FI90396B - Menetelmä yksittäisten kaksikerroksisten liposomien valmistamiseksi - Google Patents

Description

1 90396

Menetelmä yksittäisten kaksikerroksisten liposomien valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää yksittäisten kak-5 sikerroksisten liposomien valmistamiseksi. Erityisesti tämä keksintö koskee menetelmää sellaisten yksittäisten kaksikerroksisten liposomien valmistamiseksi, jotka sisältävät biologisesti aktiivisia aineita.

Liposomeja kuvataan kirjallisuudessa laajalti ja 10 niiden rakenne tunnetaan hyvin. Ne muodostuvat amfifaat-tisista molekyyleistä, kuten polaarisista lipideistä, joista esimerkkeinä ovat fosfatidyylikoliinit, etanoli-amiinit ja seriinit, sfingomyeliinit, kardiolipiinit, plasmalogeenit, fosfatidihapot ja serebrosidit. Liposome-15 ja muodostuu, kun fosfolipidien tai muiden soveliaiden amfifaattisten molekyylien annetaan "paisua" vedessä tai vesiliuoksessa, jolloin muodostuu nestemäisiä kiteitä, joiden tavallisesti monikerroksinen rakenne käsittää useita kaksoiskerroksia, jotka vesifaasi erottaa toisis-20 taan. Toisen liposomityypin tiedetään käsittävän yhden ainoan kaksoiskerroksen, joka "koteloi" vesifaasia ja jota voidaan kutsua myös unilamellaariseksi rakkulaksi. Jos vesifaasi sisältää vesiliukoisia aineita lipidien paisumisen aikana, niin ne jäävät lipidikerrosten väliin.

25 Viime vuosina on oltu hyvin kiinnostuneita liposo mien käytöstä sellaisten aineiden kantajina, jotka ovat kiinnostavia jonkin biologisen ominaisuuden vuoksi, esimerkiksi lääkeaineiden, proteiinien, entsyymien, hormonien ja diagnostisten aineiden kantajina, joihin tästälä-30 hin viitataan biologisesti aktiivisina yhdisteinä.

Vesiliukoiset aineet joutuvat bimolekyylikerrosten välissä oleviin vesifaasitiloihin. Lipidiliukoiset aineet joutuvat lipidikerroksiin, jolloin polaariset pääryhmät saattavat työntyä lipidikerroksesta ulos vesifaasitilaan. 35 Tällaisten aineiden sitominen liposomiin voidaan suorit- 2 90396 taa lukuisilla menetelmillä. Yleisimmin käytetty menetelmä käsittää ohuen fosfolipidikalvon muodostamisen lasias-tian seinämille orgaanista liuotinta haihduttamalla. Kun tämä kalvo dispergoidaan sopivaan vesiväliaineeseen, niin 5 muodostuu multilamellaarisia liposomeja (nk. karkeita liposomeja). Sopivan ultraäänikäsittelyn avulla näistä li-posomeista saadaan pienempiä, samalla tavalla "sulkeutuneita" rakkuloita.

Vesiliukoinen biologisesti aktiivinen aine sido-10 taan liposomiin tavallisesti dispergoimalla lasiastiassa oleva fosfolipidikalvo aineen vesiliuokseen. Sitoutumaton aine poistetaan tämän jälkeen sentrifugoimalla, kromato-grafoimalla, dialysoimalla tai jollakin muulla sopivalla menetelmällä. Rasvaliukoinen biologisesti aktiivinen aine 15 sidotaan tavallisesti liuottamalla se orgaaniseen liuot-timeen fosfolipidin kanssa ennen kalvon muodostamista ja dispergoimalla sitten kalvo sopivaan vesiväliaineeseen. Jos ei ole ylitetty aineen liukoisuutta lipidifaasiin, eikä ainetta ole ylenmäärin verrattuna määrään, joka ky-20 kenee sitoutumaan lipidiin, yllä olevan menetelmän mukaan valmistetut liposomit sisältävät tavallisesti enimmän osan aineesta sitoutuneena lipidikaksoiskerrokseen; lipo-somien erottamista sitoutumattomasta aineesta ei tarvita.

