FR2888509A1 - Extraits de ginkgo biloba - Google Patents

Abstract

Nouveaux extraits des feuilles de Ginkgo biloba, comprenant(a) de 20 à 30 % en poids de glycosides de flavone,(b) de 2,5 à 4,5 % en poids de ginkgolides A, B, C et J (au total),(c) de 2,0 à 4,0 % en poids de bilobalides,(d) moins de 10 ppm de composés d'alkylphénol, et(e) plus de 10 % en poids de proanthocyanidines oligomères (OPC).

Description

Objet de l'invention

La présente invention concerne de nouveaux extraits de feuilles de Ginkgo biloba, un procédé d'obtention de ces extraits et leur utilisation pour l'obtention de préparations orales ou la préparation de suppléments pharmaceutiques et/ou diététiques et/ou d'aliments (y compris des aliments fonctionnels, des aliments prévus pour des buts nutritionnels particuliers, des aliments médicaux et autres produits similaires). Etat de la technique L'arbre Ginkgo est un phénomène. Darwin l'a qualifié de fossile vivant , car toutes ses propriétés sont associées à sa longévité. Depuis les temps antiques, l'arbre est planté en Chine et au Japon dans les jardins des temples; sinon cette plante pourrait même ne plus exister de nos jours.

Bien que le Ginkgo biloba soit la seule espèce de Ginkgos encore existante aujourd'hui, on a découvert dans les registres des fossiles de nombreuses espèces parentes du Ginkgo. Ces espèces sont un groupe de gymnospermes qui remontent au Permien. On pense que ce groupe est plus apparenté aux conifères que n'importe quel autre gymnosperme. Le Ginkgo biloba actuel peut atteindre 30 mètres et peut vivre un millénaire.

Ses feuilles sont utilisées comme médicament phytothérapique, bien que ses graines soient utilisées plus fréquemment. En Chine, le Baï-guo-yé est utilisé pour traiter les problèmes respiratoires, la perte d'audition, la cataracte, la tuberculose, l'insuffisance de circulation, les pertes de mémoire, la gonorrhée, les douleurs stomacales, les maladies de la peau, la leucorrhée, l'angine de poitrine, la dysenterie, l'hypertension artérielle, l'anxiété etc... Les feuilles pulvérisées sont inhalées pour traiter l'asthme, les troubles des oreilles, du nez et de la gorge.

Dans la médecine occidentale, les feuilles de Ginkgo biloba firent l'objet de recherches à partir de la fin des années 50. Willmar Schwabe a analysé les constituants et l'activité des substances naturelles qu'on trouve dans ces feuilles et a commencé à commercialiser l'extrait de Ginkgo. Sous la marque Tebonin, des teintures et comprimés ont été offerts à la vente à une concentration de 10:1 (rapport matière brute: ex- trait). Plus tard, d'autres entreprises ont également développé cet extrait; sa concentration est actuellement tout au plus de 50:1 (rapport matière brute: extrait). Entre temps, de nombreuses études de recherches contrôlées concernant la chimie, la pharmacologie et les effets cliniques des feuilles de Ginkgo biloba ont été effectuées la plupart en utilisant l'extrait EGb761, également nommé Kaveri, Tebonin, Tanakan, Ri5kan ou Ginkgold. En 1988, Corey, de l'Université de Harward, à reçu le prix Nobel pour avoir synthétisé le ginkgolide B qui est en cours d'étude pour son utilisation pour empêcher le rejet d'organes transplantés et contre l'asthme et le choc toxique.

Les principaux composants actifs des extraits de Ginkgo biloba sont des flavonoïdes (comme la quercitine, le camphérol, l'isorhamnétine, la myricétine) et leurs glycosides, des terpénoïdes (comme les ginkgolides A, B, C, J, M et les bilobalides), et certains petits composés phénoliques.

Quercétine R2, R3=OH R1=H; Camphérol R1, R3=H R2=OH; 15 isorhamnétine R1=OMe R2=OH R3=H Selon l'état de la technique, on connaît de nombreux documents qui décrivent des extraits de Ginkgo biloba et des procédés pour leur obtention. Cependant, les documents EP 0 431 535 B1 et EP 0 431 536 B1 (Schwabe) présentent un intérêt particulier; ces documents ont pour objet des extraits des feuilles de Ginkgo biloba comprenant (a) de 20 à 30 % en poids de glycosides de flavone, (b) de 2,5 à 4,5 % en poids de ginkgolides A, B, C et J (au total), (c) 2,0 à 4,0 % en poids de bilobalides, (d) moins de 10 ppm de composés d'alkylphénol et (e) moins de 10 % en poids de tanin condensés, plus particulièrement de proanthocyanidines (oligomères) (OPC) et un procédé pour leur obtention. En fait, la composition revendiquée par Schwabe a été adoptée comme norme pour toutes les applications pharmaceutiques des extraits de Ginkgo. Il convient de prêter attention à la teneur en composés (d) et (e): en effet, les acides ginkgoliques sont soupçonnés de provoquer des irritations et les proanthocyanidi- nes (OPC) sont de nature à agglomérer l'hémoglobine et à faire précipiter le sérum si l'extrait de Ginkgo biloba est administré par voie intraveineuse ou intramusculaire, ce qui peut être contourné par une administration par voie orale.

Les propriétés négatives des OPC sont également rapportées dans le document EP 0 477 968 B1 (Schwabe) qui décrit un procédé permettant l'élimination de ces composés des extraits.

