FR2827292A1

FR2827292A1 - Photoproteines mutees et leurs applications

Info

Publication number: FR2827292A1
Application number: FR0109293A
Authority: FR
Inventors: Bernard Lambolez; Nathalie Gibelin; Gaelle Bourout; Ludovic Eric Tricoire; Olivier Arsene Courjean; Keisuke Tsuzuki; Jean Rossier
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2001-07-12
Filing date: 2001-07-12
Publication date: 2003-01-17
Anticipated expiration: 2021-07-12
Also published as: CA2455542A1; AU2002333989A1; US20050130262A1; WO2003006497A3; FR2827292B1; WO2003006497A2; EP1404711A2

Abstract

L'invention a pour objet des photoprotéinesphoto protéines> mutées dérivées des photoprotéines isolées de méduses, lesdites photoprotéines mutées étant caractérisées par une thermostabilité supérieure à celle des photoprotéines dont elles dérivent, et sont désignées photoprotéines mutées thermostables, et/ ou par un temps de luminescence supérieur à celui des photoprotéines dont elles dérivent, et sont désignées photoprotéines mutées persistantes.L'invention concerne également l'utilisation des photoprotéines mutées susmentionnées dans le cadre de la mise en oeuvre de procédés de détection in vitro de molécules dans un échantillon biologique, de procédés de détection de composés à activité enzymatique dans un échantillon biologique, ou de procédés de détection des variations de calcium intracellulaire.

Description

PHOTOPROTEINES MUTEES ET LEURS APPLICATIONS ----------------------------------------------------------------------------------
La présente invention a pour objet des photoprotéines mutées dérivées des photoprotéines isolées de méduses, lesdites photoprotéines mutées étant caractérisées par une thermostabilité supérieure, et/ou par un temps de luminescence supérieur à ceux des photoprotéines dont elles dérivent, ainsi que les utilisations de ces protéines, notamment dans le cadre de la mise en oeuvre de procédés de détection in vitro de molécules, de procédés de détection de composés à activité enzymatique dans un échantillon biologique, ou de procédés de détection des variations de calcium intracellulaire induites par divers agents.

L'aequorine est une photoprotéine de la méduse Aequoria Victoria qui est constituée d'une partie protéique appelée l'apoequorine et d'un groupement prosthétique, la coelententerazine. Cette photoprotéine a la propriété d'émettre de la lumière lorsqu'elle est en présence d'ions Calcium (Ca2+). Cette propriété permet notamment de détecter les variations de Calcium dans les cellules. Cette photoprotéine est également utilisée comme marqueur pour détecter de faibles quantités de produits organiques (jusqu'à moins d'une centaine de molécules) en raison d'un rapport signal sur bruit de fond extrêmement élevé.

Ainsi, l'aequorine commence à être utilisée dans des systèmes commerciaux de détection de molécules. Son utilisation offre plusieurs avantages : une très grande gamme dynamique qui permet de détecter et de quantifier les molécules sur plusieurs ordres de grandeur, et un bruit de fond extrêmement faible qui permet de détecter la présence de seulement quelques dizaines de molécules dans un échantillon. Ceci permet d'éviter le recours aux techniques d'amplification, telles que la PCR pour la détection des acides nucléiques.

Cependant, les photoprotéines naturelles, et l'aequorine en particulier sont très sensibles aux variations de température qui peuvent dénaturer leur pouvoir d'émission de lumière.

Par ailleurs, la cinétique d'émission de la photoprotéine naturelle est extrêmement rapide (de l'ordre de la seconde) et oblige à une analyse échantillon par échantillon dans un luminomètre à injection rapide. Ceci pose un problème pour

utiliser l'aequorine dans un système de criblage à haut débit qui nécessite l'analyse simultanée d'un grand nombre d'échantillon (HTS, High Throughput Screening).

La présente invention découle de la mise en évidence par les inventeurs du fait que certaines mutations dans la séquence peptidique de l'aequorine permettent d'obtenir des mutants d'aequorine beaucoup moins sensibles à la température (à 37 C, les photoprotéines mutantes perdent leurs propriétés photoémettrices en quelques jours au lieu de quelques heures pour la protéine naturelle), ainsi que des mutants ayant une cinétique d'émission lumineuse très ralentie (de la dizaine de secondes à la minute) qui permettent d'analyser simultanément les échantillons (format microplaque à multipuits).

Ainsi la présente invention a principalement pour but de fournir de nouvelles photoprotéines moins sensibles aux élévations de température, et dont le transport et le stockage se trouvent être facilités en raison de leur meilleure stabilité.

La présente invention a pour but également de fournir de nouvelles photoprotéines résistantes jusqu'à 50 C, ce qui simplifie leur utilisation, notamment dans les expériences de détection d'acides nucléiques.

L'invention a également pour but de fournir de nouvelles photoprotéines dont le temps de luminescence est nettement supérieur à celui des photoprotéines dont elles dérivent, ce qui permet de les utiliser dans le cadre du criblage à haut débit, notamment pour la détection in vitro de molécules organiques à l'état de trace.

L'invention a également pour but de fournir des kits comprenant ces nouvelles photoprotéines, pour la mise en oeuvre de procédés de mesure et de détection tels que mentionnés ci-dessus.

L'invention a principalement pour objet les photoprotéines mutées dérivées des photoprotéines isolées de méduses, lesdites photoprotéines mutées étant caractérisées par une thermostabilité supérieure à celle des photoprotéines dont elles dérivent, et sont désignées photoprotéines mutées thermostables, et/ou par un temps de luminescence supérieur à celui des photoprotéines dont elles dérivent, et sont désignées photoprotéines mutées persistantes.

Avantageusement, les photoprotéines mutées selon l'invention, sont telles que la stabilité dans le temps est augmentée à 37 C d'un facteur d'au moins environ 10, et/ou leur temps de luminescence est augmenté d'un facteur d'au moins environ 10, par rapport aux photoprotéines dont elles dérivent.

Avantageusement encore, les photoprotéines mutées selon l'invention, sont caractérisées en ce qu'elles sont stables pendant au moins environ 30 minutes jusqu'à la température d'environ 50 C, et en ce qu'elles peuvent être conservées pendant au moins environ 4 jours à des températures pouvant atteindre jusqu'à 37 C, et/ou en ce que leur temps de luminescence est compris entre environ 1 min et environ 5 min.

L'invention a plus particulièrement pour objet les photoprotéines mutées telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles comprennent : * au moins une des trois mutations augmentant leur thermostabilité, choisie parmi les suivantes : - suppression de la lysine (K) contenue dans le motif RHKXIMFX2 dans lequel Xi=H ou F, et X2= N ou D, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cette lysine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette lysine par une arginine, - suppression de la glutamine (Q) contenue dans le motif DEMTRQHLGFWY, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cette glutamine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette glutamine par une arginine, - suppression de la leucine (L) contenue dans le motif DEMTRQHLGFWY susmentionné, ou substitution de cette leucine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette leucine par une isoleucine, * et/ou au moins une des six mutations augmentant leur temps de luminescence, choisie parmi les suivantes : - suppression du glutamate (E) contenue dans le motif DXjNX2X3GX4IXsLX6E dans lequel Xi=V ou I, X2=H, G ou S, X3=N ou D, X4=K ou Q, Xs=S, T ou N, et X6=D ou N, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de ce glutamate par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de ce glutamate par une glycine, - suppression de l'aspartate (D) contenue dans le motif DKDXjX2GX3X4XsLDE dans lequel Xi=Q, G ou R, X2=N ou S, X3=A, S ou T, X4=I ou V, et Xs=T ou S, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cet aspartate par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cet aspartate par une glycine, - suppression du glutamate (E) contenue dans le motif DKDXjX2GX3X4XsLDE susmentionné, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou

substitution de ce glutamate par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de ce glutamate par une glycine, - suppression de la phénylalanine (F) contenue dans le motif EXiTFXzXs dans lequel XI=E, K ou A, X2=R, K ou A, et X3=V ou H, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cette phénylalanine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette phénylalanine par une sérine, - suppression de l'aspartate (D) contenue dans le motif DXjDX2X3GX4LDVDE, dans lequel Xi=I ou L, X2=E, N ou G, X3=S ou D, et X4=Q, K ou D, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cet aspartate par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cet aspartate par une glycine, - suppression de la valine en position 54 de la séquence peptidique SEQ ID NO : 2 de l'aequorine, ou substitution de cette valine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette valine par une alanine.

