BRPI0612828A2

BRPI0612828A2 - extratos de ginkgo biloba

Info

Publication number: BRPI0612828A2
Application number: BRPI0612828-9A
Authority: BR
Inventors: Alaoui Ismaili Smail; Forner Pedro; Gärtner Christine; Buchwald-Werner Sybille; Carite Christofhe; Rull Prous Santiago
Original assignee: Cognis Ip Management Gmbh
Priority date: 2005-07-12
Filing date: 2006-07-01
Publication date: 2010-11-30
Also published as: WO2007006443A1; FR2888509A1; JP2009501169A; US20080193572A1; KR20080023733A; EP1906981A1; AU2006268999A1; FR2888509B1; NO20080741L; CA2615031A1; CN101222929A

Abstract

EXTRATOS DE GINKGO BILOBA. A presente invenção refere-se a novos extratos a partir de folhas de Ginkgo biloba, compreendendo (a) de 20 até 30% em peso de glicosideos de flavona,(b) de 2,5 até 4,5% em peso de ginkgolídios A, B, C e J (no total), (c) de 2,0 até 4,0% em peso de bíobalidas,(d) menos do que 10 ppm de compostos de alquil fenol e (e) mais do que 10% em peso de proantocianidinas oligoméricas (OPC).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "EXTRATOSA PARTIR DAS FOLHAS DE GINKGO BILOBA1 PROCESSO PARA AFABRICAÇÃO DESTES, USO DOS MESMOS E CÁPSULAS".

OBJETIVO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a novos extratos das folhas deGinkgo biloba, um processo para a obtenção dos referidos extratos e o usodos mesmos para a fabricação de preparações orais para aplicação em pro-dutos farmacêuticos e/ou suplementos dietéticos e/ou alimentos (inclusivealimentos funcionais, alimentos para finalidades nutritivas específicas, ali-mentos medicinais e os similares).

Estado da Técnica

A árvore do Ginkgo é um fenômeno. Danwin chamou-a de "um fóssilvivo", uma vez que todas as propriedades estão associadas com a longevidade.Desde os tempos antigos a árvore tem sido plantada da China e no Japão emjardins de templos, de outra forma essa planta poderia nem existir hoje.

Embora a Ginkgo biloba seja a unida espécie existente dosginkgos atualmente, muitos parentes da ginkgo tem sido encontrados emregistros fósseis. As Ginkgoales são um grupo de gimnospermas que sãodatados ao Permiano. O grupo é considerado como sendo relacionado maisproximamente as coníferas do que a outras gimnospermas. A Ginkgo bilobados dias atuais pode crescer até 30 metros e pode viver durante um milênio.As folhas são usadas como um medicamento herbáceo embora as sementestenham sido usadas mais freqüentemente. Na China a chamada "Bai-guo-ye" é usada para o tratamento de problemas respiratórios, perda da audição,tosse, tuberculose, circulação fraca, perda de memória, gonorréia, dor noestomago, doenças da pele, leucorréia, angina pectoris, disenteria, pressãoarterial alta, ansiedade e outros. As folhas em forma de pó são inaladas paraa asma, e distúrbios do ouvido nariz e garganta.

Na medicina ocidental as folhas se tornaram um objeto de pes-quisa no final dos anos 50. Willmar Schwabe analisou os constituintes e aatividade das substâncias naturais das folhas e iniciou a comercialização doextrato de Ginkgo. Sob a marca comercial de Tebonin, tintura e comprimidostem sido oferecidos em uma concentração de 10:1 (proporção de materialem bruto no extrato). Mais tarde outras companhias também desenvolveramo extrato; atualmente a concentração é em sua maioria de 50:1 (proporçãode material em bruto no extrato). Enquanto isso muitos estudos e pesquisascontroladas com relação aos efeitos químicos, farmacológicos e clínicos dasfolhas foram realizados, em sua maioria usando o extrato EGb761, tambémdenominado de Kaveri, Tebonin, Tanakan ou Ginkgold. Em 1988 Corey daUniversidade de Harvard venceu o Prêmio Nobel pela síntese da ginkgolídioB, que está sendo investigada com relação ao uso da mesma para impedir arejeição de órgãos transplantados e para a asma e choque tóxico.

Os principais ingredientes ativos dos extratos de Ginkgo bilobasão os flavonóides (tais como a quercitina, kaempferol, isoarmnetina, mirice-tina) e os seus glicosídios, terpenóides tais como os gikgolídios A, B, C, J, M(as bilobalidas), e alguns compostos fenólicos pequenos.

<formula>formula see original document page 3</formula>

Quercetina R2 R3 = OH R1 = H; Kaempeferol R1, R3 = H R2 = OH;

Isorhamnetina R1 = OMe R2 = OV R3 = H.

