WO2002026943A2 - Production de particules pseudovirales de vhc en cellules d'insectes - Google Patents

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WO2002026943A2
WO2002026943A2 PCT/FR2001/003012 FR0103012W WO0226943A2 WO 2002026943 A2 WO2002026943 A2 WO 2002026943A2 FR 0103012 W FR0103012 W FR 0103012W WO 0226943 A2 WO0226943 A2 WO 0226943A2
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transcriptional control
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Martine Cerutti
Christel Girard
Gérard Devauchelle
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Institut National De La Recherche Agronomique (Inra)
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24223—Virus like particles [VLP]

Definitions

  • the invention relates to the production of hepatitis C virus (HCV) pseudoviral particles.
  • HCV hepatitis C virus
  • HCV belongs to the family of Flaviviridae; its genome consists of a single-stranded RNA of positive polarity of approximately 9.6 b, successively comprising: a 5 'non-coding region (5'NCR) of approximately 340 nucleotides, a single open reading frame coding for a polyprotein of approximately 3000 amino acids, and a 3 'non-coding region (3' NCR) of 200 to 240 nucleotides.
  • 5'NCR 5 'non-coding region
  • 3' NCR 3 'non-coding region
  • the proteins of structure C (capsid protein), El, and E2 (envelope proteins), are coded by the 5 ′ portion of the open reading frame; the rest of the open reading frame encodes the protein p7, which is a hydrophobic peptide of unknown function, and the non-structural proteins NS2 to NS5B, which are involved in genome replication and maturation of the polyprotein.
  • the 5 'non-coding region represents the most conserved sequence in the HCV genome; its length varies between 341 and 349 nucleotides depending on the genotype. It can fold to form a complex secondary structure that includes four domains: I (nucleotides 1-42), II (nucleotides 47-67), III (nucleotides 125-323), and IV (nucleotides 331-354), as well as 'a pseudo-node (nucleotides 305-311 and 325-331) and a helical structure [RIJNBRAND and LEMON, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 242, 85-116, (2000)].
  • AUG codons 2 of which, located at positions 85 and 215, are very conserved between different HCV isolates, and also with pestiviruses.
  • This structure functions as an internal ribosome entry site (IRES), and it has been observed [TSUKIYAMA-KOHARA et al. f J. Virol., 66, 1476-1483, (1992); WANG et al. , J. Virol., 67, 3338-3344, (1993); REYNOLDS et al. , EMBO J., 14, 6010-6020, (1996)] that it made it possible to initiate the translation of the polyprotein in several systems in vitro and in vivo.
  • IVS internal ribosome entry site
  • HCV human immunodeficiency virus
  • HCV the baculovirus / insect cell system was used to study the expression of various structural proteins [MATSUURA et al. , J. Virol., 66, 1425-1431, (1992); Virology, 205, 141-150, (1994); HSU et al. , Hepatology 17, 763-771, (1993); LANDFORD et al. , Virology, 197, 225-235, (1993); HUSSY et al. , Virus Res., 45, 45-57, (1996); J. Hepatol., 26, 1179-1186, (1997)], or non-structural [HIROWATARI et al. , Arch.
  • Pseudoviral particles recognized by anti-HCV antibodies are located in infected cells, where they are enclosed in intracytoplasmic vesicles; they have a polymorphic appearance, a variable diameter from 40 nm to 60 nm, and after purification from the lysates of infected cells, a density of 1.14 g / cm 3 to 1.18 g / cm 3 . No secretion of pseudoviral particles into the culture medium was observed. BAUMERT et al. indicate that it is possible, but improbable, that the portion of 5'NCR contained in these constructions plays a role in the efficiency of particle assembly and that it is more likely that it depends on the isolate of HCV from which the expressed cDNA was obtained.
  • the object of the present invention is to provide reproducible means for the production of HCV pseudoviral particles in a baculovirus / insect cell system.
  • the Inventors have undertook to research the regions of the HCV genome potentially involved not only in the expression of viral proteins, but also in their assembly into pseudoviral particles.
  • the inventors have constructed recombinant baculoviruses carrying HCV cDNA inserts comprising the sequence encoding the part structure of the polyprotein, whether or not preceded by the 5 'non-coding region.
  • the inventors then co-expressed in the same cell, 2 different constructs: one comprising the sequence coding for the structural proteins, and devoid of the sequence of the 5 'non-coding region, and which can therefore be translated into proteins of HCV structure, and the other comprising the sequence encoding structural proteins preceded by the sequence of the 5 'non-coding region, and therefore cannot be translated into HCV structural proteins.
  • pseudoviral particles of HCV are obtained by expressing, on separate transcripts, in the same insect cell, the 5 ′ non-coding region and the sequence coding for the structural proteins.
  • the subject of the present invention is thus a process for obtaining pseudoviral particles of HCV, characterized in that it comprises simultaneous expression, in the same cell of insect, and in the form of separate transcripts, of the following nucleotide sequences:
  • non-coding sequence chosen from: a) the 5 'non-coding region of an HCV; a ') a sequence derived from the sequence a) by elimination of one or more of the translation initiation codons present in said sequence; a '') a sequence consisting of at least a portion of the sequence a) above; a '' ') a sequence consisting of at least a portion of the sequence a') above;
  • pseudoviral particles of HCV are obtained by expressing, on the same transcript, the 5 ′ non-coding region of an HCV or a portion thereof. of the latter, previously modified by elimination of the translation initiation codons.
  • the subject of the present invention is a process for obtaining pseudoviral particles of HCV, characterized in that it comprises the expression, in an insect cell, of a nucleotide sequence comprising, upstream downstream: a non-coding sequence chosen from a sequence (a ') or (a' '') as defined above;
  • the present invention can be implemented for obtaining pseudoviral particles of HCV of different genotypes, as well as for obtaining pseudoviral particles associating sequences derived from
  • HCV of different genotypes for example a 5 'non- coding and a structural sequence from different genotypes.
  • the 5 ′ non-coding regions of HCV are in fact very conserved from one genotype to another and all contain AUG codons capable of interfering with the translation of the polyprotein.
  • the elimination of a translation initiation codon can be carried out in particular by deletion of all or part of said codon, and possibly of one or a few adjacent nucleotides, by insertion into said codon or of one or more nucleotides , or by replacing said codon with a different codon.
  • the sequence (b) codes at least for the proteins C, E1, E2 and p7 of an HCV. According to a preferred arrangement of this embodiment, said sequence (b) also codes for part of the non-structural protein NS2.
  • the expression in the insect cell is carried out using 2 separate expression cassettes, one comprising a sequence (a), (a ' ), (a '') or (a '' ') under transcriptional control of a first functional promoter in said cell, the second comprising a sequence (b) under transcriptional control of a second promoter functional in said cell, which can be the same as or different from the first.
  • 2 cassettes can be carried by 2 different expression vectors or by the same vector.
  • the expression in the insect cell is carried out using a single expression cassette, comprising a sequence (a ') or (a''') followed by a sequence (b) placed under transcriptional control of a functional promoter in said cell.
  • Expression vectors which can be used for implementing the present invention are in particular recombinant baculoviruses, allowing the expression of one or more exogenous sequence (s) under the control of one or more baculovirus promoter (s).
  • a recombinant baculovirus comprising a sequence (a ') or (a''') followed by a sequence (b) placed under transcriptional control of a promoter of said baculovirus; or a recombinant baculovirus comprising a sequence (a), (a '), (a'') or (a''') under transcriptional control of a first promoter of said baculovirus and a sequence (b) under transcriptional control of a second promoter of said baculovirus identical to or different from the first, or alternatively;
  • a first recombinant baculovirus comprising a sequence (a), (a '), (a'') or (a''') under transcriptional control of a promoter of said baculovirus, and a second recombinant baculovirus comprising a sequence (b) under transcriptional control of a promoter of said baculovirus; culturing the infected cell and harvesting the pseudoviral particles of HCV at the end of said culture, from said cell or from its culture medium.
  • the pseudoviral particles are harvested after at least 48 hours of culture, preferably after 72 hours of culture.
  • HCV HCV from the infected cell
  • one proceeds to the lysis of said cell, and to the purification of the pseudoviral particles from the lysate obtained.
  • the identification of the fraction (s) containing the pseudoviral particles can easily be carried out using anti-HCV antibodies.
  • the lysate can be treated with a detergent, advantageously a nonionic detergent, at a concentration preferably between 0.5 and 1%, in order to separate the pseudoviral particles from the membranes which are associated with them.
  • a detergent advantageously a nonionic detergent
  • the pseudoviral particles of HCV can be recovered after centrifugation at equilibrium on a sucrose gradient, in a fraction whose density is approximately 1.15 to 1.18 g / ml; these particles include, in addition to the capsid protein, the envelope proteins E1 and E2.
  • the pseudoviral particles of HCV can be recovered after centrifugation at equilibrium on a sucrose gradient, in a fraction whose density is from about 1.23 to 1.26 g / ml; these particles are devoid of the envelope proteins E1 and E2.
  • Their density is similar to that of the HCV nucleocapsid which has been estimated at 1.25 g / ml [MIYAMOTO et al. , J. Gen. Virol., 73, 715-718, (1992)], after treatment with NP40 of viral particles extracted from plasma samples from infected patients.
  • the pseudoviral particles of HCV from the culture medium; since it is not necessary to carry out the prior lysis of the cells, the extraction and the purification of the pseudoviral particles are facilitated, and can be carried out under less drastic conditions, ensuring better preservation of their morphological characteristics , biochemical and antigenic.
  • the collection of pseudoviral particles from the culture medium since it is not necessary to carry out the prior lysis of the cells, the extraction and the purification of the pseudoviral particles are facilitated, and can be carried out under less drastic conditions, ensuring better preservation of their morphological characteristics , biochemical and antigenic.
  • the said medium is collected, and the pseudoviral particles are purified from it.
