NO173355B - Fremgangsmaate og selektiv bestemmelse av en hoeymolekylvekts hyaluronsyre og reagenssett for utfoerelse av fremgangsmaaten - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for selektiv bestemmelse av en høymolekylvekts hyaluronsyre ved hjelp av en spesifikk bindingsanalyse med høy følsomhet, idet hyaluronsyren av interesse har minst to seter for kobling til et hyaluronsyrebindende protein, og det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at proteinet adsorberes på en fast fase, hvor overflaten av den faste fase hvorpå det hyaluronsyrebindende protein ble adsorbert deretter ble vasket med en blokkerende substans på en slik måte at det areal av den nevnte faste fase hvorpå det hyaluronsyrebindende protein ikke ble adsorbert, dekkes med den nevnte blokkerende substans, en prøve inneholdende hyaluronsyren av interesse tilsettes for binding til proteinet adsorbert på den faste fase, videre tilsettes enten et hyaluronsyrebindende protein og en markør eller et hyaluronsyrebindende protein merket med en markør, slik at det dannes et kompleks med sandwichstruktur hvori hyaluronsyren av interesse holdes mellom proteinet adsorbert på den faste fase og proteinet merket med en markør, og mengden av hyaluronsyre av interesse måles på basis av markøren i det nevnte kompleks, idet det hyaluronsyrebindende protein er valgt fra gruppen omfattende proteoglycan, linkproteiner og hyaluronektin.

Oppfinnelsen vedrører også et reagenssett for utførelse av den ovennevnte fremgangsmåte, og det særegne ved reagens-settet i henhold til oppfinnelsen er at det som bestanddels-elementer omfatter et merket hyaluronsyrebindende protein eller et hyaluronsyrebindende protein og en markør, et hyaluronsyrebindende protein adsorbert på en fast fase, og en standardprøve inneholdende en høymolekylvekts hyaluronsyre, idet hyaluronsyren i den nevnte standardprøve har minst to seter for kobling til det hyaluronsyrebindende protein, hvor overflaten av den faste fase hvorpå det hyaluronsyrebindende protein er adsorbert deretter er blitt behandlet med en blokkerende substans på en slik måte at arealet av denfaste fase hvorpå det hyaluronsyrebindende protein ikke er adsorbert er blitt dekket med den nevnte blokkerende substans, idet det hyaluronsyrebindende protein er valgt fra gruppen omfattende proteoglycan, linkproteiner og hyaluronektin.

Disse trekk ved oppfinnelsen fremgår av patentkravene.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for assaybestemmelse av hyaluronsyre som er tilstede i løst bindevev som f.eks. synovial væske (leddvæske) i leddhulrommene. Oppfinnelsen vedrører også et reagenssett for assaybestemmelse av hyaluronsyre. Mer spesielt vedrører den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte som muliggjør meget følsom assaybestemmelse av en hyaluronsyre med høy molekylvekt, såvel som et reagenssett for å gjennomføre en slik analyse.

Hyaluronsyre, som er et surt mucopolysakkarid sammensatt av vekselvise polymerisatledd av et acetylglucosamin og glucuronsyre ved hjelp av 3-1,4 binding, tjener til å binde sammen subkutane vev og finnes i navlestrengen, i synovial-væsken, i leddhulrommene og i den krystallinske linse i øyet.

Det har vært kjent at blodinnholdet av hyaluronsyre øker i pasienter som lider av inflammasjoner som f.eks. reumatisme eller fra sykdommer som f.eks. cancer. Derfor har kvantitativ bestemmelse av hyaluronsyre i blodet potensiell anvendelse ved kliniske anvendelser for å bedømme utviklingen av inflammasjoner eller en pasients fremskritt i å komme seg etter kirurgiske operasjoner, eller for diagnose av sykdommer som f.eks. cancer.

Kvantitativ bestemmelse av hyaluronsyre er konvensjonelt

blitt gjennomført ved hjelp av radioanalyser under anvendelse av hyaluronsyrebindende proteiner merket med radioaktivt jod eller immunoenzymoanalyser under anvendelse av hyaluronectin. Ved radioanalyser blir en fast fase som f.eks. "Sepharose" koblet til hyaluronsyre blandet med en prøve inneholdende hyaluronsyre som skal analyseres og blandingen får stå etter

tilsetning av et hyaluronsyrebindende protein merket med radioaktivt jod. Ved denne metode blir bindingen av "Sepharose"-koblet hyaluronsyre til det radiomerkede hyaluronsyrebindende protein inhibert i en grad som avhenger av konsentrasjonen av hyaluronsyre i prøven. Konsentrasjonen av hyaluronsyren i prøven kan bestemmes indirekte ved å måle mengden av radiomerket hyaluronsyrebindende protein.

