FI89109B - Foerfarande foer bestaemning av hyaluronsyra med hoeg molekylvikt och foer bestaemningen erforderlig reagensfoerpackning - Google Patents

Description

1 89109

Menetelmä suuren molekyylipainon omaavan hyaluronihapon määrittämiseksi ja määritykseen tarvittava reagenssipak-kaus 5 Tämä keksintö koskee menetelmää löysissä sideku doksissa, kuten nivelontelon nivelnesteessä, olevan hyaluronihapon määrittämiseksi. Tämä keksintö koskee myös reagenssipakkausta hyaluronihapon määrittämiseksi. Tarkemmin sanottuna tämä keksintö koskee menetelmää, jolla 10 pystytään erittäin herkästi määrittämään suurimolekyyli- painoinen hyaluronihappo, samoin kuin reagenssipakkausta tämän määrityksen suorittamiseksi.

Hyaluronihappo, joka on hapan, N-asetyyliglukos-amiinin ja glukuronihapon fi-l,4-sidoksella vuorottaisesti 15 polymeroitumalla muodostunut mukopolysakkaridi, sitoo ihonalaisia kudoksia ja sitä esiintyy napanuorassa, nivelontelon nivelnesteessä ja silmän mykiössä.

Tiedetään, että veren hyaluronihappo-pitoisuus kasvaa potilailla, jotka sairastavat tulehduksia kuten 20 reumatismia tai tauteja, kuten syöpä. Niinpä veren hyaluronihapon kvantitatiista määritystä voidaan käyttää hyväksi kliinisissä sovellutuksissa arvioitaessa tulehdusten kehittymistä tai potilaan edistymistä leikkauksista toipumisessa tai diagnostisoitaessa tauteja, kuten syö-25 pää.

Hyaluronihapon kvantitatiivinen määritys on perinteisesti suoritettu radioimmunologisilla määritysmenetelmillä käyttäen hyaluronihappoa sitovia proteiineja, jotka on leimattu radioaktiivisella jodilla, tai entsyymiimmu-30 nologisilla määritysmenetelmillä käyttäen hyväksi hyalu- ronektiiniä. Radioimmunologisissa määritysmenetelmissä hyaluronihappoon kytkettyä kiinteää faasia, kuten Sepha-rose-geeliä, sekoitetaan määritettävän hyaluronihappoa sisältävän näytteen kanssa ja seoksen annetaan seistä 35 radioaktiivisella jodilla leimatun hyaluronihappoa sito- 2 89109 van proteiinin lisäyksen jälkeen. Tässä menetelmässä Sep-harose geeliin kytketyn hyaluronihapon sitoutuminen radioaktiivisella isotoopilla leimattuun hyaluronihappoa sitovaan proteiiniin inhiboituu määrällä, joka riippuu 5 näytteessä olevan hyaluronihapon pitoisuudesta. Näytteessä olevan hyaluronihapon pitoisuus voidaan määrittää epäsuorasti mittaamalla radioaktiivisella isotoopilla leimatun hyaluronihappoa sitovan proteiinin määrä.

Sekä radioimmunologisissa että entsyymi-immunolo-10 gisissa määritysmenetelmissä käytetään kompetetiivista reaktiota, eikä hyaluronihapon määrityksen herkkyys ole tyydyttävän korkea, tämä tarkoittaa, se on parhaimmillaan 40 ng. Perinteisten menetelmien huono puoli on myös se, että myös pienimolekyylipainoinen hyaluronihappo, jolla 15 on vain yksi sitoutumispaikka hyaluronihappoa sitovaan proteiineihin tai hyaluronektiiniin, voi osallistua kom-petetiiviseen reaktioon. Toisin sanoen ei vain mielenkiinnon kohteena oleva suurimolekyylipainoinen hyaluronihappo vaan myös fysiologisesti ei-tärkeä pienimolekyylipai-20 noinen hyaluronihappo määritetään. Tästä aiheutuu vakava ongelma diagnostisoitaessa tulehduksia, kuten reumatismia joissa suhteellisen suurimolekyylipainoinen hyaluronihappo on se aine, jota olisi mitattava. Niinpä halutaan kovasti kehittää menetelmä, jokä ei ole herkkä pienimole-25 kyylipainoiselle hyaluronihapolle, mutta joka pystyy antamaan käyttöön herkemmän määritysmenetelmän suurimole-kyylipainoisen hyaluronihapon määrittämiseksi kuin alalla aikaisemmin tunnetut menetelmät.

