FI97444B

FI97444B - Menetelmä lääkkeenantojärjestelmän valmistamiseksi

Info

Publication number: FI97444B
Application number: FI895555A
Authority: FI
Inventors: Lisbeth Illum
Original assignee: Danbiosyst Uk
Priority date: 1987-05-22
Filing date: 1989-11-21
Publication date: 1996-09-13
Also published as: GB2231495A; NO178564B; GB8924696D0; EP0391896A1; CA1324079C; WO1988009163A1; AU614290B2; DK175316B1; JPH02503915A; DE3888201T2; GB8712176D0; DK583789A; DK583789D0; NO890283D0; AU1793188A; GB2231495B; NO178564C; DE3888201D1; FI895555A0; NO890283L

Description

97444

Menetelmä lääkkeenantojärjestelmän valmistamiseksi -Förfarande för framställning av ett läkemedelsavgivande system 5 Keksintö koskee menetelmää limakalvon läpi tapahtuvaan antoon tarkoitetun lääkkeenantojärjestelmän valmistamiseksi, joka järjestelmä parantaa aktiivisen lääkeaineen vastaanottoa, erityisesti suurimolekyylipainoisten materiaalien, erityisesti nenäontelosta.

10

Viitataan teknisiin julkaisuihin ja muihin tämän alueen julkaisuihin, jotka esitetään selitysmielessä.

EP-patenttihakemuksissa 023359 ja 122023 kuvataan jauhemainen 15 farmaseuttinen valmiste annettavaksi nenän limakalvoon, ja menetelmiä sen antoon. Farmaseuttinen valmiste mahdollistaa po-lypeptidien ja niiden johdannaisten tehokkaan absorboitumisen nenän limakalvon läpi. Samoin US-patenttijulkaisussa 4250163 kuvataan menetelmä lääkkeen antamiseksi nenän limakalvoon, 20 jossa edullisella valmisteella on limakalvoon adheesio-ominaisuuksia. EP-patenttihakemuksessa 123831 kuvataan bioyhteenso-pivien vesiliukoisten amfifUlisten steroidien, jotka eivät ole luonnollisia sappisuoloja, kyky lisätä lääkkeen läpäisemistä kehon pintojen läpi, käsittäen nenän. DE-patenttijui-25 kaisussa 2620446 kuvataan insuliinin vesiliuosformulaatio na-saaliseen antoon, joka formulaatio sisältää läpisemisen parantajan, joka on amfoteeristen, anionisten tai ei-ionisten pin-ta-aktiivisten aineiden, saponiinin, sappisuolojen tai surfak-tiinin muodossa. EP-patenttihakemus 230264 kuvaa nasaalisen 30 vesiliuoslääkkeenantojärjestelmän rokotteisiin, jotka sisältävät suurimolekyylipainoisen lääkkeen, geelinmuodostusaineen (esimerkiksi hydroksietyyliselluloosa) ja joissain tapauksissa * muita lisäaineita (esimerkiksi pinta-aktiivisia aineita, gly serolia tai polyetyleeniglykolia).

35

Mikään edellä olevista patenttijulkaisuista ja -hakemuksista ei kuvaa mikropallosten käyttöä nasaaliseen antoon, eikä mik-. ropallosten ja vastaanottoa parantavan aineen tai muiden apu- 2 97444 aineiden yhdistelmää, jonka voisi olettaa antavan paremman biosaatavuuden.

Nasaaliseen käyttöön tarkoitettu mikropallosvalmiste on kuvat-5 tu patenttijulkaisussa PCT/GB86/00721, mutta tämä koskee kuitenkin materiaaleja, joilla on ioninvaihto-ominaisuuksia, ja jotka ovat yhdelle ainoalle spesifiselle lääkkeelle, natrium-kromoglykaatille paikalliseen vaikutukseen paremminkin, kuin antoon yleisverenkiertoon.

10

Nykyisin on ehdotettu nenää vaihtoehtoisena antoreittinä systeemisessä verenkierrossa vaikuttaville lääkkeille. Erityisesti kiinnitetään huomiota bioteknologian tuotteisiin, nimittäin peptideihin ja proteiineihin. Muita esitettyjä lääkkeitä ovat 15 oraalisesti huonosti absorboituvat lääkkeet tai lääkkeet, jotka metaboloituvat täysin joko ruoansulatuskanavassa itsessään tai maksan first pass -metabolialla.

Nasaaliseila annolla katsotaan olevan mahdollisuuksia seuraa-20 vista seikoista johtuen: 1. nenässä on epiteelipinnalla olevan mikronukan johdosta lääkkeen absorptiota varten suuri pinta-ala; 2. epiteelikudoksen alainen kerros on tiheästi suonitettu; 3. laskimoveri nenästä kulkeutuu suoraan systeemiseen veren-25 kiertoon, ja siten vältetään maksan first pass -metaboliasta johtuva lääkkeen menetys.

Nyt on tutkittu laajan lääkejoukon biosaatavuus nasaalista reittiä. Toiset lääkkeet tuntuvat absorboituvan tehokkaasti, 30 ja niillä on laskimonsisäiseen antoon verrattava biosaatavuus. Useimmilla lääkkeillä on kuitenkin huono biosaatavuus intrana-saalisti annettuna, mutta poikkeuksia esiintyy. Luonnollinen steroidi progesteroni on hyvin tehoton oraalisesti annettaessa. Nasaalisesti annettuna se absorboituu tehokkaasti, ja sil-35 lä on laskimonsisäisellä ruiskeella saatavaan verrattava biosaatavuus; huippukonsentraatio ilmenee noin 6 min kuluttua. Julkaistujen tietojen mukaan oraalisesti annetun progesteronin biosaatavuus on luokkaa 1,2 % laskimonsisäiseen antoon verrattuna (1). Toinen esimerkki on β-salpaaja propranololi. Tämä

II

3 97444 lääke metaboloituu oraalisesti annettuna laajalti maksassa ja mahdollisesti suolen seinämässä. Kun lääke annetaan intrana-saalisesti yksinkertaisena liuoksena, ovat plasmatasot saunat kuin laskimonsisäisellä annolla saavutettavat (2).

5

Insuliini, jonka intranasaalista antoa on paljon tutkittu, voidaan antaa nenän membraanin läpi, mutta absorptioteho on tavallisesti noin 5 % annetusta annoksesta. Absorptiota voidaan parantaa niin kutsuttuja absorptionparantajia käyttämäl-10 lä. Esimerkiksi tutkimuksessa, jonka suoritti Salzman, annettiin insuliinia pinta-aktiivisen aineen, Laureth 9:n, läsnäollessa (3). Selvän annoksesta riippuvan suhteen lisäksi saatiin myös nopeasti ilmennyt huipputaso. Intranasaalisesti annetun insuliinin voimakkuus oli noin 1/10 laskimonsisäisesti annetun 15 insuliinin voimakkuudesta. Selvästi, jos insuliini voidaan antaa potilaille turvallisesti ja luotettavasti nasaalisella annolla, voisi tällaisella järjestelmällä olla mahdollisuuksia antoon aterioiden yhteydessä tyypin 1 sokeritaudissa.

20 Chien ja Chan (4) ovat koonneet yhteenvedon absorptiokapasi-teeteista joukolle nasaalisesti annettuja lääkkeitä. Huomautettakoon, että suuren molekyylipainon omaavat aineet, esimerkiksi peptidit ja proteiinit absorboituvat tavallisesti huonosti nasaalista reittiä. Huomautettakoon myös, että useimmil-25 la yhdisteistä, sekä suuren että pienen absorptiotehon omaavilla, huipputaso plasmassa oli noin 30 min sisällä. Siten ab-‘ sorptio on laajuudestaan riippumatta nopeaa, muttei erityisen pitkävaikutteista. Tämä ilmaisee, että lääke voi joko olla poistunut absorptiokohdasta, tai jos se on riittävän pysymä-30 tön, olla hajonnut ennen kuin edelleen absorboitumista voi tapahtua.

