FR2465708A1 - Procede de synthese de penicillines et de cephalosporines par action d'une amidoacylase, et esters en tant que sources de groupes acyles pour cette synthese - Google Patents

Abstract

DES PENICILLINES ET DES CEPHALOSPORINES PEUVENT ETRE SYNTHETISEES PAR L'ACTION D'UNE ACYLASE SUR UNE AMINE DE NOYAU DE PENICILLINE OU DE CEPHALOSPORINE, EN TANT QUE SUBSTRAT, ET SUR UN ESTER(I), EN TANT QUE SOURCE DE GROUPES ACYLES, AYANT LA FORMULE: (CF DESSIN DANS BOPI) (OU RCO EST UN GROUPE ACYLE DANS DES CHAINES LATERALES DE PENICILLINES OU DE CEPHALOSPORINES, X EST UN ATOME D'HYDROGENE, UN GROUPE ALKYLE INFERIEUR OU UN GROUPE HYDROXYALKYLE INFERIEUR, Y EST UN ATOME D'HYDROGENE OU UN GROUPE ALKYLE INFERIEUR, ET N EST UN NOMBRE ENTIER POSITIF).

Description

La présente invention se rapporte à un nouveau

procédé pour préparer des I-lactames antibactériens, c'est-

à-dire des pénicillines et des céphalosporines, par l'ac-

tion d'une acylase sur une amine du noyau de céphalosporine ou de pénicilline, en tant que substrat, et sur un ester (I), en tant que source de groupes acyles, ayant la formule suivante: RCOO(CH2CHO)nY (I) x (o RCO est un groupe acyle dans les chaînes latérales de

céphalosporines ou de pénicillines, X est un atome d'hydro-

gène, un groupe alkyle inférieur ou un groupe hydroxyalkyle inférieur, Y est un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle,

et n est un nombre entier positif).

La réaction pour la synthèse se déroule dans une solution homogène et est convenable pour une production

efficace continue. Ceci surmonte des ennuis empêchant jus-

qu'à présent l'acylation industrielle pour la production de pénicillines et de céphalosporines par l'action d'une

acylase.

On connaît bien des procédés pour préparer des

pénicillines ou des céphalosporines par réaction d'un es-

ter méthylique ou éthylique d'un acide, ayant une partie acyle à introduire, avec l'acide 6-aminopénicillanique ou 2. l'acide 7aminocéphalosporanique ou ses dérivés réactifs (par exemple demandes de brevets japonais publiées n0 47-25388, n0 47-29588, n0 48-26985, n0 4835090, n0 48-99393, n0 49-14687, n0 49-36890, n0 49-48892,n' 49-75787, n0 49-134893 et no 52-110896). On doit noter que la source de groupes acyles dans les références indiquées ci-dessus est invariablement un ester alkylique inférieur, spécialement

un ester méthylique.

La demanderesse a constaté, durant des réactions semblables que de nombreux esters alkyliques inférieurs sont difficilement solubles dans l'eau, ce qui entraîne le fait que l'on obtient seulement des concentrations inférieures,

insuffisantes pour une acylation efficace.

Par suite, la synthèse connue avec une enzyme immobilisée a souvent présenté des difficultés dues à une

formation de deux phases ou à une formation d'un bouchon (ob-

turation) dans une colonne, ce qui empêche une élution régu-

lière.

Pour résoudre ces problèmes, on a fabriqué et es-

sayé de nombreux esters afin de les appliquer comme substrats pour les acylases, et on a trouvé très convenables un ester

de (poly)éthylèneglycol et analogues. Ces esters sont libre-

ment miscibles avec de l'eau et ne forment pas de bouchons dans une colonne lors d'une acylation. En conséquence, ils

peuvent être efficacement utilisés dans des réactions conti-

nues avec une colonne d'enzyme immobilisée. Ainsi, le rapport molaire entre la source de groupes acyles et la source de groupes amino pourrait être réduit, le rendement pourrait être

amélioré, la concentration de substrats et de produits pour-

rait être augmentée, la matière de départ n'ayant pas réagi et les produits obtenus pourraient être rassemblés à partir

du mélange réactionnel de manière efficace, et d'autres méri-

tes ont également été découverts pour cette synthèse enzyma-

tique. Ainsi, la présente invention se rapporte à une nouvelle synthèse enzymatique de $-lactames antibactériens par réaction d'un ester ayant la formule (I) avec un acide 3.

aminoazétidinonecarboxylique ayant la formule (II), en pré-

sence d'une acylase dans un milieu aqueux, pour fournir un -lactame antibactérien ayant la formule (III): RCOO(CH2C HO)nY (I) [source de groupes X acyles] H2N-Q (II) [source de groupes amino] RCa2N-O (III) [5lactame antibactérien] + HO(CH2CHO)nY X [o RCO- est un groupe acyle; - Xest un atome d'hydrogène, un groupe alkyle inférieur ou un groupe hydroxyalkyle inférieur;

Y- est un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle infé-

rieur; n est un nombre entier positif; et Q- est un groupe ayant la formule: i- NCou CH3

N Z OIN CH3

:

COOH COOH

(o Z est un atome d'hydrogène ou d'halogène, un groupe nu-

cléophile, un groupe méthyle, un groupe halométhyle ou un

groupe méthyle substitué par un groupe nucléophile)].

Comme on l'expliquera ultérieurement, des enzymes

d'origine bactérienne ou fongique sont spécialement importan-

tes en tant qu'acylases pour la présente invention au point de vue par exemple de l'efficacité de production, du coût et

de la stabilité.

Des bactéries spécialement convenables comprennent des bactéries produisant une acylase, appartenant, par exemple, au genre Micrococcus, Arthrobacter ou Bacillus, comprenant

des souches spécifiques de Micrococcus roseus M-1054-1 (FERM-

P 3744), de Micrococcus luteus M-331-1, d'Arthrobacter glo-

biformis M-345-2 (FERM-P 3743), de Bacillus circulans M-1123-

(FERM-P 5153) et de Bacillus megaterium NRRL B-5385. Les composés ayant la formule (I) sont de nouveaux 4.

composés indispensables en tant que constituants de la pré-

sente invention et sont fortement solubles dans l'eau et, de manière concomitante, susceptibles d'être des substrats des acylases. Ce sont des sources utiles de groupes acyles et ils présentent une utilité à ce point de vue.

Dans la formule indiquée ci-dessus, le groupe acy-

le représenté par RCO- est un groupe acyle de pénicillines ou de céphalosporines naturelles ou synthétiques, qui est susceptible d'être un substrat de l'amido-acylase, sous la

forme du dérivé d'ester (I).

Un groupe RCO- à titre d'illustration peut être un groupe alcanoyle inférieur ou alkénoyle inférieur à chaîne

droite, à chaîne ramifiée, cyclique ou partiellement cycli-

que; un groupe aralcanoyle inférieur monocyclique, un groupe aryloxyalcanoyle inférieur monocyclique, un groupe alcanoyle

inférieur hétérocyclique (avec 0, N ou S), un groupe thio-

alcanoyle inférieur hétérocyclique (avec 0, N ou S), un grou-

pe cyanoacétyle, un groupe cyanométhylthioacétyle, un groupe

arylglycyle monocyclique, un groupe cycloalkénylglycyle mono-

cyclique, un groupe arylglycolyle monocyclique, un groupe Nacylarylglycyle, un groupe arylmalonyle monocyclique ou un groupe arylsulfoalcanoyle monocyclique, tous les groupes

mentionnés ci-dessus ayant, de manière facultative, un grou-

pe alkyle inférieur, un groupe aminométhyle, un halogène, un groupe hydroxy, un groupe alcanoyloxy inférieur ou un groupe alcoxy inférieur en tant que substituant, et contenant de

préférence 1 à 15 atomes de carbone.

Cet ester (I) a, en tant que partie alcoolique, n unités d'un éthylèneglycol unitaire ayant la formule:

-(CH2CHXO)- en tant que constituant. Le nombre n est ordinai-

rement de 1 à 20, spécialement de 4 à 15. Une autre extrémi-

té Y de la chaîne d'éthylèneglycol peut être un atome d'hy-

drogène ou peut se présenter sous la forme d'un éther alkyli-

que inférieur. La demanderesse a trouvé que l'activité enzy-

matique pour la source de groupe acyles n'est pas beaucoup affectée par la longueur de la chaîne d'éthylèneglycol. Par suite, l'ester (I),utilisé en tant que source de groupes 5.

acyles peut être un mélange de plusieurs esters ayant diver-

ses valeurs de n, ce qui entraîne des effets équivalents.