Niinpä tämän keksinnön tarkoitus on antaa käyttöön 30 menetelmä, jolla voidaan selektiivisesti ja erittäin herkästi määrittää suurimolekyylipainoinen hyaluronihappo siten, ettei olla riippuvaisia kompetetiivisesta reaktiosta ja ettei saada vastetta ei-halutuille pienimolekyy-lipainoisille hyaluronihapoille.

35 Toinen tämän keksinnön tarkoitus on antaa käyttöön I, 3 89109 reagenssipakkaus, joka sopii tämän hyaluronihappomääri-tyksen suorittamiseen.

Näiden tarkoitusten saavuttamiseksi on tehty intensiivisiä tutkimuksia ja huomattu se seikka, että fy-5 Biologisesti tärkeässä suurimolekyylipainoisessa hyalu-ronihapossa on ainakin kaksi paikkaa hyaluronihappoa sitovaan proteiiniin kiinnittymistä varten. Tämän havainnon perusteelle on muodostettu sandwich-rakenteinen kompleksi, jossa hyaluronihappoa sitova proteiini oli kytketty 10 kahdesta tai useammasta paikasta hyaluronihappoon, jonka molekyylipaino oli tarpeeksi suuri salliakseen kytkeytymisen hyaluronihappoa sitovaan oroteiiniin kahdesta tai useammasta paikasta (tästä hyaluronihaposta käytetään tässä myöhempänä nimitystä "suurimolekyylipainoinen hya-15 luronihappo") ja mittasivat näin muodostetun sandwich-rakenteisen kompleksin pitoisuuden. Tällä menetelmällä havaittiin voitavan määrittää mielenkiinnon kohteena olevan suurimolekyylipainoisen hyaluronihapon pitoisuus erittäin herkästi.

20 Keksinnön mukaiselle menetelmälle suurimolekyyli painoisen hyaluronihapon määrittämiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Menetelmässä on seuraavat vaiheet: lisätään mielenkiinnon kohteena olevaa hyaluronihappoa sisältävä näyte kiinteään faasiin 25 adsorboituun hyaluronihappoa sitovaan proteiiniin, jolloin adsorboidun hyaluronihappoa sitovan proteiinin annetaan sitoutua mielenkiinnon kohteena olevaan hyaluronihappoon; lisätään edelleen joko hyaluronihappoa sitova proteiini ja merkkiaine tai merkkiaineella leimattu hya-30 luronihappoa sitova proteiini, jolloin muodostetaan sandwich-rakenteinen kompleksi, jossa mielenkiinnon kohteena oleva hyaluronihappo on kiinteään faasiin absorboidun hyaluronihappoa sitovan proteiinin ja leimatun hyaluronihappoa sitovan proteiinin välissä; sekä mitataan mainitun 35 mielenkiinnon kohteena olevan hyaluronihapon määrä maini- 4 89109 tussa kompleksissa olevan merkkiaineen avulla.

Toisaalta tämä keksintö antaa käyttöön reagenssi-pakkauksen, joka sopii tämän määritysmenetelmän suorittamiseen ja jolle on tunnusomaista se, mitä patenttivaati-5 muksessa 5 esitetään.

Kuvio 1 esittää graafisesti absorbanssin ja suuri-molekyylipainoisen hyaluronihapon pitoisuuden välistä suhdetta tämän keksinnön mukaisella määritysmenetelmällä saatuna.

