FR2607516A2 - Vecteurs perfectionnes d'expression d'un variant de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu - Google Patents

Vecteurs perfectionnes d'expression d'un variant de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu Download PDF

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Abstract

LA PRESENTE ADDITION CONCERNE UN BLOC FONCTIONNEL D'ADN PERMETTANT LA PREPARATION DE L'HIRUDINE A PARTIR DE LEVURE SELON L'UNE DES REVENDICATIONS 1 A 8 DU BREVET PRINCIPAL, CARACTERISE EN CE QUE LE GENE DE L'HIRUDINE EST LE GENE CODANT POUR HV1.

Description

Le brevet principal et la première addition décri- vent un procédé permettant de faire synthétieer et sécréter par des levures telles que S. cerevisiae de l'hirudine active, plus particulièrement du variant HV2.
La présente addition concerne la synthèse et la sécrétion du variant HV1 par des vecteurs, des souches et des méthodes semblables A ceux qui sont décrits dans le brevet principal.
Le gène HV1 a déjà été synthétisé chimiquement en vue de son expression dans Escherichia coli (addition 84.13250 au brevet français 84.04755).
La plupart des oligonucléotides synthétiques utilisés dans ce brevet ont été conservés pour la construction de la séquence codant pour le précurseur d'HVl, à l'exception de ceux qui permettent les différentes jonctions avec les séquences qui seront fusionnées en amont et en aval de la séquence codante.
L'obtention d'une hirudine sécrétée nécessite la présence d'un précurseur contenant les informations nécessaires à la sécrétion et à la maturation correcte de ce polypeptide suivant le chemin métabolique normal de la levure. Dans le brevet principal, on a montré que la séquence NH2terminale du précurseur du facteur a pouvait être utilisée pour la sécrétion du variant HV2 de l'hirudine. La présente invention concerne l'application de ce système à la sécrétion du variant HV1.
L'invention concerne en particulier des blocs d'expression fonctionnels tels que décrits dans le brevet principal et dans lesquels le gène de l'hirudine est le gène codant pour l'hirudine HV1, ces blocs fonctionnels d'ADN pouvant être portés par des plasmides vecteurs ou intégrés dans les cellules de levures.
Ces blocs fonctionnels présentent, de préférence, la structure décrite dans le brevet principal, à savoir
- Str - Lex - Scl - gène HV1
5tr est une séquence d'ADN comportant les signaux
assurant la transcription du gène HV1 par la levure,
. Lex est une séquence leader nécessaire pour obte
nir l'excrétion du produit du gène,
. Scl est une séquence d'ADN codant pour un site de
clivage.
Parmi les séquences Lex, il faut citer celle de la phéromone sexuelle alpha de levure, et pour Strr il faut citer le promoteur du gène MFalphal et également le promoteur du gène PGK.
Pour diriger l'expression et la sécrétion de l'hirudine dans le milieu de culture, le gène correspondant est intégré dans un vecteur de levure qui comprend, de préférence, les éléments suivants, qui ont été décrits dans le brevet principal - l'origine de réplication du plasmide de levure 2 , - le gène ura3, - une origine de réplication dans E. coli et un marqueur de
résistance à un antibiotique, - la région 5' du gène MFalphal qui comprend le promoteur de
transcription, la séquence "leader" et la séquence pre-pro
du précurseur du facteur alpha : cette séquence sera fusi
onnée, en phase, en amont de la séquence codante de l'hiru
dine HV1, - le terminateur de transcription du gène PGK de la levure,
qui sera placé en aval du gène de l'hirudine.
L'invention concerne également les levures transformées par ces vecteurs ou par ce bloc fonctionnel d'ADN et leur application à la préparation d'hirudine HV1.
En particulier, l'invention concerne un procédé de préparation de l'hirudine HV1 par fcrmentation de levures selon l'invention et récupération de l'hirudine produite dans le milieu de culture, sous forme mature ou sous forme d'un précurseur maturable in vitro.
Les techniques mises en oeuvre ont déjà été décrites plus en détail dans le brevet français nO 85 06672 et son addition n 86 10090 au nom de la Demanderesse.
L'hirudine HV1 ainsi obtenue peut être utilisée comme cela est décrit au brevet principal en tant qu'inhibiteur de la thrombine, tant in vivo que in vitro.
En particulier, l'HVl peut être utilisée dans des compositions pharmaceutiques, seule ou en combinaison avec d'autres principes actifs, ou bien dans le cadre de tests ou de diagnostic, in vitro ou in vivo. Dans ce dernier cas, il peut être intéressant de marquer la molécule par exemple par un marquage radioactif, fluorescent, enzymatique ou autre.
Exemple 1 Stratégie de synthèse de la séquence d'ADN co
dant pour HV1.
Cette séquence devra porter les éléments permettant la fusion en phase de la séquence d'HVl avec la partie prepro de MFalphal et les signaux permettant une maturation correcte de l'hirudine sécrétée ; en particulier la région de jonction contiendra un doublet Lys Arg juste en amont du premier résidu NH2-terminal de HV1.