Tekijöitä, jotka vaikuttavat lääkkeen absorptioon nenästä systeemiseen verenkiertoon 35 Nasaalisuihkeiden nopeaa puhdistumaa nenästä mahdollisilta ab-sorptiopinnoilta voidaan pitää lääkkeiden menetykseen vaikuttavana päätekijänä. Lisäksi peptidien ja proteiinien tapauk-; sessa lääkkeen entsymaattisella hajoamisella ja molekyylin koolla voi myös olla merkitystä alhaisiin biosaatavuuksiin.

4 97444

Useimmiten nasaalisessa annossa on yritetty ratkaista lääkkeen tehottomasta absorptiosta riippuva ongelma käyttämällä absorp-tionparantajia, esimerkiksi sappisuolojen tai pinta-aktiivis-ten aineiden muodossa modifioimaan nenän limakalvon ominai-5 suuksia lisäämään täten vastaanottoa. Tyypillinen esimerkki on tutkimus, jonka ovat kuvanneet Hanson et ai. (5) peptidi lohen kalsitoniinin nasaalisesta annosta. Tässä kävi selvästi ilmi, että plasman kalsitoniinipitoisuudessa voi tapahtua selvä kasvu, kun lääke annetaan yhdistelmänä pinta-aktiivisen aineen 10 kanssa. Ilman parantajaa plasmassa ilmeni siten vain pieni määrä kaisitoniinia kun AUC parantajan kanssa puolestaan kas-voi 10-kertaiseksi. Samoin on sappisuolan (natriumdeoksiko-laatti) määrien lisäämisen merkittävä vaikutus insuliinin absorptioon hyvin kuvattu: Gordon ja muut (6).

15

Nasaalisesti kontrolloidusti vapauttavat järjestelmät Ilium et ai. (7) valitsivat mikropalloset, jotka on valmistet tu materiaaleista, joiden tiedetään turpoavan kontaktissa veden kanssa muodostaen geelimäisen kerroksen, jolla on hyvät 20 biotarttumisominaisuudet. Ne voisivat nenän limakalvoon tart-tumisestaan johtuen siten hyvinkin modifioida puhdistumaa. Valitut materiaalit käsittävät albumiinin, tärkkelyksen ja ioninvaihtoina teriaalin DEAE-Sephadex, ja mikropallosten koko on ollut halkaisijaltaan luokkaa 40 - 60 /im.

25

Merkittyjen mikropallosten puhdistumaa on tutkittu vapaaehtoi-: silla ihmisillä tavanomaista gammatuikelaskuria käyttäen (7).

Mikropalloset leimattiin tecnetium-99m:llä ja lisättiin nenään jauhemuodossa nasaalista insufflaattoria käyttäen. Kontrollei-30 na käytettiin neste- ja jauhevalmisteitä. Vapaaehtoisten nenän asento pidettiin samana gammakameran kollimaattorilla erityisesti suunniteltua matriisia käyttäen. Tuikepyyhkäisykuvat * otettiin sopivin aikavälein, ja kiinnostavat alueet muodostui vat kertymisalueiden ympärille nenäontelossa. Aika/aktiivi-35 suusprofiilit osoittivat selvästi, että nasaalisuihke- ja jau-hevalmisteiden puhdistuma-ajat olivat aika nopeita (50-% puhdistuma (T50%) 15 min) . Vastakohtana tälle on mikropallosilla . paljon pidemmät puhdistuma-ajat. 3 h kuluttua noin 50 % albu miini- ja tärkkelysmikropallosista ja 60 % DEAE-Sephadex-mik- il 5 97444 ropallosista oli edelleen antokohdassa. Puhdistuman puoliin-tumisajaksi tästä alkuperäisestä DEAE-Sephadex-mikropallosten kertymispaikasta laskettiin noin 4 h:ksi. Nykyisin tämän keksinnön hakijat tutkivat, antavatko nämä mikropallosjärjestel-5 mät parantuneen biosaatavuuden valituille lääkeaineille, käsittäen peptidit ja proteiinit. Hakijat olettavat, että pienentynyt puhdistumanopeus ja mahdollinen pysymättömien lääkkeiden suojaus entsyymeillä pilkkoutumista vastaan lisää ab-sorptiotehoa merkittävästi.

10

Kontrolloidusti vapauttavien järjestelmien suhteen on mielenkiintoista havaita, että Nagai ja kollegat (8) ovat onnistuneet lisäämään insuliinin absorptiota nasaalisen annon jälkeen koirilla geeliytyvää valmistetta käyttäen. Insuliini sekoitet-15 tiin selluloosamateriaalin ja Carbopol 934:n (polyakryylihap-po) kanssa ja annettiin jauhevalmisteena. Samoin, Morimoto ja kollegat (9) käyttivät nasaaligeeliä (jälleen polyakryylihap-po) insuliinin ja kalsitoniinin antojärjestelmänä rotilla. Saatiin merkittävä plasman glukoositasojen aleneminen normaa-20 liin valmisteeseen verrattuna, mikä ilmaisee kasvaneen absorp-tiotehon.

Lääkkeen annon suurin ongelma on suurimolekyylipainoisten materiaalien, kuten proteiinien ja peptidien absorption tehok-25 kuus biologisten kalvojen läpi. Tavallisesti keho ei ota vastaan tällaisia molekyylejä ruoansulatusreittiin, posken lima-kalvoon, peräsuolen limakalvoon, emättimen limakalvoon tai intranasaalisena järjestelmänä annettuna.

30 Kuten edellä mainittiin ja kuten Chien ja Chang (4) ovat osoittaneet viimeaikaisissa insuliinikokeissa, voidaan tällaisten yhdisteiden absorptiota lisätä, mikäli yhdisteet an-’ netaan yhdessä nk. absorptionparantajan kanssa. Näihin absorp- tionparannusmateriaaleihin on kuulunut ei-ionisia pinta-atii-35 visia aineita kuten myös erilaisia sappisuolajohdannaisia. Lisääntynyt membraanien läpäisevyys tämän tyyppisten pinta-aktiivisten materiaalien läsnäollessa ei ole ennalta odottama-. tonta, tosiasiassa vatsatautialan kirjallisuudessa tunnetaan suuri joukko sellaisia absorption edistäjiä (katsausta varten 6 97444 katso Davis et ai. 910). Tällaiset materiaalit eivät kuitenkaan membraaneja ärsyttävistä vaikutuksistaan johtuen sovellu farmakologisten aineiden pitkäaikaiseen antoon. Tämä ei käsitä ainoastaan pinta-aktiivisten ei-ionisia muunnoksia vaan myös 5 sappisuoloja ja sappisuolajohdannaisia (esim. fusidiinihappo).

Tämän keksinnön tarkoituksena on saada aikaan lääkkeenantojär-jestelmä, joka parantaa suurimolekyylipainoisten materiaalien antoa.

10

Siten tämä keksintö koskee menetelmää limakalvon läpi tapahtuvaan antoon tarkoitetun lääkkeenantojärjestelmän valmistamiseksi, joka järjestelmä käsittää suuren joukon mikropallos-hiukkasia, jotka sisältävät vaikuttavan lääkkeen ja kuhunkin 15 mikropalloshiukkaseen liittyneen aineen, jolla on ominaisuus lisätä vaikuttavan lääkkeen biosaatavuutta limakalvon lävitse. Tämä lääkkeenantojärjestelmä valmistetaan menetelmällä, joka käsittää seuraavat vaiheet: i) valmistetaan mikropalloshiukkasia, 20 ii) vaikuttava lääke ja aine sisällytetään mikropallosten valmistuksen aikana tai lääke ja aine sorboidaan mikropallosten sisään tai päälle niiden valmistuksen jälkeen, ja iii) mahdollisesti pakastekuivataan vaiheesta ii) saatu tuote. 25

Hiukkaset annetaan edullisesti biotarttumisominaisuuksia omaa-van jauheen muodossa suihkeena.