Le document EP 0 360 556 B1 (Indena) divulgue à l'exemple 1 une composition de Ginkgo comprenant 24 % en poids de glycosides de flavone, 3,6 % en poids de ginkgolides, 3,1 % en poids de bilobalides et un indice procyanidolique , considéré comme un équivalent de la teneur en OPC de 9 % en poids. Les documents EP 1 037 646 B1 et 1 089 748 B1 (Schwabe) divulguent des compositions de Ginkgo caractérisées par une teneur réduite en d'autres composants, comme les 4'0-méthyl-pyrodoxines, biflavones et lactones de terpène.

Bien que les extraits de Ginkgo actuellement présents sur le marché comblent les besoins relatifs aux propriétés curatives connues du Ginkgo, les consommateurs recherchent actuellement des produits pré-sentant des propriétés améliorées et/ou supplémentaires. Dans le cas du Ginkgo par exemple, il serait souhaitable de développer de nouveaux ex-traits pouvant en outre protéger l'organisme contre les différents effets né- gatifs des radicaux libres, en règle générale par administration orale. Une deuxième demande consisterait à développer des extraits de Ginkgo qui améliorent l'état général du corps humain, par exemple concernant le microcirculation sanguine. Il est un fait qu'un tel produit pourrait facilement être obtenu en ajoutant aux extraits existants des principes actifs spécif - ques, qui sont par exemple bien connus pour leurs propriétés antiradicalaires et de stimulation de la circulation sanguine; toutefois, de tels produits seraient beaucoup plus onéreux à cause de l'effort technique accru nécessaire à leur production. En outre, de tels extraits ne correspondraient plus à de vrais extraits de Ginkgo couverts par la norme pharmaceutique standard. Par suite, un problème supplémentaire à la base de la présente invention a consisté à proposer un extrait de Ginkgo présentant les propriétés supplémentaires susmentionnées sans addition de substances actives.

Description de l'invention

La présente invention revendique de nouveaux extraits des feuilles de Ginkgo biloba, comprenant: (a) de 20 à 30 % en poids de glycosides de flavone; (b) de 2,5 à 4,5 % en poids de ginkgolides A, B, C et J (au total); (c) de 2,0 à 4,0 % en poids de bilobalides; (d) moins de 10 ppm de composés d'alkylphénol, et (e) de plus de 10 % en poids de proanthocyanidines oligomères (OPC).

A la suite de différentes expériences et tests qu'elle a réalisés, la déposante a constaté de manière surprenante que des extraits des feuilles de Ginkgo peuvent avoir les effets bénéfiques susmentionnés sur la santé souhaités par les consommateurs si l'on augmente leur teneur en proanthocyanidines oligomères au-dessus d'une limite critique de 10, plus particulièrement de 11 et de préférence de 12 % en poids. Il s'agit là d'une victoire sur un préjugé de l'état de la technique - dû à la connaissance scientifique généralement acceptée - qui a consisté à réduire la quantité d'OPC à une teneur inférieure à 10 % en poids ou même à éliminer ces composés dans leur totalité. De manière plus précise, les effets bénéfiques pour la santé des extraits de Ginkgo ayant une teneur accrue en OPC, décrits selon la présente invention, sont liés à des propriétés antioxydantes améliorées de ces extraits, ce qui augmente l'activité anti-inflammatoire et les effets bénéfiques sur les tissus vasculaires, y compris une diminution de la fragilité capillaire et une stabilisation des tissus conjonctifs. Ces effets bénéfiques concernent particulièrement la santé des yeux par amélioration de la microcirculation au niveau de la rétine, l'accélération de la resynthèse de la rhodopsine, la modulation de l'activité enzymatique réti- nale etc.. . Cette amélioration des effets bénéfiques des extraits de Ginkgo liée à une augmentation de leur teneur en OPC entraîne de façon non limitative une meilleure vision nocturne et une meilleure adaptation à l'obscurité, ainsi qu'une amélioration du flux sanguin au niveau de la rétine qui s'applique à la rétinopathie diabétique et à d'autres types de réti- nopathies, à la dégénérescence maculaire due au vieillissement et au glaucome.

Proanthocyanidines oligomères (OPC).

Les proanthocyanidines oligomères, également dénommées procyanidines, leucoanthocyanines ou tanins condensés, sont des oligo-mères ou des polymères renfermant des flavano-3-ols comme la (+)catéchine ou la (-) épicatéchine qui en constituent les unités fondamentales. Leur nom reflète le fait qu'elles sont converties en anthocyanidines colorées lors d'une hydrolyse acide. Habituellement, la liaison entre des monomères successifs s'effectue par les carbones C4 à C8, mais elle peut également s'effectuer par les carbones C4 à C6. La structure de ces composés est représentée par la formule susmentionnée: Proanthocyanidines oligomères L'analyse de la teneur en OPC des extraits de Ginkgo selon la présente invention a été effectuée conformément au document Indena io EP 0 360 556 B1 qui est donc inclus implicitement à titre de référence. Procédé d'extraction Un autre objet de l'invention consiste à proposer un procédé de préparation, à partir des feuilles de Ginkgo biloba d'extraits comprenant: (a) de 20 à 30 % en poids de glycosides de flavone; (b) de 2, 5 à 4,5 % en poids de ginkgolides A, B, C et J (au total); (c) de 2,0 à 4, 0 % en poids de bilobalides; (d) moins de 10 ppm de composés d'alkylphénols, et 20 (e) plus de 10 % en poids de proanthocyanidines oligomères (OPC).

