FI95778B - Menetelmä taudinaiheuttajien inaktivoimiseksi biologisessa tai farmaseuttisessa aineessa - Google Patents

Description

- 95778

Menetelmä taudinaiheuttajien inaktivoimiseksi biologisessa tai farmaseuttisessa aineessa Tämä keksintö liittyy menetelmään taudinaiheutta-5 jien inaktivoimiseksi biologisessa ja farmaseuttisessa aineessa, jolla suojataan näiden aktiivisuus sellaisen käsittelyn aikana, jonka tarkoituksena on inaktivoida virus-ja/tai bakteerikontaminaation aiheuttajat. Yksityiskohtaisemmin ilmaistuna keksintö liittyy sellaisten valkuaisai-10 nepitoisten materiaalien stabilointiin, joista on poistettava biologisen kontaminaation aiheuttajat kuten virukset ja niiden kaltaiset kontaminantit, joista erityisesti mainittakoon Epstein-Barr -virus (EBV) ja sytomegalovirus (CMV), tarttuvat maksatulehdusvirukset kuten B-virusmaksa-15 tulehdusvirus (HBV) ja ei-A-ei-B-virusmaksatuledusvirus (NANBV), ja ihmisen immunopuutostautivirus (HTLV III/LAV/ HIV), joka aiheuttaa AIDS:n.

Tarkemmin keksintö koskee menetelmää taudinaiheuttajien inaktivoimiseksi biologisessa tai farmaseuttisessa 20 aineessa, joka käsittää vaiheet: aineen sekoittamisen vesiliuokseen, jossa on ainakin yhtä ensisijaista stabilointiainetta, joka on valittu sokereista tai sokerialkoholeista ja ainakin yhtä toissijaista stabilointiainetta, joka on valittu neutraaleja • · 25 suoloja sisältävästä ryhmästä; vesiliuoksen pH:n säädön arvoon noin 5,0 - 10,0; vesiliuoksen altistamisen taudinaiheuttajia inak-tivoivalle käsittelylle; ja vaihtoehtoisesti tapahtuva ensisijaisen ja toissi-30 jäisen stabilointiaineen poiston vesiliuoksesta.

.. Biologiset ja farmaseuttiset tuotteet voivat konta minoitua tai niiden voidaan epäillä sisältävän kontaminoi-via viruksia tai bakteereja, jotka tekevät nämä tuotteet sopimattomiksi ja usein hyvin vaarallisiksi hoidolliseen 35 käyttöön. Tällainen kontaminaatio voi toimia tarttuvien 2 95778 tautien leviämislähteenä aiheuttaen suuren vaaran näiden tuotteiden käyttäjille.

On mahdollista inaktivoida virus- ja bakteerikon-taminantit tuotteiden tuotannon alku- ja välivaiheiden 5 aikana tai lopullisissa tuotteissa. Inaktivointimenetelmät ovat kuitenkin hyvin voimakkaita ja tavallisesti niiden käytöstä seuraa pysymättömien biologisten ja farmaseuttisten aineiden huomattava aktiivisuuden häviö. Siksi on tarpeen stabiloida biologiset ja farmaseuttiset aineet niiden 10 aktiivisuuden suojaamiseksi ennen kontaminanttien inakti- voimista.

Tämä keksintö liittyy yleiseltä osaltaan biologisten ja farmaseuttisten tuotteiden stabilointiin nestemäisessä tai seosmuodossa eliminoitaessa virus- tai bakteeri-15 kontaminantteja inaktivointimenetelmillä, joissa käytetään lämpö-, kemiallista tai säteilytyskäsittelyjä.

Erityiseltä osaltaan keksintö liittyy valmistusta! puhdistusvaiheessa nestemäisenä pastöroitavien biologisten tai farmaseuttisten tuotteiden tuotantoon.

20 Nesteessä pastörointi on vakiintunut menetelmä nii den tauteja aiheuttavien mikro-organismien inakt ivo imisek-si, joiden kontaminoimia biologisista materiaaleista, kuten ihmisen veriplasmasta, valmistetut tuotteet ovat. Erityisesti tämä keksintö liittyy stabilisaattorien käyttöön I 25 mitkä ehkäisevät valkuaisaineiden inaktivoitumista ja sallivat pastöroinnin suoritettavan siten, että biologisen ja hoidollisen vaikutuksen häviöt ovat pieniä. Stabiloituminen saadaan aikaan lisäämällä ennen pastörointia sopivia määriä yhtä tai useampaa mono-, di- tai trisakkaridia tai 30 sokerialkoholia yhdessä tai useamman neutraalin suolan .. kanssa.

