OA10615A - Immunogènes dénués de toxicité dérivant d'une protéine de régulation rétrovirale anticorps procédé de préparation et compositions pharmaceutiques les renfermant - Google Patents
Immunogènes dénués de toxicité dérivant d'une protéine de régulation rétrovirale anticorps procédé de préparation et compositions pharmaceutiques les renfermant Download PDFInfo
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Description
Cf , ‘ 1 ' 010615
Ionunogènes dénués de toxicité dérivant d’une protéine de régulationrétrovlrale, anticorps, procédé de préparation et compositions pharmaceutiquesles renfermant
La présente invention concerne de nouveaux immunogènesrétroviraux utilisant des protéines de régulation rétrovirales dont les propriétésbiologiques essentielles auront été préalablement inactivées de façon telle que ,. Pon conserve ou augmente- leurs propriétés immunogènes, leur procédé de 5 préparation et des compositions pharmaceutiques les renfermant Cesnouveaux immunogènes "inactivés" peuvent être utilisés pour induire chezl'homme une immunisation active susceptible de prévenir ou corriger les effetsde dérégulation que les protéines natives dont ils sont issus peuvent contribuer à produire. 10 De même, la présente invention concerne de nouveaux anticorps obtenus par l'utilisation de ces immunogènes "inactivés", leurs procédés depréparation et les compositions pharmaceutiques les contenant en vue d'uneimmunisation passive.
La molécule Tat est une protéine de régulation du VIH que Pon ne 15 trouve pas dans la particule virale mais qui est codée par le génome du VIH-1. A l'intérieur des cellules infectées, cette protéine codée par PADN proviral joueun rôle transactivateur de gènes viraux ou cellulaires. Cette protéine derégulation génétique peut cependant se trouver également à Pextérieur descellules dans le milieu circulant extracellulaire, excrétée au sein de débris de 20 cellules mortes à l'état natif ou fragmentaire ou par processus de sécrétion. Saprésence dans le milieu circulant explique Pexistence d'anticorps anti-Tatdétectables chez certains sujets séropositifs. Dans ce contexte extracellulairedu Tat le segment C terminal porteur des résidus RGD reconnus par lesintégrines de surface cellulaire et la région basique de la molécule (résidus 45 - 25 70) vont lui permettre, comme le font les toxines bactériennes, d'agir sur lescellules non infectées de différents tissus. Ainsi la protéine Tat circulanteagissant comme une véritable toxine virale, peut exercer des effets nocifs surles cellules endothéliales et en association avec le facteur de croissance BFGF,contribuer à la néoangiogenèse du Sarcome de Kaposi caractérisant la maladie 30 Sida. La protéine Tat circulante peut également aggraver l'immunosuppressionqui s'installe progressivement dans le Sida, soit par action immunosuppressive -2- 010615 directe sur les cellules T soit en contribuant à dérégler la productiond’interféron a par les cellules présentant d'antigène, appelées APC(macrophages ou cellules dendritiques).
Le syndrome d'immunodéficience acquise (Sida) est cliniquementdéfini par des maladies opportunistes dues à une immunosuppression ou par leSarcome de Kaposi. L’immunosuppression acquise, d'installation progressiveau cours de l'infection VIH, se manifeste biologiquement par la perte deréactivité immunologique des cellules T (cytostase et la diminution deproduction de l'IL2) après stimulation en premier lieu par les antigènes derappel, puis par les alloantigènes et enfin par les mitogènes (PHA). Cetteimmunosuppression est associée à la surproduction des interférons a et γ.
Les mécanismes cytopathogènes qui induisentl'immunosuppression sont complexes et font intervenir différents facteursd'origine virale agissant soit directement sur les cellules de l’immunité,lymphocytes T et APC, soit indirectement via le réseau des cytokines. Ainsi laprotéine d'enveloppe gp120 portée par la particule de VIH-1 et dont laprésence extracellulaire est mesurée par la charge virale sérique peut induiredirectement l'anergie de cellules T de phénotype CD4. De leur côté lesprotéines de régulation du VIH, notamment le Tat, dans sa configurationextracellulaire de toxine virale circulante, semblent également induire uneimmunosuppression directe des cellules T ou d’autres effets pathogènes, dufait par exemple qu’in vitro les cellules T activées par un antigène de rappel oupar des anticorps anti-CD3 ne prolifèrent plus en présence de la molécule Tat.En outre la protéine Tat circulante semble faciliter la surproduction par les APCd'interféron a, cytokine cytostatique et apoptogène susceptible d’amplifierl’immunosuppression et l'apoptose observés dans la maladie Sida. En effet lasécrétion d'interféron a par les macrophages ne semble plus, en présence deTat, arrêtée par une rétrorégulation (feedback) qui à l'état normal contrôle cetteproduction d’interféron a (période réfractaire).
Le Sarcome de Kaposi se manifeste cliniquement par l'apparition de nodules vasculaires représentant une néoangiogenèse constituée à partir -3- 010615 de cellules endothéliales. Ces cellules activées par des processusinflammatoires engendrant la production de cytokines (interféron γ, IL1 et IL6)produisent du BFGF (Basic Fibroblastic Growth Factor) et se multiplient. Laprolifération des cellules endothéliales activées in vitro est augmentée par la 5 présence dans le milieu de la protéine Tat. Les anticorps anti-Tat bloquent invitro les effets prolifératifs de la protéine Tat. L'action du Tat sur les cellulesendothéliales porteuses à leur surface d'adhésine de la famille des Intégriness'explique par la présence de la séquence RGD reconnue par ces molécules.
La néoangiogenèse qui sous-tend in vivo le sarcome de Kaposi 10 serait donc favorisée par la protéine de régulation Tat dans sa configurationextracellulaire, qui pourrait être reconnue, grâce à son fragment C terminalcontenant la séquence RGD, par tes intégrines des cellules endothéliales. Deplus 1e Tat pourra également agir par sa région basique riche en résidus K et R,et par conséquent susceptible de se lier à l'héparine sulfate de la matrice 15 extracellulaire qui concentre 1e facteur de croissance BFGF. Ainsi laprolifération des cellules endothéliales induite par les facteurs de croissance estaccrue par la présence de Tat et engendre la néoangiogenèse. Cet effet sur lacroissance des cellules endothéliales est réduit in vitro par l'action d'anticorpsanti-Tat. 20 II apparaît donc souhaitable de bloquer l'activité nocive des protéines de régulation des rétrovirus, notamment du Tat circulant dans tesmilieux extracellulaires (sang, lymphe, milieux interstitiels ...), véritables toxinesvirales.
En ce qui concerne tes virus VIH, on avait jusqu’à présent 25 effectué des tentatives de vaccination à l'aide de protéines de structure oufragments de protéines de structure de ces virus, mais jamais à l’aide deprotéines de régulation ou fragments de protéines de régulation de ces virus.