Ces esters peuvent être préparés par un procédé classique, par exemple par les réactions d'un acide RCOOH avec la glycérine, ou le (poly) éthylèneglycol ou l'oxyde d'éthylène, par déshydratation, condensation, ou en passant par l'intermédiaire d'un halogénure d'acide, ou d'esters chimiquement réactifs d'un autre type pour une réaction

d'échange d'esters.

L'acide aminoazétidinone carboxylique (II) est une amine de noyau de pénicilline ou une amine de noyau de céphalosporine capable d'être utilisé comme substrat de

l'acylase applicable sous une forme de sel ou d'ester solu-

ble dans l'eau.

Dans la formule (II), Q est un noyau de pénicilli-

ne ou de céphalosporine, représenté par la formule partiel-

le suivante: ou y CH3

Z CH3

COOH COOH

(o Z est tel que défini ci-dessus).

Ce groupe Z est un substituant à la position 3 des produits antibactériens céphalosporiniques, c'est-à-dire

un atome d'halogène ou un atome d'hydrogène, ou un groupe nu-

cléophile ou un groupe méthyle éventuellement substitué par ce groupe nucléophile. Ce groupe nucléophile a déjà été

décrit, par exemple, dans la demande de brevet japonais pu-

bliée n 49-81381.

Un groupe Z, à titre d'illustration,peut avoir jus-

qu'à 7 atomes de carbone et peut comprendre l'hydrogène, un

halogène, un groupe alcoxy inférieur, un groupe thio hétéro-

cyclique (avec 0, N ou S)monocyclique, un groupe alkyle infé-

rieur, un groupe aralkyle inférieur monocyclique, un groupe

alcanoyloxy inférieur, un groupe alcanoyl(inférieur)oxyalky-

le inférieur, un groupe thioalkyle inférieur hétérocyclique 6. (avec 0, N ou S) monocyclique et un groupe pyridiniumalkyle inférieur. Ces groupes peuvent être substitués par un groupe

alkyle inférieur, un groupe carboxyalkyle inférieur, un grou-

pe alcoxy inférieur, le groupe carbamoyle ou un halogène. Un hétérocycle dans RCO ou dans Z possède 1 à 4 hétéroatomes. Un acide aminoazétidinonecarboxylique (II) peut

être utilisé sous la forme de sels solubles dans l'eau,accep-

tables du point de vue enzymatique (par exemple le sel de sodium, le sel de potassium, le sel de calcium) ou d'un ester

soluble dans l'eau (par exemple un ester méthanesulfonyléthy-

lique, un ester acétonylique, un ester alcoxy(inférieur)al-

kylique inférieur), ou il peut être utilisé sous la forme d'un sel d'addition avec les acides,soluble dans l'eau (par exemple un sel d'acide minéral, un sel d'acide carboxylique ou un sel d'acide sulfonique), en tant que matière de départ

équivalente. C'est un composé connu ou c'est un composé inti-

mement apparenté qu'on peut produire à partir d'une substance

connue par un procédé connu.

L'enzyme pour la présente invention peut Gtre une acylase d'origine végétale (plante), animale, fongique ou bactérienne. Parmi ces enzymes, les plus convenables du point de vue industriel sont des enzymes fongiques ou bactériennes,

au point de vue de la disponibilité. L'enzyme peut être em-

magasinée pendant un temps important, utilisée à maintes re-

prises et disponible sous forme d'une concentration supérieu-

re à la concentration d'inhibition minima (CIM) des bactéries d'origine.

Des bactéries ôu des champignons à titre d'illus-

tration pour la source d'acylases comprennent des sources de

microorganismes appartenant, par exemple, au genre Acetobac-

ter, Achromobacter, Aeromonas, Alkaligenes, Arthrobacter,

Blevibacterium, Beneckea, Bacillus, Corynebacterium, Escheri-

chia, Flavobacterium, Gluconobacter, Kluyvera, Microbacte-

rium, Micrococcus, Nocardia, Proteus, Pseudomonas, Rhodo-

pseudomonas, Spilirum, Staphylococcus, Xanthomonas, Aphanocla-

dium ou Cephalosporium, ou une souche mutante ou variante na-

turelle ou artificielle, capable de produire une acylase pour 7.

la condensation de la présente invention.Ces souches compren-

nent celles décrites par exemple dans l'ouvrage Advances in

Applied Microbiology, Volume 20,page 217 (1976) ou une sou-

che mutante artificielle ou naturelle, disponible dans la réaction de la présente invention. Des bactéries spécialement préférables comme origines de l'enzyme pour la présente invention comprennent les trois souches suivantes:

1. Micrococcus roseus M-1054-1, FERM-P 3744, ATCC 31251.

2. Arthrobacter globiformis M-345-2, FERM-P 3743, ATCC 31250.

3. Bacillus circulans M-1123-5, acceptation par FERM No 5153.

Les souches indiquées ci-dessus ont les caractéris-

tiques suivantes: -

Micrococcus roseus M-1054-1

(1) Caractéristiques morphologiques (partie inclinée d'agar-

agar-extrait de viande, 280C, 24 heures)

Des coccus (diamètre 1,0-1,2p) se relient sous for-

me d'un seul toron ou d'un double toron. La motilité n'est

pas observée et aucune spore n'est formée. La formation de ta-

ches par la réaction de Gram est positive après incubation pendant 24 heures. La formation de tache résistant aux acides

est négative.

(2) Caractéristiques sur divers milieux a. Culture sur une plaque d'extrait de viande-agar-agar (280C, 2 jours) Des colonies circulaires rosâtres à surface luisante sont

formées. Ce sont des colonies entières, convexes et opa-

ques, à structure butyreuse. Aucun pigment soluble n'est

observé.

b. Culture sur une partie inclinée d'extrait de viande-agar-

agar (280C, 1 jour)

Une croissance rosâtre modérée et filamenteuse est observée.

Les colonies sont convexes et opaques avec une surface

luisante. Aucun pigment soluble n'est observé.

c. Culture sur un milieu liquide d'extrait de viande (280C, 2 jours) 8. Une croissance filamenteuse est observée à la surface, avec un trouble homogène, et une certaine précipitation se produit. d. Culture sur un tronçon de gélatine-extrait de viande (24 C, 30 jours)

On observe une croissance à la surface mais pas de liqué-

faction de gélatine.

e. Culture sur du lait de tournesol (28 C, 7 jours) Une petite décoloration se produit à la neutralité et on

n'observe pas de coagulation et de peptonisation du lait.

(3) Caractéristiques physiologiques Réduction de nitrate +

Dénitrification -

Test MR -

Test VP

Formation d'indole -

Formation d'acide sulfhydrique -

Hydrolyse de l'amidon + (faible) Utilisation d'acide citrique + Utilisation de sel d'ammonium + Formation de pigment Insoluble dans l'eau, jaune pâle Uréase + Oxydase + (faible) Catalase +

Formation d'ammoniac à partir d'arginine -

Formation d'acide à partir de glucose (procédé I.C.S.B.)

Par oxydation -

Par fermentation -

Exigence en oxygène Aérobie Test O-F Avec oxydation pH pour la croissance 6,1 -, 7,0 +, 7,9 +, 8,8 +, 9,8 + Température pour la croissance: 4 C -, 10 C -, 20 C +,

28 C ++, 37 C +, 42 C -

Utilisation de sucre

Sucre s'accompagnant d'une formation d'acide: L-arabino-

se, D-glucose, D-fructose.

9. Sucre ne s'accompagnant pas d'une formation d'acide: D-xylose, Dmannose, D-galactose, maltose, saccharose, lactose, D-tréhalose, Dsorbitol, D-mannitol, inositol, glycérol, amidon (ni l'un ni l'autre de ces sucres ne fournit une forma-

tion de gaz).

A partir de ces caractéristiques, on en conclut que le microbe indiqué cidessus appartient au Micrococcus roseus

et c'est une nouvelle souche parce qu'il n'y a pas de liqué-

faction de gélatine, parce qu'il y a une faible hydrolyse

d'amidon et parce qu'il n'y a pas de croissance à une tempéra-

ture en-dessous de 10 C.

