FR2908133A1 - Nouveaux analogues de nucleotides comme molecules precurseurs d'antiviraux - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un dérivé phosphonate de purine ou de pyrimidine de formule (I) suivante : dans laquelle (i) B est une base purine ou pyrimiaine choisie dans le groupe comprenant l'adénine, la xhantine, l'hypoxanthine, la guanine, la 8-bromoguanine, la 8-chloroguanine, la 8-aminoguanine, la 8-hydrazinoguanine, la 8-hydroxyguanine, la 8-méthylguanine, la 8-thioguanine, la 2-aminopurine, la 2,6-diaminopurine, la thymine, la cytosine, l'uracile, la 5-bromouracile, la 5-iodouracile, la 5-éthyluracile, la 5-propyluracile, la 5-vinyluracile et la 5-bromovinyluracile ; (ii) R1 est choisi dans le groupe comprenant un atome d'hydrogène, un groupement méthyle, éthyle, hydroxyméthyle et hydroxyéthyle ; (iii) R2 est choisi dans le groupe comprenant un atome de fluor, un groupement hydroxyle, un groupement BH3, un groupement alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 8 carbones et un groupement amine R'HN dans lequel R' est un groupement alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 8 carbones ; et (iv) X est choisi dans le groupe comprenant un atome d'oxygène, un atome de Sélénium et un atome de souffre ; ainsi qu'un intermédiaire phosphinate permettant d'obtenir un tel dérivé phosphonate ; une composition pharmaceutique comprenant un tel dérivé phosphonate et l'utilisation d'une telle composition pour la préparation destiné à traiter et/ou prévenir une infection virale chez un patient.

