DK172249B1 - Fremgangsmåde til påvisning af højmolekylær hyaluronsyre samt reagenssæt til udøvelse af fremgangsmåden - Google Patents

Description

DK 172249 B1 i

Opfindelsen angår en særlig fremgangsmåde til selektiv analyse for højmolekylær hyaluronsyre med mindst to bindingssteder for et hyaluronsyrebindende protein. Opfindelsen angår endvidere et sæt af reagenser 5 til analyse for en højmolekylær hyaluronsyre med mindst to bindingssteder for et hyaluronsyrebindende protein.

Hyaluronsyre, der er et surt mucopolysaccharid, opbygget ved skiftende polymerisering af N-acetylgluco-samin og glucuronsyre ved β-l,4-bindinger tjener til 10 sammenbinding af subkutant væv og findes i navlestrenge, i synovial væske, i leddenes hulrum og i glaslinsen i øjet.

Man ved, at niveauet af hyaluronsyre i blodet vokser hos patienter, der lider af inflammationer, såsom 15 rheumatisme eller af sygdomme, såsom cancer. Derfor vil en kvantitativ bestemmelse af hyaluronsyre i blodet have kliniske muligheder med henblik på bestemmelse af udviklingen af inflammationer eller en patients helbredelse efter operationer eller ved diagnose af sygdomme, såsom 20 cancer.

Kvantitativ bestemmelse af hyaluronsyre er ved kendt teknik blevet udført ved radioassays under anvendelse af hyaluronsyrebindende proteiner, mærket med radioaktivt jod, eller ved immunenzymassays under anven-25 delse af hyaluronectin. Ved radioassays blander man en fast fase, såsom Sepharose® koblet til hyaluronsyre, med en prøve, der indeholder hyaluronsyre til undersøgelse, og man lader blandingen henstå efter tilsætning af et hyaluronsyrebindende protein mærket med aktivt iod. ved 30 denne fremgangsmåde inhiberes bindingen af Sepharose®-koblet hyaluronsyre til det radiomærkede hyaluronsyrebindende protein i en grad, der afhænger af koncentrationen af hyaluronsyre i prøven. Man kan så indirekte bestemme koncentrationen af hyaluronsyre i prøven, idet 35 man måler mængden af radiomærket hyaluronsyrebindende protein.

DK 172249 B1 2 Både radioassayet og immunenzymassayet udnytter en kompetitiv koncentration, og følsomheden ved analysen for hyaluronsyre er ikke tilstrækkelig stor, i det højeste 40 ng. Kendt teknik har også den ulempe, at 5 lavmolekylær hyaluronsyre, der kun besidder ét bindingssted til binding til hyaluronsyrebindende proteiner eller til hyaluronnectin, kan deltage i den kompetitive reaktion. Med andre ord analyserer man ikke blot for den højmolekylære hyaluronsyre af interesse, men også 10 for den fysiologisk uinteressante lavmolekylære hyaluronsyre. Dette er et alvorligt problem ved diagnosen af inflammation, såsom rheumatisme, hvor man skal måle hyaluronsyre med en temmelig høj molekylvægt. Det har derfor været et stort ønske at udvikle en fremgangsmåde, 15 der ikke er følsom for lavmolekylær hyaluronsyre, og som alligevel er i stand til en mere følsom analyse for højmolekylær hyaluronsyre, end den man opnår ved kendt teknik.

International patentansøgning nr. W087/00289 an-20 giver en metode til bestemmelse af et glycoprotein med to antigene epitoper.

Det er et mål for opfindelsen af tilvejebringe en fremgangsmåde, der selektivt og høj følsomt kan analysere for en højmolekylær hyaluronsyre uden afhængighed af en 25 kompetitiv reaktion og uden reaktion på nogen som helst uønskede lavmolekylære hyaluronsyrer.

Et andet mål for opfindelsen er at tilvejebringe et sæt af reagenser, der er passende til udførelse af en sådan analyse for hyaluronsyre. Til opnåelse af disse 30 mål har man udført intensiv forskning under iagttagelse af, at en fysiologisk vigtig, højmolekylær hyaluronsyre i det mindste besidder to steder til kobling med et hyaluronsyrebindende protein. På basis af dette fund dannede man et kompleks med sandwich-struktur, hvori et 35 hyaluronsyrebindende protein ved to eller flere steder var koblet til en hyaluronsyre med en tilstrækkelig høj 3 DK 172249 B1 molekylvægt til tilladelse af kobling med det hyaluron-syrebindende protein ved to eller flere steder (denne hyaluronsyre betegnes herefter "en højmolekylær hyalu-ronsyre") og målte koncentrationen af det således danne-5 de sandwich-kompleks. Man fandet, at denne fremgangsmåde kunne bestemme koncentrationen af den højmolekylære hyaluronsyre af interesse med høj følsomhed.

I overensstemmelse hermed er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at man: 10 (a) adsorberer det hyaluronsyrebindende protein på en fast fase; (b) sætter en prøve med indhold af en hyaluronsyre af interesse til det hyaluronsyrebindende protein, der var adsorberet på en fast fase til opnåelse af, at hyalu- 15 ronsyren af interesse binder til det adsorberende hyaluronsyrebindende protein; (c) yderligere tilsætter enten et hyaluronsyrebindende protein og en markør eller et hyaluronsyrebindende protein, mærket med en markør, til dannelse af et kompleks 20 af sandwich-struktur, hvori hyaluronsyren af interesse er bundet mellem det hyaluronsyrebindende protein adsorberet på fast fase og det mærkede hyaluronsyrebindende protein; og (d) måler mængden af hyaluronsyren af interesse i for-25 hold til markøren i komplekset eller sandwich-strukturen.

