CN116042716A - 一种Cre重组酶调控系统及其应用 - Google Patents

一种Cre重组酶调控系统及其应用 Download PDF

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唐成程
孔雯婷
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Abstract

本发明公开了一种Cre重组酶调控系统及其应用，所述Cre重组酶调控系统包括ER50基因。本发明方案，通过引入4OHT诱导降解蛋白ER50构建得到Cre重组酶调控系统，本发明方案构建得到的Cre重组酶调控系统中，4OHT通过对ER50和ERT2的双重调控实现了对功能基因Cre功能更加严格的调控，降低了Cre系统背景问题。本系统的应用将为未来在细胞和动物上，进行更加严谨的基因表达时空调控，为未来细胞和动物内基因的条件性敲除提供了更为可靠的研究工具。

Description

一种Cre重组酶调控系统及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种Cre重组酶调控系统及其应用。
背景技术
条件性基因(Conditional Gene Knockout)敲除作为基因功能获得性研究的新型手段，通过将某个基因的表达限制在特定的细胞组织或发育阶段，从而实现对小鼠基因组的时空特异性修饰。CKO技术主要是通过如Cre-LoxP系统、FLP-Frt系统等特异性重组酶系统等来实现时空特异性基因敲除。其中Cre-LoxP系统是最广泛使用的条件性基因敲除系统，通过结合Cre重组酶系统和诱导型基因表达控制系统来实现基因编辑。将LoxP序列插入目标基因DNA序列的两端，可获得含有两个LoxP位点的突变体小鼠。当这些小鼠与Cre重组酶小鼠杂交时，就可获得条性基因敲除小鼠。该小鼠模型是遗传研究的一个重要工具。
传统的基因敲除技术是对机体内的靶基因进行全部敲除，虽然为研究基因的功能提供了很大的便利，但是也存在严重缺陷，如基因敲除导致发育缺陷或胚胎早期的致死性阻止了进一步研究，或者基因在多个组织敲除后带来的敲除效应复杂性。导致无法确定目的基因准确的作用位点及功能，分析发育后期基因实际的功能作用。而相比传统的基因敲除技术，条件性基因敲除具有时空可控性，可在诱导剂或基因作用下对体内特定部位中的目标基因进行条件性敲除，从而解决了基因被完全敲除后出现的胚胎致死，或生物体不能正常生长发育等基因等难题，将多功能基因敲除模型与不同工具小鼠搭配使用，可以对目的基因在不同组织器官中对生长发育、疾病的发生的影响，以及治疗过程中的作用效果及其机制进行全面研究，突破了以往进行基因编辑的局限性，为探讨基因的功能作用及致病机制提供了更好的模型。
由于分子生物学的迅速发展以及生命科学研究技术的不断进步，基因敲除技术被广泛用于基础实验研究且与人类生活密切相关。基因敲除作为一种新型分子生物学技术，通过应用DNA重组原理，编辑基因片段使机体内目的基因失活或者缺失。Cre-LoxP系统作为一种高效性和强特异性重组酶技术，满足了通过调控某一基因在特定的部位及时间内的表达，从而实现体内基因功能研究的强烈需求。它可以在特定的发育阶段或特定的组织细胞中诱导目标基因失活，有条件地进行基因编辑，从而避免目标基因缺失造成的发育早期胚胎死亡及基因的复杂表达的风险。基因编辑技术发展过程中的特异性操作难题，都可以通过应用Cre重组酶系统来解决。通过删除筛选目的基因，对目标基因功能进行全面性分析，有利于实现对功能基因和疾病基因的深入研究。国际上对动物转基因方面的工作均已取得明显成效，Cre-LoxP条件性敲除小鼠也因其良好的实验效果而成为许多基础研究的选择。为实现人类动物疾病模型的建立，基因功能的鉴定，病毒发病机制及抗病毒免疫研究等方面的应用提供了关键技术支持。
Cre重组酶调控系统作为实现特异性靶基因敲除的重要手段，是研究某一基因在特定组织、特定时间中表达的情况的关键性基因操作工具。目前应用最为广泛的Cre-loxP重组调控系统为Cre-ERT2(CE)或ERT2-Cre-ERT2(ECE)。在没有4羟基他莫昔芬(4OHT)条件下，使Cre重组酶与雌激素受体组成的融合蛋白处于细胞质，不会对基因组LoxP位点序列进行重组；而在有4羟基他莫昔芬(4OHT)的细胞中，Cre重组酶进入细胞核，识别LoxP位点并进行重组。但由于Cre-loxP重组调控系统存在着Cre重组酶调控不严谨，特异性定位作用不明显、效率低等问题。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种Cre重组酶调控系统。
本发明还提出Cre重组酶调控系统的应用。
根据本发明的第一方面，提出了一种Cre重组酶调控系统，所述Cre重组酶调控系统包括ER50基因。
在本发明的一些实施方式中，所述ER50基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一些实施方式中，所述Cre重组酶调控系统为严谨型Cre重组酶调控系统。
在本发明的一些实施方式中，所述Cre重组酶调控系统还包括ERT2基因。
在本发明的一些实施方式中，所述Cre重组酶调控系统上依次包括下述功能元件：可诱导启动子、ER50、Cre重组酶的核苷酸序列、ERT2、sgRNA序列，其中，ERT2序列和Cre重组酶顺序可互换；sgRNA序列靶向目的基因。
在本发明的一些实施方式中，所述Cre重组酶调控系统上依次包括下述功能元件：可诱导启动子、ER50、ERT2、Cre重组酶、ERT2、sgRNA序列，其中，ERT2序列和Cre重组酶顺序可互换；sgRNA序列靶向目的基因。
在本发明的一些实施方式中，所述可诱导启动子包括EFS启动子、Mx1或TRE启动子。
在本发明的一些实施方式中，所述可诱导启动子后还包括荧光基因。
在本发明的一些实施方式中，所述荧光序列为EGFP基因。
在本发明的一些实施方式中，ERT2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一些实施方式中，所述Cre重组酶包括Escherichia virus P1 Cre重组酶，Sphingomonas sp.ERG5Cre重组酶或Salmonella phage SJ46 Cre重组酶。
在本发明的一些实施方式中，所述Cre重组酶的编码序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一些实施方式中，所述sgRNA序列前还包括组成型启动子，所述组成型启动子包括CMV、MSCV或U6启动子。
在本发明的一些实施方式中，所述sgRNA序列为靶向p53基因和/或RB1基因的sgRNA序列。
在本发明的一些实施方式中，所述靶向p53基因的sgRNA序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一些实施方式中，所述靶向RB1基因的sgRNA序列如SEQ ID NO.5所示。
根据本发明的第二方面，提出了一种含有上述Cre重组酶调控系统的细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述细胞包括人细胞、非人哺乳动物细胞和干细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述非人哺乳动物细胞包括小鼠细胞。
根据本发明的第三方面，提出了一种含有上述Cre重组酶调控系统的试剂盒。
根据本发明的第四方面，提出了上述Cre重组酶调控系统、细胞、药物和试剂盒的应用，所述应用为在制备修饰基因或调节基因表达的产品中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述产品包括药品。
在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备药物调控系统中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备基因敲除研究工具中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述基因敲除研究工具为可用于CRISPR/CAS9的基因敲除研究工具。
根据本发明的一些实施方式，至少具有以下有益效果：本发明方案的通过引入4OHT诱导降解蛋白ER50构建得到Cre重组酶调控系统，本发明方案构建得到的Cre重组酶调控系统中，4OHT通过对ER50和ERT2的双重调控实现了对功能基因Cre功能更加严格的调控，降低了Cre系统背景问题。本系统的应用将为未来在细胞和动物上，进行更加严谨的基因表达时空调控，为未来细胞和动物内基因的条件性敲除提供了更为可靠的研究工具。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明测试例中的Cre重组酶调控系统的载体示意图；
图2为本发明测试例中的EGFP荧光定位检测结果图；
图3为本发明测试例中的PB-CMV-L-Cherry-L-EGFP载体示意图；
图4为本发明测试例中的荧光报告细胞表达情况检测结果图；
图5为本发明测试例中的LRLG单克隆细胞形态图；
图6为本发明测试例中的载体结构示意图；
图7为本发明测试例中的Cre重组系统报告细胞的工作原理图；
图8为本发明测试例中的流式检测结果图；
图9为本发明测试例中的红色荧光基因编辑工具小鼠的工作原理图；
图10为本发明测试例中的载体结构示意图；
图11为本发明测试例中的不同组合电转mNSC后tdTomato的表达结果图；
图12为本发明测试例中的不同组合电转MEF后tdTomato的表达结果图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明实施例1-21中的质粒均通过金维智生物科技有限公司进行基因合成获得。
实施例1
本实施例制备了一种Cre重组酶调控系统，命名为质粒PB-EFS-GC。原载体为PB载体(一种piggybac转座子载体，由中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学课题组惠赠)。EFS-GC序列包括依次连接的EFS启动子、绿色荧光蛋白EGFP和Cre重组酶，通过基因合成(金维智生物科技有限公司)获得，并通过酶切连接方法插入PB载体转座元件内。
EFS启动子序列：
GGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGATCCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAG(SEQ IDNO.6)。
EGFP基因核苷酸序列：
ATGGTAAGCAAAGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG(SEQ ID NO.22)。
CRE重组酶的核苷酸序列：
TCCAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGCATTGCCAGTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCGCAAGAACCTGATGGACATGTTCAGGGATCGCCAGGCGTTTTCTGAGCATACCTGGAAAATGCTTCTGTCCGTTTGCCGGTCGTGGGCGGCATGGTGCAAGTTGAATAACCGGAAATGGTTTCCCGCAGAACCTGAAGATGTTCGCGATTATCTTCTATATCTTCAGGCGCGCGGTCTGGCAGTAAAAACTATCCAGCAACATTTGGGCCAGCTAAACATGCTTCATCGTCGGTCCGGGCTGCCACGACCAAGTGACAGCAATGCTGTTTCACTGGTTATGCGGCGGATCCGAAAAGAAAACGTTGATGCCGGTGAACGTGCAAAACAGGCTCTAGCGTTCGAACGCACTGATTTCGACCAGGTTCGTTCACTCATGGAAAATAGCGATCGCTGCCAGGATATACGTAATCTGGCATTTCTGGGGATTGCTTATAACACCCTGTTACGTATAGCCGAAATTGCCAGGATCAGGGTTAAAGATATCTCACGTACTGACGGTGGGAGAATGTTAATCCATATTGGCAGAACGAAAACGCTGGTTAGCACCGCAGGTGTAGAGAAGGCACTTAGCCTGGGGGTAACTAAACTGGTCGAGCGATGGATTTCCGTCTCTGGTGTAGCTGATGATCCGAATAACTACCTGTTTTGCCGGGTCAGAAAAAATGGTGTTGCCGCGCCATCTGCCACCAGCCAGCTATCAACTCGCGCCCTGGAAGGGATTTTTGAAGCAACTCATCGATTGATTTACGGCGCTAAGGATGACTCTGGTCAGAGATACCTGGCCTGGTCTGGACACAGTGCCCGTGTCGGAGCCGCGCGAGATATGGCCCGCGCTGGAGTTTCAATACCGGAGATCATGCAAGCTGGTGGCTGGACCAATGTAAATATTGTCATGAACTATATCCGTAACCTGGATAGTGAAACAGGGGCAATGGTGCGCCTGCTGGAAGATGGCGAT(SEQ ID NO.3)。
实施例2
本实施例制备了一种Cre重组酶调控系统，命名为质粒PB-EFS-GCE，包括依次连接的EFS启动子、绿色荧光蛋白EGFP、Cre重组酶和雌激素受体(estrogen receptor，ER)的配体结合区突变体(ERT2)。
ERT2的核苷酸序列：
GCTGGAGACATGAGAGCTGCCAACCTTTGGCCAAGCCCGCTCATGATCAAACGCTCTAAGAAGAACAGCCTGGCCTTGTCCCTGACGGCCGACCAGATGGTCAGTGCCTTGTTGGATGCTGAGCCCCCCATACTCTATTCCGAGTATGATCCTACCAGACCCTTCAGTGAAGCTTCGATGATGGGCTTACTGACCAACCTGGCAGACAGGGAGCTGGTTCACATGATCAACTGGGCGAAGAGGGTGCCAGGCTTTGTGGATTTGACCCTCCATGATCAGGTCCACCTTCTAGAATGTGCCTGGCTAGAGATCCTGATGATTGGTCTCGTCTGGCGCTCCATGGAGCACCCAGTGAAGCTACTGTTTGCTCCTAACTTGCTCTTGGACAGGAACCAGGGAAAATGTGTAGAGGGCATGGTGGAGATCTTCGACATGCTGCTGGCTACATCATCTCGGTTCCGCATGATGAATCTGCAGGGAGAGGAGTTTGTGTGCCTCAAATCTATTATTTTGCTTAATTCTGGAGTGTACACATTTCTGTCCAGCACCCTGAAGTCTCTGGAAGAGAAGGACCATATCCACCGAGTCCTGGACAAGATCACAGACACTTTGATCCACCTGATGGCCAAGGCAGGCCTGACCCTGCAGCAGCAGCACCAGCGGCTGGCCCAGCTCCTCCTCATCCTCTCCCACATCAGGCACATGAGTAACAAAGGCATGGAGCATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCCCTCTATGACCTGCTGCTGGAGGCGGCGGACGCCCACCGCCTACATGCGCCCACTAGCCGTGGAGGGGCATCCGTGGAGGAGACGGACCAAAGCCACTTGGCCACTGCGGGCTCTACTTCATCGCATTCCTTGCAAAAGTATTACATCACGGGGGAGGCAGAGGGTTTCCCTGCCACA(SEQ ID NO.2)。
基因序列(EGFP到ERT2核苷酸序列):
ATGGTAAGCAAAGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGTTAACGGCGGTAGCGTGTCCAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGCATTGCCAGTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCGCAAGAACCTGATGGACATGTTCAGGGATCGCCAGGCGTTTTCTGAGCATACCTGGAAAATGCTTCTGTCCGTTTGCCGGTCGTGGGCGGCATGGTGCAAGTTGAATAACCGGAAATGGTTTCCCGCAGAACCTGAAGATGTTCGCGATTATCTTCTATATCTTCAGGCGCGCGGTCTGGCAGTAAAAACTATCCAGCAACATTTGGGCCAGCTAAACATGCTTCATCGTCGGTCCGGGCTGCCACGACCAAGTGACAGCAATGCTGTTTCACTGGTTATGCGGCGGATCCGAAAAGAAAACGTTGATGCCGGTGAACGTGCAAAACAGGCTCTAGCGTTCGAACGCACTGATTTCGACCAGGTTCGTTCACTCATGGAAAATAGCGATCGCTGCCAGGATATACGTAATCTGGCATTTCTGGGGATTGCTTATAACACCCTGTTACGTATAGCCGAAATTGCCAGGATCAGGGTTAAAGATATCTCACGTACTGACGGTGGGAGAATGTTAATCCATATTGGCAGAACGAAAACGCTGGTTAGCACCGCAGGTGTAGAGAAGGCACTTAGCCTGGGGGTAACTAAACTGGTCGAGCGATGGATTTCCGTCTCTGGTGTAGCTGATGATCCGAATAACTACCTGTTTTGCCGGGTCAGAAAAAATGGTGTTGCCGCGCCATCTGCCACCAGCCAGCTATCAACTCGCGCCCTGGAAGGGATTTTTGAAGCAACTCATCGATTGATTTACGGCGCTAAGGATGACTCTGGTCAGAGATACCTGGCCTGGTCTGGACACAGTGCCCGTGTCGGAGCCGCGCGAGATATGGCCCGCGCTGGAGTTTCAATACCGGAGATCATGCAAGCTGGTGGCTGGACCAATGTAAATATTGTCATGAACTATATCCGTAACCTGGATAGTGAAACAGGGGCAATGGTGCGCCTGCTGGAAGATGGCGATCTCGAGCCATCTGCTGGAGACATGAGAGCTGCCAACCTTTGGCCAAGCCCGCTCATGATCAAACGCTCTAAGAAGAACAGCCTGGCCTTGTCCCTGACGGCCGACCAGATGGTCAGTGCCTTGTTGGATGCTGAGCCCCCCATACTCTATTCCGAGTATGATCCTACCAGACCCTTCAGTGAAGCTTCGATGATGGGCTTACTGACCAACCTGGCAGACAGGGAGCTGGTTCACATGATCAACTGGGCGAAGAGGGTGCCAGGCTTTGTGGATTTGACCCTCCATGATCAGGTCCACCTTCTAGAATGTGCCTGGCTAGAGATCCTGATGATTGGTCTCGTCTGGCGCTCCATGGAGCACCCAGTGAAGCTACTGTTTGCTCCTAACTTGCTCTTGGACAGGAACCAGGGAAAATGTGTAGAGGGCATGGTGGAGATCTTCGACATGCTGCTGGCTACATCATCTCGGTTCCGCATGATGAATCTGCAGGGAGAGGAGTTTGTGTGCCTCAAATCTATTATTTTGCTTAATTCTGGAGTGTACACATTTCTGTCCAGCACCCTGAAGTCTCTGGAAGAGAAGGACCATATCCACCGAGTCCTGGACAAGATCACAGACACTTTGATCCACCTGATGGCCAAGGCAGGCCTGACCCTGCAGCAGCAGCACCAGCGGCTGGCCCAGCTCCTCCTCATCCTCTCCCACATCAGGCACATGAGTAACAAAGGCATGGAGCATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCCCTCTATGACCTGCTGCTGGAGGCGGCGGACGCCCACCGCCTACATGCGCCCACTAGCCGTGGAGGGGCATCCGTGGAGGAGACGGACCAAAGCCACTTGGCCACTGCGGGCTCTACTTCATCGCATTCCTTGCAAAAGTATTACATCACGGGGGAGGCAGAGGGTTTCCCTGCCACA-3’(SEQ ID NO.7)。
实施例3
本实施例制备了一种Cre重组酶调控系统，命名为质粒PB-EFS-GECE，包括依次连接的EFS启动子、绿色荧光蛋白EGFP、ERT2、Cre重组酶和ERT2。
基因序列(EGFP到ERT2核苷酸序列):
ATGGTAAGCAAAGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGTTGGAGGCGGATCTGCTGGAGACATGAGAGCTGCCAACCTTTGGCCAAGCCCGCTCATGATCAAACGCTCTAAGAAGAACAGCCTGGCCTTGTCCCTGACGGCCGACCAGATGGTCAGTGCCTTGTTGGATGCTGAGCCCCCCATACTCTATTCCGAGTATGATCCTACCAGACCCTTCAGTGAAGCTTCGATGATGGGCTTACTGACCAACCTGGCAGACAGGGAGCTGGTTCACATGATCAACTGGGCGAAGAGGGTGCCAGGCTTTGTGGATTTGACCCTCCATGATCAGGTCCACCTTCTAGAATGTGCCTGGCTAGAGATCCTGATGATTGGTCTCGTCTGGCGCTCCATGGAGCACCCAGTGAAGCTACTGTTTGCTCCTAACTTGCTCTTGGACAGGAACCAGGGAAAATGTGTAGAGGGCATGGTGGAGATCTTCGACATGCTGCTGGCTACATCATCTCGGTTCCGCATGATGAATCTGCAGGGAGAGGAGTTTGTGTGCCTCAAATCTATTATTTTGCTTAATTCTGGAGTGTACACATTTCTGTCCAGCACCCTGAAGTCTCTGGAAGAGAAGGACCATATCCACCGAGTCCTGGACAAGATCACAGACACTTTGATCCACCTGATGGCCAAGGCAGGCCTGACCCTGCAGCAGCAGCACCAGCGGCTGGCCCAGCTCCTCCTCATCCTCTCCCACATCAGGCACATGAGTAACAAAGGCATGGAGCATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCCCTCTATGACCTGCTGCTGGAGGCGGCGGACGCCCACCGCCTACATGCGCCCACTAGCCGTGGAGGGGCATCCGTGGAGGAGACGGACCAAAGCCACTTGGCCACTGCGGGCTCTACTTCATCGCATTCCTTGCAAAAGTATTACATCACGGGGGAGGCAGAGGGTTTCCCTGCCACAGGATCTGGTAGCAACGGCGGTAGCGTGTCCAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGCATTGCCAGTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCGCAAGAACCTGATGGACATGTTCAGGGATCGCCAGGCGTTTTCTGAGCATACCTGGAAAATGCTTCTGTCCGTTTGCCGGTCGTGGGCGGCATGGTGCAAGTTGAATAACCGGAAATGGTTTCCCGCAGAACCTGAAGATGTTCGCGATTATCTTCTATATCTTCAGGCGCGCGGTCTGGCAGTAAAAACTATCCAGCAACATTTGGGCCAGCTAAACATGCTTCATCGTCGGTCCGGGCTGCCACGACCAAGTGACAGCAATGCTGTTTCACTGGTTATGCGGCGGATCCGAAAAGAAAACGTTGATGCCGGTGAACGTGCAAAACAGGCTCTAGCGTTCGAACGCACTGATTTCGACCAGGTTCGTTCACTCATGGAAAATAGCGATCGCTGCCAGGATATACGTAATCTGGCATTTCTGGGGATTGCTTATAACACCCTGTTACGTATAGCCGAAATTGCCAGGATCAGGGTTAAAGATATCTCACGTACTGACGGTGGGAGAATGTTAATCCATATTGGCAGAACGAAAACGCTGGTTAGCACCGCAGGTGTAGAGAAGGCACTTAGCCTGGGGGTAACTAAACTGGTCGAGCGATGGATTTCCGTCTCTGGTGTAGCTGATGATCCGAATAACTACCTGTTTTGCCGGGTCAGAAAAAATGGTGTTGCCGCGCCATCTGCCACCAGCCAGCTATCAACTCGCGCCCTGGAAGGGATTTTTGAAGCAACTCATCGATTGATTTACGGCGCTAAGGATGACTCTGGTCAGAGATACCTGGCCTGGTCTGGACACAGTGCCCGTGTCGGAGCCGCGCGAGATATGGCCCGCGCTGGAGTTTCAATACCGGAGATCATGCAAGCTGGTGGCTGGACCAATGTAAATATTGTCATGAACTATATCCGTAACCTGGATAGTGAAACAGGGGCAATGGTGCGCCTGCTGGAAGATGGCGATCTCGAGCCATCTGCTGGAGACATGAGAGCTGCCAACCTTTGGCCAAGCCCGCTCATGATCAAACGCTCTAAGAAGAACAGCCTGGCCTTGTCCCTGACGGCCGACCAGATGGTCAGTGCCTTGTTGGATGCTGAGCCCCCCATACTCTATTCCGAGTATGATCCTACCAGACCCTTCAGTGAAGCTTCGATGATGGGCTTACTGACCAACCTGGCAGACAGGGAGCTGGTTCACATGATCAACTGGGCGAAGAGGGTGCCAGGCTTTGTGGATTTGACCCTCCATGATCAGGTCCACCTTCTAGAATGTGCCTGGCTAGAGATCCTGATGATTGGTCTCGTCTGGCGCTCCATGGAGCACCCAGTGAAGCTACTGTTTGCTCCTAACTTGCTCTTGGACAGGAACCAGGGAAAATGTGTAGAGGGCATGGTGGAGATCTTCGACATGCTGCTGGCTACATCATCTCGGTTCCGCATGATGAATCTGCAGGGAGAGGAGTTTGTGTGCCTCAAATCTATTATTTTGCTTAATTCTGGAGTGTACACATTTCTGTCCAGCACCCTGAAGTCTCTGGAAGAGAAGGACCATATCCACCGAGTCCTGGACAAGATCACAGACACTTTGATCCACCTGATGGCCAAGGCAGGCCTGACCCTGCAGCAGCAGCACCAGCGGCTGGCCCAGCTCCTCCTCATCCTCTCCCACATCAGGCACATGAGTAACAAAGGCATGGAGCATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCCCTCTATGACCTGCTGCTGGAGGCGGCGGACGCCCACCGCCTACATGCGCCCACTAGCCGTGGAGGGGCATCCGTGGAGGAGACGGACCAAAGCCACTTGGCCACTGCGGGCTCTACTTCATCGCATTCCTTGCAAAAGTATTACATCACGGGGGAGGCAGAGGGTTTCCCTGCCACA(SEQ ID NO.8)。
实施例4
本实施例制备了一种Cre重组酶调控系统，命名为质粒PB-EFS-50GC，包括依次连接的EFS启动子、雌激素受体(ER50)、绿色荧光蛋白EGFP和Cre重组酶。
ER50的核苷酸序列：
ATGAGCCTTGCCCTGTCACTTACAGCCGACCAGATGGTTTCCGCGCTTCTCGACGCTGAACCTCCAATTCTCTATTCCGAATACGACCCAACCAGGCCGTTCTCCGAGGCATCTATGATGGGTCTGCTGACAAATCTGGCAGACAGGGAACTGGTGCACATGATCAACTGGGCGAAGCGCGTACCCGGATTCGTCGATCTTGCACTCCATGATCAGGTGCACTTGCTGGAGTGCGCTTGGATGGAGATCCTCATGATCGGGCTGGTGTGGCGGAGTATGGAACACCCCGGCAAGTTGCTGTTTGCGCCTAACCTCCTGTTGGACAGGAACCAGGGGAAATGTGTGGAGGGCGGTGTGGAAATCTTTGACATGCTCCTCGCTACCTCAAGCCGGTTTAGGATGATGAATCTGCAAGGCGAAGAGTTCGTGTGTCTCAAATCTATCATACTGTTGAACAGCGGAGTCTACACCTTCCTCTCCAGCACTCTGAAATCTCTGGAGGAGAAAGATCATATCCATCGCGTGCTGGACAAGATAACCGACACGTTGATTCACTTGATGGCCAAAGCTGGGCTCACTCTGCAACAACAACATCAGCGACTGGCACAGCTGTTGCTGATTTTGAGCCACATTCGGCACATGTCCAGCAAGAGAATGGAGCACCTCTATAGTATGAAGTGCAAGAACGTCGTACCCCTGTCTGATCTGCTTCTTGAAATGCTTGATGCCCACCGGCTG(SEQ ID NO.1)。
从ER50到Cre核苷酸序列:
ATGAGCCTTGCCCTGTCACTTACAGCCGACCAGATGGTTTCCGCGCTTCTCGACGCTGAACCTCCAATTCTCTATTCCGAATACGACCCAACCAGGCCGTTCTCCGAGGCATCTATGATGGGTCTGCTGACAAATCTGGCAGACAGGGAACTGGTGCACATGATCAACTGGGCGAAGCGCGTACCCGGATTCGTCGATCTTGCACTCCATGATCAGGTGCACTTGCTGGAGTGCGCTTGGATGGAGATCCTCATGATCGGGCTGGTGTGGCGGAGTATGGAACACCCCGGCAAGTTGCTGTTTGCGCCTAACCTCCTGTTGGACAGGAACCAGGGGAAATGTGTGGAGGGCGGTGTGGAAATCTTTGACATGCTCCTCGCTACCTCAAGCCGGTTTAGGATGATGAATCTGCAAGGCGAAGAGTTCGTGTGTCTCAAATCTATCATACTGTTGAACAGCGGAGTCTACACCTTCCTCTCCAGCACTCTGAAATCTCTGGAGGAGAAAGATCATATCCATCGCGTGCTGGACAAGATAACCGACACGTTGATTCACTTGATGGCCAAAGCTGGGCTCACTCTGCAACAACAACATCAGCGACTGGCACAGCTGTTGCTGATTTTGAGCCACATTCGGCACATGTCCAGCAAGAGAATGGAGCACCTCTATAGTATGAAGTGCAAGAACGTCGTACCCCTGTCTGATCTGCTTCTTGAAATGCTTGATGCCCACCGGCTGGGATCTGGTAGCGGACATATGGTAAGCAAAGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGTTAACGGCGGTAGCGTGTCCAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGCATTGCCAGTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCGCAAGAACCTGATGGACATGTTCAGGGATCGCCAGGCGTTTTCTGAGCATACCTGGAAAATGCTTCTGTCCGTTTGCCGGTCGTGGGCGGCATGGTGCAAGTTGAATAACCGGAAATGGTTTCCCGCAGAACCTGAAGATGTTCGCGATTATCTTCTATATCTTCAGGCGCGCGGTCTGGCAGTAAAAACTATCCAGCAACATTTGGGCCAGCTAAACATGCTTCATCGTCGGTCCGGGCTGCCACGACCAAGTGACAGCAATGCTGTTTCACTGGTTATGCGGCGGATCCGAAAAGAAAACGTTGATGCCGGTGAACGTGCAAAACAGGCTCTAGCGTTCGAACGCACTGATTTCGACCAGGTTCGTTCACTCATGGAAAATAGCGATCGCTGCCAGGATATACGTAATCTGGCATTTCTGGGGATTGCTTATAACACCCTGTTACGTATAGCCGAAATTGCCAGGATCAGGGTTAAAGATATCTCACGTACTGACGGTGGGAGAATGTTAATCCATATTGGCAGAACGAAAACGCTGGTTAGCACCGCAGGTGTAGAGAAGGCACTTAGCCTGGGGGTAACTAAACTGGTCGAGCGATGGATTTCCGTCTCTGGTGTAGCTGATGATCCGAATAACTACCTGTTTTGCCGGGTCAGAAAAAATGGTGTTGCCGCGCCATCTGCCACCAGCCAGCTATCAACTCGCGCCCTGGAAGGGATTTTTGAAGCAACTCATCGATTGATTTACGGCGCTAAGGATGACTCTGGTCAGAGATACCTGGCCTGGTCTGGACACAGTGCCCGTGTCGGAGCCGCGCGAGATATGGCCCGCGCTGGAGTTTCAATACCGGAGATCATGCAAGCTGGTGGCTGGACCAATGTAAATATTGTCATGAACTATATCCGTAACCTGGATAGTGAAACAGGGGCAATGGTGCGCCTGCTGGAAGATGGCGAT(SEQ ID NO.9)。
