000rcf离心20分钟。重复该步骤5次。
-将水相转移到新试管，并添加1/10体积的3M乙酸钠和2.5体积的冰冻乙醇。混合然后在-20℃温育1小时。
-以10,000rcf离心10分钟。弃去上清液并用200μL不含核酸酶的去离子水仔细地洗涤。
根据实施例1中所示的技术可以对这些标记物进行检测。
实施例8：根据本发明方法标记新鲜食品
在该实施例中，使用多核苷酸的混合物对新鲜食品进行标记。所述产品为乳制品：酸乳。
VIII.A标记酸乳
8.a.1原理
将标记物预稀释于去矿质水中。该标记由如实施例1中所述的靶多核苷酸、编码核苷酸和诱骗核苷酸组成。
8.a.2材料
-合成多核苷酸(Eurofins MWG GmbH)，100pmol/μL
-环状单链脱氧核糖核酸(编码标记物)
-不含核酸酶的去离子H2O
-Activia酸乳(注册商标)由Danone(注册商标)制造
8.a.3方法
使用移液管P10(Gilson Pipetman，注册商标)向酸乳中添加靶多核苷酸、编码多核苷酸和诱骗多核苷酸的预备溶液，其添加量足以获得最终浓度为1E-10摩尔/千克的标记物(对于每一种非诱骗标记物，即2E-9摩尔/千克的多核苷酸)，然后将2μL预备溶液注入大量产品中。然后使用无菌刮刀(spatula)使全体良好地匀质化。
然后使经标记酸乳贮存于4℃，同时等待鉴定标记物。
III.B.标记物的提取
通过将部分酸乳溶解于去矿质水来提取标记物：取1克酸乳置于10mL水。将全体剧烈地混合然后置于94℃加热15分钟。以10,000rcf离心5分钟后，回收水相，并贮存于4℃以用于检测标记物。可以根据实施例1所示的技术对这些标记物进行检测。
实施例9：根据本发明方法标记饮料
使用例如实施例中所述的多核苷酸对无醇软饮料进行标记：Orangina(注册商标)，Schweppes International Limited。
IX.A标记饮料
9.a.1原理
将靶标记物、编码标记物和诱骗标记物预稀释于去矿质水中。然后将它们直接混入饮料中。
9.a.2材料
-合成多核苷酸(Eurofins MWG GmbH)，100pmol/μL
-环状单链脱氧核糖核酸(编码标记物)
-不含核酸酶的去离子H2O
-Orangina(注册商标)，Schweppes International Limited。
9.a.3方法
在将标记物插入饮料之前在去离子水中实现预先混合。
以足以获得最终浓度为1E-10摩尔/L的标记物(对于每一种非诱骗多核苷酸，即2E-9摩尔/千克的多核苷酸)的量将标记物的预备溶液与饮料混合。
然后将经标记饮料在密封容器中贮存于4℃。
IX.B.标记物的提取
使用实施例1中所示的苯酚-氯仿技术对标记物进行提取。
可以根据实施例1所示的技术对这些标记物进行检测。
实施例10：根据本发明方法标记纸基
该实施例显示如何标记纸基(paper base)然后如何从纸基中提取标记物。通过纸直接吸收标记物。其后通过溶解经标记的纸来检测标记物。
X.A纸的标记
10.a.1原理
将如实施例1中所述的靶多核苷酸、编码多核苷酸和诱骗多核苷酸预稀释于去矿质水中。由此将液滴吸收至纸张表面上。
10.a.2材料
-合成多核苷酸(Eurofins MWG GmbH)，100pmol/μL
-环状单链脱氧核糖核酸(编码标记物)
-不含核酸酶的去离子H2O
-纸盘“1QUALITATIVE Filter Paper”，Whatman(注册商标)。
10.a.3方法
在将标记物沉积于纸张上之前，在去离子水中进行如实施例1中总结的预混。
因此使标记物的预备溶液沉积于纸上，以沉积1E-12摩尔的标记物。使用精密移液管P10(Gilson Pipetman，注册商标)沉积1μL的预备溶液，因此导致5mm-直径圆盘的形成。
使纸在露天干燥然后保持以用于检测标记物。
X.B.标记物的提取
通过将部分纸溶解于去矿质水中来提取标记物：将1cm2含有标记物圆盘的纸切成小片，然后投入10mL水。然后将全体置于94℃加热15分钟。
将纸浆非常剧烈地混合，然后通过使用移液管吸/排使其匀质化。以2000rcf离心5分钟后，回收水相，并贮存于4℃以用于检测标记物。根据实施例1所示的技术对这些标记物进行检测。
实施例11：对根据本发明方法获得的标记产品进行的嗅觉和老化测试
由化妆品实业家联合进行随时间变化的稳定性测试和老化测试。嗅觉测试能够检查通过根据本发明进行标记，靶多核苷酸、编码多核苷酸和诱骗多核苷酸的添加不改变香水的物理化学性质和嗅觉性质。已经对几种香水并且根据以下几个条件进行了这些测试：在5℃一个月(用作对照)，在50℃一个月(刺激香水的加速老化)以及暴露于白昼光一个月。
老化后，测试显示，无论采用何种老化方法，含有多核苷酸的溶液保持与不含有多核苷酸的溶液相同的物理化学性质和嗅觉性质。另外，对于每一瓶，都已提取标记物然后进行成功鉴定。
实施例12：对根据本发明方法获得的标记产品进行的嗅觉和老化测试
图8显示检测本发明标记的检测方案和本发明的标记产品的认证。
在该图中：
1.鉴定编码标记物。第一产品认证水平在于编码标记物的存在。如果所述产品不含有编码标记物，则该产品是伪造品。