Liposomit ovat siis lipidirakkuloita, joissa on 25 yksi tai useampia lipidikerroksia ja jotka ovat disper-goituneina veteen tai elektrolyytin vesiliuokseen. Niitä käytetään laajalti biologisesti aktiivisten aineiden kantajina erilaisiin tarkoituksiin, ja erityisesti lääkeaineiden kantajina. Erityyppisiä liposomeja voidaan käyt-• 30 tää, riippuen toivotusta lipidikerrosten lukumäärästä, liposomien koosta, pintavarauksesta, lipidikoostumuksesta ja valmistusmenetelmästä.

Yleistä menetelmää multilamellaaristen lipidirak-kuloiden valmistamiseksi ovat kuvanneet Bangham et ai.

35 julkaisussaan J. Mol. Biol. 13:238—252 (1965); muodos-

II

3 90396 tuneet multilamellaariset lipidirakkulat koostuvat useasta bimolekyylilamellista sekoittuneena vesiväliaineeseen. Menetelmän mukaan lipidit ja lipofiiliset aineet liuotetaan ensin orgaaniseen liuottimeen. Liuotin poistetaan 5 alipaineessa kiertohaihdutuksella, jolloin lipidijäännös muodostaa ohuen kalvon astian seinälle. Sen jälkeen lisätään vesiliuosta, joka yleensä sisältää elektrolyyttejä ja/tai hydrofiilisiä biologisesti aktiivisia aineita, ja ravistellaan, jolloin muodostuu suuria multilamellaarisia 10 liposomeja. Pieniä, unilamellaarisia rakkuloita voidaan valmistaa ultraäänikäsittelemällä.

Vaihtoehtoisia menetelmiä löytyy lukuisia. Zum-buehl ja Weder kuvataan menetelmää, jossa lipidejä ja lisäaineita liuotetaan pinta-aktiivisten aineiden läsnä-15 ollessa ja ravistellaan voimakkaasti tai ultraäänikäsi-tellään, jolloin saadaan erillisiä sekoittuneita misel-lejä; pinta-aktiiviset aineet poistetaan dialysoimalla [Biochem. Biophys. Acta, 640:252—262, (1981)]. Uudempi menetelmä suurien unilamellaaristen lipidirakkuloiden 20 valmistamiseksi on käänteinen faasinhaihdutusmenetelmä, joka kuvataan US-patenttijulkaisussa 4 235 871. Tämä menetelmä käsittää vesiöljyssä-emulsion muodostamisen. Orgaanisen liuottimen poisto alipaineessa saa aikaan seoksen, jolla on geelinkaltainen luonne ja joka voidaan 25 muuttaa lipidirakkuloiksi ravistelemalla tai dispergoi-malla vesiliuokseen.

Tunnetaan lukuisia muita menetelmiä unilamellaaristen rakkuloiden valmistamiseksi. Esimerkiksi fosfo-lipidin vesidispersion ultaäänikäsittely saa aikaan 30 mikrorakkuloita, jotka koostuvat kaksikerroksisten fos- folipidien ympäröimistä vesipitoisista tiloista [Papa-hadjopoulos ja Miller, Biochem. Biophys. Acta,135:224— 238, (1968)].

Kaikki yllä olevat menetelmät tuottavat reprodu-35 soitavasti liposomeja laboratoriomittakaavassa. Näiden 4 90396 menetelmien soveltaminen suuremmassa mittakaavassa on usein vaikeaa, tai ei ollenkaan toteutettavissa, riippuen käytetystä laitteistosta, osaksi siksi, että tarvittavien fysikaalisten olosuhteiden toisintaminen on vaikeaa.

5 Käyttökelpoisen menetelmän ovat kehittäneet Deamer ja Bangham [Biochem. Biophys. Acta 443:629—634, (1967)]. Tässä menetelmässä lipidejä sisältävä eetteriliuos ruiskutetaan nopeasti 60-asteiseen puskuriliuokseen, jolloin muodostuu spontaanisti unilamellaaristyyppisiä liposomeja 10 eetterin haihtuessa. Ruiskutusmenetelmä on yksinkertainen ja nopea, mutta saatu liposomivalmiste on suhteellisen laimea, koska sitoutumistehokkuus on alhainen.