Des photoprotéines mutées thermostables particulièrement préférées selon l'invention, sont caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une des deux mutations suivantes : - suppression de la glutamine contenue dans le motif DEMTRQHLGFWY, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cette glutamine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette glutamine par une arginine, - suppression de la leucine contenue dans le motif DEMTRQHLGFWY susmentionné, ou substitution de cette leucine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette leucine par une isoleucine.

Des photoprotéines mutées persistantes particulièrement préférées selon l'invention, sont caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une des mutations suivantes : - suppression de l'aspartate (D) contenue dans le motif DKDXjX2GX3X5LDE dans lequel Xi=Q, G ou R, X2=N ou S, X3=A, S ou T, X4=I ou V, et X5=T ou S, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cet aspartate par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cet aspartate par une glycine, - suppression du glutamate (E) contenue dans le motif DKDXGXsXXsLDE susmentionné, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou

substitution de ce glutamate par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de ce glutamate par une glycine, - suppression de l'aspartate (D) contenue dans le motif DXi DX2X3GX4LDVDE, dans lequel Xi=I ou L, X2=E, N ou G, X3=S ou D, et X4=Q, K ou D, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cet aspartate par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cet aspartate par une glycine.

L'invention a plus particulièrement pour objet les photoprotéines mutées telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles dérivent de : - l'aequorine extraite de la méduse Aequoria Victoria, ladite aequorine étant telle que représentée par la séquence SEQ ID NO : 2, - la clytine extraite de la méduse Clytia gregaria, ladite clytine étant telle que représentée par la séquence SEQ ID NO : 18, - la mitrocomine extraite de la méduse Mitrocoma cellularia, ladite mitrocomine étant telle que représentée par la séquence SEQ ID NO : 34, - ou de l'obéline extraite de la méduse Obelia longissima, ladite obéline étant telle que représentée par la séquence SEQ ID NO : 50.

L'invention concerne plus particulièrement les photoprotéines mutées thermostables dérivées de l'aequorine telles que définies ci-dessus, et choisies parmi les protéines comprenant les séquences suivantes : - la séquence peptidique SEQ ID NO : 4, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 dans laquelle la lysine en position 27 est remplacée par une arginine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 6, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 dans laquelle la glutamine en position 178 est remplacée par une arginine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 8, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 dans laquelle la leucine en position 180 est remplacée par une isoleucine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 10, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 dans laquelle la lysine en position 27 est remplacée par une arginine, et la glutamine en position 178 est remplacée par une arginine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 12, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 dans laquelle la lysine en position 27 est remplacée par une arginine, et la leucine en position 180 est remplacée par une isoleucine,

- la séquence peptidique SEQ ID NO : 14, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 dans laquelle la glutamine en position 178 est remplacée par une arginine, et la leucine en position 180 est remplacée par une isoleucine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 16, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 dans laquelle la lysine en position 27 est remplacée par une arginine, la glutamine en position 178 est remplacée par une arginine, et la leucine en position 180 est remplacée par une isoleucine,
L'invention a particulièrement pour objet les photoprotéines mutées thermostables dérivées de la clytine telles que définies ci-dessus, choisies parmi les protéines comprenant les séquences suivantes : - la séquence peptidique SEQ ID NO : 20, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 18 dans laquelle la lysine en position 26 est remplacée par une arginine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 22, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 18 dans laquelle la glutamine en position 177 est remplacée par une arginine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 24, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 18 dans laquelle la leucine en position 179 est remplacée par une isoleucine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 26, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 18 dans laquelle la lysine en position 26 est remplacée par une arginine, et la glutamine en position 177 est remplacée par une arginine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 28, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 18 dans laquelle la lysine en position 26 est remplacée par une arginine, et la leucine en position 179 est remplacée par une isoleucine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 30, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 18 dans laquelle la glutamine en position 177 est remplacée par une arginine, et la leucine en position 179 est remplacée par une isoleucine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 32, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 18 dans laquelle la lysine en position 26 est remplacée par une arginine, la glutamine en position 177 est remplacée par une arginine, et la leucine en position 179 est remplacée par une isoleucine,
L'invention concerne plus particulièrement les photoprotéines mutées thermostables dérivées de la mitrocomine telles que définies ci-dessus, choisies parmi les protéines comprenant les séquences suivantes : - la séquence peptidique SEQ ID NO : 36, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 34 dans laquelle la lysine en position 25 est remplacée par une arginine,

- la séquence peptidique SEQ ID NO : 38, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 34 dans laquelle la glutamine en position 176 est remplacée par une arginine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 40, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 34 dans laquelle la leucine en position 178 est remplacée par une isoleucine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 42, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 34 dans laquelle la lysine en position 25 est remplacée par une arginine, et la glutamine en position 176 est remplacée par une arginine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 44 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 34 dans laquelle la lysine en position 25 est remplacée par une arginine, et la leucine en position 178 est remplacée par une isoleucine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 46, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 34 dans laquelle la glutamine en position 176 est remplacée par une arginine, et la leucine en position 178 est remplacée par une isoleucine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 48, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 34 dans laquelle la lysine en position 25 est remplacée par une arginine, la glutamine en position 176 est remplacée par une arginine, et la leucine en position 178 est remplacée par une isoleucine.

L'invention concerne plus particulièrement les photoprotéines mutées thermostables dérivées de l'obéline telles que définies ci-dessus, choisies parmi les protéines comprenant les séquences suivantes : - la séquence peptidique SEQ ID NO : 52, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 50 dans laquelle la lysine en position 23 est remplacée par une arginine,

- la séquence peptidique SEQ ID NO : 54, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 50 dans laquelle la glutamine en position 174 est remplacée par une arginine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 56, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 50 dans laquelle la leucine en position 176 est remplacée par une isoleucine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 58, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 50 dans laquelle la lysine en position 23 est remplacée par une arginine, et la glutamine en position 174 est remplacée par une arginine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 60, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 50 dans laquelle la lysine en position 23 est remplacée par une arginine, et la leucine en position 176 est remplacée par une isoleucine,

- la séquence peptidique SEQ ID NO : 62 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 50 dans laquelle la glutamine en position 174 est remplacée par une arginine, et la leucine en position 176 est remplacée par une isoleucine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 64, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 50 dans laquelle la lysine en position 23 est remplacée par une arginine, la glutamine en position 174 est remplacée par une arginine, et la leucine en position 176 est remplacée par une isoleucine.

L'invention concerne plus particulièrement les photoprotéines mutées persistantes dérivées de l'aequorine telles que définies ci-dessus, et choisies parmi les protéines comprenant les séquences suivantes : - la séquence peptidique SEQ ID NO : 66 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 dans laquelle le glutamate en position 45 est remplacé par une glycine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 68 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 dans laquelle la valine en position 54 est remplacée par une alanine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 70 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 dans laquelle l'aspartate en position 127 est remplacé par une glycine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 72 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 dans laquelle le glutamate en position 138 est remplacé par une glycine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 74 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 dans laquelle la phénylalanine en position 159 est remplacée par une sérine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 76 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 dans laquelle l'aspartate en position 163 est remplacé par une glycine.

L'invention a particulièrement pour objet les photoprotéines mutées persistantes dérivées de la clytine telles que définies ci-dessus, choisies parmi les protéines comprenant les séquences suivantes : - la séquence peptidique SEQ ID NO : 78 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 18 dans laquelle le glutamate en position 44 est remplacé par une glycine,

- la séquence peptidique SEQ ID NO : 80 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 18 dans laquelle l'aspartate en position 126 est remplacé par une glycine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 82 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 18 dans laquelle le glutamate en position 137 est remplacé par une glycine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 84 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 18 dans laquelle la phénylalanine en position 158 est remplacée par une sérine,

- la séquence peptidique SEQ ID NO : 86 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 18 dans laquelle l'aspartate en position 162 est remplacé par une glycine.

L'invention concerne plus particulièrement les photoprotéines mutées persistantes dérivées de la mitrocomine telles que définies ci-dessus, choisies parmi les protéines comprenant les séquences suivantes : - la séquence peptidique SEQ ID NO : 88 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 34 dans laquelle le glutamate en position 43 est remplacé par une glycine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 90 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 34 dans laquelle l'aspartate en position 125 est remplacé par une glycine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 92 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 34 dans laquelle le glutamate en position 136 est remplacé par une glycine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 94 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 34 dans laquelle la phénylalanine en position 157 est remplacée par une sérine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 96 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 34 dans laquelle l'aspartate en position 161 est remplacé par une glycine.