10 Tämän keksinnön mukainen määritysmenetelmä alkaa hyaluronihappoa sitovan proteiinin adsorboinnilla kiinteän faasin pintaan. Kiinteän faasin pinnalle jää vielä paikkoja, joihin hyaluronihappoa sitova proteiini tai jokin muu molekyylilaji pystyy kiinnittymään, jolloin 15 lisättäessä määritettävä näyte sen sisältämä mielenkiin non kohteena oleva suurimolekyylipainoinen hyaluronihappo ja muut veren komponentit saattavat tarttua näihin paikkoihin. Niinpä ennen näytteen lisäystä lisätään sitoutumista estävä aine peittämään ne kiinteän faasin osat, 20 joihin hyaluronihappoa sitova proteiini ei ole adsorboitunut. Esimerkkejä käyttökelpoisista sitoutumista estävistä aineista ovat γ-globuliini, seerumin albumiini sekä lehmistä tai muista eläimistä saatu seerumi. Naudan y-globuliini on edullinen käytettäessä Falcon-levyä kiin-25 teänä faasina.

Seuraavassa vaiheessa mielenkiinnon kohteena olevan suurimolekyylipainoisen hyaluroinihapon sisältävä näyte lisätään kiinteään faasiin, johon hyaluronihappoa sitova proteiini on adsorboitu. Lisättävän näytteen ei 30 tarvitse olla uuttamalla eristetyssä muodossa oleva suu rimolekyylipainoinen hyaluronihappo, vaan ihmisen verinäytettä tai ruumiinnestenäytettä voidaan käyttää sellaisena, kuin se on saatu ihmisen ruumiista. Haluttaessa näyte voidaan liuottaa sitoutumista estävän aineen liuok-35 seen tai laimennettuun seerumiin, ennen kuin se lisätään li - 5 89109 kiinteään faasiin, johon hyaluronihappoa sitova proteiini on adsorboitu.

Kun suurimolekyylipainoinen hyaluronihappo on kytketty kiinteään faasiin adsorboituun hyaluronihappoa si-5 tovaan proteiinin, kiinteän faasin pinta edullisesti pestään.

Tämän keksinnön mukaisen menetelmän kolmannessa vaiheessa tietyllä merkkiaineella leimattu hyaluronihappoa sitova proteiini lisätään kiinteään faasiin, johon 10 suurimolekyylipainoinen hyaluronihappo on kytketty. Sopivia merkkiaineita ovat isotoopit, fluorokromit, avidiini, biotiini, kemiluminesoivat aineet ja entsyymit. Mitä tahansa muita merkkiaineita, joita tavanomaisesti käytetään suurimolekyylipainoisten aineiden leimaukseen, voidaan 15 rajoituksetta käyttää.

Vaihtoehtoisesti proteiinimainen aine, joka sitoutuu helposti merkkiaineeseen, kytketään etukäteen hyaluronihappoa sitovaan proteiiniin, joka tämän jälkeen lisätään kiinteään faasiin (johon suurimolekyylipainoinen 20 hyaluronihappo on kytketty) yhdessä sopivan merkkiaineen kanssa.

Lisäämällä hyaluronihappoa sitova proteiinin kolmannessa vaiheessa muodostetaan sandwich-rakenteinen kompleksi, jossa suurimolekyylipainoinen hyaluronihappo on 25 kiinteään faasiin adsorboidun, hyaluronihappoa sitovan proteiinin ja leimatun tai helposti leimautuvan hyaluronihappoa sitovan proteiinin välissä.

Tämän keksinnön mukaisen menetelmän neljännessä vaiheessa sandwich-rakenteisen kompleksin merkkiaineen 30 pitoisuus mitataan mielenkiinnon kohteena olevan suurimo-lekyylipainoisen hyaluronihapon kvantitoimiseksi. Sandwich-rakenteinen kompleksi sisältää mielenkiinnon kohteena olevaa suurimolekyylipainoista hyaluronihappoa, mutta mitkään pienimolekyylipainoiset hyaluronihapot, joita ei 35 pitäisikään määrittää tämän keksinnön mukaisella menetel- « 89109 mällä, eivät pysty muodostamaan yllä kuvatun kaltaista sandwich-rakennetta. Niinpä mittaamalla kiinteän faasin pinnalla olevan merkkiaineen pitoisuus vain suurimolekyy-lipainoinen hyaluronihappo, joka pystyy muodostamaan tar-5 koitetun sandwich-rakenteen, voidaan kvantitoida.