Ce procédé comporte les étapes suivantes: (i) on soumet des feuilles, ou des extraits secs de Ginkgo biloba, à une extraction avec des solvants polaires aqueux pour obtenir un 25 premier intermédiaire liquide LI-1; (ii) on sépare l'intermédiaire LI-1 du solvant organique et on le soumet à une extraction liquide-liquide avec un hydrocarbure en C4-Cio non polaire pour obtenir un deuxième intermédiaire liquide (aqueux) LI-2; (iii) on règle le pH de l'intermédiaire LI-2 entre 2,5 et 6 et on le soumet ensuite à une extraction liquide-liquide avec un alcool aliphatique en C2-C6 polaire pour obtenir un intermédiaire liquide (aqueux) LI-3 riche en OPC et un autre intermédiaire liquide (organique) LI-4 riche en glycosides; (iv) on concentre l'intermédiaire LI-4, on le dilue avec de l'eau et on le mélange avec des hydrocarbures en C4-C10 non polaires afin d'obtenir un autre intermédiaire liquide (organique) LI-5 et un autre intermédiaire liquide (aqueux) LI-6, l'intermédiaire liquide LI-5 pouvant être séché, si nécessaire, afin de réguler sa teneur finale en lactones de terpène; (v) on sèche l'intermédiaire liquide LI-6 pour obtenir un premier intermédiaire solide SI-1; (vi) on sépare l'intermédiaire liquide LI-3 des solvants organiques, on le dilue avec de l'eau, on règle son pH entre 6 et 8 et on le refroidit à une température de tout au plus 10 C pendant une durée suffisante pour précipiter l'OPC de la solution; (vii) on sépare le précipité par filtration, on le lave et on le sèche pour obtenir un deuxième intermédiaire solide SI-2, et enfin (viii) on ajoute le deuxième intermédiaire solide SI-2 au premier intermédiaire solide SI-1 en quantité telle que le produit final contienne plus de 10 % en poids d'OPC.

Plus particulièrement, les extraits obtenus selon l'invention présentent en règle générale une teneur en OPC de 11 à 20, avantageuse-ment de 12 à 18 et de préférence de 13 à 15 % en poids d'OPC.

En règle générale, ces extraits renferment: (i) moins de 50 ppm de 4'0méthyl-pyroxidines; (ii) moins de 100 ppm de biflavones, et (iii) de 5 à 10 % en poids de lactones de terpène.

La teneur en eau de ces extraits est en règle générale tout au plus de 5 % en poids.

Un avantage particulier du procédé conforme à l'invention est que le produit de départ peut être soit des feuilles de Ginkgo (présentant en règle générale une teneur en glycosides de flavone, ginkgolides et bilobalides d'au moins 10 % en poids), soit des extraits secs de Ginkgo disponibles dans le commerce (présentant en règle générale une teneur en glycosides de flavone, ginkgolides et bilobalides de 5 à 20 % en poids) de façon à obtenir un produit final qui correspond aux normes et présente en particulier une teneur en OPC de plus de 10, de préférence d'environ 12 % en poids.

Selon des formes de réalisation préférées de la présente invention, les solvants polaires de l'étape (i) sont l'acétone ou l'éthanol. On a constaté que l'acétone est très appropriée pour l'extraction des feuilles, tandis que l'éthanol est le solvant préférentiel pour l'extraction des intermédiaires secs disponibles sur le marché. L'hydrocarbure non polaire des étapes (ii) et (iv) est de préférence le n-heptane, qui est utile pour garantir que tous les acides ginkgoliques non souhaités soient éliminés et concentrés dans la phase des déchets organiques. En outre, l'alcool polaire de l'étape (iii) est de préférence le n-butanol. L'avantage essentiel du nouveau procédé par rapport à l'art antérieur est lié à la séparation d'une fraction riche en OPC du flux principal, pour concentrer, purifier et isoler ces OPC, et finalement les ajouter à nouveau au flux principal afin d'augmenter son contenu en OPC, en règle générale de 4 à 8 % en poids à plus de 10, et en règle générale à environ 12 % en poids.

Encapsulation Les mélanges secs selon la présente invention peuvent être formulés sous forme de poudres, de granules ou de semi-solides pour permettre leur incorporation à des capsules. Lorsqu'elles sont utilisées sous forme de poudres, les compositions peuvent être formulées avec un ou plusieurs excipient(s), ou être présentées sous forme non diluée. Pour permettre leur présentation sous la forme d'un semi-solide, les mélanges secs peuvent être dissous ou mis en suspension dans un liquide visqueux ou dans un véhicule semi-solide, comme le polyéthylène-glycol ou un support liquide comme un glycol, par exemple le propylène-glycol ou le glycé- roi, ou une huile végétale ou de poisson, par exemple une huile sélectionnée parmi l'huile d'olive, l'huile de tournesol, l'huile de carthame, l'huile de soja etc... De tels extraits peuvent être macro- encapsulés, c'est-à-dire introduits dans des capsules de type soit de gélatine dure, soit de gélatine molle ou obtenus à partir d'équivalents de gélatine dure ou molle (sans gélatine), des capsules en gélatine molle ou en équivalent de gélatine molle étant préférées dans le cas de liquides visqueux ou de semi-solides.