  • the culture medium can be collected by any means known in themselves, making it possible to separate said medium from the infected cells, for example by centrifugation or filtration.
  • the culture medium thus collected can be treated with a detergent, as indicated above for the purification from the lysate.
  • the purification of the pseudoviral particles is then also carried out by conventional methods, similar to those mentioned above.
  • the identification of the fraction (s) containing the pseudoviral particles can be carried out using anti-HCV antibodies as indicated above.
  • those obtained from the culture medium can be recovered after centrifugation at equilibrium on a sucrose gradient, in the form of particles having the envelope proteins El and E2, and in a fraction in a fraction whose density is approximately 1.15 to 1.18 g / ml when the medium has not been treated with a detergent, and in the form of particles devoid of the envelope proteins E1 and E2, and in a fraction whose density is approximately 1.23 to 1.26 g / ml when the medium has been treated with a detergent .
  • HCV pseudoviral particles lacking the envelope proteins E1 and E2 can also be obtained by treating pseudoviral particles containing these proteins with a nonionic detergent; in this case, said detergent will be used at a lower concentration than that used for the treatment of the cell lysate or of the culture medium.
  • a concentration of detergent of the order of 0.1 to 0.5% will be used.
  • pseudoviral particles of HCV which can be obtained by a process in accordance with the invention, and in particular pseudoviral particles having the following characteristics:
  • - a nucleocapsid of icosahedral morphology, with a diameter of approximately 30 nm; a density on the sucrose gradient of approximately 1.15 to 1.18 g / ml when they are obtained from a culture medium or a cell lysate which has not been treated with a detergent; - A density on the sucrose gradient of approximately 1.23 to 1.26 g / ml when they are obtained from a culture medium or a cell lysate having been treated with a detergent.
  • the present invention also relates to tools for the production of HCV pseudoviral particles in accordance with the invention, and in particular:
  • any nucleic acid sequence comprising a sequence (a ') or (a' '') followed by a sequence (b) as defined above, as well as any expression cassette or expression vector comprising said sequence placed under transcriptional control of a baculovirus promoter;
  • the HCV pseudoviral particles in accordance with the invention can be used in particular for the preparation of anti-HCV vaccines, as well as for the preparation of diagnostic reagents, for example for detecting the presence of anti-HCV antibodies in serum samples. . They can also be used for the production of anti-HCV antibodies.
  • the baculovirus AcSLP10-5 'NCR-E1 comprises the sequence coding for proteins C and El of HCV as well as the region 5' NCR; the baculovirus AcSLPIO-C-El comprises only the region coding for the proteins C and El of HCV and is devoid of the 5 'NCR region.
  • baculoviruses were constructed from the plasmid pMINK, which comprises the cDNA of the strain HCV-H genotype la [INCHAUSPE et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 10292-10296, (1991)].
  • FIG. 1 The organization of the genome region of the HCV-H strain which comprises the sequences coding for the structural proteins is illustrated in FIG. 1; the positions of the polyprotein cleavage sites by cellular signalases are indicated below the diagram.
  • the baculoviruses ' ⁇ cSLP10-5' NCR-El and AcSLPIO-C-El were constructed using the pll ⁇ transfer vectors derived from the plasmid pG- ⁇ .8022 [CHAABIHI et al. , J. Virol., 67, 2664-2671, (1993)]. Construction of the AcSLPIO-C-El baculovirus:
  • sequence comprising nucleotides -26 to +267 relative to the ATG of protein C of HCV-H was amplified using the following primers: Primer sense: 5 '-CCGGGAGCTCTCGTAGATCTTGCACC-3'
  • Antisense primer 5 '-CTCATTGCCATAGAGGGGCC-3' and the plasmid pMINK as template. After digestion with BglII and _4sp718, the resulting fragment (which includes nucleotides +1 to +239) was cloned into a modified pUC plasmid (a BglII site was inserted in place of the 5acl site), to give the plasmid pUC-c ⁇ .
  • pl18-C-E1 codes for the capsid and for all of the E1 glycoprotein (nucleotides +1 to +1146). Construction of the AcSLPlQ-5'NCR-El baculovirus:
  • a 1369 bp BamHI fragment containing the 5 ′ non-coding region (341 nucleotides), as well as the sequence encoding the capsid protein and 149 amino acids of the glycoprotein E1 (nucleotides +1 to +1016) of HCV was inserted into the unique BglII site of the plasmid pl18 stop (pl18 with a stop codon located downstream of the BglII site) to give a plasmid called pl18-5 'NCR-E1.
  • Plasmids pll8-C-El and pll8-5 '-NCR-E1 are shown diagrammatically in Figure 2.
  • the recombinant viruses are prepared by recombination between pll8-C-El or pll8-5' -NCR-El and DNA purified from the modified baculovirus AcSLPIO [CHAABIHI et al. , 1993, cited above].
  • the baculovirus ⁇ cSLPIO is a modified baculovirus which has a single strong late promoter (P10) followed by the sequence coding for polyhedrin.
  • the selection and purification of the recombinant viruses is carried out according to the conventional procedure described by SUMMERS and SMITH [Texas Agric. Exp. Stat. Bull., 1555, 1-56, (1987)].
  • Spodoptera frugiperda cells (Sf9 cells, VAUGHN et al., In Vitro Cell Dev. Biol., 13, 213-217, 1977) are cultured at 28 ° C in TC100 medium (GIBCO) supplemented with 5% serum of fetal calf.
  • TC100 medium GEBCO
  • the cells (4 x 10 6 per 25 cm 2 bottle) are inoculated with the viral suspension at a rate of 1 to 10 plaque forming units (UFP) per cell. After 1 hour of adsorption at room temperature, the viral inoculum is removed, and fresh culture medium is added. The cells are then incubated at 28 ° C.
  • the infected cells are harvested 48 h pi (post-infection), washed with cold PBS buffer (phosphate-buffered Saline), and resuspended in electrophoresis buffer [LAEMMLI, Nature, 277, 680-684, (1970)] .
  • the protein samples are deposited on a 12.5% polyacrylarrd.de gel; under denaturing conditions, and in the presence of sodium dodecyl sulfate.
  • the proteins are then transferred to a nitrocellulose filter (SCHLEICHER and SCHUELL; BAS 85, 0.45 ⁇ m).
  • the membrane is stained with Ponceau red (Ponceau-S; SIGMA, St Louis, Mo), then blocked with a TBS solution (0.05 M Tris-HCl (pH 7.4) 0.2 M NaCl) containing 0, 05% TWEEN 20 and 5% skim milk powder (TBS sat).
  • HCV capsid protein is detected using 27D5C5 anti-capsid mouse monoclonal antibody (1: 500 in TBS-sat) or anti-capsid polyclonal rabbit serum # 57 (1: 500 in TBS-sat) as primary antibody and a rabbit anti-immunoglobulin G serum conjugated to peroxidase (SIGMA) or a rabbit anti-immunoglobulin serum conjugated to peroxidase (SIGMA) as secondary antibody (1: 1000 in TBS-sat).
  • 27D5C5 anti-capsid mouse monoclonal antibody (1: 500 in TBS-sat) or anti-capsid polyclonal rabbit serum # 57 (1: 500 in TBS-sat) as primary antibody and a rabbit anti-immunoglobulin G serum conjugated to peroxidase (SIGMA) or a rabbit anti-immunoglobulin serum conjugated to peroxidase (SIGMA) as secondary antibody (1: 1000 in T
  • E1 and E2 glycoproteins are detected using a polyclonal rabbit anti-E1 serum (1: 200 in TBS-sat) or a polyclonal rabbit anti-E2 serum (1: 500 in TBS-sat) as primary antibody and a serum rabbit anti-immunoglobulin goat conjugated to peroxidase as a secondary antibody (1: 10,000 in sat TBS). Transfers have also been revealed using human sera anti-HCV (1: 500 in TBS-sat) containing antibodies against the 3 structural proteins and a human anti-immunoglobulin goat serum conjugated with alkaline phosphatase (SIGMA) as secondary antibody (1: 10000 in TBS-sat).
  • SIGMA alkaline phosphatase
  • the immunoreactive bands were visualized using as chromogenic agent either 1-amino-3-ethyl carbazole, or a mixture of Nitrobleu salt of Tetrazolium and of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate toluidine salt.
  • chromogenic agent either 1-amino-3-ethyl carbazole, or a mixture of Nitrobleu salt of Tetrazolium and of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate toluidine salt.
  • RNA was isolated from infected cells 48 h after infection, using the reagent TRIZOL (GIBCO BRL), according to the protocol recommended by the manufacturer. After extraction with chloroform and precipitation with isopropyl alcohol, the total RNA is resuspended in water devoid of RNAse and quantified by spectrophotometry. After addition of RNA sample buffer (PROMEGA), 10 ⁇ g of each sample are subjected to electrophoresis on 1% agarose gel under non-denaturing conditions and transferred to nylon membrane (ROCHE). The transfers are hybridized with a probe of 417 bp (nucleotides 369 to 785 of the sequence coding the polyprotein of HCV) radiolabeled with 32 P.
  • RNA sample buffer PROMEGA
  • This probe covers the sequence encoding the C-terminal part of the capsid and the N-terminal part of E1.
  • a transcript of the expected size (approximately 750 nucleotides) is detected, both in cells infected with ⁇ cSLP10-5 'NCR-El, and in those infected with AcSLPIO-C-El.
  • These data indicate that the non-expression of HCV proteins in constructs containing the 5 'NCR region reflects a deficiency in the translation of mRNA into proteins.
  • the glycosylation state of HCV proteins produced by AcSLPIO-C-El was studied by culturing infected cells in the presence of tunicamycin, an antibiotic of fungal origin which blocks N-glycosylation. Tunicamycin (final concentration: 10 ⁇ g / ml) was added to the cell culture medium 7 h after infection.
  • the infected cells are harvested 52 h after infection, and the protein samples are analyzed by immunoblotting as described above.
