FR2814642A1 - Souris transgenique pour la recombinaison ciblee mediee par la cre-er modifiee - Google Patents

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Abstract

La présente invention concerne un organisme métazoaire, à l'exception de l'homme, et notamment une souris, caractérisé en ce qu'au moins une cellule de cet organisme comprend au moins une protéine de fusion entre une recombinase Cre et un récepteur nucléaire aux oestrogènes modifié lui permettant de répondre aux anti-oestrogènes synthétiques mais non aux oestrogènes naturels, et une ou des séquence (s) d'ADN d'intérêt appartenant au génome dudit organisme dans laquelle (lesquelles) est (sont) inséré (s) un ou plusieurs site (s) de reconnaissance de ladite protéine recombinase. L'invention couvre également les procédés mettant en oeuvre ledit organisme pour le criblage de médicaments, pour la mutagenèse et l'analyse de la fonction biologique de la ou des séquence (s) d'ADN d'intérêt, notamment de gène (s) d'intérêt, tel que RXRalpha .

Description

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La présente invention concerne un organisme métazoaire, à l' exception de l' homme, et notamment une souris, caractérisé en ce qu'au moins une cellule de cet organisme comprend au moins une protéine de fusion entre une recombinase Cre et un récepteur nucléaire aux #strogènes modifié lui permettant de répondre aux anti- #strogènes synthétiques mais non aux #strogènes naturels, et une ou des séquence(s) d'ADN d'intérêt appartenant au génome dudit organisme dans laquelle (lesquelles) est (sont) inséré(s) un ou plusieurs site(s) de reconnaissance de ladite protéine recombinase. L'invention couvre également les procédés mettant en #uvre ledit organisme pour la mutagenèse et l'analyse de la fonction biologique de la ou des séquence(s) d'ADN d'intérêt, notamment de gène(s) d'intérêt, tel RXR[alpha].
L'aptitude à modifier le génome d'animaux, plus particulièrement de la souris par intégration de transgènes de manière aléatoire, ou à des endroits présélectionnés par recombinaison homologue, dans les cellules souches embryonnaires (cellules ES) a permis d'améliorer grandement notre compréhension de la fonction biologique des gènes de mammifères dans des conditions normales et/ou pathologiques (Jaenisch, 1988 ; Capecchi, 1989). Néanmoins, ces techniques se sont avérées peu informatives dans un grand nombre de cas, notamment parce que les mutations héréditaires ainsi générées étaient létales durant le développement et/ou parce que leurs effets étaient pléiotropiques.
Pour pallier ces défauts, des stratégies de mutagenèse somatique conditionnelle ont été développées, particulièrement chez la souris ; elles
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permettent d'induire sélectivement des mutations dans un type cellulaire donné (contrôle spatial) ou à un temps donné (contrôle temporel) au cours de la vie de l' animal .
Une première stratégie a consisté à combiner la recombinaison homologue ciblée avec les systèmes de recombinaison site-spécifiques basés sur l'utilisation de recombinases qui catalysent la réaction de recombinaison entre deux courtes séquences d'ADN de reconnaissance. Il fut montré que ces systèmes de recombinaison site-spécifiques, bien que d'origine microbienne pour la plupart, pouvaient fonctionner chez les eucaryotes supérieurs, tels que des plantes, des insectes et la souris (Sauer, 1994 ; Rajewsky et al., 1996 ; Sauer, 1998). Parmi les systèmes de recombinaison site-spécifiques utilisés communément, il convient de citer les systèmes Cre/Lox (Sauer, 1998) et FLP/FRT (Kilby et al., 1993). La stratégie habituellement employée consiste à insérer des sites loxP (ou FRT) dans les chromosomes de cellules ES par recombinaison homologue, ou par transgenèse classique, et puis à délivrer la Cre (ou FLP) pour que cette dernière catalyse la réaction de recombinaison. La recombinaison entre les deux sites loxP (ou FRT) peut être réalisée dans les cellules ES (Gu et al., 1993) ou dans des #ufs fertilisés (Araki et al., 1995) par expression transitoire de la Cre ou en utilisant une souris transgénique Cre (Lakso et al., 1992 ; Orban et al., 1992). Une telle stratégie de mutagenèse somatique permet un contrôle spatial de la recombinaison, car l'expression de la recombinase est contrôlée par un promoteur spécifique d'un tissu donné ou d'une cellule
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donnée. Cependant cette stratégie présente également des limitations car certaines altérations somatiques peuvent conduire à un phénotype létal à un stade précoce du développement, empêchant ainsi toute étude biologique ou physiologique ultérieure. Egalement, une expression non suffisamment spécifique de la recombinase peut conduire à des événements de recombinaison dans un type cellulaire non désiré (Betz et al., 1996) qui, s'ils surviennent précocement au cours de l'embryogenèse, peuvent entraîner la recombinaison de l'ADN dans la plupart des tissus adultes, et de ce fait compliquer l'analyse du phénotype mutant.
Une seconde stratégie a consisté à contrôler l'expression des recombinases dans le temps, afin de permettre un contrôle temporel de la recombinaison somatique. Pour ce faire, l'expression des recombinases est contrôlée par des promoteurs inductibles (Kühn et al., 1995 ; Saint-Onge et al., 1996), tels que le promoteur inductible à l'interféron, par exemple. Ce système présente également des limitations, car il ne permet pas d'obtenir un contrôle spatial de la recombinaison.
Le couplage du système d'expression inductible à la tétracycline développé par H. Bujard (Gossen et al., 1992 ; WO 94 04672 ; 804 546) avec le système de recombinase site-spécifique a permis de développer un système de modification somatique du génome contrôlée de manière spatio-temporelle. Un tel système est basé sur l'activation ou la répression par la tétracycline du promoteur commandant l'expression du gène de la recombinase. Une telle méthode, bien qu'elle permette
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d'obtenir un contrôle spatio-temporel de la recombinaison somatique, présente l'inconvénient d'être lourde à mettre en #uvre, car nécessitant la création d'un animal doublement transgénique.
Une nouvelle stratégie a pu être envisagée suite au développement de recombinases chimériques activées de manière sélective par le ligand naturel du récepteur des #strogènes. En effet, l'observation que de nombreuses protéines, dont au moins deux enzymes (les tyrosine-kinases c-abl et src), voient leur activité contrôlée par des #strogènes, lorsque celui-ci est lié au domaine de liaison au ligand (LBD, pour ligandbinding domain ) du récepteur des #strogènes a(ERa) (Jackson et al., 1993 ; Picard et al., 1994), a permis de développer des stratégies de recombinaison sitespécifique contrôlée de manière spatio-temporelle (Logie et al., 1995 ; Metzger et al., 1995). Toutefois pour utiliser de telles recombinases chimériques afin de réaliser avec succès la mutagenèse somatique conditionnelle chez des Vertébrés (notamment la souris) qui produisent des #strogènes, il était nécessaire de créer des recombinases qui ne soient pas activées par les #strogènes présents chez l'animal, sans quoi le contrôle temporel de la recombinaison des gènes cibles ne pourrait être obtenu. Ainsi, des mutations ont été introduites dans le LBD de ERa, et il a été montré, dans des cellules en culture, que la recombinase chimérique Cre-ER ne répond plus aux #strogènes naturels, bien qu'étant activée efficacement par des anti#strogènes tels que le 4-hydroxytamoxifène (OHT) (Feil et al., 1996).
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La faisabilité de la recombinaison somatique sitespécifique activée par un ligand anti-#strogènique a ainsi été démontrée pour des séquences d'ADN Reporter , chez la souris, et notamment dans différentes lignées de souris transgéniques qui expriment la protéine de fusion Cre-ERT activée par le Tamoxifène (Tarn) (Feil et al., 1996 ; Brocard et al., 1997 ; Indra et al., 1999). La faisabilité de la recombinaison site-spécifique activée par un ligand pour un gène présent dans son environnement chromatinien naturel a été démontrée chez la souris par Schwenk et al. (1998). Schwenk et al. ont ainsi réalisé la délétion inductible par injection de Tamoxifène d'un gène polo dans les cellules B, en utilisant une souris exprimant spécifiquement dans les lymphocytes B, une protéine de fusion entre la recombinase Cre et le domaine de liaison au ligand du récepteur nucléaire aux #strogènes humain muté. Cependant, la technologie développée par Schwenk et al. ne permet pas d'obtenir une efficacité satisfaisante de recombinaison sitespécifique contrôlée de manière spatio-temporelle dans les cellules exprimant la protéine de fusion, car l'efficacité varie entre quelques pourcents et 80%, malgré l'utilisation de fortes doses d'OHT (cinq injections de 8mg). Par ailleurs, les résultats présentés par Schwenk et al. montrent qu'en l'absence de ligand synthétique, l'activité de la protéine de fusion utilisée peut être induite par des ligands naturels générant un "bruit de fond" résiduel non négligeable pouvant être mis en évidence par PCR.
Jusqu'à présent, la possibilité de réaliser la recombinaison somatique site-spécifique, activée par un
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ligand, de séquence(s) d'ADN chromosomique, dans leur environnement chromatinien naturel, n'a donc jamais pu être mise en #uvre de façon satisfaisante chez l'animal, notamment la souris, c'est-à-dire avec une très grande efficacité en présence de ligand synthétique et avec un "bruit de fond" négligeable, voire nul en son absence.
Comme le souligne Schwenk et al. dans la discussion de leur article, il existe un réel besoin de développer des animaux transgéniques dans les cellules desquels la recombinaison site-spécifique pourrait être induite de manière spatio-temporelle avec une efficacité voisine de 100% en présence de ligand synthétique, et qui ne surviendrait dans aucune cellule en absence de ligand synthétique et/ou en présence de ligand naturel.
Par ailleurs, il existe également un besoin de développer des recombinases chimériques de sensibilité accrue au ligand synthétique, afin d'éviter d'injecter aux animaux des doses massives de ligand synthétique susceptibles de provoquer chez ces animaux non seulement des souffrances injustifiées, mais aussi d'affecter le métabolisme général de l'animal, ce qui fausserait les études physiologiques et comportementales ultérieures.
De manière inattendue, les inventeurs ont résolu les problèmes précédemment évoqués, jusqu'alors non solutionnés, en combinant la sélection de nouvelles mutations dans le domaine de liaison au ligand du récepteur nucléaire des #strogènes humains, la sélection d'une région charnière adéquate entre les deux domaines de la recombinase chimérique, et la
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sélection de promoteurs adéquats pour diriger l'expression de la recombinase chimérique dans un tissu donné.
La présente invention porte donc sur un organisme métazoaire, à l'exception de l'homme, caractérisé en ce qu'au moins une cellule dudit organisme comprend au moins: (i) une protéine de fusion comprenant séquentiellement: - une protéine recombinase; - une région charnière d'au moins 15 acides aminés ; - un polypeptide comprenant le domaine de liaison du ligand du récepteur nucléaire des #strogènes humains, ou du récepteur nucléaire des #strogènes des vertébrés, et leurs variants naturels ou l'un de leurs fragments ; ledit polypeptide présentant au moins une mutation par rapport à la forme sauvage desdits domaines de liaison du ligand, ou de leurs variants naturels, ou de leurs fragments, et ladite protéine de fusion ayant une activité recombinase négligeable, voire nulle, en présence de ligand naturel, tel par exemple l'oestradiol, et une activité recombinase induite par de faible quantité de ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique, tel par exemple le Tarn et l'OHT ; (ii) une ou des séquence(s) d'ADN génique ou inter- génique d'intérêt appartenant naturellement au génome dudit organisme dans laquelle (lesquelles) est(sont) inséré(s) un ou plusieurs site(s) de reconnaissance de ladite protéine recombinase, la
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ou lesdites séquence(s) d'ADN d'intérêt étant localisée(s) dans l'un ou plusieurs des chromosomes du génome de ladite cellule.
Par organisme métazoaire , on entend désigner tout organisme animal, à l'exception de l'homme, constitué par plusieurs cellules. Selon un mode préféré de réalisation, il s'agit d'un vertébré, tel par exemple un mammifère, un oiseau, un poisson. De manière préférée, il s'agit d'un mammifère, tel par exemple un bovin, un porcin, un caprin, un ovin, un équidé, un rongeur. Selon un mode encore plus préféré, il s'agit d'un rongeur, tel la souris ou le rat.
Par protéine recombinase , on entend désigner les recombinases de la famille des intégrases qui catalysent l'excision, l'insertion, l'inversion ou la translocation de fragments d'ADN au niveau de sites spécifiques de reconnaissance desdites recombinases (Sternberg et al., 1986 ; Sauer, et al., 1990 ; Barbonis et al., 1993 ; Kilby et al., 1993 ; Sauer, 1994 ; et al., 1995). Ces recombinases sont actives dans les cellules animales (Sauer, 1994).
La protéine recombinase de l'invention est sélectionnée de préférence dans le groupe des recombinases sites-spécifiques composé de la recombinase Cre du bactériophage Pl, la recombinase FLP de Saccharomyces cerevisiae, la recombinase R de pSR1 de Zygosaccharomyces rouxii, la recombinase A de pKDl de Kluyveromyces drosophilarium, la recombinase A de pKWl de Kluyveromyces waltii, l'intégrase # Int, la recombinase du système de recombinaison GIN du phage Mu, de la recombinase bactérienne (3 (Diaz et al., 1999) ou une variante de celles-ci.
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La recombinase Cre ( cyclization recombination ) qui est une intégrase de 38 KDa du bactériophage P1 catalyse, en l'absence de cofacteurs, la recombinaison entre deux séquences d'ADN de 34 paires de bases appelées site loxP (Sauer et al., 1990). La position sur une ou plusieurs molécules d'ADN, et l'orientation de sites loxP l'un par rapport à l'autre, déterminent le type de fonction de la recombinase Cre : excision, insertion, inversion ou translocation. Ainsi l'activité recombinase de Cre est une inversion, lorsque deux sites loxP sont tête-bêche sur un même fragment d'ADN et une excision, lorsque les sites loxP sont en répétition directe sur un même fragment d'ADN. L'activité de la recombinase est une insertion lorsqu'un site loxP est présent sur un fragment d'ADN, une molécule d'ADN telle qu'un plasmide contenant un site loxP pouvant être insérée au niveau dudit site loxP. La recombinase Cre peut également induire une translocation entre deux chromosomes à condition qu'un site loxP soit présent sur chacun d'eux (Babinet, 1995). De manière plus générale, la recombinase Cre est donc capable de catalyser la recombinaison entre une ou plusieurs molécules d'ADN différentes, à condition qu'elles soient porteuses de sites loxP.
La recombinase FLP du système FLP/FRT est une recombinase de 43 KDa de Saccharomyces cerevisiae capable du même type d'action que la recombinase Cre sur des fragments d'ADN encadrés par des sites de reconnaissance FRT (Kilby et al., 1993).
De manière préférée, la recombinase selon l'invention est la recombinase Cre du bactériophage Pl et ses variants naturels ou synthétiques, et lesdits
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sites de reconnaissance spécifiques de ladite recombinase Cre sont choisis de préférence dans le groupe composé des séquences Lox P, Lox 66, Lox 71, Lox 511, Lox 512, Lox 514.
Par variant de la protéine recombinase , on entend désigner l'ensemble des recombinases sauvages ou leurs fragments pouvant exister naturellement et qui correspond notamment à des troncatures, substitutions, délétions et/ou additions de résidus d'acides aminés.
Ces recombinases et leurs fragments sont de préférence issus du polymorphisme génétique de la population. Par fragment de recombinase , on entend désigner toute partie de recombinase présentant au moins une activité recombinase. Par variant de la protéine recombinase on entend également désigner les variants synthétiques pour lesquels les modifications précédentes ne sont pas présentes naturellement, mais ont été introduites artificiellement, par ingénierie génétique par exemple.
Ainsi, les recombinases issues de fusion chimérique constituent-elles des variants synthétiques selon l'invention. De telles recombinases ont été décrites par exemple dans Shaikh et Sadowski (2000).
Ladite région charnière selon l'invention comprend la région charnière D du récepteur nucléaire des #strogènes, de préférence du récepteur nucléaire humain a des #strogènes, ou l'un de ses fragments.
La région charnière D (région 263 à 301 de la séquence SEQ ID N 2) est une région située entre la région C du ER qui contient le domaine de liaison à l'ADN (région 180-262 de la séquence SEQ ID N 2) et le domaine de liaison du ligand (région 302 à 552 de la séquence SEQ ID N 2).
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De préférence cette région charnière comporte séquentiellement au moins (i) deux acides aminés correspond à l'introduction de site de restriction, de linker , ou d'adaptateur, nécessaires au clonage du gène de fusion, et (ii) un fragment de la région charnière D du récepteur nucléaire humain a des #strogènes, correspondant aux acides aminés 282 à 301 de la séquence SEQ ID N 2. De manière préférée, ledit site de restriction est un site XhoI et les deux acides aminés correspondants sont la leucine et la glutamine.