L'invention concerne plus particulièrement les photoprotéines mutées persistantes dérivées de l'obéline telles que définies ci-dessus, choisies parmi les protéines comprenant les séquences suivantes : - la séquence peptidique SEQ ID NO : 98 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 50 dans laquelle le glutamate en position 41 est remplacé par une glycine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 100 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 50 dans laquelle l'aspartate en position 123 est remplacé par une glycine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 102 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 50 dans laquelle le glutamate en position 134 est remplacé par une glycine,

- la séquence peptidique SEQ ID NO : 104 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 50 dans laquelle la phénylalanine en position 155 est remplacée par une sérine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 106 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 50 dans laquelle l'aspartate en position 159 est remplacé par une glycine.

L'invention a plus particulièrement pour objet les photoprotéines mutées thermostables et persistantes telles que définies ci-dessus, choisies parmi : - les protéines dérivées de l'aequorine comprenant les séquences suivantes : SEQ ID NO : 4,6, 8,10, 12,14, 16, dans lesquelles E en position 45 est remplacé par G, et/ou V en position 54 est remplacé par A, et/ou D en position 127 est remplacé par G,

et/ou E en position 138 est remplacé par G, et/ou F en position 159 est remplacé par S, et/ou D en position 163 est remplacé par G, - les protéines dérivées de la clytine comprenant les séquences suivantes : SEQ ID NO : 20,22, 24,26, 28,30, 32, dans lesquelles E en position 44 est remplacé par G, et/ou D en position 126 est remplacé par G, et/ou E en position 137 est remplacé par G, et/ou F en position 158 est remplacé par S, et/ou D en position 162 est remplacé par G, - les protéines de la mitrocomine comprenant les séquences suivantes : SEQ ID NO : 36,38, 40,42, 44,46, 48, dans lesquelles E en position 43 est remplacé par G, et/ou D en position 125 est remplacé par G, et/ou E en position 136 est remplacé par G, et/ou F en position 157 est remplacé par S, et/ou D en position 161 est remplacé par G, - les protéines dérivées de l'obéline comprenant les séquences suivantes : SEQ ID NO : 52,54, 56,58, 60,62, 64, dans lesquelles E en position 41 est remplacé par G, et/ou D en position 123 est remplacé par G, et/ou E en position 134 est remplacé par G, et/ou F en position 155 est remplacé par S, et/ou D en position 159 est remplacé par G.

L'invention a plus particulièrement pour objet les photoprotéines mutées telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles sont liées : - à une sonde protéique ou nucléique susceptible de reconnaître des antigènes ou protéines ou acides nucléiques déterminés,

- ou à un substrat spécifique d'une activité enzymatique déterminée, - ou à une molécule susceptible de former un complexe avec une autre molécule, tel que le complexe avidine-biotine.

L'invention concerne également les séquences nucléotidiques codant pour les photoprotéines mutées définies ci-dessus.

A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet les séquences nucléotidiques susmentionnées, codant pour les photoprotéines mutées telles que définies ci-dessus, choisies parmi les acides nucléiques comprenant les séquences SEQ ID NO : 3,5, 7,9, 11,13, 15,19, 21,23, 25,27, 29,31, 35,37, 39,41, 43,45, 47,51, 53,55, 57,59, 61,63, 65,67, 69,71, 73,75, 77,79, 81,83, 85,87, 89,91, 93,95, 97, 99,101, 103,105, codant respectivement pour les séquences SEQ ID NO : 4,6, 8,10, 12,14, 16,20, 22,24, 26,28, 30,32, 36,38, 40,42, 44,46, 48,52, 54,56, 58,60, 62, 64,66, 68,70, 72,74, 76,78, 80, 82,84, 86, 88, 90,92, 94, 96, 98,100, 102,104, 106, ou toute séquence nucléotidique dérivée par dégénérescence du code génétique des séquences susmentionnées et codant pour les photoprotéines mutées susmentionnées.

L'invention concerne également les vecteurs, notamment les plasmides, contenant une séquence recombinante comprenant une séquence nucléotidique de l'invention telle que définie ci-dessus.

L'invention a également pour objet les cellules hôtes, telles que cellules procaryotes, notamment E. coli, ou eucaryotes, notamment les lignées HEK 293 (American Type Culture Collection ATCC n CRL-1573) ou CHO (ATCC n CCL-61), comprenant une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, lesdites cellules étant telles qu'obtenues par transformation à l'aide d'un vecteur susmentionné.

L'invention concerne également tout procédé de préparation de photoprotéines mutées telles que définies ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de cellules hôtes appropriées à l'aide d'un vecteur susmentionné, la mise en culture de cellules hôtes transformées ainsi obtenues dans un milieu approprié, et la récupération, le cas échéant après purification, des photoprotéines mutées produites par ces cellules.

L'invention a également pour objet l'utilisation de photoprotéines mutées telles que définies ci-dessus, ou de cellules hôtes transformées susmentionnées exprimant lesdites photoprotéines mutées, dans le cadre de la mise en oeuvre : - de procédés de détection in vitro de molécules, tels que des protéines ou antigènes ou des acides nucléiques dans un échantillon biologique, notamment dans le cadre du dépistage in vitro de bactéries telles que les Listeria dans les aliments, ou dans le cadre du dépistage d'agents pathogènes tels que le virus VIH chez l'homme, - de procédés de détection de composés à activité enzymatique dans un échantillon biologique, notamment dans le cadre du criblage de molécules activant ou inhibant une activité enzymatique spécifique, - de procédés de détection des variations de calcium intracellulaire induites par divers agents, notamment dans le cadre du criblage de molécules agissant sur une séquence nucléique ou protéique fusionnée à la photoprotéine mutée, ou coexprimée avec la photoprotéine mutée dans des cellules hôtes susmentionnées.

L'invention a plus particulièrement pour objet des procédés de détection in vitro de protéines ou antigènes ou d'acides nucléiques dans un échantillon biologique, tels que définis ci-dessus, caractérisés en ce qu'ils comprennent principalement les étapes suivantes : - le cas échéant, une étape d'amplification du nombre d'acides nucléiques présents dans l'échantillon biologique,

- immobilisation des protéines ou antigènes ou acides nucléiques sur un support approprié, puis addition d'une sonde spécifique desdits protéines ou antigènes ou acides nucléiques et rinçage, ladite sonde étant liée à une photoprotéine mutée telle que définie ci-dessus, ou ladite photoprotéine étant additionnée sur le support avec les réactifs appropriés pour sa liaison à ladite sonde, - mesure de l'intensité de la bioluminescence émise après l'étape de rinçage.

L'invention a également pour objet les procédés de détection in vitro de composés à activité enzymatique dans un échantillon biologique tels que définis ci-dessus, caractérisés en ce qu'ils comprennent principalement les étapes suivantes :

- immobilisation sur un support approprié d'un substrat protéique spécifique de l'activité enzymatique à détecter, ce substrat étant lié à une photoprotéine'mutée telle que définie ci-dessus, addition de l'échantillon biologique, puis rinçage, - ou immobilisation sur un support approprié des composés de l'échantillon biologique, addition du substrat protéique lié à une photoprotéine mutée telle que définie ci-dessus, puis rinçage, - mesure de l'intensité de la bioluminescence émise après l'étape de rinçage.

L'invention a plus particulièrement pour objet encore, les procédés de détection in vitro des variations de calcium intracellulaire induites par divers agents tels que définis ci-dessus, caractérisés en ce qu'ils comprennent la mise en culture de cellules transformées susmentionnées, avec l'échantillon contenant les molécules à détecter, et la mesure de la variation de bioluminescence.

Avantageusement, les procédés susmentionnés selon l'invention, sont caractérisés en ce qu'ils peuvent être effectués jusqu'à des températures d'environ 50 C, à l'aide de photoprotéines mutées thermostables, et, le cas échéant, persistantes, telles que définies ci-dessus.

Avantageusement encore, les procédés susmentionnés selon l'invention, sont caractérisés en ce qu'ils peuvent être effectués en simultanés sur échantillons multiples, à l'aide de photoprotéines persistantes, et, le cas échéant, thermostables, telles que définies ci-dessus.

