FR2735983A1 - Peptide permettant de modifier l'activite du systeme immunitaire humain ou animal - Google Patents

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un peptide comportant une séquence en hélice alpha amphiphile polycationique, pour la préparation d'un médicament destiné à modifier l'activité du système immunitaire humain ou animal.

Description

La présente invention concerne de nouvelles applications de peptides présentant une hélice a amphiphile polycationique, dont certains étaient connus pour leurs propriétés antimicrobiennes, comme immunomodulateur.
Il existe chez les vertébrés de nombreux peptides à activité anti-microbienne. Ces peptides ont en commun une petite taille, un caractère cationique et une action membranolytique. Ils peuvent être classés en trois grands groupes : les peptides en hélice a amphiphile, les peptides à ponts disulfures et en feuillet fr et les peptides riches en proline (Nicolas et al, M/S, 1992, e, 423-431).
La peau des amphibiens est une source importante de peptides antimicrobiens du groupe en hélice Q amphiphile, des peptides de structure identique ou voisine sont trouvés dans le système nerveux central et le tractus gastro-intestinal des mammifères.
La Demanderesse a maintenant trouvé, de manière inattendue, que ces peptides, ou des peptides apparentés peuvent être utilisés pour modifier l'activité du système immunitaire humain ou animal.
L'hydrophobicité de ces peptides est très élevée et dans un milieu apolaire ils s'organisent en hélice, dans laquelle une des faces renferme la majorité des acides aminés polaires alors que les acides aminés hydrophobes sont situés sur la face opposée, la face apolaire couvrant une surface plus importante que celle de la face polaire.
La dermaseptine 1 a été tout d'abord isolée de la peau d'une rainette arboricole, Phyllomédusa sauvagii. D'autres peptides à activité antimicrobienne ont été isolés plus tard chez Ph. sauvagii et Ph. bicolor.
La plupart de ces peptides appartiennent à la famille des dermaseptines.
D'autres peptides de ce type appartiennent à une famille de neuropeptides ubiquitaires bien étudiés, ayant en commun un ensemble de propriétés structurales et fonctionnelles ainsi qu'un repliement caractéristique, le pprold. Ou a pu démontrer que ces neuropeptides SPYY,
NPY, PYY, notamment, étaient également doués de propriétés antimicrobiennes. Cette activité est probablement due à des propriétés structurales communes à ces neuropeptides et aux dermaseptines, à savoir la séquence C-terminale structurée en hélice alpha amphiphile et riche en résidus de lysine et d'arginine, chargés positivement. Cette séquence est, par ailleurs, extrêmement conservée parmi les membres de cette famille.
La présente invention concerne l'utilisation de ces peptides, dont certains sont connus pour leur activité antibiotique in vitro, pour la réalisation de médicaments et de façon plus générale des compositions destinées au traitement, par renforcement du système immunitaire, des pathologies induites par des agents infectieux et/ou tumoraux et qui sont favorisées par l'incapacité de certaines cellules spécialisées de l'organisme hôte à activer le système immunitaire, en particulier les macrophages et les lymphocytes.
En effet les animaux vertébrés se défendent contre les infections grâce à un système immunitaire complexe à médiation humorale et cellulaire. Ce n'est que récemment que l'on a découvert qu'un second système de défense existait en parallèle chez les vertébrés. Ce système de défense chimique est basé sur la production par divers tissus non myéloïdes (peau, muqueuses intestinales et respiratoires) de batteries de petits peptides cationiques à large spectre antimicrobiens. Dans le cadre de la présente invention, on a pu mettre en évidence que les dermaseptines isolées de la peau de grenouille sont efficaces contre un certain nombre de microorganismes pathogènes (protozoaires flagelés et champignons filamenteux), in vivo par mise en oeuvre de cette défense immunitaire.
L'interféron gamma, le TNF-alpha et certaines interleukines sont les activateurs classiques du système immunitaire. Des travaux récents suggèrent que l'administration de cytokines ou des cellules souches productrices de cytokines pourraient induire une meilleure résistance à l'infection, notamment chez des hôtes immunodéficients. Par ailleurs, les traitements classiques des maladies infectieuses, en particulier les leishmanioses cutanées, cutaneo-muqueuses ou viscérales comprennent principalemcnt les dérivés de l'antimoine, les diamidines et l'amphotéricine B. Leurs inconvénients sont bien connus : thérapeutique de longue durée, manifestations d'intolérance ou de toxicité, résistance des parasites aux antimoniés, prix de revient élevé.Dans certaines régions du monde (Inde, Soudan, Brésil ...) ces traitements s'avèrent souvent inefficaces et amènent à rechercher d'autres chimiothérapies.