A partir do estado da técnica são conhecidos numerosos docu-mentos que descrevem os extratos de Ginkgo biloba e os processos para aobtenção dos mesmos. Np entanto, são de interesse específico as EP0431535 B1 e EP 0431536 B1 (Schwabe) que estão direcionadas aos extra-tos das folhas da Ginkgo biloba compreendendo (a) de 20 a 30% em pesode glicosídios de flavona, (b) de 2,5 até 4,5% em peso de ginkgolídeos A, B,C e J (no total), e (c) de 2,0 até 4,0% em peso de bilobalida (d) menos doque 10 ppm de compostos de alquil fenol e (e) menos do que 10% em pesode taninos concentrados, mais especificamente proantocianidinas (oligomé-ricas) (OPC) e um método para a obtenção das mesmas. Na verdade a es-pecificação como reivindicada por Schwabe tem sido tomada como um pa-drão para todas as aplicações farmacêuticas dos extratos de Ginkgo. Deveser chamada atenção para os teores dos compostos (d) e (e): embora osácidos ginkgcólicos sejam suspeitos de causar irritações, as proantocianidi-nas (as OPC) são responsáveis pelas propriedades de hemoaglutinação ede precipitação do soro, se o extrato de Ginkgo for administrado por via in-travenosa ou intramuscular circundando dessa forma a via oral. As proprie-dades negativas do OPC são informadas na EP 0477968 (Schwabe) quediscute a remoção desses compostos a partir dos extratos através de umprocesso especial em sua totalidade.

A EP 0360556 (Indena) descreve no Exemplo 1 uma composi-ção de Ginkgo que compreende 24% em peso de glicosídeo de flavona,3,6% em peso de ginkgolídios, 3,1% em peso de bilobalidas e um chamadoíndice procianidólico, que é considerado como sendo equivalente ao teor deOPC1 de 9% e, peso. O documento EP 1037664 B1 e EP 1089748 B1 (Sch-wabe) descreve composições de Ginkgo que são caracterizadas por um teorreduzido de outros componentes, tais como 4'0-metil-piridoxinas, biflavonase lactonas de terpeno.

Embora os extratos de Ginkgo já presentes no mercado cum-pram as necessidades com relação às propriedades conhecidas até agorado Ginkgo, os consumidores atuais esperam produtos com propriedadesaperfeiçoadas e/ou adicionais. No caso do Ginkgo, por exemplo, é desejávelo desenvolvimento de novos extratos que adicionalmente protejam o orga-nismo em geral através de administração oral contra vários efeitos negativosdos radicais livres. Uma segunda exigência é a de desenvolver extratos deGinkgo que melhorem o estado geral do corpo humano, por exemplo, comrelação à micro-circulação do sangue. Na verdade, tal produto pode ser obti-do com facilidade através da adição de ativos específicos, que, por exemplo,são bem conhecidos pelas suas propriedades de capturação de radicais ede estímulo da circulação com relação aos extratos existentes, no entantoesses produtos poderiam ser muito mais caros devido ao crescente esforçotécnico para a produção dos mesmos. Além disso, esses extratos poderiamnão representar mais os extratos verdadeiros do Ginkgo cobertos pela espe-cificação farmacêutica padrão. Por essa razão, um problema adicional quesublinha a presente invenção tem sido o de prover um extrato de Ginkgo quetenha as propriedades adicionais como explicado acima sem a adição de ativos.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção reivindica novos extratos a partir das folhasde Ginkgo biloba, que compreendem:

(a) de 20 até 30% em peso de glicosídeos de flavona,

(b) de 2,5 até 4,5% em peso de ginkgolídios A, B, C e J (no total),

(c) de 2,0 até 4,0% em peso de biobalidas,

(d) menos do que 10 ppm de compostos de alquil fenol e

(e) mais do que 10% em peso de proantocianidinas oligoméricas

(OPC)

Como o resultado de vários experimentos e testes o requerentedescobriu surpreendentemente que os extratos de folhas de Ginkgo satisfi-zeram totalmente os benefícios de saúde esperados, através do aumentodas proantocianidinas oligoméricas acima do limite crítico de 10, mais espe-cificamente de 11 e de preferência de 12% em peso. Isso tem que ser en-tendido como superando um preconceito a partir do estado da técnica, que -devido ao conhecimento científico aceito em geral - tem sido o de reduzir aquantidade da referida PPC para um teor de menos do que 10% em peso,ou mesmo de remover esses compostos totalmente. Especificamente, osbenefícios de saúde melhorados dos extratos de Ginkgo com um teor deOPC aumentado, como descrito nesta invenção, se refere aos efeitos antio-xidantes aumentados dos extratos, resultando em uma atividade antiinflama-tória melhorada e efeitos benéficos aumentados com relação aos tecidosvasculares, incluindo a redução da fragilidade dos capilares e a estabilizaçãodo tecido conectivo. Esses benefícios são de relevância com relação a saú-do ocular, através do aumento da micro circulação da retina, ressíntese ace-lerada da rodopsina, modulação da atividade de enzimas da retina, e outras.Esses benefícios melhorados dos extratos de Ginkgo com um teor de OPCaumentado conferem benefícios incluindo, porém não limitados a uma visãonoturna e adaptação ao escuro melhorada, bem como um fluxo de sanguena retina aumentado o que é relevante na retinopatia diabética, outros tiposde retinopatia, degeneração macular relacionada com a idade e glaucoma.

Proantocianidinas oligoméricas (as OPC)

As proantocianidinas oligoméricas, também conhecidas comoprocianidinas, Ieucoantocianinas ou taninos concentrados, são oligômerosou polímeros com flavan-3-óis tais como (+)-catequina ou (-)epicatequinacom as unidades formadoras da base. Os nomes das mesmas refletem ofato de que elas são convertidas para as antocianidinas coloridas na ocasiãoda hidrolise ácida. Usualmente a ligação entre os monômeros sucessivos éatravés de C4 até C8, porém também podem ocorrer através de C4 até C6.

A estrutura é refletida no gráfico que se segue.

Proantocianidinas oligoméricas.

A análise do teor das OPC dos extratos de Ginkgo de acordocom a presente invenção foi realizada de acordo com as instruções descritasna patente EP 0360556 B1, que é por essa razão especificamente incorpo-rada por referência.