La région charnière selon l'invention a une taille d'au moins 15,17, 19,21, 23,25, 27,29, 31,33, 35, 40,45, 50,55, 60,65, 70,100, 150,200, 250,292 acides aminés. Selon un mode préféré de réalisation, ladite région charnière comporte au moins 15 acides aminés et au plus 54 acides aminés. De manière encore plus préférée, la région charnière comporte 23 acides aminés. La largeur de la région charnière influence la régulation par le ligand de l'activité recombinase.
La région charnière selon l'invention peut être constituée par un peptide fonctionnellement équivalent à ladite région charnière D.
Les récepteurs des #strogènes (ER) sont des protéines régulatrices de transcription de gènes qui médient l'action des #strogènes dans les cellules cibles. Les ER appartiennent à la superfamille des récepteurs nucléaires qui présentent une structure modulaire commune : une région A/B N-terminale variable contenant l'activité de transactivation constitutive AF-1, (ii) un domaine central C de liaison à l'ADN (DBD pour DNA-Binding Domain ) hautement conservé entre les différentes espèces et permettant la
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liaison du récepteur à son élément de réponse ADN spécifique, (iii) et un domaine de liaison du ligand (LBD) , localisé dans la région C-terminale du ER (pour les articles de synthèse et références voir Evans, 1988 ; Beato et al., 1989 ; Gronemeyer, 1991 ; and Chambon, 1998 ; 1993 ; Simons,1994).
Les récepteurs nucléaires des #strogènes selon l'invention sont choisis parmi les récepteurs nucléaires des #strogènes humains, et parmi les récepteurs nucléaires des #strogènes des vertébrés tels par exemple les différentes espèces de primates, les bovins, les porcins, les ovins, les caprins, les félins, les canidés, les équidés, les oiseaux, les poissons, les rongeurs, notamment le rat et la souris.
Selon un mode préféré de réalisation, l'organisme d'origine du récepteur des #strogènes selon l'invention est caractérisé en ce que ledit domaine de liaison du ligand (LBD) de récepteur nucléaire des #strogènes, ou ses variants naturels, ou l'un de leurs fragments, est humain et est choisi parmi les LBD des récepteurs nucléaires des #strogènes humains a et (3 (ERa et ERss).
Selon un mode encore préféré, il s'agit du LBD du récepteur nucléaire des #strogènes humains a correspondant aux acides aminés 302 à 552, ou ses variants naturels, ou l'un de leurs fragments.
Par variant naturel , on entend désigner l'ensemble des LBD des récepteurs nucléaires des #strogènes ou leurs fragments pouvant exister naturellement, en particulier chez l'être humain, et correspondant notamment à des troncatures, substitutions, délétions et/ou additions de résidus d'acides aminés. Ces variants naturels, sont issus en
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général du polymorphisme génétique de la population, et ont une activité qui n'est pas substantiellement modifiée par rapport au récepteur sauvage.
Il est également compris dans la portée de l'invention, les polypeptides homologues aux LBD des récepteurs nucléaires des #strogènes sauvages, ou à leurs variants, ou à l'un de leurs fragments, et qui présentent certaines modifications en particulier une délétion, addition, substitution d'au moins un acide aminé, une troncature, un allongement et/ou une fusion chimérique.
Par fragment de récepteur nucléaire , on entend désigner toute partie des LBD récepteurs nucléaires des #strogènes présentant au moins l'activité LBD.
Ladite protéine de fusion selon l'invention est donc de préférence Cre-ER et comprend la protéine recombinase Cre, à laquelle est fusionnée une partie de la région charnière D et le LBD (acides aminés 282 à 595 de la séquence SEQ ID N 2) du récepteur nucléaire des #strogènes humain a muté (SEQ ID N 2). La protéine de fusion selon l'invention comprend au moins la partie du récepteur nucléaire aux #strogènes ayant une activité de liaison du ligand.
Ledit LBD du récepteur nucléaire, ou l'un de ses fragments présente au moins une mutation. Cette mutation est de préférence choisie dans le groupe : - mutation (G521R) glycine vers arginine en position 521 de la séquence SEQ ID N 2 ou d'un variant naturel de cette séquence; - mutation (G400V) glycine vers valine en position 400 de la séquence SEQ ID N 2 ou d'un variant naturel de cette séquence;
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mutation (méthionine-leucine) vers (alaninealanine) située en position 543-544 (mutation M543A/L544A) de la séquence SEQ ID N 2 ou d'un variant naturel de cette séquence.
Par mutation , on entend désigner n'importe quels changements intervenus dans la séquence du récepteur nucléaire des #strogènes, et notamment du récepteur nucléaire humain a des #strogènes, autres que ceux présents dans ses variants naturels, et/ou dans ses homologues humains ou vertébrés, et qui modifient de façon substantielle l'activité .de la protéine recombinase fusionnée audit récepteur ou audit domaine de liaison du ligand, en réponse à la liaison d'un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique.
Parmi les mutations susceptibles d'être introduites dans le LBD du récepteur nucléaire des #strogènes, il convient de citer, les mutations ponctuelles, les délétions, les insertions, les substitutions. Toutefois, il convient de sélectionner uniquement les mutations introduites dans le LBD des récepteurs nucléaires aux #strogènes qui permettent une induction de l'activité de la recombinase Cre fusionnée audit récepteur par un ligand synthétique à faible concentration, tout en évitant au mieux que les ligands naturels de ce récepteur présents naturellement dans l'organisme métazoaire n'induisent une activité basale.
De même, il conviendra de sélectionner les mutations qui ne confèrent pas d'activité à la recombinase Cre fusionnée audit récepteur en absence de ligand.
La mutation G521R constitue une mutation LBD du ER selon l'invention. Cette mutation est similaire à la mutation G525R introduite dans le LBD du ER de la
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souris (mER) qui réduit l'affinité pour le ligand naturel, l'oestradiol, d'environ 1000 fois, sans altérer la liaison du ligand synthétique, le 4hydroxyTamoxifène (OHT) (Danielan et al., 1993). Ainsi, les inventeurs ont montré que l'activité recombinase de la protéine de fusion Cre-ERT (T = pour inductible au Tamoxifène) qui porte la mutation G521R et l'acide aminé glycine en position 400, appelée Cre-ER (GR) dansl'article de Feil et al., 1997, est dépendante de l'addition d'OHT ou de Tarn dans le milieu de culture de cellules transfectées. Par contre, -aucune activité recombinase n'est observée en présence d'OHT lorsque la protéine de fusion porte la mutation G521R et la mutation G400V (mutant appelé Cre-ER(VR) dans Feil et al., (1997) ).
Les inventeurs ont également créé la protéine de fusion, correspondant au triple mutant G400V/M543A/L544A appelé Cre-ERT2 (Feil et al., 1997).
Cette protéine de fusion présente une activité recombinase dans des cellules en culture induite par l'anti-#strogène Tarn ou OHT, mais pas par le ligand naturel #stradiol; par ailleurs , l'activité maximale de Cre-ERT2 est induite pour des doses de Tarn ou OHT inférieures à celles nécessaires pour activer Cre-ERT.
Cette sensibilité accrue au Tarn ou OHT de Cre-ERT2 par rapport à Cre-ER a été vérifiée chez des souris transgéniques exprimant les recombinases chimériques sélectivement dans la couche basale de l'épiderme, sous le contrôle du promoteur de la cytokératine 5 (Indra et al., 1999). Les inventeurs ont observé que la translocation de Cre-ER T2 du cytoplasme dans le noyau,
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ainsi que l'excision de séquences d'ADN encadrées de sites loxP d'un gène rapporter sont induites à des doses environ dix fois inférieures à celles nécessaires pour Cre-ERT.
Dans le but d'augmenter encore la sensibilité de la recombinase chimérique Cre-ER T2 au tamoxifène, les inventeurs ont remplacé dans Cre-ERT2 la valine en position 400 par une glycine. Cette nouvelle protéine de fusion qui correspond au double mutant M543A/L544A appelé Cre-ERT3 présente une sensibilité accrue au ligand synthétique anti-oestrogénique tel que le Tam et l'OHT, sans que l'activité recombinase de cette protéine soit induite par le ligand naturel oestradiol.
Les inventeurs ont ainsi montré que pour des doses de Tam injectées 10 fois inférieures, l'activité recombinase dans les cellules d'une souris transgénique Cre-ERT3 est supérieure à celle d'une souris Cre-ERT2 (voir exemple 5).
Selon un mode préféré de réalisation, la protéine de fusion selon l'invention est Cre-ERT2 dont le LBD du ER présente la mutation G400V/M543A/L544A. Selon un autre mode préféré de réalisation, la protéine de fusion est Cre-ERT3, dont le LBD du ER présente la mutation M543A/L544A.
C'est donc un des objets de la présente invention de fournir une protéine de fusion Cre-ER, qui présente des mutations, dans le LBD du ERa humain de préférence choisies parmi les mutations G521R, G400V, M543A, et L544A, dont l'activité recombinase n'est pas induite par les ligands naturels, et est fortement induite par de faible quantité de ligand synthétique anti-
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oestrogénique. De préférence, cette protéine de fusion est Cre-ERT, Cre-ERT2, Cre-ERT3. La présente invention concerne également ledit gène de fusion codant pour ladite protéine, ledit vecteur d'expression de ladite protéine, ainsi que la cellule hôte correspondant, et l'animal transgénique correspondant, qui exprime ladite protéine de fusion dans un type cellulaire particulier, de préférence, l'épiderme, le foie ou le tissu adipeux.
La protéine de fusion Cre-ER de la présente invention comprend donc tout ou partie d'un récepteur nucléaire des #strogènes et une protéine recombinase dont l'activité est inductible beaucoup plus fortement par liaison dudit récepteur ou dudit domaine de liaison du ligand (LBD) dudit récepteur avec un dit anti- #strogène qu'avec un ligand naturel. Ladite protéine de fusion Cre-ER permet de réaliser une recombinaison entre des sites loxP, dans une cellule de l'organisme de l'invention, suite à un traitement par un anti- #strogène. En l'absence de traitement, ou en présence de concentrations de ligands tels les #strogènes naturels allant jusqu' à 10-6 M, aucune excision n'est observée. Ce système permet donc de libérer l'activité recombinase de la protéine chimérique à un moment donné et choisi. Ladite protéine de fusion Cre-ER peut être exprimée dans des cellules contenant des sites loxP, sans modifier le locus contenant les sites loxP. La recombinaison au niveau des sites loxP a lieu uniquement après traitement avec un anti-#strogène tel que le Tam ou l'OHT. De plus en exprimant ladite protéine de fusion Cre-ER dans un organisme selon l'invention, de préférence un animal, sous le contrôle d'un promoteur à spécificité cellulaire, on peut
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obtenir une recombinaison entre des sites loxP, spécifiquement dans ces cellules.
Par ligand synthétique , on entend désigner tout type de composé susceptible de se lier au récepteur nucléaire des #strogènes, et présenter des activités agonistes et/ou antagonistes, en fonction de l'espèce, du tissu ou du type cellulaire. De préférence, et sans caractère limitatif, le ligand synthétique selon l'invention est doté d'activité anti- #strogénique, de préférence il s'agit de l'agent thérapeutique anti#strogénique Tamoxifène (Tarn), mais également de son métabolite le 4-hydroxyTamoxifène (OHT). Les anti#strogènes ICI 164 384 et ICI 182 780 sont également des ligands synthétiques selon l'invention.
La présente invention fournit donc un organisme métazoaire transgénique et plus particulièrement un animal transgénique, et notamment une souris transgénique : (i) dont au moins une cellule contient une ou plusieurs séquences d'ADN chromosomiques qui sont présentes dans leur contexte chromatinien naturel et sont encadrées de sites loxP (floxées) ; (ii) qui exprime de préférence une recombinase Cre chimérique de manière tissu-spécifique dans un ou plusieurs type(s) cellulaire(s) de l'organisme (iii) dont l'activité de la recombinase Cre chimérique est négligeable, voire nulle en présence d'#strogène; (iv) dont l'activité de la recombinase chimérique est activée par des concentrations faibles d'un anti-#strogène (de 0,001 à 1 mg de Tamoxifène/souris/jour, pendant cinq jours); (v) et enfin dont la recombinase Cre est capable de catalyser avec une efficacité voisine de 100% la
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recombinaison somatique ciblée site-spécifique dans le noyau, dans un environnement chromatinien naturel de la ou des séquence(s) d'ADN floxée (s).
Les doses de ligand synthétique injectées dans l'organisme métazoaire selon l'invention sont faibles. Par faible, on entend désigner des quantités inférieures ou égales à 4 mg/souris adulte/jour, de préférence inférieures ou égales à 2 mg/souris adulte/jour, de manière préférée inférieure ou égale à 1 mg/souris adulte/jour. Selon un mode encore plus préféré, cette quantité peut être inférieure ou égale à 0, 5 mg, 0, 25 mg, 0,10 mg, 0, 075 mg, 0, 05 mg, 0, 025 mg, 0,001 mg par souris adulte et par jour.
Il est bien entendu, qu'un homme du métier sera à même d'adapter ces quantités, en fonction de l'organisme, de son poids et de son âge.
L'efficacité de la recombinaison somatique ciblée est estimée par les techniques connues de l'homme du métier. Cette efficacité est estimée par la fréquence des événements de recombinaison catalysée par ladite recombinase. Ces événements peuvent être mis en évidence par PCR ou par Southern Blotting; la fréquence de recombinaison étant estimée en faisant le rapport de la représentation des différentes allèles dans les cellules d'un tissu. Les fréquences des différentes allèles peuvent être estimées en effectuant le dosage de l'intensité des bandes correspondantes sur un gel électrophorèse de produit d'amplification PCR ou d'ADN génomique (Southern Blotting).
L'utilisation de la PCR rend cette méthode d'estimation extrêmement sensible et permet de détecter
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la présence de cellules de l'organisme dont le génome n'a pas subi de recombinaison site-spécifique ciblée.
Une autre manière d'estimer l'efficacité de la recombinaison peut être réalisée indirectement par immunohistochimie, en analysant l'expression de la séquence génique à inactiver par exemple.
Selon un mode préféré de réalisation, ladite protéine de fusion est codée par un gène de fusion intégré dans un ou plusieurs des chromosomes de ladite cellule dudit organisme. Selon un autre mode de réalisation, la protéine de fusion est codée par un gène de fusion intégré dans un vecteur d'expression. Le gène de fusion selon l'invention est introduit dans la cellule sous la forme d'un vecteur d'expression ou d'un de ses fragments. Par vecteur, on entendra désigner une séquence nucléotidique capable de s'auto-répliquer et susceptible d'être amplifiée de manière extrachromosomique. Le vecteur peut être en particulier un ADN plasmidique bactérien, un cosmide, de l'ADN de phage, de l'ADN viral, ou un mini-chromosome (BAC, YAC,...). Un tel vecteur peut être intégratif, c'est-àdire s'intégrer dans le génome de la cellule hôte ou exister à l'état de réplicon extra-chromosomique.
Lorsqu'il existe sous la forme d'un réplicon extrachromosomique, le vecteur d'expression est capable de se répliquer de manière autonome. Lorsqu'il s'agit d'un fragment d'un vecteur d'expression, de préférence ce fragment s'intègre dans le génome cellulaire. Le vecteur d'expression ou un de ses fragments comporte au moins le gène de fusion et un promoteur ou éléments d'expression permettant de diriger et de contrôler
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l'expression de ladite protéine de fusion dans au moins une cellule du dit organisme.
Le vecteur d'expression comporte en outre des signaux d'initiation et de terminaison de la transcription, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé.
Par éléments contrôlant l'expression, on entend désigner toutes les séquences d'ADN impliquées dans la régulation de l'expression génique, c'est-à-dire la séquence promotrice minimale, les séquences amonts, les séquences activatrices ( enhancers ), éventuellement les séquences inhibitrices ( silencers ), les séquences insulator .
De préférence, le gène de fusion est placé sous le contrôle d'éléments d'expression tissus-spécifiques ou cellules-spécifiques ou ubiquitaires.
Les éléments d'expression tissus-spécifiques ou promoteurs tissus-spécifiques sont choisis parmi les promoteurs qui permettent d'obtenir une expression spécifique, et de préférence forte, dans une ou plusieurs cellule(s), tissu(s), type(s) cellulaire(s), ou organe(s) de l'organisme selon l'invention. Ces promoteurs peuvent être ou non hétérologues à l'organisme et être naturellement présents ou non dans le génome de l'organisme. A titre d'exemple non limitatif de promoteurs tissus-spécifiques, on peut citer les promoteurs des gènes : - de la cytokératine, et plus particulièrement de la cytokératine 5 (K5) et de la cytokératine 14 (K14),
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qui dirige l'expression du gène dans les kératinocytes de l'épiderme; - de l'a-1-antitrypsine qui dirige l'expression du gène dans les hépatocytes ; - de la protéine adipose 2 (aP2) qui dirige l'expression du gène dans les adipocytes.