Merkkiaineen pitoisuuden mittaukseen käytetty menetelmä riippuu merkkiaineen tyypistä ja merkkiaineen ollessa kerniluminesoiva aine tämän aineen kanssa reagoineen liuoksen absorbanssi voidaan mitata.

10 Käytettäessä tämän keksinnön mukaista menetelmää on edullista valmistaa näytteet, jotka sisältävät tunnetut pitoisuudet merkkiainetta ja mielenkiinnon kohteena olevaa suurimolekyylipainoista hyaluronihappoa, ja muodostaa vakiokuvaajat signaalin voimakkuuden ja näiden 15 tunnettujen pitoisuuksien välisen suhteen määrittämiseksi, jotta mitatut arvot voidaan lukea näiden vakiokuvaa-jien avulla.

Esimerkkejä tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käyttökelpoisessa kiinteästä faasista ovat levyt, 20 putket, helmet, kalvot ja geelit. On kuitenkin mainittava, etteivät nämä ole ainoita esimerkkejä ja mitä tahansa muuta kiinteää faasia, johon hyaluronihappoa sitova proteiini voidaan adsorboida, voidaan käyttää.

Tässä keksinnössä käyttökelpoisia hyaluronihappoa 25 sitoavia proteiineja ovat Laurent, A. E. et al.:n puhdistama proteoglykaani (katso Analytical Biochemistry 109 (1980) 386-394), yhdysproteiini (link protein) ja hyalu-rononektiini.

Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä määritet-30 tävä aine on suhteellisen suurimolekyylipainoinen hyaluronihappo, jota pidetään tärkeänä tekijänä tulehdusten, kuten reumatismin, tai tautien, kuten syövän, diagnostisoinnin kannalta, ja on välttämätöntä estää tämän keksinnön mukaisen määritysmenetelmän piirin ulkopuolelle 35 jäävän pienimolekyylipainoisen hyaluronihapon mittaaminen.

li 7 89109 Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä mielenkiinnon kohteena oleva suurimolekyylipainoinen hyaluroni-happo kvantitoidaan sandwich-rakenteisena kompleksina, jossa hyaluronihappoa sitova proteiini on kytketty mai-5 nittuun hyaluronihappoon kahdesta tai useammasta kohdasta. Niinpä pienimolekyylipainoiset hyaluronihapot, joissa on vain yksi hyaluronihappoa sitovan proteiinin si-toutumispaikka, eivät pysty muodostamaan yllä kuvatun kaltaisia sandwich-rakenteista kompleksia, eivätkä siis 10 reagoi tämän keksinnön mukaista menetelmää käyttävässä määritysmenetelmässä.

Alalla aikaisemmin tunnetut menetelmät hyaluroni-hapon määrittämiseksi ovat riippuvaisia kompetetiivises-ta reaktiosta, mutta tämän keksinnön mukainen menetelmä 15 ei ole. Niinpä tämän menetelmän etu on se, ettei siinä tarvitse käyttää reagenssina etukäteen puhdistettua hyaluronihappoa ja että se voidaan suorittaa hyvin helposti .

Tämän keksinnön mukaisen määritysmenetelmän herk-20 kyys on niin suuri, että se pystyy toteamaan ja kvanti-toimaan suurimolekyylipainoisen hyaluronihapon silloinkin, kun sitä esiintyy niinkin pieni määrä kuin 10 ng.

Seuraavan esimerkin tarkoituksena on valaista tätä keksintöä edelleen, mutta sitä ei tule mitenkään pitää 25 rajoittavana.

Seuraavassa kuvauksessa on kaksi osaa, joista ensimmäinen koskee menetelmää puhdistetun hyaluronihappoa sitovan proteiinin valmistamiseksi, jota proteiinia tullaan käyttämään tämän keksinnön mukaisessa määritysmene-30 telmässä, ja toinen osa kuvaa vakiokuvaajien muodostamista käyttäen tämän keksinnön mukaista määritysmenetelmää ja näytteitä, jotka sisältävät tunnetut pitoisuudet suurimolekyylipainoista hyaluronihappoa.