Processo de capturação.Outro objetivo da invenção é o de prover um processo para afabricação de extratos a partir das folhas de Ginkgo biloba, que compreende:

(a) de 20 até 30% em peso de glicosídeos de flavona,

(b) de 2,5 até 4,5% em peso de ginkgolídios A, B, C e J (no total),

(c) de 2,0 até 4,0% em peso de biobalidas,

(d) menos do que 10 ppm de compostos de alquil fenol e

(e) mais do que 10% em peso de proantocianidinas oligoméricas (OPC)

Esse processo da invenção consiste nas etapas que se seguem:

(i) tanto as folhas como os estratos secos de Ginkgo biloba, sãosubmetidos à capturação com solventes polares aquosos com a finalidadede dar um primeiro intermediário líquido LI-1;

(ii) o referido intermediário líquido Ll-I é separado a partir dosolvente orgânico e submetido a uma capturação líquido-líquido com um C4-C10 hidrocarboneto não polar com a finalidade de ser obtido um segundointermediário líquido (aquoso) LI-2;

(iii) o referido intermediário LI-2 é ajustado para um pH de 2,5até 6,0 e em seguida submetido a uma capturação líquido-líquido com umC2-C6 álcool alifático com a finalidade de ser obtido um segundo intermediá-rio líquido (aquoso) LI-3, rico em OPC e outro intermediário líquido (orgâni-co) LI-4, rico em glicosídios;

(iv) o referido intermediário líquido LI-4 é concentrado, diluídocom água e misturado com um C4-Ci0 hidrocarboneto não polar com a finali-dade de ser obtido outro intermediário líquido (orgânico) LI-5 e outro inter-mediário líquido (aquoso) LI-6, enquanto o LI-5 pode ser secado, se neces-sário, com a finalidade de ajustar o teor final de Iactona de terpeno;

(ν) o referido intermediário líquido LI-6 é secado para dar umprimeiro intermediário sólido SI-1;

(vi) o referido intermediário líquido LI-3 é separado a partir desolventes orgânicos, diluído com água, ajustado para um valor de pH de 6 a8 e resfriado para uma temperatura de mo máximo 10 qC durante um perío-do de tempo suficiente para a precipitação da OPC a partir da solução;

(vii) o referido precipitado é removido através de filtragem, lava-do e secado com a finalidade de dar um segundo intermediário sólido SI-2; efinalmente,

(viii) o segundo intermediário sólido SI-2 é adicionado ao primei-ro intermediário sólido SI-1 em uma quantidade tal que o produto final conte-nha mais do que 10% em peso de OPC.

Mais especificamente os extratos obtidos de acordo com a in-venção tipicamente exibem um teor de OPC de 11 até 20, de mais preferên-cia de 12 a 18 e de maior preferência de 13 até 15 % em peso de OPC.

Usualmente eles compreendem

(i) menos do que 50 ppm de 4'0-metil piroxidinas.

(ii) menos do que 100 ppm de biflavonas e

(iii) de 5 a 10% em peso de Iactonas de terpeno.

O teor de água dos extratos é tipicamente de no máximo 5% em peso.

Uma vantagem específica do novo processo é que ele pode seriniciado tanto a partir das folhas de Ginkgo (exibindo tipicamente um teor deglicosídios de flavona, ginkgolídeos e bilobalidas de pelo menos 10% empeso) ou de extratos de Ginkgo comercialmente disponíveis (exibindo tipi-camente um teor de glicosídios de flavona, ginkgolídio e bilobalidas de 5 até20% em peso) com a finalidade de finalizar com um produto final que estejade acordo com as especificações, que exiba especificamente um teor deOPC de mais do que 10, de preferência de cerca de 12% em peso.

Em modalidades de preferência da presente invenção, os sol-ventes polares da etapa (i) são acetona ou etanol. Foi descoberto que a ace-tona é muito adequada com relação à capturação das folhas, enquanto queo etanol é o solvente de preferência com relação à capturação dos interme-diários secos que podem ser adquiridos no mercado. O hidrocarboneto nãopolar das etapas (ii) e (iv), é, de preferência o n-heptano, o qual é bastanteútil com a finalidade de assegurar que todos os ácidos ginkgólicos não dese-jados sejam removidos e concentrados na fase orgânica a ser descartada.Além do mais, o referido álcool polar da etapa (iii) é de preferência o n-butanol. O aperfeiçoamento principal do novo processo sobre o processoanterior é o de separar uma fração rica em OPC a partir da corrente princi-pal, com a finalidade de aumentar o teor de OPC a partir tipicamente de 4até 8% em peso para mais do que 10, e tipicamente cerca de 12% em peso.

Encapsulacão.

As misturas secadas de acordo com a presente invenção tam-bém podem ser formuladas como pós, grânulos ou semi-sólidos para a in-corporação no interior de cápsulas. Quando usados na forma de pós, ascomposições podem ser formuladas junto com qualquer de um ou mais ex-cipientes, ou elas podem ser apresentadas em uma forma não diluída. Paraa apresentação na forma de um semi-sólido, as misturas secas podem serdissolvidas ou suspensas em um veículo de líquido viscoso ou semi-sólido,tão como o polietileno glicol, ou um veículo líquido tal como um glicol, comopor exemplo, propileno glicol, ou glicerol, ou um óleo vegetal ou de peixe,por exemplo, um óleo selecionado a partir de óleo de oliva, óleo de semen-tes de girassol, óleo de açafrão, óleo de soja e outros. Esses extratos podemser macroencapsulados, o que significa enchidos dentro de cápsulas tantodo tipo de gelatina rígida como de gelatina macia ou feitas a partir de equiva-lentes de gelatina rígida ou macia (isentos de gelatina), cápsulas de gelatinamacia ou cápsulas de equivalentes de gelatina de preferência para enchi-mentos com líquidos viscosos ou com enchimentos semi-sólidos.