Arthrobacter globiformis M-345-2

(1) Caractéristiques morphologiques (partie inclinée d'agar-

agar-extrait de viande, 28 C, 24 heures) Des tiges (0,7-1,0 x 1,5-3,O0) sont reliées pour

former un seul toron ou un double toron qui constitue une let-

tre V et quelquefois on reconnaît une liaison. La motilité et les spores ne sont pas observées. La formation de taches par le test de Gram est positive après incubation pendant 6, 18 et 24 heures. La formation de tache résistant aux acides est négative. Les cellules se transforment en coccus (diamètre 0,7-1,2w) après incubation pendant 3 jours sur un milieu en

pente (partie inclinée) d'extrait de viande-agar-agar et re-

viennent à la forme de tiges par incubation pendant plusieurs

jours dans un milieu liquide d'extrait de viande.

(2) Caractéristiques sur divers milieux a. Culture sur une plaque de viande-agar-agar (28 C, 2 jours) Des colonies circulaires jaunâtres pâles à surface luisante sont formées. Ce sont des colonies entières, convexes et opaques, ayant une structure butyreuse. Aucun pigment

soluble n'est observe.

b. Culture sur une partie inclinée d'agar-agar-extrait de viande (28 C, 1 jour)

Une croissance modérée,jaunâtre et filamenteuse est obser-

vée. Les colonies sont convexes et opaques, à surface

luisante. Aucun pigment soluble n'est observé.

10. c. Culture sur un milieu liquide d'extrait de viande (28 C, 2 jours) Trouble homogène, mais aucune croissance n'est observée,

avec quelques précipitations.

d. Culture sur un tronçon de gélatine-extrait de viande (24 C, 30 jours)

Une croissance en surface est observée mais pas de liqué-

faction de gélatine.

e. Culture sur du lait de tournesol (28 C, 7 jours) On observe une décoloration en milieu alcalin et aucune

coagulation avec peptonisation graduelle.

(3) Caractéristiques physiologiques Réduction de nitrate + Dénitrification Test MR Test VP Formation d'indole Formation d'acide sulfhydrique + Hydrolyse d'amidon Utilisation d'acide citrique + Utilisation de sel d'ammonium + Formation de pigment Uréase + Oxydase + (faible) Catalase +

Aminoacide de parois de cellules Acide glutamique, ala-

Exigence en produit nutritif est stimulée avec des aminoacides) Exigence en oxygène Test O-F pH pour la croissance Température pour la croissance nine et lysine Thiamine (la croissance Aérobie Avec oxydation

6,1 -, 7,0 +, 7,9 ++,

8,8 +, 9,8 +.

C -, 10 C +, 20 C ++,

28 C ++, 37 C ++,

420 C -.

Utilisation de sucre 11. Sucre s'accompagnant d'une formation d'acide: Dfructose,

Sucre ne s'accompagnant pas d'une formation d'acide: L-

arabinose, D-xylose, D-glucose, D-mannose, D-galactose,

maltose, saccharose, lactose, D-tréhalose, D-sorbitol, D-

mannitol, inositol, glycérol, amidon (ni l'un ni l'autre de ces sucres ne fournit de formation

de gaz).

Ces caractéristiques sont directement comparées à l'Arthrobacter globiformis ATCC 8010 et on en conclut que

la souche indiquée ci-dessus M-345-2 se distingue par]'as-

pect positif de la formation de taches par le test de Gram au stade initial de l'incubation (28 C, 6 heures) et par l'exigence en thiamine en tant que facteur de croissance. En

outre, ces souches sont différentes par l'hydrolyse de l'ami-

don et par la réduction de nitrate. Cependant, on ne se réfè-

re à ces différences que sous forme de note, puisqu'on ne

peut pas les reconnaître comme étant des différences remar-

quables entre les souches. A partir du fait indiqué ci-dessus, on en conclut que la souche ci-dessus est une nouvelle souche mutante, à exigence en thiamine, d'Arthrobacter globiformis

ATCC 8010.

Bacillus circulans M-1123-5

(1) Caractéristiques morphologiques (partie inclinée d'ex-

trait de viande-agar-agar, 28 C,24 heures) Des tiges (0,8-1,0 x 2,0-4,50) sont reliées en un

seul toron ou en un double toron. On n'observe pas de moti-

lité, et la formation de taches par le test de Gram est po-

sitive après incubation pendant 24 heures. La formation de

tache résistant aux acides est négative.

En outre, des spores sont formées par culture sur une partie inclinée de soja-agar-agar,après incubation à 28 C pendant 4 jours. Les spores sont à dimension de

0,8-1,0 x 1,5 - 2,O0 et sont cylindriques. Elles sont pla-

cées sur la partie centrale ou légèrement à l'extrémité.Le

sporange est gonflé. La tache des spores est positive.

(2) Caractéristiques sur divers milieux a. Culture sur une plaque de viande-agar-agar (28 C, 2 jours) 12.

Des colonies circulaires, à coloration crème et à surfa-

ce luisante, sont formées, ayant une structure entière,

convexe, opaque et butyreuse. On n'observe pas de pig-

ment soluble.

b. Milieu d'agar-agar-extrait de viande (28 C, 1 jour) On observe une croissance modérée, à coloration crème et

filamenteuse. Les colonies sont opaques, avec unesirfa-

ce luisante.

c. Culture sur un milieu liquide d'extrait de viande (28 C, 2 jours)

On n'observe aucune croissance à la surface mais un trou-

ble homogène.

d. Culture sur un tronçon de gélatine-extrait de viande (24 C, 30 jours) Une croissance à la surface et jusqu'à l'intérieur est

observée. La liquéfaction se déroule peu à peu après in-

*cubation pendant 10 jours.

e. Culture sur du lait de tournesol (28 C, 7 jours)

Aucun changement ne se produit en milieu neutre et l'aci-

dification commence presque le 22ème jour avec coagulation graduelle.

f. Culture sur une partie inclinée de dextrose de Sabouraud-

agar-agar (28 C, 2 jours)

Une faible croissance est observée.

g. Culture sur une partie inclinée de soja-agar-agar (28 C, 2 jours)

Une croissance modérée est observée.

h. Culture sur une plaque d'agar-agar-tyrosine (28 C) Une croissance modérée est observée. Le milieu ne devient

pas marron.

(3) Caractéristiques physiologiques Réductionde nitrate + Dénitrification + Test MR Test VP Formation d'indole Formation d'acide sulfhydrique + 13. Hydrolyse d'amidon Utilisation d'acide citrique Utilisation de sel d'ammonium Formation de pigment Uréase Oxydase Catalase Désamination de phénylalanine pH du bouillon VP 6,1 Lécitinase + + + + + + Exigence en oxygène Aérobie de manière facultative Test O-F Par oxydation + Par fermentation + pH pour la croissance 5,2 -, 6,1 +, 7,0 +, 7,9 ++,

8,8 +, 9,8 -.

Concentration de sel pour la croissance

0,5 % +, 3 % +, 5 % +, 7 % -,

Température pour la croissance

4 C -, 10 C-, 20 C +, 28 C ++,

37 C ++, 42 C +, 52 C -.

Utilisation de sucre

Sucre s'accompagnant de formation d'acide: L-arabinose, D-

mannose, D-glucose, D-fructose, maltose, saccharose, lacto-

se, D-tréhalose, D-mannitol, glycérol, amidon Sucre ne s'accompagnant pas de formation d'acide: D-xylose, D-galactose, D-sorbitol, inositol

(ni l'un ni l'autre sucre ne fournit une formation de gaz).

D'après les résultats indiqués ci-dessus, on en conclut que le microbe cidessus est une souche décrite dans l'ouvrage Manual of Determinative Bacteriology, de Bergey,

8ème édition, page 539 (1974).

Ces champignons ou ces bactéries peuvent être uti-

lisés sous la forme de cellules, de cellules broyées, d'enzy-

me brute, d'enzyme pure, d'enzyme immobilisée ou de prépa-

rations semblables disponibles pour cette acylase.

Les cellules sont produites ordinairement dans des conditions aérobies, par exemple par propagation en milieu 14. liquide avec aération. Le milieu de propagation est une solution aqueuse à pH -de 6 à 8 contenant, par exemple, de la

peptone, un extrait de viande, un extrait de levure, un hy-

drolysat de protéines de soja, un extrait de soja ou une liqueur de mais macérée, comme source d'azote; du sirop, du

glucose ou de la glycérine, comme source de carbone; un phos-

phate, un sel de magnésium ou du chlorure de sodium comme sel

minéral; et, si on l'exige, en présence d'une quantité con-

venable de facteur favorisant la croissance. La propagation est réalisée entre 20 et 400C pendant 10 à 60 heures. Les cellules ainsi préparées peuvent être séparées, par exemple, par filtration ou centrifugation, et lavées, par exemple,

avec de l'eau, de l'acétone, du méthanol ou de l'éthanol.