Toinen menetelmä pienten unilamellaaristen rakkuloiden valmistamiseksi, jossa ei myöskään tarvita 15 ultraäänikäsittelyä, on etanoliruiskutusmenetelmä [S.

Batzri ja E. D. Korn, Biochem. Biophys. Acta 298:1015— 1019, (1973)]. Yksittäisiä kaksikerroksisia liposomeja valmistetaan ruiskuttamalla fosfolipidin etanoliliuosta veteen. Suspensio konsentroidaan ultrasuodattamalla ja 20 etanoli poistetaan dialyysillä.

US-patenttijulkaisussa 4 206 197 kuvataan kemikaalien päällystämismenetelmää, jossa rasva sekoitetaan vesiliukoisen liuottimen, pinta-aktiivisen aineen ja päällystettävän kemikaalin kanssa. Tämän jälkeen liuos paine-25 ruiskutetaan vesifaasiin. Tällä menetelmällä muodostuva tuote on kuitenkin kolloidinen suspensio.

Monipuolinen katsaus liposomityyppeihin ja menetelmiin niiden valmistamiseksi sisältyy julkaisuun "Liposome Technology", toim. G. Gregoriadis, CRC Press Inc., 30 Boca Raton, Florida, osat I, II & III (1984).

Kuten edellä osoitettiin, tunnetut menetelmät yksittäisten kaksikerroksisten liposomien valmistamiseksi tuottavat liposomeja laboratoriomittakaavassa, mutta useinkaan niitä ei voida soveltaa tuotantomittakaavaan 35 tai voidaan soveltaa vain vaikeuksin. Tämä keksintö kosii 5 90396 kee menetelmää yksittäisten kaksikerroksisten liposomien valmistamiseksi laajassa mittakaavassa. Toisaalta tämä keksintö koskee menetelmää biologisesti aktiivisten aineiden sitomiseksi liposomeihin laajassa mittakaavassa.

5 Keksinnön mukainen menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: a) täytetään reaktioastia osittain vesikomponen- tilla, b) liuotetaan lipidikomponentti erillisessä as- 10 tiassa sopivaan orgaaniseen liuottimeen, c) upotetaan suurinopeuksisen homogenisaattorin sekoitusväline mainittuun vesikomponenttiin, d) lipidikomponentti ruiskutetaan paineen alaisena ruiskutusvälineen läpi suoraan vesikomponenttiin samanai- 15 kaisesti sekoittaen seosta sekoitusvälineellä suurella nopeudella lipdin vesidispersion muodostamiseksi, jolloin muodustuu yksittäisi kaksikerroksisia liposomeja.

Yksittäisiä kaksikerroksisia liposomeja, jotka sisältävät biologisesti aktiivista ainetta, voidaan käyttää 20 sellaisinaan tai niitä voidaan käyttää sopivaan farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan imeytyneinä paikalliseen tai koko elimistöön vaikuttavaan hoitoon. Liposo-mivalmisteen viskositeettia voidaan nostaa lisäämällä yhtä tai useampaa sopivaa sakeutusainetta, kuten esimerkik-25 si ksantaanikumia, hydroksipropyyliselluloosaa tai hydr-oksipropyylimetyyliselluloosaa, ja näiden seosta.

Kuten edellä mainittiin, tämän keksinnön mukaisella menetelmällä saadaan yksittäisiä kaksikerroksisia liposomeja, jotka sisältävät biologisesti aktiivista ainet-30 ta, ruiskuttamalla paineen alaisena biologisesti aktiivisen aineen orgaanista liuosta vesikomponenttiin samanaikaisesti sekoittaen suurinopeuksisella homogenisaattoril-la tai muulla sekoitusvälineellä.