Biologisista lähteistä peräisin olevat vaikuttavat aineet, jotka ovat suunniteltuja hoidolliseen, ennalta ehkäisevään tai taudinmäärityskäyttöön, muodostavat suuren 35 ja tärkeän terveydenhoitotuotteiden segmentin. Esimerkkei- 3 95778 nä näistä tuotteista ja niiden käytöstä ovat seuraavat: hyytymistekijää VIII käytetään verenvuototaudin hoidossa; immuuniseerumiglobuliinia käytetään periytyvän gammaglobu-liinipuutostaudin, lapsihalvauksen, A-virus- ja B-virus-5 maksatulehduksen hoidossa; antitrombiini III on veren hyytymisen estäjä; plasminogeeni-streptokinaasikompleksia käytetään veritulpan hoidossa; ja veriplasman kasvuhormoni korjaa aivolisäkkeen vajaatoiminnan aiheuttaman vähäkas-vuisuuden.

10 Biologista alkuperää olevien hoidollisesti vaikut tavien aineiden käyttöön liittyvä huomionarvoinen seikka on tautien, erityisesti virustautien siirtyminen käyttäjään. Sairastuvuuden kannalta merkittäviin viruskontami-naatioihin kuuluu B-virusmaksatulehdusvirus (HBV), ei-A-15 ei-B-virusmaksatulehdusvirus (NANBV), ja HTLV III/LAV/HIV, joka aiheuttaa AIDS:n. Useita virusten inaktivointimene-telmiä on esitetty sen varmistamiseksi, että tuotetut alkuperältään biologiset tuotteet ovat vaarattomia virusten suhteen. Yleispiirteissään nämä voidaan lyhyesti esittää 20 menetelminä, jotka käsittävät: verestä peräisin olevien tuotteiden kuumennuksen vesiliuoksessa, joka voidaan tarvittaessa suorittaa viruksia tuhoavien aineiden läsnä ollessa; verestä peräisin olevien tuotteiden kuumennuksen vesiliuoksessa stabiloivien aineiden läsnä ollessa; veres-* 25 tä peräisin olevien aineiden käsittely orgaanisilla liuot timilla; verestä peräisin olevien tuotteiden säteilytys kiinteässä olomuodossa; ja verestä peräisin olevien tuotteiden kuumennus kuivana.

Kaikkien näiden menetelmien tarkoitus on hävittää 30 valmisteista niissä mahdollisesti oleva bakteeri- tai vi-rustartutuskyky ja samalla olennaisesti säilyttää niiden haluttu biologinen aktiivisuus.

Edustavia aikaisempia menetelmiä, joiden uskotaan sivuavan tätä keksintöä ovat seuraavat: 4 95778 US-patentti nro 4 456 590 (Rubenstein) koskee menetelmää veriplasman jakeiden kuumennuskäsittelyksi kylmäkuivatussa muodossa jakeissa mahdollisesti olevan maksa-tulehdusviruksen inaktivoimiseksi.

5 US-patentti nro 4 314 997 (Shanbrom) opettaa kemi allisen inaktivointimenetelmän, missä liuoksessa tai seoksessa oleva veriplasma tai veriplasmajohdannaiset ovat kosketuksissa denaturaatiokyvyttömän amfifiilisen aineen, siis pinta-aktiivisen aineen kanssa ja jonka tarkoituksena 10 on tuhota endotoksiinit palautumattomasti ja inaktivoida maksatulehdusvirukset.

US-patentti nro 4 440 679 (Fernandes ja muut) kuvaa menetelmän,missä hoitovaikutuksellisesti aktiiviset valkuaisaineet pastöroidaan siten, että sekoitetaan pastöroi-15 tava valkuaisaineita käsittävä osuus stabiloivaan määrään polyolia ennen pastörointia.

US-patentti nro 4 297 344 (Schwinn ja muut) kuvaa menetelmän hyytymistekijöiden II, VIII, XIII, antitrombii-ni III ja plasminogeenin stabiloimiseksi kuumuutta vastaan 20 vesiliuoksessa, mikä käsittää tähän liuokseen tehtävät sekä aminohapon että yhden tai useamman monosakkaridin tai sokerialkoholin lisäykset.

US-patentti nro 4 585 645 (Landaburu ja muut) käsittää menetelmän veriplasmaproteiiniliuoksissa olevien • 25 virusten inaktivoimiseksi, missä tätä liuosta kuumennetaan polyolin, pinta-aktiivisen aineen ja kelatoivan aineen kanssa.

Joidenkin tutkijoiden mukaisesti vaikuttaa siltä, että biologisten tuotteiden kuumennus kosteana on tehok-30 kaampaa kuin kuumennus kuivana. Esimerkkinä mainittakoon, • · .. että tulokset, jotka saatiin verrattaessa kosteaa kuumen nusta kuivaan kuumennuskäsittelyyn NANBV:n siirtymistä vastaan, viittasivat siihen, että kostea kuumennus tarjosi paremman suojan (Kernoff ja muut, The Lancet, 28. syyskuu-35 ta 1985, s. 721). Kliiniset tutkimustulokset osoittavat, 5 95778 että nestefaasissa pastöroidun hyytymistekijä VIII väkevöidyn liuoksen välityksellä ei yhtään viruksista HBV, NANBV tai HTLV/LAV/HIV siirtynyt käyttäjään yli kuuden vuoden kliinisen tarkasteluajanjakson kuluessa. (Maailman 5 hemofiliayhdistysten liiton kansainvälinen kongressi, 8. -13. kesäkuuta (1986); N. Heimburger: "Preparation of a F VIII concentrate free from pathogenic viruses.") Nesteessä tapahtuvan pastöroinnin tehokkuudesta virusten inaktivoi-miseksi on ehkä parhaimpana osoituksena seerumin albumii-10 nin historia, missä yli 35 vuoden aikana yhtään seerumi-maksatulehdustapausta ei ole voitu osoittaa kuumennetusta albumiinista johtuvaksi. ("Milestones in Blood Transfusion and Immunohaematology", Vox Sang 46:338-340 (1984)) .

