CN101222929A - 银杏提取物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及来自银杏叶的新型提取物,其含有(a)20~30%重量的黄酮糖苷;(b)2.5~4.5%重量的银杏苦内酯A,B,C和J(以总量计);(c)2.0~4.0%重量的白果内酯;(d)低于10ppm的烷基酚化合物和(e)大于10%重量的低聚原花色素(OPC)。
Description
发明的目的
本发明涉及银杏叶的新型提取物,用于获得所述提取物的方法及其用于制备适用于在药物和/或食品添加剂和/或食品(包括功能性食品、用于特殊营养目的食品、药用食品等)中的口服制剂的用途。
现有技术的陈述
银杏树是一种珍品。Darwin称它为“活化石”,因为它的所有性能都与长寿有关。由于古代这种树就一直种植在中国和日本的寺庙花园里,否则,这种植物或许存活不到今天。
尽管银杏(Ginkgo biloba)仅是目前现存的一种银杏属(ginkgos)的植物,许多银杏属的相关物种已在化石资料中找到。银杏目是一组可追溯至二叠纪的裸子植物。该组被认为与针叶树的关系较与其它任何裸子植物关系更紧密。现代的银杏最高可以长到30米并且能活1千年。尽管籽的使用更频繁些,但树叶可作为草药使用。中国所谓的“白果叶”,被用来治疗呼吸道病、听觉失灵、内障摘除术(couching)、结核病、不良循环、记忆失灵、淋病、胃痛、皮肤病、白带、心绞痛、痢疾、高血压、焦虑以及其它。吸入粉末状树叶用于治疗气喘病、耳、鼻和咽喉病症。
在西药中,50年代后期该树叶成为研究的项目。Willmar Schwabe分析过树叶天然物质的组分和活性,并且使银杏提取物开始商业化。商标Tebonin的酊剂和片剂,以10∶1的浓度(原料∶提取物比)提供。后来,其他公司也开发出了该提取物;当今的浓度大多在50∶1(原料∶提取物比)。同时,对于该树叶的化学、药物学和临床效果进行了许多对照的研究和探讨,大部分使用提取物EGb761,其又叫做Kaveri、Tebonin、Tanakan、Rkan或Ginkgold。1988年,Harvard大学的Corey固合成了银杏苦内酯(ginkgolide)B,并对防止器官移植排斥和气喘以及毒性中风的用途进行了研究而获得了诺贝尔奖。
银杏叶提取物的主要活性成分是类黄酮(如豕草花粉苷、莰非醇、异鼠季亭、杨梅黄酮)及其苷类、萜类化合物(如银杏内酯(ginkgolides)A、B、C、I、M和白果内酯(bilobalides))、以及某些少量的酚类化合物。
五羟黄酮R2、R3=OH R1=H;莰非醇R1、R3=H R2=OH;异鼠季亭R1=OMe R2=OH R3=H
由许多文献已知,其已公开银杏提取物和获得它们的方法。然而,其中,特别感兴趣的是EP 0431535 B1和EP 0431536 B1(Schwabe),他们涉及银杏叶提取物,其含有(a)20~30%重量的黄酮糖苷;(b)2.5~4.5%重量的银杏苦内酯A、B、C和J(总计);(c)2.0~4.0%重量的白果内酯;(d)低于10ppm的烷基酚化合物和(e)低于10%重量的缩合单宁,更特别地(低聚的)原花色素(proanthocyanidins(OPC)),以及获得它们的方法。事实上,按Schwabe所要求保护的说明书,已作为适于银杏属提取物的所有药用申请的标准而接受。应当把注意力吸引到化合物(d)和(e)的含量上:假若银杏提取物经静脉内或肌肉内给药,由此超过口服,怀疑银杏酸会引起刺激作用,则原花色素(OPCs)是造成血细胞凝集(haemagluinating)和血清沉淀性质的主要原因。OPC的消极性质也在EP 0477968 B1(Schwabe)中作了报道,该专利全面地讨论了通过一个特定方法从提取物中除去这些化合物。
