FR2711672A1 - Procédé de sélection et/ou d'obtention de sondes capables de détecter de nouvelles régions à nombre variable de répétitions en tandem, sondes pouvant être ainsi obtenues et leurs utilisations. - Google Patents
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Abstract
Selon le procédé de l'invention, on prépare des ensembles de fragments de restriction provenant de l'ADN d'un individu, ces fragments étant séparés en fonction de leur taille. On prépare par ailleurs des sondes par hydrolyse enzymatique d'ADN d'une banque génomique de l'espèce à laquelle appartient cet individu, puis, par séparation des fragments obtenus en fonction de leur taille, on marque ces sondes, et on les met en contact dans des conditions d'hybridation avec ces ensembles de fragments de restriction. On sélectionne enfin les sondes qui ne donnent pas de profils d'hybridation identiques à ceux obtenus avec les sondes connues reconnaissant des régions à nombre variable de répétitions en tandem. Application des sondes obtenues notamment dans des procédés d'identification d'un individu, de recherche de parenté, ou de contrôle de l'origine d'une semence.
Description
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L'invention a pour objet un procédé de sélection et/ou d'obtention de sondes nucléiques capables'de détecter des nouvelles régions à nombre variable de répétitions en tandem présentes dans le génome des eucaryotes supérieurs, les sondes pouvant être ainsi obtenues et leurs utilisations. Avec le développement de la biologie moléculaire et son application dans la vie courante, les circonstances requérant une identification génétique sont de plus en plus fréquentes. Parmi celles- ci, on peut notamment citer l'identification d'un individu, en particulier lors d'enquêtes de police ou de recherches de paternité, l'identification d'une lignée cellulaire ou bien encore le
contrôle de l'origine d'une semence, qu'elle soit humaine, animale ou végétale.
Toutefois, étant donné la complexité du génome des eucaryotes supérieurs, une analyse
complète de celui-ci, pour un individu donné, est inenvisageable à l'heure actuelle.
Il est par conséquent nécessaire de recourir à l'utilisation de marqueurs de cette identité génétique. Il a récemment été mis en évidence l'existence, dans le génome d'eucaryotes supérieurs, de marqueurs intéressants désignés sous le terme de régions à nombre variable de répétitions en tandem (régions VNTR ou de façon abrégée VNTR), ces régions étant également encore
appelées "régions hypervariables" ou "régions minisatellites".
Chaque locus correspondant à une VNTR est constitué d'une séquence de nucléotides répétée en tandem et dont le nombre de répétitions varie d'un individu à l'autre.Toutefois, toutes les séquences répétées ne sont pas toujours parfaitement identiques. Néanmoins, pour une espèce
donnée, la séquence répétée d'un locus déterminé est fortement conservée.
Les différentes VNTR d'un même individu sont dispersées dans le génome et se distinguent les unes des autres non seulement par la séquence du motif répété mais également par le nombre
de répétitions de leur propre motif.
Parmi les procédés de détection de ces régions utilisés jusqu'à présent, on peut citer le criblage d'une banque à l'aide de sondes nucléotidiques à répétitions en tandem naturelles (Wong et al, Annu, Hum Genet, 51,269288, 1987) ou de sondes synthétiques (Zischler et al,.Genomics, 13, 983990, 1992). On peut également citer le procédé décrit dans la demande de brevet FR 91.10516 consistant en un criblage d'une banque enrichie en VNTR à l'aide de sondes nucléotidiques à répétitions en tandem artificielles ainsi que le procédé consistant en une
recherche systématique dans une banque génomique (Armour et al, Génomics, 8, 501-512).
Toutefois, ces procédés se sont avérés insuffisants dans la mesure o ils n'ont permis de mettre en évidence jusqu'à présent que 10% environ du nombre de VNTR estimé pour l'espèce humaine. On a maintenant découvert que de façon surprenante, en utilisant des fragments d'ADN génomique obtenus après hydrolyse d'ADN à l'aide de certaines enzymes de
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restriction et sélectionnés d'après leur taille, il devenait possible d'obtenir aisément de nouvelles
sondes càpables de nouvelles VNTR.
Par sonde, on entend, dans la présente demande, toute séquence nucléotidique simple brin
pouvant s'apparier à une VNTR, selon les propriétés bien connues d'appariement purine-
pyrimidine des brins complémentaires d'acides nucléiques dans les duplex ADN-ADN, ADN- ARN et ARN-ARN.Ce processus d'appariement s'effectue par l'établissement de liaisons hydrogène entre les bases adénosine-thymine (A-T) et guanosine-cytosine (G-C) de l'ADN double brin; des paires de bases adénosine -uracile (A-U) peuvent également se former par liaison hydrogène dans les duplex ADN -ARN ou ARN-ARN. L'appariement des brins d'acides nucléiques pour la mise en évidence d'une molécule d'acide nucléique est communément appelé
"hybridation d'acides nucléiques" ou simplement "hybridation".
Par nouvelle VNTR on entend une région du génome non encore identifiée comme telle, et
pour laquelle on ne dispose pas de sonde spécifique connue dans la littérature.
