FR2732035A1 - Procede de regulation de l'expression d'un gene dans un baculovirus, par un site de fixation d'un recepteur de l'acide retinoique, et vecteur pour la mise en oeuvre du dit procede - Google Patents
Procede de regulation de l'expression d'un gene dans un baculovirus, par un site de fixation d'un recepteur de l'acide retinoique, et vecteur pour la mise en oeuvre du dit procede Download PDFInfo
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Abstract
L'invention est relative à un vecteur recombinant, utilisable pour réguler l'expression d'un gène placé sous contrôle du promoteur P10 ou du promoteur polyédrine du baculovirus, par l'intermédiaire d'une séquence constituant un site de fixation pour un récepteur hormonal du type RAR.
Description
La présente Invention est relative à de nouveaux vecteurs d'expression obtenus à partir de baculovirus.
Les baculovirus, représentés par le virus de la polyédrose nucléaire Autographa californica (AcMNPV), possèdent deux promoteurs très tardifs forts : celui de la polyédrine et celui du polypeptide P10, qui permettent d'exprimer, à un niveau élevé les gènes placés sous leur contrôle, et en conséquence sont couramment employés pour l'expression de gènes étrangers.
Ces promoteurs sont décrits de manière détaillée dans les publications suivantes : POSSEE et
HOWARD [Nucleic Acid Research, vol. 15, p. 10233-10248 (1987)], pour le promoteur de la polyhédrine, et QIN et al. LJ. Gen. Virol. vol. 70, p. 1273-1279, (1989)] pour le promoteur P10.
HOWARD [Nucleic Acid Research, vol. 15, p. 10233-10248 (1987)], pour le promoteur de la polyhédrine, et QIN et al. LJ. Gen. Virol. vol. 70, p. 1273-1279, (1989)] pour le promoteur P10.
On définit généralement comme : Promoteur de la polyédrine" la séquence localisée entre les positions (-71 et +1) définies par rapport au A(+1) de 1'ATG de la polyédrine, et comme "promoteur P10" la séquence localisée entre les positions (-70 et +1) définies par rapport au A(+1) de l'ATG du polypeptide P10.
Pour obtenir, à partir d'un baculovirus, un vecteur capable d'exprimer un gène étranger sous contrôle de l'un ou l'autre de ces deux promoteurs, l'on procède généralement, selon des méthodes connues en elles-mêmes, à la construction d'un vecteur de transfert renfermant ledit promoteur, puis à la recombinaison avec l'ADN du virus sauvage, et enfin à la sélection des recombinants.
Les gènes PlO et polyédrine ne s expriment qu'en fin de cycle d'infection, après la réplication du génome viral ; les promoteurs tardifs de ces gènes sont transcrits par une ARN polymérase particulière, d'origine au moins en partie virale, insensible à l'a-amanitine.
Un motif A/GTAAG commun à tous les gènes tardifs, constitue le site d'initiation de la transcription. Ce motif est indispensable à la reconnaissance de ces promoteurs par 1'ARN polymérase et donc à leur activité. Les mécanismes qui gouvernent l'activation transcriptionnelle ne sont toutefois pas encore précisément connus.
Des travaux précédents de l'équipe des
Inventeurs ont montré qu'il est particulièrement intéressant, pour augmenter le niveau d'expression d'un gène hétérologue sous contrôle de l'un des deux promoteurs très tardifs forts, de construire un baculovirus dans lequel un seul de ces deux promoteurs tardifs forts est inactivé, et de faire exprimer ledit gène sous contrôle du promoteur restant.
Inventeurs ont montré qu'il est particulièrement intéressant, pour augmenter le niveau d'expression d'un gène hétérologue sous contrôle de l'un des deux promoteurs très tardifs forts, de construire un baculovirus dans lequel un seul de ces deux promoteurs tardifs forts est inactivé, et de faire exprimer ledit gène sous contrôle du promoteur restant.
Ce principe a servi de base à la construction de plusieurs baculovirus modifiés [Demande Européenne n 91 913 605.1, aux noms de 1'INSTITUT NATIONAL DE LA
RECHERCHE AGRONOMIQUE (I.N.R.A.) et du CENTRE NATIONAL DE
LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (C.N.R.S.) ; CHAABIHI et al.,
J. Virol., 67, 2664-2671 (1993)], dans lesquels soit le promoteur P10 (baculovirus dénommé AcSLP33, par exemple), soit le promoteur de la polyédrine (baculovirus dénommé
AcSLP10, par exemple) est inactivé par délétion
Dans le cadre de la poursuite de leurs travaux sur la régulation de l'expression chez les baculovirus, les Inventeurs ont eu l'idée d'étudier l'influence de la séquence codante du gène P10 sur l'expression de celuici.Dans ce but, ils ont réalisé, à partir de baculovirus sauvage AcMNPV, des constructions comprenant le gène rapporteur CAT inséré à l'une des positions +16, +150, ou +230 de la séquence codant pour la P10 (ces positions sont définies par rapport au A (+1) du codon d'initiation
ATG de la P10), et ont étudié l'expression simultanée du gène rapporteur CAT et du gène de la polyédrine, dans les virus recombinants (dénommés respectivement AcCAT+16,
AcCAT+150, et AcCAT+230) obtenus, par rapport au baculovirus sauvage AcMNPV et au baculovirus modifié
AcSLP33 (dans lequel le promoteur P10 est inactivé).