2.然后在产品中鉴定诱骗标记物和靶标记物。在该图上，所述产品用一系列的20种假定的靶多核苷酸和诱骗多核苷酸标记。因此，其含有1～20种选自该批次的标记物。在所述方法的该步骤中，靶标记物和诱骗标记物未被区分(不可能说明一种多核苷酸是靶多核苷酸还是诱骗多核苷酸)。
3.然后将第一步期间检测出的编码多核苷酸(此处是多核苷酸A)的性质发送给标记提供者。借助该信息，标记提供者从数据库复原标记的译码密匙，因而允许他/她区分来自所述诱骗多核苷酸和靶多核苷酸系列中的诱骗多核苷酸和靶多核苷酸。
4.使用所述译码密匙，用户仅关注靶多核苷酸。因而用户可以阅读由靶多核苷酸的存在或缺失组成的编码(在该实施例中，编码为-、-、+和-)。
5.因而编码的阅读能够使用户使用安全数据库来检查所述认证编码是否确实与所关注产品相对应。在相反情况下，其可以是非法复制品、产品的混合物或产品滥用。
参考文献
[1]Molecular Cloning，Maniatis，Cold Spring-Harbor，第二版，第C3～C14页.
[2]Smith TF，Waterman MS(1981).Identification of common molecular subsequences，J Mol Biol 1981 Mar 25；147(1)：195-7.
[3]Xin W，Zhang YM，Xiao JH，Huang DW(2003).Construction of linear functional expression elements with DNA fragments created by site-specific DNA nickase，N.Bpu10I，and exonuclease III，Biotechnol Lett.2003 Nov；25(22)：1913-6.
[4]Caruthers MH，Beaucage SL，Efcavitch JW，Fisher EF，Matteucci MD，Stabinsky Y.，(1980)New chemical methods for synthesizing polynucléotides，Nucleic Acids Symp Ser.1980；(7)：215-23.
[5]Wheeler，C.J.，L Sukhu，G.Yang，Y.Tsai，C.Bustamente，P.Felgner，J.Norman，M.Manthorpe.(1996).Converting an alcohol to an amine in a cationic lipid dramatically alters the co-lipid requirement，cellular transfection activity and the ultrastructure of DNA-cytofectin complexes.Bioch.Biophys.Acta 1280：1.
[6]Felgner，J.H.，R.Kumar，C.N.Sridhar，C.J.Wheeler，Y.S.Tsai，R.Border，P.Ramsey，M.Martin，P.L.Felgner.(1994).Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations.J.Biol.Chem.269：2550
[7]Ogris M，Steinlein P，Carotta S，Brunner S，Wagner E(2001)NA/polyethylenimine transfection particles：influence of ligands，polymer size，and PEGylation on internalization and gene expression，AAPS PharmSci.2001；3(3)：E21.
[8]Molecular Cloning.Maniatis，CoId Spring-Harbor，第二版，第E3～E4页.
[9]Molecular Cloning，Maniatis，CoId Spring-Harbor，第二版第9.47～9.57页.
[10]Kabilov MR，Pyshnyi DV，Dymshits GM，Gashnikova NM，Pokrovskii AG，Zarytova VF，Ivanova EM (2002).A new approach to detect a particular DNA sequence by UV-immobilization of its hybridization complex with a highly specific probe resulting from ligation of a tandem of short oligonucleotides in solution，Mol Biol (Mosk).2002 May-Jun；36(3)：424-31.