Or, on a trouvé avec étonnement que, tout comme tes toxines bactériennes (tétanique, diphtérique ou botulique) dont l'activité toxique est 30 neutralisée par des anticorps spécifiques, tes effets nocifs des protéines virales de régulation et notamment du Tat, véritable toxine du VIH dans sa -4- 010615 configuration extracellulaire - qu'ils s'exercent par l’immunosuppression descellules T, par le dérèglement de la production de l'interféron a par les APC oupar la néoangiogenèse qui sous-tend le Sarcome de Kaposi - sont abolis enprésence d'anticorps spécifiques anti-Tat, comme on le verra ci-après dans lapartie expérimentale.
Il en est de même avec d’autres protéines de régulation de virustels que V1H-1, V1H-2, HTLV-1 ou HTLV-2. Il serait donc souhaitable dedisposer d’immunogènes administrables à l'homme capables de produire detels anticorps, de même que disposer de tels anticorps, à des fins tant curativesque préventives. En effet les composés de fart antérieur utilisés commeimmunogènes peuvent être toxiques pour l'homme (voir par exemple WO-A-9118454), notamment ceux comportant les régions basiques. Il s'agit defragments non modifiés de Tat, de Nef ou de Rev "natifs", contrairement à laprésente invention basée sur l'inactivation de ces protéines ou fragments deprotéines. C’est pourquoi la présente demande a pour objet des composésimmunogènes administrable(s) à l'homme car dénué(s) de toxicité, caractérisésen ce qu’ils dérivent d’une protéine de régulation d’un virus VIH-1, VIH-2,HTLV-1 ou HTLV-2, par traitement chimique à l'aide d'un agent de couplage telqu'un aldéhyde, ou d'une protéine porteuse activée par un pré-traitement àl’aide d'un aldéhyde, de préférence le formaldéhyde ou le glutaraldéhyde, leurpermettant d'être reconnus par des anticorps dirigés contre ladite de protéinede régulation, et de conserver des propriétés immunogènes suffisantes pourcréer des anticorps neutralisant ou bloquant ladite protéine native, tout enayant perdu au moins 50%, notamment au moins 80%, particulièrement plus de95% des propriétés biologiques toxiques de ladite protéine native.
Ces composés, par analogie aux toxoïdes bactériens tel que letétanos toxoïde, seront qualifiés ci-après de "toxoïdes".
En effet, tout comme les toxoïdes bactériens classiques, ils sontdépourvus de toxicité propre, mais sont cependant capables de provoquer uneimmunisation par administration chez un sujet. - 5 - 010615
Le traitement chimique ci-dessous peut être complété par untraitement physique comme par exemple une irradiation et tout particulièrementune irradiation U.V., dans le but de diminuer la toxicité résiduelle des composésimmunogènes selon l'invention.
Les toxoTdes ci-dessus peuvent par exemple être préparés àpartir d*un peptide ayant une séquence identique ou similaire à une séquencepeptidique d’une protéine de régulation, telle que le Tat, et être obtenu parexemple par synthèse peptidique conventionnelle sur résine ou par géniegénétique. Tous ces procédés sont bien connus par l’état de la technique.
Afin de vérifier que la protéine de régulation modifiée ou sonfragment modifié selon l’invention est bien reconnu par des anticorps dirigéscontre ladite protéine de régulation native, on peut par exemple vérifierimmunologiquement par Elisa en présence d’anticorps spécifiques, la formationde complexes antigènes-anticorps comme on le verra ci-après dans la partieexpérimentale.
Afin de déterminer si les propriétés immunogènes de la protéinede régulation ont été suffisamment conservées pour créer des anticorpsneutralisant ladite protéine native, on peut par exemple immuniser desmammifères (lapins, rats, souris) à l’aide d’un composé immunogène selonl’invention et vérifier que les anticorps produits neutralisent les activitéstoxiques de la protéine de régulation, comme on le verra pour le Tat dans lapartie expérimentale.
Afin de déterminer si la protéine de régulation modifiée a perdu aumoins de 50% de ses propriétés biologiques toxiques, on peut par exempleétudier l'effet de la protéine de régulation telle que le Tat inactivé surl’immunosuppression des cellules T ou sur la production d’interféron a par descellules mononucléées du sang périphérique activées ou encore sur lanéoangiogénèse induite par la protéine de régulation. L’inactivation de la protéine de régulation Tat est vérifiée par exemple par le " Tat Rescue Assay " utilisant un mutant de VIH non infectieux
Tat déficient cultivé sur la lignée cellulaire HLM-1 dont la réplication dépend d’un apport exogène de Tat natif. 010615
Le composé immunogène peut dériver d’une quelconque desprotéines de, régulation des virus. VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2 etnotamment Vif, Rev, Nef et Tat des virus VIH-1 et VlH-2 ; on retientparticulièrement Rev, Nef et Tat, plus particulièrement Rev et Tat et depréférence ce dernier.
On peut aussi citer la protéine Tax de HTLV-1 ou HTLV-2.
On peut citer également tout particulièrement les régionsextérieures aux régions basiques de Tat et de Rev c’est à dire extérieures auxrégions 49 à 57 de Tat et 35 à 50 de Rev, ou chevauchant ces régions sur auplus 4 acides aminés, de préférence au plus 2 acides aminés, particulièrementle peptide HQVSLSKQPTSQPRGD.
Par « dérivent » ou « dériver » d'une protéine de régulation d’unvirus VIH1, VIH2, HTLV1 ou HTLV2, l’on entend que le composé immunogènepeut être constitué de la totalité ou d'un fragment de la protéine de régulation etpeut comporter une ou plusieurs modifications dans les acides aminés de cetteprotéine ou fragment telles que des délétions, substitutions, additions, oufonctionnalisations telles qu’acylation d’acides aminés, dans la mesure où cesmodifications restent dans le cadre précisé ci-dessus (absence de toxicité,caractères immunologiques). Par exemple, en général le remplacement d’unrésidu leucine par un résidu isoleucine ne modifie pas de telles propriétés; lesmodifications doivent généralement concerner moins de 30% d’acides aminés,de préférence moins de 20% et tout particulièrement moins de 10% sur lessegments d'homologie à la protéine de régulation d'au moins 8 acides aminés,notamment au moins 12 acides aminés. Un fragment peut comporter de 8 à 60acides aminés par exemple, de préférence de 12 à 40 acides aminés, etparticulièrement de 25 à 40 acides aminés. On peut citer par exemple lesrésidus 65-80 en C terminal du Tat de VIH-1.
Dans des conditions préférentielles, les composés immunogènes de l'invention comportent au moins 50% de la totalité de la protéine de régulation, de préférence au moins 70%, particulièrement au moins 90%, et - 7 - 010615 tout particulièrement la totalité ou quasi-totalité de ladite protéine.
De manière générale, en ce qui concerne les modifications,l’homologie ou la similitude entre l’immunogène modifié et la protéine ou partiede protéine native, ainsi que les dimensions du composé immunogène, demême que les modalités d’utilisation, ou de couplage du composé immunogèneselon l'invention à une protéine immunogène telle que le toxoïde tétanique, onpeut en particulier se référer à WO-A-86/06 414 ou à EP-A-0.220.273 ouencore à PCT/US.86/00831, équivalents, dont l’enseignement est incorporé icipar référence.