Virusten inaktivoitumisen paljastavaa suoraa mit-15 tausmenetelmää käyttämällä on voitu osoittaa, että nestemäisessä tilassa tapahtuvassa pastöroinnissa inaktivoitu-vat sytomegalo-, Epstein-Barr-, herpes simplex-, B-virus-maksatulehdus-, ei-A-ei-B-maksatulehdusvirukset ja HTLV III/LAV/HIV, ja että neoantigeenejä ei muodostu nesteessä 20 tapahtuvassa pastöroinnissa ("Pasteurization as an Effi cient Method to Inactivate Blood Borne Viruses in Factor VIII Concentrates", J. Hilfenhous and E. Weidman; Arneim. Forsch/Drug Res. 36(1) nro 4 (1986)).

Kun nesteessä tapahtuva pastörointi on osoitettu • 25 varmaksi viruskontaminanttien inaktivointimenetelmäksi, syntyy tarve stabiloida lämpöherkät bioaktiiviset molekyylit lämpöinaktivoitumista vastaan. Näiden tuotteiden stabiloituminen lämpöinaktivaatiota vastaan saadaan aikaan käyttämällä yhtä tai useampaa mono-, di- tai trisakkaridia 30 tai sokerialkoholia yhdessä yhden tai useamman neutraalin .. suolan kanssa.

Keksinnölle on tunnusomaista, että toissijainen stabilointiaine valitaan ryhmästä natriumasetaatti, ka-liumasetaatti, litiumasetaatti, magnesiumasetaatti, ammo-35 niumasetaatti, bariumasetaatti, natriumsulfaatti, ammo- . 95778 6 niumsulfaatti, litiumsulfaatti, bariumsulfaatti, kalium-sulfaatti ja magnesiumsulfaatti.

Tämä menetelmä eroaa huomattavasti lähimmistä sitä muistuttavista aikaisemmin tunnetuista menetelmistä, jotka 5 on edellä esitetty. Todisteeksi: (a) Se eroaa menetelmästä, jossa käytettiin mono-sakkaridien, oligosakkaridien tai sokerialkoholien yhdistelmiä yhdessä aminohappojen ja tiettyjen aminohappojen kaltaisten aineiden kanssa siinä, että aminohapot ja nii- 10 den kaltaiset aineet on korvattu neutraalilla suolalla. Ensimmäinen näkökohta on se, että stabiloivien aminohappo-määrien lisääminen biologiseen tai farmaseuttiseen tuotteeseen voi aiheuttaa inaktivoitumista, joka johtuu äkillisistä ja usein merkittävistä pH:n muutoksista. Tämä vai-15 kutus vähenee tai poistuu käyttämällä stabiloivia suoloja.

Toinen näkökohta on, että monet aminohapot liukenevat huonosti vesipohjaisiin liuotinaineisiin, kun taas useimmat stabiloivat suolat ovat hyvin liukoisia ja sallivat korkeampien stabilointiainepitoisuuksien käytön. Kolmas nä-20 kökohta on se, että käytettäessä aminohappoja stabilointiaineina on välttämätöntä poistaa kaikki stabilointiaineiden jäämät lopullisesta tuotteesta, koska aminohappojäämiä sisältävän farmaseuttisen tuotteen hoidollinen tehokäyttö saattaa ylittää kehon myrkkyjen poistojärjestelmän suori-• 25 tuskyvyn potilailla, joiden maksa tai munuaiset ovat vau rioituneet vakavasti.

(b) Se eroaa myös menetelmästä, jonka patenttivaatimus kattaa polyolin käytön ainoana stabilisaattorina. Pastörointi missä käytetään yksinomaan polyolia ilman yh- 30 tään glysiiniä johtaa huonoon aktiivisuussaantoon, kuten .. esimerkiksi hyytymistekijä VIII:n tapauksessa on laita. On myös ilmeistä, että patentin tarkoittamien tuotteiden lopulliseen koostumukseen kuuluu glysiini ja siksi pastö-rointiolosuhteet muistuttavat niitä, joissa on käytetty 35 sokeria yhdessä aminohapon kanssa.

7 95778 Tämä keksintö käsittää menetelmän biologisissa tai farmaseuttisissa aineissa olevien taudinaiheuttajien inak-tivoimiseksi, jonka vaiheisiin kuuluu aineen sekoittaminen vesiliuokseen, johon on lisätty ainakin yksi ensisijainen 5 stabilointiaine, joka on valittu sokereista sokerialkoho-leista, ja ainakin yksi toissijainen stabilointiaine, joka on valittu neutraaleja suoloja sisältävästä ryhmästä; pH:n säätö noin alueelle 5-10, nesteliuoksen altistaminen taudinaiheuttajia inaktivoivalle menetelmälle; ja tarvit-10 taessa tehtävä ensisijaisen ja toissijaisen stabilointiaineen poisto vesiliuoksesta.