Seuraavassa kuvauksessa M tarkoittaa yksikköä 35 mol/1 ja % tarkoittaa yksikköä g/100 ml.

e 89109

Hyaluronihappoa sitovan proteiinin puhdistus

Hyaluronihappoa sitovan proteiinin uuttamiseksi ja puhdistamiseksi tässä keksinnössä käytettäväksi suoritettiin seuraavat toimenpiteet Laurent, A. E. et al.:n, 5 Analytical Biochemistry 109 (1980) 386-394, menetelmän mukaisesti.

Naudan nenärusto (300 g; saatu Tokyo Shibaura Zoki Co., Ltd. -yhtiöstä) leikattiin pieniksi palasiksi saksilla, upotettiin 0,5 natriumasetaattiliuokseen (pH

10 5,8), joka sisälsi 4 M guanidiinihydrokloridia (Wako

Pure Chemical Industries, Ltd.) ja jota pidettiin 4 °C:ssa (tästä liuoksesta käytetään tässä myöhempänä nimitystä puskuriliuos A) ja uutettiin sekoittamalla yli yön 4 °C:ssa.

15 Kun seosta oli sentrifugoitu 20 minuuttia kier- rosnopeudella 13 000 g, supernatantti erotettiin, dia-lysoitiin tislattua vettä vastaan ja kylmäkuivattuin. Kiinteät aineet murskattiin, jolloin saatiin raaka-uute jauhe.

20 Raakauutejauhe käsiteltiin trypsiinillä seuraa- via menetelmiä käyttäen. Raakauutejauhe (1 600 mg) ja 0,8 mg trypsiiniä (Sigma) liuotettiin 25 ml:aan 0,1 M Tris-HCl-puskuriliuosta (pH 7,3), joka sisälsi 0,1 M natriumasetaattia, ja liuosta pidettiin 37 °C:ssa kah- 25 den tunnin ajan. Kun seokseen oli lisätty 1 mg soija- pavun trypsiini-inhibiittoria (Sigma) ja 19,1 g guanidiinihydrokloridia, siihen lisättiin 0,5 M natriumasetaat-tiliuosta siten, että kokonaistilavuudeksi saatiin 50 ml.

30 Trypsiinillä käsitellyn hyaluronihappoa sitovan proteiinin sisältävästä liuoksesta ajettiin affini-teettikromatografia puhdistetun hyaluronihappoa sitovan proteiinin valmistamiseksi seuraavia menetelmiä käyttäen .

Il 9 89109 50 ml trypsiinillä käsitellyn hyaluronihappoa sitovan proteiinin sisältävää liuosta sekoitettiin 50 ml:aan erikseen valmistettua Sepharosea-geeliä, johon oli kytketty hyaluronihappoa (menetelmä tämän valmista-5 miseksi, katso alla) ja seos vietiin välittömästi dia-lyysikalvoon, jonka jälkeen dialysoitiin yhdeksää tilavuutta tislattua vettä vastaan yli yön 4 °C:ssa. Dialyysin jälkeen geelin koko tilavuus pakattiin pylvääseen, jonka sisähalkaisija oli 3,2 cm. Pylväs pes-10 tiin 1 M natriumkloridiliuoksella adsorboitumattoman aineen poistamiseksi.

Ei-toivottu proteiini poistettiin peräkkäisillä pesuilla 1 M - 3 M natriumkloridia käyttäen ja adsorboitunut aine otettiin talteen eluoimalla puskuriliuos 15 A :11a.

Talteen otetut fraktiot konsentroitiin DIAFLO PM-10 -suodattimena (Amicon) 4 ml:n kokonaistilavuuteen ja ajettiin Sepharose 6B -pylvään (3,1 cm φ x 43 cm) läpi. Fraktiot, joissa oli toinen ja kolmas piikki, otet-20 tiin talteen, jonka jälkeen ne erotettiin ja konsentroitiin DIAFLO PM-10 -suodattimena hyaluronihappoa sitovaa proteiinia sisältävien reagenssien valmistamiseksi .