Selon un mode préféré de réalisation, ledit organisme est caractérisé en ce que ledit promoteur est le promoteur de la cytokératine 5 (K5) et ledit gène de fusion Cre-ERT.
Selon un second mode préféré de réalisation, ledit organisme est caractérisé en ce que ledit promoteur est le promoteur de la cytokératine 5 (K5) et ledit gène de fusion Cre-ERT2.
Selon un troisième mode préféré de réalisation, ledit organisme est caractérisé en ce que ledit promoteur est le promoteur de la cytokératine 5 (K5) et ledit gène de fusion Cre-ERT3.
Selon un quatrième mode préféré de réalisation, ledit organisme est caractérisé en ce que ledit promoteur est le promoteur de la cytokératine 14 (K14) et ledit gène de fusion Cre-ERT.
Selon un cinquième mode préféré de réalisation, ledit organisme est caractérisé en ce que ledit promoteur est le promoteur de la cytokératine 14 (K14) et ledit gène de fusion Cre-ER T2
Selon un sixième mode préféré de réalisation, ledit organisme est caractérisé en ce que ledit promoteur est le promoteur de la cytokératine 14 (K14) et ledit gène de fusion Cre-ERT3.
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Selon un septième mode préféré de réalisation, ledit organisme est caractérisé en ce que ledit promoteur est le promoteur de l'[alpha]-1-antitrypsine et ledit gène de fusion Cre-ERT.
Selon un huitième mode préféré de réalisation, ledit organisme est caractérisé en ce que ledit promoteur est le promoteur de l'[alpha]-1-antitrypsine et ledit gène de fusion Cre-ER T2
Selon un neuvième mode préféré de réalisation, ledit organisme est caractérisé en. ce que ledit promoteur est le promoteur de l'a-l-antitrypsine et ledit gène de fusion Cre-ERT3.
Selon un dixième mode préféré de réalisation, ledit organisme est caractérisé en ce que ledit promoteur est le promoteur de la protéine adipose 2 (aP2) et ledit gène de fusion Cre-ERT.
Selon un onzième mode préféré de réalisation, ledit organisme est caractérisé en ce que ledit promoteur est le promoteur de la protéine adipose 2 (aP2) et ledit gène de fusion Cre-ERT2.
Selon un douzième mode préféré de réalisation, ledit organisme est caractérisé en ce que ledit promoteur est le promoteur de la protéine adipose 2 (aP2) et ledit gène de fusion Cre-ERT3.
Selon un premier mode de réalisation, l'organisme selon l'invention est caractérisé en ce que ledit gène de fusion est de séquence SEQ ID N 3 et code pour la protéine Cre-ERT de séquence SEQ ID N 4.
Selon un second mode de réalisation, l'organisme selon l'invention est caractérisé en ce que ledit gène
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de fusion code de séquence SEQ ID N 5 pour la protéine de fusion Cre-ERT2 de séquence SEQ ID N 6.
Selon un troisième mode de réalisation, l'organisme selon l'invention est caractérisé en ce que ledit gène de fusion code de séquence SEQ ID N 7 pour la protéine de fusion Cre-ERT3 de séquence SEQ ID N 8.
L'article de Metzger et Feil (1999) donne à titre d'exemple non limitatif (cf. tableau page 471) une liste de promoteurs tissus-spécifiques susceptibles d'être utilisés pour diriger l'expression de la protéine Cre dans différents tissus.
Les promoteurs tissus-spécifiques sont d'une manière plus générale choisis parmi ceux qui dirigent l'expression d'une protéine de fusion dans un système physiologique, un organe, un tissu, un type cellulaire, ou une cellule particulière, parmi lesquels il convient de citer de manière non exhaustive le système nerveux en général, et notamment le cerveau, le cervelet, les neurones, les motoneurones, les cellules gliales, les cellules de Schwann, l'hypophyse, l'hypothalamus, la glande pituitaire, l'hippocampe et le cortex, le c#ur, les cardiomyocytes ventriculaires et les cardiomyocytes auriculaires, les poumons, les os, les yeux et plus particulièrement la rétine et le cristallin, la peau et plus particulièrement le derme et l'épiderme, les muscles, et plus particulièrement les muscles squelettiques, le muscle cardiaque, les muscles lisses, la glande mammaire, les gonades et plus particulièrement les testicules, les ovaires, les cellules germinales, les ovocytes, les ovogonies, les spermatozoïdes, les spermatogonies et les spermatocytes, le rein, le foie et notamment les
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hépatocytes, la rate, le pancréas et notamment les cellules de Langerhans et les cellules P, la langue, l'oesophage, le tissu adipeux, les cellules endothéliales.
Les éléments d'expression ubiquitaire ou promoteurs ubiquitaires sont choisis parmi les promoteurs qui permettent d'obtenir une expression, de préférence forte, dans l'ensemble, ou pour le moins dans une grande proportion d'organes, ou de tissus de l'organisme selon l'invention. Ces promoteurs peuvent être hétérologues ou non à l'organisme selon l'invention. A titre d'exemple non limitatif de promoteurs ubiquitaires, on peut citer le promoteur du cytomégalovirus (CMV) (Schmidt et al., 1990) et le promoteur inductible par l'interféron (Mxl) (Hug et al., 1998 ; Arnheiter et al., 1990). En outre, les éléments d'expression, ou promoteurs selon l'invention, peuvent assurer un contrôle constitutif ou inductible de l'expression du gène de fusion. Parmi les éléments assurant une expression inductible, il convient de citer les promoteurs eucaryotiques inductibles par les métaux lourds (Mayo et al., 1982 ; Brinster et al., 1982 ; Seark et al., 1985), par un choc thermique (Nover et al., 1991), par les hormones (Lee et al., 1981 ; Hynes et al., 1981 ; Klock et al., 1987 ; Israel et al., 1989), par l'interféron (Hug et al., 1998 ; Arnheiter et al., 1990). Il convient également de citer les éléments d'expression procaryotiques inductibles tels que le système répresseur Lac (LacR/opérateur/inducteur) d'E. coli (Hu et al., 1987 ; Brown et al., 1987 ; Figge et al., 1988 ; Deuschle et
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al., 1990 ; Labow et al., 1990), le système de résistance à la tétracycline d'E. coli (Gossen et al., 1992) (WO 94 04 672, EP 804 565).
Dans le cas où l'intégration du gène de fusion est ciblée par recombinaison homologue dans le génome de l'organisme ( Knock-in ), le gène de fusion peut être dépourvu de promoteurs ou d'éléments d'expression et être placé sous le contrôle d'un promoteur ou d'éléments d'expression endogènes.
Les technologies de l'ADN recombinant utilisées pour la construction du vecteur d'expression selon l'invention sont celles connues et communément utilisées par les hommes de l'art. Les techniques standard sont utilisées pour le clonage, l'isolement de l'ADN, l'amplification, et la purification ; les réactions enzymatiques impliquant l'ADN ligase, l'ADN polymérase, les endonucléases de restriction sont effectuées selon les recommandations du fabricant. Ces techniques et les autres sont généralement réalisées selon Sambrook et al. (1989).
Le vecteur selon l'invention ou le fragment de vecteur peuvent être introduits dans la cellule hôte par des méthodes standard telles que par exemple la micro-injection dans un pronucléus, la transfection par précipitation au phosphate de calcium, la lipofection, l'électroporation, le choc thermique.
Le gène de fusion selon l'invention comprend de préférence dans le sens 5'# 3' : - un fragment d'ADN codant pour la recombinase Cre du bactériophage P1 ou l'un de ses variants ; - un fragment d'ADN d'au moins 45 nucléotides codant au moins soit pour tout ou partie de la région charnière
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D d'un récepteur nucléaire des #strogènes, région située entre le domaine de liaison à l'ADN et le domaine de liaison du ligand, soit pour un peptide fonctionnellement équivalent à ladite région charnière D ; - un fragment d'ADN codant pour le domaine de liaison du ligand (LBD) d'un récepteur nucléaire des #strogènes ou de leurs variants, ledit fragment présentant au moins une mutation conférant au LBD la capacité de répondre aux anti-#strogènes synthétiques mais non aux agonistes #strogéniques naturels.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la protéine de fusion est directement introduite dans l'organisme, ou dans une cellule de l'organisme, cette introduction pouvant se faire par injection dans un tissu ou un organe dans le cas d'un organisme, ou par micro-injection dans le cas d'une cellule.
La séquence d'ADN d'intérêt selon l'invention est un gène ou une séquence inter-génique. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la séquence d'ADN d'intérêt est un gène, la fonction du gène pouvant être connue ou inconnue. L'étude d'un organisme selon l'invention présentant une modification d'un gène ou de tout autre région génomique de fonction inconnue permet de contribuer à la définition de la fonction de ce gène ou de cette région inter-génique. Tous les gènes et régions inter-géniques d'un organisme métazoaire sont susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la présente invention ; plus particulièrement, il convient de citer les gènes RXRa, RXRss, RXR[gamma], RARa, RARss, RARy, SNF2p. Par séquence d'ADN d'intérêt
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appartenant naturellement au génome dudit organisme, ou séquence d'ADN d'intérêt dans son environnement chromatinien naturel, on entend désigner une séquence d'ADN endogène, tel un gène endogène, présent dans le génome à son(ses) locus(loci) naturel (s).
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'organisme selon l'invention est un animal, notamment une souris, caractérisé en ce qu'au moins une des cellules de ladite souris comprend : - un gène de fusion codant pour la protéine de fusion
Cre-ERT de séquence SEQ ID N 4, 'ou Cre-ERT2 de séquence ID N 6, ou Cre-ERT3 de séquence ID N 8, ledit gène de fusion étant sous le contrôle du promoteur de la cytokératine K5 ; - une ou des séquences d'ADN chromosomique d'intérêt dans leur contexte chromatinien naturel et encadrée(s) de site lox ( floxées ).
Selon un second mode préféré de réalisation de l'invention, l'organisme selon l'invention est caractérisé en ce qu'au moins une des cellules de ladite souris comprend : - un gène de fusion codant pour la protéine de fusion
Cre-ERT de séquence SEQ ID N 4, ou Cre-ERT2 de séquence ID N 6, ou Cre-ERT3 de séquence ID N 8, ledit gène de fusion étant sous le contrôle du promoteur de la cytokératine K14 ; - une ou des séquences d'ADN chromosomique d'intérêt dans leur contexte chromatinien naturel et encadrée (s) de site lox ( floxées ) .
Selon un troisième mode préféré de réalisation de l'invention, l'organisme selon l'invention est
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caractérisé en ce qu'au moins une des cellules de ladite souris comprend : - un gène de fusion codant pour la protéine de fusion
Cre-ERT de séquence SEQ ID N 4, ou Cre-ERT2 de séquence ID N 6, ou Cre-ERT3 de séquence ID N 8, ledit gène de fusion étant sous le contrôle du promoteur de la protéine adipose 2 (aP2) ; - une ou des séquences d'ADN chromosomique d'intérêt dans leur contexte chromatinien naturel et encadrée(s) de site lox ( floxées ).
Selon un quatrième mode préféré de réalisation de l'invention, l'organisme selon l'invention est caractérisé en ce qu'au moins une des cellules de ladite souris comprend : - un gène de fusion codant pour la protéine de fusion
Cre-ERT de séquence SEQ ID N 4, ou Cre-ERT2 de séquence ID N 6, ou Cre-ERT3 de séquence ID N 8, ledit gène de fusion étant sous le contrôle du promoteur de l'a-1-antitrypsine.
- une ou des séquences d'ADN chromosomique d'intérêt dans leur contexte chromatinien naturel et encadrée(s) de site lox ( floxées ).
La présente invention concerne également des procédés de préparation d'un organisme métazoaire selon l'invention.
Un premier procédé de préparation consiste dans les étapes de : a) obtention d'une cellule souche embryonnaire (ES) modifiée par insertion de site(s) de reconnaissance de ladite protéine recombinase dans ladite (lesdites) séquence(s) d'ADN d'intérêt,
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localisées dans un ou plusieurs chromosomes, par recombinaison homologue ; b) introduction de ladite cellule souche embryonnaire modifiée dans un embryon dudit organisme ; c) développement dudit embryon jusqu'au stade d'un organisme adulte fertile ; d) croisement dudit organisme adulte fertile avec un organisme transgénique dont au moins une des cellules exprime ladite protéine de fusion et obtention des descendants issus dudit croisement ; et e) facultativement, sélection, parmi lesdits descendants, dudit organisme métazoaire.
Un second procédé de préparation consiste dans les étapes de : a) Obtention d'une cellule somatique modifiée par insertion de site(s) de reconnaissance de ladite protéine recombinase dans ladite (lesdites) séquence(s) d'ADN d'intérêt localisée(s) dans un ou plusieurs chromosome(s), par recombinaison homologue ; b) transfert du noyau de ladite cellule somatique modifiée dans le cytoplasme d'un oocyte receveur énucléé ; c) développement de l'embryon obtenu à l'étape b) jusqu'au stade d'un organisme adulte fertile ; d) croisement dudit organisme adulte fertile avec un organisme transgénique dont au moins une des cellules exprime la protéine de fusion et obtention des descendants issus dudit croisement ; et
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e) facultativement, sélection, parmi les descendants dudit organisme métazoaire.
Par transfert du noyau ou transfert nucléaire, au sens de la présente invention, on entend désigner le transfert de noyau d'une cellule vivante donneuse de vertébré, d'un organisme adulte ou au stade f#tal, dans le cytoplasme d'une cellule receveuse énucléée de la même espèce ou d'une espèce différente. Le noyau transféré est reprogrammé pour diriger le développement des embryons clonés qui peuvent ensuite être transférés dans des femelles porteuses pour produire les foetus et les nouveau-nés, ou utilisés pour produire des cellules de la masse cellulaire interne en culture. Différentes techniques de clonage nucléaire sont susceptibles d'être utilisées ; parmi celles-ci, il convient de citer celles qui font l'objet des demandes de brevet WO 95 17500, WO 97 07668, WO 97 07669, WO 98 30683, WO 99 01163, WO 99 37143.
Un troisième procédé de préparation consiste dans les étapes de : a) obtention d'une cellule souche embryonnaire (ES) modifiée par insertion de site(s) de reconnaissance de ladite protéine recombinase dans ladite (lesdites) séquence(s) d'ADN d'intérêt, localisée(s) dans un ou plusieurs chromosome(s), par recombinaison homologue ; b) introduction de ladite cellule souche embryonnaire modifiée dans un embryon dudit organisme ; c) développement dudit embryon ; et d) introduction de ladite protéine de fusion dans au moins une cellule dudit embryon ou de l'organisme issu du développement dudit embryon.
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Un quatrième procédé de préparation consiste dans les étapes de : a) Obtention d'une cellule somatique modifiée par insertion de site(s) de reconnaissance de ladite protéine recombinase dans ladite (lesdites) séquence(s) d'ADN d'intérêt localisée(s) dans un ou plusieurs chromosome(s), par recombinaison homologue ; b) transfert du noyau de ladite cellule somatique modifiée dans le cytoplasme d'un oocyte receveur énucléé ; c) développement dudit embryon ; et d) introduction de ladite protéine de fusion dans au moins une cellule dudit embryon ou dudit organisme issu du développement dudit embryon.
L'insertion des sites de reconnaissance spécifiques de la protéine recombinase, notamment du ou des sites loxP pour la recombinase Cre, dans la séquence d'ADN d'intérêt se fait de préférence par recombinaison homologue du gène comportant ledit fragment d'ADN à exciser ou inverser (deux sites loxP) ou respectivement insérer ou transloquer (un site loxP) avec un dit gène modifié comportant ledit fragment d'ADN à exciser flanqué en 5' et/ou 3' par le ou lesdits sites de reconnaissance de recombinase en fonction de l'application désirée, notamment les sites loxP.
Pour ce faire, le fragment d'ADN d'intérêt modifié peut être intégré par recombinaison homologue dans le génome des cellules dudit organisme avant, en même temps, ou après l'étape d'introduction de la protéine de fusion ou d'un vecteur de transfert, ou d'expression
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de la protéine de fusion. De préférence, le fragment d'ADN d'intérêt est introduit dans des cellules embryonnaires pluripotentes (cellules ES) par la technique appropriée, telle par exemple l'électroporation, ou l'utilisation de vecteurs rétroviraux, la précipitation au phosphate de calcium, la lipofection.
Les constructions d'ADN destinées à la recombinaison homologue comprendront au moins une portion de la séquence d'ADN d'intérêt, notamment du gène ou de la séquence inter-génique d'intérêt, dans laquelle se trouvera introduite la ou les modifications génétiques souhaitées, telle que l'introduction d'au moins un site de reconnaissance de la recombinase, et qui inclura des régions d'homologie avec le locus cible. Pour une utilisation facilitée, on introduit des marqueurs de sélection positif et/ou négatif (par exemple, le gène néo, conférant la résistance à l'antibiotique G418). Le marqueur de sélection utilisé pour permettre d'identifier les événements de recombinaison homologue peut être gênant, et peut être éliminé, si nécessaire, s'il est lui même encadré de sites de reconnaissance de recombinase tels que des sites loxP (ou FRT). Ceci permet d'obtenir des souris dont la seule modification au niveau du locus modifié est l'insertion de sites de reconnaissance tels que loxP.