  • infected cells were cultured under the same conditions, but without tunicamycin. Under these conditions, the high molecular weight forms of El and C-El are no longer observed. In all cases, these structural proteins are also not found in the cell culture media.
  • the observation under the electron microscope of Sf9 cells infected with AcSLPIO-C-El reveals a dense crosslinked material, with perinuclear distribution characteristic of the proteins associated with the endoplasmic reticulum.
  • the Labeling of cells with human anti-HCV serum shows a colocalization of these immunoreactive materials with dense intracytoplasmic structures, which indicates that the expressed proteins are retained in the endoplasmic reticulum.
  • cells infected with AcSLP10-5 'NCR-E1 only show the characteristics of cells infected with a recombinant baculovirus, that is to say: nuclear enlargement, the presence of large quantities of virus in the nucleus, and the absence of polyhedrin or P10 type structures. No reticulated cytoplasmic retention or formation of aggregates is observed, and no intracellular protein is labeled with anti-HCV human serum, which confirms the results of the immuno-transfer.
  • Sf9 cells were infected with AcSLPIO-C-El alone, or else co-infected with AcSLPIO-C-El and AcSLP10-5 'NCR-El, according to the protocol described in Example 1 above.
  • the cells are resuspended in low saline buffer (10 mM HEPES, pH 7.9, 10 mM KC1, 1.5 mM MgCl 2 , 0.5% NP40) cold, in the presence of '' a cocktail of protease inhibitors (O-COMPLETE, ROCHE), and ground in a potter (BIOBLOCK SCIENTIFIC).
  • low saline buffer 10 mM HEPES, pH 7.9, 10 mM KC1, 1.5 mM MgCl 2 , 0.5% NP40
  • proteins C and C-El • are present in the sedimenting fractions at a density of 1.21 to 1.26 g / ml; when they are expressed in cells co-infected with the 2 constructs, they are present in the sedimenting fractions at a density of 1.15 to 1.18 g / ml.
  • HCV capsid protein is capable of self-assembling in Sf9 cells when expressed with only part of the HCV RNA, provided that it contains all or part of the 5 'NCR .
  • baculovirus p 5mAc5'NCRm-NS2 ⁇
  • This virus is constructed using the transfer vector pGmAcll ⁇ .
  • This vector has a BglII linker inserted into a deletion at the level of the polyhedrin gene extending from nucleotides -10 to +483 (position +1 corresponding to the 1st nucleotide of the ATG initiation codon of polyhedrin). Deletion in the polyhedrin promoter sequence makes it possible to attenuate the level of expression of the heterologous gene.
  • 5 'modified HCV NCR with mutations in the 5 silent AUG codons is constructed using a set of 14 overlapping oligonucleotides.
  • the position of the 1st nucleotide of each AUG codon in the 5 ′ non-coding region of HCV is respectively -328, -310, -257, -246 and -127 relative to the A (+1) of the initiation codon of the HCV polyprotein.
  • the mutations were chosen so as to create convenient sites for possible subsequent cloning steps; on the other hand, no attempt has been made to preserve the secondary structure of the 5 'NCR region.
  • the positions of the mutations are indicated in Table I below:
  • a 2987 bp M-el-BglII fragment (nucleotides -92 to +2895) containing 93 bp of the wild type HCV 5'NCR, as well as the sequences coding for the proteins C, E1, E2-P7 and the 158 first amino acid of NS2, was introduced downstream of the 5 'NCR mutated in the transfer vector pGmAcll8.
  • a BglII linker inserted into the NS2 gene introduced a stop codon in phase.
  • the resulting plasmid is called pGrr. ⁇ c-5 'NCRm-NS2 ⁇ . This plasmid is shown schematically in Figure 3.
  • Sf2 cells are co-transfected with the DNA of the plasmid p GmAc-5 'NCRm-NS2 ⁇ and the wild-type baculovirus DNA AcNMPV, by lipofection (DOTAP; ROCHE).
  • SF9 cells are infected with the AcPH5'NCRm-NS2 ⁇ virus, and cultured according to the protocol described in Example 1 above.
  • Cell lysates were prepared 72 h after infection and the proteins of these lysates were analyzed by immunoblot, according to the protocol described in Example 1 above, using either the anti-capsid monoclonal antibody. of HCV 27D5C5, or the polyclonal anti-E1 serum, or the polyclonal anti-E2 serum, or the human anti-HCV serum.
  • Additional bands distributed between 35 and 110 kDa can represent uncleaved and partially glycosylated CE-1, E1-E2 or C-E1-E2 polypeptides.
  • Variants of glycosylation of the E2 glycoprotein were revealed using an anti-E2 polyclonal antibody, in a molecular weight zone ranging from 40 to 66 kDa.
  • the two glycoproteins E1 and E2, and to a lesser extent the capsid protein, were also detected in the packing gel, in the form of insoluble aggregates.
  • NP40 final concentration of 1% in the cell lysis buffer causes a shift in the density of the particles from 1.14-1.18 g / ml to 1.23-1.26 g / ml.
  • the pellet of this second centrifugation is resuspended in TEN buffer (containing protease inhibitors) and subjected to isopycnic centrifugation on a sucrose gradient. Under these conditions, the supernatant is concentrated from 20 to 100 times. 500 ⁇ l fractions are collected from the top of the gradient and analyzed as described in Example 2 above.
  • the treatment of the particles with 1% NP40 prior to centrifugation on a sucrose gradient causes the same density shift (from 1.18 to 1.25 g / ml) as that observed in the case of the particles obtained from the cytoplasmic extracts .

Abstract

L'invention concerne la production de particules pseudovirales du virus de l'hépatite C, par expression, en cellules d'insectes, de la région 5' non-codante et des séquences codant pour les protéines structurales dudit virus dans des conditions ne permettant pas la traduction des séquences codant pour les protéines structurales à partir d'un codon d'initiation de la région 5' non-codante.

Description

PRODUCTION DE PARTICULES PSEUDOVIRALES DE VHC EN CELLULES D'INSECTES
L' invention est relative à la production de particules pseudovirales du virus de l'hépatite C (VHC) . Le virus de l'hépatite C a été identifié en 1989
[CHOO et al . , Science, 244, 359-362, (1989)] par des techniques de biologie moléculaire. Ce n'est qu'ultérieurement que les particules virales ont été caractérisées [KAITO et al . , J. Gen. Virol., 75, 1755-1760, (1994)] ; il s'agit de particules spheriques de 45 à 65 nm de diamètre, dont la densité en gradient de saccharose est de 1,03 à 1,2 g/ml.
Le VHC appartient à la famille des Flaviviridae ; son génome est constitué d'un ARN monocaténaire de polarité positive d'environ 9,6 b, comprenant successivement : une région 5' non codante (5'NCR) d'environ 340 nucléotides, un unique cadre ouvert de 'lecture codant pour une polyprotéine d' approximativement 3000 acides aminés, et une région 3' non codante (3' NCR) de 200 à 240 nucléotides.
L'organisation du génome peut être schématisée comme suit :
5'NCR-C-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-3'NCR.
Les protéines de structure C (protéine de capside) , El, et E2 (protéines d'enveloppe), sont codées par la portion 5' du cadre de lecture ouvert ; le reste du cadre de lecture ouvert code la protéine p7, qui est un peptide hydrophobe de fonction inconnue, et les protéines non-structurales NS2 à NS5B, qui sont impliquées dans la réplication du génome et la maturation de la polyprotéine.
La région 5 ' non codante représente la séquence la plus conservée du génome du VHC ; sa longueur varie entre 341 et 349 nucléotides selon le génotype. Elle peut se replier pour former une structure secondaire complexe qui comprend quatre domaines : I (nucléotides 1-42), II (nucléotides 47-67), III (nucléotides 125-323), et IV (nucléotides 331-354), ainsi qu'un pseudo-nœud (nucléotides 305-311 et 325-331) et une structure en hélice [RIJNBRAND et LEMON, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 242, 85-116, (2000)]. Elle possède en outre un nombre variable (de 3 à 6 selon le génotype) de codons AUG dont 2, situés aux positions 85 et 215, sont très conservés entre différents isolats de VHC, et également avec les pestivirus. Cette structure fonctionne comme un site interne d'entrée des ribosomes (IRES), et il a été observé [TSUKIYAMA-KOHARA et al . f J . Virol., 66, 1476-1483, (1992) ; WANG et al . , J. Virol., 67, 3338-3344, (1993) ; REYNOLDS et al . , EMBO J. , 14, 6010-6020, (1996)] qu'elle permettait d'initier la traduction de la polyprotéine dans plusieurs systèmes in vi tro et in vivo . L'étude du VHC, notamment dans le cadre du développement de vaccins ou de réactifs de diagnostic, est freinée par la difficulté d'obtention d'antigènes viraux en quantité suffisante. Bien que l'on parvienne à répliquer ce virus in vitro dans certaines cellules de mammifères (notamment des lymphocytes ou des hépatocytes) , le taux de réplication demeure très faible.
Divers systèmes d'expression hétérologues ont donc été utilisés, et parmi ceux-ci, le système baculovirus/cellules d'insectes. Ce système, qui présente de nombreux avantages (notamment niveau d'expression élevé, innocuité vis-à-vis des vertébrés, et modifications co- et post-traductionnelles pour la plupart similaires à celles des cellules de mammifères), a été proposé pour l'expression de protéines de différents virus, ainsi que pour la production de particules pseudovirales non infectieuses.