Description

NOUVEAUX ANALOGUES DE NUCLÉOTIDES COMME MOLÉCULES PRÉCURSEURS D'ANTIVIRAUX

La présente invention concerne de nouveaux analogues de nucléotides, leur procédé de synthèse et leur utilisation 5 en tant que précurseurs d'antiviraux. La polymérase d'un virus est essentielle dans le processus de réplication virale. Après infection d'une cellule cible par le virus, elle catalyse la synthèse du génome viral et la reproduction du virus qui établit alors 10 une infection persistante. Cette enzyme représente une cible privilégiée des traitements antiviraux en raison de son rôle dans la réplication du virus. Les inhibiteurs nucléosidiques sont la première classe d'antirétroviraux qui a prouvé son efficacité clinique et 15 constituent un maillon essentiel du traitement antirétroviral actuel. Cette classe de médicaments fait l'objet d'une recherche thérapeutique très active dans le but de mettre au point des analogues plus performants que ceux actuellement utilisés en thérapie, tant par une 20 activité antivirale plus puissante que par une pharmacologie plus avantageuse. Concernant leur mode d'action, ces analogues de nucléoside, après pénétration de la cellule infectée, sont phosphorylés par les kinases cellulaires en 5'- 25 triphosphates. S'ils sont de mauvais substrats pour les polymérases cellulaires, ils sont en revanche incorporés dans la chaîne d'ADN viral en croissance par la transcriptase inverse. Comme ces analogues ne possèdent pas de groupements 3'-OH, leur incorporation produit une 30 terminaison de synthèse d'ADN responsable de l'effet antiviral. Malheureusement, les traitements utilisant des analogues nucléosidiques perdent rapidement de leur 2908133 2 efficacité au cours du temps, alors qu'émergent simultanément des virus résistants. Cette résistance virale est due à l'apparition de mutations dans le gène pol codant pour la transcriptase inverse. Ainsi, chaque analogue de nucléotide sélectionne des mutations à l'origine des mécanismes de résistance de la RT. L'abondance des souches du VIH-1 résistantes à plusieurs molécules antivirales rend la situation actuelle très préoccupante : il est de plus en plus fréquent que de telles souches virales soient acquises dès la primo-infection d'un patient, qui se trouve alors dans une impasse thérapeutique. Il est donc urgent de développer de nouveau antiviraux plus actifs et surtout plus actifs sur ces souches résistantes pour optimiser les thérapies antivirales combinant plusieurs médicaments. Les analogues nucléotidiques de type phosphonate où un des atomes d'oxygène simplement lié au phosphore est substitué par un groupement CH2, isostères et isoélectroniques des phosphates, ont largement été étudiés et notamment les travaux de A. HOLY en font le pionnier dans ce domaine pour la synthèse d'analogues phosphonates acycliques. L'intérêt principal des phosphonates réside dans le fait que ce sont des composés monophosphates qui permettent de contourner la première étape de phosphorylation, souvent limitante dans l'efficacité de l'analogue de nucléoside. Ils présentent une bonne stabilité chimique et enzymatique et une durée de vie élevée dans les fluides biologiques et dans les cellules. Leur mode de pénétration cellulaire ainsi que leur phosphorylation intracellulaire ont été décrits (ROBBINS et al., Antimicrob. Agents Chemother., vol.42(3), p :612-617, 1998). 2908133 3 La société GILEAD possède actuellement sur le marché deux molécules antivirales de type nucléotide phosphonate acyclique : le cidofovir ou HPMC (VISTIDE ) contre le cytomégalovirus (CMV) et le ténofovir ou (R)-PMPA sous 5 forme de prodrogue (VIREAD ) qui a été approuvé par la FDA en octobre 2001 en monothérapie contre le VIH-1 et qui a obtenu l'AMM en Europe en février 2002, ou encore le PMEA (HEPSERA ) contre le VHB. Concernant la résistance de ces composés, il est admis 10 que seule la mutation directement sélectionnée à basse fréquence contre le ténofovir est la mutation K65R (DEAVL et al., J. biol. Chem., vol.279(l), p :509-516, 2004). Pour autant, la synthèse de telles molécules avec des rendements quantitatifs se révèle difficile et, au regard 15 de l'apparition de résistance des virus aux rétroviraux utilisés aujourd'hui, il est important de développer rapidement de nouveaux antiviraux efficaces. Les inventeurs ont développé une méthode de synthèse permettant l'obtention de nouveaux analogues phosphonates. 20 En outre, les inventeurs ont pu démontrer que certains de ces analogues présentaient une efficacité comparable à certains analogues connus mais avec une moindre toxicité. Enfin, les inventeurs ont également pu mettre en évidence que la mutation K65R n'était pas résistante à certains de 25 ces analogues. En conséquence, un premier objet de l'invention consiste en un dérivé phosphonate de purine ou de pyrimidine de formule (I) suivante : B CH2 CH (RI) OCH2 PR2OH X (I) 30 2908133 dans laquelle : • B est une base purine ou pyrimidine choisie dans le groupe comprenant l'adénine, la xanthine, l'hypoxanthine, la guanine, la 8-bromoguanine, la 8-chloroguanine, la 8-aminoguanine, la 8-hydrazinoguanine, la 8-hydroxyguanine, la 8-méthylguanine, la 8-thioguanine, la 2-aminopurine, la 2,6-diaminopurine, la thymine, la cytosine, l'uracile, la 5-bromouracile, la 5-iodouracile, la 5-éthyluracile, la 5- propyluracile, la 5-vinyluracile et la 5- bromovinyluracile ; • R1 est choisi dans le groupe comprenant un atome d'hydrogène, un groupement méthyle, éthyle, hydroxyméthyle et hydroxyéthyle ; • R2 est choisi dans le groupe comprenant un atome de fluor, un groupement hydroxyle, un groupement BH3, un groupement alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 8 carbones et un groupement amine R'HN dans lequel R' est un groupement alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 8 carbones ; et • X est choisi dans le groupe comprenant un atome d'oxygène, un atome de Sélénium et un atome de souffre. Avantageusement, B est une base purine ou pyrimidine choisie dans le groupe comprenant l'adénine, l'uracile, la thymine, la guanine et la cytosine, de préférence B est une adénine. 30 Avantageusement, R1 est choisi dans le groupe comprenant un atome d'hydrogène, un groupement méthyle et un groupement hydroxyméthyle. 4 5 10 15 20 25 2908133 5 Avantageusement, R2 est choisi dans le groupe comprenant un atome de fluor, un groupement hydroxyle, un groupement alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 8 carbones et un groupement amine R'HN dans lequel R' est un 5 groupement alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 8 carbones Avantageusement, X est un atome de soufre ou de sélénium. Selon un mode de réalisation préféré, X est un atome de 10 soufre et R2 est un groupement hydroxyle. Selon un second mode de réalisation préféré, X est un atome d'oxygène et R2 est choisi dans le groupe comprenant un atome de fluor, un groupement BH3r un groupement alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 8 carbones. 15 Les composés de formule (I) peuvent être préparés selon les voies de synthèse décrites dans les exemples à partir d'un intermédiaire précurseur H-phosphinate. En effet, les inventeurs ont mis en évidence que les dérivés de formule (I) peuvent être obtenus avec un rendement 20 significatif à partir d'un intermédiaire précurseur H-phosphinate. En conséquence, un deuxième objet de l'invention consiste en un intermédiaire précurseur H-phosphinate de formule (II) suivante : 25 B CH2 H (R1) OCH2 PHOH O (II) dans laquelle : • B est une base purine ou pyrimidine choisie dans le groupe comprenant l'adénine, la xanthine, 30 l'hypoxanthine, la guanine, la 8-bromoguanine, la 8-chloroguanine, la 8-aminoguanine, la 8- 2908133 6 hydrazinoguanine, la 8-hydroxyguanine, la 8-méthylguanine, la 8-thioguanine, la 2-aminopurine, la 2,6-diaminopurine, la thymine, la cytosine, l'uracile, la 5-bromouracile, la 5- iodouracile, la 5-éthyluracile, la 5- propyluracile, la 5-vinyluracile et la 5- bromovinyluracile ; et • R1 est choisi dans le groupe comprenant un atome d'hydrogène, un groupement méthyle, éthyle, hydroxyméthyle et hydroxyéthyle. Il est entendu que l'invention n'est pas limitée à une voie de synthèse particulière, et s'étend à d'autres procédés permettant la production des dérivés de formule (I) sans passer par l'intermédiaire de formule (II). 15 Un troisième objet de l'invention consiste en une composition pharmaceutique comprenant un dérivé phosphonate de purine ou de pyrimidine de formule (I) tel que décrit précédemment ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci. 20 Avantageusement, B est une base purine ou pyrimidine choisie dans le groupe comprenant l'adénine, l'uracile, la thymine, la guanine et la cytosine, de préférence B est une adénine. Avantageusement, R1 est choisi dans le groupe 25 comprenant un atome d'hydrogène, un groupement méthyle et un groupement hydroxyméthyle. Avantageusement, R2 est choisi dans le groupe comprenant un atome de fluor, un groupement hydroxyle, un groupement alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 8 30 carbones et un groupement amine R'HN dans lequel R' est un groupement alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 8 carbones 5 10 2908133 7 Avantageusement, X est un atome de souffre ou de sélénium. La formulation des compositions pharmaceutiques selon l'invention est du type généralement utilisée dans le 5 domaine pharmaceutique. À titre d'exemple, il peut s'agir de vecteurs pharmaceutiques tels que, par exemple, des sels ou des électrolytes, des sels de l'acide ascorbique, de l'eau ou des solutions tamponnées, des solutions colloïdales, des 10 substances à base de cellulose, du polyéthylène glycol, des polyacrylates, des cires, des protéines, ou tout autre substance capable de dissoudre ou de rendre le composé actif disponible pour une action thérapeutique. Les compositions de la présente invention peuvent 15 être administrées sous forme injectable ou par voie orale, parentérale, nasale sous forme de spray, rectale ou vaginale, par l'implantation de réservoir ou dispensateurs ou sous tout autre forme galénique en usage dans le domaine pharmaceutique. 