FI99027C - Menetelmä kliinisen näytteen riittävyyden määrittämiseksi - Google Patents

Description

1 99027

MENETELMÄ KLIINISEN NÄYTTEEN RIITTÄVYYDEN MÄÄRITTÄMISEKSI

TEKNINEN ALUE

Tämä keksintö liittyy infektiotautidiagnostiikassa käytettäviin hybridisaatiotesteihin ja sen kohteena on menetelmä nukleiinihappo-hybridisaation avulla suoritettavassa infektiotaudin määrityksessä käytettävän kliinisen näytteen riittävyyden määrittämiseksi sekä reagenssi menetelmän suorittamiseksi.

KEKSINNÖN TAUSTA

Nukleiinihappohybridisaatioon perustuvat diagnostiset menetelmät tulevat yhä tärkeämmiksi kliinisessä diagnostiikassa. Hybridisaatioon perustuvia menetelmiä on hyödynnetty erityisesti infektiotautidiagnostiikkassa.

Sellaisten virusten kohdalla, jotka eivät ilmennä proteiinejaan tai jotka ovat integroituneet isäntäsolun genomiin, nukleiinihappohybridisaatio on ainoa käytettävissä oleva diagnostinen menetelmä.

Ihmisen papillomavirukset (HPV), joita pidetään kohdunkaulan neoplasian ja invasiivisen karsinooman etiologisena tekijänä, muodostavat diagnostisen ongelman, koska niitä ei voi kasvattaa in vitro eikä viruksen antigeenejä voida luotettavalla tavalla määrittää näytteistä. Ihmisen kohdunkaulan papillomavirusinfektiot määritetään joko Papanicolaou-näytettä (papa) vastaavasta kliinisestä näytteestä kuten ekso- tai endokervikaalisesta ·’..** irtosolunäytteestä, tai genitaalialueen kudosnäytteestä. Näytteeseen saatu solumäärä on kuitenkin usein riittämätön, mikä johtaa vääriin negativisiin : tuloksiin hybridisaatiotestissä.

• · « • « • # *:* Papa-näytteen luotettavuus ja riittämättömän solumäärän aiheuttamat :.:V ongelmat ovat jo pitkään olleet tunnistettuja ongelmia sytopatologian alalla, jossa on ponnisteltu näytteenottomenetelmien kehittämiseksi. Katso esim.

Greening (Diagnostic Cytopathology, Voi. 1, No. 1,1985) ja Yobs et ai., (Obstetrics & Gynecology, Voi.65, No.2, 1985).

2 99027

Molekyylidiagnostiikassa, so. hybridisaatiotesteissä, näytteen edustavuus on vielä kriittisempi tekijä kuin sytologisessa testissä, koska hybridisaatiotesteissä, in situ hybridisaatiotestejä lukuunottamatta, ei suoriteta mikroskooppista evaluointia. Julkaisussa Vermund et ai. (Am.J.Obstet.Gynecol.,

Voi.160, No.2, 1989) kuvataan parannettu menetelmä solunäytteiden keräämiseksi ihmisen papillomaviruksen määrittämiseen tarkoitettua molekyyli-diagnostista testiä varten. Tässä julkaisussa painotetaan näytteen edustavuuden tärkeyttä HPV infektioiden seulonnassa.

Suomessa suoritetussa tutkimuksessa (Parkkinen et ai., Gynecologic Oncology, 30, 251-2, 1988) tutkittiin kerroshybridisaatioon ja in situ hybridisaatioon perustuvien testien herkkyyttä ja käyttökelpoisuutta kohdunkaulan HPV infektioiden rutiinidiagnostiikassa. Tämä tutkimus korosti näytteen laadun tärkeyttä. Koska irtosolunäytteiden riittävyyden määrittäminen oli vaikeaa, Parkkinen et ai. sisällyttivät kerroshybridisaatiotestiinsä sisäisen standardin, jolla mitattiin näytteen todellista solusisältöä. Solumäärä arvioitiin suorittamalla rinnakkainen kerroshybridisaatioon perustuva testi, jossa käytettiin yksittäisenä kopiona esiintyvän ihmisen pro-alfa2(l)-kollageeni-geenin tunnistavia reagensseja. Tämänkaltaisen sisäisen standardin mukaanottaminen osoitti, että riittävään irtosolunäytteeseen vaaditaan 500.000 solua. Parkkinen et ai. päätyivät siihen, että olisi otettava uusi näyte mikäli sisäinen standardi osoittaa näytteessä olevan vähemmän kuin 500.000 solua.