La présente invention a pour objet un procédé de sélection et/ou d'obtention de sondes nucléiques capables de détecter de nouvelles VNTR dans le génome d'une espèce donnée, caractérisé par le fait: a) que l'on prépare un ensemble de fragments de restriction provenant de l'ADN d'un individu de ladite espèce, ledit ensemble étant obtenu, de façon connue en soi, par hydrolyse d'un échantillon contenant au moins une partie de l'ADN génomique dudit individu, à l'aide d'au moins une enzyme de restriction coupant à une distance sensiblement constante du site qu'elle reconnaît, puis séparation des fragments de restriction en fonction de leur taille, b) que l'on répète les opérations du paragraphe a) ci-dessus sur des échantillons semblables d'ADN génomique du même individu de façon à obtenir une pluralité de tels ensembles de fragments de restriction, c) que, par ailleurs, on prépare des sondes par hydrolyse enzymatique d'ADN d'une banque génomique de ladite espèce à l'aide d'au moins une enzyme de restriction coupant à une distance sensiblement constante du site qu'elle reconnaît, puis séparation des fragments de.restriction obtenus en fonction de leur taille, sélection des fragments ayant une longueur supérieure à 1.5 kb, et marquage desdits fragments selon les méthodes connues, les fragments de même taille marqués ainsi obtenus constituant une sonde, d) que l'on met en contact, dans des conditions d'hybridation, chacune des sondes ainsi
obtenues avec l'un des ensembles de fragments de restriction obtenus au paragraphe a) ou b) ci-
dessus, e) que l'on sélectionne les sondes qui dans ces conditions sont capables d'hybridation avec des fragments de restriction, d'au moins une longueur déterminée, de l'ensemble de fragments avec lequel la sonde considérée a été mise en contact, f) que l'on sélectionne en outre les sondes qui, avec un ensemble de fragments de restriction, obtenu comme au paragraphe a), d'ADN d'un individu de la même espèce, ne donnent pas des profils d'hybridation identiques à ceux obtenus, avec les sondes connues -3- reconnaissant des VNTR, sur des ensembles de fragments de restriction obtenus de façon analogue et provenant du même individu, g) et que, si désiré, on séquence et/ou synthétise et/ou marque avec un traceur, selon les méthodes connues une sonde nucléique comprenant au moins une partie de la séquence des sondes ainsi sélectionnées. Bien entendu, il est possible par utilisation de méthodes connues, y compris celles du paragraphe g) ci-dessus, de confirmer que la sonde nucléique obtenue par le procédé de
l'invention reconnaît bien une VNTR. On trouvera plus loin dans la description, l'indication
d'autres méthodes permettant d'obtenir une telle confirmation.
Selon un mode de réalisation du procédé selon l'invention, celui-ci comprend après l'étape e) deux étapes supplémentaires d') et e') consistant à répéter les étapes d) puis e), mais avec des ensembles de fragments de restriction obtenus à partir d'ADN d'un individu autre que celui dont provient l'ADN utilisé aux étapes a) et b). Parmi les sondes capables d'hybridation avec un ensemble de fragments de restriction provenant dudit autre individu, on sélectionne, après l'étape e'), celles qui donnent un profil d'hybridation différent de celui obtenu avec les
fragments préparés à l'étape a) ou b).
L'enzyme de restriction utilisée dans le procédé selon l'invention est de préférence une enzyme qui reconnaît une séquence courte et donc fréquente dans le génome, et possède un site de restriction à distance constante ou quasi-constante du site reconnu. Parmi les enzymes possédant les propriétés requises, on peut citer notamment les enzymes de classe II, c'est-à-dire coupant en un site spécifique à proximité du site reconnu ou inclus dans le site reconnu, et les enzymes de classe III, coupant en un site non spécifique mais à une distance constante ou quasi-constante, de l'ordre de 20 bases, du site reconnu. Parmi les enzymes utilisables, on peut citer par exemple Alu I, Hae III et Hinf I. Selon un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, les hydrolyses enzymatiques sont réalisées à l'aide de deux enzymes choisies parmi les enzymes
précédemment citées.
La séparation des fragments de restriction en fonction de leur taille peut être réalisée
par tout procédé connu, par exemple par électrophorèse.
Bien entendu, on entend par taille des fragments la longueur de ceux-ci, exprimée en nombre de nucléotides. Les fragments seront considérés comme de même taille si par la mise en oeuvre du procédé de séparation utilisé, lesdits fragments ne sont pas séparés. Ainsi, par exemple, lorsqu'on utilise comme procédé de séparation l'électrophorèse sur gel d'agarose à 1%, des fragments seront considérés de même taille, si leurs longueurs ne different pas de plus
de 50 à 100 bases environ.
Par banque génomique, on désigne tout mode de stockage du génome d'un individu, ladite banque pouvant être partielle ou totale, c'est-à-dire contenant une partie ou la totalité dudit génome. Les banques génomiques utilisées se présentent notamment sous forme de microorganismes dans lesquels sont insérés selon les méthodes connues des fragments du -4génome ou de la partie du génome à stocker. Parmi les microorganismes couramment utilisés, on peut citer notamment des bactéries, des virus et des levures. Les fragments du génome à stocker sont insérés directement dans le génome du microorganisme récepteur ou sous une forme indépendante telle qu'un plasmide. L'utilisation de ces banques permet, par culture préalable desdits microorganismes, d'augmenter facilement le nombre de copies du génome ou de la partie du génome à étudier. On extrait ensuite le matériel génétique recherché, selon les
méthodes connues.
Dans un mode de réalisation particulier, la banque utilisée pour préparer des sondes
selon le procédé de l'invention est une banque génomique humaine, notamment cosmidique.
Parmi les banques génomiques humaines sous forme de cosmides, on peut citer notamment les banques commercialisées sous la référence "HL 1145y" par la Société Clontech, sous la référence "951202" par la Société Stratagene Cloning System ou celle réalisée à partir du vecteur Supercos I de référence "961200" avec le lysat d'encapsidation de référence "Gigapack
II" commercialisés par la Société Stratagene Cloning System.
Selon un autre mode de réalisation, la banque utilisée est une banque génomique de
rat telle que celle commercialisée sous la référence "RL1032m" par la Société Clontech.
La banque utilisée peut être également une banque génomique de poulet telle que
celle commercialisée sous la référence "951401" par la Société Stratagene Cloning System.
Les sondes utilisées dans le procédé selon l'invention peuvent être marquées par
tout marqueur classiquement utilisé.
Elles peuvent être notamment marquées à l'aide d'un traceur radioactif comme 32p,
33S, 125H, 14C. Le marquage radioactif peut être réalisé selon les méthodes connues.
Les séquences de nucléotides peuvent être notamment marquées en (3') par addition soit d'un ou plusieurs désoxyribonucléotides ou ribonucléotides, soit d'un analogue de nucléotide tel qu'un didésoxynucléotide, marqué en position alpha par le 32p, en présence de la Desoxynucleotidyl Terminal Transferase; les séquences de nucléotides peuvent également être marquées en (5') à l'aide d'une kinase, par exemple la T4 Polynucleotide Kinase; il s'agit dans ce cas du transfert sur les polynucléotides du phosphate radioactif d'un nucléotide marqué en position gamma. Les séquences de nucléotides peuvent encore être marquées à chaque
extrémité par adjonction, en présence d'une ligase, d'une séquence quelconque radiomarquée.