20 Un quatrième objet de l'invention consiste en l'utilisation d'une composition thérapeutique telle que décrite précédemment pour la préparation d'un médicament destiné à traiter et/ou prévenir une infection virale chez un patient. 25 Par patient, on entend un mammifère, de préférence un humain. Par infection virale, on entend une infection par un virus à ADN ou à ARN. À titre d'exemple de virus à ADN, on peut citer la famille des Hepadnaviridae (VHB), des 30 Herpesviridae (HSV-1 et HSV-2) et des Poxviridae (vaccinia). À titre d'exemple de virus à ARN, on peut citer les virus de la famille des Bunyavirus (punto toro), des Flaviviridae (VHC), des Orthomyxoviridae, des 2908133 8 paramyxoviridae (parainfluenza 3 et VRS), des Picornaviridae (Coxsackie B4), des Rétroviridae (VIH-1 et VIH-2) et des Togaviridae (Sindbis). Les exemples qui suivent sont fournis à titre 5 d'illustration et ne sauraient limiter la portée de la présente invention. Exemple 1 : synthèse de différents dérivés phosphonate de nucléosides : Une méthode de synthèse originale a été mise au point 10 laquelle fait, en l'occurrence, appel à une molécule intermédiaire précurseur de type H-phosphinate, qui a permis de synthétiser 3 séries d'analogues : - les a-boranophosphonates -les thiophosphonates 15 -les sélénophosphonates Schéma 1 : synthèse des dérivés boranophosphonates, sélénophosphonates et thiophosphonates à partir de la molécule précurseur H--phosphinate : i) BSA ii) BH3-DIPEA o I HO'%i) BSA H R ii) Se / pyridine i) BSA ii) S8/CS2/pyridine R R = H, dérivé du PMEA (6) R = CH3,dérivé du PMPA (11) 20 2908133 9 1) synthèse de dérivés de nucléosides a- boranophosphonates : La stratégie utilisée pour la préparation de nucléosides a-boranophosphonates est décrite dans le 5 schéma 2. Les stratégies décrites pour la préparation des nucléosides a-boranophosphates via un intermédiaire phosphoramidite ou H-phosphonate ne sont pas applicables pour la synthèse des dérivés a-boranophosphonates et ont nécessité la mise au point d'un procédé de synthèse 10 spécifique. Cette stratégie de synthèse a permis d'obtenir une voie efficace de boronation d'un intermédiaire activé H-phosphinate pour préparer les composés cible 9-[2-(Boranophosphonomethox:y)ethyl]adenine (6a) et (R)-9-[2-(Boranophosphonomethox:y)propyl]adenine (6b). 15 Schéma 2 : NH2 a(R=H)orh\~ b(R=Me) N''ùN L OH R d IaR=H tbR=Me 3aR=H 3b R = Me R 4aR=H 4b R = Me 5aR=H 5b R = Me ..,,OSE(CH3)3 OSi(CH3)3 BH3 0\ PV--Q~iE(eH3)3 OSi(CH3)3 2908133 10 Réactifs et conditions : (a) 2-bromoethylbenzoate, NaH, DMF, 60 C, 16h puis NH3/MeOH saturant 14h ; (b) (R)- propylène carbonate, NaOH, DMF, 140 C, 16h ; (c) 5 diethyl[[(p-toluènesulfonyl)oxy]methyl] phosphonate (2), sodium tert-butoxide, DMF, rt, 72h ; (d) TMSC1, LiAlH4r THF, -78 C puis température ambiante 2h ; (e) H202, H20/THF, température ambiante 1h ; (f) BSA, THF, température ambiante, 1h ; (g) BH3r DIPEA, THF, température 10 ambiante, 1h ; (h) NH4OH :MeOH (1 :1, v/v). La réaction de l'adénine et du 2-bromoéthylbenzoate en présence de NaH dans le DMF à 60 C est suivie par le clivage du groupe protecteur benzoate dans le MeOH saturant avec de l'ammoniac donne le composé la avec un 15 rendement de 84 %. La condensation de l'adénine avec le (R)-propylène carbonate dans le DMF à 140 C pendant 16 h en présence d'hydroxyde de sodium en quantité catalytique permet d'obtenir l'alcool pur lb isolé directement par cristallisation à partir du mélange réactionnel avec un 20 rendement de 81%. Les alcools résultants la et lb sont alkylés avec du diéthyl ptoluènesulfonyloxyméthanephosphonate 2 en présence de sodium tert-butoxide dans du DMF ce qui permet d'obtenir les diéthyl phosphonates 3a et 3b avec un rendement de 27% 25 et de 29% respectivement. L'étape de réduction avec le LiAlH4 des deux diesters de phosphonate 3a et 3b dans le THF médiée par l'addition d'une quantité stoechiométrique de TMSC1 permet d'obtenir les phosphines 4a et 4b avec un rendement de 78 et 65% 30 respectivement. Les phosphines 4a et 4b sont ensuite isolées simplement, purifiées et caractérisées. Lesdites phosphines sont ensuite oxydées avec deux équivalents de péroxyde d'hydrogène dans un mélange eau/THF pour obtenir les H-phosphinates 5a et 5b avec un 2908133 11 rendement quantitatif. L'évolution de la réaction est suivie par spectroscopie RMN 31P. L'oxydation des composés 4a et 4b s'avère être rapide et la réaction est complète après 1 heure. L'étude des spectres RMN 31P RMN a permis 5 d'établir que les signaux pour 4a (b: -144.67 ppm, tt, 1JPH = 199.0 Hz et 2JPH = 7.8 Hz) et 4b (S: -144.86 ppm, tt, 1JPH = 198.5 Hz et 2JPH = 7.3 Hz) sont remplacés par de nouvelles résonances à 21.15 pour 5a (dm, 1JPH = 528 Hz) et 24.64 ppm pour 5b (dm,1JPH = 528 Hz). 10 Comme l'atome de phosphore de l'intermédiaire H-phosphinate ne présente pas une paire d'électrons libres et n'est pas un bon donneur pour l'introduction du groupe BH3, la procédure de boronation nécessite une activation intermédiaire in situ du H-phosphinate avec un agent de 15 silylation pour obtenir un disilyl phosphonite. Les H-phosphinates 5a et 5b sont activés in situ dans du THF anhydre avec du N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamide (BSA) pendant 1 h en leurs intermédiaires disilyl phosphonites correspondants. Différents complexes de bore ont été 20 testés dans différents solvants pour optimiser les conditions de boronation. Une boronation rapide et efficace est finalement obtenue avec le complexe borane-N,N-diisopropyléthylamine (BH3 :DIPEA). Les complexes borane-tétrahydrofuran (BH3 :THF), borane-pyridine 25 (BH3 : Pyridine) , et borane-diméthyl sulfide (BH3 :Me2S) requièrent des temps de réaction importants et/ou ne permettent d'obtenir qu'un rendement moindre. En outre, afin de réduire la formation de produits diboranés, la quantité de complexes de bore a été réduite à un maximum 30 de 2 équivalents pour obtenir le meilleur compromis entre la consommation du matériel initial et l'apparition de produits secondaires. phosphonites de 5a et résulte en la La boronation in situ des disilyl 5b avec 2 équivalents de BH3:DIPEA formation d'intermédiaires a- boranophosphonate. Sans obtenus ont été traités isolation, les intermédiaires avec de l'hydroxyde d'ammonium 2908133 12 concentré (30%) dans le méthanol (1:1, v/v) pour cliver les groupes triméthylsilyl permettant ainsi d'obtenir les aboranophosphonates 6a et 6b. La présence de la liaison P-B a été confirmée par RMN 31P qui montre un pic typique à 5 83 ppm et 98 ppm respectivement. Les a-boranophosphonates 6a et 6b sont purifiés par chromatographie en phase inverse avec un rendement de 28% et 32% respectivement. 2) synthèse de dérivés de nucléosides thiophosphonate : 10 Les dérivés thiophosphonates du PMEA et du PMPA (composés 6 et 11, ci-dessous) sont des analogues nucléotidiques acycliques où l'atome d'oxygène doublement lié au phosphore a est remplacé par un atome de soufre. 15 NH2 KNN S Il -0 o XV0 6 thiophosphonate du F'MEA S-PMEA Structures des thiophosphonates du PMEA 6 (S-PMEA) et du PMPA 11 (S-PMPA) 20 Comme l'indique le schéma 3, la première étape de préparation de ces deux composés inédits consiste à substituer l'adénine 1 afin d'obtenir la 9-(2- Hydroxyéthyl)adénine (analogue du PMEA) 2 (Rdt = 85%) et la ( R)-9-(2-Hydroxypropyl)adénine (analogue du PMPA) 7 25 (Rdt = 81%). Ces deux molécules sont ensuite couplées par 2908133 13 substitution nucléophile au diéthyl[[( ptoluènesulfonyl)oxy]méthyl]phosphonate, préparé au préalable, pour conduire aux diéthylphosphonates correspondants 3 et 8 avec des rendements de 27% et 29%. 5 Schéma 3 : Voie de synthèse des thiophosphonates du PMEA (6) et du PMPA (11) 10 Les étapes de synthèse suivantes ont été réalisées : - La réduction des diéthylphosphonates en phosphines à l'aide d'hydrure de lithium aluminium et de chlorure de triméthylsilyle dans du THF anhydre à -78 C (composés 4 et 9, rendements respectifs : 78% et 65%). 15 -L'oxydation des phosphines, en présence peroxyde d'hydrogène dans un mélange eau-THF, pour conduire, avec un rendement quantitatif, aux H-phosphonates 5 et 10. - L'oxydation des H-phosphinates par le soufre. Cette OH NH2 iv N\\ O N N7 II ä/O\/P'\HOH 5 NH2 N vy `N N S L.,/O\./P\O . 6 thiophosphonate du PMEA i) 2-bromoethylbenzoate, NaH, DMF, 60 C, 16h puis NH2/MeOH set 14h; ii) diethyl [[(p-toluenesutfonyl)oxyjmethyl]-phosphonate, sodium tert-butoxide, DMF, TA, 72h; iii) TMSCI, AILiH4, THF, -78"C puis TA, 2h; iv) H202, H2OITHF, TA, 1h; v) BSA, SelCS2Ipyridine, pyridine, TA, 1h30. O EtO~\/Oyl EtO 8 NH2 iv NH2 NH2 N ii N H N 7 HO thiophosphonate du PMPA i) (R)-propylene carbonate, DMF, 140 C, 16h; ii) diethyl 11(p-toluenesultonyl)oxy]methyl]phosphonate, sodium tert-butoxide, DMF, TA, 64h; iii) TMSCI, AILiH4, THF, -78 C puis TA, 2h; iv) H2O2, H20lTHF, TA, 1h; v) BSA, Sa/CS2lpyridine, pyridine, TA, 1h30. NH2 NH2 /NH2 N i N N , N iii `a N NN l v ,O\. OEt 3 OEt 2 2908133 14 dernière étape de synthèse implique l'activation de la fonction H-phosphinate (PV) en phosphite (PIII) par un agent de silylation afin de déplacer l'équilibre tautomère de la forme phosphinate (tétravalent) vers une forme 5 phosphite (trivalent) (Schéma 4). Les dérivés thiophosphonates du PMEA 6 et du PMPA 11 sont obtenus respectivement avec 52 et 47% de rendement, en présence respectivement de BSA et S8/CS2/pyridine dans la pyridine anhydre. 