Lorsqu'une acylase produite par un microorganisme est excrétée à l'extérieur des cellules et s'accumule dans le bouillon de fermentation, l'acylase est rassemblée par addition d'un produit adsorbant au bouillon à partir duquel les cellules ont été retirées, par exemple par filtration,

centrifugation, ou par relargage, par exemple, avec du sul-

fate d'ammonium ou du chlorure de sodium, ou par précipita-

tion par l'addition d'un solvant organique miscible à l'eau, par exemple le méthanol, l'éthanol ou l'acétone, ou par un procédé semblable pour séparer l'enzyme et, si on l'exige,

purifiée par dialyse, absorption, reprécipitation, filtra-

tion sur gel, chromatographie ou par lyophilisation. Un bouillon exempt de cellule peut être utilisé comme source d'acylase.

Dans le cas d'une enzyme intracellulaire, des cel-

lules humides, des cellules sèches ou analogues peuvent être utilisées comme enzymes, ou bien elles peuvent être brisées avec des moyens mécaniques ou par onde ultrasonique et, si on l'exige, mélangées avec un détergent pour séparer l'activité

d'acylase à partir de la masse de cellules.

Dans une utilisation industrielle, l'acylase peut être liée, par exemple, par absorption ou liaison chimique sur un support, par exemple, de l'alumine, de la terre de diatomées, le produit dit Celite, de la bentonite acide, de 15. l'argile activée,du kaolin, du phosphate de calcium, de

l'hydroxyapatite, des fibres, de la cellulose, de l'agar-

agar, une résine échangeuse d'ions, des résines synthéti-

ques, des perles de verre, le produit dit sephalose, le pro-

duit dit sephadex ou de l'agarose pour produire une enzyme immobilisée. Lorsqu'une acylase produite par un microorganisme

est utilisée sous forme d'enzyme absorbée, l'enzyme sépa-

rée dans l'eau ou le bouillon fermenté est mélangée avec un

produit adsorbant par exemple le produit dit celite, le pro-

duit dit dicalite, un gel de phosphate de calcium, de l'ar-

gile active, de la bentonite acide ou un polymère synthéti-

que à pores de grandes dimensions, pour absorber l'acylase, et le produit est filtré et lavé avec de l'eau et utilisé

comme source d'enzyme.

En outre, au lieu d'un copolymère de méthacrylate,

un copolymère d'acrylate, un copolymère de maleate, un copo-

lymère de carboxystyrène, un copolymère de sulfostyrène, de la carboxyméthylcellulose ou des résines échangeuses d'ions peuvent être utilisés sous une forme de sel ou d'acide libre pour produire l'enzyme immobilisée, liée par des ions. Une enzyme immobilisée par une liaison chimique est préparée par un procédé classique, par exemple celui décrit dans l'ouvrage Methods in Enzymology, Volume 44,page 25 (1976) comprenant le procédé à l'halogénure de cyanogène, le procédé à l'oxirane,le procédé à l'acide divinylsulfonique,

le procédé à l'halogénure d'haloacétyle, le procédé au di-

sulfure, le procédé à l'aldéhyde-nitrile, le procédé à la phénylènediamine-cyclohexylisocyanure ou le procédé par

irradiation de rayons y.

Quand la masse de cellules est utilisée comme acyla-

se, les cellules sont immobilisées, par exemple, dans une

résine de polyacrylamide par un procédé classique pour four-

nir une enzyme immobilisée par inclusion.

En utilisant les procédés décrits ci-dessus, les com-

posés suivants peuvent être préparés avec succès: 16.

les produits dits cefaclor, cefacetrile, cefazolin, cefatri-

zin, cefadroxyl, cefapyrin, cefamandole, cefalexin, cefalo-

glycin, cefalothin, cefaloridine, cefaclomezin, cefsulodin,

ceftezol, cefradin, CGP-9000,ainsi que l'acide phénylacéta-

midocéphalosporanique, l'acide phénoxyacétamidocéphalospora- nique, l'amoxicilline, l'ampicilline, la carbénicilline, la phénoxyméthylpénicilline, la phénoxypropylpénicilline et la benzylpénicilline. Le procédé de la présente invention est réalisé

en mettant en contact une acylase avec l'ester (I) et l'aci- de aminoazétidinone carboxylique (II) dans de l'eau, de

préférence entre 20 C et 40 C.

Ordinairement, la concentration d'acide aminoazétidi-

nonecarboxylique (II) est 0,1 à 50 mg/ml, de préférence 5 à 20 mg/ml, et la concentration molaire de l'ester (I) est

1 à 10 fois, de préférence 2 à 5 fois, celle du produit (II).

La concentration del'acide carboxylique (II) peut

être inférieure à 5 mg/ml, en fournissant une réaction ef-

ficace. Dans certains cas, le composé recherché (III) peut être obtenu avec un rendement de plus de 90 %. Le taux de

conversion varie selon les conditions réactionnelles, spé-

cialement selon l'activité enzymatique utilisée par quantité unitaire de la matière de départ. Ordinairement, la réaction

est réalisée entre 35 et 40 C, à un pH de 6 à 8.

L'acylase est mise en contact avec les matières de

départ (I) et (II) en ajoutant une solution aqueuse de l'en-

zyme brute ou purifiée dans le mélange réactionnel, si on le désire.

Des bactéries ou des champignons produisant une acy-

lase efficace intracellulaire ou extracellulaire peuvent être utilisés sous forme de suspension de cellules dans l'eau ou dans un milieu de bouillon, en l'ajoutant dans le milieu réactionnel, pour utiliser cette suspension comme

source d'enzyme.

L'enzyme immobilisée peut être employee en tant que source d'enzyme par un procédé par fournée (discontinu) ou

sur colonne par un procédé classique.

17. Le temps de réaction dans le procédé par fournée, le

débit et la température de réaction dans le procédé sur co-

lonne peuvent être déterminés en observant le rendement

en produit ou la disparition de la matière de départ. Le mé-

lange réactionnel est filtré pour retirer la matière solide, lavé avec un solvant organique pour retirer la substance neutre,par exemple l'ester (I) , et par un procédé classique, par exemple extraction fractionnée, absorption fractionnée,

recristallisation ou chromatographie, pour obtenir la matiè-

re recherchée (III).

La présente invention utilise un nouvel ester de (poly)éthylèneglycol (I) comme source de groupes acyles, cet ester étant librement miscible à l'eau, et la réaction est

réalisée en phase homogène pour éviter la formation de bou-

chon (obturation) dans le cas d'un procédé sur colonne, de manière efficace. Ceci constitue en effet une amélioration

remarquable par comparaison avec la source connue de grou-

pes acyles, les esters méthyliques à faible solubilité (une concentration seulement égale à 1 % d'ester méthylique d'acide 2-thiénylacétique peut se dissoudre dans l'eau), ce qui entraîne une formation de bouchon et inhibe un écoulement régulier. Dans le cas des esters méthyliques connus, une

concentration élevée de substrat bloque la réaction enzyma-

tique. Cependant, la présente invention utilisant un ester (I) soluble dans l'eau,donne la matière recherchée avec un

bon rendement, même pour une telle concentration supérieu-

re. En outre, la présente invention, qui est une synthèse

par voie enzymatique, permet d'avoir une concentration supé-

rieure du substrat ou du produit recherché, ce qui entraîne

une récupération efficace de la matière de départ ou du pro-

duit recherché à partir du mélange réactionnel.

Comme indiqué ci-dessus, la présente invention cons-

titue une synthèse enzymatique de très grande valeur des

D-1actames antibactériens, du point de vue industriel.

Les exemples suivants sont donnés pour présenter

des réalisations détaillées de la présente invention.

18.

EXEMPLE 1

(Bacillus circulans M-1123-5) (Enzyme brute) Un milieu aqueux contenant de l'amidon soluble (0,5 %), une polypeptone (0,5 %) et une liqueur de mals macérée (0,5 %) est réglé à un pH de 7,0 et inoculé avec le Bacillus circulans M-1123-5. Après préincubation à 32 C pendant 24

heures, le bouillon est transféré au môme milieu aqueux (vo-

lume 100 fois plus important) que celui décrit ci-dessus. Le

mélange est agité pendant 42 heures à 32 C. Le bouillon ob-

tenu est centrifugé à 6.500 tours par minute pour retirer les cellules. La liqueur surnageante séparée (5 litres; pH 7,7)

est réglée à un pH de 7 avec de l'acide chlorhydrique, mélan-

gée avec du sulfate d'ammonium pour obtenir une saturation à 70 % et centrifugée. Le précipité est dissous dans de l'eau

désionisée (110 ml) et désalé par dialyse avec de l'eau dé-

sionisée (14 litres). La solution dialysée est centrifugée pour retirer des produits de contamination insolubles. La liqueur surnageante (227 ml) est-lyophilisée pour obtenir

une enzyme brute (1,65 g).

