NO303585B1 - FremgangsmÕte til Õ bestemme hvorvidt et klinisk pr°vemateriale er egnet til bruk i nukleinsyrehybridiseringsfors°k og testkit for utf°relse av fremgangsmÕten - Google Patents
FremgangsmÕte til Õ bestemme hvorvidt et klinisk pr°vemateriale er egnet til bruk i nukleinsyrehybridiseringsfors°k og testkit for utf°relse av fremgangsmÕten Download PDFInfo
- Publication number
- NO303585B1 NO303585B1 NO922515A NO922515A NO303585B1 NO 303585 B1 NO303585 B1 NO 303585B1 NO 922515 A NO922515 A NO 922515A NO 922515 A NO922515 A NO 922515A NO 303585 B1 NO303585 B1 NO 303585B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- sample
- nucleic acid
- gel
- stated
- kit
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims description 94
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 title claims description 9
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 title 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 39
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 21
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 32
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 30
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 15
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 claims description 14
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 14
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 14
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 14
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 11
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 claims description 6
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003086 colorant Substances 0.000 claims 3
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 claims 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 abstract 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 18
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 12
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- BGEBZHIAGXMEMV-UHFFFAOYSA-N 5-methoxypsoralen Chemical compound O1C(=O)C=CC2=C1C=C1OC=CC1=C2OC BGEBZHIAGXMEMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N Quercetin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000000980 acid dye Substances 0.000 description 2
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N benzo-alpha-pyrone Natural products C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 2
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 2
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 2
- 150000004775 coumarins Chemical class 0.000 description 2
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 239000008393 encapsulating agent Substances 0.000 description 2
- 125000004387 flavanoid group Chemical group 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 238000009595 pap smear Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJZOMNXBSRED-UHFFFAOYSA-N Bergamottin Natural products O1C(=O)C=CC2=C1C=C1OC=CC1=C2OCC=C(C)CCC=C(C)C DBMJZOMNXBSRED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 101000875067 Homo sapiens Collagen alpha-2(I) chain Proteins 0.000 description 1
- GQODBWLKUWYOFX-UHFFFAOYSA-N Isorhamnetin Natural products C1=C(O)C(C)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 GQODBWLKUWYOFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N Quercetagetin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=C(O)C(O)=C(O)C=C2O1 ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N Rhynchosin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001251 acridines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 229940111121 antirheumatic drug quinolines Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229960002045 bergapten Drugs 0.000 description 1
- KGZDKFWCIPZMRK-UHFFFAOYSA-N bergapten Natural products COC1C2=C(Cc3ccoc13)C=CC(=O)O2 KGZDKFWCIPZMRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- LIIALPBMIOVAHH-UHFFFAOYSA-N herniarin Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(OC)=CC=C21 LIIALPBMIOVAHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JHGVLAHJJNKSAW-UHFFFAOYSA-N herniarin Natural products C1CC(=O)OC2=CC(OC)=CC=C21 JHGVLAHJJNKSAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000012296 in situ hybridization assay Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 208000024312 invasive carcinoma Diseases 0.000 description 1
- XDROKJSWHURZGO-UHFFFAOYSA-N isopsoralen Natural products C1=C2OC=CC2=C2OC(=O)C=CC2=C1 XDROKJSWHURZGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IZQSVPBOUDKVDZ-UHFFFAOYSA-N isorhamnetin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 IZQSVPBOUDKVDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008800 isorhamnetin Nutrition 0.000 description 1
- MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N kaempferol Natural products OC1=C(C(=O)c2cc(O)cc(O)c2O1)c3ccc(O)cc3 MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 150000005053 phenanthridines Chemical class 0.000 description 1
- 150000002988 phenazines Chemical class 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- MLMVLVJMKDPYBM-UHFFFAOYSA-N pseudoisopsoralene Natural products C1=C2C=COC2=C2OC(=O)C=CC2=C1 MLMVLVJMKDPYBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 235000005875 quercetin Nutrition 0.000 description 1
- 229960001285 quercetin Drugs 0.000 description 1
- 150000003248 quinolines Chemical class 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011309 routine diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N sitosterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CC[C@@H](CC)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N 0.000 description 1
- 229950005143 sitosterol Drugs 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte til å bedømme hvorvidt prøvematerialet er velegnet for deteksjon og identifisering av nukleinsyrer i kliniske prøver, og kit for bedømmelse av nevnte velegnethet.
Diagnostiske metoder basert på nukleinsyrehybridiserings-teknikker blir stadig viktigere i klinisk diagnostikk. Særlig diagnosen av smittsomme sykdommer har dratt fordel av bruken av hybridiseringsbaserte metoder. For viruser som er infektive uten ekspresjon av virusproteiner eller som innlemmes i vertscellens genom, er nukleinsyrehybridisering den eneste diagnostiske metode som er mulig.