Vesikomponentti koostuu joko pelkästä vedestä tai 35 siinä voi olla elektrolyyttejä, puskuria tai muita ainei- 6 90396 ta, kuten esimerkiksi säilöntäaineita. Käytettäväksi sopivia elektrolyyttejä ovat mm. metallisuolat, kuten al-kalimetalli- ja maa-alkalimetallisuolat. Edullisia metal-lisuoloja ovat kalsiumkloridi, natriumkloridi ja kalium-5 kloridi. Elektrolyytin pitoisuus voi vaihdella laajalla alueella nollasta 260 mmol/l:iin. Edullinen pitoisuusalue on 5—160 mmol/1. Vesikomponentti pannaan sopivaan astiaan, jossa voidaan aikaansaada homogenointi aiheuttamalla voimakasta pyörteilyä orgaanisen komponentin 10 ruiskutuksen aikana. Näiden kahden komponentin homogenointi voidaan vaihtoehtoisesti suorittaa ruiskuttamalla ne erikseen sekoitusvälineeseen, joka sijaitsee astian ulkopuolella. Jälkimmäisessä tapauksessa liposomit muodostuvat sekoitusvälineessä, josta ne siirtyvät toiseen 15 astiaan (säilytysastiaan).

Orgaaninen komponentti käsittää sopivan myrkyttömän, farmaseuttisesti hyväksyttävän liuottimen, kuten esimerkiksi etanolin, glyserolin, propyleeniglykolin ja polyetyleeniglykolin, ja sopivan lipofiilisen aineen, ku-20 ten fosfolipidin. Sopivia fosfolipidejä ovat mm. lesitiini, fosfatidyylikoliini, fosfatidyylietanoliamiini, fosfatidyyliseriini, fosfatidyyli-inositoli, lysofosfati-dyylikoliini ja fosfatidyyliglyseroli. Muita lipofiilisiä lisäaineita voidaan käyttää liposomien piirteiden vali-25 koivaan muunteluun. Esimerkkejä tällaisista lisäaineista ovat mm. stearyyliamiini, fosfatidihappo, tokoferoli, kolesteroli ja lanoliiniuutteet.

Biologisesti aktiivinen aine liuotetaan orgaaniseen komponenttiin. Mitä tahansa orgaaniseen liuottimeen 30 liukenevaa biologisesti aktiivista ainetta voidaan sitoa liposomeihin. Patentin selityksessä ja patenttivaatimuksissa käytettynä ilmaus biologisesti aktiivinen aine tarkoittaa yhdistettä tai koostumusta, joka vaikuttaa eläviin soluihin tai organismeihin, kun sitä on läsnä teho-35 kas määrä. Esimerkkejä edullisista biologisesti aktiivi- 7 90396 sista aineista ovat mm. dermatologiset aineet (esim. triamsinoloniasetonidi, retinoiinihappo, 13-cis-retinoii-nihappo, hydrokortisoni); bakteerinvastaiset aineet (esim. ampisiliinni); sienenvastaiset aineet (esim. eko-5 natsolinitraatti, mikonatsoli, butakonatsoli, terkonatso-li, amfoterisiini B); eritystä vähentävät aineet (esim. simetidiini, ranitidiini); kouristusta lieventävät aineet (esim. difenyylihydantoiini); verenpainetta alentavat aineet (esim. minoksidiili); syövänvastaiset aineet (esim. 10 metotreksaatti); immunomodulaattorit (esim. muramyylidi-peptidin lipofiiliset johdannaiset); virusvastaiset aineet (esim. asykloviiri, interferonit); ei-steroidiset tulehduksenvastaiset aineet (esim. ibuprofeeni, suprofee-ni); ja prostaglandiinit (rioprostiili, mesoprostiili).