(Activité de liaison de divers supports) Une quantité donnée d'un support indiqué dans le tableau I est mise en suspension dans l'eau et mélangée avec une solution aqueuse à 10 % de bromure de cyanogène,

tout en maintenant le pH à 11 en ajoutant une solution aqueu-

se de soude 4N. Le mélange est agité pendant 10 minutes à

C, filtré et lavé avec de l'eau froide et un tampon phos-

phaté M/30 (pH 8) pour obtenir un support activé.

Le support activé est ajouté à une solution aqueuse

de l'enzyme brute et maintenu à 4 C toute la nuit. L'enzy-

me immobilisée produite est rassemblée par filtration, lavée totalement avec un tampon phosphaté M/30 et emmagasinée à la

température ambiante.

(Détermination de capacité d'acylation par le procédé par fournée) Dans une solution d'acide 7-aminocéphalosporanique

(ci-après appelé 7-ACA) (15 mg), et d'ester de tétraéthylène-

19. glycol d'acide 2- thiénylacétique (ci-après appelé TA-tétra) (75 mg) dans un tampon phosphaté M/20 (5 ml), on ajoute une enzyme immobilisée préparée ci-dessus. Le mélange est agité à 37 C pendant 40 minutes. Le produit dit cephalothin obtenu est déterminé par l'évaluation d'activité antibactérienne

vis-à-vis du Bacillus subtilis PCI-219.

(Détermination de capacité d'acylation par le procédé sur colonne) Une solution mélangée composée de 7-ACA (5 mg/ml),de TA-tétra (25 mg/ml) et de tampon phosphaté M/20 (pH 7,0) est passée à travers une colonne de l'enzyme immobilisée, à 37 C, suivant un débit de 25 ml/h. Le CET produit dans l'éluat est estimé par l'évaluation antibactérienne contre le Bacillus

subtilis PCI-219 pour calculer le taux de conversion.

Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau I

TABLEAU I

Préparation et activité d'enzyme immobilisée Support CD rd t7i D0 id I 0

O b qO-

Condition \a u eu %de BrCN (ml) 30 30 30 30 30 60 \l P U} 0 Cd o4 'OU t M Support lOml 1 g 1 g lOml 1 g 20ml $) Suspension (ml) 10 10 10 10 20 40 A Solution aqueuse à O de BrCN(ml) 30 30 30 30 30 60 o Solution aqueuse d'enzyme brute (ml) 18 18 18 18 16 36 Rapport de protéine liée (%) 89,1 52,3 25,3 26,3 82,2 87,5 Protéine liée à M l'état humide (g) 4 3,2 4 8,3 12,5 21 - Enzyme immobilisée à oZl'état humide (mg) 111 89 61 230 390 290 oo Taux de conversion

P " 7-ACAICET (%) 85 62 4 92 67 101

Id Enzyme immobilisée à ]0 ol'état humide (ml) - - - 11 - 13 o 0Taux de conversion t l 7-ACA-CET (%) - - - 75,2 - 87,6 20. (Réactivité des TAesters) 1. Procédé par fournée Dans une solution de 7-ACA (30 mg) et de TA-esters (quantité donnée) dans un tampon phosphaté M/10 (pH 7,0) (10 ml) , on ajoute une enzyme immobilisée (0,9 g) sur le produit dit Sephalose 4B, et le mélange est agité à 37 C pendant 3 heures. La concentration de CET dans le mélange

réactionnel est estimée par évaluation d'activité antibac-

térienne contre le Bacillus subtilis PCI-219 et le taux de conversion du 7-ACA en CET est calculé. Les résultats sont

indiqués dans le tableau II.

TABLEAU II

Réactivité des TA-esters par le procédé par fournée

I \

/S25 CH2COOR

1) R = -(CH2CH20)4H

2) R = -(CH2CH20)5H

3) R = -(CH2CH20)8H

4) R = -(CH2CH20)4CH

) R = -(CH2CH20)8 4CH3

) R = - (CH2CH20) 8CH 3

6) R = -CH2CHOHCH20H

2. Procédé sur colonne Une solution de 7-ACA (5 mg/ml) et de TA-ester du tableau suivant dans un tampon phosphaté M/20 est passée à Esters Quantité Taux de initiale conversion (mg/ml) (%) TA-tétraester1) 15,0 77, 1 TA-pentaester2) 10,2 80,6 TA-octaester3 17,7 76,2 4) Ether méthylique de TA-tétraester) 15,7 73,3 Ether méthylique de TA-octaester5) 24,0 68,2 TA-ester de glycérine6) 23,3 73r7 21.

travers une colonne d'enzyme immobilisée (12 ml), à 37 C, sui-

vant un débit de 25 ml/h. La concentration du CET dans

l'éluat est déterminée-par évaluation d'activité antibacté-

rienne contre le Bacillus subtilis PCI-219 afin d'estimer le rendement indiqué dans le tableau III,dans l'état d'écoule-

ment laminaire.

TABLEAU III

Réactivité des TA-esters par le procédé sur colonne

Taux de con-

TA-esters version ____ ____ ___, ___ ___ ____ __ i7-ACA+CET (%) Sepha- Gel

Type mg/ml lose d'agar-

4B agar TA-tétraester1) 25,0 87,6 85,0

TA-pentaester2) 17,0 69,9 -

Ether méthylique de TA-tétraester4) 29,6 86,5 86,5 Ether méthylique de TAoctaester5) 26,1 69,8 69,8

TA-ester de glycérine6) _ 55,0 82,0 -

Pour les notes 1) à 6), voir sous le tableau II (Immobilisation d'enzyme purifiée) Dans un milieu aqueux (pH 7,0) contenant de l'amidon soluble (0, 5 %) de la peptone (0,5 %) et de la liqueur de

mais macérée (0,5 %), on inocule le Bacillus circulans M-

1123-5 et on agite pendant 24 heures à 32 C. Le produit de préincubation préparé est ajouté dans un volume 100 fois plus grand de milieu aqueux ayant la même composition que celle indiquée ci-dessus, et on agite à 32 C pendant 2 jours. Le bouillon est centrifugé pour retirer les cellules, dilué avec une solution aqueuse de sulfate d'ammonium à 70 %

pour relarguer la fraction de protéine. La fraction ebt dia-

lysée pour retirer les sels et lyophilisée pour donner l'en-

zyme brute. L'enzyme brute ainsi obtenue (1,1 g) est dissou-

te dans un tampon phosphaté M/100 (pH 8,0) (200 ml) et chro-

matographiée à travers une colonne-de diéthylaminoéthylcel-

lulose (produit dit Whatman-DE 52: diamètre24 mm x 160 mm: 73 ml) par l'élution par gradient d'une solution acqueuse de 22. chlorure de sodium(de 0 à 0,6 M). Les fractions actives sont

rassemblées, concentrées avec le sac de collodion dit SM-

13200 (produit de la société dite Zartorius Co.) et dialysées

pour donner une solution aqueuse purifiée d'enzyme (35 ml).

Dans cette solution, on ajoute du gel d'agar-agar à 4 % (for- me de perles) (20 ml) activé avec du bromure de cyanogène, et le mélange est agité toute la nuit pour réagir en formant une enzyme immobilisée. Le produit est lavé totalement avec du tampon phosphaté M/30 (pH 7,0) contenant du chlorure de

sodium 0,5 M pour obtenir l'enzyme immobilisée.

A travers une colonne de cette enzyme solide (14,1 ml) remplie dans une colonne à diamètre de 10 mm, on fait

passer une solution de tampon phosphaté M/20 (pH 7,0) conte-

nant du 7-ACA (10 mg/ml) et de l'éther méthylique de TA-oc-

taester (voir note 5 sous le tableau II) (142,2 mg/ml), à 370C, suivant un débit de 16 ml/h. Le volume d'éluat et le taux de conversion 7-ACA-CET sont tels que présentés dans

le tableau IV suivant.