Humane papillomaviruser som er implisert som en etiologisk agens i utviklingen av neoplasia og invasivt karsinom av livmorhalsen representerer et slikt diagnostisk problem fordi de ikke kan dyrkes in vitro og virusantigener påvises ikke pålitelig i prøvene. Humane papillomavirus-infeksjoner av livmorhalsen påvises fra kliniske prøver, dvs. celler samlet opp som eksocervikale spatelutskrapninger eller endocervikale vattpinner eller pensler, analoge med Papanicolaou-utstryk-ningsoppsamling. Utilstrekkelig fremskaffelse av celler er imidlertid vanlig, hvilket fører til falske negative resultater i hybridiseringsanalysen.
Påliteligheten av Papanicolaou-utstryket og problemer som oppstår ved utilstrekkelig celleutvinning har man lenge vært oppmerksom på innen området cytopatologi, hvor store anstrengelser har vært gjort for å forbedre prøvetagnings-metodene. Se f.eks. Greening (Diagnostic Cytopathology, Vol. 1, nr. 1, 1985) og Yobs et al. (Obstetrics & Gynecology, Vol. 65, nr. 2, 1985).
I molekylær diagnose, dvs. hybridiseringsanalyser, er problemet med prøvenøyaktighet enda mer akutt enn i cytologiske tester, fordi der er ingen mikroskopisk evaluering av prøvene i hybridiseringsanalyser, bortsett fra i • in situ hybridiseringsanalyser. Vermund et al. (Am J Obstet Gynecol, Vol. 16 0, nr. 2,1989) beskriver en forbedret fremgangsmåte til oppsamling av celleprøver for molekylær diagnose av human papillomavirus. Denne referanse peker på betydningen av prøvenøyaktighet ved screening .for HPV-inf eks joner.
I en undersøkelse utført i Finland (Parkkinen et al. Gynecologic Oncology, 30, 251-264, 1988) ble følsomheten og anvendeligheten av sandwichhybridisering og in situ hybridi-seringsforsøk for rutinediagnoser av cervikale HPV-infeksjoner fra utstryk testet. Undersøkelsen bekreftet betydningen av kvaliteten av prøvematerialet. På grunn av vanskeligheter ved bedømmelse av tilstrekkeligheten av utskrapningene inkluderteParkkinen et al. en intern standard i sandwichanalysen for å måle det faktiske antall celler i prøvematerialet. Bedømmelsen av antall celler ble utført ved en parallell hybridiseringstest ved anvendelse av sandwichhybridiseringsreagenser for det humane pro-alfa2(I)-kollagen-gen som er et enkeltkopi-gen. Innlemmelsen av denne internstandard antydet at et minimum på 500 000 celler er nødvendig for et adekvat utskrapnings-prøvemateriale, og Parkkinen et al. trekker den konklusjon at et nytt prøvemateriale bør tas dersom internstandarden viser færre celler enn 500 000. Ulempen ved denne metode er at bedømmelsen av tilstrekkeligheten eller velegnetheten av prøvematerialet ikke er tilgjengelig før neste dag. Når det gjelder en utilstrekkelig prøve, må pasienten således kontaktes på nytt for en ny test, noe som kan være meget ubeleilig.
Selv om testen skulle utføres ved bruk av et sandwichformat i oppløsning såsom AffiProbe™ HPV-testen, tilgjengelig i handelen fra Orion Corporation, hvor resultatene fås i løpet av en dag, er den tid som går med mellom oppsamling av prøve-materialet og resultatet med hensyn til velegnethet av prøvematerialet som tas, altfor lang (3-5 h).
Der er følgelig et etablert behov for en fremgangsmåte til evaluering av velegnetheten av de oppsamlede kliniske prøve-materialer før hybridisering. Dessuten-bør en slik fremgangsmåte være lett å anvende uten krav til spesielt utstyr. Resultatene av en slik test bør. være tilgjengelig innen kort tid, fortrinnsvis mens pasienten venter i klinikken.
Det er en hensikt med oppfinnelsen å skaffe en hurtig og pålitelig fremgangsmåte til bedømmelse av et klinisk prøve-materiales velegnethet og skaffe en reagenspakke eller -kit for utførelse av fremgangsmåten. Resultatet er synlig for øyet og lett å tolke. Den pakke (eller kit) som anvendes til bedømmelse av prøvematerialets velegnethet i henhold til oppfinnelsen er en løsning på et lenge følt behov innen klinisk diagnostikk.
Fremgangsmåten er basert på bruken av kjemiske agenser som innføyes i dobbelttrådede DNA-molekyler, vanligvis ved innsetting mellom baseparene. Dette bevirker spredning av tilgrensende basepar og fører til en økning i den molekylære lengde av duplekset. En rekke forskjellige innføyingsagenser (intercalating agents) kan anvendes i oppfinnelsen. Innføyings-agensene velges fra gruppen bestående av kjemiske stoffer som er enten direkte visuelt påviselige etter innføyingen eller indirekte visuelt påviselige ved tilsetning av en detekterbar molekyldel til innføyingsagensen.