EP 0360556 B1(Indena)在实施例1中公开了一种,含有24%重量的黄酮糖苷、3.6%重量的银杏苦内酯、3.1%重量的白果内酯和所谓的原花青色素(procyanidolic)指标的银杏组合物,该指标可认为与9%重量的OPC含量等效。专利文献EP 1037646 B1和EP 1089748 B1(Schwabe)公开了银杏的组分,该组分的特征在于降低其他成分的含量,像4′O-甲基-吡哆醇(pyridoxines)、双黄酮和萜内酯含量。
就深知银杏的健康性质来说,虽然已有的银杏提取物已在市场满足需要特性,但现今的顾客仍希望具有改进的和/或有另外性能的产品。在银杏的情况下,例如,人们希望开发出一种新型提取物,该提取物通过口服给药,通常具有使机体免遭自由基的各种负面影响。第二个要求是开发出一种银杏的提取物,其改善人体的整体状态,例如有关血液的微循环。事实上,这样的产品,易于通过加入特定的活性剂而获得,例如,对现存提取物已知特定活性剂用于自由基清除和血液循环促进性能,然而,由于生产这种产品需付出巨大的技术努力,所以贵得多,另外,这种提取物可能不再代表为药物标准说明书所覆盖的真实银杏提取物。因此,作为本发明基础的另外一个问题是,提供一种具有如上所述的附加性能而不添加活性成分的银杏提取物。
本发明的描述
本发明要求保护的是来自银杏叶的新型提取物,其中含有:
(a)20~30%重量的黄酮糖苷,
(b)2.5~4.5%重量的银杏苦内酯A、B、C和J(总量),
(c)2.0~4.0%重量的白果内酯,
(d)低于10ppm的烷基酚化合物,和
(e)大于10%重量的低聚原花色素(proanthocyanidins(OPC))。
作为各种实验和检验的结果,本申请人意外地发现了,通过增加低聚原花色素的含量在临界极限10以上,更优选11,优选12%重量,来自银杏叶提取物,完全满足所期待的改善健康的优点。这一点必须理解成克服来自现有技术状态的偏见,由于一般接受的科学知识-已经降低所述OPC量至低于10%重量的含量或者甚至全部除去这些化合物。特别地,具有增加的OPC含量的银杏提取物的改善健康优点,正如本发明所述,与改善提取物的抗氧剂作用有关,导致改善的抗炎活性和改善的对血管组织的有利作用,包括降低毛细管脆性和连结组织的稳定作用。通过改善视网膜的微循环,加速视紫红质的再合成、视网膜酶活性的调节等这些特别与眼健康有关,具有增视紫红质加OPC含量的银杏提取物的改善益处所提供的有利包括但不限于改善夜间视觉和黑暗适应,而且还改善与糖尿病的视网膜病有关的视网膜血流,其它类型的视网膜病、与年龄有关的斑点变性和青光眼。
低聚的原花色素(OPCs)
低聚的原花色素,又称原花青色素(procyanidins)、无色花色素(leucoanthocyanins)或缩合单宁,是具有作为形成碱性单元的黄烷-3-醇如(+)-儿茶素或(-)-表儿茶素的低聚物或聚合物。它们的名称反映出在酸水解时它们转化成有色的花色素。通常,连续的单体间的可通过C4~C8连接,但也可经C4~C6产生。结构反映在下图中。
低聚的原花色素
本发明银杏提取物中的OPC含量分析,可按照Indena的专利EP0360556 B1中陈述的方法完成,因此,将其清楚地引入作为参考。
提取方法
本发明的另一个目的在于提供从银杏叶中制备提取物的方法,该提取物包括:
(a)20~30%重量的黄酮糖苷,
(b)2.5~4.5%重量的银杏苦内酯,
(c)2.0~4.0%重量的百果内酯,
(d)低于10ppm的烷基酚化合物,和
(e)大于10%重量的低聚原花色素(OPC)。
该发明方法由下列步骤组成:
(i)把银杏叶或干提取物(dry extract),用水性极性溶剂提取,以产生第一液体中间体LI-1;
(ii)使所述中间体LI-1从有机溶剂分离,并用非极性C4~C10烃进行液-液提取,以产生第二(含水)液体中间体LI-2;
(iii)调节所述中间体LI-2至pH为2.5~6.0并且下一步用极性C2~C6脂族醇进行液-液提取,产生富含OPC的(含水)液体中间体LI-3和另一种富含苷的(有机的)液体中间体LI-4;
(iv)使所述LI-4浓缩,用水稀释,再与非极性C4~C10烃混合,以产生另外的(有机的)液体中间体LI-5和另一种(含水)液体中间体LI-6,如有必要,然后可将LI-5,干燥,以调节最终萜内酯的含量;