Selon une forme de réalisation particulière de la présente invention, les compositions actives sont micro-encapsulées. Par microcapsules on entend des agrégats sphériques présentant un dia-mètre d'environ 0,1 à environ 5 mm qui contiennent au moins un noyau solide ou liquide entouré d'au moins une membrane continue. Il s'agit là plus précisément de phases liquides ou solides finement dispersées revé- tues de polymères filmogènes; lors de leur préparation, les polymères sont déposés sur la matière à encapsuler après émulsification et co-acervation ou polymérisation interfaciale. Selon un autre procédé, les principes actifs liquides sont absorbés dans une matrice ( micro-éponge ) et peuvent être en outre revêtus de polymères filmogènes, sous la forme de microparticules. Les capsules de taille microscopique également dénommées nanocapsules, peuvent être séchées de la même manière que les poudres. Outre les microcapsules à noyau unique, il existe également des agrégats à plu-sieurs noyaux, également dénommés micro-sphères, qui contiennent deux noyaux ou plus distribués dans la matière de membrane continue. Les microcapsules à noyau unique ou à plusieurs noyaux peuvent être de plus entourées d'une deuxième, troisième, etc.. membrane supplémentaire. Ces membranes peuvent être constituées de matières naturelles semisynthétiques ou synthétiques. Les matières naturelles pour membranes sont par exemple la gomme arabique, l'agar-agar, l'agarose, la maltodextrine, l'acide alginique et leurs sels, par exemple l'alginate de sodium ou le calcium, des graisses et acides gras, l'alcool cétylique, le collagène, la chitosane, les lécithines, la gélatine, l'albumine, le shellac, les plysaccharides comme l'amidon ou le dextrane, les polypeptides, les hydrolysats de protéines, le sucrose et les cires. Les matières semisynthétiques pour mem- branes sont notamment les celluloses chimiquement modifiées, plus particulièrement les esters et les éthers de cellulose, par exemple l'acétate de cellulose, 1'éthylcellulose, 1'hydroxypropylcellulose, 1'hydroxypropyl méthylcellulose et la carboxyméthylcellulose et les dérivés d'amidon, plus particulièrement les éthers et les esters d'amidon. Les matières synthéti- ques pour membranes sont par exemple des polymères comme les polyacrylates, les polyamides, les polyvinyl alcools ou la polyvinyl pyrrolidone. Des exemples de microcapsules connues sont les produits commerciaux suivants (la matière de membrane est indiquée entre parenthèses) Hallcrest Microcapsules (gélatine, gomme arabique), Coletica Thalaspheres (collagène maritime), Lipotec Millicapseln (acide alginique, agar-agar), Induchem Unispheres (lactose, cellulose microcristalline, hydroxypropylmé- thylcellulose), Unicerin C30 (lactose, cellulose microcristalline, hydroxypropylméthylcellulose), Kobo Glycospheres (amidon modifié, esters d'acide gras, phospholipides) Softspheres (agar-agar modifié), Kuhs Probiol Nanospheres (Phospholipides) et Primaspheres ou Prismasponges (chitosanes, polymères anioniques). Les compositions selon la présente invention sont préférentiellement encapsulées lorsque les substances actives sont administrées par voie orale et doivent être libérées dans une partie parti-culière de l'intestin. L'homme du métier peut facilement sélectionner le système d'encapsulation approprié en comparant la stabilité des capsules dans les conditions de pH des différentes parties de l'intestin. Des procédés appropriés sont par exemple divulgués dans les documents WO 01/01926, WO 01/01927, WO 01/01928, WO 01/01929 (Primacare) ou EP 1 064 088 B1 (Max Planck Gesellschaft), qui sont par suite inclus dans la présente description à titre de référence.

Application commerciale Comme souligné ci-dessus, les nouveaux extraits conformes à l'invention combinent les propriétés avantageuses connues des extraits de Ginkgo actuellement sur le marché avec de nouvelles propriétés sur-prenantes, en particulier pour améliorer l'état global du corps humain, surtout en ce qui concerne sa protection contre les radicaux libres et l'amélioration de la micro-circulation au niveau de la rétine. Par suite, l'invention a également pour objet l'utilisation des nouveaux extraits riches en OPC pour l'obtention de préparations pharmaceutiques et/ou de suppléments diététiques et/ou d'aliments (y compris des aliments fonctionnels, des aliments destinés à des fins nutritionnelles particulières, des aliments médicaux et aliments similaires), dans lesquels ils peuvent être présents en quantité de 10 à 1 000 mg, avantageusement de 30 à 500 mg et de préférence de 60 à 240 mg (calculés sur la base de la composition finale). Ces extraits sont administrés par voie soit topique, soit orale.

L'invention a également pour objet l'utilisation de ces ex-traits pour l'obtention d'un médicament destiné à améliorer la micro- circulation au niveau de la rétine et l'état du corps humain.

Exemples

Préparation Exemple Al Préparation d'extraits de Ginkgo ayant une teneur en OPC augmentée à partir des feuilles de Ginkgo.

Etape I. On introduit dans un récipient sous agitation 1 000 g de feuilles de Ginkgo biloba présentant une teneur totale en glucosides de flavone, ginkgolides et bilobalides de 0,8 % en poids et on les soumet à une extraction à 50 C pendant 2 heures en utilisant de l'acétone aqueuse (60 % w/w). On sépare la phase liquide du résidu, on la soumet à une filtration et on évapore le solvant afin d'obtenir l'intermédiaire liquide LI-1 présentant un résidu sec d'environ 30 % en poids. Ensuite, on extrait la phase LI-1 avec du n-heptane afin d'obtenir une phase organique ren-fermant tous les acides ginkgoliques non souhaités et une deuxième phase intermédiaire liquide (aqueuse) LI-2 contenant les produits valorisables.

Etape II. On soumet à trois reprises la phase intermédiaire LI-2 ainsi obtenue, après avoir réglé son pH entre 2,5 et 6, à une extraction avec du n-butanol afin d'obtenir une troisième phase intermédiaire liquide (aqueuse) LI-3 riche en OPC et une quatrième phase intermédiaire liquide (organique) LI-4, cette dernière étant lavée à deux reprises avec de l'eau pour éliminer les produits secondaires indésirables. On concentre ensuite la phase LI-4 afin d'obtenir une fraction concentrée présentant un résidu sec d'environ 20 % en poids, puis on dilue le concentrat avec de l'eau afin d'obtenir un résidu sec d'environ 10 % en poids et on le mélange avec du n-héptane (70/30 w/w). Après séparation, on obtient un cinquième intermédiaire liquide (organique) LI-5 riche en ginkgolides et bilobalides et un sixième intermédiaire liquide (aqueux) LI-6 riche en produits valorisables. Enfin, on concentre et on sèche la fraction LI-6. Le solide fi- nal obtenu présente une teneur en OPC d'environ 7 % en poids.