Dans le cas du VHC, le système baculovirus/cellules d'insectes a été utilisé pour l'étude de l'expression de diverses protéines, structurales [MATSUURA et al . , J. Virol., 66, 1425-1431, (1992) ; Virology, 205, 141-150, (1994) ; HSU et al . , Hepatology 17, 763-771, (1993) ; LANDFORD et al . , Virology, 197, 225-235, (1993) ; HUSSY et al . , Virus Res., 45, 45-57, (1996) ; J. Hepatol., 26, 1179-1186, (1997)], ou non-structurales [HIROWATARI et al . , Arch. Virol., 133, 349-356, (1993) ; NISHIHARA et al . , Gène, 129, 207-214, (1993) ; OVERTON et al . , J. Gen. Virol., 76, 3009-3019, (1995) ; SUZUKI et al . , J. Gen. Virol., 76, 3021-3029, (1995) ; H ANG et al . , Virology, 227, 439-446, (1997)]. Il a également été utilisé pour la production d'antigènes du VHC à des fins d'études immunologiques [CHIBA et al . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4641-4645, (1991) ; CHIEN et al . , Proc. Nad. Acad. Sci. USA, 89, 10011-10015, (1992) ; INOUE et al . , J. Gen. Virol., 73, 2151-2154, (1992) ; BASSET et al . , J. Virol,. 73, 1118-1126, (1999)] ainsi que pour l'étude des interactions proteiques et de leur assemblage [WANG et al . , Arch. Virol., 142, 2211-2223, (1997)] ; ces derniers auteurs ont notamment observé que l'IRES de la région 5' non-codante n'était pas fonctionnel dans les cellules d'insectes.
Cependant, les protéines virales ainsi obtenues ne s'assemblent pas en particules pseudovirales, et ne reproduisent donc pas certains des déterminants antigéniques du VHC natif. Des travaux récents [BAUMERT et al . , J. Virol.,
72, 3827-3836, (1998) ;• Demande PCT WO 98/21338], décrivent l'obtention de particules pseudovirales de VHC par l'expression dans un système baculovirus/cellules d'insectes, d'une construction comprenant une partie (les 81 derniers nucléotides) de la région 5' non-codante, ainsi que les séquences codant les protéines de structure C, El et E2 d'un VHC de génotype lb. Les particules pseudovirales reconnues par des anticorps anti-VHC sont localisées dans les cellules infectées, où elles sont enfermées dans des vésicules intracytoplasmiques ; elles ont un aspect polymorphe, un diamètre variable de 40 nm à 60 nm, et après purification à partir des lysats de cellules infectées, une densité de 1,14 g/cm3 à 1,18 g/cm3. Aucune sécrétion des particules pseudovirales dans le milieu de culture n'a été observée. BAUMERT et al. indiquent qu'il est possible, mais improbable que la portion de la 5'NCR contenue dans ces constructions joue un rôle dans l'efficacité de l'assemblage des particules et qu'il est plus probable que celle-ci dépend de l'isolât de VHC à partir duquel a été obtenu l'ADNc exprimé. La présente invention a pour but de fournir des moyens reproductibles de production de particules pseudovirales de VHC dans un système baculovirus/cellules d'insectes. Pour atteindre ce but, les Inventeurs ont entrepris de rechercher les régions du génome de VHC potentiellement impliquées non seulement dans l'expression des protéines virales, mais également dans leur assemblage en particules pseudovirales. ' Dans un premier temps, pour étudier l'influence de la région 5' non-codante sur l'expression des protéines du VHC, les Inventeurs ont construit des baculovirus recombinants portant des inserts d'ADNc de VHC comprenant la séquence codant pour la partie structurale de la polyprotéine, précédée ou non par la région 5' non-codante.
Ils ont observé que : l' insert d'ADNc dépourvu de la région 5' non-codante est traduit en protéines, mais il n'y a pas d' autoassemblage de celles-ci ; - l' insert d'ADNc contenant la région 5' non-codante est transcrit normalement en ARNiτi, mais n'est pas traduit, ce qui confirme les résultats rapportés par WANG et al . , (1997, précité).
Les Inventeurs ont ensuite co-exprimé dans une même cellule, 2 constructions différentes : l'une comprenant la séquence codant pour les protéines structurales, et dépourvue de la séquence de la région 5' non-codante, et pouvant donc être traduite en protéines de structure de VHC, et l'autre comprenant la séquence codant pour les protéines structurales précédée de la séquence de la région 5' non-codante, et ne pouvant donc pas être traduite en protéines de structure de VHC.
Ils ont alors constaté que de manière surprenante, cette expression en trans de la 5 'NCR et des protéines structurales produit, à l'intérieur de la cellule, des particules pseudovirales de morphologie et de densité similaires à celles du VHC, ce qui permet de supposer que la région 5' non-codante joue un rôle dans l'assemblage des particules pseudovirales. Les Inventeurs ont alors cherché à modifier la région 5 ' non-codante de manière à supprimer des codons AUG présents dans cette région et susceptibles d'interférer avec la traduction de la polyprotéine, permettant ainsi de rétablir la traduction des protéines de structures de VHC, sans altérer la fonction de la 5 'NCR dans l'assemblage des particules pseudovirales. Dans ce but, ils ont réalisé une construction comprenant une 5 'NCR modifiée par suppression des codons AUG présents dans cette région (en effectuant leur mutation en codons non-AUG) , placée en amont de la séquence codant pour les protéines structurales. Ils ont constaté que l'expression de cette construction dans le système baculovirus/cellules d'insectes permettait également d'obtenir la traduction des protéines structurales de VHC ainsi que leur association en particules pseudovirales ; de plus ils ont constaté que de façon surprenante, une partie de ces particules pseudovirales était sécrétée dans le milieu extra cellulaire. Les résultats obtenus par les Inventeurs montrent donc que des particules pseudovirales de VHC peuvent être obtenues par l'expression simultanée, dans une même cellule d'insecte, de séquences de la région 5' non-codante, et de séquences codant pour les protéines structurales, à condition que cette expression s'effectue dans un contexte ne permettant pas la traduction des séquences codant pour les protéines structurales à partir d'un codon d'initiation situé sur la région 5' non-codante.
Ces résultats permettent de proposer de nouvelles méthodes et de nouveaux outils utilisables pour l'obtention de particules pseudovirales de VHC dans des cellules d' insectes .
La présente invention concerne ces méthodes et outils, qui comportent plusieurs variantes. Selon une première variante de la présente invention, on obtient des particules pseudovirales de VHC en exprimant sur des transcrits séparés, dans une même cellule d'insecte, la région 5' non-codante et la séquence codant pour les protéines structurales. Conformément à cette première variante, la présente invention a ainsi pour objet un procédé d'obtention de particules pseudovirales de VHC, caractérisé en ce qu'il comprend l'expression simultanée, dans une même cellule d'insecte, et sous forme de transcrits séparés, des séquences nucléotidiques suivantes :
- une séquence non-codante choisie parmi : a) la région 5' non-codante d'un VHC ; a' ) une séquence dérivée de la séquence a) par élimination d'un ou plusieurs des codons d'initiation de la traduction présents dans ladite séquence ; a' ' ) une séquence constituée par au moins une portion de la séquence a) ci-dessus ; a' ' ' ) une séquence constituée par au moins une portion de la séquence a' ) ci-dessus ;
- une séquence (b) codant au moins pour les protéines C, El, et E2 d'un VHC, et dépourvue de la région 5' non-codante dudit VHC ; et la récupération des particules pseudovirales de VHC à partir de ladite cellule.
Selon une autre variante de la présente invention, on obtient des particules pseudovirales de VHC en exprimant sur un même transcrit, la région 5' non-codante d'un VHC ou une portion . de celle-ci, préalablement modifiée par élimination des codons d'initiation de la traduction.
Conformément à cette deuxième variante, la présente invention a pour objet un procédé d'obtention de particules pseudovirales de VHC, caractérisé en ce qu'il comprend l'expression, dans une cellule d'insecte, d'une séquence nucléotidique comprenant, d'amont en aval : une séquence non-codante choisie parmi une séquence (a') ou (a''') telles que définies ci-dessus ;
- une séquence (b) telle que définie ci-dessus ; et la récupération des particules pseudovirales de VHC à partir de ladite cellule ou de son milieu de culture .
La présente invention peut être mise en œuvre pour l'obtention de particules pseudovirales de VHC de différents génotypes, ainsi que pour l'obtention de particules pseudovirales associant des séquences issues de
VHC de différents génotypes, par exemple une région 5' non- codante et une séquence structurale provenant de génotypes différents .
Les régions 5' non-codantes des VHC sont en effet très conservées d'un génotype à l'autre et contiennent toutes des codons AUG susceptibles d'interférer avec la traduction de la polyprotéine.
A partir des séquences 5' non-codantes des VHC de différents génotypes disponibles dans la littérature . (cf. par exemple BURATTI et al . , FEBS Letters, 411, 275-280, 1997) et sur les bases de données, l'homme du métier peut sans difficulté localiser les codons d'initiation de la traduction, et les supprimer par toute méthode, connue en elle-même, de mutagenèse dirigée.
L'élimination d'un codon d'initiation de la traduction peut être effectuée notamment par délétion de tout ou partie dudit codon, et éventuellement d'un ou de quelques nucléotides adjacents, par insertion dans ledit codon ou d'un ou de quelques nucléotides, ou par remplacement dudit codon par un codon différent. Selon un mode de mise en œuvre préféré de la présente invention, la séquence (b) code au moins pour les protéines C, El, E2 et p7 d'un VHC. Selon une disposition préférée de ce mode de mise en œuvre, ladite séquence (b) code en outre pour une partie de la protéine non structurale NS2.
Pour la mise en œuvre de la première variante de l'invention, l'expression dans la cellule d'insecte est effectuée à l'aide de 2 cassettes d'expression séparées, l'une comprenant une séquence (a), (a'), (a'') ou (a''') sous contrôle transcriptionnel d'un premier promoteur fonctionnel dans ladite cellule, la seconde comprenant une séquence (b) sous contrôle transcriptionnel d'un second promoteur fonctionnel dans ladite cellule, qui peut être identique au premier ou différent de celui-ci. Ces 2 cassettes peuvent être portées par 2 vecteurs d'expression différents ou par un même vecteur.