RECHERCHE AGRONOMIQUE (I.N.R.A.) et du CENTRE NATIONAL DE
LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (C.N.R.S.) ; CHAABIHI et al.,
J. Virol., 67, 2664-2671 (1993)], dans lesquels soit le promoteur P10 (baculovirus dénommé AcSLP33, par exemple), soit le promoteur de la polyédrine (baculovirus dénommé
AcSLP10, par exemple) est inactivé par délétion
Dans le cadre de la poursuite de leurs travaux sur la régulation de l'expression chez les baculovirus, les Inventeurs ont eu l'idée d'étudier l'influence de la séquence codante du gène P10 sur l'expression de celuici.Dans ce but, ils ont réalisé, à partir de baculovirus sauvage AcMNPV, des constructions comprenant le gène rapporteur CAT inséré à l'une des positions +16, +150, ou +230 de la séquence codant pour la P10 (ces positions sont définies par rapport au A (+1) du codon d'initiation
ATG de la P10), et ont étudié l'expression simultanée du gène rapporteur CAT et du gène de la polyédrine, dans les virus recombinants (dénommés respectivement AcCAT+16,
AcCAT+150, et AcCAT+230) obtenus, par rapport au baculovirus sauvage AcMNPV et au baculovirus modifié
AcSLP33 (dans lequel le promoteur P10 est inactivé).
Les virus recombinants AcCAT+16, AcCAT+1SO, et
AcCAT+230, sont schématisés à la Figure 1.
AcCAT+230, sont schématisés à la Figure 1.
Les Inventeurs ont ainsi pu constater que lorsque le gène rapporteur est inséré en +16 (cette insertion s'accompagne de la délétion d'une partie de la séquence codant pour la P10), l'expression du gène rapporteur est faible et celle du gène de la polyédrine augmente très significativement, bien que le promoteur de la P10 soit intact, jusqu'à atteindre un niveau comparable à celui observé dans un virus où le promoteur de la P10 est inactivé, tel que le virus AcSLP33.
En revanche, lorsque le gène rapporteur est inséré plus en aval (+150 ou +230), l'expression dudit gène augmente, et celle de la polyédrine diminue pour revenir à un niveau de base comparable à celui observé dans le baculovirus sauvage AcMNPV.
D'autre part, dans d'autres expérimentations entreprises indépendamment, les Inventeurs ont cherché à exprimer les isoformes a et Y du récepteur humain de l'acide rétinoïque (hRAR) dans des cellules d'insectes, et ont dans ce but construit à partir de baculovirus sauvages AcMNPV, des baculovirus recombinants qui expriment respectivement lesdites isoformes a ou Y sous contrôle du promoteur de la polyédrine. Or, au cours de ces expérimentations ils ont observé une surexpression inattendue du gène P10 dans ces baculovirus.
Cette activation se manifeste par un taux d'ARNm qui est 2 fois supérieur au témoin (constitué par le baculovirus sauvage AcMNPV,) dans le cas du récepteur a, et 5 fois supérieur dans le cas du récepteur : il s'agit donc d'une activation au niveau transcriptionnel.
D'autre part cette activation est observée non seulement lors de la transfection d'une cellule avec un virus double-recombinant, mais également lors de la co transfection d'une cellule avec deux plasmides (l'un exprimant un RAR, et 1' autre portant un domaine RARE localisé dans le gène P10) ; il s'agit donc d'une transactivation.
Les récepteurs de l'acide rétinoïque (RARs) appartiennent à la famille des "récepteurs nucléaires", qui comprend également par exemple chez les vertébrés, les récepteurs de la vitamine D3, ou les récepteurs thyroïdiens. I1 existe également chez les insectes des protéines voisines des RARs ; il s'agit en particulier du récepteur hormonal de l'ecdysone (EcR) et de la protéine
USP de la Drosophile.
USP de la Drosophile.
On sait que les récepteurs nucléaires sont capables d'activer la transcription d'un gène-cible.
Cette activation transcriptionnelle fait intervenir d'une part la liaison de ces récepteurs nucléaires avec leur ligand spécifique, et d'autre part leur fixation à l'ADN, qui implique la reconnaissance de courtes séquences consensus d'ADN généralement situées en amont du gènecible. Les RARs reconnaissent ainsi des séquences consensus qui définissent des portions d'ADN dénommées "éléments de réponse à l'acide rétinoïqueW (éléments
RARE) [GORDMAN et al. Mol. Cell. Biol. 2, 1044-1051 (1982)].
RARE) [GORDMAN et al. Mol. Cell. Biol. 2, 1044-1051 (1982)].
Les Inventeurs ont établi un rapprochement entre les résultats de ces deux expérimentations, et ont procédé à l'analyse de la séquence de la région P10, afin de rechercher l'existence éventuelle de séquences apparentées à celles constituant des sites de fixation pour les récepteurs nucléaires, et en particulier pour les récepteurs rétinoïques.
Or, cette analyse a effectivement révélé l'existence dans le gène de la P10, d'une séquence intragénique GTTGACAGTGTTCA, similaire à une séquence consensus reconnue par les RARs, et constituant donc un élément RARE putatif. Cette séquence est localisée, chez
AcMNPV de type sauvage, en position +61 par rapport au
A(+1) du codon d'initiation ATG de la P10.
AcMNPV de type sauvage, en position +61 par rapport au
A(+1) du codon d'initiation ATG de la P10.
Des expériences complémentaires effectuées par les Inventeurs ont permis de montrer que l'activation du gène P10, ou du gène rapporteur placé sous contrôle du promoteur P10, en présence du produit d'un gène RAR placé sous contrôle du promoteur de la polyédrine, intervient à condition que le domaine de type RARE localisé dans le gène P10 soit présent.