La stratégie utilisée eet similaire à celle décrite dans l'addition n 84.13250 du brevet n0 84.04755. La synthè- se se fait en deux blocs séparés qui sont ensuite assemblés grâce à leurs extrémités cohésives BamHI. Le premier bloc comprend 9 oligonucléotides numérotés de 1 à 9 et le second bloc comprend 10 nucléotides numérotés de 10 à 19. Leurs séquences et la position des oligonucléotides sont représentées dans la figure 1.
La carte de restriction ainsi que la traduction de la séquence en amino acides sont données dans les figures 2 et 3.
Exemple 2 Assemblage du gène synthétique.
- Premier bloc synthétique
Les oligonucléotides 2 à 8 (figure 1) ont été phosphorylés à leurs extrémités 5' pour éviter la formation de dimères ou de polymères : 500 picomoles de chaque oligonucléotide ont été traitées à la polynucléotide kinase (2 unités) dans un volume final de 25 jil de Tris HC1 60 mM, pH 7.5, MgC12 10 mM, dithiothreitol 8 mM, contenant 3,3 pmoles de -ATP 32P (5000 Ci/ nmole) ; après 15 minutes d'incubation à 370C on ajoute 5 nmoles d'ATP non marqué.
Après incubation à 370C pendant 30 minutes, les fragments complémentaires ont été hybridés deux à deux, à l'exception des fragments 1, 2 et 3 ces derniers étant mélangés ensemble. 300 pmoles de chaque oligonucléotide ont été utilisés.
dans un volume final 10 p1 de Tris HC1 66 mM, pH 7,5, MgC12 6 mM, NaCl 100 mM, spermidine 0,5 mM, DTT 8 mM.
Ces mélanges chauffés & 100C pendant 3 minutes sont ensuite refroidis lentement A 370C pendant 2 heures. Les oligonucléotides 1-2-3 hybridés ont été mélangés avec les oligonucléotides 4-5 et incubés à 370C pendant 2 heures. De la même façon, on a procédé à l'hybridation des couples des oligonucléotides 6-7 avec 8-9. Dans une dernière étape, on a rassemblé les 9 oligonucléotides ainsi prétraités, que l'on a incubés deux heures à 370C dans un volume final de 100 1.
14 pmoles de ces oligonucléotides hybridés ont été soumis à un traitement par la ligase de T4 pendant 15 heures à 150C.
Ensuite on a ajouté au mélange réactionnel 50 ng du grand fragment HindIII-BamHI du M13TG131 préalablement purifié sur gel. Le mélange de ligation a ensuite été utilisé pour transformer des cellules compétentes d'E. coli JM103. Parmi 12 clones phagiques ainsi obtenus, un seul présentait la séquence recherchée : M13TG1888.
- Deuxième bloc synthétique
On a utilisé la même stratégie pour synthétiser le second bloc (figure 1) qui a été cloné entre les sites BamHI et SalI du phage M13TG131. Deux clones sur les 12 testés ont présenté un insert correspondant à la séquence recherchée. Un de ces clones a été nommé M13TG1889.
- Assemblage du gène synthétique
Les deux ADNs double-brin de M13TG1888 et de M13TG1889 ont été digérés par HindIII et BamHI et par BamHI et SalI respectivement, et mélangés avec le grand fragment HindIII-SalI de pBR322 purifié sur gel. Après ligation, le mélange a servi à transformer E. coli 1106. Par sélection pour la résistance à l'ampicilline on a obtenu le plasmide pTG1890 qui contient la séquence synthétique correctement reconstituée.
Exemple 3 Construction du vecteur pTG1891 qui permet la
sécrétion de l'hirudine synthétisée.
Le fragment d'ADN de pTG1890 qui porte la séquence codante de HV1 est repris sous forme de fragment HindIII
BglII (le site BglII étant situé juste en amont du site SalI qui a servi au clonage- précédent) pour être inséré entre les sites HindIII et BglII du plasmide pTG881, décrit dans le brevet principal 85.06672.Dans le plasmide résultant, pTG1891, le gène HV1 se retrouve donc inséré entre les séquences pre-pro de MFa1 et le terminateur de transcription cette construction doit donc assurer la maturation et la sécrétion de l'hirudine HV1, puisqu'elle est identique à pTG1818 (brevet principal) à l'exception des séquences codantes de HV2 qui sont remplacées par celles de HV1.
Exemple 4 Transformation d'une souche TGYlsp4 par 1'ADN du
plasmide pTG1891.
La souche TGYlsp4 (a1 ura3-251-373-328, His3-ll-15) a été transformée par le plasmide pTG1891 ; 2 clones obtenus par sélection pour le caractère ura+ ont été mis en culture et leur production d'hirudine, sécrétée dans. le milieu de culture, a été déterminée. Comme contrôle, on a dosé dans les mêmes conditions la quantité d'hirudine sécrétée par TGYlsp4 pTG1818.
On mesure deux fois plus d'activité antithrombine dans le surnageant de culture de la souche TGYlsp4 pTG1891 (0,9 mg par litre de surnageant de culture) que dans celui de la souche TGYlsp4 pTG1833.
Dépôt de souche représentative de l'invention
La souche suivante a été déposée à la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes de l'institut
Pasteur, 28 Rue du Docteur Roux, Paris (15), le 6 novembre 1986
TGYlsp4 pTG1891 sous le n0 I-623.