Etape III. On libère l'intermédiaire liquide LI-3 obtenu à l'étape II, de toutes traces de solvants organiques, on le dilue avec de l'eau pour obtenir un résidu sec d'environ 30 % en poids et on règle son pH à environ 6,8 à 7,2 en y ajoutant une solution aqueuse d'hydroxyde de so- dium. Ensuite, on refroidit la faction liquide pendant la nuit à 8 C. Le jour suivant, on sépare par filtration un précipité constitué principalement d'OPC, on le lave, et on le sèche, et on y ajoute les solides obtenus comme produit final de l'étape II. Les produits ainsi obtenus présentent la composition suivant (entre parenthèses figure la moyenne de trois échantillons) : Glycosides de flavone de Ginkgo: 22 à 27 (24)% en poids Bilobalides: 2,6 à 3,2 (2,9)% en poids Ginkgolides: 2,8 à 3,4 (3,0)% en poids OPC / 12 à 13 (12,2)% en poids Acides ginkgoliques: < 10 ppm Préparation exemple A2.

Préparation d'extraits de Ginkgo ayant une teneur augmentée en OPC à partir d'extraits secs de Ginkgo.

On introduit dans un récipient sous agitation 1 000 g d'un extrait sec de Ginkgo biloba disponible dans le commerce de couleur jaune à brune renfermant moins de 4,5 % en poids de glycosides de flavone, et on l'extrait avec de l'éthanol aqueux (80 % w/w). On filtre la fraction liquide ainsi obtenue et on élimine le solvant. On dilue l'intermédiaire ainsi obtenu avec de l'eau jusqu'à l'obtention d'un résidu sec d'environ 10 % en poids, puis on l'extrait avec du n-heptane pour éliminer les acides ginkgoliques. On traite ensuite la phase aqueuse ainsi obtenue comme expliqué aux Etapes II e III de l'exemple Al.

Exemples d'application Mise en évidence des propriétés antioxydantes Des formes réactives d'oxygène (ROS) et d'azote (RNS) correspondent à des composés qui peuvent endommager des biomolécules importantes comme les protéines, les lipides, les hydrates de carbone et l'ADN si leur action n'est pas neutralisée par des antioxydants. Certains ROS et RNS, mais pas tous, sont des radicaux libres, c'est-à-dire des atomes ou des molécules contenant un ou plusieurs électrons non appariés. Des ROS et des RNS sont formés dans le cadre du métabolisme humain, par exemple par la chaîne respiratoire mitochondriale, lors de la rupture par oxydation des phagocytes activés qui correspond à une étape du fonctionnement normal du système immunitaire, ou par des enzymes comme l'oxydase de xanthine. Des facteurs exogènes comme la lumière du soleil, la fumée de cigarette ou certains polluants de l'environnement peuvent contribuer à l'exposition du corps humain aux ROS et RNS. Les ROS/RNS sont neutralisés par une pléthore d'antioxydants, et le stress oxydatif ne se produit que quand l'équilibre se déplace en faveur des ROS/RNS. Il peut en résulter un endommagement des biomolécules vitales et des systèmes biologiques, et de tels dégâts, lorsqu'ils s'accumulent sur de longues périodes de temps, sont impliqués dans le développement de beaucoup de maladies dégénératives ainsi que sur le processus de vieillissement lui-même.

Les propriétés antioxydantes de substances actives comme l'extrait de Ginkgo qui fait l'objet de l'invention, peuvent être mesurées par différents tests, soit in vitro, soit dans des systèmes de culture de cellules ou d'une autre manière. Chaque test est en règle générale spécifique d'un certain type de ROS et/ou de RNS. Comme le corps humain est exposé à la totalité du spectre de ces substances réactives, également nommées pro-oxydants , il est souhaitable qu'un antioxydant soit efficace contre une pluralité de pro-oxydants. Par suite, afin d'évaluer ses propriétés, l'extrait de Ginkgo peut être soumis à une variété de tests, consistant à mesurer son aptitude à réduire les cations radicalaires (test DPPH), son aptitude à capter les radicaux hydroxyles (HO. ), superoxyde (02e), le pe- roxyde d'hydrogène (H202), ainsi que son aptitude à désactiver l'oxygène singulet. On peut en outre, analyser ses propriétés de chélation des métaux. 1.

Test DPPH.

Le test DPPH mesure l'aptitude d'une substance échantillon à capter les radicaux libres, spécifiquement pur réduire les cations radicalaires. Ce test utiliser le DPPH (2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle), un radical stable qui apparaît violet à cause de son absorption maximale à 515 nm, et qui est transformé en un composé incolore lors de sa réduction par un antioxydant. L'activité antioxydante de la substance échantillon peut donc être mise en évidence par la diminution de l'absorbance à 515 nm. Les résultats du test sont indiqués sur le tableau I ci-dessous. Tableau I. Analyse de l'aptitude d'extraits de Ginkgo à capter des radicaux libres en fonction de leur teneur en OPC.

Contrôle Cl* C2* 1* 2* 3* Composition de l'extrait de Ginkgo (en % en poids) Glucosides de flavone - 25,0 25,0 25,0 25,0 25,0 Ginkgolides -3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 Bilobalides - 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 Alkylphénols - < 5 ppm < 5 ppm < 5 ppm < 5 ppm < 5 ppm OPC - 9 10 12 15 18 Résultats du test (en % d'inhibition par rapport au contrôle) Concentration de l'extrait de Ginkgo dans la solution test [% w/v] 0,0003 0 18 20 29 35 38 0,001 0 55 57 71 75 77 0,01 0 78 79 85 88 91 * Contrôle: aucun extrait; Cl, C2: extraits de Ginkgo de contrôle 1 et 2, non conformes à la présente invention (teneur en OPC <_10 %) ; 1,2,3: extraits de Ginkgo 1, 2 et 3, conformes à la présente invention (teneur en OPC >10 %). II.