Les composés immunogènes selon l’invention peuvent êtreutilisés comme suit :
On administre à un patient un composé immunogène selon laprésente invention, par exemple par voie sous-cutanée ou intramusculaire, enquantité suffisante pour être efficace sur le plan thérapeutique, à un sujet ayantbesoin d’un tel traitement La dose administrée peut aller par exemple de 100 à1000 pg par voie sous-cutanée, une fois par mois pendant trois mois, puispériodiquement en fonction du taux des anticorps sériques induits, par exempletous les 2-6 mois.
Une composition selon l’invention peut être administrée parn'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins,en particulier par voie sous-cutanée, par voie intramusculaire, par voieintraveineuse ou par voie orale. L'administration peut avoir lieu en dose uniqueou répétée une ou plusieurs fois après un certain intervalle de temps. C’est pourquoi la présente demande a également pour objet unecomposition pharmaceutique, curative ou préventive, caractérisée en ce qu'ellecomprend à titre de principe actif, un composé immunogène tel que défini ci-dessus. Le composé immunogène peut être conditionné seul ou mélangé à unexcipient pharmaceutiquement acceptable tel qu’un adjuvant. L’invention a encore pour objet des médicaments caractérisés en ce qu'ils sont constitués des composés immunogènes tels que définis ci- dessus, à savoir des composés immunogènes ci-dessus pour leur utilisation - 8 - 010615 dans une méthode de traitement thérapeutique du corps humain ou animal,ainsi que l'utilisation d’un tel composé immunogène pour la préparation d’unmédicament curatif ou préventif destiné au traitement ou à la prévention deseffets nocifs des protéines de régulation ci-dessus, et notamment du Tat. En 5 effet, les composés selon l'invention ont perdu leurs propriétés toxiques etpeuvent donc être administrés chez l'homme comme on le verra ci-après dansla partie expérimentale. L'administration de composés immunogènes selon l’inventioncorrespond à une immunothérapie active. Il peut être intéressant également de 10 procéder à une immunothérapie passive, c'est à dire de fournir à un patientdirectement des anticorps dont il a besoin pour neutraliser les effets nocifs desprotéines de régulation des virus V1H-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2.
Ces anticorps anti-protéine de régulation peuvent être obtenusclassiquement et à titre d’exemple après immunisation d’un mammifère, 15 homme ou animal, à l’aide d’un composé immunogène tel que défini ci-dessus,par clonage de lymphocytes B humains transformés par le virus Epstein-Barr
_puis récupération des anticorps attendus sécrétés par lesdits lymphocytes B transformés, ou encore par recombinaison génétique à partir d'une librairie dephages. 20 C'est pourquoi la présente demande a également pour objet de tels procédés de préparation d’anticorps anti-protéine de régulation d'un virusVIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2 et en particulier d'anticorps anti-Tat toxoïde,et notamment un procédé de préparation d’un anticorps ci-dessus caractériséen ce que l’on immunise un mammifère à l'aide d'un composé immunogène tel 25 que défini ci-dessus.
La présente demande a encore pour objet un anticorps anti-protéine de régulation d’un virus VlH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2 et enparticulier des anticorps polyclonaux ou monoclonaux obtenus à partir de sujetshumains ou de mammifères immunisés par la mise en oeuvre des procédés ci- 30 dessus décrits.
Ces anticorps spécifiques pourront provenir : - 9 - 010615 1. soit du sujet lui-même, induits par une immunisation active(vaccination) avec une protéine de régulation biologiquement inactivée maisimmunogène, notamment le Tat Un tel composé immunogène, dans le cas parexemple du Tat est appelé Tat-toxoTde par analogie aux toxoTdes bactériens, 2. soit d'un organisme étranger, allô- ou xénogénique, administréau sujet par immunisation passive (sérothérapie). Les anticorps allogéniques(chez l’homme) pourront être engendrés chez des sujets non infectésvolontaires après immunisation active (vaccination) avec une protéineimmunogène ou ses dérivés selon l'invention, notamment du Tat (Tat-toxoïdeou fragments peptidiques du Tat selon l'invention). Ces anticorps administrés ’passivement, qu’ils soient allogéniques (humains) ou xénogéniques (animaux),pourront être des anticorps monodonaux ou polyclonaux complets ou desfragments F(ab*)2 ou Fab de l'anticorps.
Par « anticorps anti-protéine de régulation », l’on entend desanticorps monoclonaux ou polyclonaux ou des fragments F(ab*)2 ou Fab de cesanticorps ou encore des anticorps anti-protéine de régulation obtenus parconstruction génétique à partir d’une librairie de phages.
Les anticorps allogéniques d'origine humaine sont : - soit polyclonaux - pouvant être obtenus chez des sujetsséronégatifs volontaires immunisés avec un composé immunogène selonl’invention, notamment du Tat-toxoïde ou des fragments peptidiques de Tat. - soit monoclonaux à partir de clones spécifiques de cellules Btransformées par le virus EBV de ces individus immunisés (lignées B EBVspécifiques).
Les anticorps xénogéniques proviennent d'animauxhyperimmunisés avec un composé immunogène selon l’invention, notammentdu Tat ou ses dérivés (Tat-toxoïde, fragments peptidiques de Tat détoxifiésselon l'invention), et sont - soit polyclonaux provenant d'animaux hyperimmunisés, - soit monoclonaux, obtenus après hybridation selon la techniqueque Kohler et Milstein de cellules spléniques ou d'adénocytes avec une lignée 10 - 010615 myélomateuse, type x63, notamment x63AG3. Dans ce cas on préfère lesanticorps équins ou de lapin. • La présente demande a encore pour objet un procédé depréparation d’anticorps anti-protéine de régulation d’un virus VIH-1, VIH-2,HTLV-1 ou HTLV-2, caractérisé en ce que l’on immunise un mammifère,homme ou animal, avec un composé immunogène tel que défini ci-dessus.
La présente invention a aussi pour objet un procédé depréparation d'anticorps monoclonaux anti-protéine de régulation d’un virus VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2, caractérisé en ce que l’on utilise des cellules Bprovenant d’individus immunisés par un composé immunogène selon laprésente invention, lesdites cellules B étant transformées par le virus EBV etproduisant des anticorps spécifiques anti-protéine de régulation d’un virus VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2.
Les cellules EBV + ci-dessus peuvent être cultivées de manière àproduire les anticorps attendus. Ces cellules, comme on l'a vu, proviennentnotamment de malades immunisés par une protéine de régulation native, oupar un composé immunogène selon l’invention.
La présente demande a encore pour objet un procédé depréparation d’anticorps selon l’invention monoclonaux, dirigés contre uneprotéine de régulation d’un virus VlH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2 inactivée ounon, caractérisé en ce que l'on prépare des hybridomes de mammifère,notamment de souris à partir de splénocytes ou adénocytes notamment desouris immunisées par une protéine de régulation native ou un composéimmunogène selon l’invention, et de cellules de myélome, de préférence delignée x63, selon les procédés bien connus de l'état de la technique (Kohler etMilstein).