Pinta-aktiivisella aineella ei pitäisi olla kroonisia toksi-30 suusongelmia, koska in vivo pinta-aktiivisen aineen pitäisi olla ärsyttämätön ja/tai metaboloitua nopeasti tavalliseksi solun osaksi, jolla ei ole merkittävää ärsytysvaikutusta. Edullinen pinta-aktiivinen materiaali on lysolesitiini ja muut lysofosfatidyyliyhdisteet, kuten lysofosfatidyylietanoliamii-35 ni, lysofosfatidihappo ja vastaavat. Sopiva konsentraatio on 0,02 - 10 %.

it 7 97444 Tämän keksinnön suoritusmuotoja kuvataan nyt esimerkinomaisesti viitaten oheisiin piirroksiin, joissa: kuva 1 kuvaa graafisessa muodossa luonnollisen pinta-aktiivi-5 sen aineen käytön vaikutusta lääkkeen vastaanottoon ensimmäisessä kokeessa; kuva 2 kuvaa graafisessa muodossa luonnollisen pinta-aktiivisen aineen käytön vaikutusta, ja antoa mikropallosten muodos-10 sa; kuva 3 kuvaa graafisessa muodossa luonnollisen pinta-aktiivisen aineen käytön vaikutusta rottatutkimuskokeessa; 15 kuva 4 kuvaa plasmaglukoositasoa kaneilla intranasaalisen Zn-insuliinin annon jälkeen; kuva 5 kuvaa plasmaglukoosiatasoa kaneilla intranasaalisen Na-insuliinin annon jälkeen; 20 kuva 6 kuvaa plasmaglukoositasoja eri muodoissa annetuilla insuliinin intranasaalisilla annoilla; kuvassa 7 esitetään vastaavat plasman insuliinitasoien käy-25 rät; kuvassa 8 esitetään arvot rottakokeista, joissa annettiin hGH:ta intranasaalisti; ja 30 kuvassa 9 esitetään arvot lammaskokeista, joissa hGH annettiin intranasaalisti.

. Lysofosfatidit muodostuvat fosfolipidien hydrolyysillä. Täl laiset aineet ovat pinta-aktiivisia, ja muodostavat miselli-35 rakenteita. Tämän keksinnön mukaisesti aktiiviseen lääkkeeseen lisätään lysolesitiiniä ja muita lysofosfatideja vaikuttamaan lääkkeen annossa mahdollisena absorption par-antajana. Lysofosfatidyylikoliini muuttaa membraanien läpäisevyyttä ja 8 97444 mahdollistaa lisääntyneen proteiinien ia peptidien, käsittäen esimerkiksi insuliinin, ihmisen kasvuhormonin ia muiden bioteknologian ia rekombinantti-DNÄ-meneteImien tuotteiden vastaanoton. Annon jälkeen limakalvon sisäkettoverhon solut 5 muuttavat lysofosfatidit eheiksi fosfatideiksi, jotka ovat tavallisia solukomponentteja (katso de Vries et ai. (ID). (Myös lysolesitiiniä itseään esiintyy hyvin pieninä määrinä solumembraaneissa (12)). Tämä lysofosfatidien nopea ia tehokas muuntuminen täydelliseksi fosfatidirakenteeksi johtaa 10 huomattavasti vähentyneisiin ärsytys- tai toksisuussivuvaikutuksiin.

Lääke, joka on annetaan limakalvon pinnalle ruoansulatuskanavassa, sukuelinreitillä tai nenässä, silmässä tai keuhkoissa, 15 voidaan antaa viskoosina liuoksena, suspensiona tai jauheena yhdessä lysolesitiinin kanssa, tai edullisemmin kolloidisina hiukkasina, jotka käsittävät mikropallosjärjestelmän. Etuna biotarttuvilla mikropallosjärjestelmillä lisättäessä limakal-vopinnalle on, että tällaiset järjestelmät mahdollistaisivat 20 pitemmät kontaktiajanjaksot, erityisesti jos mikropalloset ovat hitaasti hajoavia. Tämä pätee erityisesti annettaessa nasaalisesti lääkkeitä, jotka on sisällytetty mikropallosiin, jotka on valmistettu luonnollisista materiaaleista, kuten albumiinista, gelatiinista, ja erityisesti tärkkelyksestä.

25 Joissain tapauksissa pitempi kontaktiaika yksinään saattaa antaa käyttöön riittävän parannuksen biologiseen saatavuu-• teen.

Edullinen parannusmateriaali on munan tai soijan lesitiinistä 30 valmistettu lysofosfatidyylikoliini. Voidaan käyttää muita lysofosfatidyylikoliineja, joissa on erilaisia asyyliryhmiä, kuten myös fosfatidyylietanoliamiineista ja fosfatidihapoista . valmistettuja lysoyhdisteitä, joilla on samanlaisia membraa- neja modifioivia ominaisuuksia. Asyylikarnitiinit (esimerkik-35 si palmitoyyli-DL-karnitiinikloridi) ovat eräs vaihtoehto.

Muihin parannusaineisiin, jotka olisivat tämän keksinnön mukaisesti sopivia, kuuluvat kelatoivat aineet (EGTA, EDTA, ai- I) 9 97444 ginaatit), pinta-aktiiviset aineet (erityisesti ei-ioniset materiaalit), asyyliglyserolit, rasvahapot ja -suolat, tylok-sapoli ja biologiset detergentit, jotka on lueteltu luettelossa SIGMA Catalog, 1988, s. 316 - 321. Myös aineet, jotka 5 modifioivat membraanin fluiditeettia ja läpäisevyyttä, olisivat sopivia, kuten enamiinit (esimerkiksi etyyliasetoasetaa-tin fenyylialaniinienamiini), malonaatit (esimerkiksi diety-leenioksimetyleenimalonaatti), salisylaatit, sappisuolat ja -analogit ja fusidaatit. Sopivia konsentraatioita olisivat 10 konsentraatiot jopa 10-%.

Sama antosääntö lääkkeelle, joka on sisällytetty biotarttuvan mikropallosen sisälle tai päälle lisätyn farmaseuttisen apuaineen kanssa, pätisi järjestelmille, jotka sisältävät vai-15 kuttavan lääkkeen ja mukolyyttisen aineen, peptidaasi-inhi-biittoreita tai asiaankuulumattoman polypeptidialustan yksinään tai yhdistelmänä. Sopivia mykolyyttisiä aineita olisivat tiolia sisältävät yhdisteet, kuten N-asetyylikysteiini ja sen johdannaiset. Peptidi-inhibiittoreita ovat aktinoniini, ama-20 statiini, antipaiini, bestatiini, klooriasetyyli-HQLeu-Äla-Gly-NHc?, diprotiini A ja B, ebelaktoni A ja B, E-64, leupep-tiini, pepstatiini A, fisforamidoni, H-Thr-(t-Bu)-Phe-Pro-Oh, aprotiini, kallikreiini-inh. 1, kymostationi, bentsamidiini, kymotrypsiini Ing. 11, trypsiini-inh. 111-0. Sopivia konsent-25 raatioita olisivat konsentraatiot 0,01 - 5 %.

Mikropalloset ovat kooltaan välillä 10 ja 100 nm, ja ne valmistetaan bioyhteensopivasta materiaalista, joka geeliytyy kontaktissa limakalvon pinnan kanssa. Tärkkelysmikropalloset 30 (tarvittaessa ristiiiitetyt) ovat edullisia materiaaleja. Muita mikropallosia ovat gelatiini, albumiini, dekstraani ja kollageeni. Näiden mikropallosjärjestelmien valmistus on far-* maseuttisessa kirjallisuudessa hyvin kuvattu (katso esimer kiksi Davis et ai. (13)). Emulsio- ja kerroserotusmenetelmät 35 ovat molemmat sopivia. Lopulliset mikropalloset voidaan modifioida kemiallisella ristiiiittämisellä ja kuumennuskäsitte-lyllä. Vaikuttava aine voidaan sisällyttää mikropallosten si-. sälle niiden formuloinnin aikana tai sorboida järjestelmän 10 97444 sisälle -tai päälle valmistuksen jälkeen. Järjestelmän tehokkuutta voidaan kontrolloida mikropallosmatriisin fysikaalisella luonteella ja esimerkiksi ristiliittämisen laajuudella. Mikropalloskuljetusjärjestelmä voisi myös käsittää mikropal-5 losia, jotka on valmistettu aktiivisesta peptidistä tai proteiinista itsestään, kuten insuliinimikropallosista.