L'invention a également pour objet les kits ou trousses, pour la mise en oeuvre de procédés tels que définis ci-dessus, caractérisés en ce qu'ils comprennent des photoprotéines mutées susmentionnées, le cas échéant en association avec des réactifs nécessaires à la mise en oeuvre desdits procédés.

L'invention a plus particulièrement pour objet les kits tels que définis ci-dessus, caractérisés en ce qu'ils peuvent être conservés en solutions prêtes à l'emploi, notamment pendant au moins environ 4 jours à des températures ambiantes d'environ 20 C, et pouvant atteindre jusqu'à environ 37 C, lorsqu'ils contiennent des photoprotéines mutées thermostables, et, le cas échéant, persistantes, telles que définies ci-dessus.

L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit d'obtention de photoprotéines mutées telles que définies ci-dessus, et des conditions d'utilisation de ces photoprotéines dans le cadre des applications susmentionnées de ces dernières.

A) Obtention de mutants thermostables de la photoprotéine aequorine
Protocoles
La procédure employée a consisté en la réalisation d'une banque de mutants aléatoires d'aequorine générés par la technique de"DNA shuffling" (ou brassage de l'ADN) (Stemmer, WPC, 1994). Ces mutants, insérés dans un vecteur d'expression procaryotique ont été transformés dans E. coli et clonés. Les clones ont été criblés individuellement pour une augmentation de bioluminescence. Les meilleurs mutants ont alors été utilisés pour un deuxième tour de DNA shuffling suivi d'un criblage identique.

Ce processus a été répété une troisième fois. Trois mutations qui augmentaient l'activité de l'aequorine ont été répertoriées. Lors des test subséquents, nous avons pu montrer que ces mutations n'augmentent pas l'émission de lumière de l'aequorine mais augmentent sa stabilité. Ceci explique que ces mutants aient été sélectionnés dans notre système cellulaire procaryotique (E. coli). Pour l'un de ces mutants, les tests montrent une augmentation du temps de demi-vie à 37 C d'un facteur 12.5 en système cellulaire procaryotique et d'un facteur 7.5 pour la protéine purifiée, par rapport à l'aequorine sauvage. De même, la température de demi-inactivation de ce mutant lors d'un choc thermique de 30 minutes est supérieure de 10 degrés Celsius à celle de l'aequorine sauvage (expérience réalisée en système cellulaire et sur protéine purifiée). Ce même mutant montre une légère réduction d'affinité pour le calcium par rapport à l'aequorine sauvage, ce qui est un avantage pour une utilisation de l'aequorine in vitro.

DNA shuffling
Le cDNA de l'aequorine sauvage (Aeqwt,-600 bp) a été sous-cloné aux sites KpnI (5') et EcoRI (3') du vecteur pPD16 sous dépendance du promoteur Plac. Ce clone a été nommé pPD-Aeqwt. 20 ng du plasmide pPD-Aeqwt a été digéré par PstI et vagi (sites externes à l'insert aequorine dans le polylinker de pPD16) et l'insert Aeqwt amplifié par PCR en utilisant les amorces suivantes : up-e-Aeq, 5'CGG GTA CCG ATG CTTTATGATGTTCCTGAT 3'et lo-e-Aeq, 5'TGGAATTC TTA GGGGACAGCTCCAC 3'. Le produit de PCR résultant a été purifié (Qiaquick extraction kit, Qiagen). 3 ptg du produit purifié a été digéré par la DNAseI (1 ng/ l) dans 100 ul de tampon DNAse I à 25 C pendant 7 min. Les fragments de digestion compris entre 50 et 300 bp ont été purifiés par électrophorèse sur gel d'agaròse.

PCR sans amorces (shuffling)

1 ug des fragments Aeq digérés ont été soumis à une PCR sans amorces dans 50 ul de tampon PCR contenant 200 uM de chaque dNTP, 2, 2 mM MgCl2, 2. 5 unités de taq polymérase (Qiagen) en effectuant 35 cycles avec 30s à 94 C, 30s à 45 C et 30s à 72 C.

PCR avec amorces
2,5 al du produit de la réaction de shuffling a été amplifié par 20 cycles de PCR (30s à 94 C, 30s à 58 C et 40s à 72 C) dans 100 ul de tampon de PCR contenant 20 pmole de chaque amorce up-e-Aeq et lo-e-Aeq, 50 uM de chaque dNTP, 1,5 mM MgCl2 et 2.5 unités de taq polymérase (Qiagen).

Banque de mutants
Le produit de la PCR avec amorces (aequorines mutées) a été purifié (Qiaquick extraction kit, Qiagen), digéré KpnI/EcoRI et sous-cloné dans le vecteur pPD16 sous dépendance du promoteur Plac. La banque d'aequorines mutantes a été transformée dans la souche d'E. Coli XL1 blue (Stratagene), et étalée sur boites LB ampicilline.

Au 1er tour de shuffling-criblage, 15840 colonies ont été repiquées individuellement, transférées en plaques 96 puits (Costar) dans 50 ul de LB ampicilline

par puits et incubées 4 h à 37 C avec agitation en vue du criblage de leur activité.

Aux 2e et 3e tour de shuffling-criblage, respectivement 19200 et 17952 colonies ont été repiquées individuellement, transférées en plaques 96 puits dans 200 ul de milieu de congélation (composition en g/l, Bacto tryptone, 16, Bacto yeast extract, 10, NaCl, 5, K2HP04, 0,27, KH2PO4, 7,16, Na citrate, 2, MgS04-7H20, 0,1, (NH4) 2S04,

0,9, glycérol, 50 et 100 g/ml d'ampicilline) et après incubation sur la nuit à 37 C sans agitation, stockées à-80 C. Ces plaques de stockage ont été répliquées (96 pin

replicator long, Genetix) en plaques 96 puits (Costar) dans pli de LB ampicilline par puits. Ces répliques pour criblage ont été incubées 4 h à 37 C avec agitation.

Après ajout de 50 po par puits d'une solution contenant Tris pH8, 100 mM, NaCl, 90 mM, coelenterazin, 5 mM, les plaques à cribler ont été incubées à 4 C durant la nuit pour la reconstitution de l'aequorine (volume final par puits 100/11).

Criblage
Après 15 minutes à température ambiante, les clones d'aequorines mutées en plaques 96 puits ont été criblées pour leur activité de bioluminescence activée par le Ca à l'aide d'un luminomètre à injecteur (PhL, Mediators, Austria). La lumière émise durant les 4 secondes consécutives à l'injection de l00 Ill d'une solution contenant Cal2, 20 mM et triton X100, 1% a été mesurée pour chaque clone individuellement.

Les mutants ont été sélectionnés sur la base d'une activité 15 fois supérieure à la moyenne des clones de la plaque 96 puits et ré-étalés sur boite LB ampicilline pour confirmation et comparaison avec l'aequorine sauvage. A l'issue du 1er tour de criblage, 40 clones dont l'activité était supérieure à celle de l'aequorine sauvage ont été sélectionnés pour le 2e tour de shuffling-criblage. 37 clones ont été sélectionnés au second tour pour le troisième tour de criblage. L'insert de chacun de ces clones a été amplifié individuellement par PCR en utilisant les amorces up-e-Aeq et lo-e-Aeq (voir ci-dessus, DNA shuffling). Les produits de PCR de chaque clone ont été combinés (200 ng par clone) et soumis au protocole de DNA shuffling précédent pour générer la banque de mutants du tour suivant.

1
Séquençage des mutants
Le séquençage des mutants (7 mutants sélectionnés au 2e tour et 7 mutants sélectionnés au 3e tour) a été réalisé sur un séquenceur automatique ABI310 (PE applied biosystems) avec les amorces up-e-Aeq et lo-e-Aeq (voir DNA shuffling).

Purification des aequorines
Les cDNA de l'aequorine sauvage et des aequorines mutantes, excisés par double coupure KpnIlEcoRI ont été sous-clonés dans pRSETC (Invitrogen, Xpress protein expression system). Les plasmides résultants ont été transformés dans la souche d'E. Coli BL21 (DE3) pLysS (Invitrogen) pour expression des aequorines. Les

aequorines ont été purifiées par chromatographie d'affinité sur colonne de nickelagarose (Invitrogen, Xpress protein expression system), selon les instructions du fabriquant (élution par 350 mM imidazole). Les aequorines purifiées ont été conservées

à-20 C dans une solution contenant (concentrations finales) imidazole, 175 mM ; EDTA, 10 uM ; BSA, 10/lg/ml et glycérol, 50%.