Les sondes peuvent aussi être marquées par amorçage aléatoire ou encore lors de leur synthèse chimique par incorporation d'un ou plusieurs ribonucléotides ou
désoxyribonucléotides radioactifs.
La méthode de détection de l'hybridation dépendra du marqueur radioactif utilisé et pourra reposer sur l'autoradiographie, la scintillation liquide, le comptage de rayonnement gamma ou toute technique connue permettant de détecter le rayonnement émis par le marqueur radioactif. Un marquage non radioactif peut également être utilisé, de façon connue en soi, par exemple en associant aux séquences de nucléotides des substances présentant des propriétés -5- immunologiques, comme un antigène ou un haptène, ou présentant une affinité spécifique pour certains réactifs, comme un ligand, ou encore présentant des propriétés permettant la complétion de réactions enzymatiques, comme une enzyme ou un substrat d'enzyme. Les séquences de nucléotides peuvent être marquées par amorçage aléatoire, ou lors de la synthèse chimique, en incorporant un ou plusieurs ribonucléotides ou désoxyribonucléotides marqués non radioactivement. Le marquage non radioactif peut encore être réalisé par incorporation à l'extrémité (3') d'un ou plusieurs désoxyribonucléotides ou ribonucléotides, ou d'un analogue de nucléotide tel qu'un didésoxynucléotide comportant l'un de ces groupements. Le marquage peut aussi être fait directement par modification chimique de l'oligonucléotide, comme la photobiotinylation ou la sulfonation, ou encore par fixation de colorants spécifiques de l'ADN
qui sont fluorescents quand ils sont fixés, tels que les dimères d'oxazole ou de thiazole orange.
Il peut également être réalisé par addition en (3') ou (5') de molécules traceuses par réaction chimique après synthèse; les séquences de nucléotides peuvent encore être marquées à chaque extrémité par adjonction, en présence d'une ligase, d'une séquence quelconque portant des molécules traceuses. La méthode de détection et de révélation de l'hybridation, réalisée de
façon connue en soi, dépendra évidemment du marqueur non radioactif utilisé.
Les conditions d'hybridation du procédé selon l'invention sont de préférence des
conditions discriminantes, permettant ainsi d'augmenter la spécificité de ladite hybridation.
Parmi ces conditions, on peut citer notamment une température comprise entre 60 et 75 C et en particulier comprise entre 65 C et 70 C, une concentration ionique comprise entre 0,3 et 1,2M et de préférence égale à 0,9 M en ions Na+. L'étape d'hybridation proprement dite est suivie de plusieurs lavages à 65 C à l'aide d'un milieu à concentration ionique plus faible
et en particulier comprise entre 0,015 et 0,15 M en Na+.
Par le procédé selon l'invention, on obtient pour chaque ensemble de fragment un profil d'hybridation. Lorsqu'on obtient des profils d'hybridation différents à partir des ensembles de fragments de restriction d'un même individu mis en contact d'une part avec la sonde obtenue par le procédé et d'autre part avec les sondes déjà connues, on peut conclure que la sonde obtenue est nouvelle, c'est-à-dire qu'il s'agit d'une sonde susceptible d'identifier
une VNTR non encore connue.
Lorsqu'on obtient des profils d'hybridation différents à partir d'ensembles de fragments de restriction d'individus différents, mis en contact avec une même sonde, cela constitue une confirmation de la variabilité de la VNTR détectée. Pour cette raison, les deux individus testés sont de préférence non apparentés afin de diminuer la probabilité de mettre en
évidence des allèles identiques.
Lorsque les profils d'hybridation obtenus sont identiques, c'est-à-dire lorsqu'on observe une hybridation sur des fragments de même taille, on ne peut conclure à l'absence de variabilité de la région détectée, car deux hypothèses sont alors à envisager: soit la sonde utilisée détecte effectivement une région ne répondant pas à la définition d'une VNTR, soit la sonde utilisée détecte bien une VNTR mais les deux individus testés présentent des allèles -6- identiques pour ladite région. Pour conclure, on peut alors analyser un ensemble de fragments de restriction, provenant de l'ADN d'un troisième individu, obtenu de façon identique à celle utilisée pour les ensembles de fragments des deux premiers individus, et ainsi déterminer si la
région testée est variable ou non.
La présente invention a également pour objet les sondes détectant de nouvelles
VNTR pouvant être obtenues par le procédé selon l'invention.
Parmi les sondes selon l'invention, on peut citer notamment: - les nouvelles sondes obtenues selon le procédé de l'invention au départ des banques génomiques humaines commercialisées sous la référence "HL 1145y" par la Société Clontech, sous la référence "951202" par la Société Stratagene Cloning System ou celle réalisée à partir du vecteur Supercos I de référence "961200" avec le lysat d'encapsidation de référence "Gigapack II" commercialisés par la Société Statagene Cloning Système et notamment les sondes décrites dans la partie expérimentale ci-après; - les nouvelles sondes obtenues selon le procédé de l'invention au départ d'une banque génomique de rat commercialisée sous la référence "RL 1032m" par la Société Clontech. - les nouvelles sondes obtenues selon le procédé de l'invention au départ de la banque génomique de poulet commercialisée sous la référence "951401" par la Société Stratagene Cloning System; En particulier, la présente invention a pour objet les nouvelles sondes caractérisées par le fait qu'elles contiennent une séquence d'au moins 40 nucléotides choisie dans la séquence du génome humain contenue dans l'une de cultures suivantes, déposées à la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes (CNCM) à l'Institut Pasteur le Juillet 1993 sous les numéros: - 1-1343 pour le cosmide 159E5 contenant le locus D1S339, - I1344 pour le cosmide 32A8 contenant le locus D1 lS1000, - I-1345 pour le cosmide 33F4 contenant le locus D8S358, - 1-1346 pour le cosmide 51A11 contenant le locus D17S885, et - 1-1347 pour le cosmide 151A7 contenant pour le locus D13S324, lesdites sondes étant respectivement désignées sous les références "CEB88",
"CEB41", "CEB42", "CEB49" et "CEB69".