C'est l'un des buts de la présente invention que de proposer des activateurs du système immunitaire, plus facilement disponibles et comportant un certain nombre d'avantages.
C'est pourquoi la présente invention concerne l'utilisation de peptides comportant une séquence en hélice a amphiphile polycationique, pour la préparation de médicaments destinés à modifier l'activité du système immunitaire humain ou animal et plus particulièrement à activer les macrophages et/ou les lymphocytes du système immunitaire humain ou animai.
Ce type de médicament peut être utilisé à titre préventif ou curatif, en particulier pour des maladies causées par des microorganismes ou des parasites intracellulaires ou ayant au moins une phase intracellulaire.
Les applications en thérapeutique humaine et animale des maladies infectieuses et cancéreuses, notamment chez les patients immunodéprimés, envisagées avec les compositions selon la présente invention sont notamment
- Paludisme
- Trypanosomiases
- Leishmanioses - Amibiase
- Filarioses
- Bilharzioses
- Echinococcose
- Lèpre
- Tuberculose
- Choléra
- Méningites à méningocoques
- Poliomyélite
- Hépatites
- Diarrhées aiguës
- SIDA
De manière avantageuse, le médicament est destiné, en améliorant la résistance aux affections opportunistes associées au syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA), à les prévenir ou à les traiter. II est également utile dans le cas d'immunodéficience médicamenteuse, notamment dans les cas de transplantation, chez les grands brûlés, en transfusion sanguine ou lors de chimiothérapie.
Le médicament préparé selon l'invention sera, selon un autre de ses aspects, utile dans la prévention ou le traitement du cancer.
L'invention comprend également l'utilisation de tels peptides à titre d'agents cicatrisants.
Les peptides tels que définis précédemment peuvent être utilisés seuls ou en association ; l'efficacité du médicament paraît augmenter de façon synergistique lorsque l'on mélange deux ou plusieurs peptides possédant une séquence en hélice a amphiphile.
Bien que les dermaseptines naturelles soient actives, diverses versions synthétiques et chimiquement modifiées qui ont été réalisées apportent certains avantages par rapport aux molécules parentales.
Tout d'abord, les dermaseptines sont de petits peptides ayant de 28 à 34 amino-acides, plus économiques à produire que les activateurs classiques du système immunitaire comme les cytokines qui doivent notamment être obtenues par des méthodes de génie génétique, mais surtout le fait que des analogues tronqués des dermaseptines ayant de 16 à 10 amino-acides soient actifs les rend encore plus économiques et plus attrayants.
Parmi les peptides de la famille des dermaseptines, on peut citer les peptides qui comportent l'une des séquences ID n" 8 à 14 ou une séquence présentant au moins 70% de similarité avec l'une des séquences ID n" 8 à 14.
Un autre groupe de peptides utiles selon l'invention sont ceux comportant l'une des séquences ID n" 1 à 6 ou une séquence présentant au moins 70% de similarité avec une des séquences ID n" 1 à 6 (PY).
Les Demandeurs ont pu mettre en évidence que le peptide ne comportant que la partie correspondant à l'hélice Q C-terminale du peptide
SPYY, isolé de la peau de Phyllomedusa bicolor, possède la même activité que le peptide entier.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet l'utilisation d'un peptide comportant la séquence ID n" 7 (SPYY1+36) ou une séquence présentant au moins 70% d'identité avec la séquence ID n" 7.
Ce peptide de séquence ID n" 7 ou le peptide complet de séquence ID n" 1 montrent également une activité antibiotique.
Les taux de similarité peuvent être mesurés notamment avec le logiciel Clustal V multiple sequence alignment (Higgins et al, Comput.
Appl. Biosci, 1989, 5, 151-153); ils comprennent les peptides possédant une structure primaire identique à au moins 70%, et ceux dans lesquels les acides aminés sont remplacés par un acide aminé équivalent, permettant le maintien de la structure tertiaire et des propriétés physico-chimiques.