实施例5
本实施例制备了一种Cre重组酶调控系统，命名为质粒PB-EFS-50GCE，包括依次连接的EFS启动子、雌激素受体(ER50)、绿色荧光蛋白EGFP，Cre重组酶和ERT2。
从ER50到ERT2核苷酸序列:
ATGAGCCTTGCCCTGTCACTTACAGCCGACCAGATGGTTTCCGCGCTTCTCGACGCTGAACCTCCAATTCTCTATTCCGAATACGACCCAACCAGGCCGTTCTCCGAGGCATCTATGATGGGTCTGCTGACAAATCTGGCAGACAGGGAACTGGTGCACATGATCAACTGGGCGAAGCGCGTACCCGGATTCGTCGATCTTGCACTCCATGATCAGGTGCACTTGCTGGAGTGCGCTTGGATGGAGATCCTCATGATCGGGCTGGTGTGGCGGAGTATGGAACACCCCGGCAAGTTGCTGTTTGCGCCTAACCTCCTGTTGGACAGGAACCAGGGGAAATGTGTGGAGGGCGGTGTGGAAATCTTTGACATGCTCCTCGCTACCTCAAGCCGGTTTAGGATGATGAATCTGCAAGGCGAAGAGTTCGTGTGTCTCAAATCTATCATACTGTTGAACAGCGGAGTCTACACCTTCCTCTCCAGCACTCTGAAATCTCTGGAGGAGAAAGATCATATCCATCGCGTGCTGGACAAGATAACCGACACGTTGATTCACTTGATGGCCAAAGCTGGGCTCACTCTGCAACAACAACATCAGCGACTGGCACAGCTGTTGCTGATTTTGAGCCACATTCGGCACATGTCCAGCAAGAGAATGGAGCACCTCTATAGTATGAAGTGCAAGAACGTCGTACCCCTGTCTGATCTGCTTCTTGAAATGCTTGATGCCCACCGGCTGGGATCTGGTAGCGGACATATGGTAAGCAAAGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGTTAACGGCGGTAGCGTGTCCAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGCATTGCCAGTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCGCAAGAACCTGATGGACATGTTCAGGGATCGCCAGGCGTTTTCTGAGCATACCTGGAAAATGCTTCTGTCCGTTTGCCGGTCGTGGGCGGCATGGTGCAAGTTGAATAACCGGAAATGGTTTCCCGCAGAACCTGAAGATGTTCGCGATTATCTTCTATATCTTCAGGCGCGCGGTCTGGCAGTAAAAACTATCCAGCAACATTTGGGCCAGCTAAACATGCTTCATCGTCGGTCCGGGCTGCCACGACCAAGTGACAGCAATGCTGTTTCACTGGTTATGCGGCGGATCCGAAAAGAAAACGTTGATGCCGGTGAACGTGCAAAACAGGCTCTAGCGTTCGAACGCACTGATTTCGACCAGGTTCGTTCACTCATGGAAAATAGCGATCGCTGCCAGGATATACGTAATCTGGCATTTCTGGGGATTGCTTATAACACCCTGTTACGTATAGCCGAAATTGCCAGGATCAGGGTTAAAGATATCTCACGTACTGACGGTGGGAGAATGTTAATCCATATTGGCAGAACGAAAACGCTGGTTAGCACCGCAGGTGTAGAGAAGGCACTTAGCCTGGGGGTAACTAAACTGGTCGAGCGATGGATTTCCGTCTCTGGTGTAGCTGATGATCCGAATAACTACCTGTTTTGCCGGGTCAGAAAAAATGGTGTTGCCGCGCCATCTGCCACCAGCCAGCTATCAACTCGCGCCCTGGAAGGGATTTTTGAAGCAACTCATCGATTGATTTACGGCGCTAAGGATGACTCTGGTCAGAGATACCTGGCCTGGTCTGGACACAGTGCCCGTGTCGGAGCCGCGCGAGATATGGCCCGCGCTGGAGTTTCAATACCGGAGATCATGCAAGCTGGTGGCTGGACCAATGTAAATATTGTCATGAACTATATCCGTAACCTGGATAGTGAAACAGGGGCAATGGTGCGCCTGCTGGAAGATGGCGATCTCGAGCCATCTGCTGGAGACATGAGAGCTGCCAACCTTTGGCCAAGCCCGCTCATGATCAAACGCTCTAAGAAGAACAGCCTGGCCTTGTCCCTGACGGCCGACCAGATGGTCAGTGCCTTGTTGGATGCTGAGCCCCCCATACTCTATTCCGAGTATGATCCTACCAGACCCTTCAGTGAAGCTTCGATGATGGGCTTACTGACCAACCTGGCAGACAGGGAGCTGGTTCACATGATCAACTGGGCGAAGAGGGTGCCAGGCTTTGTGGATTTGACCCTCCATGATCAGGTCCACCTTCTAGAATGTGCCTGGCTAGAGATCCTGATGATTGGTCTCGTCTGGCGCTCCATGGAGCACCCAGTGAAGCTACTGTTTGCTCCTAACTTGCTCTTGGACAGGAACCAGGGAAAATGTGTAGAGGGCATGGTGGAGATCTTCGACATGCTGCTGGCTACATCATCTCGGTTCCGCATGATGAATCTGCAGGGAGAGGAGTTTGTGTGCCTCAAATCTATTATTTTGCTTAATTCTGGAGTGTACACATTTCTGTCCAGCACCCTGAAGTCTCTGGAAGAGAAGGACCATATCCACCGAGTCCTGGACAAGATCACAGACACTTTGATCCACCTGATGGCCAAGGCAGGCCTGACCCTGCAGCAGCAGCACCAGCGGCTGGCCCAGCTCCTCCTCATCCTCTCCCACATCAGGCACATGAGTAACAAAGGCATGGAGCATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCCCTCTATGACCTGCTGCTGGAGGCGGCGGACGCCCACCGCCTACATGCGCCCACTAGCCGTGGAGGGGCATCCGTGGAGGAGACGGACCAAAGCCACTTGGCCACTGCGGGCTCTACTTCATCGCATTCCTTGCAAAAGTATTACATCACGGGGGAGGCAGAGGGTTTCCCTGCCACA(SEQ ID NO.10)。
实施例6
本实施例制备了一种Cre重组酶调控系统，命名为质粒PB-EFS-50GECE，包括依次连接的EFS启动子、雌激素受体(ER50)、绿色荧光蛋白EGFP、ERT2、Cre重组酶和ERT2。
从ER50到ERT2核苷酸序列:
ATGAGCCTTGCCCTGTCACTTACAGCCGACCAGATGGTTTCCGCGCTTCTCGACGCTGAACCTCCAATTCTCTATTCCGAATACGACCCAACCAGGCCGTTCTCCGAGGCATCTATGATGGGTCTGCTGACAAATCTGGCAGACAGGGAACTGGTGCACATGATCAACTGGGCGAAGCGCGTACCCGGATTCGTCGATCTTGCACTCCATGATCAGGTGCACTTGCTGGAGTGCGCTTGGATGGAGATCCTCATGATCGGGCTGGTGTGGCGGAGTATGGAACACCCCGGCAAGTTGCTGTTTGCGCCTAACCTCCTGTTGGACAGGAACCAGGGGAAATGTGTGGAGGGCGGTGTGGAAATCTTTGACATGCTCCTCGCTACCTCAAGCCGGTTTAGGATGATGAATCTGCAAGGCGAAGAGTTCGTGTGTCTCAAATCTATCATACTGTTGAACAGCGGAGTCTACACCTTCCTCTCCAGCACTCTGAAATCTCTGGAGGAGAAAGATCATATCCATCGCGTGCTGGACAAGATAACCGACACGTTGATTCACTTGATGGCCAAAGCTGGGCTCACTCTGCAACAACAACATCAGCGACTGGCACAGCTGTTGCTGATTTTGAGCCACATTCGGCACATGTCCAGCAAGAGAATGGAGCACCTCTATAGTATGAAGTGCAAGAACGTCGTACCCCTGTCTGATCTGCTTCTTGAAATGCTTGATGCCCACCGGCTGGGATCTGGTAGCGGACATATGGTAAGCAAAGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGTTGGAGGCGGATCTGCTGGAGACATGAGAGCTGCCAACCTTTGGCCAAGCCCGCTCATGATCAAACGCTCTAAGAAGAACAGCCTGGCCTTGTCCCTGACGGCCGACCAGATGGTCAGTGCCTTGTTGGATGCTGAGCCCCCCATACTCTATTCCGAGTATGATCCTACCAGACCCTTCAGTGAAGCTTCGATGATGGGCTTACTGACCAACCTGGCAGACAGGGAGCTGGTTCACATGATCAACTGGGCGAAGAGGGTGCCAGGCTTTGTGGATTTGACCCTCCATGATCAGGTCCACCTTCTAGAATGTGCCTGGCTAGAGATCCTGATGATTGGTCTCGTCTGGCGCTCCATGGAGCACCCAGTGAAGCTACTGTTTGCTCCTAACTTGCTCTTGGACAGGAACCAGGGAAAATGTGTAGAGGGCATGGTGGAGATCTTCGACATGCTGCTGGCTACATCATCTCGGTTCCGCATGATGAATCTGCAGGGAGAGGAGTTTGTGTGCCTCAAATCTATTATTTTGCTTAATTCTGGAGTGTACACATTTCTGTCCAGCACCCTGAAGTCTCTGGAAGAGAAGGACCATATCCACCGAGTCCTGGACAAGATCACAGACACTTTGATCCACCTGATGGCCAAGGCAGGCCTGACCCTGCAGCAGCAGCACCAGCGGCTGGCCCAGCTCCTCCTCATCCTCTCCCACATCAGGCACATGAGTAACAAAGGCATGGAGCATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCCCTCTATGACCTGCTGCTGGAGGCGGCGGACGCCCACCGCCTACATGCGCCCACTAGCCGTGGAGGGGCATCCGTGGAGGAGACGGACCAAAGCCACTTGGCCACTGCGGGCTCTACTTCATCGCATTCCTTGCAAAAGTATTACATCACGGGGGAGGCAGAGGGTTTCCCTGCCACAGGATCTGGTAGCAACGGCGGTAGCGTGTCCAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGCATTGCCAGTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCGCAAGAACCTGATGGACATGTTCAGGGATCGCCAGGCGTTTTCTGAGCATACCTGGAAAATGCTTCTGTCCGTTTGCCGGTCGTGGGCGGCATGGTGCAAGTTGAATAACCGGAAATGGTTTCCCGCAGAACCTGAAGATGTTCGCGATTATCTTCTATATCTTCAGGCGCGCGGTCTGGCAGTAAAAACTATCCAGCAACATTTGGGCCAGCTAAACATGCTTCATCGTCGGTCCGGGCTGCCACGACCAAGTGACAGCAATGCTGTTTCACTGGTTATGCGGCGGATCCGAAAAGAAAACGTTGATGCCGGTGAACGTGCAAAACAGGCTCTAGCGTTCGAACGCACTGATTTCGACCAGGTTCGTTCACTCATGGAAAATAGCGATCGCTGCCAGGATATACGTAATCTGGCATTTCTGGGGATTGCTTATAACACCCTGTTACGTATAGCCGAAATTGCCAGGATCAGGGTTAAAGATATCTCACGTACTGACGGTGGGAGAATGTTAATCCATATTGGCAGAACGAAAACGCTGGTTAGCACCGCAGGTGTAGAGAAGGCACTTAGCCTGGGGGTAACTAAACTGGTCGAGCGATGGATTTCCGTCTCTGGTGTAGCTGATGATCCGAATAACTACCTGTTTTGCCGGGTCAGAAAAAATGGTGTTGCCGCGCCATCTGCCACCAGCCAGCTATCAACTCGCGCCCTGGAAGGGATTTTTGAAGCAACTCATCGATTGATTTACGGCGCTAAGGATGACTCTGGTCAGAGATACCTGGCCTGGTCTGGACACAGTGCCCGTGTCGGAGCCGCGCGAGATATGGCCCGCGCTGGAGTTTCAATACCGGAGATCATGCAAGCTGGTGGCTGGACCAATGTAAATATTGTCATGAACTATATCCGTAACCTGGATAGTGAAACAGGGGCAATGGTGCGCCTGCTGGAAGATGGCGATCTCGAGCCATCTGCTGGAGACATGAGAGCTGCCAACCTTTGGCCAAGCCCGCTCATGATCAAACGCTCTAAGAAGAACAGCCTGGCCTTGTCCCTGACGGCCGACCAGATGGTCAGTGCCTTGTTGGATGCTGAGCCCCCCATACTCTATTCCGAGTATGATCCTACCAGACCCTTCAGTGAAGCTTCGATGATGGGCTTACTGACCAACCTGGCAGACAGGGAGCTGGTTCACATGATCAACTGGGCGAAGAGGGTGCCAGGCTTTGTGGATTTGACCCTCCATGATCAGGTCCACCTTCTAGAATGTGCCTGGCTAGAGATCCTGATGATTGGTCTCGTCTGGCGCTCCATGGAGCACCCAGTGAAGCTACTGTTTGCTCCTAACTTGCTCTTGGACAGGAACCAGGGAAAATGTGTAGAGGGCATGGTGGAGATCTTCGACATGCTGCTGGCTACATCATCTCGGTTCCGCATGATGAATCTGCAGGGAGAGGAGTTTGTGTGCCTCAAATCTATTATTTTGCTTAATTCTGGAGTGTACACATTTCTGTCCAGCACCCTGAAGTCTCTGGAAGAGAAGGACCATATCCACCGAGTCCTGGACAAGATCACAGACACTTTGATCCACCTGATGGCCAAGGCAGGCCTGACCCTGCAGCAGCAGCACCAGCGGCTGGCCCAGCTCCTCCTCATCCTCTCCCACATCAGGCACATGAGTAACAAAGGCATGGAGCATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCCCTCTATGACCTGCTGCTGGAGGCGGCGGACGCCCACCGCCTACATGCGCCCACTAGCCGTGGAGGGGCATCCGTGGAGGAGACGGACCAAAGCCACTTGGCCACTGCGGGCTCTACTTCATCGCATTCCTTGCAAAAGTATTACATCACGGGGGAGGCAGAGGGTTTCCCTGCCACA(SEQ ID NO.11)。