La présente invention a également pour objet les sondes polynucléotidiques synthétiques ou hémi-synthétiques équivalentes aux nouvelles sondes obtenues par le procédé selon l'invention, (c'est-à- dire des sondes présentant les mêmes propriétés d'hybridation). On peut aussi préparer des sondes modifiées, notamment des sondes d'acides ribonucléiques, ou d'acides désoxyribonucléiques dont l'une des quatre bases est modifiée, et en particulier
remplacée par une base telle que par exemple l'inosine.
L'invention s'étend donc à toute sonde polynucléotique ne se distinguant d'une sonde directement obtenue par le procédé selon l'invention que par l'addition et/ou la délétion
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et/ou la substitution d'un ou plusieurs nucléotides, tout en conservant les mêmes popriétés
d'hybridâtion avec la VNTR reconnue par ladite sonde directement obtenue par ledit procédé.
On peut citer en particulier les polynucléotides dont la séquence est identique à celle d'une partie
de la sonde initialement obtenue, mais est exempte de la ou des régions bordant la VNTR.
Par région bordant, on entend les 200 nucléotides situés de part et d'autre de la VNTR
proprement dite.
On peut bien entendu multiplier par amplification, selon les méthodes connues, les sondes capables de détecter des VNTR obtenues par le procédé de l'invention ou les sondes équivalentes telles que définies ci- dessus. La méthode d'amplification consiste par exemple à utiliser une première amorce complémentaire d'au moins une partie d'une séquence bordante de la région hypervariable, telle qu'elle peut être obtenue à partir des cosmides, et une seconde amorce contenant au moins une partie de la séquence de l'autre région bordante, puis à mettre en oeuvre un processus d'extension enzymatique à l'aide d'ADN-polymérase, suivi d'un processus de dénaturation, et à répéter le cycle hybridation-extension- dénaturation, cette méthode étant connue sous le nom de PCR (brevets US n 4 683 195, 4 683 202 et 4 800 159,et EP n 0 201 184), pour
obtenir un nombre suffisant de copies des sondes selon l'invention.
La présente invention a également pour objet l'utilisation des sondes décrites précédemment. La présente invention concerne en particulier l'utilisation telles que définies précédemment dans des procédés de recherche de parenté, de dépistage de maladies tumorales ou héréditaires,
ou d'identification d'un échantillon biologique.
Selon un mode de réalisation particulier, on utilise les sondes telles que définies précédemment, notamment chez les humains, dans un procédé de recherche de parenté, comprenant: - une première étape dans laquelle on met en contact, dans des conditions d'hybridation, ladite sonde ou lesdites sondes, marquée(s), chacune avec un ensemble de fragments de restriction obtenu par hydrolyse d'un échantillon de l'ADN génomique d'un individu testé, à l'aide d'au moins une enzyme de restriction coupant à une distance sensiblement constante du site
qu'elle reconnaît, puis séparation desdits fragments en fonction de leur taille.
- une deuxième étape dans laquelle on met en contact, dans des conditions d'hybridation, ladite sonde ou lesdites sondes, marquée(s), chacune avec un ensemble de fragments de restriction obtenu par hydrolyse d'un échantillon de l'ADN génomique d'un second individu, dont on veut déterminer s'il est parent dudit individu testé, à l'aide de l'enzyme ou des enzymes de restriction utilisée(s) à la première étape, lesdits fragments étant également séparés en fonction de leur taille, et - une troisième étape dans laquelle on compare la taille des fragments s'hybridant -8- avec la ou lesdites sonde(s) chez les deux individus, étant entendu qu'il y a présomption de
parenté quand la taille des fragments s'hybridant avec la ou lesdites sonde(s) est identique.
On peut conclure à l'existence d'un lien de parenté entre les deux individus, lorsqu'un nombre suffisamment représentatif de fragments s'hybridant avec des sondes obtenues selon l'invention ont la même taille. On peut en particulier utiliser le procédé décrit ci-dessus pour une recherche de paternité selon la méthode décite par Alec Jeffreys (Highly variable minisatellites and DNA fingerprints, Biochemical Society Transactions, Vol 15, pp 309-317, 1987) ou par Wong et al, (Characterisation of a panel of highly variable minisatellites cloned from Human DNA, Ann
Hum Genet 51, pp 269-288, 1987).
Ce procédé peut bien entendu être également appliqué à la vérification de l'origine de toute
semence animale ou végétale.
On peut également utiliser les sondes selon l'invention d'un procédé de dépistage d'un
dérèglement génétique associé à certains cancers ou maladies héréditaires.
Le processus de cancérisation s'accompagne parfois d'une instabilité génétique générale entraînant des mutations et/ou des pertes de fragments chromosomiques, notamment de fragments porteurs de gènes antitumoraux. Cette instabilité générale peut se traduire par une modification du nombre de répétitions des motifs d'une VNTR, ou même par la délétion d'une VNTR. La présente invention a donc en particulier pour objet l'utilisation des sondes telles que définies précédemment dans un procédé de dépistage de maladies tumorales, caractérisé par le fait qu'il comprend: - une première étape dans laquelle on met en contact, dans des conditions d'hybridation, ladite sonde ou lesdites sondes, marquée(s), chacune avec un ensemble de fragments de restriction obtenu par hydrolyse d'un échantillon de l'ADN génomique des cellules testées d'un individu, à l'aide d'au moins une enzyme de restriction coupant à une distance sensiblement constante du site qu'elle reconnaît, puis séparation desdits fragments en fonction de leur taille, - une deuxième étape dans laquelle on met en contact dans des conditions d'hybridation, ladite sonde ou lesdites sondes, marquée(s), chacune avec un second ensemble de fragments de restriction obtenu par hydrolyse d'un échantillon de l'ADN génomique de cellules normales d'un même individu, à l'aide de de l'enzyme ou des enzymes de restriction utilisées à la première étape, lesdits fragments étant également séparés en fonction de leur taille, et -une troisième étape dans laquelle on compare, chez les deux catégories de cellules le nombre et la taille des fragments s'hybridant avec la ou lesdites sonde(s), étant entendu qu'il y a présomption d'une maladie tumorale quand le nombre ou la taille des fragments s'hybridant avec
la ou lesdites sonde(s) diffèere.