Expression en lignée cellulaire eucaryote (HEK 293) Les cDNA de l'aequorine sauvage et des aequorines mutantes, excisés par double

coupure pnl/Spel ou HindIIMpeI ont été sous-clonés aux sites KpnIlNheI ou coupure K HindIII/NheI dans un vecteur d'expression eucaryote, pCMX, sous dépendance du promoteur CMV. Les plasmides résultants ont été co-transfectés avec Un plasmide contenant le gène LacZ (p-galactosidase) sous dépendance du promoteur RSV dans les cellules HEK 293.24 h après la transfection les cellules ont été collectées et resuspendues en tampon PBS.

Test d'activité ss-galactosidase.

Un aliquote de la suspension cellulaire a été utilisé pour la mesure de l'activité ss-galactosidase (luminescent ss-galactosidase detection kit II, Clontech) en plaque 96 puits afin de normaliser les activités aequorine.

Bioluminescence aequorine.

Après ajout de coelenterazine (10 uM final) la suspension cellulaire a été distribuée en plaque 96 puits à raison de 50 Ill par puits et incubée 3h à 37 C pour reconstituer l'aequorine. La mesure de l'activité aequorine a été réalisée à l'aide d'un luminomètre à injecteur (PhL, Mediators, Austria). La lumière émise durant les 4 secondes consécutives à l'injection de 100 nul d'une solution contenant CaCl2, 1,5 mM et triton X100, 0,75% a été mesurée et normalisée par rapport à l'activité ss-galactosidase.

Tests de stabilité des aequorines
En bactéries
Pour chaque clone d'aequorine à tester, une colonie a été amplifiée dans 5 ml de LB ampicilline et après centrifugation le culot bactérien a été rincé deux fois par 5 ml d'une solution contenant NaCl, 100 mM ; Tris HCl, 50 mM, pH 8 et EGTA, 1 mM. Les bactéries ont été resuspendues dans 500 Ill de la même solution contenant 10 pom de

coelenterazine et incubées à 4 C durant la nuit. Après ajout de lysozyme (0,8 mg/ml final) et homogénéisation, des aliquotes de 50 pLI ont été prélevés pour les test de stabilité.

Stabilité à 37 C au cours du temps : les aliquotes ont été incubés à 37 C et à différents temps (jusqu'à 72 h), puis ont été distribués en plaque 96 puits à raison de 10 ul par puits. La luminescence activée par injection de 200 III d'une solution contenant CaC12, 2 mM ; NaCl, 100 mM ; Tris HCl pH 8,50 mM et EGTA, 1 mM (Ca2+ libre,-1 mM) a été mesurée et normalisée par rapport à la valeur obtenue à to.

Stabilité à différentes températures : les aliquotes ont été incubés à des températures comprises entre 25 et 55 C durant 30 min puis distribués en plaque 96 puits à raison de zip par puits. La luminescence, mesurée comme ci-dessus, a été normalisée par rapport à la valeur obtenue à 25 C.

Sur protéines purifiées
Les aequorines purifiées ont été reconstituées par dilution 10 dans une solution contenant Tris HCI, 50 mM pH8 ; DTT, 10 mM, EDTA, 1 mM et coelenterazine, 2 uM

et incubation 1h à 4 C. Des aliquotes de 50 ul ont ensuite été prélevés pour les test de stabilité. Les mesures de stabilité ont été effectuées comme précédemment, à l'exception de l'étape d'activation réalisée par injection de 100 gel d'une solution contenant CaCl2, 10 mM ; Tris HCI pH 8,50 mM et EDTA, 1 mM.

Tests de sensibilité calcique des aequorines
Les aequorines purifiés ont été reconstituées par dilution 10 dans une solution contenant Tris HCI, 50 mM pH8 ; DTT, 10 mM, EDTA, 10 u. M et coelenterazine, zum et incubation 1h à 4 C. Les aequorines reconstituées ont été, distribuées en plaque 96

puits à raison de 55 ni par puits et activées par 100 ul d'une solution contenant Tris HCI pH 8, 50 mM ; EDTA, 10 uM et des concentrations de Ca2+ libres variables (concentrations libres finales après injection : 10-8 à 10-1 M). Les mesures de luminescence (luminomètre PhL, Mediators) ont été réalisées en mode cinétique (Fast kinetics, Interval 0.1 sec, kinetic points 60). La détermination des courbes de sensibilité calcique a été basée sur les valeurs initiales de luminescence des cinétiques d'émission lumineuse.

B) Obtention de mutants persistants de la photoprotéine aequorine à luminescence prolongée
Protocoles
La procédure employée a consisté en la réalisation d'une banque de mutants aléatoires d'aequorine générés par la technique de"DNA shuffling" (Stemmer, WPC, 1994). Ces mutants, insérés dans un vecteur d'expression procaryotique ont été transformés dans E. Coli et clonés. Les clones ont été criblés individuellement pour une augmentation de la durée d'émission de la bioluminescence. Les meilleurs mutants ont alors été séquencés. Nous avons répertorié six mutations qui prolongent la bioluminescence de l'aequorine. Lors des test subséquents, nous avons pu montrer que ces mutations n'augmentent pas l'émission totale de lumière de l'aequorine mais ralentissent sa cinétique. Pour ces mutants, les tests montrent une augmentation du temps d'émission de la bioluminescence (de l'ordre de la minute) d'environ un facteur dix en système cellulaire procaryotique ou eucaryotique et sur protéine purifiée, par rapport à l'aequorine sauvage (de l'ordre de la seconde). Des données préliminaires indiquent que certains mutants présenteraient une thermostabilité supérieure à celle de l'aequorine sauvage (expériences réalisées sur protéine purifiée). Tous ces mutants sauf un montrent une importante réduction d'affinité pour le calcium par rapport à l'aequorine sauvage.

DNA shuffling

Le cDNA de l'aequorine sauvage (Aeqwt, -600 bp) a été sous-cloné aux sites KpnI (5') et EcoRI (3') du vecteur pPD16 sous dépendance du promoteur Plac. Ce clone a été nommé pPD-Aeqwt. 20 ng du plasmide pPD-Aeqwt a été digéré par PstI et EagI (sites externes à l'insert aequorine dans le polylinker de pPD16) et l'insert Aeqwt amplifié par PCR en utilisant les amorces suivantes : up-e-Aeq, 5'CGG GTA CCG ATG CTTTATGATGTTCCTGAT 3'et lo-e-Aeq, 5'TGGAATTC TTA GGGGACAGCTCCAC 3'. Le produit de PCR résultant a été purifié (Qiaquick extraction kit, Qiagen). 3 jug du produit purifié a été digéré par la DNAseI (1 ng/l)

dans 100 l de tampon DNAse 1 à 250C pendant 7 min. Les fragments de digestion compris entre 50 et 300 bp ont été purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose.

PCR sans amorces (shuffling)
1 jug des fragments Aeq digérés ont été soumis à une PCR sans amorces dans 50

ILl de tampon PCR contenant 200 ILM de chaque dNTP, 2, 2 mM MgCL ;, 2. 5 unités de taq polymérase (Qiagen) en effectuant 35 cycles avec 30s à 94 C, 30s à 45 C et 30s à 72 C.

PCR avec amorces

2, 5 ILl du produit de la réaction de shuffling a été amplifié par 20 cycles de PCR (30s à 94 C, 30s à 58 C et 40s à 72 C) dans 100 ILl de tampon de PCR contenant 20 pmole de chaque amorce up-e-Aeq et lo-e-Aeq, 50 ILM de chaque dNTP, 1,5 mM MgCl2 et 2.5 unités de taq polymérase (Qiagen).

Banque de mutants
Le produit de la PCR avec amorces (aequorines mutées) a été purifié (Qiaquick extraction kit, Qiagen), digéré KpnI 1 EcoRI et sous-cloné dans le vecteur pPD16 sous dépendance du promoteur Plac. La banque d'aequorines mutantes a été transformée dans la souche d'E. Coli XL1 blue (Stratagene), et étalée sur boites LB ampicilline.