Les organismes métazoaires obtenus par les procédés de préparation présentés ci-dessus peuvent ensuite être traités avec un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique tel que le Tam et l'OHT.
Dans les différents procédés et utilisations de
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l'invention, la mise en présence desdites cellules dudit organisme avec ledit ligand synthétique se fait par administration par voie orale ou topique, ou par injection et notamment, par injection intraveineuse, intramusculaire, intrarachidienne, intracérébrale, intrapéritonéale. Dans le cas d'un embryon, d'un foetus ou d'un nouveau-né avant le sevrage, le traitement avec le ligand synthétique pourra être réalisé par administration à la mère. Lorsqu'il s'agit de cellules en culture dérivées dudit organisme ledit ligand synthétique est de préférence ajouté au milieu de culture, ou injecté dans ladite cellule. Ce traitement ou cette mise en présence permet d'inactiver ou de modifier un gène ou une séquence inter-génique d'intérêt à un moment déterminé (contrôle temporel) dans un tissu donné (contrôle spatial), et ainsi permettre d'étudier la fonction de ce gène ou de cette séquence à différents moments du développement. Ceci est particulièrement intéressant pour l'étude des gènes qui sont indispensables au bon déroulement du développement embryonnaire et dont l'inactivation est létale à un stade précoce du développement.
La présente invention a donc également pour objet de fournir un procédé de recombinaison, notamment d'excision, d'insertion, d'inversion, de translocation, conditionnelle au niveau de la séquence d'ADN d'intérêt dans laquelle est(sont) inséré(s) un ou plusieurs sites de reconnaissance de ladite protéine recombinase, ladite séquence d'ADN d'intérêt étant localisée dans un ou plusieurs des chromosomes dudit génome de ladite cellule dudit organisme selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes de :
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(i) mise en présence d'au moins une cellule dudit organisme avec un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique ; (ii) induction de l'activité de la recombinase de ladite protéine de fusion par ledit ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique.
La présente invention fournit donc un procédé de délétion conditionnelle d'un fragment d'ADN dans lequel on met en #uvre un procédé d'excision selon l'invention, et dans lequel ledit(lesdits) fragment(s) d'ADN à exciser est (sont) encadré (s) par deux sites de reconnaissance de protéine recombinase orientés en répétition directe. En particulier, ledit fragment d'ADN peut être choisi de telle sorte que l'excision dudit fragment d'ADN a pour effet, l'inactivation dudit gène.
La présente invention fournit également un procédé d'obtention d'un organisme métazoaire à l'exception de l'homme, dont au moins une cellule possède un allèle d'un gène d'intérêt inactivé par un procédé de délétion conditionnelle et dont l'autre allèle dudit gène d'intérêt possède une mutation, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : a) obtention d'un organisme métazoaire dont au moins une cellule de la lignée germinale comporte ladite mutation dans un des allèles dudit gène d'intérêt ; b) croisement dudit organisme obtenu à l'étape a) avec un organisme selon l'invention ; c) sélection d'un descendant dont le génome comprend un gène d'intérêt dont un des allèles possède une mutation et l'autre allèle possède au moins deux
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sites de reconnaissance de protéines recombinases orientés en répétition directe ; d) mise en #uvre du procédé de délétion conditionnelle, selon l'invention, du fragment d'ADN dudit allèle dudit gène d'intérêt qui est encadré par au moins deux sites de reconnaissance de protéine recombinase orientés en répétition directe ; et e) obtention dudit organisme métazoaire dont le génome d'au moins une cellule comprend ledit gène d'intérêt dont un allèle est inactivé, et l'autre allèle possède une mutation somatique de préférence limitée, et de préférence dans des séquences exoniques et/ou régulatrices.
Un tel procédé permet d'étudier et d'analyser la fonction biologique de mutations autres que des délétions, et plus particulièrement des mutations observées dans des gènes dont le dysfonctionnement provoque une pathologie génétique récessive. Ce procédé est donc particulièrement adapté à l'obtention de modèles animaux transgéniques de pathologies génétiques humaines à transmission récessive, le modèle animal étant de préférence le modèle murin.
Les mutations sont de préférence des mutations ponctuelles ou limitées dans des exons ou des séquences régulatrices telles que des insertions, délétions, substitutions.
Selon un mode préféré de réalisation du procédé de recombinaison, et du procédé de délétion conditionnelle ou du procédé d'obtention d'un organisme métazoaire selon l'invention, les sites de reconnaissance spécifique de la protéine recombinase sont les sites
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loxP et ladite protéine recombinase est la protéine Cre du bactériophage P1, ou l'un de ses variants.
Les organismes susceptibles d'être obtenus par la mise en #uvre des différents procédés précédents sont également compris dans la portée de l'invention. Ces organismes sont de préférence des animaux, et de manière préférée des rongeurs, tels que le rat et la souris, de préférence la souris.
De manière préférée, l'invention a pour objet une souris transgénique K5-Cre-ER T RXR[alpha]L2/L2 dont le gène RXRa peut être sélectivement inactivé dans les kératinocytes de l'épiderme par la mise en #uvre d'un procédé de délétion conditionnelle suite à un traitement par un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique, entraînant chez ladite souris une alopécie, et/ou une hyperprolifération des kératinocytes et/ou une réaction inflammatoire de la peau.
De manière préférée, l'invention a pour objet une souris transgénique K5-Cre-ERT2 RXR[alpha]L2/L2 dont le gène RXRa peut être sélectivement inactivé dans les kératinocytes de l'épiderme par la mise en #uvre d'un procédé de délétion conditionnelle suite à un traitement par un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique, entraînant chez ladite souris une alopécie, et/ou une hyperprolifération des kératinocytes et/ou une réaction inflammatoire de la peau.
De manière préférée, l'invention a pour objet une souris transgénique K5-Cre-ERT3 / RXRaL2/L2 dont le gène
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RXRa peut être sélectivement inactivé dans les kératinocytes de l'épiderme par la mise en #uvre d'un procédé de délétion conditionnelle suite à un traitement par un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique, entraînant chez ladite souris une alopécie, et/ou une hyperprolifération des kératinocytes et/ou une réaction inflammatoire de la peau.
De manière préférée, l'invention a pour objet une souris transgénique K14-Cre-ERT RXR[alpha]L2/L2 dont le gène RXRa peut être sélectivement inactivé dans les kératinocytes de l'épiderme par la mise en #uvre d'un procédé de délétion conditionnelle suite à un traitement par un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique, entraînant chez ladite souris une alopécie, et/ou une hyperprolifération des kératinocytes et/ou une réaction inflammatoire de la peau.
De manière préférée, l'invention a pour objet une souris transgénique K14-Cre-ERT2 / RXRaL2/L2 dont le gène RXRa peut être sélectivement inactivé dans les kératinocytes de l'épiderme par la mise en #uvre d'un procédé de délétion conditionnelle suite à un traitement par un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique, entraînant chez ladite souris une alopécie, et/ou une hyperprolifération des kératinocytes et/ou une réaction inflammatoire de la peau.
De manière préférée, l'invention a pour objet une souris transgénique K14-Cre-ERT3 / RXR[alpha]L2/L2 dont le gène
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RXR[alpha] peut être sélectivement inactivé dans les kératinocytes de l'épiderme par la mise en #uvre d'un procédé de délétion conditionnelle suite à un traitement par un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique, entraînant chez ladite souris une alopécie, et/ou une hyperprolifération des kératinocytes et/ou une réaction inflammatoire de la peau.
De manière préférée, l'invention a pour objet une souris transgénique [alpha]AT-Cre-ERT / RXR[alpha]L2/L2 dont le gène RXRa peut être sélectivement inactivé dans les hépatocytes par la mise en #uvre d'un procédé de délétion conditionnelle suite à un traitement par un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique entraînant chez ladite souris notamment une altération de la prolifération des hépatocytes.
De manière préférée, l'invention a pour objet une souris transgénique aAT-Cre-ER T2 / RXRa L2/L2 dont le gène RXRa peut être sélectivement inactivé dans les hépatocytes par la mise en #uvre d'un procédé de délétion conditionnelle suite à un traitement par un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique entraînant chez ladite souris notamment une altération de la prolifération des hépatocytes.
De manière préférée, l'invention a pour objet une souris transgénique [alpha]AT-Cre-ERT3 / RXR[alpha]L2/L2 dont le gène RXRa peut être sélectivement inactivé dans les hépatocytes par la mise en #uvre d'un procédé de délétion conditionnelle suite à un traitement par un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique
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entraînant chez ladite souris notamment une altération de la prolifération des hépatocytes.
De manière préférée, l'invention a pour objet une souris transgénique aP2-Cre-ER / RXR[alpha]L2/L2 dont le gène RXRa peut être sélectivement inactivé dans les adipocytes par la mise en #uvre d'un procédé de délétion conditionnelle suite à un traitement par un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique entraînant chez ladite souris une altération du métabolisme des lipides dans les adipocytes et/ou un diabète.
De manière préférée, l'invention a pour objet une souris transgénique aP2-Cre-ER T2 / RXR[alpha]L2/L2 dont le gène RXRa peut être sélectivement inactivé dans les adipocytes par la mise en #uvre d'un procédé de délétion conditionnelle suite à un traitement par un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique entraînant chez ladite souris une altération du métabolisme des lipides dans les adipocytes et/ou un diabète.
De manière préférée, l'invention a pour objet une souris transgénique aP2-Cre-ER T3 / RXR[alpha]L2/L2 dont le gène RXRa peut être sélectivement inactivé dans les adipocytes par la mise en #uvre d'un procédé de délétion conditionnelle suite à un traitement par un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique entraînant chez ladite souris une altération du métabolisme des lipides dans les adipocytes et/ou un diabète.
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De préférence, ledit gène RXRa de ladite souris est inactivé par la mise en #uvre d'un procédé selon l'invention.
La présente invention et notamment l'organisme métazoaire et les cellules qui en sont dérivées sont particulièrement utiles pour l'analyse ou l'étude de la fonction biologique d'une séquence d'ADN d'intérêt, qu'elle soit génique ou inter-génique dans son environnement chromatinien naturel. C'est la raison pour laquelle, il est également dans la portée de la présente invention de fournir un procédé d'analyse ou d'étude de la fonction biologique d'une séquence d'ADN d'intérêt, notamment d'un gène ou d'une séquence intergénique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes de : (i) mise en présence d'un organisme selon l'invention ou de cellules isolées dudit organisme avec un ligand synthétique doté d'activité anti- #strogénique ; (ii) facultativement l'induction de l'expression de ladite protéine de fusion ; (iii) mise en évidence de l'événement de recombinaison catalysé par l'activité recombinase de ladite protéine de fusion ; (iv) étude ou analyse biochimique et/ou physiologique et/ou phénotypique et/ou comportementale, de ladite cellule ou dudit organisme.
Les analyses phénotypiques et comportementales de l'organisme selon l'invention avant ou après induction de la recombinaison somatique sont réalisées en utilisant les techniques connues de l'homme de l'art.
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La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un organisme selon l'invention ou de cellules dérivées dudit organisme pour réaliser une recombinaison site-spécifique spatio-temporellement contrôlées de ladite séquence d'ADN d'intérêt dans son environnement chromatinien naturel, avec une efficacité d'au moins 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, en présence de ligand synthétique dans les cellules dudit organisme exprimant ladite protéine de fusion et avec une efficacité au moins inférieure à 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,01%, ou nulle en absence de ligand synthétique ou en présence de ligand naturel dans les cellules dudit organisme exprimant ladite protéine de fusion.
Selon un mode préféré, ladite recombinaison est réalisée dans l'épiderme, et plus précisément dans les kératinocytes, dans les adipocytes, ou dans les hépatocytes.
La présente invention a également pour objet son procédé de criblage de composés susceptibles d'être utilisés comme médicament pour le traitement préventif et/ou curatif de pathologies associées à une altération de l'expression (dans le cas notamment de séquence d'ADN inter-génique) et/ou de la fonction (dans le cas de séquence d'ADN génique) de ladite séquence d'ADN d'intérêt, caractérisé en ce qu'il comporte l'étape d'administration dudit composé dans un organisme selon l'invention.
Cet organisme peut ainsi être utilisé pour le criblage de composés susceptibles de constituer un principe actif d'un médicament destiné au traitement de pathologies associées à une altération de l'expression
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et/ou de la fonction de ladite séquence d'ADN d'intérêt.
Ainsi, la présente invention a pour objet de fournir un procédé de criblage de composés susceptibles d'être utilisés comme médicament pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie et/ou de l'hperprolifération des kératinocytes et/ou des réactions inflammatoires de la peau, caractérisé en ce qu'il comporte l'étape d'administration dudit composé dans une souris selon l'invention.
La présente invention a également pour objet de fournir un procédé de criblage de composés susceptibles d'être utilisés comme médicament pour favoriser notamment la régénération hépatique, caractérisé en ce qu'il comporte l'étape d'administration dudit composé dans une souris selon l'invention.
La présente invention a également pour objet de fournir un procédé de criblage de composés susceptibles d'être utilisés comme médicament pour le traitement préventif et/ou curatif du diabète et/ou pour le traitement de l'altération du métabolisme des lipides, notamment de l'obésité, caractérisé en ce qu'il comporte l'étape d'administration dudit composé dans une souris selon l'invention.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière des exemples qui vont suivre.
Figure 1 : Inactivation du gène RXRa dans l'épiderme de souris adulte médiée par la Cre-ERT et Cre-ERT2, et induite par le Tamoxifène.
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Figure 1A : Représentation schématique du locus génomique sauvage de RXRa (+), de l'allèle RXRa L2 floxé, de l'allèle RXRa L- obtenu après une excision médiée par la Cre de l'exon 4 (codant pour le domaine de liaison à l'ADN), et de l'allèle nul RXRa (-) (Kastner et al., 1994). Les boîtes noires indiquent les exons (E2 - E4). Les sites de restriction enzymatique et la position de la sonde X4 sont indiqués. Les tailles des fragments BamHI sont indiquées en kilobases (kb) : BamHI ; C, ClaI ; E, EcoRI H, HindIII ; S, Spel ; X, XbaI. Les pointes de flèche dans les allèles L2 et L- indiquent les sites Lox P.
Figure 1B : L'obtention d'allèles RXR[alpha]L- médié par K5Cre-ERT induit par le Tamoxifène est illustrée par l'analyse en Southern blot de l'ADN isolé de l'épiderme, six semaines (lignes 1 à 3) ou douze semaines (lignes 4 à 6) après la première injection de Tamoxifène (1 mg) (AFT : after first Tamoxifen treatment ). Le génotype des souris est tel qu'indiqué, et les fragments digérés par BamHI correspondant aux allèles RXRa(+), L2, L-, (-) sont décrits.
Figure 1C : Sélectivité tissulaire de l'inactivation de RXRa médié par Cre-ERT. Les allèles sauvages (+), L2, Lsont identifiés par PCR à partir d'ADN extrait de différents organes de souris K5-Cre-ERT(tg/0)/RXR[alpha]L2/+~,
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douze semaines après le premier traitement au Tamoxifène.
Figure 1D : L'obtention d'allèles RXRa L- médiés par K14-Cre-ER T2 induit par le Tamoxifène dans l'épiderme de la souris adulte est illustré par une analyse PCR de l'ADN génomique extrait de l'épiderme (E) et du derme (D) isolé deux semaines après la première injection de Tamoxifène (0,1 mg) (+) ou du véhicule (huile) (-) . Le génotype des souris est indiqué et les fragments PCR correspondant aux allèles RXRa(+), L2 et L- sont indiqués.
Figure 2 : Anomalies générées par l'inactivation de RXRa médiée par K5-Cre-ERT et K14-Cre-ERT2 induits par le Tamoxifène, dans la peau de souris adulte.
Figure 2A : Vue ventrale d'une souris femelle
Figure img00450001