[11]Ramsay G(1998).DNA chips：state-of-the art.Nat Biotechnol.1998 Jan；16(1)：40-4.
[12]Ivanovskaia MG，Kozlov IA，Lebedeva IV，Shabarova ZA (1994).A new method of covalent immobilization of oligodeoxyribonucleotides on nylon membranes for hybridization with nucleic acids，Mol Biol(Mosk).19949月-10月；28(5)：1176-82.
Figure IPA00001277200600011
Figure IPA00001277200600021
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Claims (26)

1.一种产品标记方法，所述方法包括在所述产品上或在所述产品中添加多种单链多核苷酸的步骤，所述多种多核苷酸包含：
-至少一种由具有预定长度和序列的单链多核苷酸组成的靶多核苷酸，和
-具有相同或不同预定长度和相同或不同预定序列的诱骗多核苷酸，所述诱骗多核苷酸的长度与所述至少一种靶多核苷酸相同或不同，且所述诱骗多核苷酸的序列与所述至少一种靶多核苷酸的序列不同，
其中所述靶多核苷酸和诱骗多核苷酸的每一种都不与所述多种多核苷酸中的任何其它多核苷酸杂交，且
其中所述多种多核苷酸中的多核苷酸是脱氧核糖核酸序列或核糖核酸序列，所述脱氧核糖核酸序列或核糖核酸序列分别包括相同比例的四种天然或修饰碱基A、C、G和T，或A、C、G和U。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述多种多核苷酸还包含至少一种由具有预定长度和序列的单链多核苷酸组成的识别多核苷酸，其用于鉴定所述至少一种靶多核苷酸的性质和序列，其中所述识别多核苷酸的每一种都不与所述多种多核苷酸中的任何其它多核苷酸杂交。
3.如权利要求1所述的标记方法，其中所述多种多核苷酸中的所述多核苷酸是环状或直链的。
4.如权利要求1所述的标记方法，其中使用至少两种靶多核苷酸，一种是环状多核苷酸，另一种是直链多核苷酸。
5.如权利要求3或4所述的标记方法，其中所述直链多核苷酸包含在不同的多核苷酸之间可变的可变末端和在不同的多核苷酸之间恒定的恒定末端。
6.如前述权利要求中任一项所述的标记方法，其中所述多种多核苷酸中的所述至少一种靶多核苷酸的长度为5～50个核苷酸。
7.如前述权利要求中任一项所述的标记方法，其中所述多种多核苷酸中的所述多核苷酸的长度为5～5000个核苷酸。
8.如前述权利要求中任一项所述的标记方法，其中所述添加步骤通过在所述产品制造期间将所述多种多核苷酸添加至最终产品中或最终产品上来进行。
9.如权利要求1～8中任一项所述的标记方法，其中所述添加步骤通过将所述多种多核苷酸添加在所述产品的表面来进行。
10.如前述权利要求中任一项所述的标记方法，其中在添加步骤之前进行将所述多种多核苷酸包封在脂质载体中的步骤。
11.如前述权利要求中任一项所述的标记方法，其中所述多种多核苷酸的引入在所述产品的成分上或其中进行。
12.如前述权利要求中任一项所述的标记方法，其中添加所述多种多核苷酸后所述产品中所述多种多核苷酸的浓度为10-6摩尔/dm3～10-18摩尔/dm3。
13.一种标记产品，所述标记产品能够通过权利要求1～12中任一项所述的方法获得。
14.如权利要求13所述的标记产品，所述标记产品选自包含香精、化妆品、卫生洁品、食品、调味品、植物提取物、烟草制品、饮料、纺织品、皮革制品、药品、粉料、清漆、油墨、食品、碳氢化合物、纸、涂料以及化学产品和化合物的组。
15.一种权利要求13所述产品的标记的检测方法，所述方法包括对所述多种多核苷酸进行分析的步骤，所述分析步骤使得能够特别是检测所述至少一种靶多核苷酸，所述方法包括以下连续步骤：
(i)使所述多种多核苷酸与其上固定有探针序列的固相基质接触，所述探针序列与所述产品标记的多种多核苷酸中的所述至少一种靶多核苷酸的所述末端中的一个末端互补，所述接触使得能够将靶多核苷酸通过与固定在所述基质上的所述互补探针序列杂交而固定在所述基质上；
(ii)除去未由步骤(i)杂交的多核苷酸；
(iii)检测所述基质上的靶多核苷酸的存在；和
(iv)将步骤(iii)的结果与能够鉴定和认证所述产品的数据库的内容进行比较。
16.如权利要求15所述的方法，所述方法在所述分析步骤之前还包括以下步骤：
(a)取得所述产品的样品；和
(b)从所述样品提取所述多种多核苷酸，对从所述样品提取的所述多种多核苷酸完成所述分析步骤。
17.如权利要求15或16所述的检测方法，其中所述分析步骤包括进行所述靶多核苷酸的聚合链式反应。
18.如权利要求15～17中任一项所述的检测方法，其中通过免疫检测进行所述分析步骤。
19.如权利要求15所述的标记检测方法，其中利用生物素/链霉亲和素连接使与所述靶多核苷酸互补的多核苷酸固定在所述固相基质上。
20.如权利要求15所述的标记检测方法，其中通过与不带电的尼龙膜形成共价键而使与所述靶多核苷酸互补的多核苷酸固定在所述基质上，所述膜形成所述固相基质。
21.如权利要求15～20中任一项所述的标记检测方法，其中利用被标记试剂标记且与所述靶多核苷酸的另一端互补的多核苷酸检测固定于所述基质的靶多核苷酸，所述标记试剂选自包含荧光素、胶体金颗粒和酶的组。