Les peptides contiennent de préférence de 10 à 36 acides aminés.
La présente invention concerne également des peptides tels que décrits ci-dessus, présentant une meilleure efficacité, caractérisés en ce que le groupement carboxylique C-terminal est amidé à l'aide d'une amine, notamment aliphatique ou aromatique.
Les peptides antibiotiques naturels, et en particulier les dermaseptines, comprennent des acides aminés ayant tous la configuration L; on a pu mettre en évidence le fait qu'en introduisant certains acides aminés D, on augmentait la durée de vie, donc l'efficacité des peptides correspondants.
Enfin, il est possible d'utiliser des acides aminés non naturels et ayant la même caractéristique d'ensemble, notamment du type ornithine ou des acides aminés halogénés ou alkylés par exemple.
Bien que la présente invention ne soit pas limitée par les interprétations scientifiques ci-après, le mécanisme d'action des dermaseptines conduit à la lyse cellulaire des microorganismes et produit une activation du macrophage en très peu de temps, de l'ordre de quelques minutes, alors que l'activation du macrophage obtenue avec les cytokines traditionnelles, type interféron gamma, est supérieure à 5 heures.
L'activation cellulaire est mise en évidence par la culture de macrophages en présence d'une ou plusieurs dermaseptines. A des doses nanomolaires, les dermaseptines induisent en quelques minutes la production de radicaux NO et des cytokines (TNF et interleukines).
L'ensemble de ces produits sont impliqués dans la cytotoxicité vis à vis de microbes ou de cellules cancéreuses. Le traitement de macrophages avec la dermaseptine à différentes doses entraine 100 % de résistance à l'infection par divers microbes (Leishmania ou listeria). Le traitement de macrophages infectés entraîne la mort des agents infectieux intracellulaires.
De la même manière, les dermaseptines protègent les hépatocytes et les érythrocytes par rapport aux agents infectieux du paludisme (plasmodium falciparum) ou les cellules rénales par rapport aux microsporidies (septata intestinalis).
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples ci-après.
Dans ces exemples on se réfèrera aux figures suivantes
Figure 1 : concentration en cytokines dans le sérum de souris Balb/C traitées ou non, déterminé par immunoessai enzymatique (Kit Genzyme ) en utilisant des anticorps monoclonaux murins anti TNF-Q ou anti-I FN-y et les anticorps polyclonaux de lapin correspondants.
Figure 2 : effet anti-leishmaniose de SPW in vivo.
A: examen direct de la lésion cutanée
B : taux de parasites dans la zone inflammatoire.
Exemple 1
L'efficacité de la dermaseptine (DS) sur les amastigotes intracellulaires de Leishmania a été étudiée en utilisant des cultures de macrophages (MSCP) murins infectés. La dermaseptine réduit la fréquence d'infections de 66% à moins de 1% comme montré sur le tableau 1. La viabilité des parasites intracellulaires a été vérifiée par incubation dans un milieu dépourvu de médicament à 26 C. Ceci aurait dû induire une différenciation des amastigotes viables en la forme mobile promastigote en 24 heures, telle qu'on l'observe dans les échantillons contrôles. Les échantillons traités par la dermaseptine n'ont pas conduit à des promastigotes observables après 7 jours d'incubation, indiquant que 100% des parasites intracellulaires étaient tués.