Både radioanalyser og immunoenzymoanalyser anvender en konkurrerende reaksjon og følsomheten av analysen av hyaluronsyre er ikke tilfredsstillende høy, d.v.s. høyst 40 mg. De konvensjonelle metoder har også den ulempe at endog en hyaluronsyre med en lav molekylvekt som har bare ett sete for binding til hyaluronsyrebindende proteiner eller hyaluronectin kan delta i konkurransereaksjonen. Med andre ord blir ikke bare hyaluronsyren med høy molekylvekt av interesse analysert, men også den fysiologisk uviktige hyaluronsyre med lav molekylvekt. Dette frembyr et alvorlig problem ved diagnose av inflammasjoner som f.eks. reumatisme hvor hyaluronsyre med en forholdsvis høy molekylvekt er den substans som skal måles. Det har derfor vært et sterkt ønske om å utvikle en fremgangsmåte som er ufølsom for hyaluronsyre med lav molekylvekt og som allikevel er istand til å gi en mer følsom analyse av hyaluronsyre med høy molekylvekt enn tidligere kjente metoder.

Det er derfor et formål for den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte og et reagenssett som er i stand til selektiv og meget følsom analyse av hyaluronsyre med høy molekylvekt uten å være avhengig av en konkurransereaksjon og uten å reagere på noen av de uønskede hyaluronsyrer med lav molekylvekt.

For å oppnå disse formål ble det i oppfinnelsens sammenheng gjennomført intensive undersøkelser og bemerket det forhold at en fysiologisk viktig hyaluronsyre med høy molekylvekt har minst to seter for kobling med et hyaluronsyrebindende protein. På basis av dette funn ble det tildannet et kompleks med sandwich-struktur hvor et hyaluronsyrebindende protein ble koblet ved to eller flere seter til en hyaluronsyre med en tilstrekkelig høy molekylvekt slik at det ble tillatt kobling med det hyaluronsyrehindrende protein ved to eller flere seter (denne hyaluronsyre er i det følgende omtalt som "hyaluronsyre med høy molekylvekt"), og konsentrasjonen av det således dannede kompleks med sandwich-struktur ble målt. Denne metode ble funnet å være istand til å bestemme konsentrasjonen av hyaluronsyren med høy molekylvekt av interesse og med høy følsomhet.

Fig. 1 er en grafisk fremstilling som viser forholdet mellom absorpsjon og konsentrasjon av hyaluronsyre med høy molekylvekt oppnådd ved analysemetoden i samsvar med oppfinnelsen.

Analysemetoden i samsvar med oppfinnelsen begynner med adsorpsjon av et hyaluronsyrebindende protein på overflaten av en fast fase. Den faste fase har fremdeles seter tilbake på sin overflate som er istand til kobling med det hyaluronsyrebindende protein eller andre molekylspesies, slik at ved tilsetning av en prøve som skal analyseres kan hyaluronsyren med høy molekylvekt av interesse i prøven og andre blod-komponenter bindes til disse seter. Det er derfor viktig at før tilsetningen av prøven, tilsettes det en blokkerende substans slik at alle deler av den faste fase hvorpå det hyaluronsyrebindende protein ikke er blitt absorbert blir dekket. Eksempelvise blokkerende substanser som kan anvendes er gammaglobulin, serumalbumin og serum ekstrahert fra kuer og andre dyr. Bovint gammaglobulin er fordelaktig når en Falcon-"plate" anvendes som fast fase.

I det neste trinn blir prøven inneholdende en hyaluronsyre med høy molekylvekt av interesse tilsatt til den faste fase hvorpå det hyaluronsyrebindende protein er blitt absorbert. Prøven som tilsettes behøver ikke være hyaluronsyren med høy molekylvekt i en form isolert ved ekstraksjon. En human blodprøve eller en human kroppsvæskeprøve kan anvendes som den tas fra humankroppen. Om ønsket kan prøven oppløses i en oppløsning av en blokkerende substans eller fortynningsserum før den tilsettes den faste fase hvorpå det hyaluronsyrebindende protein er blitt absorbert.

Etter kobling av hyaluronsyren med høy molekylvekt til det hyaluronsyrebindende protein adsorbert på den faste fase, blir overflaten av den faste fase foretrukket vasket.