22.如权利要求15所述的标记检测方法，其中所述数据库能够确定所述产品的来源。
23.如权利要求15～22所述的标记检测方法，其中所述数据库能够鉴定真正产品的伪造品。
24.如权利要求15～23中任一项所述的标记检测方法，其中步骤(b)所定义的提取为苯酚-氯仿提取。
25.如权利要求15～24中任一项所述的检测方法，其中当所述靶多核苷酸为核糖核酸时，所述分析步骤包括将核糖核酸逆转录成脱氧核糖核酸。
26.如权利要求15～24中任一项所述的检测方法，其中所述分析步骤包括对所述靶多核苷酸进行测序的步骤。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109070130A (zh) * 2016-04-11 2018-12-21 亚普蒂恩（B V I）公司 用于标记纤维素产品的方法
CN110709521A (zh) * 2017-05-31 2020-01-17 罗地亚阿塞托有限公司 标记的乙酸纤维素纤维、生产方法及包含所述纤维的产品

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3082942B2 (ja) * 1989-05-22 2000-09-04 エフ・ホフマンーラ ロシュ アーゲー 核酸による物質の標識及び追跡方法
US6030657A (en) * 1994-11-01 2000-02-29 Dna Technologies, Inc. Labeling technique for countering product diversion and product counterfeiting
ATE347617T1 (de) * 1999-05-06 2006-12-15 Sinai School Medicine Steganographie auf dna basis
US7115301B2 (en) * 2001-04-09 2006-10-03 Rixflex Holdings Limited Method of marking solid or liquid substances with nucleic acid for anti-counterfeiting and authentication
US6558907B2 (en) * 2001-05-16 2003-05-06 Corning Incorporated Methods and compositions for arraying nucleic acids onto a solid support
AU2003216989A1 (en) * 2002-03-01 2003-09-16 The Secretary Of State For The Home Department Improvements in and relating to marking
GB2387437A (en) * 2002-04-09 2003-10-15 Gersan Ets A method of authenticating an article or its origin
AR037006A1 (es) * 2002-06-20 2004-10-20 S I G Sist S De Identificacion Marcador de objetos a identificar consistente en al menos un fragmento de adn.
JP2004329014A (ja) * 2003-04-30 2004-11-25 Id Technica:Kk 偽造行為防止機能を備えた識別手段を付加する識別添加物質及び識別情報保持物並びに識別情報保持物の不正使用検出方法
EP1865070A1 (de) * 2006-06-10 2007-12-12 Cognis IP Management GmbH Verfahren zur Markierung von Produkten mit Nukleinsäuren für den Identitäts- und Herkunftsnachweis der Produkte
JP2008187992A (ja) * 2007-02-08 2008-08-21 National Printing Bureau Ｄｎａ混合体及びその使用並びに真偽判別方法
JP2008187991A (ja) * 2007-02-08 2008-08-21 National Printing Bureau Ｄｎａ及び該ｄｎａの利用並びにｄｎａの異同識別方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109070130A (zh) * 2016-04-11 2018-12-21 亚普蒂恩（B V I）公司 用于标记纤维素产品的方法
CN109070130B (zh) * 2016-04-11 2022-03-22 亚普蒂恩（B V I）公司 用于标记纤维素产品的方法
CN110709521A (zh) * 2017-05-31 2020-01-17 罗地亚阿塞托有限公司 标记的乙酸纤维素纤维、生产方法及包含所述纤维的产品

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