Esimerkiksi tärkkelys/insuliini-järjestelmän valmistus suoritettiin lisäämällä pakastekuivattuja tärkkelysmikropallosia 10 fosfaattipuskurilluokseen (pH = 7,3), joka sisälsi insuliinin ja parannusjärjestelmän, sekoittamalla 1 h ja pakastekuivaa-malla kunnes saatiin kevyt jauhe. Tyypillinen insuliinin kon-sentraatio olisi 1 IU/mg mikropallosta ja tyypillinen paran-nusainejärjestelmän (esimerkiksi lysolesitiinin) konsentraa-15 tio 0,08 mg/mg mikropallosta. Mikropallosiin voidaan sisällyttää enemmän tai vähemmän lääkettä ja parannusainejärjeste lmää.

Käyttämällä mikropallosten ja parannusaineiden yhdistelmää on 20 havaittu, että biotarttuvilla mikropallosjärjestelmillä on kyky parantaa suuresti poolisten aineiden biosaatavuutta, kun ne annetaan yhdessä parannusainejärjestelmän kanssa. Tämä parannus on paljon suurempi, kuin parannus, joka voidaan saavuttaa parannusaineel 1 a sinänsä. Tämän pai-annusainevaikutuk-25 sen potensoinnin uskotaan johtuvan lääkkeenantojärjestelmän pitemmästä viipymisajasta nenäontelossa. Teorian on havaittu pätevän erilaisille lääkkeille, kuten gentamiinille, insuliinille ja kasvuhormonille. Näihin tutkimuksiin valittu paran-nusaine oli lysofosfatidyylikoliini (edellä kuvattu). Teoria 30 toimisi yhtä hyvin muille parannusainejärjestelmiile (katso luetteloa muualta) ja muille lääkkeille, kuten: insuliini (heksameerinen/dimeerinen/monomeerinen muoto) glukagoni kasvuhormoni (somatotropiini) 35 polypeptidit tai niiden johdannaiset (edullisesti molekyyli-paino noin 1000 - 300000) kalsitoniinit ja niiden synteettiset modifikaatiot ·; enkefaliinit 11 11 97444 interferonit (erityisesti interferoni a-2 tavallisten vilustumisten hoitoon) LHRH ja analogit (nafareliini, busereliini, Zolidex) GHRH (kasvuhormonia vapauttava hormoni) 5 sekretiini nifedipiini bradykiniiniantagonistit GRF (kasvua vapauttava teki ia)

THF

10 TRH (tyrotropiinia vapauttava hormoni) ACTH-analogit IGF (insuliinityyppiset kasvutekijät) CGRP (kalsitonigeeniin liittyvä peptidi) atrialinen natriureettinen peptidi 15 vasopressiini ja analogit (DDAVP, lypressiini) antibiootit metoklopramidi migreenin käsittely (dihydroergotamiini, ergometriini, er-gotamiini, pitsotsiini)

20 nasaaliset rokotteet (erityisesti AIDS-rokotteet) tekijä VIII

Antibiootit ja antimikrobiaaliset aineet, kuten tetrasykli!-nihydrokloridi, leukomysiini, penisilliini, penisilliinijoh-25 dannaiset ja erytromysiini, kemoterapeuttiset aineet, kuten sulfatiatsoli ja nitrofuratsoni; paikallispuudutteet, kuten bentsokaiini; vasokonstriktorit, kuten fenyyliefx'iinihydrok-loridi, tetrahydrotsoliinihydrokloridi, nafatsoliininiti-aat-ti, oksimetatsoliinihydrokloridi ja tramatsoliinihydroklori-30 di; sydänlääkkeet, kuten digitalis ja digoksiini; vasodila-toivat lääkeaineet, kuten nitroglyseriini ja papaveriinihyd-; rokloridi; antiseptiset aineet, kuten klooriheksidiinihydro- kloridi, heksyyliresorsinoli, dekvaliniumkloridi ja etakri-diini; entsyymit, kuten lysotsymikloridi, dekstranaasi; luu-35 metaboliaa kontrolloivat aineet, kuten vitamiini Efe> ja aktiivinen vitamiini D3; sukupuolihormonit; verenpainetta alentavat lääkkeet; rauhoittavat lääkkeet; ja syöpälääkkeet.

12 97444

Steroidiset tulehduksenvastaiset aineet, kuten hydrokortisoni, prednisoni, flutikasoni, predonisoloni, triamsinoloni, triamsinoloniasetonidi, deksametasoni, betametasoni. beklo-metasoni ia beklometasonidipropionaatti; ei-steroidiset anti-5 inflammatoriset aineet, kuten asetaminofeeni, aspiriini, ami-nopyriini, fenyylibutatsoni, mefenaamihappo, ibuprofeeni, di-klofenaakkinatrium, indometasiini, kolkisiini ia probenesidi; entsymaattiset anti-inflammatoriset aineet, kuten kymotryp-siini ia bromeliiniseratiopeptidaasi; antihistaminiiniset ai-10 neet, kuten difenhydramiinihydrokloridi, kloorifeniramiinima-leaatti ia klemastiini; antiallergia-aineet (yskää vastusta-vat/ysköksiä irrottavat antiastmaattiset aineet, kuten nat-riumkromoglykaatti, kodeiinifosfaatti ia isoprotereolihydro-kloridi.

15

Anto

Mikropalloset voidaan antaa nasaalista reittiä nasaali-in-sufflaattorilaitetta käyttäen. Esimerkkejä näistä on io käytössä nasaaliseen antoon tarkoitetuissa kaupallisissa jauhe-20 järjestelmissä (esimerkiksi Fisonin Lomudal - jäi* iestelmä) . Farmaseuttisesta kirjallisuudesta löytyy esimerkkejä muista laitteista (katso esimerkiksi: Bell, A. Intranasal Delivery devices, in Drug Delivery Devices Fundamentals and Applications, Tyle P. (toim.), Dekker, New Yoi'k, 1988).

25

Eläimillä suoritetut nasaaliset antokokeet.

* Seuraavat eläimillä (rotilla, kaneilla ja lampailla) suorite tut nasaaliset antotutkimukset suoritettiin keksinnön havainnollistamiseksi .

30

Gentamysiini: Lääke gentamysiini valittiin mallitestiaineeksi. Tämä pooli-nen yhdistelmä tunnetaan huonosti absorboituvaksi nenään an-nettuna (katso esimerkiksi Duchateau et ai. (17), ia biolo-35 gista saatavuutta voidaan parantaa lisätyillä sappisuoloilla.

Ro t ta tutk imuk s e t Käytettiin in situ-rottamallia, jonka on kuvannut Hirai et

II

13 97444 ai. (14), modifioituna Fisher et al.:in (15) tavalla. Koiras-puoliset Wistar-rotat, jotka painoivat noin 200 g, nukutettiin vatsaontelonsisäisellä pentobarbitoniruiskeella, 80 mg/-kg (Sagatal, 60 mg/ml). Rottien henkitorviin tehtiin avanne, 5 ruokatorvi suljettiin, ja yhteinen päänvaltimo kanyloitiin.

Tilavuus gentamysiiniliuosta, joka sisälsi 0,5 % lääkettä lisätyn lysofosfatidyylikoliinin (LPC) (0,2 %) kanssa ja ilman, lisättiin nenäonteloon. Päänvaltimosta otettiin verinäytteet 10 hetkillä 0, 5, 10, 15, 30, 45, 60 ja 120 min lääkkeen annon jälkeen. Gentamysiinitasot määritettiin EMIT-menetelmällä (16). LPC-parannusaineen vaikutus esitetään kuvassa 1. Genta-mysiiniliuoksen anto yksinään sai aikaan huonon biosaatavuuden, kun taas parannusainejärjestelmän lisäys sai aikaan 5-15 kertaisesti suuremman huipputason. AUC oli 128 ug min/ml hetkellä t = 0, ja 557 ug min/ml hetkellä 120 min.