Tableau 1 : Activité leishmanicide de macrophages murins infectés, traités par DS (IM#)
Culture IM# Amastigotes Nitrites TNF-α cAMP cGMP I-A+ (n ) (Total n ) ( M) (U/mL) (nM) (nM) (%)
M# de souris Balb/c
IM# 330#24 893#43 2#0.3 < 2 nd nd 3#1
IM# + DS 2#1 5#2 25#3 64 6 4 53#3
IM# + DS + L-NMMA 202#12 881#24 7#0,7 4 < 0,01 0,7 29#4
IM# + DS + D-NMMA 10#1 34#6 18#2 16 < 0,01 2 43#4
M# de souris C3H
IM# 230#22 600#40 3#1 < 2 nd nd 14#2
IM# + DS 2#1 3#2 55#5 640 nd nd 68#4
IM# + DS + L-NMMA 176#12 462#20 11#1 16 nd nd 48#4
IM# + DS + D-NMMA 6#1 13#2 48#2 640 nd nd 65#2
M# de souris SCID
IM# 370#30 1200#60 1,5#0 UD nd nd 6#1
IM# + DS 3#1 6#2 25#3 64 nd nd 56#3
IM# + DS + L-NMMA 212#12 810#40 6#0,7 < 2 nd nd 42#2
IM# + DS + D-NMMA 8#1 11#2 23#2 32 nd nd 51#1
UD : indétectable nd : non déterminé
Les macrophages péritonéaux (2 x 105 / mL) de souris Balb/c,
C3H/HeN (C3H) et CB-17/Icr (élevées dans des conditions dépourvues de pathogène spécifique) ont été infectés en utilisant une souche infectieuse de L major MRHO/SU/59/Neal P. à une phase stationnaire de culture. Les macrophages infectés ont été ensuite mis en culture (dans un incubateur humidifié à 5% de CO2-95% d'air) pendant 24 heures en présence ou absence de : DS (50 llg/mL), L-NNINIA ( (lmM) et ISNMMA (lmM). Après incubation, le taux de cellules infectées a été déterminé après lavage, fixation et coloration Giemsa, en comptant 500 macrophages dans 20 champs microscopiques pris au hasard. Les valeurs proviennent de deux expériences indépendantes.
Les nitrites ont été mesurés en utilisant la méthode de Griess en mélangeant 50 cil de surnageant de culture avec 100 ss1 de réactif de
Griess. A550 a été lu 10 minutes plus tard et la concentration en NO2 a été déterminée par référence à une courbe standard de NaNO2 5-1000 zM (Green et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 7764 (1981).
Le TNF a a été mesuré en utilisant une lignée cellulaire L929 et le test colorimétrique au bromure de 3(4,5-diméthyl-thiazoyl-2yl)2,5- diphényltétrazolium pour vérifier la viabilité cellulaire. L'activité TNF observée a été confirmée par blocage avec des anticorps anti-TNF murin.
La sensibilité est de 1U TNE/mL.
En parallèle, des MfP+I-A ont été comptés après avoir été lavés avec du milieu frais, fixés à l'acétone et incubés pendant 20 minutes en présence d'anticorps monoclonaux anti-I-Ad (dilution au 1/100). La quantification de l'expression de surface des cellules I-A a été effectuée en utilisant la méthode à l'immunopéroxidase (Vector Laboratories,
Burlingame, CA) suivie d'une coloration à l'hémalun de Mayer. Pour l'expérience de contrôle, l'anticorps anti-I-Ad a été remplacé avec anti-I
Ak, un anticorps qui ne reconnait pas l'antigène I-A.
Les nucléotides cycliques ont été mesurés par radioimmunessai spécifique (Amersham les Ulis France).
L'activation a été confirmée par la détection des antigènes de surface I-A sur les macrophages traités par DS (les molécules I-A sont essentielles pour la fonction de présentation de l'antigène du macrophage).
La population de macrophages I-A+ pour les anticorps anti I
Ad augmente de 3% à 53%, alors que les macrophages I-A+ pour les anticorps anti-I-Ak ne sont pas observés. Les effets induits par la dermaseptine sont restreints en présence de l'inhibiteur de synthèse de
NO L-NMMA (beaucoup moins par D-NMMA), ce qui confirme le rôle critique des radicaux nitriques dans l'effet leishmanicide.
L'activation des macrophages et la mort des parasites ont été également observées en utilisant des macrophages provenant soit de souris C3H très résistantes, soit de souris présentant de sévères immunodéficiences combinées (SCID).
L'interaction de la DS avec les macrophages est mise en évidence par l'immunolocalisation du peptide à la surface du macrophage.
L'efficacité des macrophages activés à résister à l'infection a été étudiée en utilisant des macrophages prétraités par DS avant d'être exposés aux parasites infectieux. Après une heure de traitement, la dermaseptine induit une production dose-dépendante de nitrites et de TNF Q dans les surnageants de cultures (Tableau 2). Des macrophages péritonéaux (2 x 105/ mL) ont été cultivés avec DS pendant 1 heure puis les nitrites et TNF-ti ont été mesures dans les surnageants de culture. Après lavage, la résistance à l'infection a été étudiée en exposant les macrophages à 1 x 105 promastigote pendant 24 heures. Les conditions de culture, de comptage cellulaire et d'analyse des surnageants de culture sont telles que décrites précédemment.