La mise en évidence par les Inventeurs, de cette séquence intragénique de type RARE, et de son rôle effectif dans la régulation de l'expression du gène P10, permettent de proposer de nouveaux moyens de régulation de l'expression de gênes hétérologues sous contrôle des promoteurs polyédrine ou P10 de baculovirus.
La présente Invention concerne ces moyens de régulation, qui comportent plusieurs variantes.
Selon une première variante de l'Invention, des vecteurs d'expression comprenant une séquence de type
RARE à proximité du promoteur P10 permettent d'obtenir, en présence du produit d'un gène RAR, une activation dudit promoteur P10.
RARE à proximité du promoteur P10 permettent d'obtenir, en présence du produit d'un gène RAR, une activation dudit promoteur P10.
Conformément à cette variante, la présente
Invention a pour objet des vecteurs recombinants, utilisables pour réguler l'expression d'un gène sous contrôle du promoteur P10 O de baculovirus, et qui sont constitués par des baculovirus modifiés, comprenant une séquence d'ADN RARE constituant un site de fixation pour un récepteur hormonal du type RAR, placée à proximité du promoteur P10, et une séquence d'ADN codant pour un récepteur hormonal du type RAR placée sous contrôle d'un promoteur autre que le promoteur P10 à proximité duquel est placée la séquence RARE.
Invention a pour objet des vecteurs recombinants, utilisables pour réguler l'expression d'un gène sous contrôle du promoteur P10 O de baculovirus, et qui sont constitués par des baculovirus modifiés, comprenant une séquence d'ADN RARE constituant un site de fixation pour un récepteur hormonal du type RAR, placée à proximité du promoteur P10, et une séquence d'ADN codant pour un récepteur hormonal du type RAR placée sous contrôle d'un promoteur autre que le promoteur P10 à proximité duquel est placée la séquence RARE.
Un promoteur autre que le promoteur P10 à proximité duquel est placée la séquence RARE", peut représenter par exemple un des promoteurs de baculovirus différents du promoteur P10, tels que par exemple le promoteur de la polyédrine, les promoteurs des gènes IE1, lEN, ou des promoteurs synthétiques, etc..., ou également une autre copie du promoteur P10.
Selon un mode de réalisation préféré de cette première variante de l'Invention, ces vecteurs comprennent en outre au moins une séquence codant pour une protéine hétérologue, placée sous contrôle du promoteur P10, ou au moins un site pour l'insertion de ladite séquence.
Des vecteurs conformes à cette première variante de l'invention sont par exemple les virus double-recombinants, obtenus à partir des virus recombinants Ac+150 et Ac+230 décrits ci-dessus, par insertion d'un gène codant pour un des récepteurs RARa ou
RARE de l'acide rétinoïque, sous contrôle du promoteur de la polyédrine.
RARE de l'acide rétinoïque, sous contrôle du promoteur de la polyédrine.
Selon une deuxième variante de l'invention, des vecteurs d'expression dépourvus de la totalité de la séquence codant pour la protéine P10 montrent une activation du promoteur polyédrine similaire à celle observée dans les vecteurs d'expression où le promoteur
P10 est inactivé.
P10 est inactivé.
Conformément à cette deuxième variante, la présente Invention a pour objet des vecteurs recombinants, utilisables pour augmenter l'expression deun gène sous contrôle du promoteur polyédrine de baculovirus, et qui sont constitués par des baculovirus modifiés, comprenant un promoteur polyédrine et un promoteur P10 intacts et fonctionnels, et où le voisinage du promoteur P10 est dépourvu de toute séquence constituant un site de fixation pour un récepteur hormonal du type RAR.
Selon un mode de réalisation préféré des vecteurs conformes à cette deuxième variante de l'Invention, ils sont dépourvus de la totalité de la séquence codant pour P10.
Selon un autre mode de réalisation préféré des vecteurs conformes à cette variante de l'Invention, ils comprennent en outre au moins une séquence, codant pour une protéine hétérologue que 1' on souhaite exprimer, placée sous contrôle du promoteur de la polyédrine, ou au moins un site pour l'insertion de ladite séquence.
Des vecteurs conformes à cette deuxième variante de l'invention peuvent par exemple être obtenus à partir d'un virus recombinant Ac+16.
Selon un autre mode de réalisation préféré des vecteurs conformes à cette deuxième variante de 1' Invention, ils comprennent en outre une séquence d'ADN codant pour un récepteur hormonal du type RAR, laquelle séquence est placée sous contrôle d'un promoteur de baculovirus autre que le promoteur P10.
En effet, les Inventeurs ont observé que lorsqu'un gène, (tel que par exemple le gène rapporteur
CAT) est inséré sous contrôle du promoteur pic, et en l'absence de la séquence RARE on note non seulement une absence d'activation, mais même une inhibition de son expression lors de la co-expression avec les RARs.
CAT) est inséré sous contrôle du promoteur pic, et en l'absence de la séquence RARE on note non seulement une absence d'activation, mais même une inhibition de son expression lors de la co-expression avec les RARs.
Des vecteurs de ce type peuvent être obtenus à partir de Ac+16 par insertion d'un gène codant pour un des récepteurs RARa ou RARY de l'acide rétinoïque, sous contrôle du promoteur de la polyédrine;
Des vecteurs conformes à l'Invention, peuvent constituer des vecteurs de transfert ou des vecteurs d'expression. Ils peuvent être obtenus à partir de n'importe quel baculovirus ou construction (telle qu'un vecteur de transfert) dérivée de baculovirus, à condition que ledit baculovirus ou ladite construction comprenne les séquences constituant le promoteur de la P10, telles que définies ci-dessus.