Lamrnastutkimukset

Ristisiitetyt (Suffolk ja Texel) lampaat jaettiin 3:n ja 2:n 20 ryhmiin. Lampaiden keskipaino oli noin 40 kg.

Eläimet eivät paastonneet ennen gentamysiinin antoa. Kunkin eläimen oikeaan kaulalaskimoon asetettiin kokeen ensimmäisenä päivänä paikalleenturpoava Viggo secalon universal-sentraali-25 nen laskimokatetri, sisähalkaisijaltaan 1,2 mm, jossa oli secalon universal-virtausventtiili, ja huuhdeltiin tarvittaessa aukipitämiseksi heparinisoidulla normaalisuolalvuoksella (50 IU/ml). Katetri poistettiin tutkimuksen lopussa. Lampaat nukutettiin intranasaalista antoa varten ketamiini-30 hydrokloridin IV-annoksella, 2 mg/kg annon aikaisen aivastuksen estämiseksi. Nukutus kesti noin 3 min. Myös eläimet, jotka saivat gentamysiiniä laskimonsisäisesti, nukutettiin.

Liuosten intranasaaliseen antoon lampaan sieraimeen asetet-35 tiin siniviivoitettu, 35-cm napakanyyli (koko 6 FG) ennalta-määrättyyn 10-cm syvyyteen ennen liuoksen lisäystä 1-ml ruiskusta. Jauhevalmisteiden antamiseksi 6,5-mm BOC henkitorvi-putkeen (punaista kumia, taivutettu) lisättiin jauhevalmis- 14 97444 tetta, ia se asetettiin sitten lampaan sieraimeen määrättyyn 6-cm syvyyteen ennen jauheen puhaltamista nenäonteloon.

Ensimmäinen lammasryhmä (n = 2) sai 0,25 ml gentamysiini-5 liuosta (386 mg/ml) (5,0 mg/kg) kumpaankin sieraimeen. Toinen ryhmä (n = 3) sai kumpaankin sieraimeen gentamysiiniliuosta (386 mg/ml) (5,0 mg/kg), joka sisälsi 2 mg/ml LPC:tä. Kolmas ryhmä (n = 3) sai 5,0 mg/kg gentamysiiniä ja 0,2 mg/kg LPC:tä yhdistelmänä tärkkelysmikropallosten kanssa (1,9 mg 10 gentamysiiniä/mg tärkkelysmikropallosia). Viimeinen lammas-ryhmä (n = 3) sai laskimonsisäisesti 2 mg/kg gentamysiiniä liuoksena (40 mg/ml) kaulalaskimon kautta. Kaulalaskimon kautta otettiin verinäytteitä (2-ml) hetkillä 0, 8, 16, 24, 32, 45, 60, 90, 120, 180 ja 240 min lääkkeen annosta. Seerumi 15 erotettiin sentrifugoimalla, ja näytteitä säilytettiin -20 °C:ssa odottamassa analyysiä. Mihinkään näytteistä ei lisätty hepariinia. Gentamysiinitasot määritettiin EMIT-tekniikalla (16) .

20 Dramaattinen vaikutus havaittiin, kun gentamysiini plus pa-rannusaine annetaan tärkkelysmikropallosvalmisteen muodossa, veren huipputason ollessa 6,3 pg/ml verrattuna gentamiini-liuoksella saatuun huippuun 0,4 ug/ml. Mikr©pallosten plus LPC-parannusaineen yhdistelmä antaa taso veressä/aika-profii-25 Iin, joka on hyvin samanlainen kuin gentamysiiniä laskimonsisäisesti antamalla saatu (kuva 2).

Annetut annokset huomioon ottaen on intranasaalisesti yhdistelmänä LPC-parannusaineen ja geeliytyvän mikropallosjärjes-30 telmän kanssa annetun gentamysiinin biosaatavuus 57,3 % verrattuna gentamysiinin IV-annokseen.

Insuliini

Glukoosin plasmatasot. analysoitiin eläinkokeissa glukoosiok-35 sidaasimenetelmällä. Plasman insuliinitasot määritettiin kani- ja lammaskokeissa radioimmunomäärityksellä kaksoisvas-ta-ainetekniikan avulla.

li.

15 97444

Rottakokeet: Käytettiin Hirain in situ-rottamallia (Fisherin modifioimaa) insuliinin nasaalisen absorption tutkimiseksi yön yli paastonneilla koiraspuolisilla Wistar-rotilla, jotka painoivat 5 noin 150 g. Rotat nilkutettiin vatsaontelonsisäisellä 0,25-ml pentobarbitoniruiskeella (60 mg/ml).

Valmistettiin puskuriin (1/75 M Na^PO*.), pH 7,3, sinkki (Zn)-ihmisen insuliinin 250 IV/ml liuos. Joissain kokeissa valmis-10 teeseen lisättiin 0,2 % LPC tai vertailun vuoksi 1 % glykode-oksikolaattia (GDC) absorptioparannusaineeksi. Kokeet suoritettiin rinnakkaisnäyttein (n = 4). Nenäonteloon lisättiin 10 μΐ vastaten 16,67 IV/kg (2,5 IV/rotta). Otettiin verinäytteet (0,2 ml) 5-ml fluoridioksalaattiputkiin hetkillä 10, 6 ja 2 15 min ennen antoa ja hetkillä 5, 10, 20, 40, 60, 90, 120, 180, 240 ja 300 min annon jälkeen. Veri korvattiin kaulalaskimon kautta annetulla suolaliuoksella.

Kuvassa 3 esitetään glukoositasot rotilla, jotka saivat int-20 ranasaaliset annokset Zn-insuliiniliuosta, Zn-insuliiniliuosta yhdistelmänä 0.2 % LPC:n kanssa tai Zn-insuliiniliuosta yhdistelmänä 1 % GDC:n kanssa. Tulokset osoittavat, että int-ranasaalisesti yksinkertaisena liuoksena annettu insuliini ei ole tehokas plasman glukoositason parantamiseen, kun taas pa-25 rannusainejärjestelmä, kuten LPC saa mitatuissa plasmatasois-sa aikaan nopean ja merkittävän laskun. LPC-parannusainejärjestelmällä konsentraatiossa 0.2 % tässä in situ-mallissa, jossa mikrokarvojen puhdistumamekanismi on heikentynyt, voidaan nähdä samanlainen vaikutus, kuin l-% sappisuolalla.

30

Tutkimukset kaneilla: : Zn-insuliini- (pääosin heksameerimuodossa) tai Na-insuliini- valmisteita (pääosin monomeeri/dimeeri-muodoissa) annettiin kaneille nasaalisesti joko vapaana insuliinina tai mikropal-35 losantojärjestelmänä lysofosfatidyylikoliinin (LPC) kanssa parannusaineena. Kokeet suoritettiin rinnakkaismääi-ityksin (n = 4).

.: Tässä tutkimuksessa käytettiin paastoamattomia Uuden Seelan- 16 97444 nin naaraspuolisia kaneja, joiden keskimääräinen paino oli 3.5 kg.

Puskuriin (1/7 5 M NaeHPO*,), pH 7,3 - 7,4, valmistettiin 40 5 IU/ml Zn- tai Na- ihmisen insuliinin liuos. Joissain kokeissa lisättiin 0,2 % LPC:tä.

Eppendorf-pipettiä käyttäen lisättiin intranasaalisti yhteensä 200 ui liuosta. (100 ui kumpaankin sieraimeen) vastaten 10 noin 2,3 IU/kg.

Kaneille annettiin ihonalaisesti insuliinia 0,8 IU/kg 14 IU/ml-vesiliuoksesta tai 0,6 IU/kg 10 IU/ml-vesiliuoksesta.

15 Tärkkelysmikropallosten annos oli kiinteä 2,5 mg/kg, ja insuliinin annos oli kiinteä 2,5 IU/kg. LPC-annos oli 0,2 mg/kg. Kanien keskimääräinen paino oli 3,5 kg.