Pour la mise en œuvre de la deuxième variante de l'invention, l'expression dans la cellule d'insecte est effectuée à l'aide d'une seule cassette d'expression, comprenant une séquence (a') ou (a''') suivie d'une séquence (b) placées sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur fonctionnel dans ladite cellule. Des vecteurs d'expression utilisables pour la mise en œuvre de la présente invention sont notamment des baculovirus recombinants, permettant l'expression d'une ou plusieurs séquence (s) exogène sous contrôle d'un ou plusieurs promoteur (s) de baculovirus. Différents systèmes baculovirus/cellules d'insectes, permettant l'expression de gènes d' intérêt ainsi que les outils de clonage et d'expression de séquences exogènes dans ces différents systèmes sont bien connus de l'homme de l'art, et sont décrits par exemple dans BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS : A LABORATORY MANUAL [O'REILLY et al . , Freeman and Cie, New York, (1994)], ainsi que dans un grand nombre de Brevets ou Demandes de Brevets, tels que, par exemple, la Demande EP 0 345 152, la Demande EP 0 651 815, la Demande EP 0 638 647 ou la Demande PCT WO 95/20672. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à l'invention, il comprend l'infection d'une cellule d'insecte avec : un baculovirus recombinant comprenant une séquence (a') ou (a''') suivie d'une séquence (b) placées sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur dudit baculovirus ; ou bien un baculovirus recombinant comprenant une séquence (a) , (a' ) , (a' ' ) ou (a' ' ' ) sous contrôle transcriptionnel d' un premier promoteur dudit baculovirus et une séquence (b) sous contrôle transcriptionnel d'un second promoteur dudit baculovirus identique au premier ou différent de celui-ci, ou bien ;
- un premier baculovirus recombinant comprenant une séquence (a), (a'), (a'') ou (a''') sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur dudit baculovirus, et un second baculovirus recombinant comprenant une séquence (b) sous contrôle transcriptionnel d' un promoteur dudit baculovirus ; la culture de la cellule infectée et la récolte des particules pseudovirales de VHC à l'issue de ladite culture, à partir de ladite cellule ou de son milieu de culture . Selon une disposition préférée de ce mode de mise en œuvre, pour obtenir des particules pseudovirales en quantité plus importante, on effectue la récolte des particules pseudovirales après au moins 48 heures de culture, de préférence après 72 heures de culture. Pour la récolte des particules pseudovirales de
VHC à partir de la cellule infectée, on procède à la lyse de ladite cellule, et à la purification des particules pseudovirales à partir du lysat obtenu. L'identification de la ou des fraction (s) contenant les particules pseudovirales peut s'effectuer aisément à l'aide d'anticorps anti-VHC.
On peut traiter le lysat par un détergent, avantageusement un détergent non-ionique, à une concentration comprise de préférence entre 0,5 et 1%, afin de séparer les particules pseudovirales des membranes qui leurs sont associées.
Pour la purification des particules pseudovirales, on utilisera des méthodes classiques telles que des centrifugations successives et/ou une centrifugation sur gradient de saccharose ou tout autre procédé équivalent. Par exemple, lorsque la purification est effectuée sans traitement du lysat cellulaire par un détergent, les particules pseudovirales de VHC peuvent être récupérées après centrifugation à l'équilibre sur gradient de saccharose, dans une fraction dont la densité est d'environ 1,15 à 1,18 g/ml ; ces particules comprennent, outre la protéine de capside, les protéines d'enveloppe El et E2. Lorsque la purification est effectuée après traitement du lysat cellulaire par un détergent, (par exemple NP40 à 1% final) , les particules pseudovirales de VHC peuvent être récupérées après centrifugation à l'équilibre sur gradient de saccharose, dans une fraction dont la densité est d'environ 1,23 à 1,26 g/ml ; ces particules sont dépourvues des protéines d'enveloppe El et E2. Leur densité est similaire à celle de la nucléocapside du VHC qui a été estimée à 1,25 g/ml [MIYAMOTO et al . , J. Gen. Virol., 73, 715-718, (1992)], après traitement au NP40 de particules virales extraites d'échantillons de plasma provenant de patients infectés.
Avantageusement, dans le cadre de la deuxième variante de la présente invention, on peut récolter les particules pseudovirales de VHC à partir du milieu de culture ; du fait qu'il n'est pas nécessaire de procéder à la lyse préalable des cellules, l'extraction et la purification des particules pseudovirales sont facilitées, et peuvent s'effectuer dans des conditions moins drastiques, assurant une meilleure préservation de leurs caractéristiques morphologiques, biochimiques et antigéniques . Pour la récolte des particules pseudovirales de
VHC à partir du milieu -de culture, on procède à la collecte dudit milieu, et à la purification des particules pseudovirales à partir de celui-ci.
La collecte du milieu de culture peut s'effectuer par tous moyens connus en eux-mêmes, permettant de séparer ledit milieu des cellules infectées, par exemple par centrifugation ou filtration.
Préalablement à la purification des particules pseudovirales de VHC, on peut traiter le milieu de culture ainsi collecté par un détergent, comme indiqué ci-dessus pour la purification à partir du lysat. La purification des particules pseudovirales s'effectue ensuite également par des méthodes classiques, similaires à celles mentionnées ci- dessus. L'identification de la ou des fraction (s) contenant les particules pseudovirales peut s'effectuer à l'aide d'anticorps anti-VHC comme indiqué ci-dessus.
Comme dans le cas des particules pseudovirales obtenues à partir du lysat cellulaire, celles obtenues à partir du milieu de culture peuvent être récupérées après centrifugation à l'équilibre sur gradient de saccharose, sous forme de particules possédant les protéines d'enveloppe El et E2, et dans une fraction dans une fraction dont la densité est d'environ 1,15 à 1,18 g/ml lorsque le milieu n'a pas été traité par un détergent, et sous forme de particules dépourvues des protéines d'enveloppe El et E2, et dans une fraction dont la densité est d'environ 1,23 à 1,26 g/ml lorsque le milieu a été traité par un détergent. Des particules pseudovirales de VHC dépourvues des protéines d' enveloppe El et E2 peuvent également être obtenues en traitant par un détergent non-ionique des particules pseudovirales possédant ces protéines ; dans ce cas, on utilisera ledit détergent à une concentration plus faible que celle employée pour le traitement du lysat cellulaire ou du milieu de culture. Avantageusement, on utilisera une concentration en détergent de l'ordre de 0,1 à 0,5%.
La présente invention a également pour objet les particules pseudovirales de VHC susceptibles d'être obtenues par un procédé conforme à l'invention, et notamment des particules pseudovirales présentant les caractéristiques suivantes :
- une nucléocapside de morphologie icosaédrique, et de diamètre de 30 nm environ ; une densité sur gradient de saccharose d'environ 1,15 à 1,18 g/ml lorsqu'elles sont obtenues à partir d'un milieu de culture ou d'un lysat cellulaire n'ayant pas été traité par un détergent ; - une densité sur gradient de saccharose d'environ 1,23 à 1,26 g/ml lorsqu'elles sont obtenues à partir d'un milieu de culture ou d'un lysat cellulaire ayant été traité par un détergent.
La présente invention a également pour objet des outils de production des particules pseudovirales de VHC conformes à l'invention, et notamment :
- toute séquence d'acide nucléique comprenant une séquence (a') ou (a''') suivie d'une séquence (b) telles que définies ci-dessus, ainsi que toute cassette d'expression ou vecteur d'expression comprenant ladite séquence placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur de baculovirus ;
- tout vecteur recombinant contenant une cassette d'expression comprenant une séquence (a), (a'), (a'') ou (a''') sous contrôle transcriptionnel d'un premier promoteur de baculovirus, et une cassette d'expression comprenant une séquence (b) sous contrôle transcriptionnel d'un second promoteur de baculovirus ; - toute cellule d'insecte exprimant soit une séquence (a') ou (a''') suivie d'une séquence (b) sous contrôle transcriptionnel d'un même promoteur de baculovirus, soit une séquence (a), (a'), (a'') ou (a''') sous contrôle transcriptionnel d'un premier promoteur de baculovirus, et une séquence (b) sous contrôle transcriptionnel d'un second promoteur de baculovirus.
Les particules pseudovirales de VHC conformes à l'invention peuvent être utilisées notamment pour la préparation de vaccins anti-VHC, ainsi que pour la préparation de réactifs de diagnostic, par exemple pour détecter la présence d' anticorps anti-VHC dans des échantillons de sérum. Elles peuvent également être utilisées pour la production d'anticorps anti-VHC.
La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs de construction et de mise en oeuvre de vecteurs d'expression conformes à 1 ' Invention.
Les protocoles utilisés dans les exemples qui suivent font appel à des techniques classiques du génie génétique, telles que celles décrites par SAMBROOK et al . [Molecular cloning : A Laboratory Manual ; Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)], ou par O'REILLY et al . [Baculovirus Expression Vectors : A Laboratory Manual ; Freeman and Cie, New York, (1994)] pour la manipulation de l 'ADN de baculovirus. Les conditions particulières à chaque expérimentation sont, s'il y a lieu, précisées dans l'exemple correspondant . EXEMPLE 1 : EFFET DE LA SEQUENCE 5' NON CODANTE SUR LA TRADUCTION DE LA REGION STRUCTURALE DE LA POLYPROTEINE DE VHC
Pour étudier le rôle de la région 5' non codante (5' NCR) de VHC sur la morphogénèse des particules virales, 2 baculovirus recombinants dénommés respectivement AcSLP10-5'NCR-El et ΛcSLPIO-C-El ont été construits.
Le baculovirus AcSLP10-5' NCR-E1 comprend la séquence codant les protéines C et El de VHC ainsi que la région 5 'NCR ; le baculovirus AcSLPIO-C-El comprend uniquement la région codant les protéines C et El de VHC et est dépourvu de la région 5' NCR.
Ces baculovirus ont été construits à partir du plasmide pMINK, qui comprend l'ADNc de la souche VHC-H génotype la [INCHAUSPE et al . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 10292-10296, (1991)].