Des vecteurs conformes à l'Invention, peuvent constituer des vecteurs de transfert ou des vecteurs d'expression. Ils peuvent être obtenus à partir de n'importe quel baculovirus ou construction (telle qu'un vecteur de transfert) dérivée de baculovirus, à condition que ledit baculovirus ou ladite construction comprenne les séquences constituant le promoteur de la P10, telles que définies ci-dessus.
La présente invention a également pour objet un procédé pour réguler l'expression d'un gène placé sous contrôle du promoteur P10 de baculovirus, lequel procédé est caractérisé en ce que l'on procède à l'expression dudit gène en présence du produit de traduction d'un gène codant pour un récepteur hormonal du type RAR.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré d'un procédé conforme à l'Invention, l'expression du gène placé sous contrôle du promoteur P10 0 est effectuée en présence dans la même cellule, d'un gène codant pour un récepteur hormonal du type RAR.
Le promoteur P10 et le gène codant pour un récepteur hormonal du type RAR peuvent être portés par une même molécule d'ADN, ou bien par deux molécules d'ADN différentes.
Selon un autre mode de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, l'expression du gène placé sous contrôle du promoteur P10 0 est effectuée en présence d'une séquence constituant un site. de fixation d'un récepteur hormonal du type RAR, située à proximité du promoteur P10.
L'analyse de séquence du gène P10 chez les baculovirus Choristoneura fumiferana NPV et Bombyx mori
NPV révèle la conservation du motif RARE. Ces baculovirus peuvent donc, au même titre que AcMNPV, être utilisés pour la mise en oeuvre de la présente Invention.
NPV révèle la conservation du motif RARE. Ces baculovirus peuvent donc, au même titre que AcMNPV, être utilisés pour la mise en oeuvre de la présente Invention.
Il existe chez les insectes des protéines voisines des RARs des vertébrés ; il s'agit en particulier du récepteur hormonal de l'ecdysone (EcR) et de la protéine USP de la Drosophile, dont les gènes pourraient également être utilisés pour la transactivation de la P10 conformément à la présente
Invention.
Invention.
La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de construction et de mise en oeuvre de vecteurs d'expression conformes à l'invention.
Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Les protocoles utilisés dans les exemples qui suivent font appel à des techniques classiques du génie génétique, telles que celles décrites par SAMBROOK et al.lMolecular cloning . A Laboratory Manual ; Second
Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989], ou par
O'REILLY et al. [Baculovirus Expression Vectors : A
Laboratory Manual , Freeman and Cie, New York, (1992)3 pour la manipulation de l'ADN de baculovirus. Les conditions particulières à chaque expérimentation sont, s'il y a lieu, précisées dans l'exemple correspondant.
Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989], ou par
O'REILLY et al. [Baculovirus Expression Vectors : A
Laboratory Manual , Freeman and Cie, New York, (1992)3 pour la manipulation de l'ADN de baculovirus. Les conditions particulières à chaque expérimentation sont, s'il y a lieu, précisées dans l'exemple correspondant.
Ix-Ipra 1 1 > An. plasaidiques et vecteurs de transfert
Une série de trois vecteurs de transfert dénommés respectivement pMH16, pMH1SO, et pMH230, a été construite, afin d'introduire le gène bactérien codant pour la CAT (Chloramphénicol Acétyl Transférase) dans la séquence codant pour la P10, aux positions +16, +150, et +230.
Une série de trois vecteurs de transfert dénommés respectivement pMH16, pMH1SO, et pMH230, a été construite, afin d'introduire le gène bactérien codant pour la CAT (Chloramphénicol Acétyl Transférase) dans la séquence codant pour la P10, aux positions +16, +150, et +230.
La Figure 2 représente une carte de la région
P10, montrant les positions concernées.
P10, montrant les positions concernées.
Dans ces trois constructions, le codon ATG de la P10 a été muté en AGC, et un site de restriction BnrII a été créé (séquence ATG TCA mutée en AGC TGA).
- pMH16
Le plasmide pMH16 est dérivé du vecteur de transfert pGm16. Le vecteur pGml6 contient un insert obtenu à partir du fragment EcoRI-P du baculovirus GmNNPV, muté comme indiqué ci-dessus au niveau du site d'initiation de la traduction de P10, et où la séquence comprise entre les bases +16 et +265 du gène P10, a été délétée, et remplacée par un lieur BglII.
Le plasmide pMH16 est dérivé du vecteur de transfert pGm16. Le vecteur pGml6 contient un insert obtenu à partir du fragment EcoRI-P du baculovirus GmNNPV, muté comme indiqué ci-dessus au niveau du site d'initiation de la traduction de P10, et où la séquence comprise entre les bases +16 et +265 du gène P10, a été délétée, et remplacée par un lieur BglII.
Pour obtenir pNH16, un fragment HindIII- de 1900 pb, isolé à partir du fragment HindIII-Q de
AcMNPV, qui contient les séquences hr5 et le gène p26, a été introduit entre les sites HindIII et NsiI de pGm16.
AcMNPV, qui contient les séquences hr5 et le gène p26, a été introduit entre les sites HindIII et NsiI de pGm16.
Le fragment BglII-BanI de 790 pb obtenu à partir du plasmide pBLCAT2 (LUCKOW and SCHUTZ, Nucleic
Acid Res., 15, (13) 5940 (1987), et comprenant la séquence codant pour la CAT, a ensuite été introduit dans le plasmide, au site BalII.