Tämän menetelmän haittana on erityisesti se, että näytteen riittävyyden arviointitulos on käytettävissä vasta vuorokauden kuluttua näytteen ottamisesta.

Mikäli näyte on riittämätön potilas on kutsuttava takaisin uutta näytteenottoa varten, mikä voi olla hyvinkin hankalaa.

Vaikka testin voisikin suorittaa käyttäen liuoksessa tapahtuvaan kerroshybridisaatioon perustuvaa testiä, esim. Lääketehdas Orionin markki-. noima AffiProbe™ HPV-testiä, jossa tulokset saadaan vuorokauden sisällä, näytteenottotilaisuuden ja näytteen riittävyyden arvioinnin välinen aika on liian ’·;· pitkä (3-5 tuntia).

• · r * · //.I' Täten on olemassa ilmeinen tarve menetelmälle kliinisten solunäytteiden '*'·* riittävyyden määrittämiseksi ennen hybridisaation suorittamista. Menetelmän tulee lisäksi olla helposti suoritettavissa ilman erikoisia laitteita. Menetelmän mukaisen testin tuloksien tulee olla käytettävissä heti näytteenoton jälkeen, edullisesti potilaan odottaessa vastaanotolla.

3 99027 YHTEENVETO KEKSINNÖSTÄ

Keksinnön kohteena on nopea ja luotettava menetelmä kliinisen solunäytteen riittävyyden evaluointia varten sekä reagenssiyhdistelmä menetelmän suorittamista varten. Tulos on visuaalisesti havaittavissa ja helppo tulkita. Keksinnön mukainen näytteen riittävyyden määrittämiseen tarkoitettu testikitti ratkaisee kliinisen diagnostiikan alalla pitkään todetun ongelman.

Menetelmä perustuu sellaisten kemiallisten aineiden käyttöön, jotka interkalatoituvat kaksisäikesiin DNA molekyyleihin, useimmiten emäsparien väliin. Tämä aiheuttaa sen, että perättäiset emäsparit loitontuvat toisistaan, mistä seuraa kaksoiskierteen molekyylirakenteen pidentyminen. Keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan käyttää suurta valikoimaa interkalatoivia aineita. Käytettävät interkalatoivat aineet ovat kemiallisia yhdisteitä, jotka ovat määritettävissä joko suoraan interkalatoinnin jälkeen tai epäsuorasti interkalaattoriin lisätyn detektoitavissa olevan ryhmän avulla.

Eräässä keksinnön mukaisen menetelmän edullisessa käyttömuodossa näytteen riittävyyden määrittämiseen tarkoitetun testikitin muodostaa käsittelyä helpottavalle kiinteälle alustalle valettu etidiumbromidia (EtBr) sisältävä 1% agaroosigeeli (670 ng/ml).

Edustava ostos kliinisestä solunäytteestä pipetoidaan agaroosigeelille ja agaroosilevylle lisätään DNA-standardit tulosten vertailua varten. Näytteen riittävyyden arviointi voidaan suorittaa heti sen jälkeen kun otokset ovat imeytyneet geeliin. Evaluointi suoritetaan visuaalisesti ja näyte katsotaan riittäväksi kun sopivasti laimennetun näytteen antama signaali vastaa vastaavan • *** standardin antamaa signaalia.

> I I

• · » * » »

KUVAT

' * I

f I » * * · · • · » t · * ·

Kuva 1 esittää UV-valossa kuvattua testilevyä. Ylimmät täplät vastaavat ·:·* standardi-HPV-DNAta (75 ng/μΙ ja 5 ng/μΙ). Lyhenteet M-18, N-53, S-36, S-46 ja D-56 kuvaavat viittä eri kliinistä näytettä; vasemmassa reunassa laimentamattomana ja oikealla laimennettuna 1:15.

Kuva 2 esittää geelin kiinteää alustaa ja sen pakkausta.

4 99027

KEKSINNÖN YKSITYIKOHTAINEN KUVAUS

Esillä oleva keksintö kohdistuu menetelmään, jonka avulla voidaan helpolla tavalla määrittää sisältääkö kliininen näyte riittävän määrän soluja käytettäväksi hybridisaatiotestissä. Ilmausta "kliininen näyte" käytetään tässä tarkoittamaan mitä tahansa irtosoluja sisältävää kliinistä näytettä. Kliininen näyte on yleensä sytopatologian tavanomaisia menetelmiä käyttäen otettu irtosolunäyte, esimerkiksi papa-näyte. Keksinnön mukaisessa menetelmässä ja testikitissä voidaan kuitenkin käyttää mitä tahansa solunäytettä, kuten kaavinta-, punktio-, huuhtelu- ja nestenäytettä.