Em uma modalidade especial da presente invenção as referidascomposições ativas são microencapsuladas. "Micro cápsulas" são entendi-das como sendo agregados esféricos com um diâmetro a partir de cerca de0,1 até cerca de 5 mm que contenham pelo menos um núcleo sólido ou lí-quido envolvido por pelo menos uma membrana contínua. Mais precisamen-te, elas são fases líquidas ou sólidas finamente dispersas revestidas compolímeros de formação de película, na produção das quais os polímeros sãodepositados sobre o material a ser encapsulado depois da emulsificação eacumulação ou da polimerização interfacial. Em outro processo, os princí-pios ativos líquidos são absorvidos em uma matriz ("microesponja") e, comomicropartículas podem ser também revestidas com os polímeros de forma-ção de película. As pequenas cápsulas microscópicas, também conhecidascomo nanocápsulas, podem ser secadas da mesma maneira como os pós.Alem das microcápsulas de núcleo único, também existem agregados denúcleos múltiplos, também conhecidos como microesferas, que contém doisou mais núcleos distribuídos no material continuo da membrana. Além disso,as microcápsulas de núcleo único ou de núcleos múltiplos podem ser envol-vidas por segundas, terceiras, etc., membranas. A membrana pode consistirem materiais naturais, semi-sintéticos ou sintéticos. Os materiais de mem-brana natural são, por exemplo, goma arábica, agar agar, agarose, malto-dextrina, ácido algínico e sais do mesmo, por exemplo, alginato de sódio oucálcio, gorduras e ácidos graxos, álcool de cetil, colágeno, quitosana, Ieciti-nas, gelatina, albumina, verniz, polissacarídios, tais como amido ou dextra-no, polipeptídios, hidrolisados de proteína, sacarose e ceras. Os materiais demembrana semi-sintéticos são, entre outros, celuloses quimicamente modifi-cadas, mais especificamente, ésteres e éteres de celulose, por exemplo,acetato de celulose, metil celulose, hidroxipropil celulose, hidroxipropil metilcelulose e carboximetil celulose, e derivados de amido, mais especificamen-te éteres e ésteres de amido. Os materiais de membrana sintéticos são, porexemplo, polímeros, tais como os poliacrilatos, poliamidas, álcool de polivinilou polivinil pirrolidona. Os exemplos de microcápsulas conhecidos são osprodutos comerciais que se seguem (o material de membrana é mostradoentre parênteses) Halecrest Microcapsules (gelatina, goma arábica), ColeticaThalasferes (colágeno marítimo), Lipotee Mileieapseln (ácido algínico, agaragar), Induehem Unisferes (lactose, celulose macrocristalina, hidroxipropil-metil celulose), Unieerin C30 (lactose, celulose microcristalina, hidroxipropil-metil celulose), Kobo Glyeosferes (amido modificado, ésteres de ácido graxo,fosfolipídios,), Softsferes (agar agar modificada), Kuhs Probiol Nanosferes(fosfolipídios) e Primasferes ou Primasponges (quitosana, polímeros aniôni-cos). A encapsulação das composições de acordo com a presente invençãoé de preferência no caso dos ingredientes ativos serem administrados porvia oral e devem ser liberados em uma parte especial do intestino. Por essemotivo, uma pessoa versada na técnica pode selecionar com facilidade osistema de encapsulação adequado através da comparação da estabilidadedas cápsulas sob as condições de pH da respectiva parte do intestino. Osprocessos adequados estão descritos, por exemplo, no WO 01/01926, WO01/01927, WO 01/01928, WO 01/01929 (Primacare) ou EP 1064088 B1(Max Planck Gesellchaft), as quais são por essa razão incorporadas por re-ferência.

Aplicação comercial

Como esboçado acima, os novos extratos combinam as proprie-dades vantajosas dos extratos de Ginkgo encontrados no mercado com asnovas e surpreendentes características, especialmente com relação à me-lhora do estado geral do corpo humano, especialmente com relação à prote-ção contra os radicais livres e a microcirculação da retina melhorados. Poresse motivo, um outro objetivo da invenção é o uso dos novos extratos ricosem OPC para a fabricação de preparações farmacêuticas e/ou suplementosdietéticos e/ou alimentos (inclusive alimentos funcionais, alimentos para fina-lidades alimentares específicas, alimentos medicinais e os similares), nosquais eles podem estar presentes em quantidades a partir de 10 até 1.000mg, de preferência de 30 até 500 mg e de mais preferência de 60 até 240mg (calculados sobre as composições finais). Os extratos são administradosao corpo tanto por aplicação tópica como oral. Outro objetivo da invenção éfinalmente o uso dos referidos extratos para a fabricação de um medicamen-to para o melhoramento da microcirculação da retina e do estado do corpo humano.

Exemplos

Exemplo de Preparação A1

Preparação de extratos de Ginkgo com o teor de OPC aumenta-do a partir de folhas de Ginkgo.