La présente demande a également pour objet un procédéd’obtention d’anticorps anti-protéine de régulation d'un virus VlH-1, VIH-2,HTLV-1 ou HTLV-2, par la technologie de recombinaison génétique, caractériséen ce que l'on utilise à titre d’immunogène un composé immunogène tel quedéfini ci-dessus. - 11 - 010615
La présente demande a encore pour objet des fragments F(ab’)2ou Fab desdits anticorps ; ceux-ci peuvent être obtenus par digestionenzymatique par exemple.
La présente invention a tout autant pour objet un procédéd’immunisation passive de sujets contaminés par le virus VIH, utilisant desanticorps spécifiques anti-protéine de régulation de la multiplication du virusVIH et spécialement anti-Tat neutralisant ou bloquant les effets nocifs de cetteprotéine dans sa configuration extracellulaire et préparés comme indiqué ci-dessus, ou des fragments F(ab’)2 ou F(ab) de ces anticorps.
La présente demande a aussi pour objet un procédéd'immunisation active anti-VIH ou Sida utilisant un composé immunogène décritci-dessus, associé à une protéine constitutive (ou de structure) d’un virus VIH,notamment la glycoprotéine d’enveloppe gp 120 ou gp 160 ou un fragmentpeptidique modifié ou non de celles-ci, ou au virus VIH inactivé, ou au virus VIHdeplété de son ARN génomique par exemple par hydrolyse alcaline. L’invention a encore pour objet un procédé d’immunisation activeanti-VIH ou - Sida utilisant un composé immunogène décrit ci-dessus, associéà un ou plusieurs immunogènes à base de cytokines inactivées etspécialement l’interféron a, le TGFp ou le TNF. En effet, comme on le verra ci-après dans la partie expérimentale, une combinaison des effets des anticorpsselon l’invention contre des protéines de régulation et des anticorps anti-interféron a en particulier, restaure complètement l’immunosuppression induitepar le VIH. C'est pourquoi la présente demande a encore pour objet unecomposition renfermant deux composés immunogènes, à savoir un composéimmunogène d-dessus décrit, et un composé immunogène capable d’induiredes anticorps contre une cytokine, comme Finterféron a ou le TNF a, commedécrit par exemple dans WO-A-9118454, ainsi qu'une composition refermantun anticorps dirigé contre une cytokine notamment l'interféron a et un anticorpsci-dessus dirigé contre une protéine de régulation. - 12 - 010615
La présente demande a également pour objet un procédéd’immunisation active caractérisé en ce que l’on utilise à titre d'immunogène uncomposé immunogène tel que défini ci-dessus associé à un adjuvantd'immunité minéral, huileux ou de synthèse, ou encore un composéimmunogène tel que défini ci-dessus couplé ou associé à une protéineaugmentant son immunogénicité.
Ces immunisations peuvent être réalisées tant à titre curatif qu’àtitre préventif. A titre d'immunogène pour tous les procédés ci-dessus et ci-après, on utilise de préférence un dérivé de la protéine Tat.
La présente invention a encore pour objet un procédéd’hyperimmunisation de sujets séronégatifs ou séropositifs VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2, caractérisé en ce que l’on utilise un immunogène tel que défini ci-dessus, pour la production de sérums humains hyperimmuns, lesquels peuventêtre particulièrement destinés à la sérothérapie passive par administrationd’anticorps spécifiques purifiés ou de leurs fragments F(ab’)2 ou Fab. L’invention a en outre pour objet une composition pharmaceutiquecomprenant, à titre de principe actif curatif ou préventif, au moins un anticorpsanti-protéine de régulation d’un virus tel que défini ci-dessus ou obtenu selonles procédés ci-dessus. L’invention a enfin pour objet l’utilisation d’un composéimmunogène ou d’un anticorps ci-dessus pour la préparation d'un médicamentdestiné au traitement des effets nocifs d’une protéine de régulation d’un virusVIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2.
En résumé et notamment, la présente invention a pour objetl’usage à titre préventif, ou curatif chez le sujet séropositif ou atteint d'ARC/Sidad’anticorps spécifiques de manière à bloquer l'action nocive d’une protéine derégulation d’un virus VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2 et notamment du Tatcirculant Ces anticorps spécifiques pourront provenir. 1. du sujet lui-même,induits par une immunisation active (vaccination) avec du Tat biologiquementinactivé mais immunogène, appelé Tat-toxoïde par analogie aux toxoîdes 13 - 010615 bactériens ou 2. d'un organisme étranger, allô- ou xénogénique, administré ausujet par immunisation passive (sérothérapie). Les anticorps allogéniques (chezl'homme) pourront être engendrés chez des sujets non infectés volontairesaprès immunisation active (vaccination) avec une protéine de régulation telleque le Tat ou ses dérivés (Tat-toxoTde ou fragments peptidiques du Tat selonl'invention). Ces anticorps administrés passivement, qu’ils soient allogéniques(humains) ou xénogéniques (animaux), pourront être des anticorpsmonoclonaux ou polyclonaux complets ou des fragments F(ab*)2 ou Fab del'anticorps.
Par Tat-toxoïde, comme on l'a indiqué ci-dessus on entend unpeptide ou une protéine Tat traitée par un agent chimique. Ce traitement a faitperdre à la molécule les propriétés biologiques toxiques du Tat circulant(immunosuppression des cellules T; induction de la production d'interféron apar les cellules productrices d'interféron ; néoangiogenèse des cellulesendothéliales; blocage de l'effet antiviral de l'interféron sur les macrophages)mais ont préservé les propriétés susceptibles d'induire la formation desanticorps, lorsque présentée et préparée de manière appropriée, couplée ounon à un "carrier", agrégée ou non, en présence ou non d'adjuvant.
On a élargi la notion de Tat-toxoïde aux fragments peptidiquesimmunogènes de Tat c'est-à-dire une séquence peptidique du Tat susceptibled’induire la formation des anticorps anti-Tat lorsqu'elle est présentée demanière appropriée, couplée à un carrier ou non, en présence ou nond'adjuvant L'invention a également pour objet des compositionspharmaceutiques. a) Une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agentpréventif ou curatif un toxoïde viral ou un fragment ou analogue de protéine derégulation, notamment du Tat selon l'invention. b) Une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agentpréventif ou curatif des anticorps anti-Tat produits à partir d’organismesimmunisés contre ladite protéine ou ses fragments F(ab*)2 ou Fab, selon - 14 - 010615 l’invention.
En outre l'invention propose également un kit comprenant une composition pharmaceutique vaccinale qui en plus du principe actif (Tat-toxoïde ou ses dérivés ou anticorps anti-Tat) peut comprendre un adjuvant et/ou un autre immunogène à propriétés anti-rétrovirus.