Acid Res., 15, (13) 5940 (1987), et comprenant la séquence codant pour la CAT, a ensuite été introduit dans le plasmide, au site BalII.
- pMH150 et DMH230 .
Les plasmides pMH150 et pMH230 dérivent d'une même construction, qui a été réalisée en insérant un fragment NsiI-EcoRI de 1900 pb portant les mutations indiquée ci-dessus du fragment EcoRI-P de AcMNPV, entre les sites ESiI et KDnI du fragment HindIII-Q de AcMNPV, préalablement cloné dans le vecteur pUC18.
Pour obtenir le plasmide pMH150, le fragment II-I de pBLCAT2 comprenant la séquence codant pour la CAT, a été introduit au site AglII situé en position +150 dans la séquence codant pour la P10. Pour obtenir le plasmide pMH230, ledit fragment BglII-BanI a été introduit au site HindIII situé en position +230 dans la séquence codant pour la P10.
La Figure 3 représente schématiquement les inserts des plasmides pMH16, pMH150, et pNH230.
- Plasmide pPH-RARa et pPH-RARt
Un fragment KpnI-StuI de 1518 pb, ou un fragment NcoI-SmaI de 1564 pb, comprenant la totalité des séquences codant respectivement pour les éléments hRARa [PETROVITCH et al. Nature, vol. 330, p. 444-450 (1987)] et hRARγ [BENBROOK et al., Nature, vol. 333, p. 669-672 (1988)] ont été introduits en aval du promoteur de la polyédrine, dans le site SmaI du plasmide pGmAc34T [DAVRINCHE et al. Biochem. Biophys. Res. Com., vol 195, p. 469-477].
Un fragment KpnI-StuI de 1518 pb, ou un fragment NcoI-SmaI de 1564 pb, comprenant la totalité des séquences codant respectivement pour les éléments hRARa [PETROVITCH et al. Nature, vol. 330, p. 444-450 (1987)] et hRARγ [BENBROOK et al., Nature, vol. 333, p. 669-672 (1988)] ont été introduits en aval du promoteur de la polyédrine, dans le site SmaI du plasmide pGmAc34T [DAVRINCHE et al. Biochem. Biophys. Res. Com., vol 195, p. 469-477].
- Plasmides pRARa(P10) et pRARy(P10)
De la même manière, les séquences codant pour les éléments hRAR ont été introduites au site aglII du plasmide pMH16.
De la même manière, les séquences codant pour les éléments hRAR ont été introduites au site aglII du plasmide pMH16.
2) Obtention de baculovirus reccibinants
Pour chacun des vecteurs de transfert décrits ci-dessus 4.106 cellules Sf9 sont co-transfectées par lipofection (DOTAP, BOEHRINGER MANNHEIM), avec 10Rg de vecteur, et 1CLg d'ADN viral.
Pour chacun des vecteurs de transfert décrits ci-dessus 4.106 cellules Sf9 sont co-transfectées par lipofection (DOTAP, BOEHRINGER MANNHEIM), avec 10Rg de vecteur, et 1CLg d'ADN viral.
Les recombinaisons au site de la polyédrine sont effectuées en co-transfectant le plasmide concerné avec de 1'ADN de virus AcMNPV sauvage, tandis que les recombinaisons au site P10 sont effectuées en cotransfectant le plasmide concerné avec 1'ADN d'un baculovirus modifié (AcSLP10) dans lequel le promoteur et le gène de la polyédrine ont été excisés, et la séquence codant pour la polyédrine replacée sous contrôle du promoteur P10.
Deux clones de chaque recombinant ont été purifiés indépendamment.
La Figure 4 représente schématiquement les différents virus recombinants obtenus. Les promoteurs (P10 et polyédrine) sont représentés par un rectangle de couleur noire unie, la séquence P10 est représentée par un rectangle de couleur blanche unie, la séquence codant pour la polyédrine est représentée par un rectangle en pointillés serrés(1), les séquences codant pour les RARs sont représentées par un rectangle en pointillés espacés (xB), la séquence codant pour la CAT est représentée par un rectangle hachuré.
La Figure 4A représente, de haut en bas
- le virus AcMNPV sauvage
- un virus dépourvu du promoteur et du gène polyédrine (AcD3)
- un virus obtenu après recombinaison d'un plasmide pPH-RAR avec l'ADN de virus sauvage (AcRARP10);
- un virus obtenu après recombinaison d'un plasmide pPH-RAR avec 1'ADN de virus dépourvu du promoteur et du gène P10 (AcRARAP10);
- un virus obtenu après recombinaison d'un plasmide pRAR(P10) avec 1'ADN de virus dépourvu du promoteur polyédrine (AcSLP10RAR);
- un virus obtenu après recombinaison d'un plasmide pRAR(P10) avec 1'ADN de virus sauvage (AcPHRAR).
- le virus AcMNPV sauvage
- un virus dépourvu du promoteur et du gène polyédrine (AcD3)
- un virus obtenu après recombinaison d'un plasmide pPH-RAR avec l'ADN de virus sauvage (AcRARP10);
- un virus obtenu après recombinaison d'un plasmide pPH-RAR avec 1'ADN de virus dépourvu du promoteur et du gène P10 (AcRARAP10);
- un virus obtenu après recombinaison d'un plasmide pRAR(P10) avec 1'ADN de virus dépourvu du promoteur polyédrine (AcSLP10RAR);
- un virus obtenu après recombinaison d'un plasmide pRAR(P10) avec 1'ADN de virus sauvage (AcPHRAR).