15840 colonies ont été repiquées individuellement, transférées en plaques 96 puits (Costar) dans 50 ILl de LB ampicilline par puits et incubées 4 h à 370C avec agitation en vue du criblage de leur activité.

Après ajout de 50 l par puits d'une solution contenant Tris pH8,100 mM, NaCl, 90 mM, coelenterazin, 5 mM, les plaques à cribler ont été incubées à 4 C durant la nuit pour la reconstitution de l'aequorine (volume final par puits 100 ILl).

Criblage
Après 15 minutes à température ambiante, les clones d'aequorines mutées en plaques 96 puits ont été criblées pour leur activité de bioluminescence activée par le Ca2+ à l'aide d'un luminomètre à injecteur (PhL, Mediators, Austria). La lumière émise durant les 4 secondes consécutives (tO-4) à l'injection de 100 al d'une solution contenant Cal2, 20 mM et triton X100, 1 %, et durant les 4 secondes suivantes (t4-8) a été mesurée pour chaque clone individuellement. Les mutants ayant un rapport tO-

4/t4-8 inférieur à 1.5 ont été sélectionnés et réétalés sur boite LB ampicilline pour confirmation et détermination des meilleurs mutants.

Séquençage des mutants
Le séquençage des mutants (20 mutants séquencés) a été réalisé sur un séquenceur automatique ABI310 (PE applied biosystems) avec les amorces up-e-Aeq et lo-e-Aeq (voir DNA shuffling).

Purification des aequorines
Les cDNA de l'aequorine sauvage et des aequorines mutantes, excisés par double coupure KpnIlEcoRI ont été sous-clonés dans pRSETC (Invitrogen, Xpress protein expression system). Les plasmides résultants ont été transformés dans la souche d'E. Coli BL21 (DE3) pLysS (Invitrogen) pour expression des aequorines. Les aequorines ont été purifiées par chromatographie d'affinité sur colonne de nickelagarose (Invitrogen, Xpress protein expression system), selon les instructions du fabriquant (élution par 350 mM imidazole). Les aequorines purifiées ont été conservées à -20oC dans une solution contenant (concentrations finales) imidazole, 175 mM ; EDTA, 10 M ; BSA, 10 jug/ml et glycérol, 50%.

Expression en lignée cellulaire eucaryote (HEK 293)

Les cDNA de l'aequorine sauvage et des aequorines mutantes, excisés par double coupure KpnIlSpeI ou HindIII/SpeI ont été sous-clonés aux sites KpnI/NheI ou HindIII/NheI dans un vecteur d'expression eucaryote, pCMX, sous dépendance du 1 promoteur CMV. Les plasmides résultants ont été transfectés dans les cellules HEK 293.24 h après la transfection les cellules ont été collectées et resuspendues en tampon PBS.

Après ajout de coelenterazine (10 AM final) la suspension cellulaire a été distribuée en plaque 96 puits à raison de 50 ILl par puits et incubée 3h à 37 C pour reconstituer l'aequorine. La mesure de l'activité aequorine a été réalisée à l'aide d'un luminomètre à injecteur (PhL, Mediators, Austria). Les cinétiques d'émission de la bioluminescence consécutives à l'injection de 100 iLl d'une solution contenant CaCI,

1,5 mM et triton X100,0, 75% ont été déterminées en mode cinétique (Fast kinetics, Interval 0.1-10 sec, kinetic points 60).

Tests de cinétique de bioluminescence et de sensibilité calcique des aequorines
En bactéries
Pour chaque clone d'aequorine à tester, une colonie a été amplifiée dans 5 ml de LB ampicilline et après centrifugation le culot bactérien a été rincé deux fois par 5 ml d'une solution contenant NaCl, 100 mM ; Tris HCl, 50 mM, pH 8 et EGTA, 1 mM.

Les bactéries ont été resuspendues dans 500 J1l de la même solution contenant 10, aM de coelenterazine et incubées à 4 C durant la nuit. Après ajout de lysozyme (0,8 mg/ml final) et homogénéisation, des aliquotes de 50 J1l ont été prélevés pour les test de cinétique et/ou de sensibilité calcique comme décrit ci-dessous.

Sur protéines purifiées
Les aequorines purifiées ont été reconstituées par dilution 10 dans une solution contenant Tris HC1, 50 mM pH8 ; DTT, 10 mM, EDTA, 10 J1M et coelenterazine, 2 J1M et incubation 1h à 4 C Les aequorines reconstituées ont été distribuées en plaque 96 puits à raison de 55 l par puits et activées par 100 J1l d'une solution contenant Tris HCl pH 8,50 mM ; EDTA, 10 J1M et des concentrations de Ca2+ libres variables (concentrations libres finales après injection : 10' à 10' M). Les mesures de luminescence (luminomètre PhL, Mediators) ont été réalisées en mode cinétique (Fast kinetics, Interval 0.1-10 sec, kinetic points 60). La détermination des courbes de sensibilité calcique a été basée sur les valeurs initiales de luminescence des cinétiques d'émission lumineuse.

C) Applications industrielles des mutants de la photoprotéine aequorine
1) Détection in vitro de molécules organiques (acides nucléiques, protéines, antigènes etc.)
Ces tests de détection sont basés sur l'immobilisation de la molécule à détecter et sur la fixation spécifique de la photoprotéine à cette molécule. L'immobilisation et la fixation spécifique sont réalisées par des moyens très divers en fonction du type de

molécule à détecter et du type d'échantillon à analyser. La quantité de la molécule à détecter dans l'échantillon est ensuite déterminée par activation de la photoprotéine fixée et mesure de la bioluminescence émise. a) Détection d'acides nucléiques
La détection de séquences d'acides nucléiques peut être réalisée, soit après une étape d'amplification par PCR (ADN) ou RT-PCR (ARN) ou par toute autre technique d'amplification d'acides nucléiques, soit directement. Après immobilisation des molécules d'acides nucléiques ou de leurs produits d'amplification, les molécules sont détectées par hybridation d'une sonde. L'hybridation de la sonde est ensuite révélée grâce à une photoprotéine couplée directement à la sonde ou liée de façon subséquente à celle-ci. Les molécules d'acides nucléiques ou de leurs produits d'amplification sont quantifiées par l'intensité de la bioluminescence émise.

Les principales références bibliographiques décrivant de tels procédés sont les suivantes :
1-Lewis JC, Daunert S. Photoproteins as luminescent labels in binding assays.

Fresenius J Anal Chem. 2000 Mar-Apr ; 366 (6-7) : 760-8
2-Coombes BK, Mahony JB. Nucleic acid sequence based amplification (NASBA) of Chlamydia pneumoniae major outer membrane protein (ompA) mRNA with bioluminescent detection. Comb Chem High Throughput Screen. 2000 Aug ; 3 (4) : 315-27.

3-Laios E, Ioannou PC, Christopoulos TK. Enzyme-amplified aequorin-based bioluminometric hybridization assays. Anal Chem. 2001 Feb 1 ; 73 (3) : 689-92.

4-Actor JK. Bio1uminescent quantitation and detection, of gene expression during infectious disease. Comb Chem High Throughput Screen. 2000 Aug ; 3 (4) : 273-88.

5-White SR, Christopoulos TK. Signal amplification system for DNA hybridization assays based on in vitro expression of a DNA label encoding apoaequorin.

Nucleic Acids Res. 1999 Oct 1 ; 27 (19) : e25.

6-Guenthner PC, Hart CE. Quantitative, competitive PCR assay for HIV-1 using a microp1ate-based detection system. Biotechniques. 1998 May ; 24 (5) : 810-6.

b) Détection de protéines ou d'antigènes
Après immobilisation, les protéines et antigènes sont détectés par association spécifique avec une sonde (association du type antigène-anticorps ou ligand-récepteur).

La fixation de la sonde est ensuite révélée grâce à une photoprotéine couplée directement à la sonde ou liée de façon subséquente à celle-ci. Les molécules de protéines ou d'antigènes sont quantifiées par l'intensité de la bioluminescence émise.

Les principales références bibliographiques décrivant de tels procédés sont les suivantes :
1-Jackson RJ, Fujihashi K, Kiyono H, McGhee JR. Luminometry : a novel bioluminescent immunoassay enhances the quantitation of mucosal and systemic antibody responses. J Immunol Methods. 1996 Apr 19 ; 190 (2) : 189-97.