Keksinnön mukainen menetelmä perustuu visuaalisesti detektoitavia signaaleja muodostavien, nukleiinihappoihin spesifisesti kiinnittyvien kemiallisten aineiden käyttöön. Erityisen käyttökelpoisia nukleiinihappojen väriaineita ovat interkalatoivat aineet, jotka sitoutuvat ei-kovalenttisesti kaksijuosteisen nukleiinihapon tavanomaisen heliksirakenteen emäsparien väliin. Sopivia keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettäviä nukleiinihappojen väriaineita ovat interkalatoinnin jälkeen suoraan tai epäsuorasti visuaalisesti detektoitavissa olevat aineet. Tämänkaltaisia aineita ovat esim. fenantridiinit, akridiinit, fenatsiinit, kumariinit, flavonoidit, kinoliinit ja vastaavat.

Interkalatoiva aine on sellainen, joka on helposti visualisoitavissa fluoresenssin tai värireaktion avulla. Eräs edullinen aine on etidiumbromidi (EtBr), joka interkalatoituu DNA:n emäsparien väliin. Tämän ryhmän kiinteä sijainti ja sen läheisyys emäksiin nähden aiheuttaa DNAihan sitoutuneen värin ··, fluoresenssin voimakkuuden lisääntymistä verrattuna sitoutumattoman värin • ψ fluoresenssiin. Visuaalinen detektio perustuu nukleiinihappomolekyyleihin # · · interkalatoituneiden EtBr-molekyylien emittoimaan UV-valolla indusoituun • * * fluoresenssiin.

* · r * » **’ Muita sopivia nukleiniihappojen väriaineita ovat kaupallisesti saatavilla .r.' oleva fluresoiva väriaine Hoechst H33258, flavonoidit kuten quercetiini, kamferoli ja isorhamnetiini sekä kumariinit kuten bergapteeni, angeliciini ja herniariini.

5 99027

Keksinnön mukainen menetelmä perustuu lisäksi soluja sisältäviä käsittelemättömiä näytteitä varten muokattuun levytestiin. Etidiumbromidi-agaroosilevyn käyttö on alunperin kuvattu puhdistetun DNA:n määrittämistä varten (Maniatis et ai., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, s. 468-469, 1982). Tässä laboratoriomenetelmässä puhdistettu DNA-näyte pipetoidaan 0,5 μg/ml etidiumbromidia sisältävän 1% agaroosilevyn pinnalle. Geelin annetaan seistä huoneenlämmössä muutaman tunnin ajan, jotta pienet kontaminoivat molekyylit diffundoituvat pois, jonka jälkeen geeli kuvataan käyttäen lyhytaaltoista UV-valoitusta. Geelin DNA-konsentraatio arvioidaan tämän jälkeen vertaamalla näytteen fluoresenssin voimakkuutta standardeihin.

Nyt on yllättäen havaittu, että tätä menetelmää voidaan käyttää tutkittaessa kokonaisia soluja sisältävä käsittelemättömiä näytteitä ilman soluja tuhoavaa käsittelyä tai puhdistusvaiheita.