TABLEAU IV

Capacité d'acylation d'enzyme pure immobilisée t'- w na 0% tn u1 co Eluat (ml) 9 173 [306 3405 731 782 917 1089 11561294 T14321534 Taux de conver-8 85, 3i sion 7-ACA+CET i

(%) 84,8,2 85,3 90,485,7 86,388,5 86,986,682,51 83,182,0

__ i__ _ 24.

Dans la gamme observée, le taux de conversion de-

meurait au même niveau, ce qui montre une activité enzyma-

tique presque constante.

L'éluat contient, en plus du CET recherchér l'éther méthylique de TAtétraester et l'acide 2-thiénylacétique, chacun pouvant être récupéré avec des rendements de 90 à 95 % de 60 à 85 % et de 8 à 10 % par rapport aux substances dans l'éluat. (Enzyme absorbée)

- Dans un milieu aqueux (pH 7,0) contenant de l'ami-

don soluble (0,5 %), de la peptone (0,5 %) et de la liqueur de mais macérée (0,5 %), on inocule le Bacillus circulans M-1123-5 et on le soumet à une préincubation à 32 C pendant 24 heures. Le produit préincubé (1 partie) est ajouté à un milieu aqueux (100 parties) ayant la même composition, et

on amène le mélange à se propager à 32 C pendant 24 heures.

Le bouillon est centrifugé pour retirer les cellules, réglé à un pH de 7, 0 en ajoutant une solution aqueuse de soude 1N, mélangé avec 1/50ème de son poids du produit dit Celite 560 (distribué par la société dite JohnsManville Sales Co.),

agité entre 0 et 4 C pendant 40 minutes et filtré. La frac-

tion solide est lavée avec un tampon phosphaté M/20 pour ob-

tenir une enzyme absorbée immobilisée.

A travers une colonne de cette enzyme absorbée (4 g) remplie dans un tube à diamètre de 10 mm, on fait passer une

solutionv-de 7-ACA (5 mg/ml) et de TA-tétraester dans un tam-

pon phosphaté M/20 à 37 C,suivant un débit de 25 ml/h. Durant le passage de 75 ml de la solution, le CET produit formé est estimé par évaluation d'activité antibactérienne contre le Bacillus subtilis PCI-219. Les résultats sont donnés dans le tableau V en fonction du taux de conversion (%) à partir

du 7-ACA.

246S708

25.

TABLEAU V

Capacité d'acylation d'enzyme absorbée sur le produit dit Celite 560 TAtétraester (mg/ml) 25 25 25 18,8 12,5 pH 6,0 7,0 8,0 7,0 7,0 Taux de conver- Dans l'éluat 62,8 72,9 71,6 63,0 63,0 sion 7-ACA±CET Sel de sodium (%) isolé 48,5 67,2 49,3 64,2 53,0

-- _..

(Isolement du produit à partir du mélange réactionnel) Un mélange réactionnel est d'abord extrait trois fois avec à chaque fois le même volume d'acétate d'éthyle pour récupérer les TA-esters dans la solution d'extrait. La couche aqueuse restante est acidifiée à un pH de 3,6, lavée avec de l'éther, réglée à un pH de 2,0 et extraite avec de l'acétate d'éthyle. La couche aqueuse contient le 7-ACA.La seconde solution d'extrait est 1 avée avec une s olution saline saturée, séchée sur du sulfate de sodium et concentrée sous vide. La solution concentrée d'acétate d'éthyle est mélangée avec du 2-éthylhexanoate de sodium (environ 1,5 équivalent molaire), on la laisse au repos à 4 C pendant 24 heures et on

la filtre pour rassembler le sel de sodium de CET.

Par ce procédé, on peut récupérer environ 80 à 95 %

de CET dans le mélange réactionnel.

(Sélectivité des acylases) (Enzyme immobilisée) Selon les procédés indiqués ci-dessus, le Bacillus circulans M-1123-5, l'Arthrobacter globiformis M-345-2 ou l'Arthrobacter flagerum M-2183-1 est cultivé et filtré pour obtenir un bouillon de culture exempt de cellule. Le bouillon

est traité avec du chlorure de sodium pour relarguer la frac-

tion enzymatique, qui est rassemblée, dialysée et chromato-

graphiée sur une colonne de diéthylaminoéthylcellulose pour obtenir une enzyme partiellement purifiée. Cette dernière

est traitée avec du gel d'agar-agar a 4 % activé par du bro-

mure de cyanogène.

26. (Solution réactionnelle) Dans une solutiond'un ester (I) (45 mg) et d'acide aminoazétidinonecarboxylique (II) (9 mg) dans un tampon phosphaté M/20 (pH 6 à 7) (3,0 ml), on ajoute une enzyme immobilisée (0,15 à 0,5 g) et on agite à 37 C pendant 3 heu- res 45 minutes. Apres la réaction, le mélange est filtré à

travers un tampon de coton, et le filtrat obtenu est véri-

fié par un chromatogramme sur couche mince et par un procédé d'évaluation sur disque de papier, en utilisant le Bacillus

subtilis PCI-219 comme microorganisme expérimental,pour dé-

tecter et déterminer chaque produit. Les résultats sont

indiqués dans le tableau VI.

TABLEAU VI

RCOO(CH CHO) Y

X

HN-Q 2 RCONH-Q

x

*H2N-Q > RCONH-Q

R Y Q R f B.circulansA.globi- A.fragerum M-1123-5 iformis M-2183-1 n nM345-2 ICLCH2- |H s 0,7 49,6 23,2 28,5 l|4 t/0X CCH3 i l1 tV CH-H < S 0,72 36,1 16,5 5,6 ri--il CH o 3 COOH --j NI os n o- Co TABLEAU VI (Suite)

I S- CH2-

H

LCN O H

COOH 0,54 6,0 k CN2-SHX N X 0,63 40,2 25,1 23,0

CHO,2.

4 Os sC 4i COOH H o 0,71 36,2 10,1 16,1 CH-,

2 - N OCCH3

4 O S. 2 Il 3 avec de la 4,e3N \ CH pênicillinase COOH _.. oo 0% VI o

j-0CH2 -

H TABLEAU VI (Suite)

N CH3

COOH 0,71 + + H S CH 0,71 Décomposition 21,0 80,2 CH&>t \ / 3 avec de la a >-OCH 2-4# - CH3pénicillinase

0 3

COOH

N1 CH3 S -N 0,5 55,7 43,7 51,9

N<N -CH2- 5 > N XS S A CH

3

COOH

CH3 S

2 N CH 0,13 29,6 10,6

NH2 COOH x Plaque de Si02/acétone: acide acétique: eau (95: 5: 10 en volume/volume) Nw N o co co 30.

EXEMPLE 2

(Arthrobacter globiformis M-345-2) (Enzyme immobilisée) Dans un milieu aqueux (pH 7,0) contenant du glucose (0,5 %) de la peptone (0,5 %) et de la liqueur de mais macé- ree (0,5 %), on inocule l'Arthrobacter globiformis M-345-2

et on soumet à une préincubation à 28 C pendant 24 heures.

Ensuite, le bouillon est ajouté à 100 volumes de milieu aqueux ayant la même composition et soumis à une propagation à 28 C pendant 2 jours. Apres avoir retiré le mycélium par

centrifugation, le bouillon (530 ml) est mélangé avec une so-

lution aqueuse de sulfate d'ammonium à 70 % pour relarguer le précipité, qui est purifié par chromatographie sur colonne sur de la diméthylaminoéthylcellulose, concentré avec un sac de collodion et dialysé pour donner une solution d'enzyme purifiée (24 ml). Dans cette solution (19 ml), on ajoute du gel d'agar-agar à 4 % (10 ml) ou le produit dit Sephalose

4B (10 ml), chacun ayant été activé avec du bromure de cya-

nogène à 10 % comme dans l'exemple 1, et on fait réagir le

mélange toute la nuit. Le produit est rassemblé par filtra-

tion et lavé avec de l'eau et du tampon phosphaté M/30 pour

donner une enzyme immobilisée.

A travers une colonne de cette enzyme immobilisée (10 ml) remplie dans un tube d'un diamètre de 10 mm, on fait passer à 37 C une solution de 7-ACA (quantité donnée) et de TA-tétraester (120 mg/ml) dans un tampon phosphaté M/20 (pH 7,0), suivant un débit de 25 ml/h. La quantité de CET dans l'éluat est estimée par évaluation antibactérienne contre le Bacillus subtilis PCI-219 et on l'indique dans le tableau

VII sous forme de taux de conversion de 7-ACA en CET.