Yksityiskohtaisemmin tarkasteltuna keksintö tarjoaa menetelmän taudinaiheuttajien inaktivoimiseksi biologisessa tai farmaseuttisessa aineessa sekoittamalla tähän ai-15 neeseen vesiliuoksessa yhtä tai useampaa ensisijaista stabilointiainetta, jotka on valittu mono-, di- tai trisakka-ridien tai sokerialkoholien ryhmistä ja joiden pitoisuus vaihtelee 10 tilavuusprosentista kyllästyspitoisuuteen; lisäämällä yhtä tai useampaa toissijaista stabilointiai-20 netta, jotka on valittu neutraaleja suoloja sisältävästä ryhmästä ja joiden pitoisuus seoksessa on 0,01 Mistä kyllästyspitoisuuteen; inaktivoimalla taudinaiheuttajat lämpökäsittelyllä pitämällä lämpötila rajojen 30 - 100 °C välissä 1 minuutista 72 tuntiin; säätämällä pH alueelle 6,7 25 - 7,7; ja poistamalla mainitut ensisijaiset ja toissijai set stabilointiaineet lämpöinaktivoinnin jälkeen.

Tämän keksinnön mukaisesti biologiset ja farmaseuttiset tuotteet pastöroidaan ensisijaisten ja toissijaisten stabilointiaineiden läsnä ollessa, joiden yhteisvaikutus 30 varmistaa sen, että tuotteiden aktiivisuus säilyy lämmi- e *« .. tysvaiheen aikana.

Lämpökäsittely suoritetaan siinä lämpötilassa ja siinä ajassa, mikä tarvitaan taudinaiheuttajien, erityisesti tarttuvien virusten, inaktivoimiseksi, mutta mitkä 35 samalla sallivat tuotteiden aktiivisuuden säilymisen. Täi- 8 95778 laista lämpökäsittelyä ylläpidetään noin yhdestä minuutista 72 tuntiin lämpötilarajoissa 30 - 100 °C, ensisijaisesti noin 10 - 20 tuntiin 55 - 70 °C välillä, mieluimmin 10 tuntia 60 eC:ssa.

5 Taudinaiheuttajien poistoon biologisista/farmaseut- tisista tuotteista käytetään vesiliuosta, johon ensisijaiset ja toissijaiset stabilointiaineet on liuotettu tai sekoitettu. Pastöroitava tuote saatetaan kosketuksiin tämän liuoksen kanssa ja altistetaan olosuhteille, jotka ovat 10 riittävät taudinaiheuttajien aktiivisuuden poistamiseksi. Tuotteen käsittely voi tapahtua missä tahansa tuotantoprosessin vaiheessa, kuten lähtöaineiden tasolla tai joidenkin myöhempien tuotantovaiheiden tasolla tai tiettyjen tuotteiden tapauksissa tuotantoprosessin päättymisen jäl-15 keen.

Stabilointiaineiden lisäyksen jälkeen pH säädetään, mikäli siihen on tarvetta, alueelle 5,0 - 10,0, mieluummin alueelle 6,7 - 7,7. Tuotteen pitoisuus vesiliuoksessa vaihtelee yleisesti rajojen 1 mg/ml - 500 mg/ml välissä, 20 mieluummin rajoissa 1 - 100 mg/1.

Kun pastörointi on saatu päätökseen, stabilointiaineet poistetaan sopivilla menetelmillä, joihin kuuluu dia-lysointi (McPhie, P. (1971), Methodes in Enzymol. 22, sivut 23-32); diafiltrointi (Blatt, W.F. ja muut (1968), 25 Anal. Biochem. 26, s. 151); pylväskromatografia (Porath, J. ja Flodin, P. (1959), Nature 183, sivut 1657-1659); saostus (Dixon, M. ja Webb, E.C. (1961), Adv. in Protein Chem. 16, sivut 197-219, Academic Press, N.Y., Honig, W. ja Kula, M.R. (1976), Anal. Biochem. 72, sivut 502-512); 30 tai mikä tahansa muu menetelmä, jolla stabilointiaineiden « ♦ ·· poisto voidaan toteuttaa.

Tuotteet Tämän keksinnön menetelmä on sovellettavissa biolääketieteellisten ja farmaseuttisten alojen piiriissä lu-35 kumäärältään suureen ja luonteeltaan vaihtelevaan joukkoon 9 95778 aineita ja tuotteita, jotka on tarkoitettu käytettäväksi ihmisissä tai eläimissä biolääketieteellisiin tai hoidollisiin tarkoituksiin sekä ei-hoidollisiin tutkimustarkoituksiin. Kyseisiä aineita ja tuotteita, joista taudinai-5 heuttajat voidaan poistaa tällä keksinnöllä ovat seuraa-vat, mutta luettelo ei rajoitu näihin: veren jakeet kuten verenvuototaudin vastatekijät (Smith, J.K. ja Bidwell, E. (1979) Clinics in Haematol. 8, sivut 184-205); protrombiini kompleksi, siis hyytymisteki-10 jät II, VII, IX ja X (Chanra, s. ja Brummelhuis, H.G.J.