Enfin l'invention propose une composition pharmaceutique sousune forme galénique conventionnelle. En particulier on associe le principe actifselon l'invention en quantité suffisante pour être efficace d'un point de vuethérapeutique avec un diluant ou un support acceptable d’un point de vuepharmaceutique. EXPERIENCE 1 : Effets pathogènes de la protéine Tat circulante
Immunosuppression des cellules T en présence de Tat: L'effet du Tat sur des lymphocytes T activés du sang périphériquea été recherché. Des cellules mononuclées (PMBC) et des lymphocytes T (HLA35 DR-) isolés par immunomagnétisme ont été activés par des anticorps anti-CD3 en présence ou en absence de la molécule Tat Après 5 jours de culture,la prolifération cellulaire a été mesurée par incorporation de thymidine H3. Lesrésultats ont montré que le Tat inhibait la prolifération des cellules T HLA DR-(85% d'inhibition à la concentration de 1,5 pg par ml). Cette inhibition disparaîten présence d'anticorps spécifique anti-Tat (Intracel, U.K.). EXPERIENCE 2 : Effets pathogènes de la protéine Tat circulante :
Inhibition de l'effet de l'interféron sur les macrophages enprésence de Tat : L'effet du Tat sur l'action antivirale de l'interféron a a été mesurépar te test biologique conventionnel en utilisant la mesure du pouvoircytopathogène du virus VSV sur tes cellules MDBK.
Effet du Tat sur l’interféron exogène
Des doses croissantes de Tat ont permis d'inhiber dès de faiblesconcentrations suivant une courbe dose-effet pour des concentrations de Tat - 15 - 010615 allant de 1 à 20 pg/ml, le pouvoir anti-viral de Tinterféron exogène. Dans uneexpérience représentative, l'effet protecteur de l'interféron a apparent jusqu'à ladilution 1/4800 (correspondant à 150 U.l.) est réduit à la dilution 1/300 pour desconcentrations de Tat de 10 pg/ml. Ainsi à la concentration de 10 pg/ml de Tat,à la dilution 4 800 de l’interféron exogène le titre de VSV est passé de 10^.8(échantillons interféron sans Tat) à 105.5 (échantillons interféron en présencede Tat). Dans ces expériences, Tinhibition de ,'effet anti-viral de l'interféron apar la molécule Tat est supprimée en présence d'anticorps spécifiques anti-Tat(Intracel, U.K.), de même que par les anticorps de cheval que nous avonspréparé (voir exemples ci-après). EXPERIENCE 3 : Mise en évidence chez les sujets infectes par le VlH-1 dela protéine Tat dans sa configuration extraceiiuiaire.
Présence d'anticorps anti-Tat dans le sérum de patients séropositifs: a) Une étude par Elisa des anticorps anti-Tat sériques utilisantcomme antigène la molécule Tat native a été réalisée chez 50 sujetsséropositifs et 15 sujets séronégatifs. Tous les sérums des sujets séronégatifset 20 sérums de séropositifs n'ont pas révélé la présence d'anticorps anti-Tatavec une densité optique inférieure au seuil (eut off) (D.O. = 0,250). Parmi les30 sérums de sujets infectés par le VIH, qui ont dépassé le seuil, 6 ont une DOsupérieure à 0,500. Aucune corrélation apparente n'a pu être faite entre laprésence d'anticorps anti-Tat d'une part, l'état clinique et le nombre de cellulesCD4 par mm3 de sang d'autre part b) Une étude par Elisa d'anticorps anti-Tat sériques utilisantcomme antigènes différents peptides du Tat a été réalisée chez des sujetsséropositifs à différents stades de l'évolution de leur infection VIH - sujetsasymptomatiques ; patients présentant des manifestations cliniques pré-Sida(ARC) et patients atteints de Sida. Les résultats de cette étude sont lessuivants: - 16 - 010615 1) Les séquences peptidiques du Tat.. MEPVDPRLEPWKHPG (résidus 1 - 15 en N terminal) HQVSLSKQPTSQPRGD (résidus 65 - 80 en C terminal)ont été reconnues par b grande majorité des sérums de séropositifs et par 5 aucun sérum de séronégatifs (contrôles). Les réactions ont été fortementpositives mais aucune corrélation n'a pu être montrée en rapport avecrévolution de l'infection VIH et le nombre de CD4 des sujets. 2) Les autres séquences étudiées n'ont pas été reconnues demanière notable par les sérums qu'ils soient d'individus séropositifs ou 10 contrôles (voir Tableau 1). Seuls quelques rares sérums pour chaque séquenceont montré une densité optique supérieure au seuil (2 fois la moyenne dessérums contrôles). TABLEAU 1
Sujets infectés* (72 sérums) Sujets contrôles( 10 sérums) Résidus peptidiques du Tat Sérums positifs** D.O. moyenne Sérums positifs** D. O.moyenne 1-15 67 0,43 0 0,08 9-20 0 0,26 0 22 - 37 7 0,78 0 0,41 36-50 5 0,86 0 0,65 46-60 6 0,53 0 0,40 52-60 2 0,32 0 0,38 56-70 0 0,19 0 0,20 65-80 70 1,01 0 0,08 15 * Les sujets infectés par le VIH sont à des stades variés; sujetsasymptomatiques, patients atteints d'ARC et patients atteints de Sida. ** La réaction est considérée positive (seuil) lorsque la densité optique est 2fois supérieure à la moyenne des séronégatifs. 20 3) II est intéressant de noter que la séquence la plus réactive (AA 65 - 80) est celle contenant les résidus RGD reconnus par les intégrines. EXEMPLE 1 : Préparation de la protéine Tat immunogène (Tat-toxoïde). - 17 - 010615
Inactivation de la protéine Tat en présence de formaldéhydeA une solution de Tat (1 mg/ml) dans du phosphate disodique 70 mM, pH 8,0, on ajoute du formaldéhyde à la concentration finale 33 mM.
Le mélange est incubé à 37 *C pendant 1,3,5,7 et 9 jours.A la fin de chacune des périodes d'incubation, un échantillon est prélevé et la réactionavec le formaldéhyde bloquée par addition de glycine à la concentration finale100 mM.