Claims (11)

REVENDICATIONS
1. Bloc fonctionnel d'ADN permettant la préparation de l'hirudine à partir de levure selon l'une des revendications 1 à 8 du brevet principal, caractérisé en ce que le gène de l'hirudine est le gène codant pour HV1.
2. Plasmide comportant les éléments nécessaires à l'excrétion de l'hirudine par une levure, caractérisé en ce qu'il contient un bloc fonctionnel selon la revendication 1 et au moins une origine de réplication dans les levures.
3. Plasmide selon-la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comporte - l'origine de réplication du plasmide de levure 2 , - le gène ura3, - une origine de réplication dans E. coli et un marqueur de
résistance à un antibiotique, - la région 5' du gène MFalphal qui comprend le promoteur de
transcription, la séquence "leader" et la séquence pre-pro
du précurseur du facteur alpha, cette séquence étant
fusionnée en phase, en amont de la séquence codant pour
l'hirudine HV1, - le terminateur de transcription du gène PGK de la levure
placé en aval du gène de l'hirudine.
4. Levure transformée par un plasmide selon l'une des revendications 2 et 3 ou par un bloc d'expression selon la revendication 1.
5. Levure selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure du genre Saccharomyces.
6. Levure selon l'une des revendications 4 à 5, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de
S. cerevisiae.
7. Procédé de préparation d'hirudine par fermentation d'une levure selon l'une des revendications 4 à 6 et selon le procédé d'une des revendications 18 à 23 du brevet principal et récupération de l'hirudine produite dans le milieu de culture sous forme mature ou sous forme d'un précurseur maturable in vitro.
8. Hirudine HV1 obtenue par la mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 7.
9. A titre d'inhibiteur de la thrombine, l'hirudine selon la revendication 8.
10. Application de l'hirudine selon la revendication 8 à titre d'agent anticoagulant.
11. A titre de médicament, l'hirudine selon la revendication 8.
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