2-Mattox S, Walrath K, Ceiler D, Smith DF, Cummings RD. A solid-phase assay for the activity of CMPNeuAc : Gal beta 1-4G1cNAc-R alpha-2,6-sialyltransferase. Anal Biochem. 1992 Nov 1 ; 206 (2) : 430-6.

2) Détections d'activités enzymatiques
Des substrats protéiques composés en partie d'une photoprotéine (type protéine de fusion) peuvent permettre de mesurer des activités enzymatiques in vitro ou en systèmes cellulaires. Les activités enzymatiques détectables sont, par exemple, du type modification de protéines (protéases, kinases, glycosylases, etc. ). Ce type de mesure peut servir au criblage de molécules activant ou inhibant une activité enzymatique spécifique (par exemple en référence 1, détection de l'activité de la protéase d'HIV-1).

Pour les mesures in vitro, le substrat protéique contenant la photoprotéine, ou l'échantillon à doser, sont immobilisés. L'activité enzymatique est ensuite quantifiée par l'intensité de la bioluminescence émise. Le même type de mesure peut être réalisé en systèmes cellulaires exprimant le gène correspondant au substrat protéique contenant la photoprotéine. Les activités enzymatiques cellulaires sont alors quantifiées par activation de la photoprotéine et mesure de l'intensité de la bioluminescence émise.

Un tel procédé est décrit notamment dans Deo SK, Lewis JC, Daunert S.

Bioluminescence detection of proteolytic bond cleavage by using recombinant aequorin.

Anal Biochem. 2000 May 15 ; 281 (1) : 87-94.

3) Détection des variations de calcium intracellulaire en systèmes cellulaires.

Les photoprotéines de type aequorine exprimées en lignées cellulaires (procaryotiques ou eucaryotiques) permettent de détecter les variations de calcium intracellulaire induites par divers agents. Les variations de calcium intracellulaire sont détectées par les variations correspondantes de la bioluminescence émise. L'application la plus courante utilise des lignées eucaryotes du type HEK 293 co-exprimant l'aequorine et un récepteur de neurotransmetteur (récepteur-canal ou récepteur couplé à une protéine G) pour cribler des agents pharmacologiques ou des ligands naturels agissant sur le récepteur. Inversement, ces systèmes peuvent être utilisés pour cribler des banques d'ADN à la recherche des récepteurs activés par un agent pharmacologique ou un ligand naturel. Le crible est basé sur la variation de bioluminescence induite par l'application de l'agent pharmacologique ou du ligand naturel.

Les principales références bibliographiques décrivant de tels procédés sont les suivantes :
1-Button D, Brownstein M. Aequorin-expressing mammalian cell lines used to report Ca2+ mobilization. Cell Calcium. 1993 Oct ; 14 (9) : 663-71.

2-Ungrin MD, Singh LM, Stocco R, Sas DE, Abramovitz M. An automated aequorin luminescence-based functional calcium assay for G-protein-coupled receptors.

Anal Biochem. 1999 Jul 15 ; 272 (1) : 34-42.

3-Schaeffer MT, Cully D, Chou M, Liu J, Van der Ploeg LH, Fong TM. Use of bioluminescent aequorin for the pharmacological characterization of 5HT receptors. J Recept Signal Transduct Res. 1999 Nov ; 19 (6) : 927-38.

4-George SE, Schaeffer MT, Cully D, Beer MS, McAllister G. A highthroughput glow-type aequorin assay for measuring receptor-mediated changes in intracellular calcium levels. Anal Biochem. 2000 Nov 15 ; 286 (2) : 231-7.

5-Pamot C, Bardin S, Miserey-Lenkei S, Guedin D, Corvol P, Clauser E.

Systematic identification of mutations that constitutively activate the angiotensin II type 1A receptor by screening a randomly mutated cDNA library with an original pharmacological bioassay. Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Jun 20 ; 97 (13) : 7615-20.

6-Kotani M, Mollereau C, Detheux M, Le Poul E, Brezillon S, Vakili J, Mazarguil H, Vassart G, Zajac JM, Parmentier M. Functional characterization of a human receptor for neuropeptide FF and related peptides. Br J Pharmacol.

2001 May l ; 133 (1) : 138-144.

Claims

REVENDICATIONS

1. Photoprotéines mutées dérivées des photoprotéines isolées de méduses, lesdites photoprotéines mutées étant caractérisées par une thermostabilité supérieure à celle des photoprotéines dont elles dérivent, et sont désignées photoprotéines mutées thermostables, et/ou par un temps de luminescence supérieur à celui des photoprotéines dont elles dérivent, et sont désignées photoprotéines mutées persistantes, lesdites photoprotéines mutées étant choisies parmi celles comprenant : * au moins une des trois mutations augmentant leur thermostabilité, choisie parmi les suivantes : - suppression de la lysine (K) contenue dans le motif RHKXiMFXz dans lequel Xi=H ou F, et X2= N ou D, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cette lysine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette lysine par une arginine, - suppression de la glutamine (Q) contenue dans le motif DEMTRQHLGFWY, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cette glutamine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette glutamine par une arginine, - suppression de la leucine (L) contenue dans le motif DEMTRQHLGFWY susmentionné, ou substitution de cette leucine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette leucine par une isoleucine, * et/ou au moins une des six mutations augmentant leur temps de luminescence, choisie parmi les suivantes : - suppression du glutamate (E) contenue dans le motif DXjNX2X3GIXsLX6E dans lequel Xi=V ou I, X2=H, G ou S, X3=N ou D, X4=K ou Q, Xs=S, T ou N, et X6=D ou N, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de ce glutamate par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de ce glutamate par une glycine, - suppression de l'aspartate (D) contenue dans le motif DKDXjX2GX3X4XsLDE dans lequel Xi=Q, G ou R, X2=N ou S, X3=A, S ou T, X4=I ou V, et Xs=T ou S, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cet aspartate par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cet aspartate par une glycine,

- suppression du glutamate (E) contenue dans le motif DKDXiXzGXjXsLDE susmentionné, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de ce glutamate par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de ce glutamate par une glycine, - suppression de la phénylalanine (F) contenue dans le motif EXiTFXzXs dans lequel Xi=E, K ou A, X2=R, K ou A, et X3=V ou H, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cette phénylalanine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette phénylalanine par une sérine, - suppression de l'aspartate (D) contenue dans le motif DX1DX2X3GX4LDVDE, dans lequel X]=I ou L, X2=E, N ou G, X3=S ou D, et X4=Q, K ou D, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cet aspartate par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cet aspartate par une glycine, - suppression de la valine en position 54 de la séquence peptidique SEQ ID NO : 2 de l'aequorine, ou substitution de cette valine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette valine par une alanine.

2. Photoprotéines mutées thermostables selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une des deux mutations suivantes : - suppression de la glutamine contenue dans le motif DEMTRQHLGFWY, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cette glutamine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette glutamine par une arginine, - suppression de la leucine contenue dans le motif DEMTRQHLGFWY susmentionné, ou substitution de cette leucine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette leucine par une isoleucine.

3. Photoprotéines mutées persistantes selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une des mutations suivantes : - suppression de l'aspartate (D) contenue dans le motif DKDXiX2GX3X4X5LDE dans lequel Xi=Q, G ou R, X2=N ou S, X3=A, S ou T, Xt=I ou V, et Xs=T ou S, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cet aspartate par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cet aspartate par une glycine,

- suppression du glutamate (E) contenue dans le motif DKDX]X2GX3X5LDE susmentionné, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de ce glutamate par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de ce glutamate par une glycine, - suppression de l'aspartate (D) contenue dans le motif DXIDX2X3GLDVDE, dans lequel X ; =I ou L, X2=E, N ou G, X3=S ou D, et X4=Q, K ou D, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cet aspartate par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cet aspartate par une glycine.

4. Photoprotéines mutées selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisées en ce qu'elles dérivent de l'aequorine (SEQ ID NO : 2), de la clytine (SEQ ID NO : 18), de la mitrocomine (SEQ ID NO : 34), et de l'obéline (SEQ ID NO : 50).

5. Photoprotéines mutées thermostables selon la revendication 4, choisies parmi : - les protéines dérivées de l'aequorine comprenant les séquences suivantes : SEQ ID NO : 4,6, 8,10, 12,14, 16, - les protéines dérivées de la clytine comprenant les séquences suivantes : SEQ ID NO : 20,22, 24,26, 28, 30, 32, - les protéines de la mitrocomine comprenant les séquences suivantes : SEQ ID NO : 36, 38, 40,42, 44,46, 48, - les protéines dérivées de l'obéline comprenant les séquences suivantes : SEQ ID NO : 52,54, 56,58, 60,62, 64.