Etapa 1. 1.000 g de folhas de Ginkgo biloba tendo um teor deglicosídios de flavona, ginkgolidas e biobalidas de em total 0,8% foram colo-cados em um recipiente agitado e extraídos a 50?C durante 2 horas com autilização de 5 I de acetona aquosa (60% v/v). A fase líquida foi separada doresíduo e submetida à filtragem e a evaporação do solvente com a finalidadede dar o intermediário líquido LI-1 que tinha um resíduo seco de cerca de30% em peso. Em seguida, a referida fase Ll-I foi extraída com n-heptanocom a finalidade de ser obtida uma fase orgânica composta de todos os áci-dos ginkgólicos não desejados e uma segunda fase intermediária líquida(aquosa) LI-2 que continha os produtos de valor.

Etapa 2. O intermediário da fase LI-2 obtido desse modo, depoisde ter o pH ajustado para 2,5 a 6, foi submetido três vezes a uma capturaçãocom n-butanol com a finalidade de ser obtido uma terceira fase intermediárialíquida (aquosa) LI-3, rica em OPC e uma quarta fase intermediária líquida(orgânica) LI-4, esta última sendo lavada duas vezes com água com a finali-dade da remoção os produtos secundários não desejados. Em seguida areferida fase LI-4 foi concentrada com a finalidade de ser obtida uma fraçãoconcentrada que exibia um resíduo seco de cerca de 20% em peso. A se-guir, o concentrado foi diluído com água para um resíduo seco de cerca de10% em peso e misturado com n-heptano (70:30 p/p). Depois da separaçãoum quinto intermediário líquido (orgânico) LI-5 rico em ginkgolidas e bilobali-das e um sexto intermediário líquido (aquoso) LI-6 rico nos produtos valiososfoi obtido. Finalmente a fração LI-6 foi concentrada e secada. O sólido finalexibiu um teor de OPC de cerca de 7% em peso.

Etapa III. O intermediário líquido LI-3, que tinha sido obtido naEtapa Il foi liberado a partir de todos os traços do solvente orgânico, diluídocom água para ser obtido um resíduo seco de cerca de 30% em peso e ajus-tado para um valor de pH de cerca de 6,8 até 7,2 através da adição de umasolução aquosa de hidróxido de sódio. Em seguida, a fração líquida foi res-friada de um dia para o outro para 8 9C. No dia seguinte um precipitado queconsistia principalmente em OPC foi removido através de filtragem, lavado esecado e adicionado aos sólidos obtidos como o produto final da Etapa II. Osprodutos combinados mostraram a especificação que se segue (em parênte-ses a media das amostras):

Glicosídios de Ginkgoflavonas : 22 a 2 (24)% em peso

Bilobalidas : 2,6 - 3,2 (2,9)% em pesoGinkgolidas : 2,8 - 3,4 (3,0)% em peso

OPC : 12-13 (12,2)% em peso

ácidos ginkgólicos : < 10 ppm.

Exemplo de preparação A2

Preparação de extratos de Ginkgo com teor de OPC aumentadoa partir de extratos de Ginkgo.

1.000 g de extratos de Ginkgo biloba comercialmente disponí-veis, tendo uma aparência de amarelo a marrom e compreendendo menosdo que 4,5% de glicosídeos de flavona, foram colocados em um recipienteagitado e extraídos com etanol aquoso (80% p/p). A fração líquida obtidadessa forma foi filtrada e o solvente foi removido. O intermediário obtidodessa forma foi diluído com água para um resíduo seco de cerca de 10% empeso, e a seguir extraído com n-heptano para a eliminação dos ácidos gink-gólicos. Em seguida, a fase aquosa obtida desse modo foi tratada como ex-plicado nas Etapas Il e Ill do Exemplo A1.

Exemplos de aplicação

Demonstração das Propriedades AntioxidantesAs espécies reativas de oxigênio (ROS) e as espécies reativasde nitrogênio (RNS) são compostos reativos que podem danificar biomolécu-las importantes tais como proteínas, lipídios, carboidratos e DNA se não fo-rem contra-atacadas pelos chamados antioxidantes. Alguns porém não to-das as ROS e RNS são radicais livres, isto é, átomos ou moléculas que con-tém um ou mais eletros não pareados. A formação das ROS e ENS ocorrecomo uma parte integral do metabolismo humano, por exemplo, através dacadeia respiratória mitocôndriana, durante ao explosão de oxidação dos fa-gócitos ativados como uma parte do funcionamento normal do sistema deimunização, ou através de enzimas tais como a xantina oxidase. Os fatoresexógenos tais como a luz do sol, uso de tabaco, e determinados poluidoresambientais podem contribuir para a exposição do corpo humano as ROS eRNS. As ROS e RNS são contra-atacadas através de uma pletora de antio-xidantes, e o esforço de oxidação ocorre somente quando esse equilíbriomuda em favor das ROS/RNS. Em seguida os danos para os sistemas bio-molecular e biológico podem ser induzidos, e esse dano, quando se acumuladurante longos períodos de tempo, tem sido implicado no desenvolvimentode muitas doenças degenerativas, bem como no próprio processo de enve-lhecimento.