Chaque prélèvement est dialysé pendant 1 nuit à 4°C contre 100fois son volume de PBS (tampon phosphate salin). EXEMPLE 2 : Préparation de la protéine Tat immunogène (Tat-toxoïde)Inactivation de la protéine Tat en présence de glutaraldéhydeA une solution de Tat (1 mg/ml) dans du phosphate disodique 70 mM, pH 8,2 on ajoute du glutaraldéhyde à la concentration finale, soit 0,026M, soit 0,0026 M. On laisse la réaction avec le glutaraldéhyde se poursuivrependant des temps divers variant de 1 mn à 3 h. Après le temps de réactionchoisi, à la température du laboratoire, la réaction est bloquée par addition deglycine à la concentration finale de 100 mM. Les différents prélèvements sontdialysés, pendant 16 heures, à 4’C, contre 100 fois leur volume de PBS. EXEMPLE 3 : Préparation de la protéine Tat immunogène (Tat-toxoïde)Inactivation et couplage simultané à la toxine tétanique du TatA un mélange de toxine tétanique et de Tat dans un rapport molaire de 1 à 15, dans un tampon phosphate 70 mM -100 mM (pH variant de6,8 à 8,2) on a ajouté du glutaraldéhyde à la concentration finale (variant de0,0026 M à 0,026 M) et on laisse la réaction d'inactivation et de couplages'effectuer pendant des temps variables (3-15 mn) à la température dulaboratoire. La réaction est bloquée par addition de glycine à la concentrationfinale 100 mM et les différents prélèvements sont dialysés pendant 16 heures,à 4°C, contre 100 fois leur volume de PBS. 18 - 0Î06Î5 EXEMPLE 4 : Pouvoir immunogène et antigénicité des Tat-toxoïdes
Tat-toxoïde immunogène chez ia souris: Anticorps par Elisa
Le pouvoir immunogène des différentes préparations de Tatinactivé, soit par le formaldéhyde (Tat-toxoïde), soit par le glutaraldéhyde (Tat-polan), soit après couplage à la toxine tétanique (conjugué Tat-toxinetétanique), c’est à dire des composés immunogènes des exemples 1 à 3, a étédéterminé chez la souris.
Des souris Swiss de 18-20g ont été immunisées par 2 injectionssous-cutanées de l'immunogène des exemples 1, 2 et 3 en présenced'adjuvant complet de Freund, la seconde pratiquée 3 semaines après la 1 èreavec 20 pg de préparation en émulsion en présence d'adjuvant incomplet deFreund. 15 jours après l'injection de rappel, des prélèvements sanguinsont été pratiqués par voie intracardiaque. Les anticorps anti-Tat ont étédéterminés dans les sérums par Elisa. La densité optique a été mesurée à490 nm.
Les résultats obtenus, résumés dans le Tableau 2, montrent quetoutes les préparations de Tat sont immunogènes à des degrés divers, hormisle conjugué Tat-TT traité pendant un temps court (3 minutes) par laglutaraldéhyde, qui s’est avéré toxique et a tué les souris en 24 heures (TT tropfaiblement inactivé). Il est à signaler que les sérums des souris non-immunisées répondent en dessous de 0,200 (D.O) au Tat natif comme au Tat-toxoïde. De plus ces résultats montrent que le Tat natif est reconnu par lesanticorps de la même façon que le toxoïde, ce qui confirme leur antigénicitééquivalente et justifie encore l'utilisation du Tat-toxoïde pour immuniser. - 19 - 01 Ο 6 î 5 TABLEAU 2
Préparations Taux d'anticorpsanti-Tat natifDensité Optique (D.O) Taux d'anticorpsanti-Tat toxoïde(3 jours) Densité Optique (D.O) Tat-toxoïde (1 jours) 0,320 0,331 Tat-toxoïde (3 jours) 0,465 0,494 Tat-toxoïde (5 jours) 0,998 0,901 Tat-toxoïde (9 jours) 0,807 0,780 Tat -polan (1 mn;) 0,026 M 0,718 0,706 Tat -polan (15 mn;) 0,026 M 1,564 1,452 Tat -polan (60 mn;) 0,0026 M 1,065 1,113 Tat -polan (3h;) 0,0026 M 0,194 0,210 conjugué Tat - TT (3 mn; 0.0026M) toxique toxique conjugué Tat - TT (15 mn; 0.0026M) 1,987 1,897 conjugué Tat - TT (6 mn; 0.026M) 0,824 0,795 conjugué Tat - TT (Ï5 mn; 0.026M) 1,642 1,556 5 EXEMPLE 5 : Toxicité aiguë
La toxicité des préparations de Tat-toxoïde et de Tat-polan a étédéterminée par injection sous-cutanée à la souris Swiss de 18-20g. Lespréparations de Tat-toxoïde (7 jours) et Tat-polan (15 mn; 0,026 M) ont étéadministrées à la dose de 100 pg par souris. Les animaux ont été observés 10 pendant 7 jours.
Aucun signe manifeste de toxicité n’a été observé. Le poids desanimaux a continué de croître. L’examen macroscopique des organes àl’autopsie n'a pas permis de révéler d’anomalies. 15 EXEMPLE 6 : Anticorps anti-Tat
On a préparé des anticorps anti-Tat comme suit : on a isolé lafraction IgG sur une colonne de protéine G à partir de sérums de sourisimmunisées avec du Tat-polan. Les fragments F(ab’)2 ont été égalementpréparés à partir de la fraction IgG isolée par digestion pepsique. La réactivité 20 immunologique de ces fractions a été vérifiée par Elisa. - 20 - 010615 EXEMPLE 7 : Inactivité biologique du Tat-toxoïde
Les différents Tat-toxoïdes inactivés 1, 3, 5 , et 9 jours de l'exemple 1 sont testés dans un test d'activité d'expression du gène reporter
Chloramphénicol-Acétyl-Transférase (CAT) dépendants du "Long Terminal
Repeat" (LTR) du VIH-1.
Le principe de cet essai est te suivant : des cellules de lignéeHela contenant te gène CAT sous contrôle du LTR du VIH, sont mises encontact avec 1e Tat natif ou tes toxoïdes pendant 6h. Après 24h de culture, tescellules sont lysées et la quantité de CAT produite est mesurée par un testd'activité du CAT qui mesure 1e pourcentage d'acétyl-CoA accroché au.chloramphénicol. Si la molécule Tat est active, il y aura un fort pourcentage dechloramphénicol acétylé, sinon ce pourcentage sera faible. La culture de cescellules adhérentes se fait de manière standard en milieu RPMI, 10% FCS. Laconcentration de Tat ajoutée pour avoir un effet-dose va de 1 pg à 10 pg par mlde surnageant.
Les résultats présentés ici montrent que le Tat-toxoïde esttotalement inactivé après 3 jours, avec une activité résiduelle faible à 1 jour.
Préparations Acétylation du chloramphénicol (%) Tat natif 100 Tat-toxoïde (1 jours) 18 Tat-toxoïde (3 jours) 3 Tat-toxoïde (5 jours) 2 Tat-toxoïde (9 jours) 3 EXEMPLE 8 : Absence d’effets pathogènes du Tat-toxoïde a) Absence d'immunosuppression des cellules T en présence de
Tat-toxoïde (contrairement aux expériences 1 et 2). L'effet du Tat-toxoïde (5 jours) sur des lymphocytes T activés du sang périphérique a été recherché. Des cellules mononuclées (PMBC) et deslymphocytes T (HLA 35 DR-) isolés par immunomagnétisme ont été activés pardes anticorps anti-CD3 en présence ou en absence de composés ~ 21 - 010615 immunogènes de l’exemple 1. Après 5 jours de culture, la prolifération cellulaire a été mesurée par incorporation de thymidine H3. Les résultats ont montré que, contrairement au Tat natif, le Tat-toxoïde n'inhibait pas la prolifération des cellules T HLA DR-. Ainsi, à la dose de 5 pg/ml dans la culture, en présence de
Tat-toxoïde, la prolifération des cellules était identique à celle du contrôle. b) Absence d'inhibition de l'effet de l'interféron a sur lesmacrophages en présence de Tat-toxoïde: L'effet du Tat-toxoïde sur l'action antivirale de l'interféron a a étémesuré par le test biologique conventionnel en utilisant la mesure du pouvoircytopathogène du virus VSV sur les cellules MDBK.