31.

TABLEAU VII

Capacité d'acylation d'enzyme immobilisée à partir d'Arthro-

bacter globiformis M-345-2 7-ACA TA-ester mg Support Taux de conversion 1 mg/ml TA-tétraester 120 Sephalose 83,7 % 4B 2 TA-tétraester 120 Sephalose 71,0 4B 3 TA-tétraester 120 Sephalose 56,3

4B _

1 TA-têtraester 114 Sephalose 78,5 4B

1 Ether méthyli-

que de TA-oc-

taester 114 Gel d'agar- 76,5 agar

1 Ether méthyli-

que de TA-oc-

taester 60 Gel d'agar- 80,5 agar

EXEMPLE 3

(Micrococcus luteus M-331-1) (Mycélium) 2C Dans un milieu aqueux contenant de l'amidon soluble (0,5 %), de la peptone (0,5 %) et de la liqueur de mais macérée (0,5 %), on inocule du Micrococcus luteus M-331- 1,

et le milieu est préincubé à 28 C pendant 24heures. Le bouil-

lon est ajouté dans un milieu aqueux (100 volumes) ayant la même composition que celle indiquée ci-dessus et soumis à

l'incubation pendant 3 jours à 28 C. Le bouillon est neutra-

lisé avec de l'acide chlorhydrique jusqu'à un pH de 7, centrifugé pour rassembler les cellules,lavé avec de l'eau, et séché par lavage avec de l'acétone pour donner 1.302 g

de cellules sèches.

Les cellules séchées (26 mg) sont mises en suspen-

sion dans de l'eau (1,5 ml), diluées avec une solution de 7-

ACA (4 mg/ml) et de TA-tétraester (20 mg/ml) dans un tampon phosphaté M/5 (pH 7,0) (0,5 ml) et agitées pendant 3 heures 3 à 37 C pour produire du CET suivant un taux de conversion

d'environ 30 %.

32. (Cellule immobilisée emprisonnée dans du gel d'acrylamide) Dans une solution d'acrylamide monomère (750 mg) et

de N,N'-méthylènebisacrylamide (40 mg) dans un tampon phos-

phaté M/20 (pH 7,0) (4 ml), on met en suspension ces cellu-

les sèches (1 g). Dans cette solution, on ajoute du 3-dimé-

thylaminopropionitrile à 5 % (0,5 ml) et une solution aqueu-

se de persulfate de potassium à 1 % (0,5 ml), et on laisse

le mélange reposer à 25 C pendant 30 minutes. Le gel pro-

duit est broyé avec un mélangeur et les particules produi-

tes à dimension de plus de 0,149 mm (100 mesh) sont rassem-

blées, remplies dans un tube à diamètre de 10 mm, et lavées

avec un tampon phosphaté M/20 (pH 7,0) pour donner une co-

lonne (10,2 ml) de cellules immobilisées.

A travers cette colonne, on fait passer une solu-

tion de 7-ACA (1 mg/ml) et de TA-tétraester (30 mg/ml ou 6 mg/ml) dans un tampon phosphaté M/30 (pH 7,0), suivant un débit de 25 mg/h, et la quantité de CET dans l'éluat est estimée par évaluation d'activité antibactérienne contre le Bacillus subtilis PCI-219, en obtenant un taux de conversion

de 31,2 à 34,1 % et de 28,6 à 32,5 %.

EXEMPLE 4

(Xanthomonas axonopcdis M-621-1) Dans un milieu aqueux (pH 7,0) (100 ml) contenant de l'extrait de viande (1,0 %), de la polypeptone (1,0 %) et du chlorure de sodium (0,5 %) places dans un flacon de Sakaguchi de 500 ml, on inocule du Xanthomonas axonopodis M-621-1 et on agite pendant 2 heures à 28 C. Le bouillon est déversé dans un milieu (700 ml) ayant la même composition, dans un flacon de Mayer de 3 litres. Apres agitation à 28 C

pendant 41 heures, le bouillon est inoculé dans six dispo-

sitifs de fermentation, en forme de flacon de 30 litres chacun, contenant 15 litres de milieu aqueux ayant la même composition. La propagation est poursuivie pendant 2 jours à 28 C. Le bouillon est filtré pour rassembler des cellules

humides (1.320 g). La liqueur résultante est mise en suspen-

sion dans un tampon phosphaté 0,1 M (pH 7,0) (8 litres), dé-

chiquetée avec le produit dit Dynomil (produit de la société 33. dite Wiley A. Bahoffer Manufacturing Engineers Co.) pour obtenir une solution d'extrait enzymatique. Une partie de cette solution d'extrait (2,4 litres) est traitée avec du phosphate de calcium et centrifugée pour fournir une liqueur active surnageante. Cette dernière est passée à travers le produit dit Amberlite CG-50 (résine échangeuse de cations, faiblement acide), équilibré avec un tampon phosphaté 0,01 M (pH 6,0) pour emprisonner l'enzyme, qui est éluée avec un

tampon phosphaté 0,2 M contenant du chlorure de sodium 1M.

L'éluat est traité avec le produit dit Sephalose 4B (100

ml) activé avec du bromure de cyanogène par un procédé sem-

blable aux exemples précédents. Le rapport de liaison de

l'activité enzymatique est 40 %.

Dans une solution d'éther méthylique d'ester de dié-

thylèneglycol de la D-phénylglycine (45 mg) et d'acide 7-

aminodésacétoxycéphalosporanique (3 mg), on ajoute l'enzyme solide (0,15 g) et le mélange est agité à 37 C pendant 3 heures et demie. Le mélange réactionnel est filtré à travers un tampon de coton. Le produit dit cephalexin obtenu dans le filtrat est évalué par le procédé sur disque de papier, et

le taux de conversion à partir d'acide 7-aminocéphalospora-

nique pour fournir le produit dit cephalexin est calculé,ce

qui fournit une valeur de 26,3 %.

EXEMPLE 5

(Micrococcus roseus M-1054-1) Dans un milieu aqueux (pH 7,0) (100 ml) contenant du glucose (0,5 %), de la polypeptone (0,5 %) et de la liqueur de mais macérée (0,5 %), on inocule le Micrococcus roseus M-1054-2, et le milieu est agité pendant 3 jours à 28 C. Le bouillon est réglé à un pH de 7,0. Le bouillon (4,5

ml) est ajouté à une solution de 7-ACA (3 %) et (i) de l'es-

ter de glycérine d'acide 2-thiénylacétique, (ii) de l'ester de tétraéthylèneglycol d'acide 2-thiénylacétique ou (iii) de l'ester d'octaéthylèneglycol d'acide 2-thiénylacétique dans un tampon phosphaté 0, 2 M (0,5 ml) pour fournir une

réaction pendant 3 heures et demie à 37 C. Le mélange réac-

tionnel est centrifugé pour retirer les cellules et la li-

34. queur surnageante est évaluée par le procédé d'évaluation sur disque de papier vis-à-vis du Bacillus subtilis PCI-219,

ce qui fournit les valeurs suivantes du produit dit cephalo-

thin obtenu: (i) 34 y/ml (ii) 26 y/ml (iii) 22 y/ml

EXEMPLE 6

On indique dans ce qui suit des procédés pour la

synthèse d'esters disponibles pour les procédés enzymati-

ques indiqués précédemment.

1. Esters d'acide 2-thiénylacétique (1) Ester de glycérine Un mélange de glycérine (9,2 g), d'ester méthylique

d'acide 2-thiénylacétique (3,12 g) et de carbonate de po-

tassium (0,1 g) est chauffé à 40 C pendant 2 heures sous

pression réduite,alors qu'on fait passer de l'azote à tra-

vers un tube capillaire. Le mélange réactionnel est dilué avec de l'eau (60 ml) et extrait avec de l'acétate d'éthyle (100 ml). La solution d'extrait est séchée sur du sulfate

de magnésium et concentrée pour donner de l'ester de gly-

cérine d'acide 2-thiénylacétique (3,55 g) sous forme

de matière huileuse.

Chromatographie sur couche mince: Rf = 0,23 (benzène-acé-

tate d'éthyle (t: 5)/SiO2).

nD0= 1,5405.

IR: film 3400, 1740, 1175, 705 cm-1 max

Analyse calculée pour C9H1204S: C 49,98; H, 5,59; S 14,82.

Trouvé: C 49,86; H, 5,69; S 14,79.