10 Schéma 4 : Formation d'un thiophosphonate à partir de H-phosphinate Par soucis de simplification, le composé 6 sera noté S-15 PMEA et le composé 11 sera noté S-PMPA. Détail de la synthèse : NH2 NH2 NH2 0 J HO'/ \OY H R TMSO\ P\ TMSO _ R Il 1 i) BSA ; II) S21CS2lpyridine R = H, dérivé du PMEA (6) R = CH 3,dérivé du PMPA (11) Composé 2 : 9-(2-Hydroxyéthyl)adenine NH2 NL'--N N jN> OH De l'adénine (5.23 g, 38.70 mmol) a été ajouté sous argon à une suspension de 60% NaH dans de l'huile minérale 20 (1.70 g, 42.57 mmol) dans du DMF (120 mL) et le mélange a été chauffé à 60 C pendantl h. du 2-Bromoethylbenzoate (9.2 mL, 58.06 mmol) a été ajouté goutte-à-goutte à 60 C et la réaction a été maintenue à cette température pendant 16 h. Le mélange a ensuite été filtré pour éliminer les 2908133 15 matériaux insolubles. Le filtrat a été évaporé sous pression réduite et co-évaporé à trois reprises avec du toluène. Le résidu a été mélangé avec de EtOAc puis filtré pour donner un solide blanc qui a été re-suspendu 5 immédiatement dans une solution d'ammoniac saturée dans du MeOH (400 mL). Le mélange réactionnel a été agité pendant 14h à température ambiante et le méthanol a été éliminé sous pression réduite. La recristallisation avec de l'EtOH permet d'obtenir le composé 2 (5.87 g, 85%): mp 236 C 10 (Lit. 238-239 C); 1H RMN (DMSO-d6) S : 8.13 (s, 1H, H-2), 8.10 (s, 1H, H-8), 7.23 (bs, 2H, NH2), 5.05 (bs, 1H, OH), 4.19 (t, J = 5.2 Hz, 2H, CH2O), 3.71 (t, J = 5.2 Hz, 2H, CH2N). 13C RMN (DMSO-d6) b: 155.79, 152.23, 149.44, 141.46, 118.55, 59.17, 45.61. MS (GT, FAB+): 136 (B+1H)+, 180 15 (M+1H) +, 202 (M+Na) +. Composé A : Diéthyl [[(p-toluènesulfonyl)oxy]méthyll phosphonate De la triéthylamine (3.38 mL, 24.04 mmol) a été ajoutée au goutte-à-goutte et sous agitation à une solution de diéthyl hydroxyméthylphosphonate (3.85 g, 20 24.04 mmol) dans de l'EtOO (30 mL). Après refroidissement du mélange à -10 C, une solution de toluène-p-sulfonyl (4.58 g, 24.04 mmol) dans de l'EtOO (10 mL) a été ajouté en goutte-à-goutte en maintenant la température interne à - 10 C. Après agitation 1h à 0 C, le mélange est laissé à 25 réchauffer à température ambiante puis agité pendant 16h. De l'EtOO (80 mL) est ajouté et le solide est éliminé par filtration. Les solvants ont été éliminés sous pression réduite et l'huile a été purifiée par flash chromatographie (dichlorométhane/AcOEt: 9/1) pour obtenir 30 le composé A (5.57 g, 75%) sous forme d'huile translucide. 1H RMN (CDC13) b: 7.76 (d, J = 8.1 Hz, 2H, Ts), 7.33 (d, J = 8.1 Hz, 2H, Ts), 4.15 (m, 6H, CH2 de P(OEt)2 et CH2P), 2.40 (s, 3H, Ts), 1.28 (t, J = 6.9 Hz, 6H, CH3 de P (OEt) 2) . 13C RMN (CDC13) S : 145.91, 132.05, 130.38, 128.53, 63.75 2908133 16 (d, J = 6.6 Hz), 62.76 (d, JCP = 168.8 Hz), 21.99, 16.69 (d, J = 5.5 Hz). MS (GT, FAB+) : 155 (Ts)+, 267 (M-2Et)+, 295 (M-Et)+, 323 (M+1H)+, 645 (2M+1H)+. Composé 3 : 9-[2-(Diéthylphosphonométhoxy)éthyl]adénine NH2 N"N `NjN> 3 O 0\/ ,OEt OEt 5 Du sodium tert-butoxide (1.38 g, 8.25 mmol) a été ajouté à température ambiante à une solution de composé 2 (1.48 g, 8.25 mmol) dans du DMF (40 mL). Le mélange a été agité 40 min puis une solution de diéthyl phosphonate A (2.66 g, 8.25 mmol) dans du DMF (10 mL) a été ajouté. 10 Après 72 h, le mélange a été filtré puis concentré sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans l'eau et extrait avec du CHC13. Les extraits organiques ont été séchés (MgSO4), filtrés et concentrés sous pression réduite. Le résidu a été purifié par flash chromatographie 15 (dichlorométhane/méthanol: 9/1) pour obtenir le composé 3 (740 mg, 27%) sous la forme d'un solide blanc. 1H RMN (CD30D) ô: 8.10 (s, 1H, H-2), 8.03 (s, 1H, H-8), 4.35 (t, J = 5.0 Hz, 2H, CH2N), :3.93 (dq, J = 8.0 et J = 7 . 0 Hz, 4H, CH2 de P(OEt)2), 3.86 (t, J = 5.0 Hz, 2H, CH2O), 3.76 (d, 20 JPH = 8.5 Hz, 2H, CH2P), 1.11 (td, J = 7.0 Hz et J = 0.5 Hz, 6H, CH3 de P (OEt) 2) . 13C RMN (CD30D) S : 157.29, 153.71, 150.67, 143.34, 119.34, 72.15 (d, J = 11.9 Hz), 66.63 (d, JcP = 166 Hz), 63.99 (d, J = 6.6 Hz), 44.54, 16.62 (d, J =-5.8 Hz). 31P RMN (CD30D) 8 : 21.56. MS (GT, FAB+) : 136 25 (B+1H)+, 330 (M+1H)+, 352 (M+Na)+. Composé 4 : 9-[2-(Phosphanylméthoxy)éthyl]adénine NH2 N~N NjN> H 4 2908133 17 De la chlorotriméthylsilane (3.15 mL, 24.78 mmol) a été ajouté au goutte-à-goutte à une solution deLiAlH4 (940 mg, 24.78 mmol) dans du THF (50 mL) à -78 C. Le mélange résultant est réchauffé jusqu'à température ambiante et 5 agité pendant 2 h. Le composé 3 (2.04 g, 6.19 mmol) dans du THF (200 mL) est ajouté au mélange à -50 C. Le mélange est laissé à réchauffer jusqu'à température ambiante et agité pendant 2 h. La réaction est stoppée par addition de H20 (10 mL) et de NaOH (20%, 10 mL). Le mélange a été 10 filtré à travers de la Célite. La phase organique layer a été séchée à l'aide de MgSO4 anhydre, filtrée et concentrée sous pression réduite. Une purification par flash chromatographie (dichlorométhane/méthanol: 95/5) a permis d'obtenir le composé 4 (1.08 g, 78%) sous forme de poudre 15 blanche. CLHP pureté 98%; 1H RMN (CD30D) b: 8.10 (s, 1H, H-8), 7.99 (s, 1H, H-2), 4.30 (t, J = 5.1 Hz, 2H, CH2N), 3. 87 (m, 2H, CH2P), 3.71 (t, J = 5.1 Hz, 2H, CH2O), 3.07 et 2.81 (dm, JPH = 199.0 Hz, 2H, PH2). 13C RMN (CD30D) 157.31, 153.68, 150.71, 143.32, 119.94, 70.23 (d, J = 2.8 20 Hz), 62.49 (d, Jcp = 12.6 Hz), 44.70. 31P RMN (CD30D) S : - 144.67 (tt, JPH = 199.0 Hz et J = 7.8 Hz). MS (GT, FAB+) : 136 (B+1H)+, 226 (M+1H)+. Composé 5: 9-[2-(Hydroxyphosphinylméthoxy)éthyl]adénine 5 Du peroxyde d'hydrogène aqueux 2% (10.8 mL) a été 25 ajouté en goutte-à-goutte et sous agitation à une solution de composé 4 (1.08 g, 4.79 mmol) dans de l'eau (30 mL) et du THF (30 mL). Le mélange a été agité à température ambiante pendant 1 h et concentré sous pression réduite pour donner après séchage au froid le composé 5 (1.23 g, 30 quant) sous forme de poudre blanche (Lit. 229-230 C); CLHP pureté > 99%; 1H RMN (DMSO-d6) S: 8.17 (s, 1H, H-8), 8.15 (s, 1H, H-2), 7.96 et 5.85 (dt, JPH = 528.0 Hz et J= 2.1 NH2 N%N bNjN O \/ \OH H 2908133 18 Hz, 1H, PH), 7.40 (bs, 2H, NH2), 4.36 (t, J = 5.2 Hz, 2H, CH2N), 3.92 (t, J = 5.2 Hz, 2H, CH2O), 3.69 (dd, J = 7.2 Hz et J = 2.1 Hz, 2H, CH2P). 13C RMN (DMSO-d6) b: 155.44, 151.66, 149.35, 141.32, 118.46, 70.33 (d, J = 10.8 Hz), 5 69.04 (d, Jcp = 109.0 Hz), 42.39. 31P RMN (DMSO-d6) 8: 21.15 (dm, JPH = 528.0 Hz). MS (GT, FAB+) : 136 (B+1H)+, 258 (M+1H) +, 515 (2M+1H) +. HRMS (FAB) théorique pour C8H13N503P (M+H)+ 258.0756, trouvé 258.0765. Composé 6 : 9-[2-(Thiophosphonométhoxy)éthyl]adénine NH2 NN LN N) S 0\//\0 6 0- 10 Le composé 5 (50 mg, 0.194 mmol) a été séché sur du pentoxyde de phosphore sous vide pendant 5h puis dissous dans de la pyridine (2 mL). De la N, O-bis(triméthylsilyl)acétamide (BSA) (240 1IL, 0.972 mmol) a été ajoutée à l'aide d'une seringue et la solution a été 15 agitée pendant environ 1h à température ambiante sous argon. Une solution fraîche de soufre élémentaire (13 mg, 0.388 mmol) dans la CS2/pyridine (1/1, 1 mL) a été ajoutée et le mélange réactionnel a été agité pendant 30 min puis neutralisé avec de l'eau déionisée (5 mL). Après que les 20 solvants aient été évaporés sous pression réduite, le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne en phase inverse (gradient linéaire 0-100% B). Les fractions de produit ont été collectées, évaporées jusqu'à siccité et lyophilisées. L'excès de triéthylammonium bicarbonate a 25 été éliminé par séchage au froid répété avec de l'eau déionisée pour donner le composé 6 (31 mg, 52%) sous forme de poudre blanche. CLHP pureté (> 98%); 1H RMN (D20) ô: 8.08 ( s , 1H, H-8), 7.93 ( s , 1H, H-2), 4.23 ( t , J = 4 . 8 Hz, 2H, CH2N), 3.87 ( t , J = 4 . 8 Hz, 2H, CH2O), 3.60 (d, J = 5.8 30 Hz, 2H, CH2P). 13C RMN (D20) ô: 152.23, 149.12, 146.98, 141.98, 116.38, 73.01 (d, Jcp = 120.0 Hz), 68.57 (d, JcP = 10.6 Hz), 42.27. 31P RMN (D20) S: 60.67 (t, J = 5.2 Hz). 2908133 19 HRMS (TOF, ES-) théorique pour C8H1,N503PS (M) 288.0320, trouvée 288.0347. HO Composé 7: (R)-9-(2-Hydroxypropyl)adénine NH2 N~ 7 Une solution d'adénine (3.85g, 28.49 mmol), de (R)- 5 propylène carbonate (2.7 mL, 31.34 mmol), et d'hydroxyde de sodium pulvérisé (60 mg, 1.42 mmol) dans du DMF anhydre (80 mL) a été chauffée à 140 C sous agitation pendant 16 h. Aprèsrefroidissement, le mélange a été filtré pour éliminer les matériaux insolubles, le filtrat a été 10 évaporé sous pression réduite et co-évaporé à trois reprises avec du toluène. Le résidu a été trituré avec de l'EtOAc puis filtré pour donner un solide blanc immédiatement recristallisé dans l'éthanol pour obtenir le composé 7 (4.5 g, 81 %) : mp 193 C (Lit. 192-195 C) ; 1H RMN 15 (DMSO-d6) S : 8.15 (s, 1H, H-2), 8.06 (s, 1H, H-8), 7.22 (bs, 2H, NH2), 5.06 (bs, 1H, OH), 4.06 (m, 3H, CH2N et CHO), 1.12 (d, J = 5.7 Hz, 3H, CH3). 13C RMN (DMSO-d6) 8: 155.87, 152.21, 149.67, 141.44, 118.50, 64.57, 50.07, 20.80. MS (GT, FAB+) : 136 (B+1H)+, 194 (M+1H)+, 216 (M+Na)+, 20 232 (M+K)+, 387 (2M+1H)+. Composé 8 : (R)-942- ÇDiéthylphosphonométhoxy)propyl]adénine /N~ IN I ( N~NJ EtO/ EtO /\ O \/ 8 7.44 mmol) a été ajouté à une solution de composé 7 (1.44 g, 7.44 mmol) dans du DMF (30 mL) à température ambiante. Le mélange a 2.5 été agité pendant 1 h avant l'ajout d'une solution de diéthyl phosphonate A (2.40 g, 7.44 mmol) dans du DMF (10 mL). Après 64 h, le mélange a été filtré et concentré sous NH2 Du sodium tert-butoxide (1.25 g, 2908133 20 pression réduite. Le résidu dissous dans l'eau a été extrait avec du CHC13. Les extraits organiques ont été séchés (MgSO4), filtrés et concentrés sous pression réduite. Le résidu a été purifié par flash chromatographie 5 (dichlorométhane/méthanol: 9/1) pour donner le composé 8 (740 mg, 29%) sous forme de solide blanc. 1H RMN (CD30D) S: 8.23 (s, 1H, H-2), 8.15 (s, 1H, H-8), 4.41 (dd, J = 14.5 Hz et J = 3.2 Hz, 1H, CHaN), 4.22 (dd, J = 14.5 Hz et J = 7 . 7 Hz, 1H, CHbN), 4.10 (m, 1H, CHO), 4.03-3.69 (m, 6H, CH2 10 de P(OEt)2 et CH2P), 1.33 (t, J = 7.1 Hz, 6H, CH3 de P(OEt)2), 1.27 (d, J = 6.2 Hz, 3H, CH3). 13C RMN (CD30D) S : 157.30, 153.70, 150.89, 143.63, 119.70, 77.65 (d, J = 12.3 Hz), 64.32 (d, &lu = 167 Hz), 64.08 (d, J = 6.6 Hz), 63.95 (d, J = 6.6 Hz), 49.18, 16.73 (d, J = 5.8 Hz), 16.71, 15 16.70 (d, J = 5.8 Hz). 