I en foretrukket utførelsesform omfatter pakken for evaluering av prøvematerialet i henhold til oppfinnelsen en 1% agarosegel inneholdende EtBr (670 ng/ml) støpt på en bærer for å lette håndteringen av gelen.
En representativ prøve av det kliniske prøvemateriale påføres agarosegelen og sammenlignbare DNA-standarder settes til platen. Velegnethetbedømmelsen kan utføres straks etter at prøvene er blitt tillatt å absorberes inn i gelen. Bedømmelsen utføres visuelt og prøvematerialet anses som velegnet (dvs. tilstrekkelig) når intensiteten av signalet fra den passende fortynnede prøve er lik den for det tilsvarende standardsignal.
Fig. 1 er et fotografi av et objektglass tatt under UV-lys. De øvre prikker på objektglasset svarer til standard HPV-DNA (75 ng/jUl) og 5 ng//xl) . Forkortelsene H-18, N-53, S-36, S-46 og D- 5 6 angir fem forskjellige kliniske prøver, ufortynnet i den venstre bane og fortynnet 1:15 i den høyre bane.
Fig. 2 er en tegning av et fast bærer for gelen og dens emballasje.
Den foreliggende oppfinnelse grunner seg på en fremgangsmåte for lett bestemmelse av hvorvidt et klinisk prøvemateriale inneholder en tilstrekkelig mengde celler, slik at det kan anvendes med pålitelighet i en hybridiseringstest. Uttrykket"klinisk prøvemateriale" (clinical specimen) slik det anvendes her, betegner et hvilket som helst klinisk prøvemateriale som inneholder cellulært materiale. Det kliniske prøvemateriale er vanligvis en cellulær avskrapning som fås ved vanlige metoder brukt i cytopatologi for f.eks. PAP-utstryk. Fremgangsmåten og den kit som anvendes for å utføre testen kan imidlertid anvendes på alle celleprøver såsom utskrapninger, utstansinger, utvaskinger og kroppsvæsker.
Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er basert på bruken av kjemiske agenser som binder spesifikt til nukleinsyrer og danner visuelt påviselige signaler. Spesielt nyttige nuklein-syrefargemidler er nukleinsyreinnføyende materialer som interreagerer med den normale heliksstruktur av dobbelttrådede nukleinsyrer ved ikke-kovalent innsettelse mellom baseparene.Egnede nukleinsyrefargingsmidler som anvendes i oppfinnelsen er midler som er direkte eller indirekte visuelt påviselige etter interreagering med nukleinsyrer. Slike forbindelser er eksemplifisert ved f.eks. fenantridiner, akridiner, fenaziner, kumariner, flavanoider, kinoliner og lignende.
Fortrinnsvis er innføyingsmiddelet slik at det lett synlig-gjøres ved fluorescens eller ved en fargereaksjon. En foretrukket agens er etidiumbromid (EtBr) som føyes inn mellom de stablede baser i DNA. Den faste posisjon for denne gruppe og dens nærhet til basene forårsaker at farge som er bundet til DNA oppviser en øket fluorescerende avgivelse sammenlignet med fri farge. Den visuelle påvisning er basert på UV-indusert fluorescens avgitt av EtBr-molekyler innføyet i nuklein-syremolekylene.
Andre egnede nukleinsyrefargingsmidler er den i handelen tilgjengelige fluorescerende farge Hoechst H33258, flavanoider som kvercetin, kaempterol og isorhamnetin og kumariner som bergapten, angelicin og herniarin.
Den foreliggende oppfinnelse er videre basert på en plate-analyse modifisert for ubehandlede prøver inneholdende hele celler. Bruken av EtBr-agaroseplater ble opprinnelig beskrevet for kvantifisering av renset DNA (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, p. 468-469, 1982). I denne laboratoriemetode blir den rensede DNA-prøve dryppet på overflaten av en 1% agaroseblokk inneholdende 0,5^.g/ml etidiumbromid. Gelen blir deretter tillatt å stå ved værelsetemperatur noen timer for å tillate at små forurensende molekyler diffunderer bort, hvoretter gelen fotograferes ved bruk av UV-belysning med kort bølgelengde. DNA-konsentrasjonen av prøven blir deretter bedømt ved sammenligning av intensiteten av fluorescens i prøven med den for standardoppløsninger.
Det er nå overraskende funnet at denne fremgangsmåte kan anvendes på ubehandlede prøver inneholdende hele celler, uten noen behandling for å ødelegge cellene eller andre rensetrinn.