Ved det tredje trinn i fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen tilsettes et hyaluronsyrebindende protein merket med en bestemt markør til den faste fase hvortil hyaluronsyren med høy molekylvekt er blitt koblet. Egnede markører inkluderer isotoper, fluorokromer, avidin, biotin, kjemo-luminiscente substanser og enzymer. Hvilke som helst andre markører som vanligvis anvendes for merking av høymolekyle-vekt-materialer kan anvendes uten begrensning.

Alternativt blir en proteinholdig substans som lett binder til en markør på forhånd koblet til det hyaluronsyrebindende protein, som deretter tilsettes til den faste fase (hvortil hyaluronsyren med høy molekylvekt er blitt koblet) sammen med en passende markør.

Ved tilsetning av det hyaluronsyrebindende protein i det tredje trinn, dannes et kompleks med sandwich-struktur hvori hyaluronsyren med høy molekylvekt holdes mellom det hyaluronsyrebindende protein absorbert på den faste fase og det merkede eller lett merkbare hyaluronsyrebindende protein.

I det fjerde trinn av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen måles innholdet av markør i komplekset med sandwich-struktur for å kvantifisere hyaluronsyren med høy molekylvekt av interesse. Komplekset med sandwich-struktur har hyaluronsyren med høy molekylvekt av høy interesse innlemmet deri men ingen av hyaluronsyrene med lav molekylvekt og som ikke skulle analyseres ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er istand til å danne en sandwich-struktur av den ovenfor beskrevne art. Derfor, ved måling av konsentrasjonen av markøren på overflaten av den faste fase, blir bare hyaluronsyren med høy molekylvekt som er istand til å danne den tilsiktede sandwich-struktur kvantifisert.

Fremgangsmåten for å måle konsentrasjonen av markøren avhenger av type av markør og hvis denne er en kjemoluminis-cent substans kan absorpsjonene av oppløsningen som er blitt underkastet reaksjon med denne substans måles.

Ved utøvelsen av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er det fordelaktig å fremstille prøver inneholdende kjente konsentrasjoner av en markør og en hyaluronsyre med høy molekylvekt av interesse og å konstruere kalibreringskurver for forholdet mellom signalintensitet og de kjente konsentrasjoner slik at målte verdier kan korrigeres mot disse kalibreringskurver.

Eksempler på fast fase som kan anvendes ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen inkluderer plater, rør, kuler, membraner og geler. Det skal imidlertid bemerkes at disse ikke er de eneste eksempler og en hvilken som helst annen fast fase hvorpå det hyaluronsyrebindende protein kan absorberes er brukelig.

Det hyaluronsyrebindende protein som anvendes ved oppfinnelsen inkluderer proteoglycan som renset av A.E. Laurent et al. (se Analytical Biochemistry, 109, 386 - 394 (1980)), link protein og hyaluronektin/

Den substans som skal analyseres ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er en hyaluronsyre med forholdsvis høy molekylvekt og som antas å være en viktig faktor for diagnose av inflammasjoner som f.eks. reumatisme og sykdommer som f.eks. cancer, og det er nødvendig å hindre måling av hyaluronsyrer med lav molekylvekt som er utenfor rammen for analysen i' henhold til oppfinnelsen.

Ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen blir hyaluronsyren med høy molekylvekt av interesse kvantifisert som et kompleks med sandwich-struktur hvori et hyaluronsyrebindende protein er koblet til den nevnte hyaluronsyre ved to eller flere seter. Derfor er hyaluronsyrene med lav molekylvekt som bare har ett sete for binding til det hyaluronsyrebindende protein ikke istand til å danne et kompleks med sandwich-struktur av den art som er beskrevet i det foregående og er således ufølsomme for analysen ved fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse.

De tidligere kjente metoder for analyse av hyaluronsyre berodde på en konkurransereaksjon mens fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen ikke beror på et slikt prinsipp. Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen har følgelig den fordel at den ikke krever bruk av en hyaluronsyre som et på forhånd renset reagens og at den kan gjennomføres med stor letthet.

Analysemetoden i samsvar med oppfinnelsen har en slik høy følsomhet at den kan påvise og kvantifisere en hyaluronsyre med høy molekylvekt selv om denne er tilstede i en spormengde så liten som 10 ng.

Det følgende eksempel skal illustrere oppfinnelsen.