Hyaluronihapolla konjugoidun Sepharose-geelin 25 valmistus

Vesiliukoista karbodi-imidiä (1,4 g) lisättiin seokseen, joka sisälsi 600 mg natriumhyaluronaattia (Seikagaku Fine Biochemicals), 75 ml AH-Sepharosea (Pharmacia Fine Chemicals) ja 200 ml tislattua vettä, 30 ja seos jätettiin seisomaan huoneenlämpötilaan 24 tunniksi. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 10 ml etikka-- happoa. Saatu geeli otettiin talteen ja pestiin peräk käin, 1 000 ml:a kutakin, 1 M NaCl:lla, 0,1 M Tris-- HCl:lla (pH 8,1), joka sisälsi 1 M NaCl:a, 0,05 M for- 35 maattiesterillä (pH 3,1), tislatulla vedellä ja 10 891 09 0,5 M natriumasetaatilla (pH 5,7), jolloin saatiin Sepharose-geeli, johon on kytketty hyaluronihappoa.

Biotiini-hyaluronihappoa sitova proteiini -kompleksin valmistus 5 Hyaluronihappoa sitova proteiini kytkettiin biotiiniin käyttäen seuraavia menetelmiä esivaiheena merkkiaine P0D:hen kytkemiselle.

Yhteen milligramaan liuosta, joka sisälsi hyaluronihappoa sitovaa proteiinia 1 ml:ssa NaHCO^a lisättiin 10 biotiini-0-Su:ta (saatu PIERCE Chemical Company -yhtiöstä) määrä 1 mg 1 ml:ssa dimetyylisulfoksidia ja seosta pidettiin huoneenlämpötilassa 4 tuntia.

Liuos ajettiin Sephadex G 25 -geelillä pakatun pylvään läpi (pylväät PD-10), joka oli tasapainotettu 15 10 mM natriumfosfaattipuskuriliuoksella (pH 7,4), joka sisälsi 0,1 % NaN^ ja 0,9 % NaClsa (tästä liuoksesta käytetään tässä myöhempänä nimitystä PBS).

Proteiinifraktiot otettiin talteen, sekoitettiin 1,53 g:n guanidiinihydrokloridin kanssa ja laitettiin 20 suspensioon, joka sisälsi hyaluronihapolla konjugoitua Sepharose-geeliä, joka oli valmistettu sekoittamalla hyaluronihapolla konjugoitua Sepharose-geeliä (10 ml:n märkätilavuus) 40 ml:aan puskuriliuosta (25 mM natrium-fosfaattia, joka sisälsi 1,5 M NaCl:a, pH 7,0), joka 25 sisälsi 0,1 % BSA:ta (tästä puskuriliuoksesta käytetään tässä myöhempänä nimitystä puskuriliuos B). Geelisus-pensiota pidettiin yli yön 4 °C:ssa.

Koko suspensiotilavuus pakattiin pylvääseen ja pylväs pestiin peräkkäin 250 ml :11a puskuriliuos B:tä, 30 250 ml:11a puskuriliuos B:tä, joka sisälsi proteaasi- inhibiittoria (EDTA:n, trypsiini-inhibiittorin, fenyy-limetyylisulfonyylifluoridin, jodiasetaatin, t-amino-kapronihapon, bentsamidiinin ja pepstatiinin seos), ja 3 M NaCl-liuoksella. Tämän jälkeen adsorboitunut aine 35 eluoitiin puskuriliuos A:lla ja otettiin talteen.

li n 89109

Talteen otettua adsorboitunutta ainetta konsentroitiin niin kauan, että saatiin vähintään 0,2:n ultra-violettivaloabsorbanssi (280 nm).

Konsentraatti jaettiin pulloihin ja säilytettiin 5 jäädytettynä biotiini-hyaluronihappoa sitova proteiini-kompleksin sisältävien reagenssien valmistamiseksi,

Suurimolekyylipainoisen hyaluronihapon määritys 50 mikrolitraa puhdistetun hyaluronihappoa sitovan proteiinin NaHCO^-liosta pitoisuutena 20 pg/ml 10 päällystettiin tasaisesti Falcon-levylle (Becton Dikinson) ja säilytettiin yli yön 4 °C:ssa.

Hyaluronihappoa sitovalla proteiinilla päällystetyn Falcon-levyn pinta päällystettiin sitoutumista estävällä aineella, joka lisättiin 0,5 % naudan γ-globu-15 liinina liuoksessa. Sitten levyä pidettiin huoneenlämpö-tilassa kahden tunnin ajan.