La Figure 4B représente schématiquement les recombinants portant le gène CAT à différentes positions à l'intérieur de la séquence P10 (+16, +150 et +230), et le gène RARa ou Y au locus polyédrine
- un virus obtenu après recombinaison d'un des plasmides pMH16, pMH150, ou pMH230 avec 1'ADN de virus sauvage (AcP10CAT) ;
- un virus obtenu après recombinaison d'un plasmide pPH-RAR avec 1 'ADN de virus AcPlOCAT (AcRARCAT);
=-PZa 2 : IXPRISSION Dl P10 DANS LES
RECOMBINANTS RAR.
- un virus obtenu après recombinaison d'un des plasmides pMH16, pMH150, ou pMH230 avec 1'ADN de virus sauvage (AcP10CAT) ;
- un virus obtenu après recombinaison d'un plasmide pPH-RAR avec 1 'ADN de virus AcPlOCAT (AcRARCAT);
=-PZa 2 : IXPRISSION Dl P10 DANS LES
RECOMBINANTS RAR.
Les cellules (Spodoptera frugiperda Sf9) sont maintenues à 28 C dans du milieu TC100 (GIBCO/BRL) supplémenté avec 5% de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur.
Les cellules sont infectées par une suspension virale (AcMNPV sauvage, ou recombinant à tester) avec une multiplicité d'infection de 10 PFU (Plage Forming Units) par cellule. Après une heure d'adsorption, l'inoculum viral est remplacé par un milieu de culture frais.
Les cellules respectivement infectées avec
AcNNPV, AcRARaP10, AcRARtP10, AcRARoAP10, AcRAR')"10, ont été récoltées 48 heures après infection, lavées dans du tampon PBS froid, puis re-suspendues dans du tampon d'échantillon et portées à ébullition pendant 5 mn. La même préparation est effectuée à partir de cellules noninfectées.
AcNNPV, AcRARaP10, AcRARtP10, AcRARoAP10, AcRAR')"10, ont été récoltées 48 heures après infection, lavées dans du tampon PBS froid, puis re-suspendues dans du tampon d'échantillon et portées à ébullition pendant 5 mn. La même préparation est effectuée à partir de cellules noninfectées.
Les protéines totales de chaque préparation sont analysées par SDS-PAGE, sur un gel de polyacrylamide à 12%. Les gels sont colorés avec du bleu de Coomassie.
La comparaison des profils électrophorétiques des protéines totales de cellules infectées avec les recombinants RAR (AcRARoP10 et AcRARyP10), avec le profil électrophorétique de protéines totales des cellules infectées avec le baculovirus de type sauvage AcNNPV, montre qu'une protéine d'un poids moléculaire apparent de 10 kDa est surproduite dans les cellules infectées avec les recombinants RAR. Cette surproduction est particulièrement importante dans les cellules infectées avec le recombinant AcRARyP10 . La bande de poids moléculaire apparent 10 kDa n'apparaît pas dans le profil des protéines totales de cellules infectées avec des recombinants AcRARoSP10 et AcRAR}iP10.
Pour vérifier si les observations ci-dessus reflètent une augmentation de la transcription du gène
P10, les ARN cytoplasmiques totaux ont été isolés, à partir des cellules infectées, 48 h et 72 h après l'infection, et analysées par hybridation "dot-blot", en utilisant des sondes d'ARN marquées au P32, complémentaires des séquences P10 et 39K, et obtenues en utilisant le kit PROMEGA RIBOPROBE (PROMEGA, France).
P10, les ARN cytoplasmiques totaux ont été isolés, à partir des cellules infectées, 48 h et 72 h après l'infection, et analysées par hybridation "dot-blot", en utilisant des sondes d'ARN marquées au P32, complémentaires des séquences P10 et 39K, et obtenues en utilisant le kit PROMEGA RIBOPROBE (PROMEGA, France).
Le comptage est fait dans un compteur à scintillation.
Les résultats sont illustrés par le tableau I ci-dessous, qui se réfère aux vecteurs représentés sur les figures 4A et 4B.
TABLEAU I
<tb> <SEP> cpm
<tb> Virus <SEP> P10 <SEP> 39K
<tb> <SEP> 48 <SEP> h <SEP> 72 <SEP> h <SEP> 48 <SEP> h <SEP> 72 <SEP> h
<tb> Aucun <SEP> 370 <SEP> + <SEP> 10 <SEP> 1010 <SEP> + <SEP> 40 <SEP> 390 <SEP> + <SEP> 12 <SEP> 530 <SEP> + <SEP> 25
<tb> AcSNPV <SEP> 32900 <SEP> + <SEP> 580 <SEP> 26290 <SEP> + <SEP> 450 <SEP> 7390 <SEP> + <SEP> 370 <SEP> 6050 <SEP> + <SEP> 310
<tb> AcD3 <SEP> 31450 <SEP> + <SEP> 800 <SEP> 37970 <SEP> + <SEP> 720 <SEP> 7580 <SEP> + <SEP> 420 <SEP> 8520 <SEP> + <SEP> 470
<tb> RARol <SEP> 73920 <SEP> + <SEP> 1300 <SEP> 96740 <SEP> + <SEP> 880 <SEP> 8840 <SEP> + <SEP> 450 <SEP> 11980 <SEP> + <SEP> 630
<tb> RARa2 <SEP> 79530 <SEP> + <SEP> 1500 <SEP> 93120 <SEP> + <SEP> 950 <SEP> 9810 <SEP> + <SEP> 600 <SEP> 11500 <SEP> + <SEP> 600
<tb> RAR4P10 <SEP> 10950 <SEP> + <SEP> 550 <SEP> 11200 <SEP> # <SEP> <SEP> 600 <SEP> 9550 <SEP> + <SEP> 720 <SEP> 5770 <SEP> + <SEP> 220
<tb> RM1 <SEP> 98290 <SEP> + <SEP> 1100 <SEP> 146230 <SEP> + <SEP> 1200 <SEP> 5300 <SEP> + <SEP> 350 <SEP> 5820 <SEP> + <SEP> 280
<tb> RARγ2 <SEP> <SEP> 138090 <SEP> + <SEP> 1450 <SEP> 142000 <SEP> + <SEP> 1380 <SEP> 6080 <SEP> + <SEP> 290 <SEP> 6400 <SEP> + <SEP> 300
<tb>
L'examen des valeurs moyennes mesurées 48 h après infection révèle que la quantité d'ARNm de P10 produite par les recombinants AcRARaP10 et AcRARtP10 est respectivement, deux fois et quatre fois plus élevée, que celle observée avec le baculovirus sauvage, ou avec le baculovirus AcD3 dépourvu du promoteur de la polyédrine.