Den følgende beskrivelse består av to deler, den første del vedrørende fremgangsmåten for fremstilling av et renset hyaluronsyrebindende protein som skal anvendes ved analysen i samsvar med oppfinnelsen, og den annen del beskriver konstruksjon av kalibreringskurver ved utøvelse av analysen i samsvar med oppfinnelsen under anvendelse av prøver inneholdende kjente konsentrasjoner av hyaluronsyre med høy molekylvekt.

I den etterfølgende beskrivelse betegner M mol/L og % betegner g/10 0 ml.

Rensing av hyaluronsyrebindende protein:

For å ekstrahere og rense et hyaluronsyrebindende protein for anvendelse ved den foreliggende oppfinnelse ble følgende prosedyrer gjennomført i samsvar med metoden til A.E. Laurent et al. beskrevet i Analytical Biochemistry 109, 386 - 394 (1980).

Bovin nasal brusk (3 00 g: oppnådd fra Tokyo Shibaura Zoki Co., Ltd.) ble kuttet opp i små stykker med saks, neddynket i 0,5 natriumacetatoppløsning (pH 5,8) inneholdende 4 M guanidinhydroklorid (Wako Pure Industries Ltd.) og som ble holdt ved 4°C (denne oppløsning omtales i det følgende som bufferoppløsning A), og ekstrahert under omrøring over natten ved 4°C.

Etter sentrifugering i 20 minutter ved 13.000 g ble sub-ernatanten separert, dalysert mot destillert vann og fryse-tørket. Faststoffene ble knust og gav et rått ekstraktpulver.

Det rå ekstraktpulver ble behandlet med trypsin ved hjelp av følgende prosedyrer. Det rå ekstraktpulver (1.600 mg) og 0,8 mg trypsin (Sigma) ble oppløst i 25 ml av en 0,1 M Tris-HCl buffer oppløsning (pH 7,3) inneholdende 0,1 M natriumacetat og oppløsningen ble holdt ved 37°C i to timer. Etter tilsetning av 1 mg soyabønnetrypsininhibitor (Sigma) og 19,1 guanidin hydroklorid, ble 0,5 M natriumacetatoppløsning tilsatt til et totalt volum på 50 ml.

Oppløsningen inneholdende det trypsinbehandlede hyaluronsyrebindende protein ble underkastet affinitetskromatogra-fering for fremstilling av et renset hyaluronsyrebindende protein ved hjelp av følgende prosedyrer. 50 ml av oppløsningen inneholdende det trypsinbehandlede hyaluronsyrebindende protein ble blandet med 5 0 ml av en separat fremstillt hyaluronsyrekoblet "Sepharose" (for fremgangsmåten for dens fremstilling, se det etterfølgende) og blandingen ble øyeblikkelig anbrakt i en dialysemembran etterfulgt av dialyse mot 9 volum destillert vann natten over ved 4°C. Etter dialyse ble hele volumet av gelen fyllt i en kolonne med indre diameter 3,2 cm. Kolonnen ble vasket med en 1 M natriumkloridoppløsning for å fjerne uabsorbert substans.

Uønsket protein ble fjernet ved påfølgende vaskinger med 1 M til 3 M natriumklorid og adsorbatet ble utvunnet ved eluering med buffer oppløsning A.

De oppnådde fraksjoner ble konsentrert med "DIAFLO PM 10"(Amicon) til et totalt volum på 4 ml og ført gjennom en "Sepharose" 6B kolonne (3,1 cm<®> x 43 cm). Fraksjonene som viste andre og tredje topper ble isolert, etterfulgt av separering og konsentrering med "DIAFLO PM-10" for fremstilling av reagenser av hyaluronsyrebindende proteiner.

Fremstilling av hyaluronsyrekoblet-"Sepharose" .

Et vannoppløselig karbodiimid (1,4 g) ble tilsatt til en blanding av 600 mg natriumhyaluronat (Seikagaku Fine Biochemicals), 7 5 ml "AH-Sepharose" (Pharmacia Fine Chemicals) og 200 ml destillert vann, og blandingen fikk så stå ved romstemperatur i 24 timer. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetning av 10 ml eddiksyre. Den resulterende gel ble isolert og vasket i rekkefølge med 1000 ml av hver av 1 M NaCl,0,l M Tris HC1 (pH 8,1) inneholdende 1 M NaCl,

0,05 M formiatester (pH 3,1), destillert vann og 0,5 M natriumacetat (pH 5,7) og førte til en hyaluronsyrebundet "Sepharose".

Fremstilling av biotin-hyaluronsyrebindende kompleks.