(1981) Vox Sang. 41, sivut 257-273); proteiini C (Stenflo, J. (1976) J. Biol. Chem. 251, sivut 355-363 ja Bajaj, S.P. ja muut (1983) Prep. Biochem. 13, sivut 191-214); proteiini S (DiScipio, R.G. ja muut (1977) Biochemistry 16, sivut 15 698-706); antitrombiini III (Rosenberg, R.D. ja Damus, P.S. (1973) J. Biol. Chem. 248, sivut 6490-6505); C-l es-teraasin estäjä (Heimburger, N. (1974) Bayer Symposium V "Proteinase Inhibitors", sivut 14-22, Springer-Verlag); alfa 1 antitrypsiini (Heimburger, N. ks. yllä); fibronek-20 tiini (Mosesson, M.N. ja Amrani, D.L. (1980) Blood 56, sivut 145-158); gammaglobuliini (Oncley ja muut (1949) J.

Amer. Chem. Soc. 71, sivut 541-550); ihmisestä tai eläimestä peräisin olevat biologiset tai farmaseuttiset tuotteet kuten insuliini, entsyymit, koentsyymit, vastaaineet • 25 ja hormonit; ihmisten tai eläinten istukoista peräisin olevat biologiset tai farmaseuttiset tuotteet kuten veren jakeet ja rokotteet; yhdistelmä-DNA-tekniikoiden avulla bakteereissa, sienissä tai nisäkässoluviljelmäsysteemeissä valmistetut biologiset tai farmaseuttiset tuotteet (Vane, 30 J. ja Cuatrecasas, P. (1984) Nature 312, sivut 303-305 ja Maniatis, T. ja muut (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.). Nämä tuotteet ja materiaalit ovat saatavilla erilaisista kaupallisista lähteistä tai niitä voidaan tuottaa hyvin tunnetuilla valmis-35 tusmenetelmillä. Esimerkiksi veren jakeita ja veren valku- x„ 95778 aisaineita voidaan saada ihmisen veriplasmasta valmistamalla jakeita tunnettujen menetelmien mukaisesti kuten esimerkiksi Cohnin alkoholifraktioinnin avulla, joka on kuvattu US-patentissa nro 2 390 074 ja Journal of American 5 Chemical Society nid. 68, s. 459 (1946). Yhteenveto näistä sekä muista menetelmistä on esitetty kirjassa "The Plasma Proteins", 2. painos nid. III, sivut 548-550, Academic Press, New York, N.Y. (1977).

Ensisijaiset stabilointiaineet 10 Ensisijaisiin stabilointiaineisiin kuuluvat mono-, di- tai trisakkaridit, ja sokerialkoholit, mm. glukoosi, sakkaroosi, ksyloosi, fruktoosi ja mannitoli, glukosamini-toli, sorbitoli, galaktosaminitoli ja näiden kaltaiset yhdisteet. Yhtä tai useampia näistä stabilointiaineista käy-15 tetään tämän keksinnön tarkoittamassa menetelmässä pitoi-suusalueella, joka ulottuu 10 tilavuusprosentista kylläs-tyspitoisuuteen.

Mieluimmin käytetään sakkaroosia ensisijaisena stabilointiaineena pitoisuusalueella 50 - 70 % tilavuuspro-20 senteissä ilmoitettuna.

Toissijaiset stabilointiaineet

Toissijaiset stabilointiaineet koostuvat tietyistä neutraaleista suoloista ja niitä käytetään tämän keksinnön tarkoittamassa menetelmässä pitoisuusalueella 0,01M:sta 25 kyllästyspitoisuuteen. Erityisesti tämän keksinnön tarkoi tusperiin soveltuviksi stabiloiviksi suoloiksi määritellään yleisten orgaanisten ja mineraalihappojen neutraalit suolat, joista esimerkkeinä, ilman että rajoituttaisiin yksinomaan näihin, ovat natriumasetaatti, kaliumasetaatti, 30 natriumfosfaatti, natriumsulfaatti ja ammoniumsulfaatti, sekä myöskin litiumsulfaatti, kaliumsulfaatti, magnesium-sulfaatti, bariumsulfaatti, litiumsulfaatti, magnesiumase-taatti ja bariumasetaatti ja joihin viitataan seuraavissa lähteissä: x! - 95778 1. Molecular Biology of Human Proteins, nid. 1., s.

3, 1966, Schulte, H.E. ja Heremans, J.F.

2. Biophysical Chemistry, nid. 1, sivut 275-277, 1958, Edsall, J.T. ja Wyman, J.

5 3. Handbook of Chemistry and Physics, CRC Handbook, 57. painos, s. 113, 1976-1977.