(2) Ether méthylique d'ester de pentaéthylèneglycol

Un mélange d'éther monométhylique de pentaéthylène-

glycol (3,5 g), d'ester méthylique d'acide 2-thiénylacétique (1,32 g) et de carbonate de potassium (74 mg) est chauffé à

40 C pendant environ 2 heures sous une atmosphère d'azote.

Le mélange réactionnel est purifié par chromatographie sur

du gel de silice pour donner de l'éther monométhylique d'es-

35. ter de pentaéthylèneglycol d'acide 2-thiénylacétique (4,6 g)

à partir des fractions éluées avec de l'acétate d'éthyle.

Chromatographie sur couche mince: Rf = 0,22 (benzène-acé-

tate d'éthyle (1: 5)/SiO2).

nD = 1,4920.

IR: Vfilm 1740, 1110, 705 cm-

max

Analyse calculée pour C17H2807S: C 54,23; H 7,49; S 8,51.

Trouvé: C 54,38; H 7,35; S 8,74.

(3) Ester de tétraéthylèneglycol Dans une solution de tétraéthylèneglycol (40 g) dans du tétrahydrofurane (80 ml) et de la triéthylamine (6,23 g), on ajoute goutte à goutte une solution de chlorure d'acide 2thiénylacétique (point d'ébullition 112-113 C/25

mm Hg) (9,48 g) dans du tétrahydrofurane (20 ml) avec agita-

tion, en refroidissant par de la glace. Après agitation pen-

dant une heure, le mélange est filtré pour retirer la matière solide séparée. Le filtrat est concentré à 40 C sous une atmosphère d'azote pour obtenir 48,6 g de résidu. Ce dernier est dilué avec de l'eau (100 ml) pour précipiter la matière O insoluble. La liqueur surnageante est séparée et extraite

avec de l'acétate d'éthyle. La solution d'extrait est con-

centrée sous pression réduite dans un courant d'azote pour fournir de l'ester de tétraéthylèneglycol d'acide 2-thiényl-

2? acétique (9,06 g). Ce dernier ne contient pas d'w,w'-diester.

Chromatographie sur couche mince: Rf = 0,17 (benzène-aceta-

te d'éthyle (1: l)/SiO2).

film -1 20

IR: vmax 3440, 1735, 1120 cm. nD = 1,5080.

Analyse calculée pour C14H2206S: C 52,81; H 6,96; S 10,07.

O trouvé:C 52,62; H 7,06; S 10,09.

RMN: 5CDC13 5,28brslH, 3,86s2H, 3,63-4,36ml6H, 6,90-6,96

PPM m2H, 7,15-7,31mlH.

(4) Ether monométhylique d'ester de polyéthylèneglycol (par-

tie 1) De l'éther monométhylique de polyéthylèneglycol (produit de la société dite Nippon Yushi Kabushiki Kaisha, connu sous l'appellation commerciale Uniox M-210, ayant un 36. poids moléculaire moyen de 201) est chauffé sous 2 mm Hg pour en faire évaporer environ le tiers. Dans le liquide restant (15 g), on ajoute de l'ester méthylique d'acide 2thiénylacétique (3,1 g) et du carbonate de potassium (51 mg) et on chauffe à 80 C sous pression réduite sous une atmosphère d'azote. Après 3 heures et demie, le contenu est purifié par chromatographie sur du gel de silice (passant à travers un tamis à ouvertures de mailles comprises entre 0,210 mm et 0,063 mm, soit 70 à 230 mesh, 250 ml). Les fractions éluées avec un mélange de benzène et d'acétate

d'éthyle (1: 1) sont concentrées pour donner de l'éther mo-

nométhylique d'ester de polyéthylèneglycol d'acide 2-thiényl-

acétique (n = 4 à 13; principalement n = 7, 8 et 9).

(5) Ether monométhylique d'ester de polyéthylèneglycol (par-

tie 2)

Un mélange d'éther monométhylique de polyéthylènegly-

col (produit de la société dite Nippon Yushi Kabushiki Kaisha, connu sous l'appellation commerciale Uniox M-400, poids moléculaire moyen 400) (40 g) , d'ester méthylique d'acide 2-thiénylacétique (3,12 g) et de carbonate de potassium (0,123 g) est chauffé à 75 C sous pression réduite sous une atmosphère d'azote. Après 3 heures, le mélange réactionnel est dilué avec de l'eau (150 ml) et extrait avec de l'acétate d'éthyle. La solution d'extrait est séchée sur du sulfate de sodium, concentrée sous vide et chromatographiée sur du gel de silice (40 fois son volume). Les fractions éluées avec un mélange d'acétonitrile et d'eau (95: 5) sont rassemblées et concentrées pour donner de l'éther monométhylique d'ester de polyéthylèneglycol d'acide 2-thiénylacétique (n = 4 à 13,

principalement n = 8).

II. Esters d'autres acides

Par remplacement d'esters grâce à un procédé sembla-

ble à (1) à (5) indiqué ci-dessus, on peut obtenir les compo-

sés suivants: 1. l'ester de tétraéthylèneglycol d'acide phénylacétique 2. l'ester de tétraéthylèneglycol d'acide phénoxyacétique 3. l'éther monométhylique d'ester de pentaéthylèneglycol 37. d'acide tetrazolylacétique 4. l'éther monométhylique d'ester de diéthylèneglycol de phénylglycine. La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de variantes et de modifications

qui apparaîtront à l'homme de l'art.

38.

Claims (11)

REVENDICATIONS

1 - Procédé de synthèse enzymatique d'une pénicil-

line ou d'une céphalosporine à partir de son amine sur le noyau par l'action d'une amido-acylase, caractérisé en ce qu'on utilise, en tant que source de groupes acyles, un es- ter ayant la formule suivante: RCOO(CH2CHO)nY (I) X

(o RCO est ungroupe acyle pour une chaîne latérale de péni-

cilline ou de céphalosporine; X est un atome d'hydrogène, un groupe alkyle inférieur ou un groupe hydroxyalkyle inférieur;

Y est un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle infé-

rieur; et n est un nombre entier positif).

2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé

en ce que l'amine sur le noyau est un composé ayant la formu-

le H2N-Q et la pénicilline ou la céphalosporine recherchée est un composé de 3-lactame ayant la formule RCONH-Q, o Q est un noyau de pénicilline ou de céphalosporine représenté par la formule suivante: 3 ou. tH3 0 Z 2O

0H COOH

(o Z est un atome d'hydrogène ou d'halogène, un groupe nu-

cléophile, un groupe méthyle, un groupe halométhyle ou un groupe méthyle substitué par un groupe nucléophile); et

RCO est tel que défini dans la revendication 1.

3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que X est le groupe hydroxyméthyle, Y est l'hydrogène

et n vaut un.

4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que X et Y sont des atomes d'hydrogène et n vaut 4 à 15. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que X est l'hydrogène, Y est un groupe alkyle inférieur 39.

et n vaut 4 à 15.

6 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé

en ce que Y est le groupe méthyle.

7 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'acylase est une amido-acylase d'origine bactérien-

ne ou fongique.

8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé

en ce que l'acylase est une enzyme immobilisée.

9 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit est choisi parmi ceux connus sous les appellations cefaclor, cefacetrile, cefazolin, cefatrizin, cefadroxyl, cefapyrin, cefamandole, cefalexin, cefaloglycin, cefalothin, cefaloridine, cefaclomezin, cefsulodin, ceftezol,

cefradin, CGP-9000, ainsi que parmi l'acide phénylacétamido-

céphalosporanique, l'acide phénoxyacétamidocéphalosporanique,

l'amoxicilline, l'ampicilline, la carbénicilline, la phéno-

xyméthylpénicillinet la phénoxypropylpénicilline et la ben-

zylpénicilline. - Composé, caractérisé en ce qu'il a la formule: RCOO(CH2CHO)nY X o R, X, Y et n sont tels que définis dans la revendication 1.

1l - Composé selon la revendication 10, caractéri-

sé en ce que X est le groupe hydroxyméthyle, Y est l'hydro-

gène et n vaut 1.

12 - Composé selon la revendication 10, caractéri-

sé en ce que X est l'hydrogène, Y est l'hydrogène ou le

groupe méthyle et n vaut 1 à 20.

13 - Composé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'on l'utilise comme source de groupes acyles de

l'acylation enzymatique indiquée dans la revendication 1.

14 - Composé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'on l'utilise sous forme d'un mélange de composés

à diverses valeurs de n dans la réaction d'acylation.