Det hyaluronsyrebindende protein ble koblet til biotin ved hjelp av følgende prosedyrer som et forutgående trinn for kobling med en POD markør.

Til 1 mg av en oppløsning av et hyaluronsyrebindende protein i 1 ml NaHCC>3 ble biotin-O-Su (oppnådd fra Pierce Chemical Company) tilsatt i en mengde på 1 mg i 1 ml dimetylsulfoksyd og blandingen ble lagret ved romtemperatur i 24 timer.

Oppløsningen ble ført gjennom "Sephandex G 25" fyllt i en kolonne (kolonner PD-10) som var ekvilibrert med en 10 mm natriumfosfat bufferoppløsning (pH 7,4) inneholdende 0,1 % NaN3 og 0,9 % NaCl (denne oppløsning benevnes i det følgende PBS).

Proteinfraksjonene ble isolert, blandet med 1,53 g guanidinhydroklorid og innført i en suspensjon av hyaluronsyre-koblende "Sepharose"-gel som var blitt fremstillt ved blanding av en hyaluronsyrekoblet "Sepharose"-gel (10 ml fuktig volum) med 40 ml av en bufferoppløsning (25 mm natriumfosfat inneholdende 1,5 M NaCl; pH 7,0) inneholdende 0,1 % BSA (denne bufferoppløsning betegnes i det følgende som bufferoppløsning B). Gelsupensjonen ble lagret over natten ved 4°C.

Hele volumet av suspensjonen ble innfylt i en kolonne og kolonnen ble i rekkefølge vasket med 250 ml bufferoppløsning B, 25 0 ml bufferoppløsning B inneholdende en protease-inhibitor (en blanding av EDTA, trypsininhibitor, fenyl-metylsulfonylfluorid, jodacetat, E-aminokapronsyre, benz-amidin og pepstatin), og 3 M NaCl oppløsning. Deretter ble adsorbatet eluert med bufferoppløsning A og isolert.

Det gjenvunnene adsorbat ble konsentrert i en slik grad at det ble oppnådd en UV-absorpsjon (280 nm) på minst 0,2.

Konsentratet ble fordelt i prøveglass og lagret i frosset tilstand for fremstilling av reagenser av biotin-hyaluronsyrekoblet proteinkompleks.

Analyse av hyaluronsyre med høy molekylvekt.

Femti mikroliter av en NaHCC>3 oppløsning av det rensede hyaluronsyrebindende protein med en konsentrasjon på 20 g/ml ble jevnt belagt på en Falcon-plate (Becton Dickin-son) og lagret over natten ved 4°C.

Overflaten av Falcon-platen som var blitt belagt med det hyaluronsyrebindende protein ble dekket med en blokkerende substans som ble tilsatt i form av 0,5 % bovint gammaglobulin i oppløsning. Platen ble så lagret i romtemperatur i 2 timer.

Etter vasking av platen 3 ganger med en 0,85 M NaCl opp-løsning inneholdende 0,05 % "Tween 20", 50 1 av en standard prøve som var en 1:11 oppløsning av serum inneholdende 10

ng/ml hyaluronsyre med høy molekylvekt ble tilsatt til platen og lagret ved romtemperatur i 2 timer. Det ble bekreftet at like gode resultater kunne oppnås ved å tilsette en prøve av hyaluronsyre under anvendelse av en oppløsning av blokkerende material i stedet for serum.

Platen ble deretter vasket 3 ganger med 0,85 M NaCl opp-løsning inneholdende 0,05 % "Tween 20" og det tidligere fremstillte biotin hyaluronsyrebindende proteinkompleks (fortynnet til 1:300 med oppløsning av 0,5 % bovint gammaglobulin som et blokkerende material) ble tilsatt i en overskuddsmengde over hyaluronsyrepunktet. Platen ble lagret ved romtemperatur i 2 timer.

Platen ble deretter vasket 3 ganger med en 0,85 M NaCl oppløsning inneholdende 0,05 % "Tween 20" og avidin POD (Vector) fortynnet 1:3000 med oppløsningen med 0,5 % bovint gammaglobulin som et blokkerende material ble tilsatt. Platen ble så lagret ved romtemperatur i 45 minutter.