As propriedades antioxidantes de substâncias ativas tais como oextrato de Ginkgo referido nesta invenção podem ser medidas através dediversos testes, tanto em sistemas in vivo como em culturas de células, ououtros. Cada teste é usualmente específico com relação a um determinadotipo de ROS e/ou de RNS. Devido a que o corpo humano está exposto aoespectro total dessas substâncias reativas - também referidas como "pró-oxidantes" - pode ser desejado para um antioxidante, que ele seja efetivocontra uma variedade de pró-oxidantes. Por esse motivo, com a finalidadede avaliar as propriedades dos produtos, o extrato de ginkgo pode ser sub-metido a uma variedade de testes, que medem a sua capacidade da redu-ção de cátions radicais (Teste DPPH), a sua capacidade de extrair radicaishidroxila (HO*), superóxido (02* ), peróxido de hidrogênio (H2O2), bem comoa sua capacidade de extinguir oxigênio "singlete". Alem disso, as proprieda-des de quelação de metal podem ser avaliadas.

Teste DPPH

O teste DPPH mede a capacidade de uma substância em testede extrair radicais livres, especificamente para a redução de cátion radicais.O teste usa DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazila), um radical estável que apa-rece na cor violeta devido a sua absorção máxima em 515 nm, e que étransformado em um composto incolor quando da redução através do antio-xidante. Desse modo, a atividade de antioxidante da substância em teste éseguida pela diminuição da absorção a 515 nm. Os resultados do teste sãodados na Tabela 1 abaixo.Tabela 1

Atividade de capturacão de radicais de extratos de Ginkgo com relação àvariação do teor de OPC,

<table>table see original document page 15</column></row><table>

Controle: nenhum extrato em teste; C1, C2: Extratos de ginkgode controle, não de acordo com a presente invenção (teor de OPC de <10%; 1, 2, 3: Extratos de Ginkgo 1, 2 e 3 de acordo com a presente in-venção (teor de OPC > 10%).

II. Atividade de Capturacão ("Scavenaer") de Radicais Hidroxila

A capacidade de capturação do radical hidroxila (HO*) pode seravaliada in vitro através da chamada "análise de deoxirribose". O HO* podeser considerado o mais reativo de todas as ROS/RNS, de tal forma que elepode atacar quase todos os compostos celulares, inclusive os constituintesdo DNA tais como a deoxirribose. No teste, o HO* é gerado através de umamistura de ácido ascórbico, H2O2, e Fe3+- EDTA, isto é, através da reação deFenton (H2O2 na presença de ferro). O HO* ataca a deoxirribose, degradan-do a mesma em fragmentos que produzem um cromogênio rosa quando doaquecimento com ácido tiobarbitútico (TBA) em um pH baixo. Os "capturado-res" do radical de hidroxila adicionados competem com a deoxirribose comrelação aos radicais hidroxila produzidos e diminuem a formação do cromo-gênio. Os testes são realizados tanto na presença como na ausência deEDTA para testar a capacidade das OPC de quelação (= ligação) dos íonsdos metais de transição tais como o ferro. Os resultados estão fornecidos naTabela II abaixo e representam a media de dois testes.

Tabela II

Capturacão de radicais hidroxila e atividade de quelação de metal dos extra-tos de Ginkgo com relação a variações no teor das OPC.

<table>table see original document page 16</column></row><table>

III. Atividade de Capturação de Superóxido e de Peróxido de Hidrogênio

Duas outras ROS são o superóxido (O2") e o peróxido de hidro-gênio (H2O2). O superóxido gerado in vivo - por exemplo, durante a explosãooxidante de fagócitos ativados, ou em reações que envolvem as citrocroma450 oxidases - é largamente convertido de forma enzimática (SDS Superóxi-do Dismutase) ou através de dismutação não enzimática para H2O, quesendo não carregada, é considerada como cruzando as membranas da célu-la com facilidade. Por exemplo, a geração aumentada de O2*" e de H2O2 emtecidos vasculares contribui para eventos pró-inflamatório e outros eventosrelacionados com a disfunção vascular e distúrbios a ela relacionados.

Com a finalidade de testar a capacidade dos extratos de Ginkgocomo descritos na presente invenção para a capturação de O2*" e de H2O2,essas ROS podem ser geradas com a utilização do sistema de xantina oxi-dase/ hipoxantina e detectada com a utilização de luminescência química(Luminol).

Tabela III

Atividade de Capturação de Superóxido e de Peróxido de Hidrogênio dosestratos de Ginkqo com relação a variações no teor das OPC.

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* ver a explicação com relação à Tabela 1.IV.

Atividade de Extinção de Oxigênio "Singlete"

O oxigênio "singlete" (1O2) é uma forma excitada de modo ele-trônico de oxigênio molecular, que pode ser gerada em vivo tanto fotoquimi-camente, isto é quando da exposição à luz, ou de forma metabólica, por e-xemplo através de neutrófilos ativados, no decorrer da peroxidação de lipí-dio, e em reações enzimáticas relacionadas a mediadores antiinflamatórios(prostaglandinas) e detoxificação ( oxigenases do citocromo P450). Para afinalidade de avaliar a atividade de extinção do oxigênio "singlete" dos extra-tos de ginkgo como descritos nesta invenção, foi usado o envolvimento dooxigênio "singlete" dos danos induzidos pela luz à pele. Os danos induzidosà pele pela luz - tais como o envelhecimento pela luz, também conhecidocomo envelhecimento prematuro da pele - através do oxigênio "singlete" émediado tanto pela indução das enzimas envolvidas na degradação da ma-triz dérmica extracelular, e através de reações diretas com o colágeno, umadas proteínas da matriz dérmica extracelular. As reações incluem a forma-ção de reticulações aberrantes, que disturbem, dessa forma a integridade damatriz da pele. Para a avaliação dos danos ao colágeno induzidos pelo 1O2,o 1O2, foi gerado in vitro através da irradiação UVA com a utilização de ribo-flavina como o fotossensibilizador, e a danificação do colágeno foi medidaatravés do aumento em viscosidade de uma solução aquosa de colágeno eglicose. Os resultados são fornecidos da Tabela IV.