Aptitude à capter des radicaux hydroxyle L'aptitude à capter les radicaux hydroxyle (HO. ) peut être évaluée in vitro par le test nommé test désoxyribose . Le radical HOe peut être considéré comme le ROS/RNS le plus réactif vu qu'il peut attaquer presque tous les composés cellulaires, y compris les constituants de l'ADN comme la désoxyribose. Dans ce test,HO. est généré par un mélange d'acide ascorbique, de H2O2 et de Fei+ EDTA, c'est-à-dire par le biais de la réaction de Fenton (H2O2 en présence de fer). HOe attaque la désoxyribose en la décomposant en fragments qui génèrent un chromo-gène rose par chauffage avec de l'acide thiobarbiturique (TBA) à faible pH. Des capteurs de radicaux hydroxyle ajoutés entrent en compétition avec la désoxyribose pour capter les radicaux hydroxyle produits et diminuent la génération de chromogène. Les tests sont réalisés à la fois en présence et en l'absence d'EDTA pour tester l'aptitude des OPC à chelater (=lier) les ions de métaux de transition comme le fer. Les résultats obtenus figurent sur le tableau II ci-dessous et représentent la moyenne des deux tests.

Tableau II

Aptitude d'extraits de Ginkgo à capter des radicaux hydroxyle et à chelater des métaux en fonction de variations de leur teneur en OPC.

Contrôle Cl* C2* 1* 2* 3* Composition de l'extrait de Ginkgo (en % en poids) Glucosides de flavone - 25,0 25,0 25,0 25,0 25,0 Ginkgolides -3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 Bilobalides - 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 Alkylphénols - < 5 ppm < 5 ppm < 5 ppm < 5 ppm < 5 ppm OPC - 9 10 12 15 18 Résultats du test (en % d'inhibition par rapport au contrôle) Concentration de l'extrait de Ginkgo dans la solution test [% w/v] Test en présence d'EDTA 0,03 0 0 1 8 12 14 0,1 0 17 18 25 35 37 Test en l'absence d'EDTA 0,003 0 8 10 37 45 49 0,01 0 36 40 76 79 81 0,03 0 68 70 79 80 82 0,1 0 73 75 83 85 86 * voir explication au Tableau I III.

Aptitude à capter le superoxyde et le peroxyde d'hydrogène Deux autres ROS sont le superoxyde (02e-) et le peroxyde d'hydrogène (H202). Le superoxyde généré in vivo - par exemple lors de la rupture par oxydation des phagocytes activés, ou dans des réactions impliquant les cytochrome P450 oxydases - est largement converti par voie enzymatique (SOD, superoxyde dismutase) ou par dismutation non enzymatique en H202 qui, n'étant pas chargé, est considéré comme apte à tra- verser facilement les membranes cellulaires. A titre d'exemple, une génération accrue de 02e et de H202 dans les tissus vasculaires contribue à l'apparition de phénomènes pro-inflammatoires et autres liés à un dysfonctionnement vasculaire et à des troubles qui y sont liés.

Afin de tester l'aptitude d'extraits de Ginkgo selon l'invention à capter l'02e et l'H202, ces ROS peuvent être générés en utilisant le système xanthine oxydase/hypoxanthine et détectés en utilisant la chimioluminescence (Luminol).

Tableau III

Aptitude d'extraits de Ginkgo à capter le superoxyde et le peroxyde d'hydrogène selon les variations de leur teneur en OPC.

Contrôle Cl* C2* 1* 2* 3* Composition de l'extrait de Ginkgo (en % en poids) Glucosides de flavone - 25,0 25,0 25,0 25,0 25,0 Ginkgolides -3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 Bilobalides - 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 Alkylphénols - < 5 ppm < 5 ppm < 5 ppm < 5 ppm < 5 ppm OPC - 9 10 12 15 18 Résultats du test (en % d'inhibition par rapport au contrôle) 0,0001 0 36 38 50 65 67 0,001 0 72 75 83 86 89 0,01 0 100 100 100 100 100 * voir explication au Tableau I IV.

Aptitude à désactiver l'oxygène singulet L'oxygène singulet (102) est une forme électroniquement ex- citée de l'oxygène moléculaire qui peut être générée in vivo soit par action photochimique, c'est-à-dire par exposition à la lumière, soit par action métabolique par exemple par des neutrophiles activés, au cours de la peroxydation de lipides, et dans des réactions enzymatiques liées à des médiateurs anti-inflammatoires (prostaglandine) et à la détoxification (cytochrome P450 oxygénases). Pour évaluer l'aptitude d'extraits de Ginkgo selon l'invention à désactiver l'oxygène singulet on a utilisé l'implication de ce dernier dans les phénomènes d'endommagement de la peau induits par la lumière. Ces phénomènes comme le photovieillissement, également nommé vieillissement prématuré de la peau, sont engendrés à la fois par l'action d'enzymes impliquées dans la dégradation de la matrice dermique extracellulaire, et par des réactions directes avec le collagène, qui est l'une des protéines de la matrice extracellulaire de la peau. Ces réactions en-traînent la formation de liaisons aberrantes, qui portent atteinte à l'intégrité de la matrice dermique. Pour évaluer l'endommagement du col- lagène induit par le 102, celui-ci est généré in vivo par irradiation par des UVA en utilisant de la riboflavine comme photosensibilisateur; l'endommagement du collagène est mesuré par l'augmentation de la viscosité d'une solution aqueuse de collagène et de glucose.