(v)使所述液体中间体LI-6干燥以产生第一固体中间体SI-1;
(vi)使所述液体中间体LI-3从有机溶剂分离,用水稀释,调节pH值至6~8并冷却至温度最高为10℃,持续足够的时间以使OPC从溶液中沉淀;
(vii)将所述沉淀过滤,洗涤并干燥,以产生第二固体中间体SI-2;和最终
(viii)把第二固体中间体SI-2加到第一固体中间体SI-1中,其量使最终产品含有大于10%重量的OPC。
更具体地说,按照本发明获得的提取物,通常显示OPC含量为11~20,更优选为12~18,最优选为13~15%重量的OPC。
通常,它们含有:
(i)低于50ppm的4′O-甲基-吡哆醇(pyroxidines),
(ii)低于100ppm的双黄酮,和
(iii)5~10%重量的萜内酯。
提取物的水含量一般至多为5%重量的。
新方法的特别优点在于人们可以或从银杏叶(通常显示黄酮糖苷、银杏苦内酯和百果内酯的含量至少为10%重量)或从市场上买到的干银杏提取物(一般显示黄苷酮、银杏苦内酯和百果内酯含量为5~20%重量)以使最后得出与说明书相匹配的最终产品,尤其是显示大于10,优选约12%重量的OPC含量。
在本发明的优选实施方案中,步骤(i)的极性溶剂是丙酮或乙醇。现已发现丙酮对于叶的提取特别合适,而乙醇对于人们从市场上买到的干中间体的提取是优选溶剂。步骤(ii)和(iv)中的非极性烃优选是正庚烷,其极为有用于保证去除所有不想要的银杏酚酸并且在废有机相中浓缩。然而,步骤(iii)的所述极性醇优选是正丁烷。新方法超过从前方法的最主要的改进在于从主流(main stream)中分离富有OPC的馏分、以浓缩、提纯和分离所述OPC,并且最终把它们加回到主流中,以使OPC含量从典型的4~8%重量提高到大于10,典型地约12%重量的。
包囊(encapsulation)
按照本发明的干燥混合物可配制成粉末、颗粒或半固体以装入胶囊。当以粉末形式使用时,所述组分可与任何一种或多种赋形剂一起进行配制,或以未稀释的形式存在。对于以半固体形式存在,可把干混合物溶解或悬浮于粘性液体或半固体溶媒中,如聚乙二醇,或液体载体,如二醇,例如丙二醇,或丙三醇,或植物油或鱼油,例如,选自橄榄油、向日葵油、红花油、大豆油和其它的油。这样的提取物可以是常量包囊(macro-encapsulated)的,其意味着装入硬明胶或软明胶型的胶囊,或由硬或软明胶同等物(无明胶)制备的胶囊,软明胶或明胶同等物的胶囊,优选用于粘性液体或半固体填充。
在本发明的一个特定实施方案中,所述活性组分是微包囊的。可以把“微胶囊”理解成直径约0.1~约5mm的球形聚集体,它含有一种由至少一种连续膜围绕的至少一种固体或液体的芯。更准确地说,它们是细分散的包衣有成膜聚合物的液相或固相,在其制备中,在乳化和凝聚或界面聚合后,所述聚合物沉积在待包囊的物质上。在另一方法中,液体活性组成主要被吸收在基质(“微型海绵状物(microsponge)”)中,并且作为微粒,可以用另外的成膜聚合物包衣。显微镜下可见的小的胶囊,也可称作纳米胶囊,可用如粉末的同样的方法干燥。除了单芯微胶囊以外,还有多芯的聚集体,又称作微球,它含有两种或更多种分配于连续膜材料中的芯。另外,单芯或多芯微胶囊可用另外的第二种、第三种等膜包绕。所述膜可以由天然的、半合成的或合成材料组成。天然膜材料是,例如,阿拉伯树胶、琼脂、琼脂糖、麦芽糖糊精、海藻酸及其盐,例如,海藻酸钠或海藻酸钙、脂肪和脂肪酸、十六醇、胶原、壳聚糖、卵磷脂、明胶、白蛋白、虫胶、多糖,如淀粉或葡聚糖、多肽、蛋白水解物、蔗糖和石蜡。半合成膜材料是,其中有,化学改性纤维素,更特别的是纤维素酯和醚,例如,乙酸纤维素酯、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素、和淀粉衍生物、更特别的是淀粉醚和酯。