25 mg mikropallosia lisättiin pieneen lasipulloon, ja lisät-20 tiin 250 ui 100 IU/ml insuliiniliuosta (Na- tai -insuliini), ja sitten 2 mg LPC ja 250 ui tislattua vettä. Sitten mikro-palloset saivat seistä 2 h huoneenlämpötilassa kosketuksissa insuliiniliuoksen kanssa ennen pakastekuivausta.

25 Noin 15 mg of pakastekuivattua jauhetta kustakin yksittäisestä pullosta täytettiin applikaattoriputkeen, ja tämä säilytettiin käyttöön asti kuivauslaitteessa.

Kanit saivat ehdotetun annoksen nenäonteloon ilman nukutusta. 30 Kutakin kania pidettiin selällään applikoinnin aikana ja 10 s sen jälkeen jotta varmistettaisiin jauhevalmisteen anto. Ää-reiskorvalaskimosta otettiin verinäytteitä, 200 ui glukoosi-; määritystä, ja 2 ml insuliinimääritystä varten hetkillä 10 ja 5 min ennen antoa ja hetkellä 5, 15, 30, 45, 60, 90, 120 ja 35 180 min annon jälkeen. Insuliinianalyysiä varten otettua verta sekoitettiin varovasti 5-ml heparinisoiduissa (Li-heparii-ni) putkissa. Glukoosianalyysiä varten otettua verta sekoitettiin varovasti 5-ml fluoridioksalaattiputkissa. Glukoosi- 17 97444 analyysiä varten otetut verinäytteet pidettiin murskatussa jäässä välitöntä analyysiä odottamassa. Verinäytteitä insu-liinianalyysiä varten sentrifugoitiin nopeudella 3000 r/min, ja kerätty plasma säilytettiin -20 °C:ssa odottamassa analyy-5 siä.

Kuvassa 4 esitetään plasman glukoositaso kaneilla, joille annettiin intranasaalinen Zn-insuliinin yksinkertainen liuos, ja kuvassa 5 esitetään plasman glukoositaso kaneilla, joille 10 annettiin Na-insuliinin yksinkertainen liuos, yksinkertaisina liuoksina lisätyn 0,2 % LPC:n tai tärkkelysmikropallosten ja LPC:n yhdistelmän kanssa. Esitetään myös plasmaglukoositasot kaneilla, jotka saivat ihonalaiset Zn-insuliini- tai Na-insu-liiniruiskeet. Tulokset osoittavat, että molemmantyyppisillä 15 insuliineilla (heksameerisellä - ja monomeeri/dimeeri-muodolla) insuliinin anto yhdistelmänä LPC-pai'annusainejärjestelmän kanssa laskee plasmaglukoositasoja merkittävästi yksinkertaisiin insuliiniliuoksiin verrattuna. Vielä huomattavampia plasmaglukoositasojen laskuja havaitaan annettaessa insuliini 20 yhdistelmänä mikropallosten ja parannusainejärjestelmän kanssa. Plasmaglukoosikäyrien muodot viimeksi mainituille järjestelmille olivat hämmästyttävällä tavalla samanlaiset kuin ihonalaisella annolla saadut, vaikkakin annokset ovat 2,5 IU/kg verrattuna ihonalaiseen annosteluun 0,8 IU/kg.

25

Lammaskokeet ' 1 mg Zn-kiteytettyä, erittäin puhdasta, puolisynteettistä ih misen insuliinia vastaa 28 IU insuliinia. Insuliiniliuokset formuloitiin 1/75 M fosfaattipuskuriin (pH 7,3).

30 Tässä tutkimuksessa käytettiin 15 ristisiitettyä (Suffolk ja Texel) lammasta käytettiin. Eläimet korvamerkittiin ja punnittiin ennen tutkimusta: 35 Lampaiden keskipaino kg:na (± S.D.) oli 35,9 (± 2,7). Eläimet eivät paastonneet ennen insuliinin antoa, koska tämän käytännön toteuttaminen on vaikeaa, ja koska on mahdollisuus insuliiniresistenssin indusoimiseen eläimillä. Viimeksimainittu 18 97444 ilmaus tarkoittaa, että lampaan veren glukoositasot eivät sellaisissa olisuhteissa vastaisi yhtä hyvin annettuun insuliiniin.

5 Kunkin eläimen oikeaan kaulalaskimoon asetettiin kokeen ensimmäisenä päivänä paikalleenturpoava Viggo secalon universal -sentraalinen laskimokatetri, sisähalkaisilaitaan 1.2 mm, jossa oli secalon universal-virtausventtiili, ja huuhdeltiin tarvittaessa aukipitämiseksi heparinisoidulla normaalisuola-10 liuoksella (50 IU/ml). Tämä katetri poistettiin tutkimuksen lopussa.

Insuliiniliuosten ja -jauheiden valmistus:

Insuliinin kantaliuokset valmistettiin 1/75 M fosfaattipusku-15 riin (pH 7,3). Näitä käytettiin nestemäisinä valmisteina las-kimonsisäiseen ja intranasaaliseen antoon, ja myös lyofili-soitujen mikropallovalmisteiden formulointiin. Viimeksi mainitut valmistettiin dispergoimalla tarvittava määrä mikropal-losia insuliiniliuokseen (+ kaikki LPC), sekoittamalla 1 h 20 huoneenlämpötilassa, ja pakastekuivaamalla sitten jauheval-misteen saamiseksi.

Insuliinivalmisteiden anto:

Insuliinia annettiin 0,1 IU/kg laskimonsisäisesti, 0,2 IU/kg 25 ihonalaisesti ja 2 IU/kg intranasaalisesti. Kussakin kokeessa käytettiin 3 lammasta: (1) insuliinin laskimonsisäinen anto vesiliuoksena, formuloitu 4 IU/ml:aan: lampaat J, K ja L, 24/11/87.

30 (2) vesiliuoksen intranasaalinen anto, formuloitu 200 : IU/ml:aan: lampaat A, B ja C, 24/11/87.

(3) vesiliuoksen intranasaalinen anto, formuloitu 200 35 IU/ml:aan yhdistelmänä 0,2 % LPC:n kanssa (0,02 mg/kg): lampaat D, E ja F, 24/11/87.

. (4) intranasaalinen insuliinin anto yhdistelmänä tärkkelys- 19 97444 mikropallosten (2,5 mg/kg) ja LPC:n (0,20 mg/kg) kanssa lyo-filisoituna jauheena. Valmisteen formuloimiseksi 500 mg Sphe-rexiä dispergoitiin 30 ml:aan 1/75M fosfaattipuskuria (pH 7,3), joka sisälsi 400 IU insuliinia ja 40 mg LPC:tä, sekoi-5 tettiin 1 h, ja pakastekuivattiin sitten: lampaat M, N ja 0, 26/11/87.

(5) intranasaalinen tärkkelysmikropallosten (2,5 mg/kg) anto ilman insuliinia. Valmisteen formuloimiseksi 500 mg Sphex-exiä 10 dispergoitiin 30 ml:aan 1/75M fosfaattipuskuria (pH 7,3), sekoitettiin 1 h ja pakastekuivattiin sitten: lampaat G, H ja I, 24/11/87.

(6) insuliinin ihonalainen anto vesiliuoksena, formuloitu 4,2 15 IU/ml:aan.

Liuosten intranasaaliseen antoon lampaan sieraimeen asetettiin siniviivoitettu, 35-cm napakanyyli (koko 6 FG, Portex Ltd., Hythe, Kent, Englanti) ennaltamäärättyyn 10-cm syvyy-20 teen ennen liuoksen lisäystä 1-ml ruiskusta. Jauhevalmistei-den antamiseksi 6,5-mm BOC henkitorviputkeen (punaista kumia, taivutettu) lisättiin jauhevalmistetta, ja se asetettiin sitten lampaan sieraimeen määrättyyn 6-cm syvyyteen ennen jauheen puhaltamista nenäonteloon.

25

Lampaat nukutettiin intranasaalista antoa varten ketamiini-hydrokloridin IV-annoksella, 2 mg/kg annon aikaisen aivastuksen estämiseksi. Nukutus kesti noin 3 min. Myös eläimet, jotka saivat insuliinia laskimonsisäisesti, nukutettiin vastus-30 tamaan ketamiinin mahdollisia vaikutuksia mitattuihin veren glukoosin tai insuliinin tasoihin.