mutante (mt) K5-Cre-ERT tg/o) /RXRaL2/- ( à gauche) et d'une souris femelle contrôle (et) K5-Cre- ERT(tg/0)/RXR[alpha]L2/+ (à droite), seize semaines après la première injection au Tamoxifène (1 mg de Tamoxifène/injection).
Figure 2B : Vue dorsale des mêmes animaux.
Figure 2C : Agrandissement de la région ventrale de la souris femelle mutante (mt) K5-Cre-ERT(tg/0)/RXR[alpha]L2/-, avec la flèche indiquant un des kystes visibles sous la surface de la peau.
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Figure 2D : Vue dorsale de la souris femelle
Figure img00460001

mutante (mt) K5-Cre-ER T (tg/0) /RXRa L2/-, vingt-huit semaines après le début du traitement au Tamoxifène. La flèche indique une lésion mineure de la peau.
Figures 2E-H : Analyse histologique. Sections histologiques de 2 um d'épaisseur de la peau ventrale de souris contrôle (E et G) et mutante (F et H), seize semaines après le début du traitement. Des follicules pileux (hf), des utricules (u) et des kystes dermiques (dc) sont indiqués. Les pointes de flèches dans (H) indiquent les cellules de Langerhans, dont le nombre est augmenté plusieurs fois dans l'épiderme des souris mutantes. Notez-en (F) et en (H) la cellularité accrue dans le derme en dessous de l'épiderme interfolliculaire hyperprolifératif. Echelle (dans E) E et F = 60 um ; G et H = 12 um.
Figures 21, J : Immunohistochimie de la kératine 6 (K6) sur des sections de peau de souris contrôle (I) et de souris mutante (J), seize semaines après le premier traitement au Tamoxifène. La couleur rouge correspond au marquage par l'anticorps dirigé contre K6, et la couleur Cyan correspond à une coloration au DAPI. K6 est normalement exprimé dans la partie externe de la gaine de la racine du follicule pileux (hf) mais pas dans l'épiderme (I) et est exprimé anormalement dans l'épiderme hyperprolifératif de souris mutante (J). Echelle (dans I) I = 25 m. Les flèches dans E à J indiquent la jonction derme-épiderme.
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Figures 2K, L : Apparence de la peau d'une souris
Figure img00470001

femelle mutante K14-Cre-ERT2 (tg/o) RXRaL2/L2 . (K) agrandissement de la région ventrale, seize semaines après le début du traitement au Tamoxifène (0,1mg par injection) ; la flèche blanche indique un kyste et la flèche noire indique un utricule contenant des mélanosomes. (L) vue dorsale du même mutant. La flèche indique une des lésions de la peau associée avec une région sans poil.
Figure 3 : Similitudes et différences entre les anomalies de la peau présentes chez une souris double
Figure img00470002

mutante K5-Cre-ERT (tg/0) /RXROE L2/L2 /RXRp-/- induite au Tamoxifène et une souris VDR nulle .
Figures 3A, E : souris K5-Cre-ER T (tg/0) /RXRa L2/L2 /RXRf3 -/- dix-huit semaines après le premier traitement au Tamoxifène (1 mg de Tamoxifène par injection) (A) et souris VDR-/- âgée de quatorze semaines (E). Les flèches en (A) indiquent les lésions de la peau. (B, C) et (F, G) : analyse histologique de sections de 2um d'épaisseur de la peau dorsale des animaux présentés en (A) et (E) respectivement. Echelle (dans G) : B et F = 60 um ; C et G = 12 pm.
Figures 3D, H : Immunohistochimie de la kératine 6 (K6) sur des sections de peau de souris prélevées sur les animaux présentés en (A) et (E) respectivement. Notez que K6 est exprimé dans l'utricule, mais pas dans l'épiderme de la peau des souris VDR-/-, alors que K6 est exprimé dans tout l'épiderme hyperprolifératif des souris double-mutantes RXRa/RXRp (D). Utricule (U),
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kyste dermique (dc). Les flèches en (B-H) indiquent la jonction derme-épiderme. Echelle (dans H) : D et H = 25 um.
Figure 4 : Inactivation ciblée sélective du gène SNF20 dans l'épiderme de souris adulte.
Figure 4A : schématique des allèles de SNF20 de type sauvage (+), L3, L2+ et L-.
La taille des segments d'ADN révélés par la sonde 5', après digestion enzymatique de l'ADN génomique par BamHI est indiquée. L' allèle L3 dans les cellules ES a été obtenu par recombinaison homologue en utilisant une stratégie similaire à celle décrite pour les cellules F9 dans Sumi-Chinose et al., 1997.
Figure 4B
Figure img00480001

Des souris K14-Cre-ERT2 tg/o) ISNU2 eL2/L2 et K14-Cre- ERT2(0/0)/SNF2ssL2/L2 de huit semaines ont été traitées au Tamoxifène (Tarn) pendant cinq jours à raison de 0,1 mg/jour ou avec de l'huile (-). Des biopsies de queue ont été prélevées, le derme et l'épiderme séparés, l'ADN génomique préparé, digéré par BamHI, séparé par électrophorèse sur gel d'agarose, et transféré sur des membranes de nylon, qui ont été hybridées avec la sonde 5' radiomarquée. Des autoradiographies sont présentées.
Figure 5 : Inactivation ciblée sélective du gène RXRa, dans les adipocytes.
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Des souris transgéniques aP2-Cre-ERT2 (tg/0) exprimant Cre-ER T2 sous le contrôle du promoteur murin aP2, qui est sélectivement actif dans les adipocytes (Ross et al., 1990), ont été croisées avec des souris RXR[alpha]L2/+ pour produire des souris aP2-Cre-ER T2 (tg/0) / RXR[alpha]L2/L2.
Ces souris ont ensuite été croisées avec des souris RXRa+/ (Kastner et al . , 1994) pour produire des souris aP2-Cre-ERT2(tg/0) / RXR[alpha]L2/-. De telles souris, âgées de quatre semaines, ont été traitées (+) ou non (-) au Tamoxifène (1 mg/jour) pendant cinq jours, et le tissu adipeux prélevé un mois après la dernière injection de Tamoxifène. L'ADN a été extrait du tissu adipeux, ou après séparation des adipocytes (adipocytes purifiés à 80%) du tissu conjonctif et vaisseaux sanguins (non adipocytes). Après digestion par BamHI, les allèles de RXRa ont été analysés par Southern blot.
Un autoradiogramme est présenté. Aucune excision n'est observée dans les adipocytes purifiés ou le tissu adipeux de souris non traitées au Tamoxifène (Tarn). En revanche, dans le tissu adipeux et les adipocytes de souris traitées au Tamoxifène, une excision est observée qui se caractérise par l'apparition d'une bande à 8,5 kb correspondant à l'allèle L-.
Figure 6 : Analyse phénotypique de souris après mutagenèse somatique conditionnelle de RXRa, dans les adipocytes.
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Le poids des souris contrôles aP2-Cre-
Figure img00500001

ERT2tg/o>RXRaL2/+ (CT) et aP2-Cre-ERT2 (tg/o) /RXRaL2/- (mutantes;KO) a été déterminé une fois par semaine. (A) Chaque groupe d'animaux était composé de 10 à 15 mâles. Les animaux étaient nourris soit avec de l'alimentation normale (AN) ou enrichie en graisses et en glucose (AR). (B) Le poids du tissu adipeux sous-cutané de souris CT et KO de 6 mois, nourris avec de l'AN ou de l'AR. (C) Cryocoupes de 10 m de tissu adipeux souscutané de souris CT (a et c) et KO (b et d) de 6 mois, nourries avec de l'AN (a et b) ou AR (c et d). Echelle ; 160 m. Les niveaux de triglycérides (D), de glucose (E) et d'insuline (F) ont été déterminés sur du sérum d'animaux CT et KO de 4 à 5 mois, nourris avec une AN ou AR. Le dosage du glucose a été réalisé après une mise à jeun des animaux de 12 heures, p < 0,05.
Figure 7 : Inactivation ciblée sélective du gène RXRa, dans les hépatocytes murins.
Pour, invalider le gène RXRa sélectivement dans les hépatocytes, des souris [alpha]AT-Cre-ERT(tg/0) qui expriment Cre-ERT sous le contrôle du promoteur du gène de l'a-1antitrypsine ([alpha]AT) dans environ 50% des hépatocytes (Imaï et al., 2000) ont été croisées avec des souris RXR[alpha]L2/L2 pour produire des souris a.AT-Cre- ERT(tg/0)/RXR[alpha]L2/L2. De telles souris, âgées de trois mois, ont été traitées au Tamoxifène (1 mg/jour) pendant cinq jours, et le c#ur et le foie prélevés sept jours après la première injection de Tamoxifène (jour
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7), sur respectivement un et trois animaux. Le c#ur et le foie ont également été prélevés sur respectivement un et trois animaux du même génotype sans traitement au Tamoxifène (Jour 0). L'ADN a été extrait de ces tissus, et après digestion par BamHI, les allèles de RXRa ont été analysés par Southern blot. Un autoradiogramme est présenté. Aucune excision n'est observée dans le c#ur au jour 0 ou 7, ou dans le foie au jour 0. En revanche, une excision est observée dans le foie de souris sept jours après le traitement au Tamoxifène ; cette excision se matérialise par l' apparition d'une bande à 8,5 kb sur l'autoradiogramme, correspondant à l'allèle L .
Figure 8 : Recombinaison site-spécifique de RXRa dans le foie.
L'excision de segments d'ADN médiée par Cre-ER a été déterminée par southern blot , effectué avec de l'ADN extrait de c#ur et de foie de souris [alpha]At-Cre- ERT(tg/0) /RXR[alpha] L2/L2 prélevés sur différents animaux avant les injections de tamoxifène (jour 0) ou 7,30 ou 90 jours après la dernière injection de Tamoxifène.
Les pistes 15-17 correspondent à de l'ADN isolé de foies d'animaux 7 jours après hépatectomie partielle (HP), réalisée après l'injection de Tamoxifène. La position des allèles RXRaL2 et L- est indiquée.
Figure 9 : Expression des recombinases Cre-ERT2 et CreERT3 dans la couche basale de l'épiderme.
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Immunohistochimie de la recombinase Cre chimérique sur des sections de l'épiderme de souris K5-Cre-ERT2 et K5-Cre-ERT3, traitées soit avec 1 mg ou 0,1 mg d'OHT (4-hydroxyTamoxifène). La couleur rouge correspond au marquage par l'anticorps anti-Cre dirigé contre la protéine recombinase Cre, et la couleur Cyan correspond au DAPI colorant les noyaux cellulaires. Cre-ERT2 et Cre-ERT3 sont localisés dans les noyaux cellulaires de la couche basale. (Notez que la superposition des couleurs rouge et cyan se traduit par une coloration violette) .
Figure 10 : Translocation nucléaire de Cre-ERT2 et CreERT3 suite à un traitement de deux jours à différentes doses d'OHT.
Immunohistochimie de la recombinase Cre chimérique sur des sections de l'épiderme de souris K5-Cre-ERT2 et K5-Cre-ERT3 traitées soit avec 0,1 mg, 0,01 mg ou 0,001 mg d'OHT et analysé deux jours (J 2) après le début du traitement (J 0). La couleur rouge correspond au marquage par l'anticorps anti-Cre dirigé contre la protéine Cre, et la couleur Cyan correspond au DAPI.
Cre-ER T2 et Cre-ERT3 sont localisés dans les noyaux cellulaires de la couche basale. Cre-ERT3 est présent dans une plus grande fraction de ceux-ci que Cre-ERT2, aux différentes doses d'OHT. A la dose de 0,001 mg environ 1/3 des noyaux sont fortement marqués par des anticorps anti-Cre dans la couche basale de l'épiderme de souris K5-Cre-ERT3, alors qu'aucun noyau positif
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n'est observé dans la peau de souris K5-Cre-ER T2 (Notez que la superposition des couleurs rouge et cyan se traduit par une coloration violette).
Figure 11 : Comparaison de l'expression de la ssgalactosidase dans l'épiderme de queue de souris K5Cre-ERT2 (tg/0) /Rosaf1/+ et K5-Cre-ERT3 (tg/0) /Rosafl/+ induite par différentes doses d'OHT.
Activité de la (3-galactosidase sur des sections de l'épiderme de la queue de souris K5-Cre-
Figure img00530001