<tb> Virus <SEP> P10 <SEP> 39K
<tb> <SEP> 48 <SEP> h <SEP> 72 <SEP> h <SEP> 48 <SEP> h <SEP> 72 <SEP> h
<tb> Aucun <SEP> 370 <SEP> + <SEP> 10 <SEP> 1010 <SEP> + <SEP> 40 <SEP> 390 <SEP> + <SEP> 12 <SEP> 530 <SEP> + <SEP> 25
<tb> AcSNPV <SEP> 32900 <SEP> + <SEP> 580 <SEP> 26290 <SEP> + <SEP> 450 <SEP> 7390 <SEP> + <SEP> 370 <SEP> 6050 <SEP> + <SEP> 310
<tb> AcD3 <SEP> 31450 <SEP> + <SEP> 800 <SEP> 37970 <SEP> + <SEP> 720 <SEP> 7580 <SEP> + <SEP> 420 <SEP> 8520 <SEP> + <SEP> 470
<tb> RARol <SEP> 73920 <SEP> + <SEP> 1300 <SEP> 96740 <SEP> + <SEP> 880 <SEP> 8840 <SEP> + <SEP> 450 <SEP> 11980 <SEP> + <SEP> 630
<tb> RARa2 <SEP> 79530 <SEP> + <SEP> 1500 <SEP> 93120 <SEP> + <SEP> 950 <SEP> 9810 <SEP> + <SEP> 600 <SEP> 11500 <SEP> + <SEP> 600
<tb> RAR4P10 <SEP> 10950 <SEP> + <SEP> 550 <SEP> 11200 <SEP> # <SEP> <SEP> 600 <SEP> 9550 <SEP> + <SEP> 720 <SEP> 5770 <SEP> + <SEP> 220
<tb> RM1 <SEP> 98290 <SEP> + <SEP> 1100 <SEP> 146230 <SEP> + <SEP> 1200 <SEP> 5300 <SEP> + <SEP> 350 <SEP> 5820 <SEP> + <SEP> 280
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<tb>
L'examen des valeurs moyennes mesurées 48 h après infection révèle que la quantité d'ARNm de P10 produite par les recombinants AcRARaP10 et AcRARtP10 est respectivement, deux fois et quatre fois plus élevée, que celle observée avec le baculovirus sauvage, ou avec le baculovirus AcD3 dépourvu du promoteur de la polyédrine.
Les résultats obtenus 72 heures après l'infection sont très similaires à ceux observés 48 heures après infection. Dans le même temps on n'observe pas de différence significative entre les différents vecteurs, au niveau de la production de L'ARYEN de 39K, mesurée à titre de contrôle interne.
EXEMPLE 3 : =XPRS8SION DU GENE RAPPORTEUR CLT SOUS CoWTROLS W PRCOCTXsR P10
Les baculovirus AcPlOCAT16, AcP10CAT150, et AcPlOCAT230 contiennent respectivement le gène rapporteur
CAT en position +16, +150 et +230 dans la séquence codant pour la P10, et le gène codant pour la polyédrine sous contrôle de son propre promoteur ; les baculovirus
AcRARaCAT16, AcRARCAT16, AcRARα;CAT150, AcRARtCAT150,
AcRARaCAT230, et AcRAR"CAT230 contiennent respectivement le gène rapporteur CAT en position +16, +150 et +230 dans la séquence codant pour la P10, et, en outre, le gène codant pour un récepteur a ou y de l'acide rétinoïque sous contrôle du promoteur de la polyédrine. Ces différents vecteurs sont obtenus comme décrit à l'exemple 1 cidessus.
Les baculovirus AcPlOCAT16, AcP10CAT150, et AcPlOCAT230 contiennent respectivement le gène rapporteur
CAT en position +16, +150 et +230 dans la séquence codant pour la P10, et le gène codant pour la polyédrine sous contrôle de son propre promoteur ; les baculovirus
AcRARaCAT16, AcRARCAT16, AcRARα;CAT150, AcRARtCAT150,
AcRARaCAT230, et AcRAR"CAT230 contiennent respectivement le gène rapporteur CAT en position +16, +150 et +230 dans la séquence codant pour la P10, et, en outre, le gène codant pour un récepteur a ou y de l'acide rétinoïque sous contrôle du promoteur de la polyédrine. Ces différents vecteurs sont obtenus comme décrit à l'exemple 1 cidessus.