Effet du Tat-toxoïde sur l'interféron exogène
Contrairement au Tat natif, des doses équivalentes de Tat-toxoïde de l'exemple 1 n'ont pas permis d'inhiber le pouvoir anti-viral deFinterféron exogène. Dans une expérience représentative, l'effet protecteur del'interféron a apparent jusqu'à la dilution 1/4800 (correspondant à 150 U.l.) estmaintenu en présence de 50 pg de Tat-toxoïde, alors qu'il est diminué au 1/300avec le Tat natif. A la dilution 4 800 de l'interféron exogène le titre de VSV estmaintenu au niveau du contrôle à 10^.8 (échantillons interféron avec Tat-toxoïde) alors qu'il passe à 10^.5 (échantillons interféron en présence de Tat). EXEMPLE 9 : Rôle protecteur des anticorps anti-Tat-toxoïde face auxeffets du Tat natif.
Des anticorps anti-Tat-toxoïdes de l'expérience 1 (traitement auformaldéhyde 3 jours) ont été préparés chez des chevaux hyperimmunisés. Apartir de ces anticorps des fragments F(ab*)2 ont été aussi préparés selon laprocédure décrite dans l'exemple 6.
Les anticorps, comme les fragments F(ab’)2, inhibent les différentes activités biologiques du Tat natif dans les différents tests: transactivation du LTR du VIH (essai CAT) (voir exemple 7), immunosuppression (voir expérience 1), inhibition de l'effet de l'interféron a - 22 - 010615 exogène sur culture (voir expérience 2). Les expériences 1, 2, et l'exemple 7 ont été repris avec du Tat natif et en préincubant ou non ce Tat natif 1h à 37° avec les anticorps ou fragments FCab^, à la dose de 40 pg d'anticorps pour 1 pg de Tat natif. Les résultats ont montré que les anticorps inhibent l'action du
Tat natif. EXEMPLE 10 : Redressement systématique de la prolifération cellulairegrâce à la combinaison anticorps anti-Tat et anticorpsanti-interféron a : synergie des anticorps anti-Tat et anti-interféron a.
On a observé que des PBLs (cellules mononucléées du sangpériphérique) de sujets sains infectées in vitro avec du VlH-1 et cultivées 6jours exerçaient une activité immunosuppressive.
En effet, si l'on ajoute de telles cellules infectées depuis 6 jours,ou non infectées) irradiées en proportion de 1 pour 5 à des cellules autologuesactivées par la protéine Staphylococcus Enterotoxin B (SEB), on observe aubout de 4 jours que la prolifération des cellules autologues est amoindrie de80% par rapport aux contrôles (cellules non infectées).
Dans ce modèle, si on ajoute à la culture des cellules infectées invitro des anticorps anti-interféron a, ces cellules perdent alors leur effetsuppresseur dans 50% des sujets. Chez 20% des cas, les cellulessuppressives perdent 60% de leur effet suppresseur, et chez 30% cet effetsuppresseur est significativement maintenu.
Si on ajoute aux anticorps anti-interféron a des anticorps anti-Tat(monoclonaux décrits en expérience 1, ou polyclonaux de cheval de l'exemple9), c'est dans 100% des cas que les cellules infectées in vitro perdent leur effetsuppresseur.
Ces expériences montrent le rôle combiné toxique de Tat et de l'interféron a dans l'immunosuppression induite par le VIH1 et qu'une association d'anticorps anti-interféron et anti-Tat restaure une immunité normale. 23 010615 EXEMPLE 11 : Préparation de la protéine Nef immunogène (Nef-toxoïde)
Inactivation de la protéine Nef en présence de formaldéhyde. A une solution de protéine Nef (1g/ml) dans du phosphate disodique 70mM, pH 8,0, on ajoute du formaldéhyde à la concentration finale de 33 mM.
Le mélange est incubé à 37°C pendant 1, 3, 5, 7 et 9 jours. A lafin de chacune des périodes d'incubation, un échantillon est prélevé et laréaction avec le formaldéhyde bloquée par addition de glycine à laconcentration finale 100mM.
Chaque prélèvement est dialysé pendant 1 nuit à 4°C contre 100fois son volume de PBS (tampon phosphate salin), et le Nef-toxoïde isolé. EXEMPLE 12 : Préparation de la protéine Nef immunogène (Nef-polan)
Inactivation de la protéine Nef en présence de glutaraldéhyde. A une solution de Nef (1mg/mlm) dans du phosphate disodique70mM, pH 8,2, on ajoute du glutaraldéhyde à la concentration finale, soit0,026 M, soit 0,0026 M. On laisse la réaction avec le glutaraldéhyde sepoursuivre pendant des temps divers variant de 1mn jusqu'à 3 H. Après letemps de réaction choisi, à la température du laboratoire, la réaction estbloquée par addition de glycine à la concentration finale de 100 mM. lesdifférents prélèvements sont dialysés, pendant 16 heures, à 4°C, contre 100fois leur volume de PBS, et le Nef-polan isolé. EXEMPLE 13 : Pouvoir immunogène et antigénicité des Nef-toxoïdes
Nef-toxoïde immunogène chez la souris : Anticorps par Elisa.
Le pouvoir immunogène des différentes préparations de Nef inactivé, soit par le formaldéhyde (Nef-toxoïde), soit par le glutaraldéhyde (Nef- polan), c’est à dire les composés immunogènes des exemples 12 et 13, a été déterminé chez la souris. 24 010615
Des souris Swiss de 18-20 g on été immunisées par 2 injectionssous-cutanées de l'immunogène des exemples 12 et 13 en présenced'adjuvant de Freund, la seconde pratiquée 3 semaines après la première,avec 20 pg de préparation en émulsion en présence d'adjuvant incomplet de 5 Freund. 15 jours après l'injection de rappel, les prélèvements sanguins ontété pratiqués par voie intracardiaque. Les anticorps anti-Nef ont été déterminésdans les sérums par Elisa. La densité optique a été mesurée à 490 nm.
Les résultats obtenus, résumés dans le tableau ci-après, montrent10 que toutes les préparations de Nef sont immunogènes à des divers degrés. Ilfaut signaler que les sérums de souris non immunisées donnent un niveau de réponse inférieur à 0,2 (en D.O) dans ces essais Elisa.
Ces résultats montrent que la protéine Nef native est reconnuepar les anticorps de la même façon que le toxoïde, ce qui confirme leur 15 antigénicité équivalente et justifie encore l’utilisation du Nef-toxoïde pourimmuniser.