ERT2 tg/o) Rosafl/+ et K5-Cre-ERT3 tg/o) Rosafl/+ traitées avec 1 mg, 0,1 mg, 0,01 mg et 0,001 mg d'OHT. Les analyses sont réalisées au quinzième jour après le début du traitement (JO).
Les niveaux d'excision induits par 1 et 0,1 mg de OHT sont similaires pour les deux lignées ; en revanche, l'excision est plus efficace dans les souris K5-Cre-ER T3 que K5-Cre-ER T2 aux doses de 0,01 et 0,001 mg d'OHT.
@
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EXEMPLES 1) MATERIELS ET METHODES 1. 1 - Lignées transgéniques
Les lignées de souris RXR[alpha]+/-, VDR-/-, et K5-Cre-ERT ont été décrites précédemment dans Yoshizawa et al.
(1997), Kastner et al. (1994), et Indra et al. (1999).
Le transgène K14-Cre-ER T2 a été construit en remplaçant la région promotrice K5 du vecteur pK5-CreERT2 (Indra et al., 1999) par le fragment d'ADN SalI de la région promotrice/activatrice de 2 kb du gène de la kératine humaine K14, isolé à partir de Phr2 (cadeau de S. Werner). Les souris transgéniques ont été générées conformément à l'article de Indra et al. (1999).
Le transgène aP2-Cre-ERT2 a été construit comme suit : un fragment de 5. 4 kb contenant le promoteur aP2 a été amplifié par PCR à partir d'ADN génomique de souris à l'aide du LA-PCR kit (Perkin-elmer, New Jersey) . avec les oligonucléotides 5'ATACGCGGCCGCGAATTCCAGCAGGAATCAGGTAGCT-3' (Séquence ID N 13) et 5'-ATAGCGCCGGCGCTGCAGCACAGGAGGGTGCTATGAG-3' (Séquence ID N 14). Après avoir rendu les extrémités de ce fragment franches suite à l'action de la T4 polymérase, il a été cloné au niveau du site SalI de pGS-Cre-ERT2 (Indra et al., 1999), dont les extrémités ont également été rendues franches suite à l' action de la T4 polymérase. Le fragment NotI de 8. 3 kb a été isolé de ce plasmide, purifié et injecté dans des zygotes FI (C57BL/6 x SJL) à la concentration de 4
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ng/ml, et les souris portant le transgène aP2-Cre-ER ont été identifiées selon Feil et al., (1996) et Imai et al., (2000) .
1. 2 - Génotypage des allèles RXRa
L'ADN génomique est isolé de tissus selon le protocole décrit dans l'article d'Indra et al. (1999).
L'épiderme est séparé du derme après un traitement de la peau de la queue avec l'enzyme dispase (4 mg/ml dans du PBS, GIBCO-BRL) pendant 1 à 2 heures à température ambiante. Le génotypage des cellules RXRa est réalisé par PCR (réaction de polymérisation en chaîne) en utilisant les amorces ZO 243 (5'-TCC TTC ACC AAG CAC ATC TG-3') (SEQ ID N 9) (localisé dans l'exon 3) et ZO 244 (5'-TGC AGC CCT CAC AAC TGT AT-3') (SEQ ID N 10) (localisé dans l'exon 4) pour les allèles L2 et sauvage (+) ; ces réactions d'amplification génèrent pour l'allèle L2 un fragment de 700 pb et pour l'allèle sauvage (+) un fragment de 650 pb.
Les amorces ZO 243 et UD 196 (5'-CAA CCT GCA CTT GTC ACT TAG-3') (SEQ ID N 11) (localisé dans l'intron entre les exons 4 et 5) ont été utilisées dans une réaction de polymérisation en chaîne pour mettre en évidence l'allèle L- ; cette réaction d'amplification génère un fragment de 400 pb.
Les amorces ZO 243 et RU 178 (5'-ATG TTT CAT AGT TGG ATA TC-3') (SEQ ID N 12) localisé dans la cassette néo) sont utilisées dans la réaction de polymérisation en chaîne pour mettre en évidence l'allèle (-) ; cette réaction de PCR génère un fragment de 500 pb.
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Pour les analyses utilisant le transfert d'ADN (Southern blotting), l'ADN génomique est digéré avec BamHI et la sonde utilisée est la sonde X4 (fragment BamHI-XbaI de 3 kb du gène RXRa) (Metzger et al., 1995) .
1. 3 - Traitement au Tamoxifène
Des solutions de Tamoxifène (Sigma) sont préparées selon le protocole décrit par Metzger et Chambon (2000) . 1 mg de Tamoxifène dissout dans 100 l d'huile de tournesol est injecté intrapéritonéalement dans une souris transgénique K5-Cre-ER pendant cinq jours consécutifs, puis encore trois jours consécutifs, deux, quatre et six semaines plus tard. Les souris transgéniques Kl4-Cre-ER T2 sont injectées intrapéritonéalement avec 0,1 mg de Tarn dissout dans 100 l d'huile de tournesol pendant cinq jours consécutifs, tandis que les souris aP2-Cre-ER T2 et [alpha]AT- Cre-ERTsont traitées avec 1 mg de Tarn.
1. 4 - Analyses histologiques
Les biopsies de peau d'animaux de même âge et de même sexe ont été réalisées au niveau des mêmes endroits du corps.
Les échantillons de peau sont fixés dans le glutaraldéhyde (2,5% dans un tampon cacodylate à 0,1M pH 7,2) pendant la nuit à 4 C puis post-fixés avec du tétroxide d'osmium à 1% dans un tampon cacodylate pendant 1 heure à 4 C. Les tissus sont déshydratés avec
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des concentrations croissantes d'alcool puis recouverts de EPON 812. Des sections semi-fines de 2 m sont ensuite colorées avec du bleu de toluidine.
1. 5 - Immunochimie
Après fixation dans du paraformaldéhyde à 2%, des sections congelées de 10 m sont bloquées dans 5% de sérum de chèvre normal (Vector Laboratories) incubées avec l'anticorps polyclonal anti-MK6 de lapin (Babco).
Après lavage dans du PBS/0,1% Tween 20, les sections sont incubées avec l'anticorps IgG anti-lapin d'âne conjugué au CY3 (Jackson Immuno Research) puis monté dans le milieu Vectashield (Vector Laboratories) contenant du DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole dihydrochloride ; Boehringer Mannheim) (Brocard et al., 1997). Les anticorps anti-Cre sont utilisés selon Indra et al. (1999).
1.6 - Histologie
Les échantillons de tissu adipeux sont prélevés sur des animaux perfusés à la PFA, fixés à l'aide de formaldéhyde (20% dans du PBS), puis congelés dans de l'OCT (Tissue-Tek compound, Sakura). Des cryocoupes de 10 m sont colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine.
Le foie est prélevé sur des animaux, rincé dans du PBS, fixé dans une solution de Boin, puis inclus dans de la paraffine. Des coupes de 6 m sont colorées avec l'hématoxyline et de l'éosine.
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1. 7 - Dosage de paramètres sanguins
Le dosage des triglycérides et du cholestérol est réalisé selon Peters et al. (1997), avec des réactifs de Boehringer Mannheim. Le dosage de l'insuline et du glucose sont réalisés respectivement avec la trousse de Crystal Chem Inc. et des glucofilms (Bayer Corp, USA).
2) Premier exemple : Inactivation ciblée du gène RXR[alpha] dans l'épiderme de souris adulte.
Pour inactiver RXRa dans l'épiderme, les inventeurs ont construit une souris portant des allèles RXRaL2 floxés ( floxed ) (figure 1A) et ont utilisé la lignée de souris transgéniques K5-Cre-ER dans lesquelles le Tamoxifène (Tarn) induit efficacement la recombinaison médiée par Cre dans les kératinocytes de la couche basale (Indra et al., 1999). Le croisement de
Figure img00580001

la souris K5-Cre-ER T (tg/tg) /RXRa L2/L2 avec une souris RXR[alpha]+/- (figure 1A) (Kastner et al., 1994) ou avec une souris RXRaL2/+ permet d'obtenir des souris hémizygoges (tg/0) pro-mutantes (PM) pour le transgène K5-CreERT qui portent soit un allèle RXRaL2 et un allèle RXRa nul (génotype : K5-Cre-ERT(tg/0) /RXR[alpha]L2/-), soit deux allèles L2 (génotype K5-Cre-ERT(tg/0)/RXR[alpha]L2/L2). Des souris PM âgées de quatorze semaines ont été traitées au Tamoxifène (cinq jours, 1 mg/jour), puis traitées à nouveau deux, quatre et six semaines après. Six à douze
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semaines après le premier traitement au Tamoxifène ( AFT : After First Tamoxifen Treatment ), presque la totalité des allèles RXRaL2 (>80%) a été convertie en allèle RXRaL dans l'épiderme isolé de souris portant un allèle floxé (figure 1B, lignes 2,3, 5 et 6) ou deux allèles floxés (figure 1B, lignes 1 et 4).
Comme attendu (Indra et al. (1999) ), aucune excision n'est observée dans les souris traitées uniquement avec l'huile qui a servi à véhiculer le Tamoxifène ; l'excision médiée par la Cre de l'exon 4 de RXRa est en outre restreinte à la peau et à l'autres organes qui possèdent des épithelia dans lesquels le promoteur K5 est actif (c'est-à-dire : la langue, la glande salivaire, l'oesophage, figure 1C).
De manière intéressante, une perte de poil (alopécie) a été observée six à sept semaines après le premier traitement au Tamoxifène dans la région ventrale de la souris ; ceci n'a pas été observé chez les souris traitées avec de l'huile seule sans Tamoxifène, ou chez les souris contrôle de la même portée traitées au Tamoxifène (K5-Cre-ERT(tg/0) /RXR[alpha]L2/+).
Douze à seize semaines après la première injection, de larges régions ventrales et de plus petites régions dorsales de la peau de la souris avaient perdu leur poil (figure 2A et B) et des kystes qui s'agrandissent et qui apparaissent sur tout le corps avec le temps sont également visibles sous la surface de la peau (figure 2C).
Plus l'âge augmente (> vingt semaines après la première injection de Tamoxifène), des lésions
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mineures, qui ne sont pas causées par des combats, apparaissent dans des régions sans poil de la peau du dos, des joues et de la face postérieure des oreilles (figure 2D) .
Seize semaines après le premier traitement au Tamoxifène, l'histologie des régions ventrales et dorsales sans poil a montré une dégénérescence des follicules pileux résultant dans l'apparition d'utricules et de kystes dermiques (Sundberg et King, 1996) (figure 2- comparer E et F). L'épiderme interfolliculaire est hyperplastique avec une augmentation de l'incorporation de BrdU et une expression accrue du marqueur de prolifération Ki67.
La cellularité dermique est augmentée et les capillaires sont dilatés (comparer les figures 2E et 2G avec 2F et 2H) en dessous de l'épiderme épaissi, reflétant ainsi une réaction inflammatoire. La kératine 6 (K6), normalement exprimée de manière sélective dans la partie externe de la gaine de la racine du follicule pileux (ORS : Hair Follicle Outer Root Sheath) est également exprimée dans l'épiderme interfolliculaire hyperprolifératif (figure 21 et J), indiquant une anomalie de la différenciation terminale des kératinocytes (Porter et al., 1998). Toutes ces anomalies sont moins sévères et/ou apparaissent plus tardivement chez les mâles que chez les femelles.
Pour augmenter l'efficacité de la recombinaison médiée par la Cre et induite par le Tamoxifène, les inventeurs ont construit des lignées transgéniques de souris Kl4-Cre-ER T2 dans laquelle le promoteur K14 sélectif de la couche basale (Vassar et al., 1989) dirige l'expression de Cre-ERT2 dont l'activité peut
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être induite par un traitement plus doux au Tamoxifène (0,1 mg pendant cinq jours) (Indra et al., 1999).
Des souris K14-Cre-ERT2 (tg/0) /RXRaL2/L2 ont été traitées simultanément avec des souris contrôle K14-Cre-ERT2(tg/0)/RXR[alpha]l2/+, K14-Cre-ERT2(0/0) /RXRaL2/+ et k14-cRE-ert2(0/0)/rxr[alpha]l2/l2, provenant de la même portée.
En deux semaines, les allèles RXRaL2 ont été entièrement convertis en allèle rxr[alpha]l- dans l'épiderme (figure 1D, lignes 1 et 7), mais pas dans le derme (figure 1D, lignes 2 et 8) de souris transgéniques exprimant K14-Cre-ERT2, démontrant ainsi l'efficacité accrue de Cre-ERT2 pour médier, lors d'un traitement au Tamoxifène, la mutation somatique sélective de RXRa floxé dans l'épiderme.
Aucune conversion de L2 vers L- n'est apparue dans les contrôles dépourvus de transgène K14-Cre-ER T2 (figure 1D, lignes 5,6, 11 et 12) ou non traités au Tamoxifène (figure 1D, lignes 3,4, 9 et 10) . De plus, 8 semaines après le traitement au Tamoxifène, seul l'allèle RXRaL a été détecté dans l' épiderme de souris K14-Cre-ERT2(tg/0)/RXR[alpha]L2/L2 indiquant que RXRa a été excisé dans la plupart sinon toutes les cellules souches de l'épiderme. L'inactivation de RXRa apparaît également dans les autres epithélia d'autres organes dans lesquels le promoteur K14 est actif (Wang et al . , 1997) (c'est-à-dire la langue, l'#sophage, l'estomac).
A partir de 6 semaines après le début du traitement au Tamoxifène, les souris K14-Cre-
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ERT2(tg/0)/RXR[alpha]L2/L2 présentent des anomalies similaires à celles observées dans les souris K5-Cre- ERT(tg/0)/RXR[alpha]L2/L2 traitées au Tamoxifène, c' est-à-dire une perte de poil marquée avec des kystes visibles, tandis que des lésions focales visibles apparaissent à des étapes ultérieures (figure 2K et L).
Les anomalies histologiques dermique et épidermique sous-jacentes sont également similaires à celles observées ci-dessus pour les souris K5-Cre- ERT(tg/0)/RXR[alpha]L2/L2 traitées au Tamoxifène.
L'inactivation du RXRa floxé dans l'épiderme adulte est obtenue plus rapidement et avec des doses de Tamoxifène inférieures avec les souris K14-Cre-ERT2 qu'avec les souris K5-Cre-ERT, mais les anomalies résultantes de la peau sont finalement similaires, dans les deux cas, plus sévères chez les femelles que chez les mâles.
De manière intéressante, ces anomalies sont également similaires à celles observées dans les souris
Figure img00620001

K14-Cre (tg/0) i /RXR (IL2/L2 ou K14 -Cre (tg/0) /RXRaL2/- dans lesquelles les allèles RXR floxés sont sélectivement excisés dans l'épiderme durant le développement fétal, conduisant ainsi à une inactivation de RXRa dans les kératinocytes de l'épiderme et dans les gaines des racines des follicules pileux. En fait, à partir de l'âge de trois semaines, ces mutants RXRa "constitutifs" et spécifiques de l'épiderme développent une alopécie progressive avec des caractéristiques typiques de follicules pileux dégénérés, des utricules
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et des kystes dermiques, qui peuvent tous être attribués à des défauts dans le cycle du poil. De plus, ces mutants présentent également une hyperprolifération interfolliculaire des kératinocytes, ainsi qu'une différenciation terminale anormale (avec une expression de K6), et une augmentation de la cellularité dermique associée avec une réaction inflammatoire de la peau.
Bien que RXRp soit exprimée dans l'épiderme de la souris, la peau des mutants adultes RXRp apparaît normale (Kastner et al., 1996), suggérant ainsi des redondances fonctionnelles entre les différents RXR.
Comme attendu, des souris K5-Cre-ERT(tg/0) /RXR[alpha]L2/-/RXRss-/-
Figure img00630001

et K5-Cre-ER T(tg/O) /RXRa L2/L2 /RXRp -/- traitées avec de l'huile (sans Tamoxifène) ne présentent pas d'anomalies de la peau, alors qu'après un traitement au Tamoxifène, ces souris commencent à perdre leurs poils 4 semaines après le premier traitement au Tamoxifène tandis que de larges régions de la peau sont sans poil seize à dix- huit semaines après le début du traitement (comparer la figure 3A avec la figure 2D).
Des lésions focales de la peau qui n'étaient pas observées chez les mutants simples RXRa, sont également observées fréquemment chez les doubles mutants RXRa/p quatorze à seize semaines après le premier traitement au Tamoxifène. En particulier sur la peau sans poil du tronc, derrière les oreilles, et autour de la bouche (figure 3A) .
L'histologie de la peau sans poil montre une disparition des follicules pileux et la présence d'utriculi et de kystes dermiques (figure 3B).
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L'épiderme est hautement hyperplastique et hyperkératinisé (comparer les figures 3B et 3C avec les figures 2E et 2G, et figures 2F et 2H). Une expression anormale de K6 est observée à travers tout l'épiderme (figure 3D) et une réaction inflammatoire avec une augmentation de la cellularité est également observée (figure 3B). Dans la peau lésée, l'épiderme est couvert d'une croûte et davantage hyperplastique et hyperkératinisé. Les triples mutants K5-Cre-
Figure img00640001

ER T (tg/D) /RXRa L2/L2 /RXRI3 -/- /RXRy -/- ne révèlent pas de rôle additionnel de RXRy dans la peau adulte. Ainsi, RXRss peut partiellement compenser pour la perte de fonction de RXRa .
De manière intéressante, la redondance fonctionnelle est plus prononcée chez les mâles que chez les femelles, puisque les doubles mutants RXRa/RXRp mâles et femelles sont affectés de manière similaire à la différence des mutants simples.
Pris dans leur ensemble, les résultats précédents montrent l'efficacité des recombinases Cre-ERT, Cre-ERT2 et Cre-ERT3 (voir exemple 5 et figures 9,10 et 11) pour générer des mutations somatiques ciblées, spécifiques d'un type cellulaire et contrôlées temporellement, dans des tissus de souris adultes.
Les résultats précédents permettent également de démontrer l'utilisation de souris Cre-ERT-RXRfloxé pour analyser et étudier la fonction biologique complexe des différents sous-types de RXR (RXRa, RXRss, RXRy) dans un tissu particulier, c'est-à-dire l'épiderme.
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Cette étude a ainsi permis de révéler l'existence de redondances fonctionnelles entre RXRa et RXRp, bien que le rôle de RXRa soit clairement prépondérant.
Le mécanisme d'action des différents RXR dans les événements moléculaires qui conduisent à l'alopécie et aux anomalies des kératinocytes de l'épiderme déficients en récepteurs nucléaires RXR, demeure inconnu.
Néanmoins, leur rôle comme partenaires hétérodimériques d'un certain nombre de récepteurs nucléaires (par exemple RARS, TRs, VDR, PPAR) agissant comme des transducteurs du signal dans différentes voies de signalisation a été suggéré dans de nombreuses études in vitro utilisant des cellules en culture, et confirmé in vivo dans quelques cas en utilisant la mutagenèse ciblée (Chambon, 1996 ; Mascrez et al., 1998 ; Wendling et al., 1999). De manière intéressante, comme RXRa, VDR est exprimé dans les ORS du follicule pileux (Reichrath et al., 1994), et des souris dont les deux allèles du gène VDR sont inactifs (souris knockout VDR) développent une alopécie secondaire progressive, suggérant que VDR est impliqué dans le cycle du poil plutôt que dans la pousse primaire du poil (Yoshizawa et al., 1997 ; Li et al., 1997 ; Li et al., 1998).
De manière intéressante, les alopécies développées par les souris VDR-/- de quatorze semaines et les souris K5-Cre-ERT(tg/0)/RXR[alpha]L2/L2/RXRss-/- dix-huit semaines après leur traitement au Tamoxifène apparaissent très similaires, bien que la peau des souris VDR-/- ne
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présente pas les lésions observées sur l'épiderme des souris déficientes en RXR (comparer les figures 3A et 3E) .
Au niveau histologique, des utricules et des kystes dermiques similaires sont observés (comparer les figures 3B et 3F), mais aucune hyperprolifération des kératinocytes, ni de différenciation anormale révélée par l'expression de K6, n'est observée dans l'épiderme des souris VDR-/- (comparer figures 3C et 3D avec la figure 3G et 3H). Ainsi, l'alopécie générée par l'inactivation sélective de RXR dans les kératinocytes de la souris adulte révèlerait un rôle majeur des hétérodimères RXR/VDR dans le cycle du follicule pileux.
3) Deuxième exemple : Inactivation ciblée du gène SNF2ss dans l'épiderme de souris adulte.
Pour inactiver le gène SNF2ss dans l'épiderme de souris adulte, les inventeurs ont construit une souris portant des allèles SNF2(3 floxés (L2+ ; figure 4A) et ont utilisé la lignée de souris transgéniques K14-CreER T2 dans lesquelles le Tamoxifène induit efficacement la recombinaison médiée par la Cre dans les kératinocytes de la couche basale de l'épiderme. Des souris K14-Cre-ERT2(tg/0)/SNF2ssL2/L2 et K14-CreERT2(0/0)/SNF2ssL2/L2 de huit semaines ont été traitées au Tamoxifène pendant cinq jours à raison de 0,1 mg/jour ou avec de l'huile (-). Des biopsies de peau ont été prélevées, le derme et l'épiderme séparés, l'ADN
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génomique préparé, digéré par BamHI, séparé par électrophorèse sur gel d'agarose, et transféré sur des membranes de nylon qui furent hybridées avec la sonde 5' (figure 4A) radiomarquée. Les auto-radiographies correspondantes sont présentées figure 4B. En l'absence de Tamoxifène, aucune excision dans le gène SNF2(3 n'est observée que ce soit dans le derme ou l'épiderme de
Figure img00670001