31P RMN (CD30D) b : 22.11. MS (GT, FAB+) : 136 (B+1H)+, 344 (M+1H)+, 366 (M+Na)+, 687 (2M+1H)+. H~ H' P\/0 Composé 9 : (R)-9-[2-(Phosphanylméthoxy)propyl] adénine NH2 N~ 9 Du chlorotriméthylsilane (2.62 mL, 20.62 mmol) a été ajouté en goutte-à-goutte et sous agitation à une solution 20 de LiAlH4 (782 mg, 20.62 mmol) dans du THF (40 mL) à -78 C. Le mélange résultant a été laissé à réchauffer jusqu'à température ambiante et agité pendant 2 h. Le composé 8 (1.77 g, 5.15 mmol) dans du THF (150 mL) a été ajouté au mélange réducteur à -78 C. Le mélange résultant a été 25 laissé à réchauffer jusqu'à température ambiante et agité pendant 2 h. La réaction a été arrêtée par l'addition de H20 (10 mL) et de NaOH (20%, 10 mL). Le mélange a ensuite été filtré sur de la Célite. La phase organique a été séchée sur du MgSO4 anhydre, filtré et concentré sous 30 pression réduite. Une purification par flash chromatographie (dichlorométhane/méthanol: 95/5) a permis d'obtenir le composé 9 (795 mg, 65%) sous forme de poudre 2908133 21 blanche. CLHP pureté 98%; 1H RMN (CD30D) S: 8.11 (s, 1H, H-8), 7.97 (s, 1H, H-2), 4.25-3.60 (m, 5H, CH2N, CHO et CH2P), 2.90 et 2.13 (dt, JPH = 198.5 Hz et J = 6.3 Hz, 2H, PH2), 1.08 (d, J = 6.1 Hz, 3H, CH3). 13C RMN (CD30D) S: 5 157.31, 153.68, 150.82, 143.67, 119.73, 75.91 (d, J = 2.3 Hz), 60.25 (d, JCP = 12.0 Hz), 49.48, 17.16. 31P RMN (CD30D) S: -14.86 (tt, JPH = 198.5 Hz et J = 7.3 Hz). MS (GT, FAB+) : 136 (B+1H)', 240 (M+1H)+. Composé 10 : (RL[2-(Hydroxyphosphinylméthoxy)propvl]adénine NH2 NLN O N''NJ HOH~O\) 10 10 Du péroxyde d'hydrogène aqueux 2% (7 . 5 mL, 2 eq) a été ajouté goutte-à-goutte et sous agitation à une solution de composé 9 (795 mg, 3.32 mmol) dans de l'eau (20 mL) et du THF (20 mL). Le mélange a été agité à température ambiante pendant 1 h et concentré sous pression réduite pour 15 obtenir après séchage au froid le composé 10 (900 mg, quant) sous forme de poudre blanche. CLHP pureté > 99%; 1H RMN (DMSO-d6) S : 8.23 (s, 1H, H-8), 8.20 (s, 1H, H-2), 7.95 et 5.85 (dt, JPH = 528.0 Hz et J= 2.2 Hz, 1H, PH), 7.59 (bs, 2H, NH2), 4.38 (dd, J = 14.2 Hz et J = 3.9 Hz, 20 1H, CHaN) , 4.31 (dd, J = 14.2 Hz et J = 6.0 Hz, 1H, CHbN), 4.10 (m, 1H, CHO), 3.75 (m, 2H, CH2P), 1.13 (d, J = 6.8 Hz, 3H, CH3). 13C RMN (DMSO-d6) S: 155.21, 151.35, 149.56, 141.79, 118.17, 75.48 (d, J = 11.0 Hz), 67.19 (d, Jcp 111.2 Hz), 46.64, 16.93. 31P RMN (DMSO-d6) S: 24.64 (dm, JPH 25 = 528.0 Hz). MS (GT, FAB+) : 136 (B+1H)+, 272 (M+1H)+, 543 (2M+1H) +. HRMS (FAB) théorique pour C9H15N503P (M+H) + 272.0913, trouvée 272.0905. 2908133 22 Composé 11 : (R)-9-[2- (Thiopho sphonométhoxy)proipyl] adénine Ir 11 Le composé 10 (50 mg, 0.194 mmol) a été séché sur du pentoxyde de phosphore sous vide et pendant 5h avant d'être dissous dans de la pyridine (2 mL). Du N,O-bis(triméthylsilyl)acétamide (BSA) (240 }IL, 0.972 mmol) a 5 été ajouté à l'aide d'une seringue et la solution a été agitée pendant environ 1 h à température ambiante et sous argon. Une solution fraîche de soufre élémentaire (13 mg, 0.388 mmol) dans la CS2/pyridine (1/1, 1 mL) a été ajoutée, le mélange réactionnel a été agité pendant 30 min avant 10 d'être neutralisé avec de l'eau déionisée (5 mL). Après évaporation des solvants sous pression réduite, le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne en phase inverse (gradient linéaire 0-100% B). Les fractions de produits ont été col=_ectées, évaporées jusqu'à siccité et 15 lyophilisées. L'excès de triethylammonium bicarbonate a été éliminé par séchage au froid avec de l'eau déionisée pour obtenir le composé 11 (31 mg, 47%) sous forme de poudre blanche. CLHP pureté (> 98%); 1H RMN (D20) ô: 8.16 (s, 1H, H-8), 8.07 (s, 1H, H-2), 4.29 (dd, J = 2.4 Hz et J 20 = 14.5 Hz, 1H, CHaN) , 3.10 (ddd, J = 2.0 Hz, J = 6.6 Hz et J = 14.6 Hz, 1H, CHbN), 3.95 (m, 1H, CHO), 3.63 (ddd, J =-2.0 Hz, J = 6.5 Hz et J = 12.8 Hz, 1H, CHaP), 3.49 (ddd, J = 2.4 Hz, J = 6.1 Hz et J = 12.8 Hz, 1H, CHbP), 1.05 (d, J = 6.1 Hz, 3H, CH3). 13C RMN (D20) ô: 152.65, 149.12, 147.25, 25 142.25, 116.26, 74.46 (d, LJ = 10.7 Hz), 70.89 (d, JCP = 121.1 Hz), 46.39, 14.73. 31P RMN (D20) ô: 61.60 (t, J = 4.8 Hz). HRMS (TOF, ES-) théorique pour C9H13N503PS (M)- 302.0477, trouvée 302.0465. NH2 NON S ~N~NJ 'O /O 2908133 23 Composé 12 : 9-[2-(Diphosphorylthiophosphonométhoxy)éthyl] adénine Le thiophosphonate 6 (20 mg, 0.069 mmol) a été dans du DMF (2 mL) et traité avec du carbonyldiimidazole (30 mg, 0.278 mmol). Le 12 dissous 1,1'- mélange s o 0 o- 0- 0- résultant a été agité à température ambiante pendant 24 h. 5 L'excès de CDI a été décomposé par addition de méthanol anhydre (8 L) et l'agitation a été maintenue pendant 30 min. De la tri-n-batylamine anhydre (50 L) et du pyrophosphate de tributylammonium (700 L d'une solution 0.5M dans du DMF) ont été ajoutés et le mélange a été 10 agité à température ambiante pendant 3 jours. La réaction a été stoppée par l'addition de 5 mL d'eau froide. Le solvant a été éliminé sous vide, le résidu a été dissous dans l'eau et la solution a été appliquée sur une colonne de DEAE-Sephadex (gradient linéaire 0-100% B). Les 15 fractions appropriées ont été collectées, evaporées jusqu'à siccité et lyophilisées. Le résidu a été dissous dans l'eau et passé à travers une colonne Dowex 50WX2 (forme Na+) pour obtenir le composé triphosphate 12 sous forme de sel trisodique (6.3 mg, 14%) ; CLHP pureté (> 20 99%). 31P RMN (D20) ô: 61.96, -10.80, -22.98. HRMS (TOF, ES- ) théorique C8H13N509P3S (M) -447.9647, trouvée 447.9656. s o 0 /o\/Pùo- o' \--O o- o- o- 13 Le thiophosphonate 11 (15 mg, 0.05 mmol) a été dissous dans du DMF (2 mL) et traité avec du 1,1'- 25 carbonyldiimidazole (20 mg, 0.2 mmol). Le mélange résultant a été agité à température ambiante pendant 24 h. L'excès de CDI a été décomposé par addition méthanol anhydre (6 L) et l'agitation a été maintenue pendant 30 Composé 13 : (R)-9-[2-ÇPyrophosphoroxythiophosphonométhoxy)propyl]adénine 2908133 24 min. De la tri-n-butylamine anhydre (36 L) et du pyrophosphate de tributylammonium (500 L d'une solution 0,5M dans du DMF) ont été ajoutés et le mélange a été maintenu sous agitation pendant 3 jours à température 5 ambiante. La réaction a été stoppée par l'addition de 5 mL d'eau froide. Le solvant a été éliminé sous vide, le résidu a été dissout dans de l'eau et la solution a été appliquée sur une colonne de DEAE-Sephadex (gradient linéaire 0-100% B). Les fractions appropriées ont été 10 collectées, évaporées jusqu'à siccité et lyophilisées. Le résidu a été dissout dans de l'eau et appliqué sur une colonne Dowex 50WX2 (forme Na+) pour obtenir le composé triphosphate 13 sous forme de sel trisodique (5.2 mg, 22%) ; CLHP pureté (> 99%). 31P RMN (D20) S: 60.89, -5.77, - 15 21.76. HRMS (TOF, ES-) théorique pour C9H15N509P3S (W- 461.9803, trouvée 461.9802. 3) synthèse d'autres dérivés phosphonates : Comme décrit dans le schéma 1, l'oxydation de l'intermédiaire précurseur H-phosphinate par un complexe 20 du bore conduit à un boranophosphonate, par le sélénium conduit à un sélénophosphonate, par le soufre conduit à un thiophosphonate. Cette méthodologie peut être appliquée à la synthèse de dérivés fluorophosphonates, aminophosphonates et 25 aryl/alkylphosphonates comme décrit dans le schéma 5. De plus, cette méthodologie pourra être appliquée en modulant la nature du groupement R et de la base afin d'augmenter l'arsenal thérapeutique et d'élargir l'action de ces composés à d'autres cibles virales que celles 30 décrites dans ce document. Schéma 5 : synthèse des dérivés fluorophosphonates, aminophosphonates et aryl/alkylphosphonates à partir de la molécule H-phosphinate précurseur 2908133 25 Exemple 2 : activité antivirale 1) test anti-VHB Les cellules HepAD38 répondant à la tétracycline ont été utilisées (LADNER et al., Antimicrob Agents Chemother., vol. 41(8), p:1715-20, 1997). Ces cellules correspondent à des cellules transfectées (stablement) 10 avec une copie cDNA de l'ARN prégénomique du virus sauvage. Le retrait de la tétracycline du milieu de culture conduit à l'initiation de la réplication virale. Les cellules sont cultivées à 37 C dans du milieu de culture DMEM/HAM's F12 (50/50) supplémenté avec 10% de 15 sérum de veau foetal, 100 UI/ml de pénicilline, 50 g/ml de streptomycine, 400 g/ml de G418 et 0,3 lug/ml de tétracycline. Après initiation du test, les cellules sont ensemencées dans des plaques de 48 puits avec une densité de 1.5x105 cellules/puit avant induction de la production 20 de virus après 2-3 jours de culture par lavage des cellules avec du PBS préchauffé et adjonction de 200pi de milieu à tester (milieu de culture sans tétracycline ni G418) avec ou sans composés antiviraux. Le milieu est ensuite changé après 3 jours et l'ADN viral dans la 0 \n Osr,l HO'% \,/ H R 0 •'RHN P\ 0. J -0/ ~/ 0 Il NH2 O F/P\ O R = H, dérivé du PMEA R = CH3 dérivé du PMPA NH2 amlnatlon NH2 alkylation Arylatlon fluorination NH2 2908133 26 culture cellulaire est extrait à l'aide d'un kit QIAGEN après 4 jours d'induction suivant les instructions du fabricant. L'effet antiviral des différents composés est finalement quantifié par la mesure du niveau d'ADN viral 5 par PCR quantitative en temps réel (Q-PCR). La Q-PCR a été réalisée dans un volume réactionnel de 25pl en utilisant le TaqMan Universal PCR Master Mix (APPLIED BIOSYSTEMS) en utilisant l'amorce sens (5'-CCG TCT GTG CCT TCT CAT CTG-3'; concentration finale: 600 nM), amorce 10 antisens (5'-AGT CCA AGA GTY CTC TTA TRY AAG ACC TT-3'; concentration finale: 600 nM), et la sonde Taqman (6-FAMCCG TGT GCA CTT CGC TTC ACC TCT GC -TAMRA; concentration finale 150 nM). La réaction a été analysée à l'aide d'un SDS 7000 (APPLIED BIOSYSTEMS). Un plasmide contenant 15 l'insert complet du génome de VHB a été utilisé pour préparer la courbe standard. La quantité d'ADN viral produite dans les cellules traitées a été exprimée en tant que pourcentage par rapport aux échantillons traités au mock. 20 L'effet cytostatique des différents composés a été évalué sur la lignée cellulaire parentale HepG2. L'effet des différents composés sur la croissance exponentielle des cellules HepG2 a été évalué au moyen de la méthode MTS (PROMEGA). Brièvement, les cellules ont été ensemencées à 25 une densité