合成膜材料是,例如,聚合物,如聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮。已知微胶囊的例子是下列商业化产品(膜材料在括号中表示)Hallcrest Microcapsules(明胶、阿拉伯树胶)、Coletica Thalapheres(海洋骨胶原(martime collagan))、LipotecMillicapseln(海藻酸、琼脂)、Induchem Unispheres(乳糖、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素)、Unicerin C30(乳糖、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素)、KoboGlycospheres(改性淀粉、脂族酸酯、磷脂)、Softspheres(改性琼脂)、KuhsProbiol Nanospheres(磷脂)和Primaspheres或Primasponges(壳聚糖、阴离子聚合物)。按照本发明的组合物包囊优选是在活性成分口服情况下并且应在肠的特定部分释放。此外,所属技术领域的熟练技术人员通过对比胶囊在肠相应部分的pH条件下的稳定性而很容易选择适当的包囊体系。合适的方法公开在例如WO 01/01926、WO 01/01927、WO 01/01928、WO01/01929(Primacare)或EP 1064088 B1(Max Planck Gesellschaft),因此,将这些文件引入作为参考。
商业化应用
如上概述,新型提取物与在市场中发现银杏属提取物的已知有利的性能结合,其具有新的奇异特征,尤其是改善人体的整个状态,特别是有关保护免遭自由基损伤并且改善视网膜微循环。因此,本发明的进一步目的是,富有OPC的新型提取物在制备药物制剂和/或食品添加剂和/或食品(包括功能性食品,用于特殊营养目的食品、药用食品(medical food)等)中的应用,其中,它们的存在量在10~1000mg,优选30~500mg,更优选60~240mg(根据最终组合物计算)。通过局部给药或通过口服而给药入体的提取物。本发明的另一个目的是,最终使用所述提取物用于制作适于改善视网膜微循环和人体状态的药物。
实施例
制备实施例A1
来自银杏叶的具有提高的OPC含量的银杏提取物的制备
步骤I.把具有总计为0.8%重量的黄酮糖苷、银杏苦内酯和百果内酯含量的银杏叶1000g放入搅拌的容器内,并于50℃下使用5L的含水丙酮(60%w/w)提取2小时。使液相与残余物分离并进行过滤和溶剂蒸发,以产生具有约30%重量的干残余物的液体中间体LI-1。之后,所述相LI-1用正庚烷提取,以获得含所有不想要的银杏酚酸的有机相和含有有价值产物的第二(含水)液体中间体LI-2。
步骤II.如此获得的中间体相LI-2,在调节pH至2.5~6后,用正丁醇三次提取,以获得富含OPC的第三(含水)液体中间体相LI-3以及第四(有机)液体中间体相LI-4,后者用水洗涤两次以除去不想要的副产物。之后,浓缩所述相LI-4以获得显示约20%重量的干残余物的浓缩馏分。之后,浓缩物用水稀释至10%重量的干残余物,再与正庚烷(70∶30 w/w)混合。在分离富含银杏苦内酯和百果内酯的第五(有机)液体中间体LI-5后获得富有有价值产物的第六(含水)液体中间体LI-6。最后,浓缩馏分LI-6并干燥。最终固体显示约7%重量的OPC含量。
步骤III.将在步骤II中获得的液体中间体LI-3,与所有的痕量有机溶剂分离,用水稀释,获得约30%重量的干残余物并且通过添加氢氧化钠水溶液调节pH值到约6.8~7.2。其后,使液体馏分过夜冷却至8℃。第二天过滤出主要由OPC组成的沉淀物,洗涤,干燥并作为步骤II的最终产物加到所获得的固体中。合并的产物显示下列的技术规格(括号内为三个样品的平均值):
银杏黄酮糖苷:22~27(24)%重量
百果内酯:2.6~3.2(2.9)%重量
银杏苦内酯:2.8~3.4(3.0)%重量
OPC:12~13(12.2)%重量