4. Textbook of Biochemistry, 3. painos, s. 96, 1963, West, E.S. ja Todd, W.R.

Käytettävien stabiloivien suolojen pitoisuus riip-10 puu kahdesta muuttujasta. Ensiksikin se riippuu molekyylin liukoisuudesta ja toiseksi siitä pitoisuudesta, jolla valkuaisaine (id) en ulossuolautuminen liuoksesta alkaa tapahtua.

Seuraavat esimerkit kuvaavat edelleen keksintöä 15 vaikka tarkoitus ei ole rajoittaa sitä näihin.

Esimerkki 1

Matalatibrinoaeenisen väkevöidyn AH F -valmisteen pastörointi

Stabilointi sokerilla + natriumasetaatilla 20 Jokaiseen kolmeen lääkepulloon, jotka sisälsivät

Factorate-LF (Armour Pharmaceutical Company'n, Kanakee, IL valmistama matalafibrinogeeninen hyytymistekijä VIII -valmiste) rekonstituoitiin 10 ml injektiotarkoituksiin valmistettua vettä. Yhteen pulloista lisättiin 1 g sakka-* 25 roosia liuosmillilitraa kohti ja 0,5 g natriumasetaattia liuosmillilitraa kohti. Jäljellä olevaan pulloon lisättiin 1 g sakkaroosia liuosmillilitraa kohti. Tähän kolmanteen pulloon ei lisätty stabilointiaineita. Näiden kolmen liuoksen pH säädettiin 7,0 käyttäen pientä määrää 0,5 N 30 suolahappoa. Liuokset kuumennettiin 60 °C 10 tunnin ajak- * * si. Kustakin liuoksesta ennen pastörointia ja sen jälkeen otetut näytteet analysoitiin hyytymistekijäesiasteaktiivi-suuden määrittämiseksi (hyytymistekijä VIII C) käyttäen yksivaiheista aktivoitua tromboplastiiniaikamenetelmää, 35 joka on olennaisilta osiltaan sama kuin julkaisuissa Har- 12 95778 disty, R.M. ja MacPherson, J.C. (1962), Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica 7, sivut 215-229 ja Zacharski, L.R. ja Rosenstein, R. (1978), Amer. J. Clin. Path. 70, sivut 280-286 on kuvattu. Tulokset on koottu taulukkoon 1.

5

Taulukko 1 F. VIII yksikköä/ml

Stabilointi- Ennen Pastöroinnin aineet_ pastörointia jälkeen_ Saalis %

Sakkaroosi + natriumasetaatti: 11/4 9,2 80,7

Sakkaroosi: 14,2 5,9 41,5

Ei lisäyksiä: 20,1 0 0

Esimerkki 2 15 Erittäin pitkälle puhdistetun hyytymistekijä VIII:C:n pastörointi

Stabilointi sakkaroosilla + natriumasetaatilla ® ... . . Monoclate (hyytymistekijä VIII:C, valmistaja:

Armour Pharmaceutical Company, Kanakee, IL) pastöroitiin 20 seuraavasti. Käytettiin kolmea 10 ml:n erää (noin 500 yksikköä) ultrasuodatetusta eluointiliuoksesta, joka oli saatu Sepharose-Cl-2B kromatografiapylväästä, missä hyytymistekijä VIII:R vasta-aine oli kiinnitettynä. Ensimmäiseen sekoitettiin 1 g sakkaroosia yhtä liuosmillilitraa ' 25 kohti ynnä 0,5 g natriumasetaattia yhtä liuosmillilitraa kohti. Toiseen erään lisättiin 1 g sakkaroosia yhtä liuosmillilitraa kohti. Kolmanteen erään ei lisätty mitään stabilointiainetta. Näiden kolmen pH säädettiin 7,0 pienellä määrällä 0,5 N suolahappoa. Liuokset kuumennettiin 60 °C 30 10 tunnin ajaksi. Ennen pastörointia ja pastöroinnin jäi- < 4 .. keen otetut näytteet analysoitiin hyytymistekijäesiasteak- tiivisuuden määrittämiseksi (hyytymistekijä VIII:C) käyttäen yksivaiheista aktivoitua tromboplastiiniaikamenetel-mää, johon viitattiin esimerkissä 1. Tulokset on koottu 35 taulukkoon 2.

95778 13

Taulukko 2 F. VIII yksikköä/ml

Stabilointi- Ennen Pastöroinnin aineet_ pastörointia jälkeen_ Saalis % 5 Sakkaroosi + natriumasetaatti: 17,6 10,4 60,2

Sakkaroosi: 23,2 6,7 28,9

Ei lisäyksiä: 23,0 1,0 4,0

Esimerkki 3 10 Erittäin pitkälle puhdistetun hyytymistekijä VIII:C:n pastörointi

Stabilointi sakkaroosilla + natriumsulfaatilla ® ... . . Monoclate (hyytymistekijä VIII:C, valmistaja:

Armour Pharmaceutical Company, Kanakee, IL) pastöroitiin 15 seuraavasti. Käytettiin kahta 10 ml:n erää (noin 500 yksikköä) ultrasuodatetusta eluointiliuoksesta, joka oli saatu Sepharose-Cl-2B kromatografiapylväästä, missä hyytymistekijä VIII:R vasta-aine oli kiinnitettynä. Ensimmäiseen sekoitettiin 1 g sakkaroosia yhtä liuosmillilitraa 20 kohti ynnä 0,28 g natriumasetaattia yhtä liuosmillilitraa kohti. Toiseen erään lisättiin 1 g sakkaroosia yhtä liuosmillilitraa kohti. Näiden kahden pH säädettiin 7,0 pienellä määrällä 0,5 N suolahappoa. Liuokset kuumennettiin 60 °C 10 tunnin ajaksi. Ennen pastörointia ja pastöroinnin ·' : 25 jälkeen otetut näytteet analysoitiin hyytymistekijäesias- teaktiivisuuden määrittämiseksi (hyytymistekijä VIII:C) käyttäen yksivaiheista aktivoitua tromboplastiiniaikame-netelmää, johon viitattiin esimerkissä 1. Tulokset on koottu taulukkoon 3.

30 Taulukko 3 F. VIII yksikköä/ml

Stabilointi- Ennen Pastöroinnin aineet_ pastörointia jälkeen_ Saalis %

Sakkaroosi + 35 natriumasetaatti: 21,5 17,6 81,9

Sakkaroosi: 20,0 5,7 28,5 m 95778

Esimerkki 4

Matalafibrinoaeenisen väkevöidyn AHF valmisteen pastörointi

Stabilointi sokerilla + erilaisilla neutraaleilla 5 suoloilla

Jokainen yhdeksästä lääkepullosta, jotka sisälsivät Factorate-LF (Armour Pharmaceutical Company'n, Kanakee, IL valmistama matalafibrinogeeninen hyytymistekijä Vili -valmiste) rekonstituoitiin 10 ml injektiotarkoituksiin 10 valmistettua vettä. Kun rekonstituutio oli päättynyt, jokaiseen pulloon lisättiin 1 g sakkaroosia liuosmillilitraa

kohti. Erilaisia stabiloivia suoloja lisättiin sitten 1-2M

. . . . . ® pitoisuuksissa jokaiseen FactorateLF /sakkaroosiliuokseen. Käytetyt suolat olivat: kaliumasetaatti (2,0 g), 15 ammoniumasetaatti (1,6 g),natriumsulfaatti (2,8 g), ammo-niumsulfaatti (2,6 g), natriumkloridi (1,2 g), ammonium-kloridi (1,1 g), magnesiumkloridi (0,95 g), koliinikloridi (2,8 g) ja kaksiemäksinen natriumfosfaatti (1,4 g). Liuosten pH säädettiin 7,0 pienellä määrällä 0,5N suolahappoa 20 tai 0,5 N natriumhydroksidia, lukuunottamatta natriumfos-faattia sisältävää liuosta. Tämän liuoksen pH ilman säätöä oli 8,2. Liuokset kuumennettiin 60 °C 10 tunnin ajaksi.

Ennen pastörointia ja pastöroinnin jälkeen otetut näytteet analysoitiin hyytymistekijäesiasteaktiivisuuden määrittä-25 miseksi (hyytymistekijä VIII:C) käyttäen yksivaiheista aktivoitua tromboplastiiniaikamenetelmää, johon viitattiin esimerkissä 1. Tulokset on koottu taulukkoon 4.

» 95778

Taulukko 4 F. VIII saalis %

Stabilointiaineet pastöroinnin jälkeen

Sakkaroosi + kaliumasetaatti 89,4 5 Sakkaroosi + ammoniumasetaatti 72,7

Sakkaroosi + natriumsulfaatti 89,1

Sakkaroosi + ammoniumsulfaatti 78,6

Sakkaroosi + natriumkloridi 16,7

Sakkaroosi + ammoniumkloridi 34,7 10 Sakkaroosi + magnesiumkloridi 10,9

Sakkaroosi + koliinikloridi 10,0

Sakkaroosi + natriumfosfaatti (kaksi- 28,0 emäksinen)

Esimerkeissä kuvatut kokeet ja taulukoissa esitetyt 15 tulokset johtavat seuraaviin ilmeisiin johtopäätöksiin: proteiineja sisältävien aineiden pastörointi 60 °C 10 tunnin ajan aiheutti näiden aktiivisuuden lähes täydellisen tuhoutumisen; sokeri (sakkaroosi) yksin puolestaan . paransi aktiivisuuden säilymistä mutta se oli huomattavas- 20 ti tehottomampi kuin silloin kun stabilointiaineina yhdessä sokerin kanssa käytettiin jotain tiettyä stabiloivaa suolaa; ja sokeri yhdessä tiettyjen stabiloivien suolojen kanssa on parempi kuin sokeri yhdessä tiettyjen muiden stabiloivien suolojen kanssa.