Les sondes telles que définies selon l'invention peuvent également être utilisées -9- dans un procédé de dépistage de maladies héréditaires dans lesquelles on observe des pertes de fragments chromosomiques porteurs de VNTR, par exemple des microdélétions télomériques
associées à un retard mental.
L'invention concerne ainsi l'utilisation de sondes telles que définies précédemment, dans un procédé de dépistage de maladies héréditaires, caractérisé par le fait qu'il comprend: - une première étape dans laquelle on met en contact, dans des conditions d'hybridation, ladite sonde ou lesdites sondes, marquée(s), chacune avec un ensemble de fragments de restriction obtenu par hydrolyse d'un échantillon de l'ADN génomique de l'individu testé, à l'aide d'au moins une enzyme de restriction coupant à une distance sensiblement constante du site qu'elle reconnaît, puis séparation desdits fragments en fonction de leur taille, - une deuxième étape dans laquelle on met en contact, dans des conditions d'hybridation, ladite sonde ou lesdites sondes, marquée(s), chacune avec un second ensemble de fragments de restriction obtenu par hydrolyse d'un échantillon de l'ADN génomique d'un individu sain, à l'aide de l'enzyme ou des enzymes de restriction utilisée(s) précédemment, lesdits fragments étant également séparés en fonction de leur taille, et - une troisième étape dans laquelle on compare le nombre de fragments s'hybridant avec la ou lesdites sondes chez les deux individus, étant entendu qu'il y a présomption de l'existence d'une maladie héréditaire quand le nombre des fragments s'hybridant avec la ou
lesdites sonde(s) diffère.
On entend ici par "individu sain" un individu ne présentant pas la maladie
héréditaire soupçonnée.
Les sondes selon l'invention peuvent être également utilisées pour déterminer si un échantillon biologique provient d'un individu donné. Cette utilisation est particulièrement intéressante lors d'enquêtes de police afin de déterminer si un échantillon biologique provient
bien d'un individu soupçonné.
Selon ce mode de réalisation particulier, la présente invention concerne donc l'utilisation des sondes telles que définies précédemment dans un procédé d'identification d'un échantillon biologique, par comparaison avec l'ADN d'un individu testé, caractérisé par le fait qu'il comprend: - une première étape dans laquelle on met en contact, dans des conditions d'hybridation, ladite sonde ou lesdites sondes, marquée(s), chacune avec un ensemble de fragments de restriction, obtenu par hydrolyse de l'ADN dudit échantillon biologique, à l'aide d'au moins une enzyme derestriction coupant à une distance sensiblement constante du site qu'elle reconnaît, puis séparation desdits fragments en fonction de leur taille, une deuxième étape dans laquelle on met en contact, dans des conditions d'hybridation, ladite sonde ou lesdites sondes, marquée(s), chacune avec un second ensemble de fragments de restriction, obtenu par hydrolyse d'un échantillon de l'ADN génomique de l'individu testé, à l'aide de l'enzyme ou des enzymes de restrictions utilisée(s) à la première
-10- 2711672
étape, lesdits fragments étant également séparés en fonction de leur taille, et - une troisième étape dans laquelle on compare la taille des fragments s'hybridant avec lesdites sonde(s) dans l'échantillon biologique et chez l'individu testé, étant entendu qu'il y a présomption que l'échantillon biologique provient de l'individu testé quand la taille des fragments s'hybridant avec la ou lesdites sonde(s) est identique. On peut alors conclure que l'échantillon biologique provient de l'individu testé, lorsqu'un nombre suffisamment représentatif de fragments s'hybridant avec des sondes obtenues selon
l'invention ont la même taille.
Le terme "échantillon biologique" désigne ici tout échantillon dont on peut extraitre l'ADN afin de l'analyser selon le procédé précédemment décrit. Ce peut être notamment un fragment de peau, de la salive, du sperme, etc. Le procédé décrit ci-dessus permet également de vérifier, de façon analogue, si les cellulles
présentes dans un échantillon biologique proviennent bien d'une lignée cellulaire donnée.
Les exemples suivants illustrent l'invention.
EXEMPLE 1: Procédé de sélection des sondes capables de détecter des VNTR a) Préparation des sondes On a utilisé une banque génomique cosmidique commercialisée sous la dénomination "HL 1145 y" par la Société Clontech et ayant comme vecteur le cosmide pWE 15, dont on réalise une suspension à une dilution telle qu'après étalement sur milieu de culture solide LB-agar et culture
de 18 heures à 37 C, on puisse obtenir des colonies isolées, constituées d'un seul clone.
Une fraction de chaque clone est ensuite inoculée dans un puits d'une plaque à 96 puits, -25 contenant un milieu de culture de type "Terrific Broth" (TB) (Sambrook, Fritsch, Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harber Laboratory Press, 1989) et on laisse incuber durant une nuit à 37 C. On réalise alors une réplique de la microplaque sur une membrane commercialisée sous la dénomination de "Hybond N+" par la Société Amersham selon le procédé décrit par le fournisseur. La membrane ainsi obtenue est placée sur milieu de culture TB contenant de l'ampicilline à environ 80 pl, maintenue une nuit à 37 C puis fixée. On ajoute alors dans chaque puits de la plaque un volume de glycérol à 50%, puis on congèle les
plaques et les stocke à une température de -80 C.
En parallèle, on réalise une miniculture de 2 ml dans un milieu TB à partir d'une fraction de chaque colonie,.Lesdites minicultures sont mises à incuber durant 20 heures, à 37 C et sous
agitation.
On réalise alors des groupes provenant du mélange de 24 minicultures correspondant à des clones inoculés sur une même plaque multipuits. On extrait l'ADN -11l- 2711672
cosmidique, pour chaque groupe, selon les méthodes conventionnelles.
Pour chaque groupe, l'ADN cosmidique extrait est remis en suspension dans 300 tlI de Tris mM pH 7,5 EDTA lmM (TE). On prélève alors dans chaque groupe trois fractions aliquotes de 50.ll, auxquelles on ajoute respectivement les couples d'endonucléases de restriction suivants (commercialisées par la Société Appligène): - Alu Iet Hae III - Alu I et Hinf I, - Hinf I et Hae III, chaque enzyme étant une concentration de 20 unités environ pour un volume total
complété à 10 pl.