银杏酚酸:<10ppm
制备实施例A2
从干银杏提取物制备具有提高含量的OPC的银杏提取物
将1000g市售可得的银杏的干提取物放入搅拌容器中并用乙醇水溶液(80% w/w)提取,所述干提取物具有黄色~棕色的外观并含有低于4.5%重量的黄酮糖苷。使如此获得的液体馏分过滤并除去溶剂。用水稀释如此获得的中间体至约10%重量的干残余物,之后用正庚烷提取以清除银杏酚酸。随后,按实施例A1中的步骤II和III的阐述,处理如此获得的水相。
应用实施例
抗氧化剂性的验证
如果活性氧类(ROS)和活性氮类(RNS)不为所谓的抗氧剂抵制,其为可损伤重要生物分子如蛋白、脂质、糖和DNA的活性化合物。一些但不是所有的ROS和RNS都是自由基,即,含有一个或多个未成对电子的原子或分子。ROS和RNS的形成,作为人体代谢的整体部分出现,例如通过线粒体呼吸链,在作为免疫系统正常功能一部分的活性吞噬细胞的氧化性爆发过程中,或通过酶如黄嘌呤氧化酶而产生。外源因子如阳光、香烟烟雾或某些环境污染物,可促使人体暴露于ROS和RNS。ROS/RNS通过过多的抗氧化剂而抵制,氧化应激只有在这种平衡移向有利于ROS/RNS时才发生。之后,可诱导对活体生物分子和生物系统进行损伤,而这种损伤,当在很长的期间内积累时,与许多变性疾病的发展和在老化本身的过程有关。
活性物质的抗氧化性能,如有关本发明的银杏提取物可以通过各种检验,或在体外或在细胞培养系统中或其它方法测定,通常各检验对于某种类型的ROS和/或RNS为特异性的。因为人体与所有范围的这些活性物质接触,所述活性物质还可称为“促氧化剂”-抗氧化剂有效抗各种促氧化剂抵制可能是理想的。此外,为了评价产物的性质,将银杏提取物进行各种检验,测定其还原自由基阳离子的能力(DPPH检验),其清除羟基自由基(HO)超氧化物(O2 -)、过氧化氢(H2O2)的能力及其清除单线态氧的能力。另外,可对金属螯合性能评价。
DPPH试验
DPPE试验是测定待测物质清除自由基的能力,特别是降低自由基阳离子。试验使用DPPH(2,2-二苯基-1-苦基偕腙肼(picrylhydrazyl),一种稳定的自由基,其在515nm下的最大吸收呈“紫色”,并且其在受抗氧剂还原时,转化成无色化合物。这样,待测物质的抗氧化活性是根据515nm下的吸收下降而测定。试验结果列于下面的表I中。
表I
银杏提取物的自由基清除活性与OPC含量变化的关系
对照* | C1* | C2* | 1* | 2* | 3* | |
银杏提取物组成(重量%) | ||||||
黄酮糖苷 | 25.0 | 25.0 | 25.0 | 25.0 | 25.0 | |
银杏内酯 | - | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 |
白果内酯 | - | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 |
烷基酚 | - | <5ppm | <5ppm | <5ppm | <5ppm | <5ppm |
OPCs | - | 9 | 10 | 12 | 15 | 18 |
试验结果(与对照比较,抑制%) | ||||||
试验溶液中银杏提取物的浓度[%w/v] | ||||||
0.0003 | 0 | 18 | 20 | 29 | 35 | 38 |
0.001 | 0 | 55 | 57 | 71 | 75 | 77 |
0.01 | 0 | 78 | 79 | 85 | 88 | 91 |
*对照:试验中无提取物;C1,C2:对照银杏提取物1和2,不依从本发明(OPC含量≤10%);1、2、3:银杏提取物1、2、3,依从本发明(OPC含量>10%)
II.清除羟基自由基的清除活性