souris K14-Cre-ERT2 (tg/o) SNF23L2/L2 . En revanche, l'injection de Tamoxifène chez ces mêmes souris induit l'excision du fragment floxé du gène SNF2(3 uniquement dans l'épiderme, car le promoteur K14 n'est actif que dans ce tissu et non pas dans le derme. Comme attendu, le Tamoxifène n'induit aucune excision dans des souris "contrôles" K14-Cre-ERT2(0/0)/SNF2ssL2/L2 dont les cellules ne contiennent pas de transgène Cre-ER T2 4) Troisième exemple : Inactivation ciblée du gène RXR[alpha] dans les adipocytes murins.
* Pour réaliser la mutagenèse site-spécifique contrôlée' de manière spatio-temporelle dans les adipocytes, les inventeurs ont créé des souris transgéniques appelées aP2-Cre-ER T2 exprimant la protéine de fusion Cre-ERT2 sous le contrôle du promoteur du gène codant pour la protéine adipose 2 (aP2) qui est actif spécifiquement dans les adipocytes.
(Ross et al., 1990).
Pour invalider le gène RXRa sélectivement dans les adipocytes, les souris aP2-Cre-ERT2 (tg/0) ont d'abord été
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croisées avec des souris RXR L2/+ pour produire des
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souris aP2-Cre-ERT2(tg/0)/RXR[alpha]L2/L2. Ces souris ont ensuite été croisées avec des souris RXRa+/ (Kastner et al., 1994) pour produire des souris aP2-Cre- ERT2(tg/0)/RXR[alpha]L2/-. De telles souris, âgées de quatre semaines, ont été traitées (+) ou non (-) au Tamoxifène (1 mg/jour) pendant cinq jours, et le tissu adipeux prélevé un mois après la dernière injection de Tamoxifène. L'ADN a été extrait du tissu adipeux, ou après séparation des adipocytes (adipocytes purifiés à 80%) du tissu conjonctif et vaisseaux sanguins (non adipocytes). L'ADN est ensuite digéré par BamHI, puis séparé par électrophorèse sur gel d'agarose, transféré sur des membranes de nylon, puis hybridé avec la sonde X4 radiomarquée. Les radiographies correspondantes sont présentées figure 5.
En absence de Tamoxifène, aucune excision dans le gène RXRa n'est observée que ce soit dans le tissu adipeux, les adipocytes, ou d'autres cellules non adipocytaires de l'épiderme de souris aP2-Cre- ERT2(tg/0)/RXR[alpha]L2/-. En revanche, l'injection de Tamoxifène chez ces mêmes souris induit l'excision du fragment floxé du gène RXRa uniquement dans les adipocytes purifiés et le tissu adipeux.
L'analyse du poids des animaux aP2-Cre-
Figure img00680001

ERT2 (tg/o) /RXRaL2/ et Ap2-Cre-ER T2 (tg/0) /RXRaL2/+ traités au Tarn (mutants; KO, et contrôles; CT, respectivement) et nourris avec une alimentation normale (AN), déterminé pendant 30 semaines, n'a révélé aucune différente significative entre les deux groupes d'animaux (Figure 6A). De plus, le poids du tissu adipeux, ainsi que la
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morphologie des adipocytes étaient similaires (Figure 6B et 6C). Par contre, le taux de glucose était anormalement élevé et les niveaux de triglycérides étaient plus faibles chez les animaux mutants (Figure 6D). En nourrissant les animaux contrôles traités au tamoxifène avec une alimentation riche en graisse et en glucose (AR) ceux-ci deviennent obèses (augmentation du poids, de la masse de tissu adipeux et hypertrophie des adipocytes) (Figures 6A-C). les niveaux de triglycérides et d'insuline sont également beaucoup plus élevés que chez les animaux nourris avec de l'AN.
Par contre, aucune augmentation de poids des animaux et de masse de tissu adipeux n'est observée chez les animaux mutés nourris avec AR. De plus les adipocytes ne sont pas hypertrophiques, et les niveaux de triglycérides et d'insuline sont similaires à ceux observés avec une AN.
Ces animaux mutants constituent donc des modèles intéressants pour étudier l'obésité et le diabète, ainsi que pour tester des traitements de ces maladies.
5) Quatrième exemple Inactivation ciblée du gène RXR[alpha] dans les hépatocytes murins.
Pour réaliser la mutagenèse site-spécifique contrôlée de manière spatio-temporelle dans le foie, les inventeurs ont créé des souris transgéniques appelées [alpha]AT-Cre-ERT exprimant la protéine de fusion Cre-ERTsous le contrôle du promoteur du gène de l'a-1-antitrypsine humaine qui est actif spécifiquement dans les hépatocytes (Imaï et al., 2000).
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Pour inactiver RXRa dans les hépatocytes murins, les inventeurs ont construit une souris portant des allèles RXRaL2 floxés (figure 1A) et ont utilisé la lignée de souris transgéniques [alpha]AT-Cre-ERT dans lesquelles le Tamoxifène (Tam) induit efficacement la recombinaison médiée par la Cre dans les hépatocytes (figure 7). Des souris [alpha]AT-Cre-ERT(tg/0) qui expriment Cre-ERT dans environ 50% des hépatocytes (Imaï et al.
2000) ont été croisées avec des souris RXR[alpha]L2/L2 pour produire des souris [alpha]AT-Cre-ERT(tg/0)/RXR[alpha]L2/L2. De telles souris, âgées de trois mois, ont été traitées au Tam (1 mg/jour) pendant cinq jours, et le c#ur et le foie prélevés sept jours après la première injection de Tam (jour 7), sur respectivement un et trois animaux. Le c#ur et le foie ont également été prélevés sur respectivement un et trois animaux du même génotype sans traitement au Tam (Jour 0). L'ADN a été extrait de ces tissus, et après digestion par BamHI, les allèles de RXRa ont été analysés par Southern blot.
Comme attendu, aucune excision n'est observée dans les cellules du c#ur des souris traitées au Tamoxifène (figure 7) ou le foie de souris non traitées au Tamoxifène (Jour 0). En revanche, au jour 7, les souris traitées au Tamoxifène présentent une excision dans le gène RXRa dans environ 50% des cellules de foie, ce qui correspond bien à l'expression en mosaïque de la protéine Cre-ERT dans les hépatocytes de la souris aAT- Cre-ERT .
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Par contre, 30 et 90 jours après le traitement au tamoxifène pratiquement plus de cellules RXRa nulles ne sont observées (Fig.8). De plus, les cellules RXR[alpha]L-/L- se multiplient beaucoup moins que les cellules RXRaL2/L2 après hépatectomie partielle (HP) réalisée sur des animaux mutants traités au tamoxifène (Fig 8, comparer les pistes 6-8 et les pistes 15-17). Ainsi, RXRa est impliqué dans la prolifération des hépatocytes.
6) Cinquième exemple : La recombinase Cre chimérique Cre-ERT3 est dix fois plus sensible au Tamoxifène que
T2
Cre-ER .
Dans le but d'augmenter la sensibilité de la recombinase chimérique Cre-ERT2 au Tam ou OHT, les inventeurs ont remplacé dans Cre-ERT2 la V400 par G (mutant Cre-ER M543A/L544A, appelé Cre-ERT3 ). Des souris transgéniques exprimant Cre-ERT3 sous le contrôle du promoteur K5 ont été obtenues, et une lignée exprimant la recombinase chimérique à des niveaux similaires à ceux détectés dans les lignées K5Cre-ERT et K5-Cre-ERT2 a été générée (voir figure 9, et résultats non présentés).
La sensibilité à l'OHT a été testée dans un premier temps en analysant la localisation intracellulaire des protéines chimériques. Alors qu'après un traitement par 0,1 mg d'OHT, Cre-ERT2 et Cre-ERT3 sont tous les deux localisés dans les noyaux cellulaires, Cre-ERT3 est présent dans une plus grande
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fraction de ceux-ci à des doses plus faibles de Tam ou d'OHT. A la dose de 0,001 mg, environ 1/3 des noyaux sont fortement marqués par des anticorps anti-Cre dans la couche basale de l'épiderme des souris K5-Cre-ERT3, alors qu'aucun noyau positif n'est observé dans la peau de souris K5-Cre-ERT2 (figure 10). Cette différence de sensibilité a également pu être visualisée en utilisant les souris reportrices RosaR26R (Rosafl/+) (Soriano, 1999). En effet, bien que les niveaux d'excisions induits par 1 et 0,1mg de OHT soient similaires dans les deux lignées, l'excision est nettement plus efficace dans les souris K5-Cre-ERT3 suite à des traitements par 0,01 et 0,001 mg de OHT, (figure 11).
Notez qu'en l'absence de traitement, aucune activité recombinase n'est détectée dans la lignée K5-Cre-ERT3.
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Claims (55)