实施例7
本实施例制备了一种Cre重组酶调控系统，命名为质粒PB-EFS-50ECE，包括依次连接的EFS启动子、雌激素受体(ER50)、ERT2、Cre重组酶和ERT2。
从ER50到ERT2核苷酸序列:
ATGAGCCTTGCCCTGTCACTTACAGCCGACCAGATGGTTTCCGCGCTTCTCGACGCTGAACCTCCAATTCTCTATTCCGAATACGACCCAACCAGGCCGTTCTCCGAGGCATCTATGATGGGTCTGCTGACAAATCTGGCAGACAGGGAACTGGTGCACATGATCAACTGGGCGAAGCGCGTACCCGGATTCGTCGATCTTGCACTCCATGATCAGGTGCACTTGCTGGAGTGCGCTTGGATGGAGATCCTCATGATCGGGCTGGTGTGGCGGAGTATGGAACACCCCGGCAAGTTGCTGTTTGCGCCTAACCTCCTGTTGGACAGGAACCAGGGGAAATGTGTGGAGGGCGGTGTGGAAATCTTTGACATGCTCCTCGCTACCTCAAGCCGGTTTAGGATGATGAATCTGCAAGGCGAAGAGTTCGTGTGTCTCAAATCTATCATACTGTTGAACAGCGGAGTCTACACCTTCCTCTCCAGCACTCTGAAATCTCTGGAGGAGAAAGATCATATCCATCGCGTGCTGGACAAGATAACCGACACGTTGATTCACTTGATGGCCAAAGCTGGGCTCACTCTGCAACAACAACATCAGCGACTGGCACAGCTGTTGCTGATTTTGAGCCACATTCGGCACATGTCCAGCAAGAGAATGGAGCACCTCTATAGTATGAAGTGCAAGAACGTCGTACCCCTGTCTGATCTGCTTCTTGAAATGCTTGATGCCCACCGGCTGGGATCTGGTAGCGGACATATGGCTGGAGACATGAGAGCTGCCAACCTTTGGCCAAGCCCGCTCATGATCAAACGCTCTAAGAAGAACAGCCTGGCCTTGTCCCTGACGGCCGACCAGATGGTCAGTGCCTTGTTGGATGCTGAGCCCCCCATACTCTATTCCGAGTATGATCCTACCAGACCCTTCAGTGAAGCTTCGATGATGGGCTTACTGACCAACCTGGCAGACAGGGAGCTGGTTCACATGATCAACTGGGCGAAGAGGGTGCCAGGCTTTGTGGATTTGACCCTCCATGATCAGGTCCACCTTCTAGAATGTGCCTGGCTAGAGATCCTGATGATTGGTCTCGTCTGGCGCTCCATGGAGCACCCAGTGAAGCTACTGTTTGCTCCTAACTTGCTCTTGGACAGGAACCAGGGAAAATGTGTAGAGGGCATGGTGGAGATCTTCGACATGCTGCTGGCTACATCATCTCGGTTCCGCATGATGAATCTGCAGGGAGAGGAGTTTGTGTGCCTCAAATCTATTATTTTGCTTAATTCTGGAGTGTACACATTTCTGTCCAGCACCCTGAAGTCTCTGGAAGAGAAGGACCATATCCACCGAGTCCTGGACAAGATCACAGACACTTTGATCCACCTGATGGCCAAGGCAGGCCTGACCCTGCAGCAGCAGCACCAGCGGCTGGCCCAGCTCCTCCTCATCCTCTCCCACATCAGGCACATGAGTAACAAAGGCATGGAGCATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCCCTCTATGACCTGCTGCTGGAGGCGGCGGACGCCCACCGCCTACATGCGCCCACTAGCCGTGGAGGGGCATCCGTGGAGGAGACGGACCAAAGCCACTTGGCCACTGCGGGCTCTACTTCATCGCATTCCTTGCAAAAGTATTACATCACGGGGGAGGCAGAGGGTTTCCCTGCCACAGGATCTGGTAGCAACGGCGGTAGCGTGTCCAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGCATTGCCAGTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCGCAAGAACCTGATGGACATGTTCAGGGATCGCCAGGCGTTTTCTGAGCATACCTGGAAAATGCTTCTGTCCGTTTGCCGGTCGTGGGCGGCATGGTGCAAGTTGAATAACCGGAAATGGTTTCCCGCAGAACCTGAAGATGTTCGCGATTATCTTCTATATCTTCAGGCGCGCGGTCTGGCAGTAAAAACTATCCAGCAACATTTGGGCCAGCTAAACATGCTTCATCGTCGGTCCGGGCTGCCACGACCAAGTGACAGCAATGCTGTTTCACTGGTTATGCGGCGGATCCGAAAAGAAAACGTTGATGCCGGTGAACGTGCAAAACAGGCTCTAGCGTTCGAACGCACTGATTTCGACCAGGTTCGTTCACTCATGGAAAATAGCGATCGCTGCCAGGATATACGTAATCTGGCATTTCTGGGGATTGCTTATAACACCCTGTTACGTATAGCCGAAATTGCCAGGATCAGGGTTAAAGATATCTCACGTACTGACGGTGGGAGAATGTTAATCCATATTGGCAGAACGAAAACGCTGGTTAGCACCGCAGGTGTAGAGAAGGCACTTAGCCTGGGGGTAACTAAACTGGTCGAGCGATGGATTTCCGTCTCTGGTGTAGCTGATGATCCGAATAACTACCTGTTTTGCCGGGTCAGAAAAAATGGTGTTGCCGCGCCATCTGCCACCAGCCAGCTATCAACTCGCGCCCTGGAAGGGATTTTTGAAGCAACTCATCGATTGATTTACGGCGCTAAGGATGACTCTGGTCAGAGATACCTGGCCTGGTCTGGACACAGTGCCCGTGTCGGAGCCGCGCGAGATATGGCCCGCGCTGGAGTTTCAATACCGGAGATCATGCAAGCTGGTGGCTGGACCAATGTAAATATTGTCATGAACTATATCCGTAACCTGGATAGTGAAACAGGGGCAATGGTGCGCCTGCTGGAAGATGGCGATCTCGAGCCATCTGCTGGAGACATGAGAGCTGCCAACCTTTGGCCAAGCCCGCTCATGATCAAACGCTCTAAGAAGAACAGCCTGGCCTTGTCCCTGACGGCCGACCAGATGGTCAGTGCCTTGTTGGATGCTGAGCCCCCCATACTCTATTCCGAGTATGATCCTACCAGACCCTTCAGTGAAGCTTCGATGATGGGCTTACTGACCAACCTGGCAGACAGGGAGCTGGTTCACATGATCAACTGGGCGAAGAGGGTGCCAGGCTTTGTGGATTTGACCCTCCATGATCAGGTCCACCTTCTAGAATGTGCCTGGCTAGAGATCCTGATGATTGGTCTCGTCTGGCGCTCCATGGAGCACCCAGTGAAGCTACTGTTTGCTCCTAACTTGCTCTTGGACAGGAACCAGGGAAAATGTGTAGAGGGCATGGTGGAGATCTTCGACATGCTGCTGGCTACATCATCTCGGTTCCGCATGATGAATCTGCAGGGAGAGGAGTTTGTGTGCCTCAAATCTATTATTTTGCTTAATTCTGGAGTGTACACATTTCTGTCCAGCACCCTGAAGTCTCTGGAAGAGAAGGACCATATCCACCGAGTCCTGGACAAGATCACAGACACTTTGATCCACCTGATGGCCAAGGCAGGCCTGACCCTGCAGCAGCAGCACCAGCGGCTGGCCCAGCTCCTCCTCATCCTCTCCCACATCAGGCACATGAGTAACAAAGGCATGGAGCATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCCCTCTATGACCTGCTGCTGGAGGCGGCGGACGCCCACCGCCTACATGCGCCCACTAGCCGTGGAGGGGCATCCGTGGAGGAGACGGACCAAAGCCACTTGGCCACTGCGGGCTCTACTTCATCGCATTCCTTGCAAAAGTATTACATCACGGGGGAGGCAGAGGGTTTCCCTGCCACA(SEQ ID NO.12)。
实施例8
本实施例制备了一种Cre重组酶调控系统，命名为质粒PB-EFS-C，包括依次连接的EFS启动子、Cre重组酶。
实施例9
本实施例制备了一种Cre重组酶调控系统，命名为质粒PB-EFS-CE，包括依次连接的EFS启动子、Cre重组酶和雌激素受体(estrogen receptor，ER50)的配体结合区突变体(ERT2)。
从Cre重组酶到ERT2核苷酸序列：
ATGTCCAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGCATTGCCAGTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCGCAAGAACCTGATGGACATGTTCAGGGATCGCCAGGCGTTTTCTGAGCATACCTGGAAAATGCTTCTGTCCGTTTGCCGGTCGTGGGCGGCATGGTGCAAGTTGAATAACCGGAAATGGTTTCCCGCAGAACCTGAAGATGTTCGCGATTATCTTCTATATCTTCAGGCGCGCGGTCTGGCAGTAAAAACTATCCAGCAACATTTGGGCCAGCTAAACATGCTTCATCGTCGGTCCGGGCTGCCACGACCAAGTGACAGCAATGCTGTTTCACTGGTTATGCGGCGGATCCGAAAAGAAAACGTTGATGCCGGTGAACGTGCAAAACAGGCTCTAGCGTTCGAACGCACTGATTTCGACCAGGTTCGTTCACTCATGGAAAATAGCGATCGCTGCCAGGATATACGTAATCTGGCATTTCTGGGGATTGCTTATAACACCCTGTTACGTATAGCCGAAATTGCCAGGATCAGGGTTAAAGATATCTCACGTACTGACGGTGGGAGAATGTTAATCCATATTGGCAGAACGAAAACGCTGGTTAGCACCGCAGGTGTAGAGAAGGCACTTAGCCTGGGGGTAACTAAACTGGTCGAGCGATGGATTTCCGTCTCTGGTGTAGCTGATGATCCGAATAACTACCTGTTTTGCCGGGTCAGAAAAAATGGTGTTGCCGCGCCATCTGCCACCAGCCAGCTATCAACTCGCGCCCTGGAAGGGATTTTTGAAGCAACTCATCGATTGATTTACGGCGCTAAGGATGACTCTGGTCAGAGATACCTGGCCTGGTCTGGACACAGTGCCCGTGTCGGAGCCGCGCGAGATATGGCCCGCGCTGGAGTTTCAATACCGGAGATCATGCAAGCTGGTGGCTGGACCAATGTAAATATTGTCATGAACTATATCCGTAACCTGGATAGTGAAACAGGGGCAATGGTGCGCCTGCTGGAAGATGGCGATCTCGAGCCATCTGCTGGAGACATGAGAGCTGCCAACCTTTGGCCAAGCCCGCTCATGATCAAACGCTCTAAGAAGAACAGCCTGGCCTTGTCCCTGACGGCCGACCAGATGGTCAGTGCCTTGTTGGATGCTGAGCCCCCCATACTCTATTCCGAGTATGATCCTACCAGACCCTTCAGTGAAGCTTCGATGATGGGCTTACTGACCAACCTGGCAGACAGGGAGCTGGTTCACATGATCAACTGGGCGAAGAGGGTGCCAGGCTTTGTGGATTTGACCCTCCATGATCAGGTCCACCTTCTAGAATGTGCCTGGCTAGAGATCCTGATGATTGGTCTCGTCTGGCGCTCCATGGAGCACCCAGTGAAGCTACTGTTTGCTCCTAACTTGCTCTTGGACAGGAACCAGGGAAAATGTGTAGAGGGCATGGTGGAGATCTTCGACATGCTGCTGGCTACATCATCTCGGTTCCGCATGATGAATCTGCAGGGAGAGGAGTTTGTGTGCCTCAAATCTATTATTTTGCTTAATTCTGGAGTGTACACATTTCTGTCCAGCACCCTGAAGTCTCTGGAAGAGAAGGACCATATCCACCGAGTCCTGGACAAGATCACAGACACTTTGATCCACCTGATGGCCAAGGCAGGCCTGACCCTGCAGCAGCAGCACCAGCGGCTGGCCCAGCTCCTCCTCATCCTCTCCCACATCAGGCACATGAGTAACAAAGGCATGGAGCATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCCCTCTATGACCTGCTGCTGGAGGCGGCGGACGCCCACCGCCTACATGCGCCCACTAGCCGTGGAGGGGCATCCGTGGAGGAGACGGACCAAAGCCACTTGGCCACTGCGGGCTCTACTTCATCGCATTCCTTGCAAAAGTATTACATCACGGGGGAGGCAGAGGGTTTCCCTGCCACA(SEQ ID NO.13)。
实施例10
本实施例制备了一种Cre重组酶调控系统，命名为质粒PB-EFS-ECE，包括依次连接的EFS启动子、ERT2、Cre重组酶和ERT2。
从ERT2到ERT2核苷酸序列:
GCTGGAGACATGAGAGCTGCCAACCTTTGGCCAAGCCCGCTCATGATCAAACGCTCTAAGAAGAACAGCCTGGCCTTGTCCCTGACGGCCGACCAGATGGTCAGTGCCTTGTTGGATGCTGAGCCCCCCATACTCTATTCCGAGTATGATCCTACCAGACCCTTCAGTGAAGCTTCGATGATGGGCTTACTGACCAACCTGGCAGACAGGGAGCTGGTTCACATGATCAACTGGGCGAAGAGGGTGCCAGGCTTTGTGGATTTGACCCTCCATGATCAGGTCCACCTTCTAGAATGTGCCTGGCTAGAGATCCTGATGATTGGTCTCGTCTGGCGCTCCATGGAGCACCCAGTGAAGCTACTGTTTGCTCCTAACTTGCTCTTGGACAGGAACCAGGGAAAATGTGTAGAGGGCATGGTGGAGATCTTCGACATGCTGCTGGCTACATCATCTCGGTTCCGCATGATGAATCTGCAGGGAGAGGAGTTTGTGTGCCTCAAATCTATTATTTTGCTTAATTCTGGAGTGTACACATTTCTGTCCAGCACCCTGAAGTCTCTGGAAGAGAAGGACCATATCCACCGAGTCCTGGACAAGATCACAGACACTTTGATCCACCTGATGGCCAAGGCAGGCCTGACCCTGCAGCAGCAGCACCAGCGGCTGGCCCAGCTCCTCCTCATCCTCTCCCACATCAGGCACATGAGTAACAAAGGCATGGAGCATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCCCTCTATGACCTGCTGCTGGAGGCGGCGGACGCCCACCGCCTACATGCGCCCACTAGCCGTGGAGGGGCATCCGTGGAGGAGACGGACCAAAGCCACTTGGCCACTGCGGGCTCTACTTCATCGCATTCCTTGCAAAAGTATTACATCACGGGGGAGGCAGAGGGTTTCCCTGCCACAGGATCTGGTAGCGGATCCAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGCATTGCCAGTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCGCAAGAACCTGATGGACATGTTCAGGGATCGCCAGGCGTTTTCTGAGCATACCTGGAAAATGCTTCTGTCCGTTTGCCGGTCGTGGGCGGCATGGTGCAAGTTGAATAACCGGAAATGGTTTCCCGCAGAACCTGAAGATGTTCGCGATTATCTTCTATATCTTCAGGCGCGCGGTCTGGCAGTAAAAACTATCCAGCAACATTTGGGCCAGCTAAACATGCTTCATCGTCGGTCCGGGCTGCCACGACCAAGTGACAGCAATGCTGTTTCACTGGTTATGCGGCGGATCCGAAAAGAAAACGTTGATGCCGGTGAACGTGCAAAACAGGCTCTAGCGTTCGAACGCACTGATTTCGACCAGGTTCGTTCACTCATGGAAAATAGCGATCGCTGCCAGGATATACGTAATCTGGCATTTCTGGGGATTGCTTATAACACCCTGTTACGTATAGCCGAAATTGCCAGGATCAGGGTTAAAGATATCTCACGTACTGACGGTGGGAGAATGTTAATCCATATTGGCAGAACGAAAACGCTGGTTAGCACCGCAGGTGTAGAGAAGGCACTTAGCCTGGGGGTAACTAAACTGGTCGAGCGATGGATTTCCGTCTCTGGTGTAGCTGATGATCCGAATAACTACCTGTTTTGCCGGGTCAGAAAAAATGGTGTTGCCGCGCCATCTGCCACCAGCCAGCTATCAACTCGCGCCCTGGAAGGGATTTTTGAAGCAACTCATCGATTGATTTACGGCGCTAAGGATGACTCTGGTCAGAGATACCTGGCCTGGTCTGGACACAGTGCCCGTGTCGGAGCCGCGCGAGATATGGCCCGCGCTGGAGTTTCAATACCGGAGATCATGCAAGCTGGTGGCTGGACCAATGTAAATATTGTCATGAACTATATCCGTAACCTGGATAGTGAAACAGGGGCAATGGTGCGCCTGCTGGAAGATGGCGATCTCGAGCCATCTGCTGGAGACATGAGAGCTGCCAACCTTTGGCCAAGCCCGCTCATGATCAAACGCTCTAAGAAGAACAGCCTGGCCTTGTCCCTGACGGCCGACCAGATGGTCAGTGCCTTGTTGGATGCTGAGCCCCCCATACTCTATTCCGAGTATGATCCTACCAGACCCTTCAGTGAAGCTTCGATGATGGGCTTACTGACCAACCTGGCAGACAGGGAGCTGGTTCACATGATCAACTGGGCGAAGAGGGTGCCAGGCTTTGTGGATTTGACCCTCCATGATCAGGTCCACCTTCTAGAATGTGCCTGGCTAGAGATCCTGATGATTGGTCTCGTCTGGCGCTCCATGGAGCACCCAGTGAAGCTACTGTTTGCTCCTAACTTGCTCTTGGACAGGAACCAGGGAAAATGTGTAGAGGGCATGGTGGAGATCTTCGACATGCTGCTGGCTACATCATCTCGGTTCCGCATGATGAATCTGCAGGGAGAGGAGTTTGTGTGCCTCAAATCTATTATTTTGCTTAATTCTGGAGTGTACACATTTCTGTCCAGCACCCTGAAGTCTCTGGAAGAGAAGGACCATATCCACCGAGTCCTGGACAAGATCACAGACACTTTGATCCACCTGATGGCCAAGGCAGGCCTGACCCTGCAGCAGCAGCACCAGCGGCTGGCCCAGCTCCTCCTCATCCTCTCCCACATCAGGCACATGAGTAACAAAGGCATGGAGCATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCCCTCTATGACCTGCTGCTGGAGGCGGCGGACGCCCACCGCCTACATGCGCCCACTAGCCGTGGAGGGGCATCCGTGGAGGAGACGGACCAAAGCCACTTGGCCACTGCGGGCTCTACTTCATCGCATTCCTTGCAAAAGTATTACATCACGGGGGAGGCAGAGGGTTTCCCTGCCACA(SEQ ID NO.14)。
实施例11
本实施例制备了一种Cre重组酶调控系统，命名为质粒PB-EFS-50C，包括依次连接的EFS启动子、雌激素受体(ER50)和Cre重组酶。
从ER50到Cre重组酶核苷酸序列:
AGCCTTGCCCTGTCACTTACAGCCGACCAGATGGTTTCCGCGCTTCTCGACGCTGAACCTCCAATTCTCTATTCCGAATACGACCCAACCAGGCCGTTCTCCGAGGCATCTATGATGGGTCTGCTGACAAATCTGGCAGACAGGGAACTGGTGCACATGATCAACTGGGCGAAGCGCGTACCCGGATTCGTCGATCTTGCACTCCATGATCAGGTGCACTTGCTGGAGTGCGCTTGGATGGAGATCCTCATGATCGGGCTGGTGTGGCGGAGTATGGAACACCCCGGCAAGTTGCTGTTTGCGCCTAACCTCCTGTTGGACAGGAACCAGGGGAAATGTGTGGAGGGCGGTGTGGAAATCTTTGACATGCTCCTCGCTACCTCAAGCCGGTTTAGGATGATGAATCTGCAAGGCGAAGAGTTCGTGTGTCTCAAATCTATCATACTGTTGAACAGCGGAGTCTACACCTTCCTCTCCAGCACTCTGAAATCTCTGGAGGAGAAAGATCATATCCATCGCGTGCTGGACAAGATAACCGACACGTTGATTCACTTGATGGCCAAAGCTGGGCTCACTCTGCAACAACAACATCAGCGACTGGCACAGCTGTTGCTGATTTTGAGCCACATTCGGCACATGTCCAGCAAGAGAATGGAGCACCTCTATAGTATGAAGTGCAAGAACGTCGTACCCCTGTCTGATCTGCTTCTTGAAATGCTTGATGCCCACCGGCTGGGATCTGGTAGCGGACATATGGGCGGTAGCGTGTCCAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGCATTGCCAGTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCGCAAGAACCTGATGGACATGTTCAGGGATCGCCAGGCGTTTTCTGAGCATACCTGGAAAATGCTTCTGTCCGTTTGCCGGTCGTGGGCGGCATGGTGCAAGTTGAATAACCGGAAATGGTTTCCCGCAGAACCTGAAGATGTTCGCGATTATCTTCTATATCTTCAGGCGCGCGGTCTGGCAGTAAAAACTATCCAGCAACATTTGGGCCAGCTAAACATGCTTCATCGTCGGTCCGGGCTGCCACGACCAAGTGACAGCAATGCTGTTTCACTGGTTATGCGGCGGATCCGAAAAGAAAACGTTGATGCCGGTGAACGTGCAAAACAGGCTCTAGCGTTCGAACGCACTGATTTCGACCAGGTTCGTTCACTCATGGAAAATAGCGATCGCTGCCAGGATATACGTAATCTGGCATTTCTGGGGATTGCTTATAACACCCTGTTACGTATAGCCGAAATTGCCAGGATCAGGGTTAAAGATATCTCACGTACTGACGGTGGGAGAATGTTAATCCATATTGGCAGAACGAAAACGCTGGTTAGCACCGCAGGTGTAGAGAAGGCACTTAGCCTGGGGGTAACTAAACTGGTCGAGCGATGGATTTCCGTCTCTGGTGTAGCTGATGATCCGAATAACTACCTGTTTTGCCGGGTCAGAAAAAATGGTGTTGCCGCGCCATCTGCCACCAGCCAGCTATCAACTCGCGCCCTGGAAGGGATTTTTGAAGCAACTCATCGATTGATTTACGGCGCTAAGGATGACTCTGGTCAGAGATACCTGGCCTGGTCTGGACACAGTGCCCGTGTCGGAGCCGCGCGAGATATGGCCCGCGCTGGAGTTTCAATACCGGAGATCATGCAAGCTGGTGGCTGGACCAATGTAAATATTGTCATGAACTATATCCGTAACCTGGATAGTGAAACAGGGGCAATGGTGCGCCTGCTGGAAGATGGCGAT(SEQ ID NO.15)。
实施例12
本实施例制备了一种Cre重组酶调控系统，命名为质粒PB-EFS-50CE，包括依次连接的EFS启动子、雌激素受体(ER50)、Cre重组酶和ERT2。
从ER50到ERT2核苷酸序列:
AGCCTTGCCCTGTCACTTACAGCCGACCAGATGGTTTCCGCGCTTCTCGACGCTGAACCTCCAATTCTCTATTCCGAATACGACCCAACCAGGCCGTTCTCCGAGGCATCTATGATGGGTCTGCTGACAAATCTGGCAGACAGGGAACTGGTGCACATGATCAACTGGGCGAAGCGCGTACCCGGATTCGTCGATCTTGCACTCCATGATCAGGTGCACTTGCTGGAGTGCGCTTGGATGGAGATCCTCATGATCGGGCTGGTGTGGCGGAGTATGGAACACCCCGGCAAGTTGCTGTTTGCGCCTAACCTCCTGTTGGACAGGAACCAGGGGAAATGTGTGGAGGGCGGTGTGGAAATCTTTGACATGCTCCTCGCTACCTCAAGCCGGTTTAGGATGATGAATCTGCAAGGCGAAGAGTTCGTGTGTCTCAAATCTATCATACTGTTGAACAGCGGAGTCTACACCTTCCTCTCCAGCACTCTGAAATCTCTGGAGGAGAAAGATCATATCCATCGCGTGCTGGACAAGATAACCGACACGTTGATTCACTTGATGGCCAAAGCTGGGCTCACTCTGCAACAACAACATCAGCGACTGGCACAGCTGTTGCTGATTTTGAGCCACATTCGGCACATGTCCAGCAAGAGAATGGAGCACCTCTATAGTATGAAGTGCAAGAACGTCGTACCCCTGTCTGATCTGCTTCTTGAAATGCTTGATGCCCACCGGCTGGGATCTGGTAGCGGATCCAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGCATTGCCAGTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCGCAAGAACCTGATGGACATGTTCAGGGATCGCCAGGCGTTTTCTGAGCATACCTGGAAAATGCTTCTGTCCGTTTGCCGGTCGTGGGCGGCATGGTGCAAGTTGAATAACCGGAAATGGTTTCCCGCAGAACCTGAAGATGTTCGCGATTATCTTCTATATCTTCAGGCGCGCGGTCTGGCAGTAAAAACTATCCAGCAACATTTGGGCCAGCTAAACATGCTTCATCGTCGGTCCGGGCTGCCACGACCAAGTGACAGCAATGCTGTTTCACTGGTTATGCGGCGGATCCGAAAAGAAAACGTTGATGCCGGTGAACGTGCAAAACAGGCTCTAGCGTTCGAACGCACTGATTTCGACCAGGTTCGTTCACTCATGGAAAATAGCGATCGCTGCCAGGATATACGTAATCTGGCATTTCTGGGGATTGCTTATAACACCCTGTTACGTATAGCCGAAATTGCCAGGATCAGGGTTAAAGATATCTCACGTACTGACGGTGGGAGAATGTTAATCCATATTGGCAGAACGAAAACGCTGGTTAGCACCGCAGGTGTAGAGAAGGCACTTAGCCTGGGGGTAACTAAACTGGTCGAGCGATGGATTTCCGTCTCTGGTGTAGCTGATGATCCGAATAACTACCTGTTTTGCCGGGTCAGAAAAAATGGTGTTGCCGCGCCATCTGCCACCAGCCAGCTATCAACTCGCGCCCTGGAAGGGATTTTTGAAGCAACTCATCGATTGATTTACGGCGCTAAGGATGACTCTGGTCAGAGATACCTGGCCTGGTCTGGACACAGTGCCCGTGTCGGAGCCGCGCGAGATATGGCCCGCGCTGGAGTTTCAATACCGGAGATCATGCAAGCTGGTGGCTGGACCAATGTAAATATTGTCATGAACTATATCCGTAACCTGGATAGTGAAACAGGGGCAATGGTGCGCCTGCTGGAAGATGGCGATCTCGAGCCATCTGCTGGAGACATGAGAGCTGCCAACCTTTGGCCAAGCCCGCTCATGATCAAACGCTCTAAGAAGAACAGCCTGGCCTTGTCCCTGACGGCCGACCAGATGGTCAGTGCCTTGTTGGATGCTGAGCCCCCCATACTCTATTCCGAGTATGATCCTACCAGACCCTTCAGTGAAGCTTCGATGATGGGCTTACTGACCAACCTGGCAGACAGGGAGCTGGTTCACATGATCAACTGGGCGAAGAGGGTGCCAGGCTTTGTGGATTTGACCCTCCATGATCAGGTCCACCTTCTAGAATGTGCCTGGCTAGAGATCCTGATGATTGGTCTCGTCTGGCGCTCCATGGAGCACCCAGTGAAGCTACTGTTTGCTCCTAACTTGCTCTTGGACAGGAACCAGGGAAAATGTGTAGAGGGCATGGTGGAGATCTTCGACATGCTGCTGGCTACATCATCTCGGTTCCGCATGATGAATCTGCAGGGAGAGGAGTTTGTGTGCCTCAAATCTATTATTTTGCTTAATTCTGGAGTGTACACATTTCTGTCCAGCACCCTGAAGTCTCTGGAAGAGAAGGACCATATCCACCGAGTCCTGGACAAGATCACAGACACTTTGATCCACCTGATGGCCAAGGCAGGCCTGACCCTGCAGCAGCAGCACCAGCGGCTGGCCCAGCTCCTCCTCATCCTCTCCCACATCAGGCACATGAGTAACAAAGGCATGGAGCATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCCCTCTATGACCTGCTGCTGGAGGCGGCGGACGCCCACCGCCTACATGCGCCCACTAGCCGTGGAGGGGCATCCGTGGAGGAGACGGACCAAAGCCACTTGGCCACTGCGGGCTCTACTTCATCGCATTCCTTGCAAAAGTATTACATCACGGGGGAGGCAGAGGGTTTCCCTGCCACA(SEQID NO.16)。
实施例13
本实施例制备了一种Cre重组酶调控系统，命名为质粒PB-EFS-50C50，包括依次连接的EFS启动子、雌激素受体(ER50)、Cre重组酶和ER50。
从ER50到ER50核苷酸序列:
AGCCTTGCCCTGTCACTTACAGCCGACCAGATGGTTTCCGCGCTTCTCGACGCTGAACCTCCAATTCTCTATTCCGAATACGACCCAACCAGGCCGTTCTCCGAGGCATCTATGATGGGTCTGCTGACAAATCTGGCAGACAGGGAACTGGTGCACATGATCAACTGGGCGAAGCGCGTACCCGGATTCGTCGATCTTGCACTCCATGATCAGGTGCACTTGCTGGAGTGCGCTTGGATGGAGATCCTCATGATCGGGCTGGTGTGGCGGAGTATGGAACACCCCGGCAAGTTGCTGTTTGCGCCTAACCTCCTGTTGGACAGGAACCAGGGGAAATGTGTGGAGGGCGGTGTGGAAATCTTTGACATGCTCCTCGCTACCTCAAGCCGGTTTAGGATGATGAATCTGCAAGGCGAAGAGTTCGTGTGTCTCAAATCTATCATACTGTTGAACAGCGGAGTCTACACCTTCCTCTCCAGCACTCTGAAATCTCTGGAGGAGAAAGATCATATCCATCGCGTGCTGGACAAGATAACCGACACGTTGATTCACTTGATGGCCAAAGCTGGGCTCACTCTGCAACAACAACATCAGCGACTGGCACAGCTGTTGCTGATTTTGAGCCACATTCGGCACATGTCCAGCAAGAGAATGGAGCACCTCTATAGTATGAAGTGCAAGAACGTCGTACCCCTGTCTGATCTGCTTCTTGAAATGCTTGATGCCCACCGGCTGGGATCTGGTAGCGGACATATGGGCGGTAGCGTGTCCAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGCATTGCCAGTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCGCAAGAACCTGATGGACATGTTCAGGGATCGCCAGGCGTTTTCTGAGCATACCTGGAAAATGCTTCTGTCCGTTTGCCGGTCGTGGGCGGCATGGTGCAAGTTGAATAACCGGAAATGGTTTCCCGCAGAACCTGAAGATGTTCGCGATTATCTTCTATATCTTCAGGCGCGCGGTCTGGCAGTAAAAACTATCCAGCAACATTTGGGCCAGCTAAACATGCTTCATCGTCGGTCCGGGCTGCCACGACCAAGTGACAGCAATGCTGTTTCACTGGTTATGCGGCGGATCCGAAAAGAAAACGTTGATGCCGGTGAACGTGCAAAACAGGCTCTAGCGTTCGAACGCACTGATTTCGACCAGGTTCGTTCACTCATGGAAAATAGCGATCGCTGCCAGGATATACGTAATCTGGCATTTCTGGGGATTGCTTATAACACCCTGTTACGTATAGCCGAAATTGCCAGGATCAGGGTTAAAGATATCTCACGTACTGACGGTGGGAGAATGTTAATCCATATTGGCAGAACGAAAACGCTGGTTAGCACCGCAGGTGTAGAGAAGGCACTTAGCCTGGGGGTAACTAAACTGGTCGAGCGATGGATTTCCGTCTCTGGTGTAGCTGATGATCCGAATAACTACCTGTTTTGCCGGGTCAGAAAAAATGGTGTTGCCGCGCCATCTGCCACCAGCCAGCTATCAACTCGCGCCCTGGAAGGGATTTTTGAAGCAACTCATCGATTGATTTACGGCGCTAAGGATGACTCTGGTCAGAGATACCTGGCCTGGTCTGGACACAGTGCCCGTGTCGGAGCCGCGCGAGATATGGCCCGCGCTGGAGTTTCAATACCGGAGATCATGCAAGCTGGTGGCTGGACCAATGTAAATATTGTCATGAACTATATCCGTAACCTGGATAGTGAAACAGGGGCAATGGTGCGCCTGCTGGAAGATGGCGATCTCGAGAGCCTTGCCCTGTCACTTACAGCCGACCAGATGGTTTCCGCGCTTCTCGACGCTGAACCTCCAATTCTCTATTCCGAATACGACCCAACCAGGCCGTTCTCCGAGGCATCTATGATGGGTCTGCTGACAAATCTGGCAGACAGGGAACTGGTGCACATGATCAACTGGGCGAAGCGCGTACCCGGATTCGTCGATCTTGCACTCCATGATCAGGTGCACTTGCTGGAGTGCGCTTGGATGGAGATCCTCATGATCGGGCTGGTGTGGCGGAGTATGGAACACCCCGGCAAGTTGCTGTTTGCGCCTAACCTCCTGTTGGACAGGAACCAGGGGAAATGTGTGGAGGGCGGTGTGGAAATCTTTGACATGCTCCTCGCTACCTCAAGCCGGTTTAGGATGATGAATCTGCAAGGCGAAGAGTTCGTGTGTCTCAAATCTATCATACTGTTGAACAGCGGAGTCTACACCTTCCTCTCCAGCACTCTGAAATCTCTGGAGGAGAAAGATCATATCCATCGCGTGCTGGACAAGATAACCGACACGTTGATTCACTTGATGGCCAAAGCTGGGCTCACTCTGCAACAACAACATCAGCGACTGGCACAGCTGTTGCTGATTTTGAGCCACATTCGGCACATGTCCAGCAAGAGAATGGAGCACCTCTATAGTATGAAGTGCAAGAACGTCGTACCCCTGTCTGATCTGCTTCTTGAAATGCTTGATGCCCACCGGCTG(SEQ ID NO.17)。
实施例14
本实施例制备了一种Cre重组酶调控系统，命名为质粒PB-EFS-50EC50，包括依次连接的EFS启动子、雌激素受体(ER50)、ERT2、Cre重组酶和ER50。
从ER50到ER50核苷酸序列:
AGCCTTGCCCTGTCACTTACAGCCGACCAGATGGTTTCCGCGCTTCTCGACGCTGAACCTCCAATTCTCTATTCCGAATACGACCCAACCAGGCCGTTCTCCGAGGCATCTATGATGGGTCTGCTGACAAATCTGGCAGACAGGGAACTGGTGCACATGATCAACTGGGCGAAGCGCGTACCCGGATTCGTCGATCTTGCACTCCATGATCAGGTGCACTTGCTGGAGTGCGCTTGGATGGAGATCCTCATGATCGGGCTGGTGTGGCGGAGTATGGAACACCCCGGCAAGTTGCTGTTTGCGCCTAACCTCCTGTTGGACAGGAACCAGGGGAAATGTGTGGAGGGCGGTGTGGAAATCTTTGACATGCTCCTCGCTACCTCAAGCCGGTTTAGGATGATGAATCTGCAAGGCGAAGAGTTCGTGTGTCTCAAATCTATCATACTGTTGAACAGCGGAGTCTACACCTTCCTCTCCAGCACTCTGAAATCTCTGGAGGAGAAAGATCATATCCATCGCGTGCTGGACAAGATAACCGACACGTTGATTCACTTGATGGCCAAAGCTGGGCTCACTCTGCAACAACAACATCAGCGACTGGCACAGCTGTTGCTGATTTTGAGCCACATTCGGCACATGTCCAGCAAGAGAATGGAGCACCTCTATAGTATGAAGTGCAAGAACGTCGTACCCCTGTCTGATCTGCTTCTTGAAATGCTTGATGCCCACCGGCTGGGATCTGGTAGCGGACATATGGCTGGAGACATGAGAGCTGCCAACCTTTGGCCAAGCCCGCTCATGATCAAACGCTCTAAGAAGAACAGCCTGGCCTTGTCCCTGACGGCCGACCAGATGGTCAGTGCCTTGTTGGATGCTGAGCCCCCCATACTCTATTCCGAGTATGATCCTACCAGACCCTTCAGTGAAGCTTCGATGATGGGCTTACTGACCAACCTGGCAGACAGGGAGCTGGTTCACATGATCAACTGGGCGAAGAGGGTGCCAGGCTTTGTGGATTTGACCCTCCATGATCAGGTCCACCTTCTAGAATGTGCCTGGCTAGAGATCCTGATGATTGGTCTCGTCTGGCGCTCCATGGAGCACCCAGTGAAGCTACTGTTTGCTCCTAACTTGCTCTTGGACAGGAACCAGGGAAAATGTGTAGAGGGCATGGTGGAGATCTTCGACATGCTGCTGGCTACATCATCTCGGTTCCGCATGATGAATCTGCAGGGAGAGGAGTTTGTGTGCCTCAAATCTATTATTTTGCTTAATTCTGGAGTGTACACATTTCTGTCCAGCACCCTGAAGTCTCTGGAAGAGAAGGACCATATCCACCGAGTCCTGGACAAGATCACAGACACTTTGATCCACCTGATGGCCAAGGCAGGCCTGACCCTGCAGCAGCAGCACCAGCGGCTGGCCCAGCTCCTCCTCATCCTCTCCCACATCAGGCACATGAGTAACAAAGGCATGGAGCATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCCCTCTATGACCTGCTGCTGGAGGCGGCGGACGCCCACCGCCTACATGCGCCCACTAGCCGTGGAGGGGCATCCGTGGAGGAGACGGACCAAAGCCACTTGGCCACTGCGGGCTCTACTTCATCGCATTCCTTGCAAAAGTATTACATCACGGGGGAGGCAGAGGGTTTCCCTGCCACAGGATCTGGTAGCAACGGCGGTAGCGTGTCCAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGCATTGCCAGTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCGCAAGAACCTGATGGACATGTTCAGGGATCGCCAGGCGTTTTCTGAGCATACCTGGAAAATGCTTCTGTCCGTTTGCCGGTCGTGGGCGGCATGGTGCAAGTTGAATAACCGGAAATGGTTTCCCGCAGAACCTGAAGATGTTCGCGATTATCTTCTATATCTTCAGGCGCGCGGTCTGGCAGTAAAAACTATCCAGCAACATTTGGGCCAGCTAAACATGCTTCATCGTCGGTCCGGGCTGCCACGACCAAGTGACAGCAATGCTGTTTCACTGGTTATGCGGCGGATCCGAAAAGAAAACGTTGATGCCGGTGAACGTGCAAAACAGGCTCTAGCGTTCGAACGCACTGATTTCGACCAGGTTCGTTCACTCATGGAAAATAGCGATCGCTGCCAGGATATACGTAATCTGGCATTTCTGGGGATTGCTTATAACACCCTGTTACGTATAGCCGAAATTGCCAGGATCAGGGTTAAAGATATCTCACGTACTGACGGTGGGAGAATGTTAATCCATATTGGCAGAACGAAAACGCTGGTTAGCACCGCAGGTGTAGAGAAGGCACTTAGCCTGGGGGTAACTAAACTGGTCGAGCGATGGATTTCCGTCTCTGGTGTAGCTGATGATCCGAATAACTACCTGTTTTGCCGGGTCAGAAAAAATGGTGTTGCCGCGCCATCTGCCACCAGCCAGCTATCAACTCGCGCCCTGGAAGGGATTTTTGAAGCAACTCATCGATTGATTTACGGCGCTAAGGATGACTCTGGTCAGAGATACCTGGCCTGGTCTGGACACAGTGCCCGTGTCGGAGCCGCGCGAGATATGGCCCGCGCTGGAGTTTCAATACCGGAGATCATGCAAGCTGGTGGCTGGACCAATGTAAATATTGTCATGAACTATATCCGTAACCTGGATAGTGAAACAGGGGCAATGGTGCGCCTGCTGGAAGATGGCGATCTCGAGAGCCTTGCCCTGTCACTTACAGCCGACCAGATGGTTTCCGCGCTTCTCGACGCTGAACCTCCAATTCTCTATTCCGAATACGACCCAACCAGGCCGTTCTCCGAGGCATCTATGATGGGTCTGCTGACAAATCTGGCAGACAGGGAACTGGTGCACATGATCAACTGGGCGAAGCGCGTACCCGGATTCGTCGATCTTGCACTCCATGATCAGGTGCACTTGCTGGAGTGCGCTTGGATGGAGATCCTCATGATCGGGCTGGTGTGGCGGAGTATGGAACACCCCGGCAAGTTGCTGTTTGCGCCTAACCTCCTGTTGGACAGGAACCAGGGGAAATGTGTGGAGGGCGGTGTGGAAATCTTTGACATGCTCCTCGCTACCTCAAGCCGGTTTAGGATGATGAATCTGCAAGGCGAAGAGTTCGTGTGTCTCAAATCTATCATACTGTTGAACAGCGGAGTCTACACCTTCCTCTCCAGCACTCTGAAATCTCTGGAGGAGAAAGATCATATCCATCGCGTGCTGGACAAGATAACCGACACGTTGATTCACTTGATGGCCAAAGCTGGGCTCACTCTGCAACAACAACATCAGCGACTGGCACAGCTGTTGCTGATTTTGAGCCACATTCGGCACATGTCCAGCAAGAGAATGGAGCACCTCTATAGTATGAAGTGCAAGAACGTCGTACCCCTGTCTGATCTGCTTCTTGAAATGCTTGATGCCCACCGGCTG(SEQ ID NO.18)。
实施例15
本实施例制备了一种Cre重组酶调控系统，命名为质粒PB-EFS-T50ECE，包括依次连接的EFS启动子、具有3个点突变(G96V/M239A/L240A)的雌激素受体(T50)、ERT2、Cre重组酶和T50。
从T50到T50核苷酸序列:
AGCCTTGCCCTGTCACTTACAGCCGACCAGATGGTTTCCGCGCTTCTCGACGCTGAACCTCCAATTCTCTATTCCGAATACGACCCAACCAGGCCGTTCTCCGAGGCATCTATGATGGGTCTGCTGACAAATCTGGCAGACAGGGAACTGGTGCACATGATCAACTGGGCGAAGCGCGTACCCGGATTCGTCGATCTTGCACTCCATGATCAGGTGCACTTGCTGGAGTGCGCTTGGATGGAGATCCTCATGATCGGGCTGGTGTGGCGGAGTATGGAACACCCCGTCAAGTTGCTGTTTGCGCCTAACCTCCTGTTGGACAGGAACCAGGGGAAATGTGTGGAGGGCGGTGTGGAAATCTTTGACATGCTCCTCGCTACCTCAAGCCGGTTTAGGATGATGAATCTGCAAGGCGAAGAGTTCGTGTGTCTCAAATCTATCATACTGTTGAACAGCGGAGTCTACACCTTCCTCTCCAGCACTCTGAAATCTCTGGAGGAGAAAGATCATATCCATCGCGTGCTGGACAAGATAACCGACACGTTGATTCACTTGATGGCCAAAGCTGGGCTCACTCTGCAACAACAACATCAGCGACTGGCACAGCTGTTGCTGATTTTGAGCCACATTCGGCACATGTCCAGCAAGAGAATGGAGCACCTCTATAGTATGAAGTGCAAGAACGTCGTACCCCTGTCTGATCTGCTTCTTGAAGCTGCCGATGCCCACCGGCTGGGATCTGGTAGCGGACATATGGCTGGAGACATGAGAGCTGCCAACCTTTGGCCAAGCCCGCTCATGATCAAACGCTCTAAGAAGAACAGCCTGGCCTTGTCCCTGACGGCCGACCAGATGGTCAGTGCCTTGTTGGATGCTGAGCCCCCCATACTCTATTCCGAGTATGATCCTACCAGACCCTTCAGTGAAGCTTCGATGATGGGCTTACTGACCAACCTGGCAGACAGGGAGCTGGTTCACATGATCAACTGGGCGAAGAGGGTGCCAGGCTTTGTGGATTTGACCCTCCATGATCAGGTCCACCTTCTAGAATGTGCCTGGCTAGAGATCCTGATGATTGGTCTCGTCTGGCGCTCCATGGAGCACCCAGTGAAGCTACTGTTTGCTCCTAACTTGCTCTTGGACAGGAACCAGGGAAAATGTGTAGAGGGCATGGTGGAGATCTTCGACATGCTGCTGGCTACATCATCTCGGTTCCGCATGATGAATCTGCAGGGAGAGGAGTTTGTGTGCCTCAAATCTATTATTTTGCTTAATTCTGGAGTGTACACATTTCTGTCCAGCACCCTGAAGTCTCTGGAAGAGAAGGACCATATCCACCGAGTCCTGGACAAGATCACAGACACTTTGATCCACCTGATGGCCAAGGCAGGCCTGACCCTGCAGCAGCAGCACCAGCGGCTGGCCCAGCTCCTCCTCATCCTCTCCCACATCAGGCACATGAGTAACAAAGGCATGGAGCATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCCCTCTATGACCTGCTGCTGGAGGCGGCGGACGCCCACCGCCTACATGCGCCCACTAGCCGTGGAGGGGCATCCGTGGAGGAGACGGACCAAAGCCACTTGGCCACTGCGGGCTCTACTTCATCGCATTCCTTGCAAAAGTATTACATCACGGGGGAGGCAGAGGGTTTCCCTGCCACAGGATCTGGTAGCAACGGCGGTAGCGTGTCCAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGCATTGCCAGTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCGCAAGAACCTGATGGACATGTTCAGGGATCGCCAGGCGTTTTCTGAGCATACCTGGAAAATGCTTCTGTCCGTTTGCCGGTCGTGGGCGGCATGGTGCAAGTTGAATAACCGGAAATGGTTTCCCGCAGAACCTGAAGATGTTCGCGATTATCTTCTATATCTTCAGGCGCGCGGTCTGGCAGTAAAAACTATCCAGCAACATTTGGGCCAGCTAAACATGCTTCATCGTCGGTCCGGGCTGCCACGACCAAGTGACAGCAATGCTGTTTCACTGGTTATGCGGCGGATCCGAAAAGAAAACGTTGATGCCGGTGAACGTGCAAAACAGGCTCTAGCGTTCGAACGCACTGATTTCGACCAGGTTCGTTCACTCATGGAAAATAGCGATCGCTGCCAGGATATACGTAATCTGGCATTTCTGGGGATTGCTTATAACACCCTGTTACGTATAGCCGAAATTGCCAGGATCAGGGTTAAAGATATCTCACGTACTGACGGTGGGAGAATGTTAATCCATATTGGCAGAACGAAAACGCTGGTTAGCACCGCAGGTGTAGAGAAGGCACTTAGCCTGGGGGTAACTAAACTGGTCGAGCGATGGATTTCCGTCTCTGGTGTAGCTGATGATCCGAATAACTACCTGTTTTGCCGGGTCAGAAAAAATGGTGTTGCCGCGCCATCTGCCACCAGCCAGCTATCAACTCGCGCCCTGGAAGGGATTTTTGAAGCAACTCATCGATTGATTTACGGCGCTAAGGATGACTCTGGTCAGAGATACCTGGCCTGGTCTGGACACAGTGCCCGTGTCGGAGCCGCGCGAGATATGGCCCGCGCTGGAGTTTCAATACCGGAGATCATGCAAGCTGGTGGCTGGACCAATGTAAATATTGTCATGAACTATATCCGTAACCTGGATAGTGAAACAGGGGCAATGGTGCGCCTGCTGGAAGATGGCGATCTCGAGCCATCTGCTGGAGACATGAGAGCTGCCAACCTTTGGCCAAGCCCGCTCATGATCAAACGCTCTAAGAAGAACAGCCTGGCCTTGTCCCTGACGGCCGACCAGATGGTCAGTGCCTTGTTGGATGCTGAGCCCCCCATACTCTATTCCGAGTATGATCCTACCAGACCCTTCAGTGAAGCTTCGATGATGGGCTTACTGACCAACCTGGCAGACAGGGAGCTGGTTCACATGATCAACTGGGCGAAGAGGGTGCCAGGCTTTGTGGATTTGACCCTCCATGATCAGGTCCACCTTCTAGAATGTGCCTGGCTAGAGATCCTGATGATTGGTCTCGTCTGGCGCTCCATGGAGCACCCAGTGAAGCTACTGTTTGCTCCTAACTTGCTCTTGGACAGGAACCAGGGAAAATGTGTAGAGGGCATGGTGGAGATCTTCGACATGCTGCTGGCTACATCATCTCGGTTCCGCATGATGAATCTGCAGGGAGAGGAGTTTGTGTGCCTCAAATCTATTATTTTGCTTAATTCTGGAGTGTACACATTTCTGTCCAGCACCCTGAAGTCTCTGGAAGAGAAGGACCATATCCACCGAGTCCTGGACAAGATCACAGACACTTTGATCCACCTGATGGCCAAGGCAGGCCTGACCCTGCAGCAGCAGCACCAGCGGCTGGCCCAGCTCCTCCTCATCCTCTCCCACATCAGGCACATGAGTAACAAAGGCATGGAGCATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCCCTCTATGACCTGCTGCTGGAGGCGGCGGACGCCCACCGCCTACATGCGCCCACTAGCCGTGGAGGGGCATCCGTGGAGGAGACGGACCAAAGCCACTTGGCCACTGCGGGCTCTACTTCATCGCATTCCTTGCAAAAGTATTACATCACGGGGGAGGCAGAGGGTTTCCCTGCCACA(SEQ ID NO.19)。
实施例16
本实施例制备了一种Cre重组酶调控系统，命名为质粒PB-EFS-T50ECT50，包括依次连接的EFS启动子、T50、ERT2、Cre重组酶和T50。
从T50到T50核苷酸序列:
AGCCTTGCCCTGTCACTTACAGCCGACCAGATGGTTTCCGCGCTTCTCGACGCTGAACCTCCAATTCTCTATTCCGAATACGACCCAACCAGGCCGTTCTCCGAGGCATCTATGATGGGTCTGCTGACAAATCTGGCAGACAGGGAACTGGTGCACATGATCAACTGGGCGAAGCGCGTACCCGGATTCGTCGATCTTGCACTCCATGATCAGGTGCACTTGCTGGAGTGCGCTTGGATGGAGATCCTCATGATCGGGCTGGTGTGGCGGAGTATGGAACACCCCGTCAAGTTGCTGTTTGCGCCTAACCTCCTGTTGGACAGGAACCAGGGGAAATGTGTGGAGGGCGGTGTGGAAATCTTTGACATGCTCCTCGCTACCTCAAGCCGGTTTAGGATGATGAATCTGCAAGGCGAAGAGTTCGTGTGTCTCAAATCTATCATACTGTTGAACAGCGGAGTCTACACCTTCCTCTCCAGCACTCTGAAATCTCTGGAGGAGAAAGATCATATCCATCGCGTGCTGGACAAGATAACCGACACGTTGATTCACTTGATGGCCAAAGCTGGGCTCACTCTGCAACAACAACATCAGCGACTGGCACAGCTGTTGCTGATTTTGAGCCACATTCGGCACATGTCCAGCAAGAGAATGGAGCACCTCTATAGTATGAAGTGCAAGAACGTCGTACCCCTGTCTGATCTGCTTCTTGAAGCTGCCGATGCCCACCGGCTGGGATCTGGTAGCGGACATATGGCTGGAGACATGAGAGCTGCCAACCTTTGGCCAAGCCCGCTCATGATCAAACGCTCTAAGAAGAACAGCCTGGCCTTGTCCCTGACGGCCGACCAGATGGTCAGTGCCTTGTTGGATGCTGAGCCCCCCATACTCTATTCCGAGTATGATCCTACCAGACCCTTCAGTGAAGCTTCGATGATGGGCTTACTGACCAACCTGGCAGACAGGGAGCTGGTTCACATGATCAACTGGGCGAAGAGGGTGCCAGGCTTTGTGGATTTGACCCTCCATGATCAGGTCCACCTTCTAGAATGTGCCTGGCTAGAGATCCTGATGATTGGTCTCGTCTGGCGCTCCATGGAGCACCCAGTGAAGCTACTGTTTGCTCCTAACTTGCTCTTGGACAGGAACCAGGGAAAATGTGTAGAGGGCATGGTGGAGATCTTCGACATGCTGCTGGCTACATCATCTCGGTTCCGCATGATGAATCTGCAGGGAGAGGAGTTTGTGTGCCTCAAATCTATTATTTTGCTTAATTCTGGAGTGTACACATTTCTGTCCAGCACCCTGAAGTCTCTGGAAGAGAAGGACCATATCCACCGAGTCCTGGACAAGATCACAGACACTTTGATCCACCTGATGGCCAAGGCAGGCCTGACCCTGCAGCAGCAGCACCAGCGGCTGGCCCAGCTCCTCCTCATCCTCTCCCACATCAGGCACATGAGTAACAAAGGCATGGAGCATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCCCTCTATGACCTGCTGCTGGAGGCGGCGGACGCCCACCGCCTACATGCGCCCACTAGCCGTGGAGGGGCATCCGTGGAGGAGACGGACCAAAGCCACTTGGCCACTGCGGGCTCTACTTCATCGCATTCCTTGCAAAAGTATTACATCACGGGGGAGGCAGAGGGTTTCCCTGCCACAGGATCTGGTAGCAACGGCGGTAGCGTGTCCAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGCATTGCCAGTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCGCAAGAACCTGATGGACATGTTCAGGGATCGCCAGGCGTTTTCTGAGCATACCTGGAAAATGCTTCTGTCCGTTTGCCGGTCGTGGGCGGCATGGTGCAAGTTGAATAACCGGAAATGGTTTCCCGCAGAACCTGAAGATGTTCGCGATTATCTTCTATATCTTCAGGCGCGCGGTCTGGCAGTAAAAACTATCCAGCAACATTTGGGCCAGCTAAACATGCTTCATCGTCGGTCCGGGCTGCCACGACCAAGTGACAGCAATGCTGTTTCACTGGTTATGCGGCGGATCCGAAAAGAAAACGTTGATGCCGGTGAACGTGCAAAACAGGCTCTAGCGTTCGAACGCACTGATTTCGACCAGGTTCGTTCACTCATGGAAAATAGCGATCGCTGCCAGGATATACGTAATCTGGCATTTCTGGGGATTGCTTATAACACCCTGTTACGTATAGCCGAAATTGCCAGGATCAGGGTTAAAGATATCTCACGTACTGACGGTGGGAGAATGTTAATCCATATTGGCAGAACGAAAACGCTGGTTAGCACCGCAGGTGTAGAGAAGGCACTTAGCCTGGGGGTAACTAAACTGGTCGAGCGATGGATTTCCGTCTCTGGTGTAGCTGATGATCCGAATAACTACCTGTTTTGCCGGGTCAGAAAAAATGGTGTTGCCGCGCCATCTGCCACCAGCCAGCTATCAACTCGCGCCCTGGAAGGGATTTTTGAAGCAACTCATCGATTGATTTACGGCGCTAAGGATGACTCTGGTCAGAGATACCTGGCCTGGTCTGGACACAGTGCCCGTGTCGGAGCCGCGCGAGATATGGCCCGCGCTGGAGTTTCAATACCGGAGATCATGCAAGCTGGTGGCTGGACCAATGTAAATATTGTCATGAACTATATCCGTAACCTGGATAGTGAAACAGGGGCAATGGTGCGCCTGCTGGAAGATGGCGATCTCGAGCCATCTGCTGGAGACATGAGAGCTGCCAACCTTTGGCCAAGCCCGCTCATGATCAAACGCTCTAAGAAGAACAGCCTGGCCTTGTCCCTGACGGCCGACCAGATGGTCAGTGCCTTGTTGGATGCTGAGCCCCCCATACTCTATTCCGAGTATGATCCTACCAGACCCTTCAGTGAAGCTTCGATGATGGGCTTACTGACCAACCTGGCAGACAGGGAGCTGGTTCACATGATCAACTGGGCGAAGAGGGTGCCAGGCTTTGTGGATTTGACCCTCCATGATCAGGTCCACCTTCTAGAATGTGCCTGGCTAGAGATCCTGATGATTGGTCTCGTCTGGCGCTCCATGGAGCACCCAGTGAAGCTACTGTTTGCTCCTAACTTGCTCTTGGACAGGAACCAGGGAAAATGTGTAGAGGGCATGGTGGAGATCTTCGACATGCTGCTGGCTACATCATCTCGGTTCCGCATGATGAATCTGCAGGGAGAGGAGTTTGTGTGCCTCAAATCTATTATTTTGCTTAATTCTGGAGTGTACACATTTCTGTCCAGCACCCTGAAGTCTCTGGAAGAGAAGGACCATATCCACCGAGTCCTGGACAAGATCACAGACACTTTGATCCACCTGATGGCCAAGGCAGGCCTGACCCTGCAGCAGCAGCACCAGCGGCTGGCCCAGCTCCTCCTCATCCTCTCCCACATCAGGCACATGAGTAACAAAGGCATGGAGCATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCCCTCTATGACCTGCTGCTGGAGGCGGCGGACGCCCACCGCCTACATGCGCCCACTAGCCGTGGAGGGGCATCCGTGGAGGAGACGGACCAAAGCCACTTGGCCACTGCGGGCTCTACTTCATCGCATTCCTTGCAAAAGTATTACATCACGGGGGAGGCAGAGGGTTTCCCTGCCACA(SEQ ID NO.20)。
实施例17
本实施例制备了一种Cre重组酶调控系统，命名为质粒px601-EFS-C-gP53.RB1，以购自优宝生物科技有限公司的质粒px601为基础(Addgene)，包括依次连接的EFS启动子、Cre重组酶、U6启动子和靶向P53、RB1基因的gRNA。
P53 gRNA：5’-GAAAATGTCTCCTGGCTC-3’(SEQ ID NO.4)。
RB1 gRNA：5’-GGCCCCGAAGAGCTGCCCC-3’(SEQ ID NO.5)。
实施例18
本实施例制备了一种Cre重组酶调控系统，命名为质粒px601-EFS-50C-gP53.RB1，包括依次连接的EFS启动子、ER50、Cre重组酶、U6启动子和靶向P53、RB1基因的gRNA。
实施例19
本实施例制备了一种Cre重组酶调控系统，命名为质粒px601-EFS-CE-gP53.RB1，包括依次连接的EFS启动子、Cre重组酶、ERT2、U6启动子和靶向P53、RB1基因的gRNA。
实施例20
本实施例制备了一种Cre重组酶调控系统，命名为质粒px601-EFS-ECE-gP53.RB1，包括依次连接的EFS启动子、ERT2、Cre重组酶、ERT2、U6启动子和靶向P53、RB1基因的gRNA。
实施例21
本实施例制备了一种Cre重组酶调控系统，命名为质粒px601-EFS-50ECE-gP53.RB1，包括依次连接的EFS启动子、ER50、ERT2、Cre重组酶、ERT2、U6启动子和靶向P53、RB1基因的gRNA。
测试例
1、Cre重组酶调控系统在4OHT条件下Cre表达和定位情况检测
实施例1-6中构建的Cre重组酶调控系统的载体示意图如图1所示。Cre重组酶调控系统在有、无4OHT条件下，Cre表达和定位情况检测如下所示：
细胞转染：
(1)培养HEK 293T细胞至细胞汇合度为70％-80％。
(2)使用Opti-MEMTM培养基稀释质粒DNA(分别为实施例1-6制备得到的Cre重组酶调控系统)和LipofectamineTM 8000试剂，用枪轻轻吹打混匀，注意不可Vortex或离心。质粒DNA与Opti-MEMTM培养基与LipofectamineTM8000试剂的质量体积比为0.1μg：5μL：0.16μL。