清除羟基自由基(HO·)的能力可以在体外通过所谓的“脱氧核糖分析”法测定。可以认为,HO·是所有ROS/RNS中活性最强的,它几乎能攻击所有的细胞化合物,包括DNA组分如脱氧核糖。在试验中,通过抗坏血酸、H2O2、和Fe3+-EDTA的混合物产生HO·,即,经Fenton反应(H2O2在铁存在下)。HO·攻击脱氧核糖,使其降解成为片段,当在低pH下,在与硫代巴比妥酸(TBA)下加热时,产生粉红的发色团。所加入的羟基自由基“清除清除剂”与脱氧核糖竞争产生的羟基并减少发色团的形成。试验是在EDTA存在和不存在下完成的,以检验OPCs鳌合(=结合)过渡金属离子如铁的能力。结果列于下面表II中,并且以2次试验的平均值表示。
表II
银杏提取物的清除羟基自由基活性和金属螯合活性
与OPC含量改变的关系
对照* | C1* | C2* | 1* | 2* | 3* | |
银杏提取物组成(重量%) | ||||||
黄酮糖苷 | - | 25.0 | 25.0 | 25.0 | 25.0 | 25.0 |
银杏内酯 | - | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 |
白果内酯 | - | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 |
烷基酚 | - | <5ppm | <5ppm | <5ppm | <5ppm | <5ppm |
OPCs | - | 9 | 10 | 12 | 15 | 18 |
试验结果(与对照比较,抑制%) | ||||||
试验溶液中银杏提取物的浓度[%w/v] | ||||||
EDTA存在下的试验 | ||||||
0.03 | 0 | 0 | 1 | 8 | 12 | 14 |
0.1 | 0 | 17 | 18 | 25 | 35 | 37 |
不存在EDTA时的试验 | ||||||
0.003 | 0 | 8 | 10 | 37 | 45 | 49 |
0.01 | 0 | 36 | 40 | 76 | 79 | 81 |
0.03 | 0 | 68 | 70 | 79 | 80 | 82 |
0.1 | 0 | 73 | 75 | 83 | 85 | 86 |
*见表I的说明
III.清除超氧化物和过氧化氢的活性
两种另外的ROS是超氧化物(O2 ·-)和过氧化氢(H2O2)。体内产生的超氧化物-例如在活性吞噬细胞的氧化裂解(oxidative burst)过程中,或者在包含细胞色素P450氧化酶的反应中-大量酶促转化(SOD,超氧化物歧化酶)或者通过非酶促歧化成H2O2,其不带电,很容易穿过细胞膜。例如,在血管组织中增加生成的O2 ·-和H2O2,引起前炎症和与血管机能障碍有关的事件和相关疾病。
为了试验本发明所述的银杏提取物清除O2 ·-和H2O2的能力,使用黄嘌呤氧化酶/次黄嘌呤体系产生这些ROS,而使用化学发光(luminol)进行检测。
表III
银杏提取物清除超氧化物和过氧化氢的活性
与OPC含量变化的关系
对照* | C1* | C2* | 1* | 2* | 3* | |
银杏提取物组成(重量%) | ||||||
黄酮糖苷 | - | 25.0 | 25.0 | 25.0 | 25.0 | 25.0 |
银杏内酯 | - | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 |
白果内酯 | - | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 |
烷基酚 | - | <5ppm | <5ppm | <5ppm | <5ppm | <5ppm |
OPCs | - | 9 | 10 | 12 | 15 | 18 |
试验结果(与对照比较,抑制%) | ||||||
0.0001 | 0 | 36 | 38 | 50 | 65 | 67 |
0.001 | 0 | 72 | 75 | 83 | 86 | 89 |
0.01 | 0 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
*见表I的说明
IV.