Tabela IV

Atvidade de extinção do oxigênio "signlete" dos extratos de Ginkgo com re-lação à variação do teor de OPC.

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* ver a explicação com relação á Tabela 1.

Os resultados dos diversos testes mostram que os extratos deginkgo com o teor de OPC aumentado de acordo com a presente invençãoatuam como antioxidantes contra uma variedade de ROS relevantes, asquais são geradas pelo corpo humano através de fontes exógenas, e quecontribuem para os danos induzidos pelo estresse de oxidação com relaçãoa biomoléculas e sistemas biológicos importantes, relevantes para a saúdehumana. Deve ser bem observado que o aumento em propriedades vantajo-sas não segue simplesmente uma proporcionalidade, porém pode ser obser-vado que existe uma concentração crítica das OPC de cerca de 11 até 12%em peso.

Os efeitos antioxidantes dos extratos de ginkgo com o teor deOPC aumentado são exibidos com relação a radicais em geral, como de-monstrados pela análise DPPH. Além disso eles envolvem a capturação doradical hidroxila (HO*), considerado como o sendo o mais reativo de todas asROS, que é gerado em muitos trajetos do metabolismo humano e também éconsiderado como sendo o principio ativo verdadeiro que media os danospelo superóxido (O2*") e o peróxido de hidrogênio (H2O2). Também, os extra-tos de ginkgo com o teor das OPC aumentado mostraram possuir proprieda-des de quelação de metal, sendo, por esse motivo capazes de impedir a ge-ração da ROS catalisada pelos íons dos metais de transição. Além disso, osresultados dos testes demonstraram as propriedades dos extratos de captu-ração do superóxido e do peróxido de hidrogênio e do oxigênio "singlete"(1O2)1 isto é, a atividade antioxidante dos mesmos contra outras ROS res-ponsáveis com relação a muitos aspectos dos danos através dos radicaislivres ás células e a tecidos do corpo humano. Os resultados dos diversostestes mostram de forma clara que os novos extratos de acordo com a in-venção com a sua atividade antioxidante aumentada são mais adequadospara serem usados em preparações orais destinadas a controle dos sinaisde envelhecimento, estresse ambiental, inflamação e outras condições desaúda, especificamente aquelas relacionadas com a saúde dos olhos, doque aqueles extratos conhecidos a partir do estado da técnica que mostramum teor de OPC reduzido.

Exemplo B1

Encapsulação do novo extrato de Ginkgo

Em um frasco de 500 ml equipado com um agitador e um con-densador de refluxo, 3 g de agar agar foram dissolvidos em 200 ml de águaem calor de ebulição. Primeiro uma dispersão homogênea de 10 g de glice-rol adicionados em 100 g de água e em seguida uma preparação de 25 g dequitosana (Hydagen® DCMF, 1% em peso em ácido glicólico, Cognis Deuts-chland GmbH & Co. KG, Düsseldorf/FRG), 10 g de um extrato secado porpulverização de Ginkgo biloba de acordo com o exemplo A1, 0,5 g de Phe-nonip® (mistura conservante contendo fenoxietanol e parabenos) e 0,5 g dePolissorbato 20 (Tween® 20, ICI) e adicionados a 100 g de água, foram adi-cionados à mistura durante um período de tempo de cerca de 30 minutoscom agitação vigorosa. A matriz obtida foi filtrada, aquecida para 50 9C edispersa com agitação vigorosa em 2,5 vezes o seu volume de óleo de para-fina resfriado anteriormente para 15 9C. A dispersão foi em seguida lavadacom uma solução aquosa que continha 1 % em peso de Iauril sulfato de só-dio e 0,5% em peso de alginato de sódio e em seguida repetidamente comuma solução aquosa de Phenonip a 0,5% em peso, a fase de óleo sendoremovida durante o processo. Foi obtida depois da filtragem, uma prepara-ção aquosa que continha 8% em peso de microcápsulas com um diâmetromédio de 1 mm.

Exemplo B2

Encapsulação do novo extrato de Ginkqo

Em um frasco de 500 ml equipado com um agitador e um con-densador de refluxo, 1 g de agar agar foi dissolvido em 33 g de água e a-quecida pata 100 9C. Em seguida, 50 g de uma solução aquosa a 2% empeso de alginato de cálcio e 5 g de uma solução aquosa a 1 % em peso deGellam Gum (Kelgocel, Degussa AG) foi adicionada. Depois de agitação vi-gorosa, 10 g de um extrato de Ginkgo biloba secado por pulverização deacordo com o Exemplo A, 0,5 g de Phenonip® e 0,5 g de Polissorbato 20(Tween® 20, ICI) adicionados em 100 g de água foram adicionados à mistu-ra durante um período de tempo de cerca de 30 minutos. A composição ob-tida dessa forma foi vertida dentro de um banho consistindo em triglicerídioscápricos caprílicos (Myritol 331, Cognis Deutschland GmbH & Co. KG). Asmicrocápsulas resultantes do tipo de agar/goma gelana/alginato foram sepa-radas e lavadas com uma solução aquosa que continha 1 % em peso de Po-Iissorbato 20, com a finalidade de remover os traços do componente de óleo.