(3)把培养有细胞的96孔板每孔换成130μL新鲜培养液，向HEK 293T细胞中加入DNA-脂质复合物，并依次加入和不加入4OHT，连续加入和不加入4OHT 3天，然后将细胞置于激光共聚焦下进行观察拍照。
结果如图2所示，从图中可以看出，在没有小分子药物4OHT的条件下，绿色荧光蛋白主要在细胞质中，与不含ER50融合蛋白的细胞相比，含有ER50融合蛋白的细胞质中EGFP荧光较弱；而在有4OHT的细胞中，绿色荧光蛋白主要在细胞核中。表明，在没有小分子药物4羟基他莫昔芬(4OHT)的条件下，Cre重组酶与雌激素受体组成的融合蛋白定位于细胞质中，含有雌激素受体(ER50)，将与转录因子融合，这些大部分未折叠的结构域以融合蛋白为目标，进行快速蛋白酶体降解，即没有4OHT的条件下，绿色荧光蛋白主要在细胞质中，与不含ER50融合蛋白的细胞相比，含有ER50融合蛋白的细胞质中EGFP荧光较弱；而在有4OHT的细胞中，融合的Cre蛋白才会通过构象变化从锚定蛋白HSP90上解离下来，进入细胞核，识别loxP位点并发生重组。这样就通过控制4OHT的加入时间，可以实现对基因重组时间特异性的调控。
2、Cre重组酶调控系统调控Cre对LoxP调控的严谨性的验证
(1)Cre重组酶功能验证报告细胞的构建
1)报告载体构建
通过设计了报告载体PB-CMV-L-Cherry-L-EGFP，质粒的结构如图3所示。质粒PB-CMV-L-Cherry-L-EGFP，以PB转座子为基础，包括依次连接的T7启动子、CMV enhancer、CMVpromoter，loxP位点，红色荧光蛋白mCherry，BGH poly(A)signal，loxP位点，绿色荧光蛋白EGFP和SV40 poly(A)signal。
从T7启动子到EGFP的核苷酸序列如下：
taatacgactcactatagggcgaattggagctcggtattcacgacagcaggctgaataataaaaaaattagaaactattatttaaccctagaaagataatcatattgtgacgtacgttaaagataatcatgcgtaaaattgacgcatgtgttttatcggtctgtatatcgaggtttatttattaatttgaatagatattaagttttattatatttacacttacatactaataataaattcaacaaacaatttatttatgtttatttatttattaaaaaaaaacaaaaactcaaaatttcttctataaagtaacaaaacttttaaacattctctcttttacaaaaataaacttattttgtactttaaaaacagtcatgttgtattataaaataagtaattagcttaacctatacataatagaaacaaattatacttattagtcagtcagaaacaactttggcacatatcaatattatgctctcgttaatcgcagatctCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCgaattcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgccaccATGgtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaaggttaactaaaagcttgctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctcgactagagcttgcggaacccttagtcgagataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgctagccaacaagctcggatccGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA(SEQ ID NO.21)。
2)细胞转染
①培养HEK 293T细胞至细胞汇合度为70％-90％。
②使用Opti-MEMTM培养基稀释LipofectamineTM3000试剂，得到LipofectamineTM3000稀释液。Opti-MEMTM培养基与LipofectamineTM3000试剂的体积比为25:1。
③使用Opti-MEMTM培养基稀释报告载体(PB-CMV-L-Cherry-L-EGFP)和转座酶，得到DNA预混液；随后向DNA预混液中添加P3000TM试剂，得到DNA转染液。
其中，报告载体与转座酶的质量比为2:1，DNA预混液与P3000TM试剂的质量体积比为0.5μg:1μL。
④将LipofectamineTM3000稀释液与DNA转染液混匀，室温孵育10-15分钟，得到DNA-脂质复合物。
⑤向HEK 293T细胞中加入DNA-脂质复合物，将转染好的细胞放入培养箱中继续观察培养，转染24小时后细胞表达情况如图4所示。
3)细胞传代
①去掉旧培养基，加入0.05％胰酶，37℃消化3min，加入500μL培养基终止消化，吹打混匀并转移到1.5mL离心管中。
②1000rpm离心5min，去上清。
③加入300μL培养基，使用移液枪上下移液混合均匀，吹打成细胞悬液。
④取10μL细胞悬液到10cm培养皿中，放入37℃，5％ CO2培养箱中进行培养，每天观察细胞形态，约一周左右进行挑单克隆。
4)单克隆挑选
细胞培养一周左右在显微镜下看到细胞克隆生成，挑选外缘光滑平整，细胞形态正常，生长良好且表达红色荧光均一的克隆，克隆形态如图5所示。
具体步骤如下：
①在24孔板中，每孔添加含双抗和10％胎牛血清(FBS)的培养基。
②在显微镜下，使用10μL移液枪进行克隆刮取，转移到步骤①的24孔板中。
③将24孔板置于37℃和5％ CO2的恒温培养箱中培养。
5)扩大培养
观察24孔板中细胞长满后(覆盖率达到80％)，将细胞消化下来，离心，重悬，转移到6孔板中扩大培养，获得稳定遗传细胞系备用，简称LRLG细胞系。
构建得到报告载体PB-CMV-L-Cherry-L-EGFP，并将其转入293T细胞中，通过筛选单克隆进行培养，得到稳定表达红色荧光的报告细胞系(LRLG细胞系)。构建结合了雌激素受体ERT2和ER50的优化载体，并将它们转入筛选的稳定表达的LRLG细胞系中，分为加药和不加药组继续培养，即可验证Cre重组酶调控系统的有效性。
(2)Cre重组酶调控系统的验证
实施例7-16中构建的Cre重组酶调控系统的载体示意图如图6所示，将实施例7-16中构建的Cre重组酶调控系统中整合了报告载体pCMV-loxP-mCherry-loxP-EGFP的Cre重组系统报告细胞中。工作原理示意图如图7所示，在没有小分子药物4羟基他莫昔芬(4OHT)的条件下，细胞只有红色荧光，而不启动EGFP基因的表达，在有小分子药物4羟基他莫昔芬(4OHT)的条件下，位于两个方向相同LoxP位点间的序列(mCherry和终止子序列)被Cre重组酶有效切除，进而启动EGFP基因的表达。具体的验证过程如下：
1)细胞转染
①培养LRLG细胞至细胞汇合度为70％-80％。
②使用Opti-MEMTM培养基稀释质粒DNA(分别为实施例7-16中构建的Cre重组酶调控系统)和LipofectamineTM8000试剂，用枪轻轻吹打混匀，注意不可Vortex或离心。质粒DNA与Opti-MEMTM培养基与LipofectamineTM8000试剂的质量体积比为0.25μg:12.5μL:0.4μL。
③把培养有细胞的48孔板每孔换成200μL新鲜培养液，向HEK 293T细胞中加入DNA-脂质复合物，并依次加入和不加入不同浓度(分别为0、0.1、0.5、2.5、10、50、200、1000nM)的4OHT。
2)流式检测
连续加入和不加入不同浓度的4OHT 3天，显微镜下拍照并收细胞进行流式实验验证，结果如图8所示，从图中可以看出，在整合了报告载体pCMV-loxP-mCherry-loxP-EGFP的Cre重组系统报告细胞中，通过调节4OHT剂量，可以在相似范围内控制EGFP的上调，即红色荧光变成绿色荧光的比例。
3、Cre重组酶调控系统在4OHT条件下动物体内调控Cre验证实验
Cre重组酶调控系统在4OHT条件下动物体内调控Cre验证实验的工作原理示意图如图9所示，具体如下：Rosa26-LsL-cas9-tdTomato是红色荧光基因编辑工具小鼠(购买自集萃药康生物科技股份有限公司)，该小鼠与全身表达或组织特异表达Cre重组酶的品系交配后，将会在表达Cre的细胞中删除stop元件，开启Cas9和tdTomato的表达。从该工具小鼠中分离小鼠神经干细胞(mNSC)和小鼠成纤维细胞(MEF)，将分别为实施例17-21中构建的Cre重组酶调控系统(示意图如图10所示)分别电转到2种细胞系中，在有小分子药物4羟基他莫昔芬(4OHT)的条件下，将会在表达Cre的细胞中删除stop元件，进而启动Cas9和tdTomato的表达。具体验证实验如下：
(1)mNSC和MEF原代细胞分离
1)小鼠神经干细胞(mNSC)分离
①将怀孕13.5天的LSL-Cas9-tdTomato鼠脱颈椎处死，并在装有75％乙醇的烧杯中浸泡消毒。
②在超净工作台中取胎鼠，将胎鼠依次用75％乙醇，PBS浸泡多次，断颈取头部，依次剥离头皮、颅骨、脑膜和血管，分离得到两侧大脑半球。将得到的大脑半球用眼科剪剪碎，收集于6cm皿中，然后加入0.25％的trypsin-EDTA于37℃下消化10min，加入含10％胎牛血清的培养基终止消化，并用5mL的吸管反复轻柔吹打15次得到混悬液。
③将混悬液转移到15mL离心管，1000r/min离心5min，弃上清，加入神经干细胞培养基(培养基配方如表1所示)重悬沉淀，以适宜的细胞浓度接种于6cm皿中，置于体积分数为5％CO2，37℃的细胞培养箱中培养。
表1小鼠神经干培养基
Figure BDA0004069440210000211
2)小鼠成纤维细胞(MEF)分离
①将怀孕13.5天的LSL-Cas9-tdTomato鼠脱颈椎处死，并在装有75％乙醇的烧杯中浸泡消毒。
②在超净工作台中取胎鼠，将胎鼠依次用75％乙醇，PBS浸泡多次，取其背部皮肤，放入75％乙醇中浸泡消毒，PBS漂洗皮肤，将皮肤剪碎，均匀平贴于无菌10cm平皿中，然后加入0.25％的trypsin-EDTA于37℃下消化15min，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，并用5mL的吸管反复轻柔吹打15次得到混悬液。
③将混悬液转移到15mL离心管，1000r/min离心5min，弃上清，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬沉淀，以适宜的细胞浓度接种于10cm皿中，置于体积分数为5％CO2，37℃的细胞培养箱中培养。
(2)在mNSC中不同组合在有、无4OHT条件下体内调控Cre
mNSC电转：
1)收集细胞融合率达到70-90％的mNSC细胞，吸掉培养基，DPBS清洗细胞2次，弃去，加入Accutase，37℃孵育3min。
2)加入DPBS，吹打混匀后转移至1.5mL离心管。
3)1000rpm，离心5分钟。
4)加11μL NeonTM试剂盒中的bufferR到EP离心管中，然后分别加入报告质粒PB-CMV-L-Cherry-L-EGFP(简称LR)或实施例17-21中构建的Cre重组酶调控系统(示意图如图10所示)的任一个，重悬细胞沉淀，最终细胞密度为1.0×107/mL。
5)用2.5mL缓冲液E填充NeonTM管，将NeonTM管插入NeonTM移液器站，直到听到咔哒声。
6)将NeonTM移液器上的按钮按到第二个位置以打开夹子，插入NeonTM吸头，直到夹子完全抓住活塞的安装杆。
7)将NeonTM吸头浸入细胞-RNP复合物中，缓慢按钮，将细胞-RNP复合物吸入NeonTM吸头，在移液过程中避免气泡。
8)将装有样品的NeonTM移液器垂直插入放置在NeonTM移液器站中的NeonTM管中，直到听到咔嗒声。
9)设置电转参数如下表2所示：
表2电转参数
Figure BDA0004069440210000212
10)按触摸屏上的开始，触摸屏显示Complete表示电穿孔已完成。
11)从NeonTM移液器站中取出NeonTM移液器，按移液器上的按钮到第一个停止位置，立即将样品从NeonTM吸头转移到预先铺上Matrigel matrix的24孔板中，每孔添加500μL神经干培养基，并分别加入和不加入4OHT，连续加入和不加入4OHT 3天，置荧光显微镜下拍照。
结果如图11所示，在有小分子药物4羟基他莫昔芬(4OHT)的条件下，5种质粒电转小鼠神经干细胞后均有红色荧光，在没有4OHT的条件下，C，CE，50C组有红色荧光，存在泄漏现象，ECE，50ECE几乎没有红色荧光，并且加药组50ECE红色荧光比ECE多。
(3)在MEF中不同组合在有、无4OHT条件下体内调控Cre
MEF电转：
1)收集细胞融合率达到70-90％的MEF细胞，吸掉培养基，PBS清洗细胞2次，弃去，加入0.05％的trypsin-EDTA于37℃下消化3min。
2)加入PBS，吹打混匀后转移至1.5mL离心管。
3)1000rpm，离心5分钟。
4)加11μL NeonTM试剂盒中的bufferR到EP离心管中，然后分别加入报告质粒PB-CMV-L-Cherry-L-EGFP(简称LR)或实施例17-21中构建的Cre重组酶调控系统(示意图如图10所示)中的任一个，重悬细胞沉淀，最终细胞密度为5.0×106/mL。
5)用2.5mL缓冲液E填充NeonTM管，将NeonTM管插入NeonTM移液器站，直到听到咔哒声。
6)将NeonTM移液器上的按钮按到第二个位置以打开夹子，插入NeonTM吸头，直到夹子完全抓住活塞的安装杆。
7)将NeonTM吸头浸入细胞-RNP复合物中，缓慢按钮，将细胞-RNP复合物吸入NeonTM吸头，在移液过程中避免气泡。
8)将装有样品的NeonTM移液器垂直插入放置在NeonTM移液器站中的NeonTM管中，直到听到咔嗒声。
9)设置电转参数如下表3所示：
表3电转参数
Figure BDA0004069440210000221
10)按触摸屏上的开始，触摸屏显示Complete表示电穿孔已完成。
11)从NeonTM移液器站中取出NeonTM移液器，按移液器上的按钮到第一个停止位置，立即将样品从NeonTM吸头转移到24孔板中，每孔添加500μL含10％胎牛血清的DMEM培养基，并分别加入和不加入4OHT，连续加入和不加入4OHT 5天，置荧光显微镜下拍照。
结果如图12所示，从图中可以看出，在有小分子药物4羟基他莫昔芬(4OHT)的条件下，5种质粒电转小鼠成纤维细胞后均有红色荧光，在没有4OHT的条件下，C，CE，50C组有红色荧光，存在泄漏现象，ECE，50ECE几乎没有红色荧光，并且加药组50ECE红色荧光比ECE多。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种Cre重组酶调控系统，其特征在于，所述Cre重组酶调控系统包括ER50基因。
2.根据权利要求1所述的Cre重组酶调控系统，其特征在于，所述ER50基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的Cre重组酶调控系统，其特征在于，所述Cre重组酶调控系统依次包括下述功能元件：可诱导启动子、ER50、ERT2、Cre重组酶的核苷酸序列、ERT2、sgRNA序列，其中，ERT2序列和Cre重组酶顺序可互换；sgRNA序列靶向目的基因。
4.根据权利要求3所述的Cre重组酶调控系统，其特征在于，所述可诱导启动子包括EFS启动子、Mx1或TRE启动子。
5.根据权利要求3所述的Cre重组酶调控系统，其特征在于，所述Cre重组酶为Escherichia virus P1 Cre重组酶、Sphingomonas sp.ERG5Cre重组酶或Salmonellaphage SJ46 Cre重组酶。
6.根据权利要求3所述的Cre重组酶调控系统，其特征在于，所述sgRNA序列为靶向p53基因和/或RB1基因的sgRNA序列；优选地，所述靶向p53基因的sgRNA序列如SEQ ID NO.4所示；优选地，所述靶向RB1基因的sgRNA序列如SEQ ID NO.5所示。
7.根据权利要求3所述的Cre重组酶调控系统，其特征在于，所述sgRNA序列前还包括组成型启动子，所述组成型启动子包括CMV、MSCV或U6启动子。
8.含有如权利要求1-7任一项所述的Cre重组酶调控系统的细胞。
9.含有如权利要求1-7任一项所述的Cre重组酶调控系统的试剂盒。
10.权利要求1-7任一项所述的Cre重组酶调控系统、权利要求8所述的细胞和权利要求9所述的试剂盒中的至少一种在以下任一项中的应用：
(1)制备修饰基因或调节基因表达的产品；
(2)制备药物调控系统；
(3)制备基因敲除研究工具。
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