: 25 Muut patentin kattamat alueet Tähän keksintöön liittyvä toinen näkökohta kattaa biologisten ja farmaseuttisten tuotteiden stabiloinnin, joka toteutetaan pastöroinnin sijasta muiden menetelmien yhteydessä bakteerien ja virusten inaktivoimiseksi. Näihin 30 menetelmiin kuuluu: kemiallinen inaktivointi kuten otsonin käyttö taudinaiheuttajien aktiivisuutta vähentävänä aineena, mikä on kuvattu US-patentissa nro 4 632 980; orgaanisen yhdisteen käyttö inaktivaation edistämiseksi, mikä on kuvattu US-patentissa nro 4 640 384; tai suuren säteily-35 energian (UV-, infrapuna- ja gammasäteet), mikä on kuvattu US-patentissa nro 2 897 123.

16 95778

On ilmeistä, että keksinnöstä voidaan tehdä muunnelmia ja variaatioita ilman, että nämä poikkeavat sen hengestä ja kattavuudesta. Kuvatut keksinnön kattavuuden soveltuvuuskohteet on annettu vain esimerkeiksi ja keksin-5 töä rajoittavat vain liitteenä olevien patenttivaatimusten kattavuus.

• · • « 1 «

Claims (15)

1. Menetelmä taudinaiheuttajien inaktivoimiseksi biologisessa tai farmaseuttisessa aineessa, joka käsittää 5 vaiheet: aineen sekoittamisen vesiliuokseen, jossa on ainakin yhtä ensisijaista stabilointiainetta, joka on valittu sokereista tai sokerialkoholeista ja ainakin yhtä toissijaista stabilointiainetta, joka on valittu neutraaleja 10 suoloja sisältävästä ryhmästä; vesiliuoksen pH:n säädön arvoon noin 5,0 - 10,0; vesiliuoksen altistamisen taudinaiheuttajia inak-tivoivalle käsittelylle; ja vaihtoehtoisesti tapahtuva ensisijaisen ja toissi-15 jäisen stabilointiaineen poiston vesiliuoksesta, tun nettu siitä, että toissijainen stabilointiaine valitaan ryhmästä natriumasetaatti, kaliumasetaatti, litium-asetaatti, magnesiumasetaatti, ammoniumasetaatti, barium-asetaatti, natriumsulfaatti, ammoniumsulfaatti, litium-20 sulfaatti, bariumsulfaatti, kaliumsulfaatti ja magnesium- sulfaatti.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että taudinaiheuttajia inaktivoi-va menetelmä käsittää mainitun vesiliuoksen altistuksen : 25 30 -100 °C:n lämpötilalle noin 1 minuutista 72 tuntiin kestävän käsittelyjakson ajaksi.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että taudinaiheuttajia inaktivoi-va menetelmä käsittää kemiallisen inaktivaation tai sä- 30 teilytyksen.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesiliuoksen pH säädetään välille noin 6,7 - noin 7,7 ja että liuos altistetaan pas-törointiolosuhteille, jotka ovat riittävät hävittämään 35 siinä olevien taudinaiheuttajien aktiivisuuden. is 95778

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pastörointi suoritetaan 55 -70 °C lämpötilassa 10 - 20 tunnin ajan.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen me- 5 netelmä, tunnettu siitä, että ensisijainen stabi lointiaine on mono-, di- tai trisakkaridi.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sokerit ovat glukoosi, sakkaroosi, ksyloosi, fruktoosi, mannitoli ja mainitut soke- 10 rialkoholit ovat galaktitoli, glukosaminitoli, sorbitoli tai galaktosaminitoli.

8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensisijainen stabilointiaine on läsnä pitoisuusalueella 10 tilavuusprosen- 15 tista kyllästyspitoisuuteen.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että stabilointiaine on sakkaroosi pitoisuusalueella 50 - 70 tilavuusprosenttia.

. 10. Jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukainen 20 menetelmä, tunnettu siitä, että toissijainen sta bilointiaine on natriumasetaatti, kaliumasetaatti, nat-riumsulfaatti, ammoniumsulfaatti, litiumsulfaatti, kalium-sulfaatti, magnesiumsulfaatti, bariumsulfaatti, litiumase-taatti tai bariumasetaatti. •25

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toissijainen stabilointiaine on natriumasetaatti pitoisuusalueella noin 0,5 M - noin 2,5 M.

12. Jonkin patenttivaatimuksista l - 11 mukainen 30 menetelmä, tunnettu siitä, että ensisijainen ja toissijainen stabilointiaineen poisto tapahtuu diafil-troinnilla, dialyysillä, pylväskromatografiällä tai saos-tamalla.

13. Jonkin patenttivaatimuksista 1-12 mukainen 35 menetelmä, tunnettu siitä, että kyseinen aine on valkuaisaineita sisältävää. 95778

14. Jonkin patenttivaatimuksista 1-13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kyseinen aine on lopullisen tuotteen valmistusvaiheessa, aktiivisena yhdisteenä lopullisessa tuotteessa tai lopullinen tuote.

15. Jonkin patenttivaatimuksista 1-14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu aine on hyytymistekijä VIII tai protrombiinikompleksi. 1 « 2„ 95778