de 3000 cellules par puit (plaque 96 puits) et ont été placées à proliférer pendant 3 jours en l'absence ou en présence des composés à tester après que la densité cellulaire ait été déterminée. Les résultats sont présentés dans le tableau I 30 suivant : Tableau I : Activités et toxicité des thiophosphonates du PMEA 6 (S-PMEA) et du PMPA 11 (S-PMPA) contre le VHB en cultures de cellules infectées.

2908133 27 EC50 ( M) VHB TC50 ('1M) IT* S-PMEA 6 3.27 > 166 50,76 S-PMPA 11 2.26 > 174 76,99 PMEA 2.88 > 35 12,15 EC50 : concentration efficace de composés induisant une diminution de 50% du niveau d'ADN viral présent dans la culture.

5 TC50 : concentration toxique de composés induisant une diminution de 50% de la densité cellulaire. IT* = index thérapeutique : rapport de la toxicité (TC50) sur l'efficacité (EC50). La valeur de l'index thérapeutique est d'autant plus élevée que la 10 concentration efficace EC50 est inférieure et éloignée de la concentration toxique TC50. Les résultats montrent que le dérivé thiophosphonate du PMEA présente une efficacité légèrement inférieure à celle du PMEA (EC50 de 3, 27iiM contre 2, 88p,M pour le PMEA), mais 15 avec un indice thérapeutique plus de quatre fois supérieure du fait d'une moindre toxicité. En outre, les résultats montrent également que le dérivé thiophosphonate du PMPA se révèle supérieure à celui du PMEA du fait d'une moindre toxicité et d'une efficacité supérieure. 20 2) test anti-VIH L'efficacité de différents composés a également été évaluée à l'encontre des virus VIH-1(IIIB) et VIH-2(ROD) dans des cellules CEM en culture. Brièvement, des cellules CEM (4.5 x 105 cellules par ml) ont été suspendues dans du 25 milieu de culture frais et infectées par le VIH-1 à 100 CCID50 par ml de cellules en suspension. Alors, 100 pl de suspension de cellules infectées ont été transférées dans des puits de microplaques et mélangées avec 100 pl de la dilution appropriée avec le composé à tester puis incubées 30 de nouveau à 37 C. Après 4 à 5 jours, la formation de 2908133 28 cellules géantes a été mesurée au microscope dans les différentes cultures de cellules. La valeur EC50 correspond à la concentration efficace requise pour diminuer de 50% la formation de syncitium par les cultures de cellules CEM 5 infectées. Les résultats sont présentés dans le tableau II suivant : Tableau II : Activités et toxicité des thiophosphonates du PMEA 6 (S-PMEA) et du PMPA 11 (S-PMPA) 10 contre le VIH-1 et le VIH-2 en cultures de cellules infectées. EC50 ( M) VIH- EC50 ( M) TC50 (tM) 1 VIH-2 S-PMEA 6 12,2 10,4 > 332 S-PMPA 11 11., 1 8, 6 > 165 PMEA X10 n.d n.d PMPA X10 n.d n.d EC50 : concentration efficace de composés induisant une diminution de 50% de la formation de syncitium dans les cultures de cellules CEM infectées.