Tableau 2 : Activation et résistance à l'infection chez les macrophages traités par DS (M#)
DS Nitrites TNF-&alpha; Cellules Nombre total I-A+ TNF-&alpha; ( g/mL) ( M) (U/mL) infectées d'amastigotes (%) (U/mL)
M# de souris Balb/c
Aucun UD UD 298#24 893#43 3#1 < 2 0,0007 1,2#0,1 UD 112#11 252#44 10#1 < 2 0,0015 1,4#0,1 UD 54#10 124#18 15#1 < 2 0,0031 5,1#0,5 < 2 12#3 23#4 31#2 8 0,0062 6,6#0,7 < 2 10#2 18#2 40#3 8 0,0125 8,1#0,7 < 2 8#1 17#3 45#3 8 0,025 9,1#0,8 4 7#1 10#1 47#3 8 0,05 9,5#0,5 4 6#1 8#1 50#4 16 0,1 10,1#0,4 4 4#1 6#1 51#3 16
M# de souris C3H
Aucun UD UD 234#17 678#32 7#2 < 2 0,1 11,8#1 8 2#1 4#1 65#4 32
M# de souris SCID
Aucun UD UD 342#30 1012#54 5#1 < 2 0,1 5,8#0,2 4 11#1 16#2 42#2 8
UD : indétectable
Le prétraitement des macrophages induit une résistance dose dépendante à l'infection, les macrophages continuent à libérer du TNF-Q après l'épreuve aux promastigotes et expriment des niveaux significatifs d'antigène de surface I-A. L'activation et la résistance à l'infection sont aussi corrélées chez les macrophages traités par DS provenant de souris
C3H et SCID.
Exemple 2
- L'efficacité des dermaseptines in vivo a été démontrée sur un modèle murin de maladies infectieuses. En effet, le traitement de souris
Balb/c développant une leishmaniose cutanée suite à l'infection par un parasite protozoaire, la Leishmania major, induit une forte production de l'IFN-y, une guérison rapide ainsi que la cicatrication des lésions en 7-8 semaines.
- Des résultats comparables ont été obtenus chez des souris immunodéficientes (souris SCID) infectés au Laboratoire ou des chiens infectés dans une région endémique (la corse) et développant la leishmaniose viscérale due aux parasites du complexe donovani.
Ces résultats encourageants amènent à proposer de nouveaux protocoles thérapeutiques dans d'autres modèles animaux.
Pour évaluer l'efficacité du peptide in vivo, des modèles murins de leishmanioses cutanés ont été utilisés (Frommel et al. Infection and Immunity, 1988, 56, 843), dans lesquels les souris inoculées avec des promastigotes L major ont développé une lésion cutanée caractéristique qui atteint un diamètre moyen de 2,9 + 0,6 cm au jour 27 après inoculation.
Le traitement consistait en 3 injections de peptide à des intervalles de 5 jours et a été comparé avec l'effet induit par du stibogluconate de sodium, le médicament de choix des leishmanioses courantes. Après les injections, des échantillons de la zone de lésion ont été prélevés régulièrement et analysés pour vérifier l'évolution des parasites.
L'administration de dermaseptine traite efficacement 100% des souris malades. Au jour 13 de traitement, la charge de parasites était réduite de plus de 99%, alors qu'une augmentation significative était observée dans les souris contrôles. Les échantillons ont été cultivés à 26 C dans du milieu RPMI complet pour vérifier la viabilité des parasites intracellulaires. Des échantillons de souris traitées par Du16 34 et non traitées ont conduits à des taux supérieurs à 106 promastigotes/ml, alors que les échantillons de souris traitées par la dermaseptine ne permettaient pas d'observer des promastigotes après 7 jours d'incubation, confirmant que la dermaseptine induit dans 100% des cas la mort des parasites.
Une diminution marquée de la taille de la zone inflammatoire au jour 13 est observée. A partir de ce moment, le diamètre de la lésion décroît progressivement jusqu'à environ 7 semaines où on observe une reconstitution complète de la peau.
3 mois après la cicatrisation observée, on a vérifié chez les souris la présence de parasites cryptiques résiduels qui pourraient être réactivés ultérieurement. Ceci inclut l'examen direct de la peau ainsi que des coussinets plantaires, de la rate et des ganglions lymphatiques qui étaient tous dépourvus de parasites après 12 jours de culture à 26 C.