En egnet gel inneholdende innføyingsmiddelet til bruk i
oppfinnelsen er en hvilken som helst gel på hvilken prøven kan påføres, og som ikke forstyrrer synliggjøringen av innføyings-middelet og som kan festes til en fast bærer. Foretrukne geler er f.eks. agarosegeler og polyakrylamidgeler. Faststoffinn-holdet av gelen bør ikke være slik at gelen er for stiv, da dette kan hindre absorpsjonen av prøven. På den annen side, en for myk gel er utsatt for mekanisk skade. En egnet gel er en 0,5-5% agarosegel, fortrinnsvis 0,8-2% og helst en 1% agarosegel, inneholdende en egnet mengde innføyingsmiddel, som kan støpes på plastbærere. En annen foretrukket gel er poly-akrylamid tverrbundet med bis-akrylamid, som har den ytter-
ligere fordel at den kan tverrbindes til å festes til en glassbærer. Foretrukne mengder innføyingsmidler avhenger av typen innføyingsmiddel som anvendes. Mengden må optimaliseres slik at fluorescensen av middelet ikke virker forstyrrende inn på tolkningen av signalet fra prøveflekkene. I den foretrukne utførelsesform hvor innføyingsmiddelet er etidiumbromid, er en foretrukket mengde 0,3-1/xg/ml. Agarosegelen fremstilles i en nesten nøytral vandig oppløsning såsom E-buffer (0,04 M tris-acetat, 0,002 M EDTA). Agarose/buffer-blandingen varmes opp for å oppløse agarosen og kjøles deretter til ca. 50°C. Innføyings-middelet settes til den avkjølte agarosegelblanding. En egnet mengde av denne blanding støpes på en fast bærer og tillates å avkjøles ved værelsetemperatur. De ferdiglagde plater lagres ved 4°C for å hindre tørking av gelen. Eventuelt kan et antibakterielt middel såsom natriumazid innlemmes for å hindre bakteriell forurensning i løpet av lagring.
For å lette håndteringen av gelen støpes den på en fast bærer. Fortrinnsvis er den faste bærer en glass- eller plastplate såsom polystyren eller en hvilken som helst annen polymerbærer som tillater at agarose- eller polyakrylamidgel fester seg. Platen er fortrinnsvis forsynt med et deksel eller belegg, fortrinnsvis en beholder som beskytter platen som inneholder innføyingsmiddelet mot mekanisk skade, tørking og belysning. Den for bruk klargjorte gel leveres i form av en pakket kit som innbefatter alle de reagenser som er nødvendige for testen såsom fortynningsmidler og positive standardreagenser.
Fig.2viser en foretrukket plateinnretning hvor den faste bærer er et polystyrenbrett forsynt med kanter 1 for å holde gelen 3, og et håndtak 2 for å lette håndtering av gelen som vist på fig. 2. Den gelunderstøttende plate er fortrinnsvis pakket i en beholder 5 forsynt med et lokk 6 for å hindre tørking.
Hensikten med oppfinnelsen er å skaffe en passende fremgangsmåte til bestemmelse' av nukleinsyreinnholdet i en ubehandlet klinisk prøve inneholdende hele celler. Følgelig ble det lagt stor vekt på å bestemme følsomheten av testen, dvs. hvorvidt mengden av celler i et tilstrekkelig prøvemateriale er klart synlig i testen, og å bestemme egnede standarder som skal inkluderes i testen. Disse bestemmelser ble gjort for kliniske prøvematerialer, celleutskrapninger, som skal anvendes i en hybridiseringstest for påvisning og identifisering av human papillomavirus, HPV-kit AffiProbe ™ (Orion Pharmaceuticå), som er basert på en oppløsningshybridiseringsmetode angitt i GB-PS2169 403. Det vil imidlertid lett forstås av en fagmann at fremgangsmåten og testkiten i henhold til oppfinnelsen er like anvendelige på hvilke som helst kliniske prøvematerialer for bruk i en hvilken som helst hybridiseringstest.
I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir en liten prøve fra 1 til noen få mikroliter av det kliniske prøvemateriale dryppet (spotted) direkte på gelen for synliggjøring. Volumet av prøven som skal testes bestemmes av følsomheten av den hybridiseringstest som skal anvendes. I det tilfelle hvor det kliniske prøvemateriale er sterkt fortynnet, dvs. tatt opp i et stort volum fortynningsmiddel, kan det være bekvemt å sentrifugere det kliniske celleprøvemateriale for å skaffe en cellepellet. Den sentrifugerte pellet blir deretter resuspendert i et egnet volum, f. eks. 100 fil, av en egnet f ortynningsoppløsning for å danne et mer konsentrert prøvemateriale. Den optimale fortynning avhenger av typen klinisk prøvemateriale som anvendes og den molekylære 'diagnostiske test som skal utføres, f.eks. påvisning av en spesifikk patogen mikroorganisme. Et egnet volum av denne prøvesuspensjon, fortrinnsvis fra en til noen få mikroliter, påføres gelplaten med pipette sammen med egnede DNA-sammenligningsoppløsninger inneholdende klart synlige mengder av et standard-DNA. Mengdene av standard-DNA i sammenligningsprøvene er bestemt eksperimentelt slik at en ufortynnet DNA-sammenligninsprøve gir et sterkt synlig signal, mens den fortynnede DNA-sammenligningsprøve gir et svakt, men klart synlig signal. I en mest foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen er DNA-sammenligningsprøven en oppløsning inneholdende 5 ng DNA pr./xl (høy positiv sammenligningsprøve) og en fortynning av denne-standard inneholdende 75 ng DNA pr. iil (lav positiv sammenligningsprøve) . De anvendte prøver tillates å drenere inn i agarosegelen i noen minutter.