Après une nuit d'incubation à 37 C, I'ADN hydrolysé est précipité dans l'éthan>ol, séparé,
puis remis en suspension dans 5 il de TE.
On dépose les échantillons, ainsi que des marqueurs de tailles, sur un gel horizontal d'agarose à 1%. On fait migrer les fragments par électrophorèse à environ 12 V/cm en tampon TAE 1X (Sambrook, Fristch, Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Sping
Harbor Laboratory Press, 1989). Le gel est ensuite révélé au bromure d'éthidium.
Pour chaque groupe, et pour chaque hydrolysat, les fragments sont découpés du gel et récupérés par centrifugation, Des 10 à: 20 1il environ de suspension d'ADN ainsi récupérés, on prélève 2 MI que l'on marque au dCTP (32p) selon la méthode décrite par Feinberg et Volgelstein (Anal. Biochem,
132, 6-13, 1983) en utilisant le kit commercialisé par la Société Boehringer.
On obtient ainsi un ensemble de sondes marquées.
D'autres ensembles de sondes marquées ont été obtenus de façon analogue au départ de la banque génomique humaine commercialisée sous la référence "951202" par la Société Stratagene Cloning System utilisant également le vecteur cosmidique pWE 15, et au départ d'une banque génomique humaine réalisée dans le vecteur Supercos I de référence "961200" avec le lysat d'encapsidation de référence "Gigapack II" commercialisée par la Société Stratagen.e Cloning System. b) Préparation des ensembles de fragments d'ADN provenant des individus testés (blots)
On utilise l'ADN provenant des deux individus non apparentés.
On réalise de façon telle que décrite précédemment l'hydrolyse enzymatique de chacun
desdits ADN.
On sépare selon le procédé décrit précédemment les fragments obtenus, les dénature par de l'hydroxyde de sodium 0,4N, puis on transfèere les fragments simple brin séparés sur une
membrane commercialisée sous la dénomination "Hybond N+" par la Société Amersham.
-12- c) Hybridation Les hybridations par ransfert Southemrn blot ont été effectuées à 65 C de la manière décrite
par Vergnaud et al, Electrophoresis, 12, 134-140, (1991).
On réalise une hybridation des blots obtenus pour chaque individu, avec chaque sonde
obtenue ci-dessus.
En parallèle,on réalise avec chaque sonde une hybridation d'une réplique de la plaque
multipuits correspondant à l'ensemble de sondes utilisées.
Les blots et les répliques sont ensuite lavés et on soumet alors à exposition un film de type
Kodak XAR 5 à -80 C, par l'intermédiaire d'écrans amplificateurs.
Lorsque les blots et les répliques sont lavés dans des conditions de moyenne stringence
([Na+] = 0,15 M), la durée de l'exposition est de quelques heures jusqu'à 12 heures.
Lorsque les blots et les répliques sont lavés dans des conditions de moyenne stringence puis relavés dans des conditions de forte stringence ([Na+] = 0,015M), la durée de l'exposition
peut être plus élevée, par exemple 72 heures.
On obtient ainsi des représentations photographiques des hybridations obtenues.
d) Analyse des profils d'hybridation obtenus On compare un des profils d'hybridation obtenus, avec ceux obtenus pour le même individu avec les sondes connues. Lorsque ces profils different, la sonde mise en évidence est
réputée nouvelle.
Si de plus on obtient, à partir d'une même sonde détenue par le procédé, des profils d'hybridation différents pour les deux individus, on peut conclure que la sonde utilisée détecte,
sans nécessité de confirmation supplémentaire, une VNTR.
On repère ensuite sur la réplique de la plaque multipuits, le puits présentant une forte hybridation avec la sonde utilisée pour les deux blots, c'est-à-dire le puits contenant le clone dont
un des brins de l'ADN est complémentaire de ladite sonde.
On dispose alors, dans le puits correspondant de la plaque multipuits, d'un clone permettant
de préparer à nouveau ladite sonde.
Résultats Sur environ 5 000 clones d'une banque commerciale de cosmides de génome humain, analysés selon le procédé décrit ci-dessus, on a isolé environ cinquante nouvelles sondes
détectant de nouvelles VNTR humaines.
Parmi ces nouvelles sondes, cinq sont désignées sous les référence "CEB88", "CEB41",
"CEB42", CEB49" et "CEB69".
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Les cultures correspondantes ont été congelées puis déposées à la CNCM respectivement
sous les'huméros 1-1343, 1-1344, 1-1345, 1-1346 et 1-1347.
La proportion de cosmides contenant au moins une VNTR pour une banque cosmidique du génome humain complet est estimée à 2 ou 3 %. Le procédé décrit ici a permis l'isolement d'une VNTR pour cent cosmides. Ce procédé permet donc la mise en évidence d'au moins 30 à 50%
des séquences VNTR présentes dans la banque.
On a isolé selon le procédé décrit ci-dessus, des VNTR dans différents génomes. C'est ainsi
que la validité du procédé décrit a été testée non seulement chez l'homme, mais aussi chez le rat.
Par exemple, chez le rat, 10 000 clones environ ont été analysés, et une centaine de VNTR ont
été isolées.