Esillä olevaan keksintöön sopii sellainen interkalatoivaa väriainetta sisältävä geeli, johon voidaan applikoida näyte ja joka ei häiritse väriaineen visualisointia ja jota voidaan kiinnittää kiinteälle alustalle. Edullisia geelejä ovat esim. agaroosigeelit tai polyakryyliamidigeelit. Geelin kiinteä aines ei saa olla liian kova, jolloin näytteen absorptio voisi vaikeutua. Toisaalta liian pehmeä geeli on herkkä mekaaniselle vahingoittumiselle. Edullinen geeli on sopivana määränä interkalatoivaa ainetta sisältävä 0,5 - 5% agaroosigeeli, edullisemmin 0,8 - 2% ja edullisimmin 1% agaroosigeeli, joka voidaan valaa muoviselle alustalle. Toinen edullinen geeli on bisakryyliamidilla ristisidottu polyakryyliamidigeeli, jonka etuihin kuuluu lisäksi mahdollisuus kiinnittää geeli ristisidonnan avulla lasipinnalle. Edullisesti käytettävät interkalaattorimäärät riippuvat käytettävästä interkalaattorityypistä. Sopiva määrä on optimoitava siten, että interkalaattorin fluoresenssi ei häiritse näytetäplien signaalien :·. tulkintaa.Keksinnön edullisessa käyttömuodossa, jossa interkalatoiva aine on !·;·. etidiumbromidi, edullinen määrä on 0,3 - 1 μg/ml. Agaroosigeeli tehdään miltei • · · neutraaliin vesipohjaiseen liuokseen, kuten E-puskuriin (0,04 M Tris-asetaatti, : 0,002 M EDTA). Agaroosi-purskuriseos kuumennetaan, jotta agaroosi liukenee • · · ja jäähdytetään tämän jälkeen noin+50°C:seen. Interkalaattori lisätään . jäähdytettyyn agaroosigeeliseokseen. Sopiva määrä seosta kaadetaan kiinteälle alustalle ja annetaan jäähtyä huoneenlämpöiseksi. Valmiit levyt voidaan 6 99027 säilyttää +4°C:ssa kuivumisen estämiseksi. Lisäksi geeliin voidaan lisätä antibakteerista ainetta, kuten natriumatsidia, bakteerikasvun estämiseksi varastoinnin aikana.

Käsittelyn helpottamiseksi on edullista valaa geeli kiinteälle alustalle.

Kiinteä alusta on edullisesti lasi- tai muovilevy, esim. polystyreeni tai muu polymeerinen kantaja, johon agaroosi- tai polyakryyliamidigeeli kiinnittyy. Levy on edullisesti varustettu kannella tai muulla päällisellä, edullisimmin se on sijoitettu rasiaan, joka suojaa interkalaattoria sisältävää levyä mekaaniselta vahingolta, kuivumiselta sekä valolta. Käyttövalmista geeliä voidaan toimittaa pakattuna kittiin, johon sisältyy kaikki testiä varten tarvittavat reagenssit, kuten laimennusliuokset sekä positiiviset standardireagenssit.

Kuvassa 2 kuvataan edullisesti käytettävää levytyyppiä, jossa on kiinteänä alustana polystyreenilevy, jossa on reunat (1) geelin (3) paikalla pitämistä varten, sekä kädensija (2) geelilevyn käsittelyn helpottamiseksi.

Geeliä tukeva levy voidaan edullisesti pakata rasiaan (5), johon liittyy kansi(6) kuivumisen estämiseksi.

Esillä olevan keksinnön kohteena on käyttökelpoinen menetelmä käsittelemättömien, kokonaisia soluja sisältävien kliinisten näytteiden nukleiinihapposisällön määrittämiseksi. Täten kiinnitettiin erityistä huomiota menetelmän mukaisen testin herkkyyden, so. siihen että riittävän näytteen sisältämä solumäärä on selvästi näkyvissä menetelmän mukaisessa testissä, sekä testiin sisällytettävien sopivien standardien määrittämiseen. Nämä määritykset tehtiin käyttäen ihmisen papilloomavirusten määrittämiseen ja tunnistamiseen tarkoitetun ja suomalaisessa patenttijulkaisussa Fl 72146 kuvattuun liuoshybridisaatiomenetelmään perustuvan hybridisaatiotestin,

AffiProbe™ HPV-kitin (Lääketehdas Orion), kanssa käytettäviä kliinisiä • · irtosolunäytteitä. Alan ammattimiehelle on kuitenkin itsestään selvää, että esillä v · olevan keksinnön mukainen menetelmä ja testikitti ovat yhtäläisesti • : : käyttökelpoisia missä tahansa hybridisaatiotestissä käytettäväksi tarkoitettua «· · .· ··, mitä tahansa kliinistä näytettä käyttäen.

• · « ·* Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä kliinisestä näyteestä otettu pieni, yhden - muutaman millilitran, otos pipetoidaan suoraan geelille visualisointia varten. Testattavan otoksen tilavuus määräytyy käytettävän 7 99027 hybridisaatiotestin herkkyydestä. Mikäli kliininen näyte on erityisen laimea eli se on otettu suureen laimennustilavuuteen, on edullista sentrifugoida kliininen solunäyte solupelletin saamiseksi. Sentrifugoitu pelletti suspendoidaan tämän jälkeen uudelleen sopivaan tilavuuteen, esim. 100 μΙ sopivaa laimennusliuosta, jolloin saadaan konsentroidumpi näyte.