6. Photoprotéines mutées persistantes selon la revendication 4, choisies parmi : - les protéines dérivées de l'aequorine comprenant les séquences suivantes : SEQ ID NO : 66,68, 70,72, 74,76, - les protéines dérivées de la clytine comprenant les séquences suivantes : SEQ ID NO : 78, 80,82, 84, et 86, - les protéines de la mitrocomine comprenant les séquences suivantes : SEQ ID NO : 88, 90,92, 94, et 96, - les protéines dérivées de l'obéline comprenant les séquences suivantes : SEQ ID NO : 98, 100,102, 104, et 106.

7. Photoprotéines mutées thermostables et persistantes selon la revendication 4, choisies parmi : - les protéines dérivées de l'aequorine comprenant les séquences suivantes : SEQ ID NO : 4,6, 8,10, 12,14, 16, dans lesquelles E en position 45 est remplacé par G, et/ou V en position 54 est remplacé par A, et/ou D en position 127 est remplacé par G, et/ou E en position 138 est remplacé par G, et/ou F en position 159 est remplacé par S, et/ou D en position 163 est remplacé par G, - les protéines dérivées de la clytine comprenant les séquences suivantes : SEQ ID NO : 20,22, 24,26, 28,30, 32, dans lesquelles E en position 44 est remplacé par G, et/ou D en position 126 est remplacé par G, et/ou E en position 137 est remplacé par G, et/ou F en position 158 est remplacé par S, et/ou D en position 162 est remplacé par G, - les protéines de la mitrocomine comprenant les séquences suivantes : SEQ ID NO : 36,38, 40,42, 44,46, 48, dans lesquelles E en position 43 est remplacé par G, et/ou D en position 125 est remplacé par G, et/ou E en position 136 est remplacé par G, et/ou F en position 157 est remplacé par S, et/ou D en position 161 est remplacé par G, - les protéines dérivées de l'obéline comprenant les séquences suivantes : SEQ ID NO : 52,54, 56,58, 60,62, 64, dans lesquelles E en position 41 est remplacé par G, et/ou D en position 123 est remplacé par G, et/ou E en position 134 est remplacé par G, et/ou F en position 155 est remplacé par S, et/ou D en position 159 est remplacé par G.

8. Photoprotéines mutées selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisées en ce qu'elles sont liées : - à une sonde protéique ou nucléique susceptible de reconnaître des antigènes ou protéines ou acides nucléiques déterminés, - ou à un substrat spécifique d'une activité enzymatique déterminée, - ou à une molécule susceptible de former un complexe avec une autre molécule, tel que le complexe avidine-biotine.

9. Séquences nucléotidiques codant pour les photoprotéines mutées selon l'une des revendications 1 à 8.

10. Séquences nucléotidiques selon la revendication 9, codant pour les photoprotéines mutées selon les revendications 5 à 7, choisies parmi les acides nucléiques comprenant les séquences SEQ ID NO : 3,5, 7,9, 11, 13,15, 19,21, 23,25,

27,29, 31,35, 37,39, 41,43, 45,47, 51,53, 55,57, 59,61, 63,65, 67,69, 71,73, 75, 77,79, 81,83, 85,87, 89,91, 93,95, 97,99, 101,103, 105, ou toute séquence nucléotidique dérivée par dégénérescence du code génétique des séquences susmentionnées et codant pour les photoprotéines mutées selon les revendications 5 à 7.

11. Vecteur, tel qu'un plasmide, contenant une séquence recombinante comprenant une séquence nucléotidique selon la revendication 9 ou 10.

12. Cellules hôtes, telles que cellules procaryotes, notamment E. coli, ou eucaryotes, notamment les lignées HEK 293, ou CHO, transformées par un vecteur selon la revendication 11.

13. Procédé de préparation de photoprotéines mutées selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend l'utilisation d'un vecteur selon la revendication 11 capable de produire lesdites photoprotéines, ou la transformation de cellules hôtes appropriées à l'aide d'un vecteur susmentionné, la mise en culture de cellules hôtes transformées selon la revendication 12 ainsi obtenues dans un milieu approprié, et la récupération, le cas échéant après purification, des photoprotéines mutées produites par ces cellules.

14. Utilisation de photoprotéines mutées selon l'une des revendications 1 à 8, ou de cellules hôtes transformées selon la revendication 12 exprimant lesdites photoprotéines mutées, dans le cadre de la mise en oeuvre : - de procédés de détection in vitro de molécules, tels que des protéines ou antigènes ou des acides nucléiques dans un échantillon biologique, notamment dans le cadre du dépistage in vitro de bactéries telles que les Listeria dans les aliments, ou dans le cadre du dépistage d'agents pathogènes tels que le virus VIH chez l'homme, - de procédés de détection de composés à activité enzymatique dans un échantillon biologique, notamment dans le cadre du criblage de molécules activant ou inhibant une activité enzymatique spécifique, - de procédés de détection des variations de calcium intracellulaire induites par divers agents, notamment dans le cadre du criblage de molécules agissant sur une séquence nucléique ou protéique fusionnée à la photoprotéine mutée, ou coexprimée avec la photoprotéine mutée dans des cellules hôtes susmentionnées.

15. Procédés de détection in vitro de protéines ou antigènes ou d'acides nucléiques dans un échantillon biologique, tels que définis dans la revendication 14, caractérisés en ce qu'ils comprennent principalement les étapes suivantes : - le cas échéant, une étape d'amplification du nombre d'acides nucléiques présents dans l'échantillon biologique, - immobilisation des protéines ou antigènes ou acides nucléiques sur un support approprié, puis addition d'une sonde spécifique desdits protéines ou antigènes ou acides nucléiques et rinçage, ladite sonde étant liée à une photoprotéine selon la revendication 8, ou ladite photoprotéine étant additionnée sur le support avec les réactifs appropriés pour sa liaison à ladite sonde, - mesure de l'intensité de la bioluminescence émise après l'étape de rinçage.

16. Procédés de détection in vitro de composés à activité enzymatique dans un échantillon biologique tels que définis dans la revendication 14, caractérisés en ce qu'ils comprennent principalement les étapes suivantes : - immobilisation sur un support approprié d'un substrat protéique spécifique de l'activité enzymatique à détecter, ce substrat étant lié à une photoprotéine selon la revendication 8, addition de l'échantillon biologique, puis rinçage, - ou immobilisation sur un support approprié des composés de l'échantillon biologique, addition du substrat protéique lié à une photoprotéine selon la revendication 8, puis rinçage, - mesure de l'intensité de la bioluminescence émise après l'étape de rinçage.

17. Procédés de détection in vitro des variations de calcium intracellulaire induites par divers agents tels que définis dans la revendication 14, caractérisés en ce qu'il comprend la mise en culture de cellules transformées selon la revendication 12, avec l'échantillon contenant les molécules à détecter, et la mesure de la variation de bioluminescence.

18. Procédés selon l'une des revendications 15 à 17, caractérisés en ce qu'ils peuvent être effectués jusqu'à des températures d'environ 50 C, à l'aide de photoprotéines thermostables, et, le cas échéant, persistantes, selon l'une des revendications 1 à 8.

19. Procédés selon l'une des revendications 15 à 18, caractérisés en ce qu'ils peuvent être effectués en simultanés sur échantillons multiples, à l'aide de photoprotéines persistantes, et, le cas échéant, thermostables, selon l'une des revendications 1 à 8.

20. Kits pour la mise en oeuvre de procédés selon l'une des revendications 15 à 19, caractérisés en ce qu'ils comprennent des photoprotéines mutées selon l'une des revendications 1 à 8, le cas échéant en association avec des réactifs nécessaires à la mise en oeuvre desdits procédés.

21. Kits selon la revendication 20, caractérisés en ce qu'ils peuvent être conservés en solutions prêtes à l'emploi, notamment pendant au moins 4 jours à des températures ambiantes d'environ 20 C et pouvant atteindre jusqu'à environ 37 C, lorsqu'ils contiennent des photoprotéines thermostables, et, le cas échéant, persistantes, selon l'une des revendications 1 à 8.