15 TC50 : concentration toxique de composés induisant une diminution de 50% de la densité cellulaire. n.d : Non déterminée Les résultats montrent une efficacité équivalente des dérivés thiophosphonates du PMEA et PMPA par rapport au 20 PMEA et au PMPA sur le VIH-1. Exemple 3 : Evaluation des dérivés phosphonatesdiphosphates sur l'activité de la transcriptase inverse (RT) 1) Synthèse des dérivés thiophosphonate diphosphates du 25 PMEA (12) et PMPA (13) : Afin de réaliser les études d'incorporation et d'inhibition de la RT du VIH-1, les composés 2908133 29 thiophosphonate diphosphates 12 et 13 on été synthétisés selon la méthodologie décrite dans le schéma 6 qui suit : Schéma 6 :. Dans un premier temps, les thiophosphonates 6 et 11 sont activés par du carbonyldiimidazole dans du DMF à température ambiante. L'intermédiaire réactionnel obtenu 10 réagit avec une solution de tributylammonium pyrophosphate 0,5 M dans du DMF en présence de tributylamine, pour conduire aux dérivés thiophosphonate diphosphates 12 (SPMEApp) et 13 (S-PMPApp) avec des rendements respectifs de 14% et 22%. 15 2) Evaluation des dérivés thiophosphonate-diphosphates du PMEA (12) et PMPA (13) sur la RT sauvage et sur différentes RTs resistantes. Le mécanisme catalytique d'incorporation des analogues thiophosphonates diphosphates 12 et 13 a été évalué au 20 laboratoire à l'aide des techniques de cinétique pré-stationnaire, afin de déterminer la constante de dissociation (Kd) de l'analogue thiophosphonate pour la RT, la constante catalytique de création du lien phosphodiester (Kpol). Ces études permettent aussi de 25 calculer la discrimination des dérivés thiophosphonates par rapport aux dérivés correspondants non modifiés. NH2 !C > S N N II O\ OHN J R NH2 \N/~N S 0 O O\/P Il Il Il \~O~P\~0~ O O-0R = H, 6 R=H, 12 R=CH3, 11 R = CH3, 13 i) 1l (Im)2CO, DMF, TA, 4h, 21 MeOH; ii) HBu3N*H2PO4-, Bu3N, DMF, TA, 72 h ii S OH H 5 2908133 30 Les analogues ont été testés sur la RT sauvage et sur le mutant K65R. La construction bactérienne t p66RTB exprimant le gène de la RT sauvage a été utilisée pour obtenir la RT K65R 5 telle que décrit dans HSIEH et al. (J. Biot. Chem., vol.268(33), p:24607--13, 1993). Toutes les constructions ont été vérifiées par séquençage de l'ADN. Les RT recombinantes ont été co-exprimées avec la protéase du VIH-1 dans Escherichia coli de façon à obtenir les 10 hétérodimères p66/p51, qui sont purifiés ultérieurement par chromatographie d'affinité. Toutes les enzymes sont quantifiées par titration des sites actifs avant toute étude biochimique. Les études cinétiques ont été effectuées en utilisant 15 du dATP, le PMEApp, le PMPApp, le S-PMEApp (12) et le SPMPApp (13) sur la RT sauvage et la RT K65R. Des expériences de cinétique pré-stationnaire ont été effectuées à l'aide d'un instrument KINTEK modèle RQF-3 sur des temps de réaction allant de 10 ms à 30 s. Toutes 20 les concentrations indiquées correspondent aux concentrations finales. Les oligonucléotides ADN/ADN utilisés pour la réaction correspondent à une amorce de 21 bases marquée en 5" (5'-ATA CTT TAA CCA TAT GTA TCC-3 hybridée avec une matrice 25 de 31 bases (31A-RT 5"-AAA AAA AAA TGG ATA CAT ATG GTT AAA GTA T-3"). Pour les nucléotides naturels, la réaction a été effectuée en mélangeant une solution comprenant 50 nM (en sites actifs) de RT du VIH-1 liée à 100 nM de complexe amorce/matrice dans du tampon RT (50 mM Tris-HC1, 30 pH 8.0, 50 mM KCl, 0.05 % Triton X-100) et une concentration variable de dNTP avec 6 mM MgC12. Les réactions impliquant les nucléotides acycliques ont été effectuées avec un excès d'enzyme (200 nM) par rapport au complexe amorce/matrice (100 nM). Ces conditions ont été 35 choisies pour éliminer l'influence du rapport de turnover 2908133 31 de l'enzyme (kss) qui interfère avec la mesure des faibles taux d'incorporation. Les produits de réaction ont été analysés sur gel d'électrophorèse (14 % acrylamide, 8 M urée en tampon TBE) et quantifiés après révélation sur 5 FUJIIMAGER . Les constantes cinétiques ont été mesurées pour le dATP (nucléotide naturel), le PMEA diphosphate (PMEApp, analogue phosphonate acyclique), le PMPA diphosphate (PMPApp, analogue phosphonate acyclique) et les analogues 10 thiophosphonate diphosphates dérivés du PMEA (12) et du PMPA (13), sur la RT sauvage du VIH-1 et sur celle résistante au PMPA , le mutant K65R. La formation de produit (P) au cours du temps a été déterminée avec l'équation suivante: 15 (P) = A. (l-exp(-(kapp .t)) + kss.t (Eq. 1) où A est l'amplitude du pic, kapp est la constante cinétique apparente de formation de la liaison phosphodiester et kss est le niveau de turnover de l'enzyme (la constante cinétique de la phase linéaire en régime 20 permanent). La dépendance de kapp par rapport à la concentration de dNTP est décrite par l'équation hyperbolique suivante: kapp = kpol (dNTP)/ ( Kd + (dNTP)) (Eq. 2) où Kd et kpol sont les constantes d'équilibre et 25 catalytiques du dNTP pour la RT respectivement. Kd et kpol ont été déterminées par ajustement de courbe en utilisant le logiciel KALEIDAGRAPH (SYNERGY SOFTWARE). Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau III suivant : 30 Tableau III : Constantes cinétique pré-stationnaire pour le dATP (nucléotide naturel), le PMEA diphosphate 2908133 32 (PMEApp, analogue phosphonate acyclique), le PMPA diphosphate (PMPApp, analogue phosphonate acyclique) et les analogues thiophosphonate diphosphates dérivés du PMEA (12) et du PMPA (13), sur la RT sauvage du VIH-1 et sur le 5 mutant K65R : RT Nucleotide Kd ( iM) kpo, (s-') kpo,/Kd Selectivité Résistance dATP 7.47 50.16 6.71 PMEApp 7.9 6.8 0.86 7.8 sauvage PMPApp 23 7 0.3 22.3 S-PMEApp 12 1.2 0.55 0.5 14.5 S-PMPApp 13 5.2 0.58 0.11 59.8 dATP 6.89 11.63 1.69 PMEApp 7.7 0.75 0.1 16.9 2.16 Mutant K65R PMPApp 18 0.32 0.017 99.4 4.45 S-PMEApp 12 0.7 0.03 0.04 41 2.8 S-PMPApp 13 2.7 0.077 0.03 61 1 Sélectivité = (kpol/Kd) nucléotide naturel / (kpol/Kd) analogue de nucléotide Résistance = Sélectivité RT mutante / Sélectivité RT 10 sauvage Résistance > 1 : enzyme résistante au nucléotide Résistance < 1 : enzyme sensible au nucléotide Le dATP est le nucléotide naturel de référence, à partir duquel la sélectivité peut être calculée. Tous les 15 analogues de nucléotides testés sont substrats et inhibiteurs de la RT du VIH-1 sauvage et mutante K65R. Ils sont incorporés et terminateurs de chaîne. La RT sauvage discrimine le PMEADP et le PMPADP 7,8 et 22 fois. Cette discrimination est encore plus marquée pour 20 les analogues thiophosphonates diphosphates 12 et 13, puisqu'elle est respectivement de 14,5 et 59,8 fois. Cette 2908133 33 forte discrimination s'explique par des vitesses d'incorporation du S-PMEApp (12) et S-PMPApp (13) par la RT 90 fois inférieures à celle du nucléotide naturel dATP. Cette perte n'est malheureusement pas compensée par des 5 affinités de la RT pour ces analogues, légèrement meilleures : 1.2 versus 7.5 pour le S-PMEApp (12) et 5.5 versus 7.5 pour le S-PMPApp (13). Le mutant K65R est, respectivement, 2,16 fois et 4,45 fois résistant au PMEApp et PMPApp. Cette résistance est 10 principalement due à une diminution de la vitesse d'incorporation du nucléotide (facteur 9 et 22). Le mutant K65R est aussi résistant au S-PMEApp (12)(R=2,8) et ce pour la même raison : diminution de la vitesse d'incorporation d'un facteur. 18. Ce facteur de résistance 15 est identique à celui observé pour l'analogue non thio PMEApp (R = 2,2). Par contre, le mutant K65R n'est pas résistant au SPMPApp (13)(R=1) et comparativement à l'analogue PMPApp, non porteur d'un atome de soufre sur la phosphonate, il 20 diminue la résistance (R = 4,4). Exemple 4 : Etude de stabilité de dérivés phosphonates Une étude de stabilité des dérivés S-PMEA (composé 6) et S-PMEA (composé 11) a été réalisée dans des conditions mimant les fluides biologiques : en milieu complet (milieu 25 extra-cellulaire) et en extraits de cellules (milieu intra-cellulaire). Les cinétiques de dégradation sont suivies par CLHP analytique. L'appareil utilisé possède un système particulier de filtration-en-ligne (précolonne + switch) 30 qui permet d'injecter sur la colonne analytique un mélange riche en protéines (extraits de cellules, milieu de culture, sérum) sans filtration préalable.