Optimaaliset laimennusliuokset ovat riippuvaisia käytettävästä kliinisestä näytetyypistä sekä käytettävästä molekyylidiagnostisesta testistä, esim. spesifisen patogeenisen mikro-organismin detektiosta. Sopiva näytesuspension otos, tilavuudeltaan yksi - muutama μΙ, pipetoidaan geelilevylle. Edullisesti levylle kuitenkin lisätään erillisinä täplinä sopivia DNA-kontrolliliuoksia, jotka sisältävät selvästi näkyvän määrän DNA:ta. Standardi-DNA:n määrä kontrollinäytteissä määritetään kokeellisesti, siten että laimentamaton DNA-kontrolli aiheuttaa vahvan näkyvän singaalin, kun taas laimennettu DNA-kontrolli aiheuttaa himmeän, mutta selvästi näkyvän signaalin. Edullisimmassa esillä olevan keksinnön mukaisessa käyttömuodossa DNA-kontrolliliuos sisältää 75 ng DNA:ta per μΙ (korkea positiviinen kontrolli) ja tämän 5 ng/μΙ sisältävä laimennus toimii matalana positiivisena kontrollina. Näytteiden annetaan imeytyä agaroosigeeliin muutaman minuutin ajan.

Näytteet tulisi analysoida ja kliinisen näytteen riittävyys määrittää sopivassa valaistuksessa, edullisesti saman päivän aikana. Kliinisten näytteiden katsotaan sisältävän riittävästi soluja mikäli laimennetun näyteotoksen täplän antaman signaalin voimakkuus on vähintään yhtä voimakas kuin matalan positiivisen kontrollitäplän. Täten arvioidun kliinisen näytteen katsotaan riittävän hybridisaatiotestin näyteeksi.

Näyteotoksen ja standardireagenssien applikoinnin helpottamiseksi geeliin voidaan merkitä näytteenapplikointikohdat, esim. painetut syvennykset * « : " (4) geeliin kuten kuvassa 2 esitetään.

• » • · . ’ Seuraavassa kuvataan suoritusesimerkein keksinnön mukaisen *:;.r menetelmän edullista käyttömuotoa, jossa menetelmää käytetään ihmisen papilloomaviruksen detektioon ja identifiointiin tarkoitetun AffiProbe™ testin : kliinisten näytteiden riittävyyden määrittämiseksi. Esimerkit eivät millään tavalla rajoita keksintöä ko. testin käyttöön. Kiintokantajan eri muodot ja testin käyttökelpoisuus muiden infektiotauteja aiheuttavien organismien detektioon tähtäävien testien yhteydessä ovat itsestään selviä alan ammattimiehelle.

8 99027

Esimerkki 1.

Kiinteällä alustalle valetun agaroosigeelin valmistaminen

Etidiumbromidia (EtBr) sisältävä agaroosigeelilevy tehtiin lisäämällä 1,5 g agaroosia 150 ml:aan E-puskuria (0,04 M Tris-asetaattia, 0,002 M EDTA, pH 8).

Seos autoklavoitiin noin 20 min ajan ja jäähdytettiin +50°C:een vesihauteessa. Jäähdytettyyn agaroosigeeliseokseen lisättiin 10 μΙ EtBr (10 mg/ml). Seitsemän millilitran tilavuus tästä seoksesta pipetoitiin 13 cm2:lle muovialustalle ja annettiin jäähtyä huoneenlämpötilassa. EtBr-agaroosigeelilevyt säilytettiin +4°C:ssa valoa läpäisemättömissä säiliöissä.

Esimerkki 2.

UV-valossa näkyvän solumäärään määrittäminen

Parkkisen et ai. (yllä) mukaan riittävän näytteen tulisi sisältää vähintään 500,000 solua jotta sen pysytyisi detektoimaan kerroshybridisaatiotestissä.

AffiProbe™ HPV hybridisaatiotesti suoritetaan käyttäen kliinisestä solunäytteestä otettuja 30 μΙ:η näytteitä. Tämä esimerkki suoritettiin varmistaaksemme että 500,000 solua per 30 μΙ sisältävästä solunäytteestä voidaan tunnistaa nukleiinihapot EtBr-levyllä ilman uutto-, puhdistus- tai konsentrointikäsittelyä.

Ihmisen viljeltyjä R1610 soluja laskettiin Coulter laskimessa ja 5x105 solua suspendoitiin 30 μί,^η PBS-E-puskuria ja 1 μΙ tästä suspensiosta (1,7x104 solua) pipetoitiin agaroosilevylle yhdessä näyteestä valmistetun .. Talukko l:ssä esitetyn laimennussarjan kanssa. Näytteet tutkittiin muutaman minuutin jälkeen UV-valossa ja täplien fluoresenssi verrattiin tunnettuja määriä • · · puhdistettua DNA:ta sisältävien standarditäplien fluoresenssiin.