Bien que le traitement avec le stibogluconate de sodium soit partiellement efficace pour réduire à la fois le nombre de parasites et la taille des lésions, la cicatrisation complète n'a pas été observée. De la même manière, les souris non traitées et les souris traitées par Du16.34 ont développées progressivement des taux de parasites supérieurs qui ont conduits à la mort à partir du 4ème mois.
Des analyses de sérum ont été effectuées jusqu'à 6 mois après le traitement, et ont révélées des taux augmentés d'lFN-y et des taux bas de
TNF-a pour les souris guérics (figure 1). BI outre, I'augmentation d'lFN-y était corrélée avec la résistance à la réinfection comme cela a été trouvé à la fois in vitro et in vivo. In vitro, les macrophages péritonéaux provenant de souris soignées exposés pendant 5 heures à des promastigotes de L major (rapport 2:1) puis cultivés pendant 24 heures, étaient dépourvus de parasites alors que 70% de cellules infectées étaient trouvées dans les macrophages provenant de souris témoins. De même in vivo, les souris guéries réinoculées avec des promastigotes ne révélaient pas de signes d'infection 6 mois plus tard.A savoir, il n'y avait pas de signe d'ulcération de la peau et des cultures d'aspirats soit du site original de l'infection soit de rate étaient dépourvus de parasites.
La guérison de souris leishmaniosées était aussi observée en utilisant des souris SCID, dans lesquelles l'analyse préalable à l'infection de lymphocytes de rate a confirmé l'absence de cellules CD4+ et CD8+. Le tableau 3 montre que la charge de parasites augmente avec le temps, produisant un ulcère cutané dans les 2-3 semaines après l'inoculation. 13 jours après le traitement, les nombres de parasites intra et extra cellulaires étaient réduits à zéro et la cicatrisation de la peau a été observée en 46 semaines.
Tableau 3 : Effet de l'administration de DS sur les souris SCID infectées
Souris traitées par DS Souris contrôles
Jours post-inoculation 12 22 24 25 27 31 35 31 35
Nombre de M# infectés 138#14 148#18 36#3 30#3 8#1 4#1 0 316#32 378#34
Nombre d'amastigotes intracellulaires 478#42 722#44 118#20 46#4 8#2 3#1 0 3160#100 4914#200
Nombre d'amastigotes extracellulaires 4#1 8#2 1#1 0 0 0 0 14#2 18#4
Etant donné que l'infection à L major chez les souris SCID peut se développer en leishmaniose viscérale, des cultures de rate et de ganglions lymphatiques provenant de souris traitées et témoins ont été comparées au jour 35 après inoculation. Le taux de macrophages infectés dans ces tissus était de 70-72% dans les souris non traitées, comme déterminé par l'examen après coloration de Giemsa.Leur culture conduit à un taux supérieur à 2 x 106 parasites/mL après 7 jours d'incubation, alors que les cultures provenant de souris traitées (où on ne détecte pas de macrophages infectés) demeuraient dépourvues de parasites après 12 jours d'incubation. Le fait que la dermaseptine induit la guérison de la leishmaniose chez des souris immunodéficientes montre le rôle majeur joué par les voies indépendantes des cellules T pour combattre l'infection.
Exemple 3 : Activité du peptide de séquence ID n" 1 (SPYY)
On a utilisé des modèles murins de leishmaniose cutanée comme décrit dans l'exemple 2.
Le traitement consiste en trois injections intraveineuses de
SPYY à des doses respectivement de 100, 50 et 50 Fg dans 0,2 mL de sérum physiologique, à 5 jours d'intervalle. Des souris témoins ont reçu une injection de 0,2 mL de sérum physiologique comprenant un peptide acide aux mêmes doses. 6 autres souris ont reçu une injection de sérum physiologique uniquement. On n'observe pas de différence significative entre ces témoins.
Au jour 13 après le début du traitement, l'examen direct révèle une diminution significative de la zone inflammatoire (figure 2A).