Platen ble vasket 3 ganger med en 0,85 M NaCl oppløsning inneholdende 0,05 % "Tween 20" og 100 1 av oppløsning av 2 mg/ml orto-fenylendiamin (Nakarai Kagaku Co., Ltd. og inneholdende 0,015 H2C>2, 0,018 M sitronsyre, 0,064 M natrium hydrogenfosfat og 0,1 % salisylsyre) ble tilsatt. Platen ble så lagret ved romtemperatur i 30 minutter. Deretter ble spaltingen av orto-fenylendiaminet avsluttet ved tilsetning av 8 N H2SO4 i form av 2 dråper.

Reaksjonsoppløsningen farget ved spaltningen av orto-fenylendiaminet ble analysert for absorpsjon ved 492 nm med et spektrofotometer.

Ytterligere prøver ble fremstillt ved prosedyrene beskrevet i det foregående for standard hyaluronsyrekonsentrasjoner på 50, 100, 500 og 1000 ng/ml. Absorpsjon ved 492 nm av fargen fremstillt ved spaltning med orto-fenylendiamin ble målt ved et spektrofotometer. Resultatene er vist i Fig. 1, hvorfra man kan se at analysemetoden i samsvar med oppfinnelsen kan påvise og kvantifisere en hyaluronsyre med høy molekylvekt ned til en grense på omkring 10 ng.

Hvis man vil måle blodinnholdet av en hyaluronsyre med høy molekylvekt for diagnose av inflammasjoner som f.eks. reumatisme eller sykdommer som f.eks. cancer, er det fordelaktig å anvende et reagenssett bestående av et merket hyaluronsyrebindende protein, et fast faseadsorbert hyaluronsyrebindende protein, og en standard prøve inneholdende en hyaluronsyre med høy molekylvekt, idet samtlige av disse reagenser fremstilles ved hjelp av prosedyrene beskrevet i det foregående.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan selektivt analysere en hyaluronsyre med høy molekylvekt uten å reagere på uønskede lavmolekylære spesies. Ettersom denne metode ikke avhenger av en konkurransereaksjon for analyse av hyaluronsyre, trenger den ikke en renset form for hyaluronsyre som et reagens og tillater at så lite som 10 ng av en hyaluronsyre med høy molekylvekt kan påvises eller kvantifiseres ved hjelp av en meget enkel operasjon.

På grunn av disse trekk er fremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen av stor verdi ved kliniske anvendelser og kan effektivt anvendes ved diagnose av inflammasjoner som f.eks. reumatisme eller sykdommer som cancer.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for selektiv bestemmelse av en høymolekyl-vekts hyaluronsyre ved hjelp av en spesifikk bindingsanalyse med høy følsomhet, idet hyaluronsyren av interesse har minst to seter for kobling til et hyaluronsyrebindende protein, karakterisert ved at proteinet adsorberes på en fast fase, hvor overflaten av den faste fase hvorpå det hyaluronsyrebindende protein ble adsorbert deretter ble vasket med en blokkerende substans på en slik måte at det areal av den nevnte faste fase hvorpå det hyaluronsyrebindende protein ikke ble adsorbert, dekkes med den nevnte blokkerende substans, en prøve inneholdende hyaluronsyren av interesse tilsettes for binding til proteinet adsorbert på den faste fase, videre tilsettes enten et hyaluronsyrebindende protein og en markør eller et hyaluronsyrebindende protein merket med en markør, slik at det dannes et kompleks med sandwichstruktur hvori hyaluronsyren av interesse holdes mellom proteinet adsorbert på den faste fase og proteinet merket med en markør, og mengden av hyaluronsyre av interesse måles på basis av markøren i det nevnte kompleks, idet det hyaluronsyrebindende protein er valgt fra gruppen omfattende proteoglycan, linkproteiner og hyaluronektin.

2. Reagenssett for utførelse av den fremgangsmåte som er angitt i krav 1, karakterisert ved at det som bestanddels-elementer omfatter et merket hyaluronsyrebindende protein eller et hyaluronsyrebindende protein og en markør, et hyaluronsyrebindende protein adsorbert på en fast fase, og en standardprøve inneholdende en høymolekylvekts hyaluronsyre, idet hyaluronsyren i den nevnte standardprøve har minst to seter for kobling til det hyaluronsyrebindende protein, hvor overflaten av den faste fase hvorpå det hyaluronsyrebindende protein er adsorbert deretter er blitt behandlet med en blokkerende substans på en slik måte at arealet av denfaste fase hvorpå det hyaluronsyrebindende protein ikke er adsorbert er blitt dekket med den nevnte blokkerende substans, idet det hyaluronsyrebindende protein er valgt fra gruppen omfattende proteoglycan, linkproteiner og hyaluronektin.