Prøvene bør analyseres og velegnetheten av prøvematerialet bedømmes ved undersøkelse i en egnet belysning, fortrinnsvis i løpet av samme dag. De kliniske test-prøvematerialer anses å inneholde en tilstrekkelig mengde celler dersom intensiteten av signalet fra flekken av prøven av det fortynnede prøvemateriale er minst like stor som sammenligningsflekken av lavt positivt prøvemateriale. Et klinisk prøvemateriale som evalueres på denne måte anses som et tilstrekkelig prøvemateriale for hybridiseringsforsøket.
Anvendelsen av test-prøven og standardreagensene kan lettes ved at gelen forsynes med merkede prøvepåføringsflekker, dvs. utstansede fordypninger 4 i gelen som vist på fig. 2.
I det etterfølgende er en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen beskrevet nærmere i eksempler som viser en test for bestemmelse av velegnetheten av kliniske prøvematerialer til bruk i deteksjonen og identifikasjonen av human papillomavirus ve d AffiProbe™ (Or ion Pharmaceutica). Disse eksempler er ikke ment å begrense oppfinnelsens omfang. Forskjellige formater av de faste bærere og anvendeligheten av testen for andre infektuøse organismer kan lett tenkes for en fagmann.
Eksempel 1
Preparering av agarosegelen på en fast bærer
En agarosegelplate inneholdende etidiumbromid (EtBr) ble fremstilt ved tilsetning av 1,5 g agarose i 150 ml E-buffer (0,04 M Tris-acetat, 0,002 M EDTA, pH 8). Blandingen ble behandlet i en autoklav i 20 min og avkjølt i vann på 50°C.10/xl EtBr (10 mg/ml) ble tilsatt den avkjølte agarosegelblanding. Deretter ble 7 ml av denne blanding pipettert på en13 cm<2>plastbærer og tillatt å kjølne ved værelsetemperatur. Platene av EtBr-agarosegel ble lagret ved 4°C i beholdere som ikke slapp gjennom lys.
Eksempel 2
Bestemmelse av mengden av celler som er synlige i UV- belysning
I henhold til Parkkinen et al. (se ovenfor) bør et velegnet utskrapnings-prøvemateriale inneholde et minimum av 500 000 celler for å være påviselig i en sandwich-hybridiseringstest. Hybridiseringstesten AffiProbe™ HPV utføres på en 3 0/xl prøve tatt fra det kliniske utskrapnings-prøvemateriale. Dette eksempel ble utført for å bringe klarhet i hvorvidt det er mulig å gjenkjenne nukleinsyrer fra en celleprøve inneholdende 500 000 celler pr. 30/xl på en EtBr/agarosegel-plate uten noe ekstraksjons-, rense- eller konsentrasjonstrinn.
Dyrkede human R1610-celler ble tellet i et Coulter-telleapparat og 5xl0<5>celler ble suspendert i 30/xl PBS-E-buffer og 1/xl av denne suspensjon (1,7x10^ celler) ble dryppet på en agaroseplate sammen med en fortynningsserie av den samme prøve, som vist i tabell I. Fluorescensen av dryppflekkene ble sammenlignet med standardflekker inneholdende renset DNA i kjente mengder. 5 ng av en ren DNA-standard var klart synlig på platen. R1610-cellesuspensjonen inneholdende l,7xl0<3>celler//xl gav en sterkere fluorescens enn 5 ng-dryppflekken av rent DNA.
Disse resultater antyder at et egnet volum (1 til) av en cellesuspensjon inneholdende 5x10^ celler/3 0/xl DNA er klart synlig uten frigjøring eller rensing av DNA-innholdet i cellene.
Eksempel 3
Bestemmelse av den riktige fortynning av kliniske prøve-materialer
Celleinnholdet av fire kliniske celleprøvematerialer, cervikale utskrapninger oppsamlet for AffiProbe™ HPV-testen ble tellet i et Coulter telleapparat og en fortynningsserie av prøvene ble dryppet på en EtBr-agaroseplate, hvoretter dryppene, dvs. flekkene, ble visuelt analysert i UV-lys. Resultatet av forsøket er vist i tabell II.