L'organisation de la région du génome de la souche VHC-H qui comprend les séquences codant pour les protéines structurales est illustrée par la Figure 1 ; les positions des sites de clivage de la polyprotéine par les signalases cellulaires sont indiquées sous le diagramme.
Dans les exemples qui suivent, les positions des nucléotides du génome de VHC-H sont indiquées par référence au site d'initiation de la traduction de polyprotéine, le « A » du codon d'initiation représentant la position 4-1.
Les baculovirus' ΛcSLP10-5' NCR-El et AcSLPIO-C-El ont été construits à l'aide des vecteurs de transfert pllδ dérivés du plasmide pG-ι.8022 [CHAABIHI et al . , J. Virol., 67, 2664-2671, (1993)]. Construction du baculovirus AcSLPIO-C-El :
Plasmide p!18-C-El :
La séquence comprenant les nucléotides -26 à +267 par rapport à l'ATG de la protéine C de VHC-H a été amplifiée en utilisant les amorces suivantes : Amorce sens : 5' -CCGGGAGCTCTCGTAGATCTTGCACC-3'
(les nucléotides qui ont été mutés pour créer un site Sa cl et un site Bgll sont indiqués en caractères gras).
Amorce antisens : 5' -CTCATTGCCATAGAGGGGCC-3' et le plasmide pMINK comme matrice. Après digestion avec BglII et _4sp718, le fragment résultant (qui comprend les nucléotides +1 à +239) a été clone dans un plasmide pUC modifié (un site BglII a été inséré à la place du site 5acl) , pour donner le plasmide pUC-cΔ. Un fragment Asp718-5aIII (nucléotides +240 à +1141) codant pour la portion C-terminale de la capside et pour les 191 premiers acides aminés de El a été excisé de pMINK et inséré dans les sites Aspl lB-AslI du plasmide pUC-CΔ. Le dernier codon de El et un codon stop ont été enfin insérés par l'intermédiaire d'un lieur Sali avant le sous-clonage dans le vecteur de transfert pll8. Le lieur Sali a été reconstitué par hybridation des 2 oligonucléotides suivants : 5'-GTCGACGCGTAAAGATCTGAGCT-3' et
5 " -CAGATCTTTACGCGTCGACAGCT-3 ' .
Le plasmide résultant, dénommé pll8-C-El, code pour la capside et pour la totalité de la glycoprotéine El (nucléotides +1 à +1146) . Construction du baculovirus AcSLPlQ-5'NCR-El :
Plasmide p!18-5' NCR-E1 :
Un fragment BamHI de 1369 pb contenant la région 5' non-codante (341 nucléotides), ainsi que la séquence codant la protéine de capside et 149 acides aminés de la glycoprotéine El (nucléotides +1 à +1016) de VHC a été inséré dans le site unique BglII du plasmide pll8 stop (pll8 avec un codon stop situé en aval du site BglII) pour donner un plasmide dénommé pll8-5 'NCR-E1.
Les plasmides pll8-C-El et pll8-5' -NCR-E1 sont schématisés sur la Figure 2. Les virus recombinants sont préparés par recombinaison entre pll8-C-El ou pll8-5' -NCR-El et de l'ADN purifié du baculovirus modifié AcSLPIO [CHAABIHI et al . , 1993, précité]. Le baculovirus ΛcSLPIO est un baculovirus modifié qui possède un seul promoteur tardif fort (P10) suivi par la séquence codant la polyédrine. La sélection et la purification des virus recombinants est effectuée selon la procédure classique décrite par SUMMERS et SMITH [Texas Agric. Exp. Stat. Bull., 1555, 1-56, (1987)].
Des cellules de Spodoptera frugiperda (cellules Sf9, VAUGHN et al . , In Vitro Cell Dev. Biol., 13, 213-217, 1977) sont cultivées à 28°C dans du milieu TC100 (GIBCO) supplé enté avec 5% de sérum de veau fœtal. Pour l'infection, les cellules (4 x 106 par flacon de 25 cm2) sont inoculées avec la suspension virale à raison de 1 à 10 unités formant plage (UFP) par cellule. Après 1 heure d'adsorption à température ambiante, l'inoculum viral est enlevé, et du milieu de culture frais est ajouté. Les cellules sont ensuite incubées à 28°C.
Les protéines exprimées par les cellules Sf9 infectées avec AcSLPIO-C-El, AcSLP10-5' NCR-E1 ou avec le virus ΛcMNPV de type sauvage ont été analysées par électrophorèse et immuntransfert selon le protocole suivant :
Les cellules infectées sont récoltées 48 h p.i. (post-infection) , lavées avec du tampon PBS froid (phosphate-buffered Saline) , et resuspendues dans du tampon d' électrophorèse [LAEMMLI, Nature, 277, 680-684, (1970)]. Les échantillons de protéines sont déposés sur un gel de polyacrylarrd.de à 12,5%; en conditions dénaturantes, et en présence de dodécyl sulfate de sodium. Les protéines sont alors transférées sur un filtre de nitrocellulose (SCHLEICHER et SCHUELL ; BAS 85, 0,45 μm) . La membrane est colorée au rouge Ponceau (Ponceau-S ; SIGMA, St Louis, Mo) , puis bloquée avec une solution de TBS (0,05 M Tris-HCl (pH 7,4) 0,2 M NaCl) contenant 0,05% de TWEEN 20 et 5% de poudre de lait écrémé (TBS sat) .
La protéine de capside de VHC est détectée en utilisant l'anticorps monoclonal de souris anti-capside 27D5C5 (1:500 en TBS-sat) ou le sérum polyclonal de lapin anti-capside #57 (1:500 en TBS-sat) comme anticorps primaire et un sérum de lapin anti-immunoglobuline G de souris conjugué à la peroxydase (SIGMA) ou un sérum de chèvre anti-immunoglobuline de lapin conjugué à la peroxydase (SIGMA) comme anticorps secondaire (1:1000 en TBS-sat).
Les glycoprotéines El et E2 sont détectées en utilisant un sérum polyclonal de lapin anti-El (1:200 en TBS-sat) ou un sérum polyclonal de lapin anti-E2 (1:500 en TBS-sat) comme anticorps primaire et un sérum de chèvre anti-immunoglobuline de lapin conjugué à la peroxydase comme anticorps secondaire (1:10000 en TBS sat). Les transferts ont également été révélés en utilisant des sérums humains anti-VHC (1:500 en TBS-sat) contenant des anticorps contre les 3 protéines structurales et un sérum de chèvre anti-immunoglobuline humaine conjuguée à la phosphatase alcaline (SIGMA) comme anticorps secondaire (1:10000 en TBS-sat) .
Les bandes immunoréactives ont été visualisées en utilisant comme agent chromogène soit du l-amino-3-éthyl carbazole, soit un mélange de sel de Nitrobleu de Tétrazolium et de sel de5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate toluidine. Les résultats de cette analyse sont les suivants :
L'analyse des protéines exprimées dans les cellules infectées avec AcSLPIO-C-El montre la présence d'une protéine de 21 kDa, et en moindre quantité, d'une protéine de 23 kDa qui correspond probablement à la protéine de capside non clivée à son extrémité C-terminale.. 3 produits additionnels mineurs de poids moléculaire plus faible (16 et 18 kDa) ou plus élevé (22 kDa) , sont révélés avec le sérum humain anti-VHC. On observe aussi l'accumulation d'un produit de 42-55 kDa qui résulte probablement d'une maturation inefficace de la polyprotéine précurseur CE-1. En fait, ce précurseur est marqué avec l'anticorps anti-El.
L'analyse des protéines exprimées dans les cellules infectées avec AcSLP10-5 'NCR-El ne révèle aucune production de la capside ou de la glycoprotéine El.
Dans les cellules témoins infectées par le baculovirus AcMNPV de type sauvage, on n'observe aucune production de protéines reconnues par des anticorps dirigés contre les protéines de VHC. Pour vérifier si l'absence d'expression des protéines de VHC dans les cellules infectées avec ΛcSLP10-5 'NCR-El est due à une déficience au niveau de la transcription ou bien au niveau de la traduction, les ARN messagers produits par les constructions AcSLPIO-C-El et AcSLPlO-5 'NCR-El ont été analysés par transfert de Northern selon le protocole suivant :
L'ARN total, a été isolé à partir des cellules infectées 48 h après infection, en utilisant le réactif TRIZOL (GIBCO BRL) , suivant le protocole préconisé par le fabricant. Après extraction au chloroforme et précipitation à l'alcool isopropylique, l'ARN total est resuspendu dans de l'eau dépourvue de RNAse et quantifié par spectrophotométrie . Après addition de tampon d'échantillon ARN (PROMEGA), 10 μg de chaque échantillon sont soumis à une électrophorèse sur gel d' agarose 1% en conditions non-dénaturantes et transférés sur membrane de nylon (ROCHE) . Les transferts sont hybrides avec une sonde de 417 bp (nucléotides 369 à 785 de la séquence codant la polyprotéine de VHC) radio-marquée au 32P.
Cette sonde recouvre la séquence codant la partie C-terminale de la capside et la partie N-terminale de El.