15 Voi olla edullista käyttää biologisesti aktiivisen aineen mikronisoitua muotoa, so. ainetta, jonka keskimääräinen partikkelikoko on vähemmän kuin 10 pm, sillä suuri pinta-ala helpottaa liposomikomponenttien liukenemista. Lisäksi muita aineksia, jotka voivat ehkäistä fosfolipi-20 dien hapettumista, voidaan lisätä orgaaniseen komponenttiin. Esimerkkejä tällaisista aineksista ovat mm. toko-feroli, butyylihydroksianisoli, butyylihydroksitolueeni, askorbyylipalmitaatti ja askorbyylioleaatti. Säilöntäaineita, kuten bentsoehappoa, metyyliparabeenia ja pro-25 pyyliparabeeinia, voidaan myös lisätä.

Orgaanisen komponentin määrä vaihtelee riippuen ainesten liukoisuudesta. On käytettävä riittävästi liuotinta, eli sellaista määrää, että kaikki lipofiiliset ainekset liukenevat, mutta liuottimen määrä ei saisi ylit-30 tää 10 % koko seoksen tilavuudesta.

Mitä tahansa suurinopeuksista sekoitusvälinettä tai homogenisaattoria, joka mahdollistaa komponenttien suurinopeuksisen sekoituksen paineen alaisena, voidaan käyttää. Yleisesti käytetään sekoitinta, jonka nopeus on 35 noin 1500—20 000 kierrosta minuutissa. Edullisessa mene- 8 90396 telmässä orgaanista komponenttia ruiskutetaan vesikompo-nenttiin yhden tai useamman sekoitusvälineeseen kiinnitetyn suuttimen kautta. On edullista käyttää homogeni-saattoria, jonka suuttimen halkaisija on noin 0,1—20 mm, 5 mutta mitä tahansa sopivaa suuttimen halkaisijaa voidaan käyttää. Edullinen halkaisija on noin 0,1—10 mm. Homoge-nisaattorin kanssa käytettävän pumpun pitäisi saada aikaan 0,1-300 barin paine (0,01—21,4 psi). Orgaanisen komponentin virtausnopeus ruiskutuksen aikana on edullisesti 10 noin 1—1000 ml/min. Panoskoosta riippumatta vesiliuoksen virtausnopeuden pitäisi olla ainakin 50 kertaa suurempi kuin orgaanisen liuoksen virtausnopeus, kun nämä kaksi komponenttia sekoittuvat erillisessä astiassa. Sopiva virtausnopeus riippuu käytettävän sekoitusvälineen sekoi-15 tustehokkuudesta. On edullista huuhdella liuokset iner- tillä kaasulla, kuten typellä tai argonilla, käytettävien aineiden mahdollisen hapettumisen ehkäisemiseki menetelmän aikana. Tämän keksinnön mukaisen menetelmän tuottamat liposomit kerätään sinänsä tunnetuilla menetelmillä. Li-20 posomien on havaittu olevan pysyvimpiä pH-välillä 5—7.

Mitä tahansa sopivaa orgaanista tai mineraalihappoa, kuten suolahappoa, bromivetyhappoa tai etikkahappoa, voidaan lisätä liposomeihin, kunnes haluttu pH-alue saavutetaan .

25 Liposomeja voidaan käyttää esimerkiksi biologises ti ja/tai lääkkeenvaikutusopillisesti aktiivisten aineiden kantajina ja/tai sellaisenaan lääkkeiden sekoittamisessa. Yllä kuvatun mukaan valmistetut liposomit voidaan antaa ulkoisesti tai suun kautta, tapauksen mukaan. Ne 30 voidaan antaa ulkoisesti ilman lisäpuhdistusta. Suun kautta nautittaessa liposomien lisäpuhdistus voi olla tarpeen mahdollisten myrkyllisten aineiden poistamiseksi. Hoitotavasta riippuen voi olla toivottavaa antaa liposomit sopivassa farmaseuttisesti hyväksyttävässä kantajas-35 sa. Esimerkkejä sellaisista kantajista ovat mm. hyyte-

II

9 90396 löt, liuokset ja aerosolit.

Seuraavat esimerkit havainnollistavat tämän keksinnön edullisia toteutusmuotoja. Vaikka kaikissa esimerkeissä on mukana biologisesti aktiivinen aine, menetel-5 mästä käy selville, että yksittäisiä kaksikerroksisia li-posomeja voidaan valmistaa ilman aktiivista ainetta. Seuraavat edulliset yksityiskohtaiset toteutusmuodot ovat siten tulkittava puhtaasti valaiseviksi eikä keksintöä rajoittaviksi.