La présence de la protéine CAT ainsi que l'activité CAT sont recherchées sur les extraits cellulaires préparés à partir des cellules Sf9 infectées par ces différents vecteurs et récoltées 48 heures après infection.
L'expression du gène CAT est déterminée après transfert immunoélectrophorètique : les protéines totales sont analysées par SDS-PAGE comme décrit à l'exemple 1 ci-dessus, et transférées sur membrane de nitrocellulose.
La CAT est détectée avec des anticorps anti-CAT (5 PRIME > 3 PRIME INC.), ou par mesure de l'activité CAT, selon la méthode classique décrite par GORNAN et al.
[Mol. Cell. Biol. n 2, 1044-1051 (1982). Les formes acétylées du substrat (Ac-CM) sont séparées du substrat natif (CM), par chromatographie ascendante sur couche mince de silice.
Dans le cas des cellules infectées par les vecteurs de type +150 et +230, et co-exprimant un gène codant pour un récepteur a ou γ de l'acide rétinoïque.on constate en immuntransfert, pour les virus AcRARaCATîSO, AcRARtCAT150, AcRARaCAT230, et AcRARγCAT230, une très nette augmentation du signal correspondant à la CAT par rapport aux virus AcPlOCAT150 et AcPlOCAT230. Les résultats observés sont confirmés par la mesure de l'activité CAT.
Claims (10)
1) Vecteur utilisable pour réguler l'expression d'un gène sous contrôle du promoteur P10 de baculovirus, caractérisé en ce qu'il est constitué par un baculovirus modifié comprenant : a) une séquence d' ADN
RARE, constituant un site de fixation pour un récepteur hormonal du type RAR, laquelle séquence est placée en aval et à proximité du promoteur P10, et b) une séquence d'ADN codant pour un récepteur hormonal du type RAR, laquelle séquence est placée sous contrôle d'un promoteur de baculovirus autre que le promoteur P10 O à proximité duquel est placée ladite séquence RARE.
2) Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une séquence codant pour une protéine hétérologue, placée sous contrôle du promoteur P10, ou au moins un site pour l'insertion de ladite séquence.
3) Vecteur recombinant, utilisable pour augmenter l'expression d'un gène sous contrôle du promoteur polyédrine de baculovirus, caractérisé en ce qu'il est constitué par un baculovirus modifié, comprenant la totalité des séquences constituant le promoteur de la polyédrine, et la totalité des séquences constituant le promoteur du polypeptide P10, et dont le voisinage du promoteur P10 est dépourvu de toute séquence constituant un site de fixation pour un récepteur hormonal du type RAR.
4) Vecteur selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est dépourvu de la totalité de la séquence codante du gène de la P10.
5) Vecteur selon une quelconque des revendications 3 ou 4 caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une séquence, codant pour une protéine hétérologue que l'on souhaite exprimer, placée sous contrôle du promoteur de la polyédrine, ou au moins un site pour l'insertion de ladite séquence.
6) Vecteur selon une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une séquence d'ADN codant pour un récepteur hormonal du type RAR, placée sous contrôle d'un promoteur de baculovirus autre que le promoteur P10.
7) Procédé pour réguler l'expression d'un gène placé sous contrôle du promoteur P10 de baculovirus, caractérisé en ce que l'on exprime ledit gène en présence du produit de traduction d'un gène codant pour un récepteur hormonal du type RAR.
8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'expression du gène placé sous contrôle du promoteur P10 est effectuée en présence, dans la même cellule, d'un gène codant pour un récepteur hormonal du type RAR.
9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le gène codant pour un récepteur hormonal du type RAR, et le promoteur P10 sont portés par une même molécule d'ADN.
10) Procédé selon une quelconque des revendications 7 à 9 caractérisé en ce que l'expression du gène placé sous contrôle du promoteur P10 est effectuée en présence d'une séquence constituant un site de fixation d'un récepteur hormonal du type RAR, située à proximité du promoteur P10.
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| FR9503412A FR2732035B1 (fr) | 1995-03-23 | 1995-03-23 | Procede de regulation de l'expression d'un gene dans un baculovirus, par un site de fixation d'un recepteur de l'acide retinoique, et vecteur pour la mise en oeuvre du dit procede |
| US08/913,617 US5939285A (en) | 1995-03-23 | 1996-03-22 | Method for regulating the expression of a gene in a baculovirus using a retinoic acid receptor binding site and vector therefor |
| AU52779/96A AU701730B2 (en) | 1995-03-23 | 1996-03-22 | Method for regulating the expression of a gene in a baculovirus using retinoic acid receptor binding site, and vector for carrying out the said method |
| CA002216597A CA2216597A1 (fr) | 1995-03-23 | 1996-03-22 | Procede de regulation de l'expression d'un gene dans un baculovirus, par un site de fixation d'un recepteur de l'acide retinoique, et vecteur pour la mise en oeuvre dudit procede |
| HU9801202A HUP9801202A3 (en) | 1995-03-23 | 1996-03-22 | Method for regulating the expression of a gene in a baculovirus using a retinoic acid receptor binding site, and vector therefor |
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| EP96909189A EP0815226A1 (fr) | 1995-03-23 | 1996-03-22 | Procede de regulation de l'expression d'un gene dans un baculovirus, par un site de fixation d'un recepteur de l'acide retinoique, et vecteur pour la mise en uvre dudit procede |
| PCT/FR1996/000437 WO1996029400A1 (fr) | 1995-03-23 | 1996-03-22 | Procede de regulation de l'expression d'un gene dans un baculovirus, par un site de fixation d'un recepteur de l'acide retinoique, et vecteur pour la mise en ×uvre dudit procede |
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