抑制单线态氧的活性
单线态氧(1O2)是分子氧的电激发形式,它可以在体内以光化学法产生,即,暴露于光线下,或用代谢方法,例如通过活化的中性白细胞,在脂质的过氧化过程中,和抗炎症介质(前列腺素)以及解毒(细胞色素P450氧化酶)有关的酶促反应中产生。为了检测本发明所述的银杏提取物的抑制单线态氧活性,使用与单线态氧有关的光诱导皮肤损伤。经单线态氧对皮肤的光诱导损伤,如光老化(photoageing),又称作皮肤早期老化,是由与皮肤外细胞基质降解有关的酶诱导,以及与皮肤外细胞基质蛋白之一的胶原直接反应所引起的。反应包括畸变(aberrant)/交联的形成,因此,扰乱了皮肤基质的整体。为了检测诱导胶原损伤的1O2,通过使用核黄素作感光剂的UVA辐射而在体内产生1O2,并且,借助于提高胶原和葡萄糖水溶液的粘度来测定胶原损伤。得到的结果列于表IV中。
表IV
银杏提取物的抑制单线态氧活性与OPC含量变化的关系
对照* | C1* | C2* | 1* | 2* | 3* | ||||||
银杏提取物组成(重量%) | |||||||||||
黄酮糖苷 | - | 25.0 | 25.0 | 25.0 | 25.0 | 25.0 | |||||
银杏内酯 | - | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | |||||
白果内酯 | - | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | |||||
烷基酚 | - | <5ppm | <5ppm | <5ppm | <5ppm | <5ppm | |||||
OPCs | - | 9 | 10 | 12 | 15 | 18 | |||||
试验结果(与对照比较,抑制%) | |||||||||||
试验溶液中银杏提取物的浓度[%w/v] | |||||||||||
0.005 | 0 | 41 | 43 | 50 | 70 | 72 | |||||
0.010 | 0 | 54 | 56 | 75 | 78 | 79 | |||||
0.015 | 0 | 61 | 65 | 83 | 89 | 91 |
*见表I中的说明
各种试验的结果表明,照本发明的具有增加的OPC含量的银杏提取物作为抗氧化剂抗各种相关ROS,所述ROS是由人体及经外源产生的,并且,ROS导致氧化应激诱导的对人体健康有关的重要生物分子和生物系统损伤。应该更好地注意,有益性能的提高并不是简单地按比例,但是,人们能观察到存在约11~12%重量的临界OPC浓度。
具有提高的OPC含量的银杏提取物的抗氧化作用,一般显示针对自由基,如在DPPH检测中所证实。此外,它们涉及清除被认为是所有ROS的活性最强的羟基自由基(HO·-)的,所述羟基自由基在人体代谢的许多途径中产生并且也被认为是超氧化物(O2 ·-)和过氧化氢(H2O2)引起损伤的真正的有效物质。另外,具有提高的OPC含量的银杏提取物表明,具有金属螯合性能,因此,能够防止因过渡金属离子催化而产生ROS。此外,试验结果证明了提取物的清除超氧化物和过氧化氢性质以及抑制单线态(1O2)性能,即,其抗氧化剂活性进一步阻止ROS所导致的许多方面的自由基损伤人体细胞和组织。各种试验的结果清楚地证明,本发明的具有改进抗氧化性能的新提取物,与来自显示OPC含量降低的现有技术状态的已知的那些提取物相比,更适用于控制老化信号、环境应激反应、炎症以及其它健康状态,特别是那些与眼睛健康有关的病症的口服制剂。
实施例B1
新型银杏提取物的包囊(encapsulation)
在一500ml配有搅拌器和回流冷凝管的三颈烧瓶中,使3g的琼脂溶于加热煮沸的200ml水中。在约30分钟期间,在剧烈搅拌下首先将10g甘油在约100g水中的均匀分散液,然后将25g壳聚糖制剂(Hydagen DCMF,10%重量的乙醇酸溶液,Cognis Deutschland GmbH & Co.KG,Düsseldorf IFRG),10g实施例A1的银杏的喷雾干燥提取物,0.5g Phenonip(含苯氧乙醇和对羟基苯甲酸酯(parabens)的防腐混合物)以及0.5g聚山梨醇酯-20(Polysorbate-20)(Tween 20,ICI)在约100g水中的溶液加到混合物中。过滤所得基质,加热到50℃并在剧烈搅拌下分散到2.5倍其体积的预冷到15℃的石蜡油中。分散液用含1%重量的月桂基硫酸钠和0.5%重量藻酸钠的水溶液洗涤,然后重复用0.5%重量的Phenonip水溶液洗涤,取出油相。过筛后得到含8%重量平均直径为1mm的微胶囊的含水制剂。
实施例B2
新型银杏提取物的包囊