• « « · · • « DNA-standardi, joka sisälsi 5 ng puhdasta DNA:ta oli selvästi näkyvissä levyllä. 1,7x103 solua per μΙ sisältävä R1610-solususpensio antoi voimakkaamman fluoresenssin kuin 5 ng:n puhdas DNA-täplä.

Nämä tulokset osoittavat sopivan tilavuuden (1 μΙ) 5x105 solua/30 μΙ sisältävästä solususpensiosta olevan selvästi näkyvissä ilman että solujen DNA-sisältö vapautetaan tai puhdistetaan.

9 99027

TAULUKKO I

R1610 Evaluointi Standardi DNA Evaluointi solumäärä (näkyvä täplä) (ng/täplä) (näkyvä täplä) 1.7 x 104 + 100 + 1.7 x 103 + 10 + 1.7 x102 - 5 + 1,7x10 - 1 • · • · • · • · « • · » « · · • · «

• M

r : • · · 1 · · • · · 10 99027

EsimerKKi.3

Kliinisen näytteen sopivan laimennoskertoimen määrittäminen

Neljän kliinisen, AffiProbe™ testin mukaista määritystä varten kerätyn irtosolunäytteen solusisäilöt määritettiin Coulter-laskimessa ja niistä valmistetut laimennussarjat applikoitiin EtBr-agaroosilevylle. Tämän jälkeen täplät tutkittiin visuaalisesti UV-valotuksessa. Testin tulokset esitetään Taulukossa II.

AffiProbe™ testin herkkyys vaatii 300.000 - 400.000 solua 30 μΙ-ssa PBS-E-puskuria ihmisen papilloomaviruksen määrittämiseksi.

Teoreettisesti laskettiin, että AffiProbe™ näytteen 1:15 laimennus, jonka signaali vastasi 5 ng puhdasta DNA:ta sisältävän standardin signaalia, sisälsi noin 2,3 ng DNAta. (Laskelman perustuvat siihen olettamukseen, että 106 solua sisältää 3μg DNAta). Voimakkaampi fluoresenssi verrattuna puhtaan DNA:n antamaan fluoresenssiin johtuu mahdollisesti solunsisäisestä RNAista. Koska yksi näytteistä oli selvästi verinen, pystyttiin myös toteamaan että veriset näytteet toimivat hyvin keksinnön mukaisessa menetelmässä. Tämä varmistui myös esimerkeissä 4-6 esitetyissä kokeissa.

Koska tämän esimerkin näytteet etukäteen varmistetusti sisälsivät tarpeellisen määrän soluja, testin lopputuloksena voidaan sanoa, että kliininen näyte sisältää riittävän määrän soluja AffiProbe™ testin mukaista määritystä varten, jos 100 μΙ:η kliinisestä näytteestä otettu 1 μΙ:η otos antaa positiivisen signaalin 1:15 laimennuksella.

• '·· • 1 1

• · I

« · 1 4 • « « · •

• « 4 L

• 4 · • · · 2 2 · · • · ·

TAULUKKO II

11 99027

Soluja /näyte Laimennus Soluja/täplä Tuloksen (30 μΙ) (1 μΙ) evaluointi 3.4x105 1:1 1.13x104 + 1:2 5.67x103 + 1:5 2.27x103 + 1:10 1.13x103 + 1:15 7.56x102 + 1:20 5.67x102 1:40 2.83x102 1:80 1.41x102 4.0x105 1:1 1.33x104 + 1:2 6.67x103 + 1:5 2.67x103 + 1:10 1.33x103 + 1:15 7.80x102 + 1:20 6.67x102 + 1:40 3.34x102 1:80 1.67x102 4.2x105 1:1 1.40x104 + 1:2 7.00x103 + 1:5 2.80x103 + 1:10 1.40x103 + 1:15 9.33x102 + 1:20 7.00x102 + 1:40 3.50x102 1:80 1.75x102 * · i] . 4.3x105 1:1 1.43x104 + j::.’ 1:2 7.17x103 + 1:5 2.87x103 + : 1:10 1.43x103 + 1:15 9.56x102 + 1:20 7.17x102 + 1:40 3.58x102 1:80 1.79x102 12 99027

Esimerkkiä HPV-määritvstä varten otetun kohdunkaulan irtosolunäytteen edustavuuden määritys.