10

Esimerkki I

Koostumus

Ekonatsoliemäs (mikronisoitu) 2,5 g

Fosfatidyylikoliini 25,0 g 15 Kolesteroli 2,5 g

Bentsoehappo 0,5 g

Butyylihydroksianisoli 0,0125 g

Etanoli 20,0 g

Kalsiumkloridiliuos (8 mmol/1) 199,5 g 20 Menetelmä

Ekonatsoliemäs, fosfatidyylikoliini, kolesteroli, bentsoehappo ja butyylihydroksianisoli lisättiin etanoliin ja seosta kuumennettiin 45—50 °C:ssa, kunnes aineet liukenivat. Kalsiumkloridiliuos pantiin suuritehoiseen 25 homogenisaattoriin (Polytron PTA2SM; valmistanut Kinema-tica, Littau, Lucerne, Sveitsi) 25 °C:ssa. Sitten etano-liliuos pumpattiin putken läpi suoraan kalsiumkloridi-liuokseen, ja samanaikaisesti liuoksia sekoitettiin suu-. . rella nopeudella. Halkaisijaltaan 2,5 μιη pienempiä lipo- 30 someja muodostui spontaanisti.

Tekniset tiedot

Homogenisaattorin nopeus 20000 rpm

Virtausnopeus 8 ml/min

Suuttimen aukon halkaisija 0,18 mm 35 Paine 100—150 bar (7—10 psi) 10 90396

Esimerkki II Koostumus

Ekonatsoliemäs (mikronisoitu) 2,5 g

Fosfatidyylikoliini 25,0 g 5 Kolesteroli 2,5 g

Metyyliparabeeni 0,35 g

Propyyliparabeeni 0,025 g

Butyylihydroksitolueeni 0,025 g

Etanoli 12,5 g 10 Kalsiumkloridiliuos (8 mmol/1) 207,1 g

Menetelmä

Metyyliparabeeni, propyyliparabeeni, butyylihydroksitolueeni, kolesteroli, fosfatidyylikoliini ja ekonatsoliemäs lisättiin etanoliin ja suspensiota kuumennettiin 15 45—50 °C:ssa, kunnes aineet liukenivat. Suspensio puhdis tettiin typellä liukenemisen aikana. Kalsiumkloridiliuos pantiin suuritehoiseen homogenisaattoriin (Polytron PTA2SM; valmistanut Kinematica, Littau, Lucerne, Sveitsi) 20 °C:ssa. Sitten etanoliliuos pumpattiin putken läpi 20 suoraan kalsiumkloridiliuokseen ja samanaikaisesti liuoksia sekoitettiin suurella nopeudella. Jokainen liuos huuhdeltiin typellä sekoituksen aikana. Halkaisijaltaan 3 Mm pienempiä liposomeja muodostui spontaanisti.

Tekniset tiedot 25 Homogenisaattorin nopeus 9000 rpm

Virtausnopeus 8 ml/min

Suuttimen aukon halkaisija 1 mm

Paine 30 bar (2 psi)

30 Esimerkki III

Panoskoko 18 kg

Koostumus

Ekonatsoliemäs (mikronisoitu) 180,0 g

Lesitiini 1800,0 g 35 Kolesteroli 180,0 g li 11 90396

Metyyliparabeeni 25,2 g

Propyyliparabeeni 1,8 g

Natriumkloridi 19,98 g

Puhdistettu vesi 13480,02 g 5 Etanoli 1800,0 g

Askorbyylipalmitaatti 18,0 g

Hydroksipropyylimetyyliselluloosa 396,0 g

Hajuste 36,0 g

Suolahappo (10-%) 63,0 g 10 Menetelmä

Metyyliparabeeni, propyyliparabeeni ja natriumkloridi liuotettiin puhdistettuun veteen 80 °C:ssa (kattila I). Ekonatsoliemäs, askorbyylipalmitaatti, lesitiini ja kolesteroli liuotettiin etanoliin erillisessä kattilassa 15 40 °C:ssa (kattila II).