-14-
Claims (15)
1. Procédé de sélection et/ou d'obtention de sondes capables de détecter de nouvelles régions à nombre variable de répétitions en tandem dans le génome d'une espèce donnée, caractérisé par le fait: a) que l'on prépare un ensemble de fragments de restriction provenant de l'ADN d'un individu de ladite espèce, ledit ensemble étant obtenu, de façon connue en soi, par hydrolyse d'un échantillon contenant au moins une partie de l'ADN génomique dudit individu, à l'aide d'au moins une enzyme de restriction coupant à une distance sensiblement constante du site qu'elle reconnaît, puis séparation des fragments de restriction en fonction de leur taille, b) que l'on répète les opérations du paragraphe a) ci-dessus sur des échantillons semblables d'ADN génomique du même individu de façon à obtenir une pluralité de tels ensembles de fragments de restriction, c) que, par ailleurs, on prépare des sondes par hydrolyse enzymatique d'ADN d'une banque génomique de ladite espèce à l'aide d'au moins une enzyme de restriction coupant à une distance sensiblement constante du site qu'elle reconnaît, puis séparation des fragments de restriction obtenus en fonction de leur taille, sélection des fragments ayant une longueur supérieure à 1,5kb, et marquage desdits fragments selon les méthodes connues, les fragments de même taille marqués ainsi obtenus constituant une sonde, d) que l'on met en contact, dans des conditions d'hybridation, chacune des sondes ainsi
obtenues avec l'un des ensembles de fragments de restriction obtenus au paragraphe a) ou b) ci-
dessus, e) que l'on sélectionne les sondes qui dans ces conditions sont capables d'hybridation avec des fragments de restriction, d'au moins une longueur déterminée, de l'ensemble de fragments avec lequel la sonde considérée a été mise en contact, f) que l'on sélectionne en outre les sondes qui, avec un ensemble de fragments de restriction, obtenu comme au paragraphe a), d'ADN d'un individu de la même espèce, ne donnent pas des profils d'hybridation identiques à ceux obtenus, avec les sondes connues reconnaissant des VNTR, sur des ensembles de fragments de restriction obtenus de façon analogue et provenant du même individu, g) et que, si désiré, on séquence et/ou synthétise et/ou marque avec un traceur, selon les méthodes connues une sonde nucléique comprenant au moins une partie de la séquence des
sondes ainsi sélectionnées.
2. Procédé selon la revendication 1, comprenant, avec l'étape e), deux étapes supplémentaires d') et e') consistant à répéter les étapes d) puis e) de la revendication 1, mais avec des ensembles de fragments de restriction obtenus à partir d'ADN d'un individu autre que
celui dont provient l'ADN utilisé aux étapes a) et b) de la revendication 1.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que, parmi les sondes capables d'hybridation avec un ensemble de fragments de restriction provenant dudit autre
- 15 -
individu, on sélectionne, après l'étape e'), celles qui donnent un profil d'hybridation différent
de celui obtenu avec les fragments préparés à l'étape a) ou b).
4. Procédé selon l'une quelconques des revendications précédentes, caractérisé par
le fait que ladite enzyme de restriction est choisie parmi les enzymes de classe II ou III.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que ladite enzyme de restriction est choisie dans le groupe constitué par Alu I, Hae III et Hinf I.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le
fait que les hydrolyses enzymatiques sont réalisées à l'aide de deux enzymes de restriction
telles que définies dans la revendication 4 ou 5.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le
fait que ladite banque génomique est une banque génomique humaine, de rat ou de poulet.
8. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que ladite banque génomique est une banque génomique humaine choisie parmi les banques commerciales de référence "HL 1145y" de la Société Clontech, de référence "951202" de la Société Stratagene Cloning System et celle réalisée à partir du vecteur Supercos I de référence "961200" avec le lysat d'encapsidation de référence "Gigapack II" de la Société Stratagene
Cloning System.
9. Sonde nucléique pouvant être obtenue selon le procédé de l'une quelconque des
revendications précédentes.
10. Sonde selon la revendication 9, caractérisée par le fait qu'elle contient une séquence d'au moins quarante nucléotides choisie dans la séquence de génome humain contenue dans l'une des cultures suivantes, déposées à la CNCM sous les numéros 1-1343,
1-1344, 1-1345, 1-1346 et 1-1347.
11. Utilisation d'au moins une sonde telle que définie dans l'une quelconque des
revendications 9 et10, dans des procédés de recherche de parenté, de dépistage de maladies
tumorales ou héréditaires, ou d'identification d'un échantillon biologique.
12. Utilisation selon la revendication 11, dans un procédé de recherche de parenté, entre deux individus, caractérisé par le fait qu'il comprend: une première étape dans laquelle on met en contact, dans des conditions d'hybridation, ladite sonde ou lesdites sondes, marquée(s) chacune avec un ensemble de fragments de restriction obtenu par hydrolyse d'un échantillon de l'ADN génomique d'un individu testé, à l'aide d'au moins une enzyme de restriction coupant à une distance sensiblement constante du site qu'elle reconnaît, puis séparation desdits fragments en fonction de leur taille, une deuxième étape dans laquelle on met en contact, dans des conditions d'hybridation, ladite sonde ou lesdites sondes, marquée(s), chacune avec un ensemble de fragments de restriction obtenu par hydrolyse d'un échantillon de l'ADN génomique d'un second individu, dont on veut déterminer s'il est parent dudit individu testé, à l'aide de l'enzyme ou des enzymes de restriction utilisée(s) à la premiere étape, lesdits fragments étant - 16- également séparés en fonction de leur taille, et une troisième étape dans laquelle on compare la taille des fragments s'hybridant avec la ou lesdites sonde(s) chez les deux individus, étant entendu qu'il y a présomption de
parenté quand la taille des fragments s'hybridant avec la ou lesdites sonde(s) est identique.
13. Utilisation selon la revendication 11, dans un procédé de dépistage de maladies tumorales caractérisé par le fait qu'il comprend: - une première étape dans laquelle on met en contact, dans des conditions d'hybridation, ladite sonde ou lesdites sondes, marquée(s), chacune avec un ensemble de fragments de restriction obtenu par hydrolyse d'un échantillon de l'ADN génomique des cellules testées d'un individu, à l'aide d'au moins une enzyme de restriction coupant à une distance sensiblement constante du site qu'elle reconnaît, puis séparation desdits fragments en fonction de leur taille, - une deuxième étape dans laquelle on met en contact, dans des conditions d'hybridation, ladite sonde ou lesdites sondes, marquée(s), chacune avec un second ensemble de fragments de restriction obtenu par hydrolyse d'un échantillon de l'ADN génomique de cellules normales du même individu à l'aide de l'enzyme ou des enzymes de restriction utilisée(s) à la première étape, lesdits fragments étant également séparés en fonction de leur taille, et - une troisième étape dans laquelle on compare le nombre et la taille des fragments s'hybridant avec la ou lesdites sondets) chez les deux catégories de cellules, étant entendu qu'il y a présomption d'une maladie tumorale quand le nombre ou la taille des fragments
s'hybridant avec la ou lesdites sondes diffère.