Følsomheten av AffiProbe™-testen krever prøver som inneholder 300 000-400 000 celler i 30/xl PBS-E-buffer for testing av nærvær av human papillomavirus.
Det ble beregnet teoretisk at den 1:15 fortynning av AffiProbe-prøven som gav tilnærmet den samme fluorescens som 5 ng rent DNA inneholdt ca. 2,3 ng DNA. (Beregningen er basert på den tilnærmelse at IO<6>celler inneholder 3/xg DNA) . Den sterkere fluorescens sammenlignet med rent DNA skyldes muligens cellulært RNA. Da en av prøvene klart inneholdt blod, ble det også avklart at blodfargede prøvematerialer tolereres like godt i forsøket i henhold til oppfinnelsen. Dette ble ytterligere bekreftet i de forsøk som er beskrevet i eksemplene 4-6.
Da de fire prøvematerialer som ble testet i dette eksempel ble bekreftet å inneholde tilstrekkelig mange celler, var konklu-sjonen av dette forsøk at et klinisk prøvemateriale inneholder nok celler for ytterligere testing ved AffiProbe™ dersom1/xl av et 100/xl klinisk prøvemateriale gir et positivt signal ved en fortynning på 1:15.
Eksempel 4
. Evaluering av prøvetilstrekkelighet for cervikale utskrapninger for HVP- testing
Anvendeligheten av metoden for bedømmelse om hvorvidt et prøvemateriale var tilstrekkelig, ble ytterligere bestemt ved utprøving av kliniske prøvematerialer fra en undersøkelse ved et skandinavisk multisenter hvor cervikale avskrapninger ble samlet inn fra pasienter som var utsatt for papillomavirus-infeksjon. Alle kliniske prøvematerialer ble underkastet visuell inspeksjon av celleinnholdet. Denne visuelle inspeksjon ble gjort ved sentrifugering av de kliniske prøvematerialer, hvoretter celleinnholdet ble evaluert fra størrelsen av den oppnådde cellepellet. Dersom cellepelleten var meget liten eller fraværende, ble prøvematerialet betraktet som utilstrekkelig. Nærværet av viruset ble testet ved AffiProbe™ HPV-test og andre vanlige HPV-deteksjonstester.
Av 420 innsamlede avskrapninger ble i alt 48 prøvematerialer kassert ved undersøkelsen fordi den visuelle inspeksjon av prøvematerialet antydet en slik utilstrekkelighet. Denne store prosentandel (11%) viser det virkelige behov for en screening-metode for bestemmelse av prøvematerialets tilstrekkelighet ved klinikken.
Resultatet av den visuelle inspeksjon ble bekreftet ved testen i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Prøvematerialene ble fortynnet som vist i tabell III og dryppet på en EtBr-agaroseplate. DNA-standarder inneholdende 75 ng/ml og 5 ng/ml ble også dryppet på platen.
Eksempel 5
Evaluering av prøvetilstrekkeliahet for tvilsomme prøve-materialer
To prøvematerialer fra den multisenter-undersøkelse som er beskrevet i eksempel 4, som gav avvikende resultater i den visuelle tolkning av prøvematerialets tilstrekkelighet (visuell inspeksjon ble ansett som tilstrekkelig av to personer,utilstrekkelig av en), ble også testet for prøvematerialets tilstrekkelighet.
Prøvematerialene ble fortynnet og dryppet på en EtBr-agaroseplate som beskrevet i eksempel 2. Resultatene vist i tabell IV bekreftet at begge prøvematerialer inneholdt en tilstrekkelig mengde celler.
Eksempel 6
Evaluering av prøvens tilstrekkelighet for prøvematerialer som anses som tilstrekkelige ved visuell inspeksjon
En randomisert prøve (n=3 3) av prøvematerialene innbefattet i multisenter-undersøkelsen beskrevet i eksempel 4, som blebedømt å være tilstrekkelige for hybridiseringsforsøket ved visuell inspeksjon, ble testet for prøvematerialets tilstrekkelighet ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen. Denne test viste at bare 67% av prøvematerialene inneholdt en tilstrekkelig mengde celler, mens 33% av de kliniske prøve-materialer ikke var tilstrekkelige for en diagnostisk hybridiseringstest .
Prøvematerialene som ble testet er angitt i tabell V. De forskjellige prøvematerialkoder (A-E) indikerer at de kliniske prøvematerialer ble samlet inn ved forskjellige medisinske sentre.
Av de 11 utilstrekkelige prøvematerialer var det bare ett som gav et positivt signal i AffiProbe™-testen. I to tilfeller ble det bekreftet ved ytterligere testing at pasienten i virkelig-heten var infisert med HPV, mens de resterende åtte prøve-materialer ikke ble bekreftet.