Kanyloidusta lampaan kaulalaskimosta otettiin 5-ml verinäytteet jäämurskaan hetkillä 15 ja 5 min ennen insuliinin antoa, 35 ja hetkillä 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 120, 150, 180 ja 240 min annon jälkeen. Kaikki verinäytteet jaettiin 2 osaan. Insuliinianalyysiä varten otettua verta (2,5 ml) sekoitettiin varovasti 5-ml heparinisoiduissa (Li-hepariini) 20 9 7 4 4 4 putkissa. Glukoosianalyysiä varten otettua verta (2,5 ml) sekoitettiin varovasti 5-ml fluoridioksalaattiputkissa. Kaikki näytteet pidettiin ottamisen jälkeen jäämurskassa odottamassa sentrifugointia, joka suoritettiin sitten 4 °C:ssa nopeudella 5 3000 r/min. Kerätty plasma säilytettiin -20 °C:ssa odottamassa insuliini- ja glukoosianalyysiä (radioimmunomääritys insuliinille ) .

Kuvassa 6 esitetään plasmaglukoositasot, jotka saatiin anta-10 maila intranasaalisesti yksinkertainen insuliiniliuos, 0-koe tärkkelysmikropallosia, insuliiniliuosta, johon on lisätty 0,2 % LPC:tä, insuliinia mikropallosvalmisteena LPC:n kanssa, ja antamalla insuliinia laskimonsisäisesti. Kuvassa 7 nähdään vastaavat käyrät plasman insuliinitasoille. Kuten rotta- ja 15 kanikokeista nähdään, ei intranasaalisesti annetulla yksinkertaisella insuliiniliuoksella ole merkittävää vaikutusta plasman glukoositasoon, ja tätä reittiä absorboituneen insuliinin määrä on todella hyvin pieni. Parannusainejärjestelmän (LPC) lisäys formulaatioon lisää verenkierrossa ilmenevän in-20 suliinin määrää, ja aiheuttaa siten jonkin verran alhaisemman plasman glukoositason. Insuliinin anto yhdistelmänä tärkke-lysmikropallosten ja LPC:n kanssa tuottaa 693 % lisäyksen plasmainsuliinin AUC:hen verrattuna yksinkertaiseen nasaali-seen insuliiniliuokseen. Samalla insuliinin huipputaso kasvaa 25 1040 %:lla. Terävä tasohuippu ilmenee kohdalla 15 - 20 min ja laskee nopeasti kuten laskomonsisäisesti annetullekin insuliinille. Tarkasteltaessa insuliini/mikropallos/parannusai-ne-järjestelmää antamalla saatuja glukoositasoja plasmaglu-koosiprofiilin muoto on hyvin samanlainen kuin laskimonsisäi-30 sellä insuliinilla saatu. Tämän järjestelmän suhteellinen biosaatavuus on noin 25 % verrattuna ihonalaiseen insuliini-ruiskeeseen .

Ihmisen kasvuhormoni 3 5 Kaikissa kokeissa käytettiin biosynteettistä hGH:t.a. Plasma-tasot analysoitiin kiintofaasi-2-puolisesti kerrostettu-ELISA-tekniikkaa käyttäen. Plasma määritettiin kaksoiskokeena 1/10-laimennoksena vasta-aineinkubointipuskuriin valmistettua ti 21 97444 B-hGH:ta (0,11 - 7,0 ng/ml) vastaan, ja myös sopivaan plasma-laimennokseen valmistettuna.

Rottatutkimukset: 5 Kuten edellä, suoritettiin kokeet käyttäen Hirain kuvaamaa ja Fisherin modifioimaa rotan in situ-mallia.

Paastoamattomat koiraspuoliset Wistar-rotat., jotka painoivat noin 200 g, jaettiin 4:n ryhmiin, ja nukutettiin 0,35-ml pen-10 tobarbitonin vatsaontelonsisäisellä ruiskeella (60 mg/ml).

Rotille annettiin 3 eri hGH-valmistetta, nimittäin hGH:n 10-mg/ml liuos kaliumfosfaattipuskurissa (1,75 M), pH = 7,2, edellä mainittu liuos, johon lisättiin 0,05 % LPC:t.ä, ja 15 edellä mainittu liuos, johon lisättiin 0,5 % LPC:tä.

20 μΐ (1 mg/kg) jotain 3 valmisteesta annettiin intranasaa-listi muoviputken avulla.

20 Kaikki kokeet suoritettiin rinnakkaismäärityksin. Otettiin verinäytteitä, 20 tippaa, ja pidettiin ne jäissä, ajanhetkil-lä 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120, 180, 240 ja 300 min annon jälkeen. Plasma erotettiin ja säilytettiin analyysiin asti -20 °C:ssa.

25

Kuvasta 8 nähdään, ettei intranasaalisesti liuoksena ilman ·, parannusainejärjestelmää annettu hGH absorboidu merkittävässä määrin nasaalimembraanin kautta. Lisättessä luokseen 0,5 % LPC:tä saatavat huipputasot plasmassa kasvavat kuitenkin noin 30 3,5 ng/ml:sta noin 57 ng/ml:aan hyvin merkittävällä vaikutuksella AUC:hen. Hyvin alhaisen LPC:n konsentraation (0,05 %) lisäyksellä ei ilmeisesti ole vaikutusta hGH:n absorptioon.

Lammastutkimukset: 35 Tässä tutkimuksessa käytettiin 12 ristisiitettyä (Suffolk ia Texel) lammasta. Eläimet korvamerkittiin ja punnittiin ennen tutkimusta: 22 9 7 4 4 4

Lampaiden keskipaino kg:na (± S.D.) oli 35,8 (± 3,0).

Kunkin eläimen oikeaan kaulalaskimoon asetettiin kokeen ensimmäisenä päivänä paikalleenturpoava Viggo secalon univer-5 sal-sentraalinen laskimokatetri, sisähalkaisijaltaan 1.2 mm, jossa oli secalon universal-virtausventtiili, ja huuhdeltiin tarvittaessa aukipitämiseksi heparinisoidulla normaalisuola-liuoksella (25 IU/ml). Tämä katetri poistettiin tutkimuksen lopussa.

10 hGH:ta annettiin 34,2 ug/kg (0,1 IU/kg) ihonalaisesti ja 307,5 ug/kg (0,9 IU/kg) nasaalisesti. Kussakin kokeessa käytettiin 3 lammasta: 15 (1) hGH:n anto ihonalaisesti vesiliuoksena, formuloitu 1,37 mg/ml:aan (4 IU/ml).

(2) hGH:n anto intranasaalisti vesiliuoksena, formuloitu 20 17,57 mg/ml:aan (51,43 IU/ml). 40-kg lammas saisi siten 0,35 ml valmistetta kumpaankin sieraimeen (yhteensä 0,70 ml).

(3) hGH:n anto intranasaalisti yhdistelmänä tärkkelysmikro-pallosten (2,5 mg/kg) and LPC:n (0,20 mg/kg) kanssa lyofili- 25 soituna jauheena. Valmisteiden formulointiin 600 mg Spherexiä dispergoitiin 30 ml:aan steriiliä tislattua vettä, joka si-: sälsi 61.5 mg hGH:ta (180 IU) and 40 mg LPC:t.ä, sekoitettiin 1 h ja sitten pakastekuivattiin: 30 Liuosten intranasaaliseen antoon lampaan sieraimeen asetettiin siniviivoitettu, 35 cm pitkä napakanyyli ennaltamäärät-tyyn 10-cm syvyyteen ennen liuoksen lisäystä 1-ml ruiskusta. Jauhevalmisteiden antamiseksi 6,5-mm BOC henkitorviputkeen (punaista kumia, taivutettu) lisättiin jauhevalmistet-ta, ja 35 se asetettiin sitten lampaan sieraimeen määrättyyn 6-cm syvyyteen ennen jauheen puhaltamista nenäonteloon.