在一500ml安装有搅拌器和回流冷凝管的三颈烧瓶中,使1g的琼脂溶解于33g的水中并加热至100℃。随后,加入50g的2%重量的藻酸钙水溶液和5g的1%重量的Gellan Gum(Kelgocel,Degussa AG)水溶液。在强烈地搅拌后,于约30分钟的期间内10g实施例A1的喷雾干燥的银杏提取物、0.5g Phenonip和0.5g聚山梨醇酯-20(Tween20,ICI)于约100g水中的溶液加入到混合物中。把如此获得的组合物滴加至由癸基辛基甘油三脂(Myrito 331,Cognis Deutschland GmbH & Co.KG)组成的浴中。把所获得的琼脂/明胶/藻酸盐型的微囊分离出,并用含1%重量聚山梨醇酯-20的水溶液洗涤,以除去痕量的油成分。之后,把软胶囊送入由0.5%重量的氯化钙水溶液组成的浴中,以进行交联并使胶囊壁硬化。过筛后,获得含8%重量其平均直径为0.25mm微囊的含水制剂。
Claims (20)
1.来自银杏叶的提取物,其中包含:
(a)20~30%重量的黄酮糖苷;
(b)2.5~4.5%重量的银杏苦内酯A,B,C和J(总计);
(c)2.0~4.0%重量的白果内酯;
(d)低于10ppm的烷基酚化合物;和
(e)大于10%重量的低聚原花色素(OPC)。
2.按照权利要求1所述的提取物,其中,含有11~20%重量的OPC。
3.按照权利要求1和/或2所述的提取物,其中,含有12~18%重量的OPC。
4.按照权利要求1~3中任一项所述的提取物,其中,含有低于50ppm的4′O-甲基-吡哆醇。
5.按照权利要求1~4中任一项所述的提取物,其中,含有低于100ppm的双黄酮。
6.按照权利要求1~5中任一项所述的提取物,其中,含有5~10%重量的萜内酯。
7.按照权利要求1~6中任一项所述的提取物,其中,含有最多5%重量的水。
8.胶囊,其含有权利要求1所述的提取物。
9.一种制备银杏叶提取物的方法,其中包括:
(a)20~30%重量的黄酮糖苷;
(b)2.5~4.5%重量的银杏苦内酯A,B,C和J(总计);
(c)2.0~4.0%重量的白果内酯;
(d)低于10ppm的烷基酚化合物;和
(e)大于10%重量的低聚原花色素(OPC)。
其中:
(i)使银杏叶或干提取物,经过含水极性溶剂提取,产生第一液体中间体LI-1;
(ii)使所述中间体LI-1从有机溶剂分出,并用非极性C4~C10的烃的液-液提取,以获得第二(含水)液体中间体LI-2;
(iii)所述中间体LI-2,在调节pH至2.5~6之后,用极性C2~C6脂族醇的液-液提取,以获得富含OPC的(含水的)液体中间体LI-3以及另一种(有机的)富含苷的液体中间体LI-4;
(iv)浓缩所述中间体LI-4,用水稀释,并与非极性C4~C10烃混合,以获得另一种(有机的)液体中间体LI-5和另一种(含水)液体中间体LI-6;
(v)干燥所述液体中间体LI-6,产生第一固体中间体SI-1;
(vi)将所述液体中间体LI-3从有机溶剂分离,用水稀释,调节pH值至6~8,在最多10℃冷却足够的时间以使OPC从溶液中沉淀;
(vii)滤出所述沉淀,洗涤并干燥,以得到第二固体中间体SI-2;以及,最终
(viii)将所述第二固体中间体SI-2以使最终产品含有大于10%重量的OPC的量加到第一固体中间体SI-1中。
10.按照权利要求9所述的方法,其中,银杏叶显示至少10%重量的黄酮糖苷、银杏苦内酯和白果内酯的含量。
11.按照权利要求9所述的方法,其中,干银杏提取物显示5~20%重量的黄酮糖苷、银杏苦内酯和白果内酯的含量。
12.按照权利要求9~11中任一项所述的方法,其中,步骤(i)的极性溶剂是丙酮或乙醇。
13.按照权利要求9~12中任一项所述的方法,其中,步骤(ii)和(iv)中的所述非极性烃是正庚烷。
14.按照权利要求9~13中任一项所述的方法,其中步骤(iii)中的所述极性醇是正丁醇。
15.按照权利要求1所述提取物在制备药物组合物和/或食品添加剂和/或食品中的用途。
16.按照权利要求15的所述用途,其中,所述组合物是功能性食品、用于营养目的食品,和药品食品。
17.按照权利要求15和/或16的所述用途,其中,所述提取物根据最终组分计是以10~1000mg的量存在。
18.按照权利要求15和/或16所述的用途,其中,所述提取物是通过口服施用向人体给药。
19.按照权利要求1所述提取物在制备用于改善视网膜微循环的药物组合物中的用途。
20.按照权利要求1所述提取物在制备用于改善人体状态的药物组合物中的用途。
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