Claims (13)
1. Fremgangsmåte til å bedømme velegnetheten av kliniske prøvematerialer som omfatter hele celler for nukleinsyre-hybridiseringsforsøk,
karakterisert vedde følgende trinn: (a) en representativ prøve fra prøvematerialet tas, (b) prøven påføres, uten noen mellomliggende behandling, på en gel i hvilken er dispergert et fargingsmiddel for nukleinsyre, (c) mengden av det nevnte fargingsmiddel som er bundet til prøven synliggjøres, og (d) mengden av det nevnte fargingsmiddel som er bundet til prøven sammenlignes med en kjent konsentrasjon av deoksyribonukleinsyre og fargingsmiddel for å bestemme det tilnærmede antall celler i prøven, hvori ingen av cellene i nevnte prøve, hvis antall skal vurderes, er behandlet slik at de ødelegges ei heller er de blitt renset.
2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat gelen velges fra en gruppe inneholdende agarose- eller polyakrylamidgeler.
3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat nukleinsyrens fargingsmiddel er et innføyingsmiddel som er visuelt påviselig når det er innføyet i nukleinsyrer.
4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3,karakterisert vedat nukleinsyrens fargingsmiddel er etidiumbromid.
5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4,karakterisert vedat nukleinsyreinnholdet av prøven evalueres ved den UV-induserte fluorescens avgitt av etidiumbromidmolekyler som er innføyet i prøvens nukleinsyre.
6. Fremgangsmåte som angitt i krav 2,karakterisert vedat gelen støpes på en fast bærer.
7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6,karakterisert vedat den faste bærer er en plastplate.
8. Kit for bedømmelse av velegnetheten av kliniske prøve-materialer for nukleinsyrehybridiseringsforsøk som angitt i ett av kravene 1-7,
karakterisert vedat den omfatter en gel på en fast bærer, hvilken gel inneholder et middel som spesifikt binder til nukleinsyrer og danner et visuelt påviselig signal.
9. Kit som angitt i krav 8,karakterisertved at nukleinsyrens fargingsmiddel er etidiumbromid.
10. Kit som angitt i krav 8,karakterisertved at den faste bærer velges fra en gruppe inneholdende glass og polystyren.
11. Kit som angitt i krav 8,karakterisertved at den faste bærer omfattende gelen er pakket i en for UV-lys ugjennomtrengelig beskyttende beholder.
12. Kit for å bedømme velegnetheten av kliniske prøve-materialer som fås fra genitalområdet for testing av nærværet av human papillomavirus ved nukleinsyrehybridisering,karakterisert vedat den omfatter en agarosegel på en fast bærer, hvilken agarosegel inneholder et middel som innføyes i nukleinsyrene og danner et visuelt påviselig signal, standard DNA-oppløsninger som positive sammenligningsprøver og egnede fortynningsmidler.
13. Kit som angitt i krav 12,karakterisertved at innføyingsmiddelet er etidiumbromid.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US60457590A | 1990-10-26 | 1990-10-26 | |
PCT/FI1991/000321 WO1992007955A1 (en) | 1990-10-26 | 1991-10-25 | Method for evaluating the adequacy of clinical specimens for hybridization assays and kit for performing the evaluation |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO922515D0 NO922515D0 (no) | 1992-06-25 |
NO922515L NO922515L (no) | 1992-08-25 |
NO303585B1 true NO303585B1 (no) | 1998-08-03 |
Family
ID=24420178
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO922515A NO303585B1 (no) | 1990-10-26 | 1992-06-25 | FremgangsmÕte til Õ bestemme hvorvidt et klinisk pr°vemateriale er egnet til bruk i nukleinsyrehybridiseringsfors°k og testkit for utf°relse av fremgangsmÕten |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0507904B1 (no) |
JP (1) | JP2718823B2 (no) |
AT (1) | ATE176001T1 (no) |
AU (1) | AU643086B2 (no) |
CA (1) | CA2071935C (no) |
DE (1) | DE69130795T2 (no) |
DK (1) | DK0507904T3 (no) |
ES (1) | ES2129411T3 (no) |
FI (1) | FI99027C (no) |
GR (1) | GR3029345T3 (no) |
NO (1) | NO303585B1 (no) |
WO (1) | WO1992007955A1 (no) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08501228A (ja) * | 1992-08-07 | 1996-02-13 | ジェンザイム・コーポレイション | 非液体細胞試料の採取方法 |
AU2777199A (en) * | 1998-02-19 | 1999-09-06 | Edvotek | Articles of manufacture and methods for staining biomolecules |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5109429A (en) * | 1985-11-04 | 1992-04-28 | Cell Analysis Systems,Inc. | Apparatus and method for analyses of biological specimens |