Les résultats obtenus sont indiqués sur le Tableau IV.

Tableau IV.

Aptitude d'extraits de Ginkgo à désactiver l'oxygène singulet selon les variations de leur teneur en OPC.

Contrôle Cl* C2* 1* 2* 3* Composition de l'extrait de Ginkgo (en % en poids) Glucosides de flavone - 25,0 25,0 25,0 25,0 25,0 Ginkgolides -3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 Bilobalides - 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 Alkylphénols - < 5 ppm < 5 ppm < 5 ppm < 5 ppm < 5 ppm OPC - 9 10 12 15 18 Résultats du test (en % d'inhibition par rapport au contrôle) Concentration de l'extrait de Ginkgo dans la solution test [% w/v] 0,005 0 41 43 50 70 72 0,010 0 54 56 75 78 79 0,015 0 61 65 83 89 91 * voir explication au Tableau I Les résultats des différents tests montrent que les extraits de Ginkgo présentant une teneur plus importante en OPC selon la pré-sente invention ont des propriétés antioxydantes vis-à-vis d'une large gamme de ROS générés par le corps humain et via des sources exogènes et qui contribuent à l'endommagement dû au stress oxydatif de biomolé-cules et de biosystèmes importants pour la santé humaine. Il est important de noter que l'augmentation des propriétés avantageuses ne suit pas simplement une relation de proportionnalité, mais qu'il existe une con-centration critique en OPC d'environ 11 à 12 % en poids.

Les propriétés antioxydantes des extraits de Ginkgo pré- sentant une teneur augmentée en OPC se manifestent par rapport aux radicaux en général, comme le démontre le test DPPH. En outre, elles impliquent le captage du radical hydroxyle (HO e), considéré comme le plus réactif des ROS qui est généré dans de nombreux processus du métabolisme humain et est également considéré comme le vrai principe actif qui provoque les dégâts infligés par le superoxyde (02e-) et le peroxyde d'hydrogène (H202) . On a également démontré que les extraits de Ginkgo présentant une teneur en OPC augmentée peuvent chelater les métaux et sont donc capables d'empêcher la génération de ROS catalysée par des ions de métaux de transition. En outre, les résultats des tests démontrent l'aptitude des extraits selon l'invention à capter le superoxyde et le pe- roxyde d'hydrogène et à désactiver l'oxygène singulet (102) c'est-à-dire leur activité antioxydante vis-à-vis d'autres ROS responsables de beaucoup d'aspects des dégâts provoqués par les radicaux libres aux cellules et tissus du corps humain. Les résultats des différents tests démontrent clai- rement que les nouveaux extraits selon l'invention, à activité antioxydante améliorée, sont plus appropriés que les extraits connus de l'état de la technique qui présentent une teneur moindre en OPC à être utilisés dans des préparations orales destinées à maîtriser les manifestations du vieillissement, le stress dû à l'environnement, l'inflammation, et autres conditions de santé, concernant particulièrement la santé des yeux. Exemple B1 Encapsulation du nouvel extrait de Ginkgo.

Dans un flacon tricol de 500 ml équipé d'un agitateur et d'un condenseur au reflux on dissout 3 g d'agar-agar dans 200 ml d'eau à température d'ébullition. On ajoute au mélange, sur une période d'environ 30 minutes sous agitation vigoureuse tout d'abord une dispersion homo-gène de 10 g de glycérol dans 100 g d'eau supplémentaire, puis une préparation de 25 g de chitosane (Hudragen DCMF, 1 % en poids dans de l'acide glycolique, Cognis Deutschland GmbH & Co. KG, Düsseldorf/ FRG), 10 g d'un extrait séché par pulvérisation de Ginkgo biloba selon l'exemple Al, 0,5 g de Phenonip (mélange conservateur contenant du phénoxyéthanol et du parabène) et 0,5 g de Polysorbate-20 (Tween 20, ICI) dans 100 g d'eau supplémentaires. On filtre la matrice obtenue, on la chauffe à 50 C et on la disperse sous agitation vigoureuse dans 2,5 fois son volume d'huile de paraffine auparavant refroidie à 15 C. On lave ensuite la dispersion avec une solution aqueuse contenant 1 % en poids de laurylsufate de sodium et 0,5 % en poids d'alginate de sodium, puis de manière répétée avec 0,5 % en poids d'une solution aqueuse Phenonip, la phase huileuse étant éliminée dans le procédé. On obtient après tamisage une préparation aqueuse contenant 8 % en poids de microcapsules présentant un diamètre moyen de 1 mm.

Exemple 2

Encapsulation du nouvel extrait de Ginkgo.

Dans un flacon tricol de 500 ml équipé d'un agitateur et d'un condenseur au reflux, on dissout 1 g d'agar-agar dans 33 g d'eau et on chauffe cette solution à 100 C. On y ajoute ensuite 50 g d'une solution aqueuse à 2 % en poids d'alginate de calcium et 5 g d'une solution aqueuse à 1 % en poids de Gellan Gum (Kelgocel, Degussa AG). Après agitation vigoureuse, on ajoute au mélange sur une période d'environ 30 minutes 10 g d'un extrait de Ginkgo biloba selon l'exemple Al, séché par pulvérisation, 0,5 g de Phenonip et 0,5 g de Polysorbate-20 (Tween 20, ICI) dans 100 g d'eau supplémentaires. On introduit goutte à goutte la composition ainsi obtenue dans un bain constitué d'un triglycéride caprique caprylique (Myritol 331, Cognis Deutschland GmbH & Co. KG). On sépare les microcapsules du type agar/gomme de gélan/alginate résultantes et on les lave avec une solution aqueuse contenant 1 % en poids de Polysorbate-20 afin d'éliminer toutes traces du composant huileux. On introduit ensuite les capsules molles dans un bain constitué d'une solution aqueuse à 0,5 % en poids de chlorure de calcium pour réticuler et durcir les parois des capsules. On obtient après tamisage une préparation aqueuse contenant 8 % en poids de microcapsules présentant un diamètre moyen de 0,25 mm.