2908133 34 Pour chaque condition étudiée, une solution de l'analogue de nucléotide à lmN est préparée dans l'eau, 100 l de cette solution sont prélevés et additionnés à 900 l de la solution des conditions de test (tampon acide, 5 basique, milieu de culture, extraits de cellules, sérum). Le tout est incubé à 37 C et à chaque intervalle de temps choisi, 50 ml sont prélevés et directement injectés en CLHP sur une colonne analytique (phase inverse C18) où les conditions d'analyse mises au point permettent de 10 visualiser et de bien séparer le composé de départ des produits de dégradation. Les tests dans des conditions de milieu de culture ont été réalisés avec du milieu RPMI avec 10% de sérum de veau foetal (milieu complet) préparé au laboratoire.

15 Les tests dans des conditions cellulaires ont été réalisés sur des extraits de cellules CEM-SS préparés au laboratoire. Les temps de demi-vie ont été calculés et sont rassemblés dans le tableau IV suivant : 20 Tableau IV : Etude de stabilité. t1/2 : temps de demi-vie de décomposition des composés à une concentration de 0.1 mM et à 37 C dans differents milieux t1/2 milieu complet t112 extraits de cellules NH2 NN\ S ~~ HH > 24ha stables 6 NH2 > 24hb stables N N SNI N 3 `!O`~\OHH 2908133 35 11 a : produit intact à 80% (dégradation en PMEA) b : produit intact à 77% (dégradation en PMPA) c : moins de 1% de dégradation après 24h Les composés 6 et 11 ont un comportement similaire dans `i les conditions testées (milieu de culture et extraits de cellules). Le composé 6 se dégrade lentement en un produit unique, identifié comme étant le phosphonate PMEA par coinjection en CLHP. Le composé 11 se décompose lentement en un produit unique, identifié comme étant le phosphonate 10 PMPA par co-injection en CLHP. Cette conversion est due à une désulfurisation de la liaison P-S en liaison P-0. La différence de comportement observée en milieu de culture (20% dégradation) et en extraits de cellules (moins de 1% de dégradation) peut s'expliquer par la différence de 15 contenu enzymatique entre les deux milieux ; le milieu de culture contenant 10% de sérum de veau foetal. Exemple 5 : Synthèse de prodrogues des dérivés phosphonates Une prodrogue est une substance dépourvue d'activité 20 biologique, qui sous l'action de la machinerie cellulaire est transformée en substance active (la drogue). La prodrogue peut être synthétisée à partir d'une entité biologiquement active dont les fonctions chimiques impliquées dans l'activité biologique sont temporairement 25 protégées par des groupements enzymolabiles. Sous l'action d'enzymes (estérases, réductases), ces groupements sont clivés pour régénérer la molécule active. Un choix judicieux de ces groupements enzymolabiles permet ainsi de libérer spécifiquement la drogue, à l'endroit où 30 l'activité enzymatique utilisée dans l'étape de démasquage est la plus importante, en jouant sur la différence de contenu enzymatique entre le milieu intra- et extra- 2908133 36 cellulaire. En général, les prodrogues sont utilisées pour améliorer in vivo les propriétés pharmacologiques de la drogue (stabilité, solubilité, absorption, distribution, ciblage, métabolisation) 5 Afin d'améliorer les propriétés pharmacologiques d'analogues de nucléotides, diverses prodrogues ont été mises au point. En particulier, l'adéfovir (PMEA) et le ténofovir (PMPA) sont utilisés en thérapie sous forme de prodrogues (ROBINS et al., Antimicrob. Agents Chemother., 10 vol.42(3), p :612--617, 1998) qui libèrent intracellulairement, par coupure enzymatique, l'entité monophosphorylée. Dans le but d'améliorer les propriétés pharmacologiques des dérivés thiophosphonates notamment, il est possible de 15 réaliser la synthèse de prodrogues des dérivés thiophosphonates du PMEA et du PMPA selon la méthodologie décrite dans le schéma 7 avec le groupement POC ou isopropyloxyméthylcarbonyle (ROBINS et al., 1998, précité), portant une fonction ester substrat d'estérases 20 cellulaires. Schéma 7 : Synthèse de prodrogues des thiophosphonates du PMEA 14 et du PMPA 15 o R~ = H, bis(POC)-thiophosphonate du PMEA (14) R~ = CH3, bis(POC)-thiophosphonate du PMPA (15) 25 2908133 37 La synthèse de telles prodrogues peut s'effectuer notamment selon le protocole décrit dans le brevet US 5,663,159.

Claims (13)

REVENDICATIONS

1) Un dérivé phosphonate de purine ou de pyrimidine de formule (I) suivante : B CH2 CH (RI) OCH2 PR2OH X (I) 15 20 25 30 dans laquelle : • B est une base purine ou pyrimidine choisie dans le groupe comprenant l'adénine, la xanthine, l'hypoxanthine, la guanine, la 8-bromoguanine, la 8-chloroguanine, la 8-aminoguanine, la 8-hydrazinoguanine, la 8-hydroxyguanine, la 8-méthylguanine, la 8-thioguanine, la

2-aminopurine, la 2,6-diaminopurine, la thymine, la cytosine, l'uracile, la 5-bromouracile, la 5-iodouracile, la 5-éthyluracile, la 5-propyluracile, la 5-vinyluracile et la 5- bromovinyluracile ; • R1 est choisi dans le groupe comprenant un atome d'hydrogène, un groupement méthyle, éthyle, hydroxyméthyle et hydroxyéthyle ; • R2 est choisi dans le groupe comprenant un atome de fluor, un groupement hydroxyle, un groupement BH3r un groupement alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 8 carbones et un groupement amine R'HN dans lequel R' est un groupement alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 8 carbones ; et • X est choisi dans le groupe comprenant un atome d'oxygène, un atome de sélénium et un atome de soufre. 2908133 39 2) Un dérivé selon la revendication 1, caractérisé en ce que B est une base purine ou pyrimidine choisie dans le groupe comprenant l'adénine, l'uracile, la thymine, la guanine et la cytosine, de préférence B est une adénine. 5

3) Un dérivé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que R1 est choisi dans le groupe comprenant un atome d'hydrogène, un groupement méthyle et un groupement hydroxyméthyle.

4) Un dérivé selon l'une quelconque des 10 revendications 1 à 3, caractérisé en ce que R2 est choisi dans le groupe comprenant un atome de fluor, un groupement hydroxyle, un groupement alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 8 carbones et un groupement amine R'HN dans lequel R' est un groupement alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 8 carbones.

5) Un dérivé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que X est un atome de soufre ou de sélénium.

6) Un dérivé selon l'une quelconque des 20 revendications 1 à 5, caractérisé en ce que X est un atome de soufre et R2 est un groupement hydroxyle.

7) Un dérivé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que X est un atome d'oxygène et R2 est choisi dans le groupe comprenant un 25 atome de fluor, un groupement BH3, un groupement alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 8 carbones.

8) Un intermédiaire précurseur H-phosphinate de formule (II) suivante : B CH2 H (R1) OCH2 PHOH O (II) 30 2908133 dans laquelle : • B est une base purine ou pyrimidine choisie dans le groupe comprenant l'adénine, la xanthine, l'hypoxanthine, la guanine, la 8-bromoguanine, la 8-chloroguanine, la 8-aminoguanine, la 8-hydrazinoguanine, la 8-hydroxyguanine, la 8- méthylguanine, la 8-thioguanine, la 2-aminopurine, la 2,6-diaminopurine, la thymine, la cytosine, l'uracile, la 5-bromouracile, la 5- iodouracile, la 5-éthyluracile, la 5- propyluracile, la 5-vinyluracile et la 5- bromovinyluracile ; et • R1 est choisi dans le groupe comprenant un atome d'hydrogène, un groupement méthyle, éthyle, hydroxyméthyle et hydroxyéthyle.

9) Une composition pharmaceutique comprenant un dérivé phosphonate de purine ou de pyrimidine selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.

10) Utilisation d'une composition thérapeutique selon la revendication 9 pour la préparation d'un médicament destiné à traiter et/ou prévenir une infection virale chez un patient.

11) Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que ladite infection virale correspond 25 à une infection par un virus à ADN ou à ARN.

12) Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que ledit virus à ADN est choisi dans le groupe comprenant les virus de la famille des Hepadnaviridae, des Herpesviridae et des Poxviridae. 30

13) Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que ledit virus à ARN est choisi dans le groupe comprenant les virus de la famille des 40 5 10 15 2908133 41 Bunyavirus, des Flaviviridae, des Orthomyxoviridae, des paramyxoviridae, des Picornaviridae, des Rétroviridae et des Togaviridae.