Préparations Taux d'anticorpsanti-Nef natifDensité Optique (D.O) Taux d'anticorpsanti-Nef toxoïde(3 jours) Densité Optique (D.O) Nef-toxoïde (1 jours) 0,56 0,5 Nef-toxoïde (3 jours) 0,78 0,8 Nef-toxoïde (5 jours) 0,99 1,01 Nef-toxoïde (9 jours) 0,65 0,75 Nef-polan (1 mn;) 0,026 M 1,12 0,98 Nef -polan (15 mn;) 0,026 M 1,69 1,56 Nef -polan (60 mn;) 0,0026 M 1,31 1,41 Nef -polan (3h;) 0,0026 M 0,35 0,41 - 25 - 010615
LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE : (i) DEPOSANT :
(A) NOM : NEOVACS
(B) RUE : 117, rue Vieille du Temple(C ) VILLE : PARIS
(E) PAYS : FRANCE (F) CODE POSTAL : 75003 (ii) TITRE DE L'INVENTION : Nouveaux immunogènes, denouveaux anticorps, leur procédé de préparation et des compositionspharmaceutiques les renfermant. (iii) NOMBRE DE SEQUENCES : 1 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR : (A) TYPE DE SUPPORT : Floppy disk (B) ORDINATEUR : IBM PC compatible (C ) SYSTEME D’EXPLOITATION : PC-DOS/MS-DOS(D) LOGICIEL : Patentln Release # 1.0, Version # 1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQUENCE ID NO : 1 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 16 acides aminés (B) TYPE : acide aminé · (C ) NOMBRE DE BRINS : simple(D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 1 :
His Gin Val Ser Leu Ser Lys Gin Pro Thr Ser Gin Pro Arg Gly Asp 1 5 10 15
Claims (21)
- - 26 - 010615 REVENDICATIONS1. Composé immunogène administrable à l’homme car dénué detoxicité, caractérisé en ce qu’il dérive d’une protéine de régulation d’un virusVIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2, par traitement chimique à l'aide d'un agentde couplage tel qu’un aldéhyde, ou d'une protéine porteuse activée par un pré-traitement à l’aide d’un aldéhyde, lui permettant d'être reconnu par desanticorps dirigés contre ladite de protéine de régulation, et de conserver despropriétés immunogènes suffisantes pour créer des anticorps neutralisant oubloquant ladite protéine native, tout en ayant perdu au moins 50%, despropriétés biologiques toxiques de ladite protéine native.
- 2. Composé immunogène selon la revendication 1, caractérisé en.ce qu’il dérive d’une des protéines de régulation suivantes des virus V1H-1 ouVlH-2, Nef, Tat, Vif ou Rev.
- 3. Composé immunogène selon la revendication 2, caractérisé ence qu’il dérive de la protéine Tat
- 4. Composé immunogène selon la revendication 1, caractérisé ence qu’il dérive d’une protéine Tax, d’un virus HTLV-1 ou HTLV-2.
- 5. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu’ellecomprend un composé immunogène tel que défini à l’une des revendications 1à 4.
- 6. Un composé immunogène tel que défini à l’une desrevendications 1 à 4 pour son utilisation dans une méthode de traitement ducorps humain ou animal.
- 7. Procédé de préparation d’un composé immunogène tel quedéfini à l’une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l’on soumet uneprotéine de régulation d’un virus VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2 à untraitement chimique à l'aide d'un aldéhyde, sélectionne puis purifie le composéattendu.
- 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que letraitement chimique comprend un traitement à l'aide d’un aldéhyde suivi d’un - 27 - couplage à une protéine porteuse. .
- 9. Procédé de préparation d’un anticorps anti-protéine derégulation d'un virus V1H-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2 caractérisé en ce quel’on immunise un mammifère à l’aide d'un composé immunogène tel que définià l’une des revendications 1 à 4.
- 10. Procédé de préparation d’un anticorps anti-protéine derégulation d'un virus VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2 caractérisé en ce quel'on procède au clonage de lymphocytes B transformés par le virus Epstein-Barr, puis récupère les anticorps attendus sécrétés par lesdits lymphocytes Btransformés.
- 11. Procédé de préparation d’un anticorps anti-protéine Tat d’unvirus VIH-1 ou VIH-2, caractérisé en ce que l’on procède au clonage delymphocytes B transformés par le virus Epstein-Barr, puis récupère lesanticorps attendus sécrétés par lesdits lymphocytes B transformés.
- 12. Procédé de préparation d’un anticorps anti-protéine Tax d’unvirus HTLV-1 ou HTLV-2 caractérisé en ce que l’on procède au clonage delymphocytes B transformés par le virus Epstein-Barr, puis récupère lesanticorps attendus sécrétés par lesdits lymphocytes B transformés.
- 13. Procédé de préparation d’un anticorps anti-protéine derégulation d'un virus VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2 caractérisé en ce quel’on prépare ledit anticorps par recombinaison génétique, à partir d’une librairiede phages.
- 14. Procédé de préparation d’un fragment F(ab’)2 ou F(ab) d’unanticorps tel que préparé à l’une des revendications 9 à 13, caractérisé en ceque l’on procède à la digestion enzymatique d’un tel anticorps.
- 15. Un anticorps anti-protéine de régulation d'un virus VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2 obtenu par immunisation d'un mammifère à l’aide d’uncomposé immunogène tel que défini à l’une des revendications 1 à 4.
- 16. Un fragment F (ab’)2 ou F(ab) d’un anticorps tel que défini à larevendication 15.
- 17. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle 010615 - 28 - 010615 comprend un anticorps tel que défini à l’une des revendications 15 et 16.
- 18. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu’ellecomprend un composé immunogène tel que défini à l'une des revendications 1à 5, associé à une protéine Gag, Pol ou Env d’un virus VIH-1, VlH-2, HTLV-1 J 5 ou HTLV-2. « 19. Composition 'pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un composé immunogène tel que défini à l’une des revendications 1 à 5, associé à une protéine gp120 / gp160, native ou inactivée par traitement physique, chimique, génétique ou immunologique ou à une fraction peptidique 10 de cette protéine, modifiée ou non.
- 20. Un composé immunogène ayant la formule suivanteHQVSLSKQPTSQPRGD ou MEPVDPRLEPWKHPG ou correspondant au Tatnatif de HIV1 ou KIV2 après inactivation à l'aide d’un aldéhyde.
- 21. Une composition vaccinale renfermant 15 - un composé immunogène tel que défini à l'une des revendications 1 à 4. - un composé immunogène qui est une cytokine sous une formedifférente de sa forme native et inactivée ou un analogue inactif ou un fragmentinactif ou inactivé de cytokine.
- 22. Une composition renfermant - un anticorps anti-protéine de régulation d'un virus VIH-1, VIH-2,HTLV-1 ou HTLV-2 - un anticorps anti-cytokine tel qu'un anticorps anti-interféron a humain.
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