Etanoliliuosta puhdistettiin typellä koko menetelmän aikana. Molemmat liuokset jäähdytettiin huoneen lämpötilaan. Kattila I yhdistettiin suuritehoiseen homogeni-saattoriin. (Megatron MT-61; valmistaja Kinematica, Lit-20 tau, Lucerne, Sveitsi) vesiliuoksen saamiseksi kiertoliikkeeseen (virtausnopeus: 50 litraa/minuutti). Etanoli-liuos ruiskutettiin putken läpi kattila II:sta suoraan homogenoijaan (virtausnopeus: 500 ml/minuutti; paine 0,02 psi) . Halkaisijaltaan 2,5 μιη pienempiä liposomeja muodos-25 tui spontaanisti ja kerättiin kattila I:een. Tämän menetelmän loppuun suorittamisen jälkeen lisättiin suolahappoa (10-%) ja hajustetta kattila I:een. Hydroksipropyyli-metyyliselluloosaa lisättiin hyytelöitymisen aikaansaamiseksi .

30 Tekniset tiedot

Homogenisaattorin nopeus 8000 rpm

Vesiliuoksen virtausnopeus 50 1/min

Etanoliliuoksen virtausnopeus 0,5 1/min

Suuttimen aukon halkaisija 6 mm 35 Paine 0,02 psi i2 90396

Esimerkki IV

Terkonatsoli (mikronisoitu) 2,0 g

Lesitiini 25,0 g

Kolesteroli 2,5 g 5 Etanoli 25,0 g

Askorbyylipalmitaatti 0,25 g

Natriumkloridi 0,2775 g

Metyyliparabeeni 0,35 g

Propyyliparabeeni 0,025 g 10 Suolahappo (10-%) 1,03 g

Puhdistettu vesi 193,5675 g

Menetelmä

Metyyliparabeeni, propyyliparabeeni ja natriumkloridi liuotettiin veteen 80 °C:ssa suurinopeuksisella se-15 koittajalla (Polytron PTA 20 SM; valmistaja Kinematica, Littau, Lucerne, Sveitsi) varustetussa astiassa. Terkonatsoli, lesitiini, askorbyylipalmitaatti ja kolesteroli liuotettiin etanoliin 40 °C:ssa erillisessä astiassa samalla sekoittaen. Molemmat liuokset jäähdytettiin huoneen 20 lämpötilaan. Sitten etanoliliuos pumpattiin putken läpi suoraan vesiliuokseen; samanaikaisesti liuoksia sekoitettiin suurella nopeudella. Halkaisijaltaan 2,5 μπι pienempiä liposomeja muodostui spontaanisti ja kerättiin suuritehoisella homogenisaattorilla varustettuun astiaan. pH 25 säädettiin 5,5:een lisäämällä suolahappoa (10-%).

Tekniset tiedot

Homogenisaattorin nopeus 20000 rpm

Etanoliliuoksen virtausnopeus 8 ml/min

Suuttimen aukon halkaisija 1,0 mm 30 Paine 1 psi i3 90 396 Tämän keksinnön mukaan valmistetut liposomit karakterisoitiin käyttäen seuraavia fysikaalis-kemiallisia menetelmiä: 1) Hydrodynaamiset ominaisuudet, so. massan määri-5 tys ja rakkulan säde, määritettiin analyyttisellä ultra- sentrifugilla (Beckman L-65 taittolisälaitteilla) ja dynaamisella laservalosironnalla.

2) Rakkuloiden homogeenisuus määritettiin elektronimikroskoopilla käyttäen pakastemurtumismenetelmää.

10 Kuva I on elektronimikroskooppikuva esimerkin I

mukaan valmistetuista liposomeista.

Kuva II on elektronimikroskooppikuva esimerkin II mukaan valmistetuista liposomeista.