Em seguida, as cápsulas macias foram introduzidas dentro de um banho queconsistia em uma solução aquosa a 0,5% em peso de cloreto de cálcio paraa reticulação e endurecimento das paredes das cápsulas. Foi obtida depoisde peneiramento uma preparação aquosa que continha 8% em peso de mi-crocápsulas com um diâmetro médio de 0,25 mm.

Claims

1. Extratos a partir das folhas de Ginkgo biloba, compreendendo:(a) de 20 até 30% em peso de glicosídeos de flavona,(b) de 2,5 até 4,5% em peso de ginkgolídios A, B, C e J (no total),(c) de 2,0 até 4,0% em peso de biobalidas,(d) menos do que 10 ppm de compostos de alquil fenol e(e) mais do que 10% em peso de proantocianidinas oligoméricas (OPC)

2. Extratos de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelofato de que eles compreendem de 11 a 20% em peso de OPC.

3. Extratos de acordo com as reivindicações 1 e/ou 2, caracteri-zados pelo fato de que eles compreendem de 12 a 18 % em peso de OPC.

4. Extratos de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1até 3, pelo fato de que eles compreendem menos do que 50 ppm de 4Ό-metil-piroxidinas.

5. Extratos de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1até 4, caracterizados em que eles compreendem menos do que 100 ppm debiflavonas.

6. Extratos de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1até 5, caracterizados pelo fato de que eles compreendem de 5 até 10% empeso de Iactonas de terpeno.

7. Extratos de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1até 6, caracterizados pelo fato de que eles compreendem no máximo 5% empeso de água.

8. Cápsulas compreendendo estratos como definido na reivindi-cação 1.

9. Processo para a fabricação de extratos a partir das folhas deGinkgo biloba, compreendendo:(a) de 20 até 30% em peso de glicosídeos de flavona,(b) de 2,5 até 4,5% em peso de ginkgolídios A, B, C e J (no total),(c) de 2,0 até 4,0% em peso de biobalidas,(d) menos do que 10 ppm de compostos de alquil fenol e(e) mais do que 10% em peso de proantocianidinas oligoméricas(OPC); caracterizado pelo fato de que:(i) tanto as folhas como os extratos secos de Ginkgo biloba, sãosubmetidos à capturação com solventes polares aquosos com a finalidadede dar um primeiro intermediário líquido LI-1;(ii) o referido intermediário líquido LI-1 é separado a partir dosolvente orgânico e submetido a uma capturação líquido-líquido com um C4-Cio hidrocarboneto não polar com a finalidade de ser obtido um segundointermediário líquido (aquoso) LI-2;(iii) o referido intermediário LI-2 é ajustado para um pH de 2,5até 6,0 e em seguida submetido a uma capturação líquido-líquido com umC2-C6 álcool alifático com a finalidade de ser obtido um segundo intermediá-rio líquido (aquoso) LI-3, rico em OPC e outro intermediário líquido (orgâni-co) LI-4, rico em glicosídios;(iv) o referido intermediário líquido LI-4 é concentrado, diluídocom água e misturado com um C4-C10 hidrocarboneto não polar com a finali-dade de ser obtido outro intermediário líquido (orgânico) LI-5 e outro inter-mediário líquido (aquoso) LI-6, enquanto o LI-5 pode ser secado, se neces-sário, com a finalidade de ajustar o teor final de Iactona de terpeno;(ν) o referido intermediário líquido LI-6 é secado para dar umprimeiro intermediário sólido SI-1;(vi) o referido intermediário líquido LI-3 é separado a partir desolventes orgânicos, diluído com água, ajustado para um valor de pH de 6 a-8 e resfriado para uma temperatura de mo máximo 10 9C durante um perío-do de tempo suficiente para a precipitação da OPC a partir da solução;(vii) o referido precipitado é removido através de filtragem, lava-do e secado com a finalidade de dar um segundo intermediário sólido SI-2; efinalmente(viii) o segundo intermediário sólido SI-2 é adicionado ao primei-ro intermediário sólido SI-1 em uma quantidade tal que o produto final conte-nha mais do que 10% em peso de OPC.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que as folhas de Ginkgo exibem um teor de glicosídeos de fla-vona, ginkgolidas e biobalidas de pelo menos 10% em peso.

11. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que os extratos secos de Ginkgo exibem um teor de glicosídeosde flavona, ginkgolidas e biobalidas de 5 até 20% em peso.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 9 até 11, caracterizado pelo fato de que os solventes polares da etapa (i)são a acetona ou o etanol.

13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 9 até 11, caracterizado pelo fato de que o referido hidrocarboneto nãopolar das etapas (ii) e (iv) é o n-heptano.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 9 até 11, caracterizado pelo fato de que o referido álcool polar da etapa(iii) é o n-butanol.

15. Uso dos extratos como definido na reivindicação 1 para afabricação de composições farmacêuticas e/ou suplementos dietéticos e/oualimentos.

16. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelofato de que as referidas composições são alimentos funcionais, alimentospara finalidades nutritivas e alimentos medicinais.

17. Uso de acordo com as reivindicações 15 e/ou 16, caracteri-zado pelo fato de que os referidos extratos estão presentes em quantidadesa partir de 10 até 1.000 mg - calculadas sobre a composição final.

18. Uso de acordo com as reivindicações 15 e/ou 16, caracteri-zado em que os referidos extratos são administrados ao corpo através deaplicação oral.

19. Uso de extratos como definido na reivindicação 1 para a fa-bricação de composições farmacêuticas para a melhoria do estado do corpohumano.