14. Utilisation selon la revendication 11, dans un procédé de dépistage de maladies héréditaires, caractérisé par le fait qu'il comprend: - une première étape dans laquelle on met en contact, dans des conditions d'hybridation, ladite sonde ou lesdites sondes, marquée(s), chacune avec un ensemble de fragments de restriction obtenu par hydrolyse d'un échantillon de l'ADN génomique de l'individu testé, à l'aide d'au moins une enzyme de restriction coupant à une distance sensiblement constante du site qu'elle reconnaît, puis séparation desdits fragments en fonction de leur taille, - une deuxième étape dans laquelle on met en contact, dans des conditions d'hybridation, ladite sonde ou lesdites sondes, marquée(s), chacune avec un second ensemble de fragments de restriction obtenu par hydrolyse d'un échantillon de l'ADN génomique d'un individu sain, à l'aide de l'enzyme ou des enzymes de restriction utilisée(s) précédemment, lesdits fragments étant également séparés en fonction de leur taille, et une troisième étape dans laquelle on compare le nombre de fragments s'hybridant avec la ou lesdites sondes chez les deux individus, étant entendu qu'il y a présomption de l'existence d'une maladie héréditaire quand le nombre des fragments s'hybridant avec la ou
lesdites sonde(s) diffère.
- 17 -
15. Utilisation selon la revendication 11, dans un procédé d'identification d'un échantillon biologique contenant de l'ADN génomique, par comparaison avec l'ADN d'un individu testé, caractérisé par le fait qu'il comprend: - une première étape dans laquelle on met en contact, dans des conditions d'hybridation, ladite sonde ou lesdites sondes, marquée(s) chacune avec un ensemble de fragments de restriction obtenu par hydrolyse de l'ADN dudit échantillon biologique, à l'aide d'au moins une enzyme de restriction coupant à une distance sensiblement constante du site qu'elle reconnaît, puis séparation desdits fragments en fonction de leur taille, une deuxième étape dans laquelle on met en contact, dans des conditions d'hybridation, ladite sonde ou lesdites sondes, marquée(s), chacune avec un second ensemble de fragments de restriction, obtenu par hydrolyse d'un échantillon de l'ADN génomique de l'individu testé, à l'aide de l'enzyme ou des enzymes de restriction utilisée(s) à la première étape, lesdits fragments étant également séparés en fonction de leur taille, et - une troisième étape dans laquelle on compare la taille des fragments s'hybridant avec ladite sonde ou lesdites sonde(s) dans l'échantillon biologique et chez l'individu testé, étant entendu qu'il y a présomption que l'échantillon biologique provient de l'individu testé
quand la taille des fragments s'hybridant avec la ou lesdites sonde(s) est identique.
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2680520A1 (fr) * | 1991-08-22 | 1993-02-26 | France Etat Armement | Procede de detection de nouvelles regions hypervariables dans une sequence d'adn, sequences de nucleotides constituant des sondes d'hybridation et leur application biologique. |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4800159A (en) * | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
| US4963663A (en) * | 1988-12-23 | 1990-10-16 | University Of Utah | Genetic identification employing DNA probes of variable number tandem repeat loci |
| EP0402400B1 (fr) * | 1988-02-18 | 1999-09-08 | University of Utah | Identification genetique avec des adn d'investigation ayant des sites repetitifs en tandem en quantite variable |
| US5032501A (en) * | 1989-02-10 | 1991-07-16 | Virginia Mason Research Center | DNA probes to vntr loci |
| US5075217A (en) * | 1989-04-21 | 1991-12-24 | Marshfield Clinic | Length polymorphisms in (dC-dA)n ·(dG-dT)n sequences |
| US5097024A (en) * | 1989-09-25 | 1992-03-17 | Hodes Marion E | DNA probes for fingerpint analysis without tandem repeats |
| US5273878A (en) * | 1990-08-30 | 1993-12-28 | John Groffen | Nucleic acid probes that reveal hypervariable restriction fragment length polymorphisms within the ABR gene |
| US5364759B2 (en) * | 1991-01-31 | 1999-07-20 | Baylor College Medicine | Dna typing with short tandem repeat polymorphisms and identification of polymorphic short tandem repeats |
| US5427932A (en) * | 1991-04-09 | 1995-06-27 | Reagents Of The University Of California | Repeat sequence chromosome specific nucleic acid probes and methods of preparing and using |
| US5378602A (en) * | 1991-05-29 | 1995-01-03 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Highly informative microsatellite repeat polymorphic DNA markers twenty-[seven]six |
-
1993
- 1993-10-29 FR FR9312923A patent/FR2711672B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-10-27 CA CA002134539A patent/CA2134539C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1994-10-31 US US08/331,910 patent/US5573912A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-07-31 US US08/690,129 patent/US5716786A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2680520A1 (fr) * | 1991-08-22 | 1993-02-26 | France Etat Armement | Procede de detection de nouvelles regions hypervariables dans une sequence d'adn, sequences de nucleotides constituant des sondes d'hybridation et leur application biologique. |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| "page 38 and page119", STRATAGENE, PRODUCT CATALOG 1991 * |
| G. VERGNAUD ET AL.: "Detection, cloning, and distribution of minisatellites in some mammalian genomes", EXPERIMENTIA SUPPLEMENTUM (BASEL), DNA FINGERPRINTING: STATE OF THE SCIENCE; ED. BY S.D.J. PENA ET AL., vol. 67, 1993 BIRKENHäUSER VERLAG, BASEL, SWITZERLAND;, pages 47 - 57 * |
| M. LITT AND R.L. WHITE: "A highly polymorphic locus in human DNA revealed by cosmid-derived probes", PROC. NATL. ACAD SCI., vol. 82, September 1985 (1985-09-01), NATL. ACAD SCI., WASHINGTON, DC, US;, pages 6206 - 6210 * |
| Y. NAKAMURA ET AL.: "Variable number of tandem repeat (VNTR) markers for human gene mapping", SCIENCE, vol. 235, 27 March 1987 (1987-03-27), AAAS, WASHINGTON, DC, US;, pages 1616 - 1622 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2134539A1 (fr) | 1995-04-30 |
| US5573912A (en) | 1996-11-12 |
| FR2711672B1 (fr) | 1995-12-08 |
| US5716786A (en) | 1998-02-10 |
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