Claims (16)

1. Menetelmä yksittäisten kaksikerroksisten lipo-somien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se 5 käsittää seuraavat vaiheet a) täytetään reaktioastia osittain vesikomponen- tilla, b) liuotetaan lipidikomponentti erillisessä astiassa sopivaan orgaaniseen liuottimeen, 10 c) upotetaan suurinopeuksisen homogenisaattorin sekoitusväline mainittuun vesikomponenttiin, d) lipidikomponentti ruiskutetaan paineen alaisena ruiskutusvälineen läpi suoraan vesikomponenttiin samanaikaisesti sekoittaen seosta sekoitusvälineellä suurella 15 nopeudella lipidin vesidispersion muodostamiseksi, jol loin muodostuu yksittäisiä kaksikerroksisia liposomeja.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesikomponentti sisältää elektrolyyttiä, joka on alkalimetalli- tai maa-alkali- 20 metallisuola.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lipidikomponentti on fosfo-lipidi ja orgaaninen liuotin on etanoli.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että fosfolipidi on fosfati- dyylikoliini.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fosfolipidi on seoksena kolesterolin kanssa.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sekoitusvälineen nopeus on 1500—20000 rpm, mainittu ruiskutusväline on kiinnitetty yhteen tai useampaan suuttimeen, suuttimen halkaisija on 0,1—10,0 mmm lipidikomponentti ruiskutetaan vesikompo-35 nenttiin 0,1—300 barin paineessa, ja orgaanisen komponen- II is 90396 tin virtausnopeus on 1—1000 ml/min.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätään sopivaa sakeut-tamisainetta, edullisesti ksantaanikumia tai hydroksi- 5 propyyliselluloosaa, tai näiden seosta.

8. Menetelmä biologisesti aktiivista ainetta sisältävien yksittäisten kaksikerroksisten liposomien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet 10 a) täytetään reaktioastia osittain vesikomponen- tilla b) muodostetaan orgaaninen komponentti liuottamalla lipidikomponentti ja biologisesti aktiivinen aine sopivaan orgaaniseen liuottimeen erillisessä astiassa 15 c) upotetaan suurinopeuksinen homogenisaattorin sekoitusväline mainittuun vesikomponenttiin d) mainittu lipidikomponentti ruiskutetaan paineen alaisena ruiskutusvälineen läpi suoraan mainittuun vesi-komponenttiin samanaikaisesti sekoittaen seosta sekoitus-20 välineellä suurella nopeudella lipidin vesidispersion muodostamiseksi, jolloin muodostuu yksittäisiä kaksikerroksisia liposomeja.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesikomponentti sisältää 25 elektrolyyttiä, joka on alkalimetaalli- tai maa-alkali-metallisuola.

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lipidikomponentti on fos-folipidi ja orgaaninen liuotin on etanoli. 30 li. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fosfolipidi on fosfati-dyylikoliini.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fosfolipidi on seoksena ko-35 lesterolin kanssa. i6 90 396

13. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lipofiilinen biologisesti aktiivinen aine on seoksena lipidikomponentin kanssa.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että lipofiilinen biologiseti aktiivinen aine on sienenvastainen aine, edullisesti eko-natsoli, terkonatsoli tai mikonatsoli, tai lipofiilinen biologisesti aktiivinen aine on ei-steroidaalinen tuleh-duksenvastainen aine.

15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lipofiilinen biologisesti aktiivinen aine on prostaglandiini.

16. Patenttivaatimuken 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että homogenisaattorin nopeus on 15 välillä 1500—20000 rpm, mainittu ruiskutusväline kiinnitetään yhteen tai useampaan suuttimeen, suuttimen halkaisija on 0,1—10,0 mm, lipidikomponentti ruiskutetaan ve-sikomponenttiin 0,1—300 barin paineessa ja orgaanisen komponentin virtausnopeus on 1—1000 ml/min.

17. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätään sopivaa sakeutta-misainetta, edullisesti ksantaanikumia, hydroksipropyy-liselluloosaa tai hydroksipropyylimetyyliselluloosaa, tai näiden seosta. li i7 90 396