Un transcrit de la taille attendue (environ 750 nucléotides) est détecté, aussi bien dans les cellules infectées avec ΛcSLP10-5 ' NCR-El, que dans celles infectées avec AcSLPIO-C-El . 'Ces données indiquent que la non-expression des protéines de VHC dans les constructions contenant la région 5' NCR reflète une déficience au niveau de la traduction de l'ARNm en protéines. L'état de glycosylation des protéines de VHC produites par AcSLPIO-C-El a été étudié en cultivant les cellules infectées en présence de tunicamycine, un antibiotique d'origine fongique qui bloque la N-glycosylation. La tunicamycine (concentration finale : 10 μg/ml)a été ajoutée au milieu de culture des cellules 7 h après l'infection. Les cellules infectées sont récoltées 52 h après l'infection, et les échantillons de protéines sont analysés par immuntransfert comme décrit ci-dessus. A titre de contrôle, des cellules infectées ont été cultivées dans les mêmes conditions, mais sans tunicamycine. Dans ces conditions, les formes de haut poids moléculaire de El et de C-El ne sont plus observées. Dans tous les cas, ces protéines de structure ne sont pas non plus retrouvées dans les milieux de culture des cellules. L'observation au microscope électronique de cellules Sf9 infectées par AcSLPIO-C-El révèle un matériel réticulé dense, à répartition périnucléaire caractéristique des protéines associées au réticulum endoplasmique . Le marquage de cellules avec le sérum humain anti-VHC montre une colocalisation de ces matériaux immunoréactifs avec des structures intracytoplasmiques denses, ce qui indique que les protéines exprimées sont retenues dans le réticulum endoplasmique .
En revanche, les cellules infectées avec AcSLP10-5 ' NCR-El ne montrent que les caractéristiques des cellules infectées par un baculovirus recombinant, c'est-à-dire : une hypertrophie nucléaire, la présence de grandes quantités de virus dans le noyau, et l'absence de structures de type polyédrine ou P10. Aucune rétention réticulée cytoplasmique ou formation d'agrégat n'est observée, et aucune protéine intracellulaire n'est marquée avec le sérum humain anti-VHC, ce qui confirme les résultats de l' immuntransfert .
EXEMPLE 2 : EFFETS EN TRANS DE LA REGION 5' NON-CODANTE SUR LA MULTIMERISATION DE LA PROTEINE DE CAPSIDE DE VHC
Une éventuelle interaction entre la 5' CR et la protéine de capside a été étudiée par co-expression des 2 baculovirus AcSLP10-5 ' NCR-El et AcSLPIO-C-El, combinant ainsi un transcrit non traduisible en protéines de structure de VHC contenant une 5' NCR avec un transcrit traduisible en protéines de structure de VHC dépourvu de 5' NCR.
Des cellules Sf9 ont été infectées avec AcSLPIO-C-El seul, ou bien co-infectées avec AcSLPIO-C-El et AcSLP10-5 'NCR-El, selon le protocole décrit à l'Exemple 1 ci-dessus .
48 ou 72 h après l'infection, les cellules sont resuspendues dans du tampon faiblement salin (10 mM HEPES, pH 7,9, 10 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 0,5% NP40) froid, en présence d'un cocktail d'inhibiteurs de protéases (O-COMPLETE, ROCHE) , et broyées dans un potter (BIOBLOCK SCIENTIFIC) .
Après centrifugation à faible vitesse (10 x 103g pendant 10 minutes à 4°C), le surnageant est déposé sur un gradient linéaire de saccharose (20 à 60% en poids dans du tampon TEN : 50 mM Tris HC1 pH 7,4, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA) et soumis à une centrifugation isopycnique pendant 24 h à 4°C et 150 000 g. Pour certaines expériences, 1% de NP40 ont été ajoutés aux extraits bruts de protéines avant leur dépôt sur le gradient de saccharose. Des fractions de 500 ml sont collectées et analysées par immuntransfert, comme décrit à l'Exemple 1 ci-dessus .
Les résultats de l'analyse par centrifugation isopycnique sur gradient de saccharose, montrent que la distribution de la protéine de capside et du polypeptide C-El sur le gradient diffère selon que les extraits ont été préparés à partir des cellules infectées avec AcSLPIO-C-El seul ou bien à partir des cellules co-infectées avec AcSLPIO-C-El et AcSLP10-5 'NCR-El . Quand elles sont exprimées dans des cellules infectées uniquement avec AcSLPIO-C-El, les protéines C et C-El • sont présentes dans les fractions sédimentant à une densité de 1,21 à 1,26 g/ml ; quand elles sont exprimées dans les cellules co-infectées avec les 2 constructions, elles sont présentes dans les fractions sédimentant à une densité de 1,15 à 1,18 g/ml.
Lorsque l'extrait brut est traité avec un détergent nonionique doux (NP-40, 1%) préalablement à son analyse sur gradient de saccharose, les protéines C et C-El sont présentes dans les fractions sédimentant à une densité plus élevée : 1,24-1,26 g/ml.
L'analyse en microscopie électronique de cellules co-infectées avec ΛcSLP10-5' CR-El et AcSLPIO-C-El montre une distribution réticulée du matériel dense similaire à celle décrite ci-dessus. L'observation à fort grossissement de la région cytoplasmique des cellules aux phases tardives de l'affection montre des particules pseudo-virales de taille et de forme variables. Ces particules sont entourées de protubérances qui peuvent être constituées soit de complexes de protéines structurales, soit de structures pseuso-ribosomales associées.
Le marquage avec un anticorps polyclonal anti-capside de cellules infectées préalablement perméabilisées au détergent montre une colocalisation de la protéine de capside de VHC avec ces particules. Des cellules infectées avec le baculovirus de type sauvage ou avec d'autres baculovirus recombinants exprimant une ou deux protéines de VHC sans la protéine de capside ne montrent jamais de distribution similaire. Ces résultats confirment que la protéine de capside de VHC est capable de s' auto-assembler dans les cellules Sf9 lorsqu'elle est exprimée avec seulement une partie de l'ARN VHC, pourvu qu'il comporte tout ou partie de la 5 'NCR. EXEMPLE 3 : EFFETS DE LA MUTATION DES CODONS AUG DE LA REGION 5' NON-CODANTE DE VHC SUR LA TRADUCTION DES PROTEINES DE STRUCTURE ET LA FORMATION DE PARTICULES PSEUDO-VIRALES
Pour étudier le rôle potentiel de la 5' NCR sur l'assemblage des protéines structurales lorsqu'elle est placée en position cis, un baculovirus recombinant dénommé AcPH-5 'NCRm-NS2Δ a été construit. Ce baculovirus comprend la séquence codant pour la totalité des protéines de structure de VHC, précédé par une 5' NCR mutée par suppression de 5 codons AUG silencieux. Construction du baculovirus p(5mAc5'NCRm-NS2Δ
Ce virus est construit en utilisant le vecteur de transfert pGmAcllδ. Ce vecteur possède un lieur BglII inséré dans une délétion au niveau du gène de la polyhédrine s' étendant des nucléotides -10 à +483 (la position +1 correspondant au 1er nucleotide du codon d'initiation ATG de la polyhédrine) . La délétion dans la séquence du promoteur de la polyhédrine permet d'atténuer le niveau d'expression du gène hétérologue.
Construction du plasmide pGmAc-5 'NCRm-NS2Δ : Un fragment d'ADN de 256 bp contenant une région
5 'NCR modifiée de VHC présentant des mutations dans les 5 codons AUG silencieux est construit en utilisant un ensemble de 14 oligonucléotides se recouvrant. La position du 1er nucleotide de chaque codon AUG dans la région 5' non-codante de VHC est respectivement de -328, -310, -257, -246 et -127 par rapport au A(+l) du codon d'initiation de la polyprotéine de VHC. Les mutations ont été choisies de manière à créer des sites commodes pour d'éventuelles étapes de clonage ultérieures ; en revanche, il n'a pas été tenté de préserver la structure secondaire de la région 5' NCR. Les positions des mutations sont indiqués dans le Tableau I ci-dessous :
Tableau I
Figure imgf000022_0001
Un fragment M-el-BglII de 2987 bp (nucléotides -92 à +2895) contenant 93 bp de la 5'NCR de VHC de type sauvage, ainsi que les séquences codant pour les protéines C, El, E2-P7 et les 158 premiers acides aminés de NS2, a été introduit en aval de la 5 'NCR mutée dans le vecteur de transfert pGmAcll8 . Un lieur BglII inséré dans le gène NS2 a introduit un codon stop en phase. Le plasmide résultant est dénommé pGrr.Λc-5 ' NCRm-NS2Δ. Ce plasmide est schématisé sur la Figure 3. Pour la préparation du baculovirus
AcPH5'NCRm-NS2Δ, des cellules Sf2 sont co-transfectées avec l'ADN du plasmide p GmAc-5 ' NCRm-NS2Δ et l'ADN de baculovirus de type sauvage AcNMPV, par lipofection (DOTAP ; ROCHE) .
Des cellules SF9 sont infectées avec le virus AcPH5'NCRm-NS2Δ, et cultivées selon le protocole décrit à l'Exemple 1 ci-dessus. Des lysats cellulaires ont été préparés 72 h après l'infection et les protéines de ces lysats ont été analysées par immun-transfert, selon le protocole décrit à l'Exemple 1 ci-dessus, en utilisant ou bien l'anticorps monoclonal anti-capside de VHC 27D5C5, ou bien le sérum polyclonal anti-El, ou bien le sérum polyclonal anti-E2, ou bien le sérum humain anti-VHC.
Les résultats de cette analyse montrent que la traduction 'des protéines structurales est restaurée. Deux produits immuno-réactifs majeurs avec des poids moléculaires de 21 et 23 kDa, correspondant aux deux formes différentes de la protéine de capside sont révélés par l'anticorps anti-capside. Deux espèces mineures de 16 et 28 kDa sont également détectées en plus faible quantité. L'anticorps polyclonal anti-El réagit avec plusieurs bandes comprises entre 21 et 35 kDa correspondant probablement à des variants de glycosylation de la glycoprotéine El.
Des bandes additionnelles distribuées entre 35 et 110 kDa peuvent représenter des polypeptides CE-1, E1-E2 ou C-E1-E2 non clivés et partiellement _ glycosylés .
Des variants de glycosylation de la glycoprotéine E2 ont été révélés en utilisant un anticorps polyclonal anti-E2, dans une zone de poids moléculaire allant de 40 à 66 kDa. Les deux glycoprotéines El et E2, et dans une moindre mesure la protéine de capside ont également été détectées dans le gel de tassement, sous forme d'agrégats insolubles.