Kun levy oli pesty kolmesti 0,85 M NaCl-liuoksel-la, joka sisälsi 0,05 Tween 20:tä, 50 pl vakionäytettä, joka oli laimennos 1:11 10 ng/ml suurimolekyylipainoista 20 hyaluronihappoa sisältävästä seerumista, lisättiin levylle ja levyä pidettiin huoneenlämpötilassa kahden tunnin ajan. Varmistettiin että voitiin saada yhtä hyvät tulokset lisäämällä hyaluronihapponäyte käyttäen sitoutumista estävän aineen liuosta seerumin sijasta.

25 Levy pestiin tämän jälkeen 0,85 M NaCl-liuoksel- ' " la, joka sisälsi 0,05 % Tween 20:tä ja aikaisemmin val mistettua biotiini-hyaluronihappoa sitova proteiini -kompleksia (laimennettuna 1:300 0,5 % naudan y-globuliini-liuoksella, joka toimi sitoutumista estävänä aineena) :Y: 30 lisättiin ylimäärä hyaluronihappoon nähden. Sitten levyä pidettiin huoneenlämpötilassa kahden tunnin ajan.

Tämän jälkeen levy pestiin kolmesti 0,85 M NaCl-liuoksella, joka sisälsi 0,05 % Tween 20:tä, ja avidiini-POD (VEDTOR) laimennettuna 1 :3 000 0,5 % naudan y-globu-35 liiniliuoksella, joka toimi sotoutumista estävänä ainee- 12 891 09 na, lisättiin. Sitten levyä pidettiin huoneenlämpötilassa 45 minuutin ajan.

Levy pestiin kolmesti 0,85 % NaCl-liuoksella, joka sisälsi 0,05 % Tween 20:tä, ja 100 pl liuosta, joka 5 sisälsi 2 mg/ml ortofenyleenidiamiinia (Nakarai Kagaku Co. Ltd.; joka sisälsi 0,015 % 0,018 M sitruuna- happoa, 0,064 M natriumvetyfosfaattia ja 0,1 % salisyylihappoa) lisättiin. Sitten levyä pidettiin huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan. Tämän jälkeen ortofeny-10 leenidiamiinin hajoaminen pysäytettiin lisäämällä 8 N H2S04:a kaksi pisaraa.

Ortofenyleenidiamiinin hajoamisen tuloksena saadun värillisen reaktioliuoksen absorbanssi aallonpituudella 492 nm määritettiin spektrofotometrillä.

15 Muut näytteet valmistettiin yllä kuvattuja mene telmiä käyttäen, jolloin saatiin hyaluronihappovakiot, joiden pitoisuudet olivat 50, 100, 500 ja 1 000 ng/ml. Ortofenyleenidiamiinin hajoamisesta syntyneen värin absorbanssi aallonpituudella 492 nm mitattiin spektro-20 fotometrillä. Tulokset on esitetty kuviossa 1, josta voidaan nähdä, että tämän keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan todeta ja kvantitoida suurimolekyylipai-noinen hyaluronihappo 10 ng:n luokkaa olevaan pitoisuuteen asti.

25 Jos halutaan mitata suurimolekyylipainoisen hya- luronihapon pitoisuus veressä tulehdusten, kuten reumatismin, tai tautien, kuten syövän diagnostisoimiseksi, on sopivaa käyttää reagenssipakkausta, joka muodostuu leimatusta hyaluronihappoa sitovasta proteiinista, kiin-30 teään faasiin adsorboidusta hyaluronihappoa sitovasta proteiinista ja vakionäytteestä, joka sisältää suuri-molekyylipainoista hyaluronihappoa, jotka kaikki nämä reagenssit on valmistettu tässä aikaisemmin kuvattuja menetelmiä käyttäen.