Menetelmän käyttökelpoisuutta näytteen riittävyyden määrittämiseksi tutkittiin vielä testaamalla skandinaavisen monikeskustutkimuksen yhteydessä otettuja kliinisiä näytteitä. Kyseisessä tutkimuksessa kerättiin kohdunkaulan irtosolunäytteitä potilailta, joilla epäiltiin olevan papilloomainfektio. Kaikki kliiniset näytteet arvioitiin silmämääräisesti solusisällön suhteen siten, että kliiniset näytteet sentrifugoitiin, jonka jälkeen solumäärä arvioitiin saadun solupelletin perusteella. Jos solupelletti oli hyvin pieni tai puuttui kokonaan, näytettä pidettiin riittämättömänä. Viruksen läsnäolo määritettiin sekä AffiProbe™ HPV testillä että muilla konventionaalisilla HPV:n tunnistusmenetelmillä.

Kaiken kaikkiaan 420 kerätystä irtosolunäytteestä hylättiin 48 silmämääräisen arvioinnin perusteella riittämättöminä. Tämä suuri osuus (11%) osoittaa että näytteenottopaikoilla on olemassa suuri tarve näytteen riittävyyden määrittämismenetelmän saamiseksi.

Silmämääräisen testin tulokset vahvistettiin keksinnön mukaista menetelmää käyttäen. Näytteet laimennettiin Taulukon III mukaisesti ja applikoitiin EtBr-agaroosilevyile. DNA-standardit, jotka sisälsivät 75 ng/μΙ ja 5 ng/μΙ applikoitiin myös levylle.

• · 0Φ4 lit f * · · I | |

• < I

t 0 ·

! I

*04 m • · · • · · ,3 99027

TAULUKKO III

Näytekoodi Laimennus 1:1 1:10 1:15 Ä28 - - : A29 + + A37 ...

A82 ...

A94 + . .

B43 + - B45 ...

B47 ...

B48 ...

B51 ...

B58 ...

B67 ...

C10 + C28 + - - C42 ...

C43 ...

C50 ...

C58 + C59 ...

C60 + D02 D46 ...

D54 + D62 ...

D66 + D82 ...

E10 ...

E11 E16 + E20 + E21 + E23 ...

E24 ...

:·. E25 ; '1 E29 ...

•V'·· E31 + E32 + ; E41 ...

E42 ...

E43 + : .1· E45 + + - E54 E57 ...

E58 ...

E65 ...

E68 + E69 + E72 + 14 99027

Esimerkki 5

Vaikeasti tulkittavien näytteiden riittävyyden määritys

Kaksi Esimerkissä 4 kuvatun monikeskustutkimuksen näytettä, joiden riittävyys katsottiin vaikeasti tulkittavaksi silmämääräisessä riittävyyden arvioinnissa (kaksi henkilöä piti näytettä riittävänä, yksi riittämättömänä), testattiin myös keksinnön mukaisella riittävyyden määritysmenetelmällä.

Näytteet laimennettiin ja applikoitiin EtBr-agaroosilevylle kuten Esimerkissä 2 on kuvattu. Taulukossa IV esitetyt tulokset vahvistivat kummankin näytteen sisältävän riittävän määrän soluja.

TAULUKKO IV

Näytekoodi Laimennus 1:1 1:5 1:10 1:15 51 + + + + 52 + + + + t » • ·

• « I

* I

• I · • · · • · · » i · • t · »·· t : • · · 1

II

· · » · · is 99027

Esimerkki 6

Silmämääräisesti riittäväksi arvioidun näytteen riittävyyden määrittäminen

Tilastollisesti satunnainen otos (n=33) Esimerkissä 4 kuvattuun monikeskustutkimukseen sisällytetyistä näytteistä, joita silmämääräisesti tutkittuina oli pidetty riittävinä hybridisaatiotestiä varten, tutkittiin esillä olevan keksinnön menetelmän mukaisesti solumäärän riittävyyden suhteen. Tämä testi osoitti, että vain 67% hyväksytyistä näytteistä sisälsi riittävän määrän soluja, kun taas 33% kliinisistä näytteistä eivät olleet riittäviä diagnostista hybridisaatiotestiä varten.

Tutkitut näytteet on listattu Taulukossa V. Näytekoodit (A-E) osoittavat, että kliiniset näyteet oli kerätty eri klinikoissa.

Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä riittämättömiksi katsotuista näytteistä (11 kpl) vain yksi antoi AffiProbe™ testissä positiivisen signaalin. Kahdessa tapauksessa vahvistettiin muun tutkimuksen avulla, että potilaalla tosiaan oli HPV-infektio. Jäljelle jääneistä 8 näytteestä ei saatu varmistusta infektiosta.

• f < f * «« < < • 1 f • · · l> • • % · * t · * « · 4 « · * · • · » · f l • 4 I ·

• I

TAULUKKO V

ie 99027 Näytekoodi Laimunnus % riittäviä näytteitä 1:1 1:10 1:15 A10 ++ + A20 ++ + A32 ++ + A43 + A52 + A63 ++ + A73 ++ + A84 + + A91 ++ + A100 ++ + 80 B18 B29 + B39 ++ + B54 + B65 + - 20 003 ++ + '015 ++ + C25 ++ + C36 + C46 ++ + C52 ++ + 83 D11 + + D21 ++ + D28 + D42 ++ + D53 + D65 + :T: D76 + + 57 · : ;'· E12 ++ + E28 + + E46 E56 ++ + E74 ++ + 80 • · · • φ

Claims (13)

99027

1. Menetelmä nukleiinihappohybridisaatioon perustuvaan testiin tarkoitetun kliinisen näytteen riittävyyden 5 määrittämiseksi, tunnettu siitä, että (a) otetaan näytteestä edustava otos, (b) applikoidaan ilman esikäsittelyä otos geelille, johon on dispergoitu nukleiinihappojen värjäysainetta, (c) visualisoidaan otokseen sidotun värjäysaineen 10 määrää, ja (d) määritetään näytteen likimääräinen solumäärä vertaamalla otokseen kiinnittyneen värjäysaineen antama tulos tunnetun deoksiribonukleiinihappomäärän ja värjäys-aineen antamaan tulokseen, jolloin näytteen, jonka solu- 15 määrä määritetään, soluja ei käsitellä niiden hajottami seksi eikä puhdisteta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geeli on agaroosigeeli tai polyakryyliamidigeeli. • 20

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nukleiinihapon värjäysaine on ' ' interkalatoiva aine, joka on visuaalisesti detektoitavassa interkalatoiduttuaan nukleiinihappoihin.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että nukleiinihappojen värjäysaine • · • *·· on etidiumbromidi .

: 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, • [·, tunnettu siitä, että näytteen nukleiinihapposisäl- *Γ ’ to arvioidaan UV-valolla indusoidun näytteen nukleiinihap- 30 poihin interkalatoitujen etidiumbromidimolekyylien emit- toiman fluoresenssin perusteella.

: : 6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geeli valetaan kiinteälle alustalle. 99027

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiinteä alusta on muovilevy.

8. Kitti nukleiinihappohybridisaatioon perustuvaan testiin tarkoitetun kliinisen näytteen riittävyyden mää- 5 rittämiseksi jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukaisella menetelmällä, tunnettu siitä, että siihen kuuluu kiinteälle alustalle valettu nukleiinihappoon spesifisesti sitoutuvaa ainetta sisältävä geeli, jossa sanottu aine aiheuttaa visuaalisesti detektoitavan signaalin sitoudut-10 tuaan nukleiinihappoon.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen kitti, tunnettu siitä, että nukleiinihappojen värjäysaine on etidiumbromidi.

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen kitti, t u n - 15. e t t u siitä, että kiinteä alusta on lasia tai poly- styreeniä.

11. Patenttivaatimuksen 8 mukainen kitti, t u n -n e t t u siitä, että kiinteällä alustalla oleva geeli on ' pakattu UV-valoa läpäisemättömään suojakoteloon.

12. Kitti ihmisen papilloomaviruksen nukleiinihap- . pohybridisaatiolla määrittämiseen tarkoitetun genitaali alueen seudulta otetun kliinisen näytteen riittävyyden määrittämiseksi jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukaisella menetelmällä, tunnettu siitä, että siihen 25 kuuluu kiinteällä alustalla oleva agaroosigeeli, jossa on • t | *·. visuaalisesti tunnistettavan signaalin tuottava nuk- : leiinihappoihin kelatoituva aine, standardi DNA-liuoksia ;[· positiivisina kontrolleina sekä sopivaa laimennusliuosta.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen kitti, t u n -V 30 n e t t u siitä, että interkalatoiva aine on etidiumbro- : · · midi. • · · • · • · li 99027