L'observation en microscopie électronique des cellules infectées avec le baculovirus recombinant AcPH-5 'NCRm-NS2Δ montre un cercle périnucléaire de matériel très dense résultant • probablement de l'accumulation de protéines de structure de VHC associées au réticulum endoplasmique. L' immunomarquage avec le sérum humain anti-VHC de cryo-sections de cellules infectées confirme la localisation des protéines de VHC dans cette zone du cytoplasme. Un faible marquage est également observé dans le noyau.
L'analyse par centrifugation isopycnique sur gradient de saccharose, selon le protocole décrit à l'Exemple 2 ci-dessus, montre que les protéines reconnues par le sérum humain anti-VHC sédimentent dans des fractions de densité 1,14 à 1,18 g/ml. Dans ces conditions, le produit principalement détecté est la protéine de capside, essentiellement sous forme mature p21. Le traitement des extraits cellulaires avec du
NP40 (concentration finale de 1% dans le tampon de lyse cellulaire) provoque un déplacement de la densité des particules, de 1,14-1,18 g/ml à 1,23-1,26 g/ml.
L'observation en microscopie électronique, après coloration négative, de ces fractions reconnues par l'anticorps anti-VHC montre la présence de particules icosaédriques d'environ 30 nm de diamètre. EXEMPLE 4 : EFFET DE LA MUTATION DES CODONS AUG DE LA REGION 5' NON-CODANTE DE VHC SUR LA FORMATION DE PARTICULES PSEUDOVIRALES EXTRACELLULAIRES
Des surnageants de cultures de cellules co-infectées avec AcSLP10-5 ' NCR-El et AcSLPIO-C-El, ou infectées avec ΛcPH-5 ' NCRm-NS2Δ seul, ont été concentrés par centrifugation à 150000 g et analysés par centrifugation isopycnique sur gradient de saccharose selon le protocole suivant : Les particules virales présentes dans le surnageant de culture sont isolées comme suit : après une centrifugation à faible vitesse (10 min. à 4°C et 1000 g), le surnageant est récupéré et soumis à une seconde centrifugation de 1 à 2 h à 4°C et à 150000 g. Le culot de cette deuxième centrifugation est resuspendu dans du tampon TEN (contenant des inhibiteurs de protéase) et soumis à une centrifugation isopycnique sur gradient de saccharose. Dans ces conditions, le surnageant est concentré de 20 à 100 fois. Des fractions de 500 μl sont récoltées à partir du sommet du gradient et analysées comme décrit dans l'Exemple 2 ci-dessus .
Aucun produit réagissant avec les anticorps anti-VHC n'est détecté dans les surnageants de culture de cellules co-infectées avec AcSLP10-5 'NCR-El et AcSLPIO-C-El ; en revanche, dans les surnageants de cellules infectées avec AcPH-5 'NCRm-NS2Δ on détecte des fractions réagissant avec les anticorps anti-VHC. La principale fraction réagissant avec les anticorps anti-VHC sédimente à une densité d' environ 1,18 g/ml et réagit également avec les anticorps anti-capside et dans une moindre mesure, avec les anticorps anti-El et anti-E2.
Le fait que le signal obtenu avec les deux anticorps anti-enveloppe soit plus faible que celui observé avec les anticorps anti-capside peut refléter une incorporation plus faible des glycoprotéines El et E2 dans ces particules. Le traitement des particules par du NP40 1% préalablement à la centrifugation sur gradient de saccharose provoque le même déplacement de densité (de 1,18 à 1,25 g/ml) que celui observé dans le cas des particules obtenues à partir des extraits cytoplasmiques .

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé d'obtention de particules pseudovirales de VHC, caractérisé en ce qu'il comprend l'expression simultanée, dans une même cellule d'insecte, et sous forme de transcrits séparés, des séquences nucléotidiques suivantes :
- une séquence non-codante choisie parmi : a) la région 5' non-codante d'un VHC ; a' ) une séquence dérivée de la séquence a) par élimination d'un ou plusieurs des codons d'initiation de la traduction présents dans ladite séquence ; a' ' ) une séquence constituée par au moins une portion de la séquence a) ; a' ' ' ) une séquence constituée par au moins une portion de la séquence a' ) ; une séquence (b) codant au moins pour les protéines C, El, et E2 d'un VHC, et dépourvue de la région 5' non-codante dudit VHC ; et la récupération des particules pseudovirales de VHC à partir de ladite cellule.
2) Procédé d'obtention de particules pseudovirales de VHC, caractérisé en ce qu'il comprend l'expression, dans une cellule d'insecte, d'une séquence nucléotidique comprenant, d'amont en aval : - une séquence non-codante choisie parmi une séquence (a') ou (a''') telles que définies dans la revendication 1 ;
- une séquence (b) telle que définie dans la revendication 1 ; et la récolte des particules pseudovirales de VHC à partir de ladite cellule ou de son milieu de culture.
3) Procédé selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence (b) code au moins pour les protéines C, El, E2 et p7 d'un VHC. 4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ladite séquence (b) code en outre pour une partie de la protéine non structurale NS2 d'un VHC. 5) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'expression dans ladite cellule d'insecte est effectuée en utilisant un seul vecteur d'expression contenant une cassette d'expression d'une séquence (a), (a'), (a'') ou (a''') sous contrôle transcriptionnel d'un premier promoteur, et une cassette d'expression d'une séquence (b) sous contrôle transcriptionnel d'un second promoteur.
6) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'expression dans ladite cellule d'insecte est effectuée en utilisant un vecteur d'expression contenant une cassette d'expression d'une séquence (a), (a'), (a'') ou (a''') sous contrôle transcriptionnel d'un premier promoteur, et un vecteur d'expression contenant une cassette d'expression d'une séquence (b) sous contrôle transcriptionnel d'un second promoteur.
7) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'expression dans ladite cellule d'insecte est effectuée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant une cassette d'expression, comprenant une séquence (a') ou (a''') suivie d'une séquence (b) placées sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur.
8) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'on utilise comme vecteur d'expression un baculovirus recombinant. 9) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend l'infection d'une cellule d'insecte avec : un baculovirus recombinant comprenant une séquence (a') ou (a''') suivie d'une séquence (b) placées sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur dudit baculovirus ; ou bien un baculovirus recombinant comprenant une séquence (a), (a'), (a'') ou (a''') sous contrôle transcriptionnel d'un premier promoteur dudit baculovirus et une séquence (b) sous contrôle transcriptionnel d'un second promoteur dudit baculovirus identique au premier ou différent de celui-ci, ou bien ; - un premier baculovirus recombinant comprenant une séquence (a), (a'), (a'') ou (a''') sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur dudit baculovirus, et un second baculovirus recombinant comprenant une séquence (b) sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur dudit baculovirus ; la culture de la cellule infectée, et la récolte des particules pseudovirales de VHC à l'issue de ladite culture, à partir de ladite cellule ou de son milieu de culture.
10) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'on effectue la récolte des particules pseudovirales après au moins 48 heures de culture, de préférence après au moins 72 heures de culture. 11) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'on effectue la purification des particules pseudovirales de VHC à partir d'un lysat de la cellule infectée.
12) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'on effectue la purification des particules pseudovirales de VHC à partir du milieu de culture des cellules infectées.
13) Procédé selon une quelconque des revendications 11 ou 12, caractérisé en ce qu'il comprend en outre le traitement dudit lysat ou dudit milieu de culture par un détergent non-ionique.
14) Particules pseudovirales de VHC, caractérisées en ce qu'elles sont susceptibles d'être obtenues par un procédé selon une quelconque des revendications 1 à 13, et en ce qu'elles ont une nucléocapside de morphologie icosaédrique, et de diamètre de 30 nm environ.
15) Particules pseudovirales selon la revendication 14, caractérisées en ce qu'elles sont susceptibles d'être obtenues par un procédé selon une quelconque des revendications 1 à 12, et en ce que leur densité déterminée par centrifugation à l'équilibre sur gradient de saccharose est d'environ 1,15 à 1,18 g/ml. 16) Particules pseudovirales selon la revendication 14, caractérisées en ce qu'elles sont susceptibles d'être obtenues par un procédé selon la revendication 13, et en ce que leur densité déterminée par centrifugation à l'équilibre sur gradient de saccharose est d'environ 1,23 à 1,26 g/ml
17) Séquence d'acide nucléique comprenant une séquence (a') ou (a''') suivie d'une séquence (b) telles que définies dans la revendication 1. 18) Cassette d'expression comprenant une séquence d'acide nucléique selon la revendication 17 placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur de baculovirus.
19) Vecteur d'expression, constitué par un baculovirus recombinant comprenant une séquence d'acide nucléique selon la revendication 17 placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur dudit baculovirus.
20) Vecteur d'expression constitué par un baculovirus recombinant comprenant une séquence (a) , (a' ) ,
(a'') ou (a''') telles que définies dans la revendication 1, sous contrôle transcriptionnel d'un premier promoteur dudit baculovirus, et une cassette d'expression comprenant une séquence (b) telle que définie dans la revendication 1, sous contrôle transcriptionnel d'un second promoteur dudit baculovirus ; 21) Cellule d'insecte contenant une cassette d'expression selon la revendication 18.
22) Cellule d'insecte contenant une cassette d'expression comprenant une séquence (a), (a'), (a'') ou (a''') telles que définies dans la revendication 1, sous contrôle transcriptionnel d'un premier promoteur de baculovirus, et une séquence (b) telle que définie dans la revendication 1, sous contrôle transcriptionnel d'un second promoteur de baculovirus.
23) Utilisation de particules pseudovirales de VHC selon une quelconque des revendications 14 à 16 pour la préparation d'un vaccin. 24) Utilisation de particules pseudovirales de VHC selon une quelconque des revendications 14 à 16 pour la préparation d'un réactif de diagnostic.
25) Utilisation de particules pseudovirales de VHC selon une quelconque des revendications 14 à 16 pour la préparation d'anticorps anti-VHC.
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