Il is 89109

Kuten edellä olevan kuvauksen perusteella ymmärretään, tämän keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan selektiivisesti määrittää suurimolekyylipainoinen hya-luronihappo ilman, että saadaan vaste ei-toivotulle 5 pienimolekyylipainoiselle hyaluronihappolajille. Koska tämä menetelmä ei ole riippuvainen kompetetiivisesta reaktiosta hyaluronihapon määrittämiseksi, siinä ei tarvita puhdistetussa muodossa olevaa hyaluronihappoa reagenssina ja se sallii niin pienien kuin 10 ng:n mää-10 rien suurimolekyylipainoista hyaluronihappoa toteamisen tai kvantitoimisen erittäin yksinkertaisella toimenpiteellä .

Näiden piirteiden takia tämän keksinnön mukainen määritysmenetelmä on erittäin arvokas kliinisissä sovel-15 lutuksissa ja sitä voidaan käyttää tehokkaasti tulehdusten, kuten reumatismin, tai tautien, kuten syövän, diagnostisoinnissa.

Claims (8)

14 891 09 Patentt ivaat imukset

1. Menetelmä suurimolekyylipainoisen hyaluroni-hapon selektiiviseksi määrittämiseksi spesifisellä sitou- 5 tumisanalyysillä suurella herkkyydellä, jolloin mielenkiinnon kohteena olevalla hyaluronihapolla on ainakin kaksi paikkaa hyaluronihappoa sitovaan proteiiniin kytkeytymistä varten, tunnettu siitä, että mainittu proteiini adsorboidaan kiinteään faasiin, jossa kiinteän 10 faasin pinta, johon hyaluronihappoa sitova proteiini adsorboitiin, käsitellään tämän jälkeen sitoutumista estävällä aineella siten, että kiinteän faasin pinta, johon hyaluronihappoa sitovaa proteiinia ei ole adsorboitunut, päällystetään situotumista estävällä aineella, lisätään 15 mielenkiinnon kohteena olevaa hyaluronihappoa sisältävä näyte sitoutumista varten proteiniin, joka on adsorboitunut kiinteään faasiin, lisätään edelleen joko hyaluronihappoa sitova proteiini ja merkkiaine tai merkkiaineella leimattu hyaluronihappoa sitova proteiini, jolloin muo-20 dostetaan sandvrichrakenteinen kompleksi, jossa mielenkiinnon kohteena oleva hyaluronihappo on kiinteään faasiin adsorboidun proteiinin ja merkkiaineella leimatun proteiinin välissä, sekä mitataan mielenkiinnon kohteena olevan hyaluronihapon määrä kompleksissa olevan merkkiaineen 25 perusteella, jolloin hyaluronihappoa sitova proteiini on proteoglykaani, yhdysproteiini tai hyalurononektiini.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiinteä faasi on levy, putki, helmi, kalvo tai geeli.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että merkkiaine on isotooppi, fluorokromi, avidiini, biotiini, kerniluminesoiva aine tai entsyymi.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että sitoutumista estävä aine on li is 89109 γ- globuliini, seerumin albumiini tai seerumi.

5. Reagenssipakkaus patenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän suorittamiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää konstituenttielementteinä leimatun hyaluro- 5 nihappoa sitovan proteiinin tai hyaluronihappoa sitovan proteiinin ja merkkiaineen, kiinteään faasiin adsorboidun hyaluronihappoa sitovan proteiinin ja standardinäytteen, joka sisältää suurimolekyylipainoisen hyaluronihapon, jossa on ainakin kaksi paikkaa hyaluronihappoa sitovaan 10 proteiiniin kytkeytymistä varten, jossa kiinteän faasin pinta, johon hyaluronihappoa sitova proteiini on adsorboitu, on tämän jälkeen käsitelty sitoutumista estävällä aineella siten, että kiinteän faasin pinta, johon hyaluronihappoa sitovaa proteiinia ei ole adsorboitunut, on 15 päällystetty sitoutumista estävällä aineella, jolloin hyaluronihappoa sitova proteiini on proteoglykaani, yh-dysproteiini tai hyalurononektiini.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että kiinteä faasi on le- 20 vy, putki, helmi, kalvo tai geeli.

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että merkkiaine on isotooppi, fluorokromi, avidiini, biotiini, kemiluminesoiva aine tai entsyymi.

8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen reagenssipak kaus, tunnettu siitä, että sitoutumista estävä aine on γ- globuliini, seerumin albumiini tai seerumi. ie 89109