Claims (20)

1. REVENDICATIONS 1 ) Extraits des feuilles de Ginkgo biloba,

   caractérisés en ce qu'ils comprennent (a) de 20 à 30 % en poids de glycosides de flavone, (b) de 2,5 à 4,5 % en poids de ginkgolides A, B, C et J (au total), (c) de 2,0 à 4,0 % en poids de bilobalides, (d) moins de 10 ppm de composés d'alkylphénol, et (e) plus de 10 % en poids de proanthocyanidines oligomères (OPC).
2. 2 ) Extraits selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils comprennent de 11 à 20 % en poids d'OPC.
3. 3 ) Extraits selon la revendication 1 et/ou 2, caractérisés en ce qu'ils comprennent de 12 à 18 % en poids d'OPC.
4. 4 ) Extraits selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce qu'ils comprennent moins de 50 ppm de 4'0-méthyl- pyroxidines.
5. 5 ) Extraits selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce qu'ils comprennent moins de 100 ppm de biflavones.
6. 6 ) Extraits selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisés en ce qu'ils comprennent de 5 à 10 % en poids de lactones de terpène.
7. 7 ) Extraits selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisés en ce qu'ils comprennent tout au plus 5 % en poids d'eau.
8. 8 ) Capsules, comprenant des extraits selon la revendication 1.
9. 9 ) Procédé de préparation d'extraits des feuilles de Ginkgo biloba, comprenant (a) de 20 à 30 % en poids de glycosides de flavone, (b) de 2,5 à 4,5 % en poids de ginkgolides A, B, C et J (au total), (c) de 2,0 à 4,0 % en poids de bilobalides, (d) moins de 10 ppm de composés d'alkylphénol, et (e) plus de 10 % en poids de proanthocyanidines oligomères (OPC) caractérisé en ce que (i) on soumet des feuilles, ou des extraits secs de Ginkgo biloba à une ex-traction avec des solvants polaires aqueux pour obtenir un premier intermédiaire liquide LI-1; (ii) on sépare l'intermédiaire LI-1 du solvant organique et on le soumet à une extraction liquide-liquide avec un hydrocarbure en C4-CIO non polaire pour obtenir un deuxième intermédiaire liquide (aqueux) LI-2; (iii) on règle le pH de l'intermédiaire LI-2 entre 2,5 et 6 et on le soumet en- suite à une extraction liquide-liquide avec un alcool aliphatique en C2- C6 pour obtenir un intermédiaire liquide (aqueux) LI-3 riche en OPC et un autre intermédiaire liquide (organique) LI-4 riche en glycosides; (iv) on concentre l'intermédiaire LI-4, on le dilue avec de l'eau et on le mélange avec des hydrocarbures en C4-C10 non polaires afin d'obtenir un autre intermédiaire liquide (organique) LI-5 et un autre intermédiaire liquide (aqueux) LI-6; (v) on sèche l'intermédiaire liquide LI-6 pour obtenir un premier intermédiaire solide DI-1; (vi) on sépare l'intermédiaire liquide LI-3 des solvants organiques, on le dilue avec de l'eau, on règle son pH entre 6 et 8 et on le refroidit à une température de tout au plus 10 C pendant une durée suffisante pour pré- cipiter l'OPC de la solution; (vii) on sépare le précipité par filtration, on le lave et on le sèche pour obtenir un deuxième intermédiaire solide SI-2, et enfin (viii) on ajoute le deuxième intermédiaire solide SI-2 au premier intermédiaire solide SI-1 en quantité telle que le produit final contienne plus de 10 % en poids d'OPC.
10. 10 ) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que les feuilles de Ginkgo présentent une teneur en glycosides de flavone, ginkgolides et bilobalides d'au moins 10 % en poids.
11. 11 ) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que les extraits secs de Ginkgo présentent une teneur en glycosides de flavone, ginkgolides et bilobalides de 5 à 20 % en poids.
12. 12 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, 5 caractérisé en ce que les solvants polaires de l'étape (i) sont l'acétone ou l'éthanol.
13. 13 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisé en ce que l'hydrocarbure non polaire des étapes (ii) et (iv) est le n-heptane.
14. 14 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisé en ce que l'alcool polaire de l'étape (iii) est le n-butanol.
15. 15 ) Utilisation d'extraits selon la revendication 1 pour la préparation de compositions pharmaceutiques et/ou de suppléments diététiques et/ou d'aliments.
16. 16 ) Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que les compositions sont des aliments fonctionnels, des aliments prévus à des fins nutritionnels et des aliments médicaux.
17. 17 ) Utilisation selon la revendication 15 et/ou 16, caractérisée en ce que les extraits sont présents en quantités de 10 à 1 000 mg, calculées sur la composition finale.
18. 18 ) Utilisation selon la revendication 15 et/ou 16, caractérisée en ce que les extraits sont administrés au corps par voie orale.
19. 19 ) Utilisation des extraits selon la revendication 1 pour la préparation 35 d'une composition pharmaceutique destinée à améliorer la microcirculation au niveau de la rétine.
20. 20 ) Utilisation des extraits selon la revendication 1 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à améliorer l'état du corps humain.