Après 6 à 8 semaines, la lésion a disparu et la peau est complètement reconstituée. Des échantillons prélevés au jour 13 après le début du traitement à partir de souris traitées ou non traitées ont été analysés et comparés pour le nombre de macrophages infectés (figure 2B). L'analyse de ces échantillons révèle une population de macrophages infectés inférieure à 2%, alors qu'elle est supérieure à 66% pour les souris non traitées. La viabilité des parasites intracellulaires a été vérifiée par des cultures d'aliquots des échantillons dans du milieu complet RPMI 1640 à 26 C. Les échantillons prélevés au jour 45 après le début du traitement ne montrent pas de macrophages infectés alors qu'on observe 70% de macrophages infectés chez les souris non traitées.
Des macrophages infectés ont été exposés directement à SPW in vitro. Après incubation, le nombre de macrophages infectés a été compté et les surnageants de culture ont été analysés (tableau 4). Après 24 heures de traitement, la population de macrophages infectés a chuté à 15% par rapport aux cellules non traitées. Après 48 heures de traitement, on n'observe plus de macrophages infectés. Quand les macrophages traités pendant 48 heures sont transférés d'une température d'incubation de 37
C à 26 C, on n'observe pas de différenciation de la forme amastigote forme promastigote après 7 jours, ce qui confirme la mort de tous les parasites intracellulaires. Il n'existe pas de signe de toxicité pour les macrophages, qui présentent des vacuoles vides après coloration de
Giemsa.
L'analyse des surnageants de culture révèle que le traitement par SPYY induit une production d'oxyde nitrique. Lorsque les macrophages sont exposés à SPYY en présence de l'inhibiteur de synthèse de NO L- NMMA pendant 24 heures, les macrophages demeurent aussi infectés que dans l'expérience témoin, le taux de NO2 chutant à 9 zM. Le remplacement de L-NMMA par son analogue non inhibiteur D-NMMA, a pour conséquence une mort des parasites proche de celle observée lors du traitement avec SPYY en l'absence d'inhibiteur.
Le SPYY est inefficace sur les macrophages infectés, si ceuxci ont été préalablement traités par la bréfeldine A, un inhibiteur du transport réticulum endoplasmique-golgi.
Tableau 4
Nombre de macrophages Nombre total NO2 infectés d'amastigotes ( M)
Macrophages + SPYY - - 20#2
Macrophages infectés 350#4 930#10 < 2
Macrophages infectés + SPYY 5#2 10#5 21#2
Macrophages infectés + SPYY + L-NMMA 290#6 900#10 9#1
Macrophages infectés + SPYY + D-NMMA 25#2 30#5 18#2
Macrophages infectés + BFA* + SPYY 270#8 890#10 N.D.
* Les cultures ont été prétraitées avec BFA (Brefeldine A) pendant 15 minutes avant l'addition de SPYY.
ND : non déterminé.
LISTE DE SEQUENCES
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 14
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release &num;1.0, Version &num;1.3 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 36 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 1:
Tyr Pro Pro Lys Pro Glu Ser Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu
1 5 10 15
Met Asn Lys Tyr Leu Thr Ala Leu Arg His Tyr île Asn Leu Val Thr
20 25 30
Arg Gln Arg Tyr
35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 36 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 2:
Tyr Pro Pro Lys Pro Glu Asn Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu
1 5 10 15
Met Thr Lys Tyr Leu Thr Ala Leu Arg His Tyr île Asn Leu Val Thr
20 25 30
Arg Gîn Arg Tyr
35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 36 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 3:
Tyr Pro Ser Lys Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp
1 s 10 15
Met Ala Lys Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr
20 25 30
Arg Gln Arg Tyr
35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 36 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 4:
Ala Pro Ser Glu Pro His His Pro Gly Asp Gln Ala Thr Pro Asp Gln
1 5 10 15
Leu Ala Gln Tyr Tyr Ser Asp Leu Tyr Gln Tyr Ile Thr Phe Ile Thr
20 25 30
Arg Pro Arg Phe
35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 36 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 5:
Tyr Pro Ala Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu
1 5 10 15
Leu Ser Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr
20 25 30
Arg Gîn Arg Tyr
35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 36 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 6:
Tyr Pro Ser Lys Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp
1 5 10 15
Leu Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr île Asn Leu île Thr
20 25 30
Arg Gln Arg Tyr
35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 7:
Pro Glu Glu Met Asn Lys Tyr Leu Thr Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn
1 5 10 15
Leu Val Thr Arg Gîn Arg Tyr 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 34 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 8:
Ala Leu Trp Lys Thr Met Leu Lys Lys Leu Gly Thr Met Ala Leu His
1 5 10 15
Ala Gly Lys Ala Ala Leu Gly Ala Ala Ala Asp Thr Ile Ser Gîn Gly
20 25 30
Thr Gln (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 34 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 9:
Ala Leu Trp Phe Thr Met Leu Lys Lys Leu Gly Thr Met Ala Leu His
1 5 10 15
Ala Gly Lys Ala Ala Leu Gly Ala Ala Ala Asn Thr Ile Ser Gîn Gly
20 25 30
Thr Gîn (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 10:
Ala Leu Trp Lys Asn Met Leu Lys Gly Ile Gly Lys Leu Ala Gly Lys
1 5 10 15
Ala Ala Leu Gly Ala Val Lys Lys Leu Val Gly Ala Glu Ser
20 25 30 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 28 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 11:
Ala Leu Trp Met Thr Leu Leu Lys Lys Val Leu Lys Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
Ala Ala Leu Asn Ala Val Leu Val Gly Ala Asn Ala
20 25 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 12:
Gly Leu Trp Ser Lys Ile Lys Thr Ala Gly Lys Ser Val Ala Lys Ala
1 5 10 15
Ala Ala Lys Ala Ala Val Lys Ala Val Thr Asn Ala Val
20 25 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 31 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:
Ala Met Trp Lys Asp Val Leu Lys Lys Ile Gly Thr Val Ala Leu
1 5 10 15
His Ala Gly Lys Ala Ala Leu Gly Ala Val Ala Asp Thr île Ser Gln
20 25 30 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
Gly Leu Trp Ser Lys Ile Lys Glu Val Gly Lys Glu Ala Ala Lys
1 5 10 15
Ala Ala Ala Lys Ala Ala Gly Lys Ala Ala Leu Gly Ala Val Ser Glu
20 25 30
Ala Val

Claims (20)

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un peptide comportant une séquence en hélice Q amphiphile polycationique, pour la préparation d'un médicament destiné à modifier l'activité du système immunitaire humain ou animal.
2. Utilisation selon la revendication 1, pour la préparation d'un médicament destiné à activer les macrophages et/ou les lymphocytes du système immunitaire humain ou animal.
3. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le médicament est utilisé à titre préventif.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le médicament est utilisé à titre curatif.
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le médicament est destiné à la prévention ou au traitement de maladies causées par des microorganismes ou des parasites intracellulaires ou ayant au moins une phase intracellulaire.
6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le médicament est destiné à prévenir ou à traiter une maladie choisie dans le groupe comprenant : paludisme, trypanosomiases, leishmanioses, amibiase, filarioses, bilharzioses, echinococcose, lèpre, tuberculose, choléra, méningites à méningocoques, poliomyélite, hépatites, diarrhées aiguës et SIDA.
7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la maladie en cause est le cancer.
8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le médicament est destiné au traitement ou à la prévention des affections associées au syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) ou médicamenteuse.
9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que le peptide est utilisé en mélange avec d'autres peptides ayant également une séquence en hélice Q amphiphile.
10. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le peptide comporte une séquence en hélice a amphiphile riche en charges positives.
11. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que le peptide comporte l'une des séquences ID n 1 à 6 ou une séquence présentant au moins 70% de similarité avec une des séquences ID n 1 à 6.
12. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que le peptide comporte la séquence ID n" 7 ou une séquence présentant au moins 70% d'identité avec la séquence ID n" 7.
13. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que le peptide comporte l'une des séquences ID n 8 à 14, ou une séquence présentant au moins 70% de similarité avec une des séquences ID n 8 à 14.
14. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que le peptide comporte de 10 à 36 acides aminés.
15. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que le peptide est choisi dans le groupe des dermaseptines ou des neuropeptides.
16. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que le radical carboxyl C-terminal du peptide est amidé à l'aide d'une amine.
17. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisée en ce qu'au moins une partie des acides aminés est sous forme n
18. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisée en ce qu'une partie au moins du peptide est constituée d'acides aminés non naturels.
19. Utilisation à titre d'antibiotique d'un peptide ayant la séquence ID n 1 ou 2.
20. Utilisation d'un peptide comportant une séquence en hélice a amphiphile polycationique tel que défini dans l'une des revendications 10 à 18, à titre d'agent cicatrisant.
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