REVENDICATIONS
1. Organisme métazoaire, à l'exception de l'homme, caractérisé en ce qu'au moins une cellule dudit organisme comprend au moins : (i) une protéine de fusion comprenant séquentiellement : - une protéine recombinase ; - une région charnière d'au moins 15 acides aminés ; - un polypeptide comprenant le domaine de liaison du ligand du récepteur nucléaire des #strogènes humains, ou du récepteur nucléaire des #strogènes des vertébrés, et leurs variants naturels ou l'un de leurs fragments, ledit polypeptide présentant au moins une mutation par rapport à la forme sauvage desdits domaines de liaison du ligand, ou de leurs variants naturels, ou de leurs fragments, ladite protéine de fusion ayant une activité recombinase négligeable, voire nulle, en présence de ligand naturel, et une activité recombinase induite par de faibles quantités de ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique ; (ii) une ou des séquence(s) d'ADN génique ou intergénique d'intérêt appartenant naturellement au génome dudit organisme dans laquelle (lesquelles) est(sont) inséré(s) un ou plusieurs site(s) de reconnaissance de ladite protéine recombinase, la ou lesdites séquence(s) d'ADI d'intérêt étant localisée(s) dans l'un OU
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plusieurs des chromosomes du génome de ladite cellule.
2. Organisme selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite protéine recombinase est sélectionnée de préférence dans le groupe des recombinases sites spécifiques composé de la recombinase Cre du bactériophage Pl, la recombinase FLP de Saccharomyces cerevisiae, la recombinase R de pSRl de Zygosaccharomyces rouxii, la recombinase A de pKDl de Kluyveromyces drosophilarium, la recombinase A de pKW1 de Kluyveromyces waltii, l'intégrase X Int, la recombinase du système de recombinaison GIN du phage Mu, de la recombinase bactérienne P, ou une variante de celles-ci.
3. Organisme selon la revendication 2, caractérisé en ce que la recombinase est la recombinase Cre du bactériophage P1 et ses variants naturels ou synthétiques.
4. Organisme selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que lesdits sites de reconnaissance spécifiques de ladite recombinase Cre sont choisis de préférence dans le groupe composé des séquences Lox P, Lox 66, Lox 71, Lox 511, Lox 512, Lox 514.
5. Organisme selon les revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite région charnière comprend tout ou partie de la région charnière D d'un récepteur nucléaire des #strogènes, région située entre le domaine de liaison à l'ADN et le domaine de liaison du
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ligand, soit un peptide fonctionnellement équivalent à ladite région charnière D.
6. Organisme selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite région charnière comprend les acides aminés 282 à 301 de la séquence SEQ ID N 2.
7. Organisme selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit polypeptide choisi parmi le domaine de liaison du ligand des récepteurs nucléaires des #strogènes humains ou ses variants naturels, ou l'un de leurs fragments est le domaine de liaison du ligand du récepteur nucléaire des #strogènes humain a ou ses variants naturels, ou l'un de leurs fragments et que ledit domaine de liaison du ligand ou l'un de ses variants naturels, ou l'un de leurs fragments présente au moins une mutation choisie dans le groupe : - mutation (G521R) glycine vers arginine en position 521 de la séquence SEQ ID N 2 ou d'un variant naturel de cette séquence; - mutation (G400V) glycine vers valine en position 400 de la séquence SEQ ID N 2 ou d'un variant naturel de cette séquence; - mutation (méthionine-leucine) vers (alaninealanine) situé en position 543-544 (mutation M543A/L544A) de la séquence SEQ ID N 2 ou d'un variant naturel de cette séquence.
8. Organisme selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite protéine de fusion est codée par un gène de
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fusion intégré dans un ou plusieurs des chromosomes de ladite cellule dudit organisme, ledit gène de fusion étant sous le contrôle d'éléments d'expression assurant son expression dans au moins une cellule dudit organisme.
9. Organisme selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ladite protéine de fusion est codée par un gène de fusion intégré dans un vecteur d'expression extrachromosomique, ledit gène de fusion étant sous le contrôle d'éléments d'expression assurant son expression dans au moins une cellule dudit organisme.
10. Organisme selon l'une des revendications 8 et 9, caractérisé en ce que lesdits éléments d'expression sont choisis parmi les éléments contrôlant l'expression tissus-spécifiques ou cellules-spécifiques et les éléments d'expression ubiquitaires.
11. Organisme selon les revendications 8 à 10, caractérisé en ce que lesdits éléments contrôlant l'expression sont choisis parmi les éléments contrôlant l'expression assurant une expression constitutive et les éléments contrôlant l'expression assurant une expression inductible.
12. Organisme selon les revendications 8 à 11, caractérisé en ce que ledit élément d'expression est choisi dans le groupe composé des promoteurs de la cytokératine 14 (K 14), de la cytokératine 5 (K 5), de la protéine adipose 2 (aP2) et de l'a-1-antitrypsine.
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13. Organisme selon l'une des revendications 8 à 12, caractérisé en ce que ledit gène de fusion de séquence SEQ ID N 3 code pour la protéine de fusion Cre-ERT de séquence SEQ ID N 4.
14. Organisme selon l'une quelconque des revendications 8 à 12, caractérisé en ce que ledit gène de fusion de séquence SEQ ID N 5 code pour la protéine de fusion Cre-ERT2 de séquence SEQ ID N 6.
15. Organisme selon l'une .quelconque des revendications 8 à 12, caractérisé en ce que ledit gène de fusion de séquence SEQ ID N 7 code pour la protéine de fusion Cre-ERT3 de séquence SEQ ID N 8.
16. Organisme selon les revendications 9 à 15, caractérisé en ce que ledit gène de fusion comprend de préférence dans le sens 5'# 3' : - un fragment d'ADN codant pour la recombinase Cre du bactériophage P1 ou l'un de ses variants ; - un fragment d'ADN d'au moins 45 nucléotides codant au moins soit pour tout ou partie de la région charnière
D d'un récepteur nucléaire des #strogènes, soit pour un peptide fonctionnellement équivalent à ladite région charnière D ; - un fragment d'ADN codant pour le domaine de liaison du ligand (LBD) d'un récepteur nucléaire des #strogènes, ou de leurs variants, ledit fragment d'ADN présentant au moins une mutation conférant au
LBD la capacité de répondre aux anti-#strogènes synthétiques mais non pas aux agonistes #strogéniques naturels.
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17. Organisme selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ladite protéine de fusion est introduite dans au moins une cellule dudit organisme.
18. Organisme selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que ledit ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique induisant l'activité de la recombinase est choisi dans le groupe composé du Tamoxifène, du 4hydroxyTamoxifène, de l'ICI 164 384 et de l'ICI 182 780.
19. Organisme selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite séquence d'ADN d'intérêt est un gène sélectionné dans le groupe composé de RXRa, RXRp, RXRY, RARa, RARss, RARy, SNF2p.
20. Organisme selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit organisme est un animal, notamment une souris.
21. Organisme selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'au moins une des cellules de ladite souris comprend : - un gène de fusion codant pour la protéine de fusion Cre-ER T de séquence SEQ ID N 4, ou Cre-ER T2 de séquence ID N 6, ou Cre-ERT3 de séquence ID N 8, ledit gène de fusion étant sous le contrôle du promoteur de la cytokératine K5 ;
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- une ou des séquences d'ADN chromosomique d'intérêt dans leur contexte chromatinien naturel et encadrée(s) de site lox ( floxées ).
22. Organisme selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'au moins une des cellules de ladite souris comprend : - un gène de fusion codant pour la protéine de fusion Cre-ERT de séquence SEQ ID N 4, ou Cre-ERT2 de séquence ID N 6, ou Cre-ERT3 de séquence ID N 8, ledit gène de fusion étant sous. le contrôle du promoteur de la cytokératine K14 ; - une ou des séquences d'ADN chromosomique d'intérêt dans leur contexte chromatinien naturel et encadrée (s) de site lox ( floxées ) .
23. Organisme selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'au moins une des cellules de ladite souris comprend : - un gène de fusion codant pour la protéine de fusion
Cre-ERT de séquence SEQ ID N 4, ou Cre-ERT2 de séquence ID N 6, ou Cre-ERT3 de séquence ID N 8, ledit gène de fusion étant sous le contrôle du promoteur de la protéine adipose 2 (aP2) ; - une ou des séquences d'ADN chromosomique d'intérêt dans leur contexte chromatinien naturel et encadrée (s) de site lox ( floxées ) .
24. Organisme selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'au moins une des cellules de ladite souris comprend :
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un gène de fusion codant pour la protéine de fusion Cre-ER de séquence SEQ ID N 4, ou Cre-ERT2 de séquence ID N 6, ou Cre-ERT3 de séquence ID N 8, ledit gène de fusion étant sous le contrôle du promoteur de l'a-1-antitrypsine. une ou des séquences d'ADN chromosomique d'intérêt dans leur contexte chromatinien naturel et encadrée(s) de site lox ( floxées ).
25. Procédé de préparation d'un organisme métazoaire selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) obtention d'une cellule souche embryonnaire (ES) modifiée par insertion de site(s) de reconnaissance de ladite protéine recombinase dans ladite (lesdites) séquence(s) d'ADN d'intérêt, localisées dans un ou plusieurs chromosomes, par recombinaison homologue ; b) introduction de ladite cellule souche embryonnaire modifiée dans un embryon dudit organisme ; c) développement dudit embryon jusqu'au stade d'un organisme adulte fertile ; d) croisement dudit organisme adulte fertile avec un organisme transgénique dont au moins une des cellules exprime ladite protéine de fusion et obtention des descendants issus dudit croisement ; et e) facultativement, sélection, parmi lesdits descendants, dudit organisme métazoaire.
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26. Procédé de préparation d'un organisme métazoaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 24, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Obtention d'une cellule somatique modifiée par insertion de site(s) de reconnaissance de ladite protéine recombinase dans ladite (lesdites) séquence(s) d'ADN d'intérêt localisée(s) dans un ou plusieurs chromosome(s), par recombinaison homologue ; b) transfert du noyau de ladite cellule somatique modifiée dans le cytoplasme d'un oocyte receveur énucléé ; c) développement de l'embryon obtenu à l'étape b) jusqu'au stade d'un organisme adulte fertile ; d) croisement dudit organisme adulte fertile avec un organisme transgénique dont au moins une des cellules exprime ladite protéine de fusion et obtention des descendants issus dudit croisement ; et e) facultativement, sélection, parmi les descendants dudit organisme métazoaire.
27. Procédé de préparation d'un organisme métazoaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 24, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) obtention d'une cellule souche embryonnaire (ES) modifiée par insertion de site(s) de reconnaissance de ladite protéine recombinase dans ladite (lesdites) séquence(s) d'ADN d'intérêt,
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localisée(s) dans un ou plusieurs chromosome(s), par recombinaison homologue ; b) introduction de ladite cellule souche embryonnaire modifiée dans un embryon dudit organisme ; c) développement dudit embryon ; et d) introduction de ladite protéine de fusion dans au moins une cellule dudit embryon ou de l'organisme issu du développement dudit embryon.
28. Procédé de préparation d'un organisme métazoaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 24, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Obtention d'une cellule somatique modifiée par insertion de site(s) de reconnaissance de ladite protéine recombinase dans ladite (lesdites) séquence(s) d'ADN d'intérêt localisée(s) dans un ou plusieurs chromosome(s), par recombinaison homologue ; b) transfert du noyau de ladite cellule somatique modifiée dans le cytoplasme d'un oocyte receveur énucléé ; c) développement dudit embryon ; et d) introduction de ladite protéine de fusion dans au moins une cellule dudit embryon ou dudit organisme issu du développement dudit embryon.
29. Procédé de recombinaison, notamment d'excision, d'insertion, d'inversion, de translocation, conditionnelle au niveau de la séquence d'ADN d'intérêt dans laquelle est(sont) inséré(s) un ou plusieurs sites de reconnaissance de ladite protéine recombinase,
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ladite séquence d'ADN d'intérêt étant localisée dans un ou plusieurs des chromosomes dudit génome de ladite cellule dudit organisme selon les revendications 1 à 24, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes de : (i) mise en présence d'au moins une cellule dudit organisme avec un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique ; (ii) induction de l'activité de la recombinase de ladite protéine de fusion par ledit ligand synthétique.
30. Procédé de délétion conditionnelle d'un fragment d'ADN dans lequel on met en #uvre un procédé d'excision selon la revendication 29 et dans lequel ledit(lesdits) fragment(s) d'ADN à exciser est(sont) encadré(s) par deux sites de reconnaissance de la protéine recombinase orientés en répétition directe.
31. Procédé d'obtention d'un organisme métazoaire, à l'exception de l'homme, dont au moins une cellule possède un allèle d'un gène d'intérêt inactivé par un procédé de délétion conditionnelle et dont l'autre allèle dudit gène d'intérêt possède une mutation, de préférence limitée, dans des séquences exoniques et/ou régulatrices, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il permet d'obtenir chez un organisme métazoaire des mutations somatiques contrôlées dans l'espace et le temps et qui soient limitées (mutations ponctuelles, petites délitions ou insertion) dans des séquences exoniques et/ou régulatrices, et en ce qu'il comprend les étapes de :
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29 ou 30 de délétion conditionnelle du fragment d'ADN dudit allèle dudit gène d'intérêt qui est encadré par au moins deux sites de reconnaissance de protéine recombinase orientés en répétition directe ; et e) obtention dudit organisme métazoaire dont le génome d'au moins une cellule comprend ledit gène d'intérêt dont un allèle est inactivé, tandis que l'autre allèle possède une mutation somatique de préférence limitée, et de préférence dans des séquences exoniques et/ou régulatrices.
a) obtention d'un organisme métazoaire dont au moins une cellule de la lignée germinale comporte ladite mutation dans un des allèles dudit gène d'intérêt ; b) croisement dudit organisme obtenu à l'étape a) avec un organisme selon l'une quelconque des revendications 1 à 24 ; c) sélection du descendant dont le génome comprend un gène d'intérêt dont un des allèles possède une mutation et l'autre allèle possède au moins deux sites de reconnaissance de protéines recombinases orientés en répétition directe d) mise en #uvre du procédé selon les revendications
32. Procédé selon l'une quelconque des revendications 29 à 31, caractérisé en ce que lesdits sites de reconnaissance spécifiques de la protéine recombinase sont les sites Lox P et ladite protéine recombinase est la protéine Cre du bactériophage Pl, ou l'un de ses variants.
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33. Organisme susceptible d'être obtenu par la mise en #uvre d'un procédé selon les revendications 25 à 32.
34. Organisme selon la revendication 33, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un animal, notamment d'une souris.
35. Procédé d'analyse ou d'étude de la fonction biologique d'une séquence d'ADN d'intérêt, notamment d'un gène, caractérisé en ce qu' il comporte les étapes de : (i) mise en présence d'un organisme selon l'une des revendications 1 à 24,33 et 34, ou de cellules isolées dudit organisme avec un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique ; (ii) facultativement l'induction de l'expression de ladite protéine de fusion ; (iii) mise en évidence de l'événement de recombinaison catalysé par l'activité recombinase de ladite protéine de fusion ; (iv) étude ou analyse biochimique, physiologique, phénotypique, comportementale, de ladite cellule ou dudit organisme.
36. Procédé selon les revendications 29,30, 31, 32 et 35, caractérisé en ce que la mise en présence desdites cellules dudit organisme avec ledit ligand synthétique se fait selon une voie d'administration choisie parmi la voie orale, la voie topique, l'injection, notamment l'injection intramusculaire, intraveineuse, intracérébrale, intrarachidienne,
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intrapéritonéale, ou encore dans le cas d'embryons, de f#tus et de nouveau-nés avant le sevrage par administration dudit ligand synthétique à la mère.
37. Procédé de criblage de composés susceptibles d'être utilisés comme médicament pour le traitement préventif et/ou curatif de pathologies associées à une altération de l'expression et/ou de la fonction de ladite séquence d'ADN d'intérêt caractérisé en ce qu'il comporte l'étape d'administration dudit composé dans un organisme selon les revendications 1 à 24,33 et 34.
38. Utilisation d'un organisme selon l'une quelconque des revendications 1 à 24,33 et 34 ou de cellules dérivées dudit organisme pour réaliser une recombinaison site-spécifique spatio-temporellement contrôlées de ladite séquence d'ADN d'intérêt dans son environnement chromatinien naturel, avec une efficacité d'au moins 85% en présence de ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique dans les cellules dudit organisme exprimant ladite protéine de fusion et avec une efficacité au moins inférieure à 5% en absence dudit ligand synthétique ou en présence de ligand naturel dans les cellules dudit organisme exprimant ladite protéine de fusion.
39. Utilisation selon la revendication 38, caractérisée en ce que lesdites cellules dudit organisme sont choisies parmi les cellules de l'épiderme, les hépatocytes, les adipocytes.
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40. Souris transgénique K5-Cre-ERT / RXR[alpha]L2/L2 dont le gène RXRa peut être sélectivement inactivé dans les kératinocytes de l'épiderme par la mise en #uvre d'un procédé de délétion conditionnelle suite à un traitement par un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique, entraînant chez ladite souris une alopécie, et/ou une hyperprolifération des kératinocytes et/ou une réaction inflammatoire de la peau.
41. Souris transgénique K5-Cre-ERT2 / RXRaL2/L2 dont le gène RXRa peut être sélectivement inactivé dans les kératinocytes de l'épiderme par la mise en #uvre d'un procédé de délétion conditionnelle suite à un traitement par un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique, entraînant chez ladite souris une alopécie, et/ou une hyperprolifération des kératinocytes et/ou une réaction inflammatoire de la peau.
42. Souris transgénique K5-Cre-ERT3 / RXRaL2/L2 dont le gène RXRa peut être sélectivement inactivé dans les kératinocytes de l'épiderme par la mise en #uvre d'un procédé de délétion conditionnelle suite à un traitement par un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique, entraînant chez ladite souris une alopécie, et/ou une hyperprolifération des kératinocytes et/ou une réaction inflammatoire de la peau.
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43. Souris transgénique K14-Cre-ERT / RXRaL2/L2 dont le gène RXR[alpha] peut être sélectivement inactivé dans les kératinocytes de l'épiderme par la mise en #uvre d'un procédé de délétion conditionnelle suite à un traitement par un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique, entraînant chez ladite souris une alopécie, et/ou une hyperprolifération des kératinocytes et/ou une réaction inflammatoire de la peau.
44. Souris transgénique K14-Cre-ERT2 RXRaL2/L2 dont le gène RXRa peut être sélectivement inactivé dans les kératinocytes de l'épiderme par la mise en #uvre d'un procédé de délétion conditionnelle suite à un traitement par un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique, entraînant chez ladite souris une alopécie, et/ou une hyperprolifération des kératinocytes et/ou une réaction inflammatoire de la peau.
45. Souris transgénique K14-Cre-ERT3 RXRaL2/L2 dont le gène RXRa peut être sélectivement inactivé dans les kératinocytes de l'épiderme par la mise en #uvre d'un procédé de délétion conditionnelle suite à un traitement par un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique, entraînant chez ladite souris une alopécie, et/ou une hyperprolifération des kératinocytes et/ou une réaction inflammatoire de la peau.
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46. Souris transgénique aAT-Cre-ER T / RXR[alpha]L2/L2 dont le gène RXRa peut être sélectivement inactivé dans les hépatocytes par la mise en #uvre d'un procédé de délétion conditionnelle suite à un traitement par un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique entraînant chez ladite souris notamment une altération de la prolifération des hépatocytes.
47. Souris transgénique aAT-Cre-ERT2 RXRaL2/L2 dont le gène RXR[alpha] peut être sélectivement inactivé dans les hépatocytes par la mise en #uvre d'un procédé de délétion conditionnelle suite à un traitement par un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique entraînant chez ladite souris notamment une altération de la prolifération des hépatocytes.
48. Souris transgénique aAT-Cre-ERT3 RXRaL2/L2 dont le gène RXRa peut être sélectivement inactivé dans les hépatocytes par la mise en #uvre d'un procédé de délétion conditionnelle suite à un traitement par un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique entraînant chez ladite souris notamment une altération de la prolifération des hépatocytes.
49. Souris transgénique aP2-Cre-ERT/ RXRaL2/L2 dont le gène RXRa peut être sélectivement inactivé dans les adipocytes par la mise en #uvre d'un procédé de délétion conditionnelle suite à un traitement par un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique
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entraînant chez ladite souris une altération du métabolisme des lipides dans les adipocytes et/ou un diabète.
50. Souris transgénique aP2-Cre-ERT2 RXRaL2/L2 dont le gène RXRa peut être sélectivement inactivé dans les adipocytes par la mise en #uvre d'un procédé de délétion conditionnelle suite à un traitement par un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique entraînant chez ladite souris une altération du métabolisme des lipides dans les adipocytes et/ou un diabète.
51. Souris transgénique aP2-Cre-ERT3 RXR[alpha]L2/L2 dont le gène RXR[alpha] peut être sélectivement inactivé dans les adipocytes par la mise en #uvre d'un procédé de délétion conditionnelle suite à un traitement par un ligand synthétique doté d'activité anti-#strogénique entraînant chez ladite souris une altération du métabolisme des lipides dans les adipocytes et/ou un diabète.
52. Souris transgénique selon l'une des revendications 40 à 51, caractérisée en ce que ledit gène RXRa est inactivé par la mise en #uvre d'un procédé selon la revendication 30.
53. Procédé de criblage de composés susceptibles d'être utilisés comme médicament pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie et/ou de
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l'hyperprolifération des kératinocytes et/ou des réactions inflammatoires de la peau, caractérisé en ce qu'il comporte l'étape d'administration dudit composé dans une souris selon les revendications 40 à 45 et 52.
54. Procédé de criblage de composés susceptibles d'être utilisés comme médicament pour favoriser notamment la régénération hépatique, caractérisé en ce qu'il comporte l'étape d'administration dudit composé dans une souris selon les revendications 46 à 48 et 52.
55. Procédé de criblage de composés susceptibles d'être utilisés comme médicament pour le traitement préventif et/ou curatif du diabète et/ou pour le traitement de l'obésité, caractérisé en ce qu'il comporte l'étape d'administration dudit composé dans une souris selon les revendications 49 à 52.
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