Lampaat oli nukutettava intranasaalista antoa vai'ten ketamii-

II

23 97444 nihydrokloridin IV-annoksella 2 mg/kg. Tama oli tarkoitettu vastustamaan eläinten aivastamista annon aikana. Nukutus kesti noin 3 min.

5 Eläimet, jotka saivat hGH:ta ihonalaisesti, nukutettiin myös vastustamaan mahdollista ketamiinin vaikutusta mitattuihin veren hGH-tasoihin.

Kanyloidusta lampaan kaulalaskimosta otettiin 2-ml verinäyt-10 teet heparinisoituihin (Li-hepariini) putkiin jäämurskaan ennen hGH:n antoa ja hetkillä 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 120, 150, 180, 240 ja 300 min annon jälkeen. Sentrifugoimalla (3000 r/min 4 °C:ssa) kerätty plasma säilytettiin -20 °C:ssa odottamassa ELISA-tekniikalla tehtävää analyysiä.

15

Kuvassa 9 esitetään saadut hGH-tasot yksinkertaisella hGH-liuoksen intranasaalisella annolla, hGH:n intranasaalisella annolla yhdistelmänä mikropallosten ja LPC:n kanssa ja hGH:n ihonalaisella ruiskeella. Tuloksista voidaan tehdä johtopää-20 tös, ettei intranasaalisesti yksinkertaisena liuoksena annettu hGH absoroidu merkittävästi. Annettaessa hGH yhdistelmänä mikropallosten ja LPC-parannusainejärjestelmän kanssa hGH:n plas-mataso kasvaa kuitenkin huomattavasti. Siten plasman huipputaso on kasvanut noin 10 ng/ml:sta noin 55 ng/ml:aan. Biosaata-25 vuus ihonalaiseen ruiskeeseen verrattuna voidaan laskea noin 20 %:ksi.

Viitteet 1. Hussain, A., Hirai, S. ja Bawarshi, R., Nasal absorption of 30 natural contraceptive steroids in rats - progesterone absorption, J. Pharm. Sci. 70, 1981, s. 466 - 467.

2. Hussain, A., Hirai, S. ja Bawarshi, R., Nasal absorption of propranolol from different dosage forms by rats and dogs, 35 J. Pharm. Sci. 69, 1980, s. 1411 - 1413.

3. Salzman, R., Manson, J.E., Griffing, C.T., Kimmerle, R., Ruderman, N., McCall, A., Stoltz, E.I., Mullin, C., Small, 97444 24 D., Armstrong, J. ja Melly, J.S., Intranasal aerosolized insulin, N. Eng. J. Med. 312, 1985, s. 1078 - 1084.

4. Chien, Y.W. ja Chang, S.F., Intranasal Dry Delivery for 5 Systemic Medications CRC Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 4, 67ug (1987).

5. Hanson, M., Gazdick, G., Cahill, J. ja Augustine, M., Intranasal delivery of the peptide, salmon calcitonin. Teok- 10 sessa S.S. Davis, L. Ilium ja E. Tomlinson: Advanced Delivery Systems for Peptides and Proteins, Plenum Press, London, 1986, s. 233 - 242.

6. Gordon, G.F., Moses, A.C., Silver, R.D., Flier, G.F. ja 15 Carey, E., Nasal absorption of insulin: enhancement by hydro-phobic bile salts, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1985, s. 7419 - 7423.

7. Ilium. L., Jorgenson, H., Bisgaard, H., Krogsgaard, 0., 20 and Rossing N., Bioadhesive microshheres as a potential nasal drug delivery system. Int. J. Pharmaceut. 39, s. 189 -199 (1987).

8. Nagai, T., Nishimoto. Y., Nambu, N., Suzuki, Y. ja Sekine, 25 K., Powder dosage form of insulin for nasal administration, J. Control. Rel. 1, 1984, s. 15 - 22.

9. Morimoto, K., Morisaka, K. ja Kamada, A., Enhancment of nasal absorption of insulin and calcitonin using polyacrylic 30 acid gel, J. Pharm. Pharmacol. 37, 1985, s. 135 - 136.

• 10. S.S. Davis, L. Ilium ja E. Tomlinson (toimittajat) Deli very systems for peptide drugs, plenum. New York, 1987.

35 11. de Vries, A.C.J., Batenburg, F.F. ja van Golde, L.M.G. Lysophosphatidylcholine acyltransferase and lysophosphatidyl-choline :lysophosphatidylcholine acyltransferase in alveolar type II cells from fetal rat lung. Biochem. Biophys. Acta 833

II

25 97444 (1985) s. 93 - 99.

12. Christiansen, K. ja Carlsen, J, Reconstitution of a protein into lipid vesicles using natural detergents. Biochim.

5 Biophys. Acta 735 (1983) s. 225 - 233.

13. Davis S.S., Ilium, L. McVie, J.G. ja Tomlinson E. (toimittajat) Microspheres and Drug Therapy, Pharmaceutical, Immunological and Medical Aspects, Elsevier Science Publishers 10 B.V., Amsterdam, 1983.

14. Fisher, A.N. , Brown, K., Davis, S.S., Par, G.D. ja Smith D.A., The effect of molecular size on the nasal absorption of water soluble compounds by the albino rat, J. Pharm. Pharma- 15 col. 39, 1987, s. 357 - 362.

15. Hirai, S., Yashiki, T., Matsuzawa, T. ja Mima, H., Absorption of drugs from the nasal mucosa of rat, Int. J.

Pharm. 7, 1981, s. 317 - 325.

20 16. O'Connell, M.B., Hein, K., Halstenson, C. ja Matzke, G.R. Heparin interference with tobramycin, netilmicin and gentamicin concentrations determined by EMIT. Drug Intell. Clin. Pharm. 18 (1984), s. 503 - 504.

25 17. Duchateau, G.S.M.J.E., Zuidema, F. ja Merkus, W.H.M. Bile salts and intranasal drug absorption. Int. J. .Pharm. 31 (1986) s. 193 - 199.

Claims

97444
1. Menetelmä limakalvon läpi tapahtuvaan antoon tarkoitetun lääkkeenantojärjestelmän valmistamiseksi, joka järjestelmä käsittää suuren joukon mikropalloshiukkasia, jotka si- 5 sältävät vaikuttavan lääkkeen ja kuhunkin mikropalloshiukka-seen liittyneen aineen, jolla on ominaisuus lisätä vaikuttavan lääkkeen biosaatavuutta limakalvon lävitse, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: i) valmistetaan mikropalloshiukkasia, 10 ii) vaikuttava lääke ja aine sisällytetään mikropallosten valmistuksen aikana tai lääke ja aine sorboidaan mikropallosten sisään tai päälle niiden valmistuksen jälkeen, ja iii) mahdollisesti pakastekuivataan vaiheesta ii) saatu tuo-15 te.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistettujen mikropallosten koko on välillä 10 -100 μια. /20
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnet-tu siitä, että aine on pinta-aktiivinen aine.
4. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetel-25 mä, tunnettu siitä, että mikropalloset valmistetaan tärkkelyksestä, tärkkelysjohdannaisista, gelatiinista, albumiinista, kollageenistä, dekstraanista tai dekstraanijohdannaisista .
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että mikropalloset valmistetaan tärkkelyksestä.
6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikropalloset muodostetaan vaikuttavasta 35 lääkkeestä itsestään. il 27 97444
7. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää vaiheen, jossa mikro-palloset ristisidotaan.
8. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että biosaatavuutta lisäävä aine on lysofos-fatidyylikoliini.
9. Jonkin patenttivaatimuksen 3-7 mukainen menetelmä, tun-10 nettu siitä, että pinta-aktiivinen aine on ei-ioninen pinta- akti ivinen aine.
10. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistettu koostumus on tarkoitettu int- 15 ranasaaliseen antoon.
11. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lääke on biologisesti aktiivinen polypep-tidi tai sen johdannainen, jonka molekyylipaino on 1000 - 20 300000.
12. Patenttivaatimuksen li mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidi on insuliini tai kasvuhormoni.
25 Patentkrav