JP2681061B2 (ja) * | 1988-06-08 | 1997-11-19 | ロンドン・ダイアグノスティック・インコーポレーテッド | 検出可能なシグナルのセンシタイザー誘導発生を利用したアッセイ |
-
1991
- 1991-10-25 AU AU87127/91A patent/AU643086B2/en not_active Ceased
- 1991-10-25 WO PCT/FI1991/000321 patent/WO1992007955A1/en active IP Right Grant
- 1991-10-25 EP EP91917738A patent/EP0507904B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-25 DK DK91917738T patent/DK0507904T3/da active
- 1991-10-25 CA CA002071935A patent/CA2071935C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-10-25 AT AT91917738T patent/ATE176001T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-10-25 ES ES91917738T patent/ES2129411T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-25 JP JP3516421A patent/JP2718823B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-10-25 DE DE69130795T patent/DE69130795T2/de not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-06-24 FI FI922926A patent/FI99027C/fi not_active IP Right Cessation
- 1992-06-25 NO NO922515A patent/NO303585B1/no unknown
-
1999
- 1999-02-10 GR GR990400432T patent/GR3029345T3/el unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE69130795D1 (de) | 1999-03-04 |
FI99027B (fi) | 1997-06-13 |
FI99027C (fi) | 1999-10-20 |
NO922515L (no) | 1992-08-25 |
ATE176001T1 (de) | 1999-02-15 |
JPH05502798A (ja) | 1993-05-20 |
EP0507904A1 (en) | 1992-10-14 |
DE69130795T2 (de) | 1999-07-08 |
DK0507904T3 (da) | 1999-09-13 |
ES2129411T3 (es) | 1999-06-16 |
WO1992007955A1 (en) | 1992-05-14 |
FI922926A0 (fi) | 1992-06-24 |
NO922515D0 (no) | 1992-06-25 |
CA2071935A1 (en) | 1992-04-27 |
EP0507904B1 (en) | 1999-01-20 |
GR3029345T3 (en) | 1999-05-28 |
AU643086B2 (en) | 1993-11-04 |
FI922926A (fi) | 1992-06-24 |
CA2071935C (en) | 1996-06-11 |
AU8712791A (en) | 1992-05-26 |
JP2718823B2 (ja) | 1998-02-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Ahmed et al. | Comparison of current methods used to detect Cryptosporidium oocysts in stools | |
AU2007203372B2 (en) | Universal collection medium | |
Snijders et al. | HPV DNA detection and typing in cervical scrapes | |
AU2004278730B2 (en) | Automated cytological sample classification | |
EP1034040A2 (en) | Devices and methods for detecting target molecules in biological samples | |
WO2011008030A2 (ko) | 핵산 검출용 크로마토그래피 시스템 | |
EA010500B1 (ru) | Детектирование вируса папилломы человека | |
Tsang et al. | Canadian Public Health Laboratory Network laboratory guidelines for the use of direct tests to detect syphilis in Canada | |
JP2003530830A (ja) | 微生物の計数および同定方法 | |
Iglesias et al. | Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR | |
CN114410830A (zh) | 部分裂解和测定的方法 | |
Mota et al. | Filter paper performance in PCR for cutaneous leishmaniasis diagnosis | |
CN211339511U (zh) | 用于lamp或rt-lamp的一体化试纸条 | |
NO303585B1 (no) | FremgangsmÕte til Õ bestemme hvorvidt et klinisk pr°vemateriale er egnet til bruk i nukleinsyrehybridiseringsfors°k og testkit for utf°relse av fremgangsmÕten | |
Khanaliha et al. | Comparison of three staining methods for the detection of intestinal Microspora spp | |
Moyo et al. | Comparison of the AmpFire® Multiplex HPV Assay to the Xpert® HPV Assay for detection of human papillomavirus and cervical disease in women with human immunodeficiency virus: a pragmatic performance evaluation | |
US7569344B2 (en) | Detection of human papilloma virus in papanicolaou (Pap) smears | |
Ribeiro-dos-Santos et al. | An improved, PCR-based strategy for the detection of Trypanosoma cruzi in human blood samples | |
Kellogg et al. | Diff-Quik stain as a simplified alternative to Papanicolaou stain for determination of quality of endocervical specimens submitted for PCR detection of Chlamydia trachomatis | |
CN210340943U (zh) | 用于lamp或rt-lamp的整合一体式多联试纸条 | |
Aslan et al. | The diagnosis of malaria and identification of Plasmodium species by polymerase chain reaction in Turkey | |
Prétet et al. | Novaprep® Vial Test is a suitable liquid-based cytology medium for high risk human papillomavirus testing by Hybrid Capture 2 | |
Van Dijk et al. | Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection | |
Callaghan et al. | Hybrid capture as a means of detecting human papillomavirus DNA from liquid-based cytology specimens: a preliminary evaluation | |
Mazellier et al. | Papillomavirus genotyping on formaldehyde fixed paraffin-embedded tissues in vulvar intraepithelial neoplasia |