Endvidere er sættet af reagenser ifølge opfindelsen ejendommeligt ved, at det som grundelementer omfatter et markørmærket hyaluronsyrebindende protein, et 30 hyaluronsyrebindende protein adsorberet på en fast fase og en standardprøve med indhold af en højmolekylær hyaluronsyre.

På fig.l vises en kurve, der angiver forbindelsen mellem absorbans og koncentrationen af højmolekylær hya-35 luronsyre, som er opnået ved analysefremgangsmåden ifølge opfindelsen.

DK 172249 B1 4

Ved analysefremgangsmåden ifølge opfindelsen begynder man med at adsorbere et hyaluronsyrebindende protein til overfladen af en fast fase. Der er stadig pladser tilbage på den faste fase, der er i stand til at 5 koble med hyaluronsyrebindende protein eller andre typer molekyler, hvorfor højmolekylær hyaluronsyre af interesse, til stede i en prøve efter tilsætningen af prøven samt andre blodkomponenter, kunne bindes til disse ste der. Det anbefales derfor, at man før tilsætning af 10 prøven tilsætter et blokerende middel til dækning af en hvilken som helst del af den faste fase, på hvilken det hyaluronsyrebindende protein ikke er blevet adsorberet. Eksempler på blokerende midler, der kan anvendes, er y-globulin, serumalbumin og serum fra køer og andre dyr.

15 Bovin-y-globulin er anbefalet, når man benytter en Falcon-plade som fast fase.

I det næste trin sætter man en prøve, der indeholder en højmolekylær hyaluronsyre af interesse til den faste fase, på hvilken det hyaluronsyrebindende protein 20 er blevet adsorberet. Prøven, der skal tilsættes, behøver ikke at være den højmolekylære hyaluronsyre på en form, isoleret ved ekstraktion, og man kan benytte en human blodprøve eller kropsvæskeprøve direkte som udtappet. Hvis det ønskes, kan man opløse prøven i en opløs-25 ning af et blokerende middel eller fortyndet serum, før den sættes til den faste fase, på hvilken det hyaluronsyrebindende protein er blevet adsorberet.

Når den højmolekylære hyaluronsyre er blevet koblet til det hyaluronsyrebindende protein, adsorberet på 30 den faste fase, vasker man foretrukket overfladen af den faste fase.

I det tredie trin af fremgangsmåden ifølge opfindelsen sætter man et hyaluronsyrebindende protein, mærket med en markør, til den faste fase, hvortil er koblet 35 den højmolekylære hyaluronsyre. Passende markører inkluderer isotoper, fluorochromer, avidin, biotin, kemo- 5 DK 172249 B1 luminescerende substanser og enzymer. En hvilken som helst anden markør, der ved kendt teknik benyttes til at mærke højmolekylære materialer, kan benyttes uden begrænsning.

5 Alternativt kan man anvende en proteinagtig sub stans, der let binder til en markør, og som foreløbig kobles til det hyaluronsyrebindende protein, der derefter sættes til den faste fase (til hvilken den højmolekylære hyaluronsyre er blevet koblet) sammen med en pas-10 sende markør.

Når man tilsætter det hyaluronsyrebindende protein i det tredie trin, dannes et sandwich-kompleks, hvori den højmolekylære hyaluronsyre er bundet mellem det hyaluronsyrebindende protein, adbsorberet på den faste fase 15 og det mærkede eller lette at mærke hyaluronsyrebindende protein.

Ved det fjerde trin af fremgangsmåden ifølge opfindelsen måler man indholdet af markør i sandwich-komplekset for at opnå et mål for den højmolekylære hyalu-20 ronsyre af interesse. I sandwich-komplekset er den højmolekylære hyaluronsyre af interesse inkorporeret, men ingen af de lavmolekylære hyaluronsyrer, der ikke skal analyseres ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan danne en sandwich-struktur af den ovenfor beskrevne 25 art. Når man derfor måler koncentrationen af markøren på overfladen af den faste fase, får man kun et mål for mængden af den højmolekylære hyaluronsyre, der kan danne den ønskede sandwich-struktur.

Fremgangsmåden til måling af koncentrationen af 30 markøren afhænger af markørens art; hvis det drejer sig om en kemoluminescerende substans, kan man måle absor-bansen af den opløsning, der har reageret med denne substans .

Ved udførelse af fremgangsmåden ifølge opfindel-35 sen er det en fordel at fremstille prøver, der indeholder kendte koncentrationer af en markør og en højmole- DK 172249 B1 6 kylær hyaluronsyre af interesse og at konstruerer kalibreringskurver for sammenhængen mellem intensitet af signaler og kendte koncentrationer, så man kan korrigere målte værdier mod disse kalibreringskurver.

5 Eksempler på faste faser, der kan benyttes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, inkluderer plader, rør, partikler, membraner og geler. Man bør notere sig, at disse er ikke de eneste eksempler, og at man kan anvende en hvilken som helst anden fast fase, på hvilken 10 man kan adsorbere et hyaluronsyrebindende protein.

Eksempler på hyaluronsyrebindende proteiner, der kan anvendes ifølge opfindelsen, inkluderer proteoglycan renset af A.E. Laurent et al. [se Analytical Biochemistry, 109, 386-394 (1980)], link protein, hyaluronectin, 15 etc.

Forbindelsen, der skal analyseres ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er en hyaluronsyre med høj molekylvægt, der betragtes som en vigtig faktor til diagnose af inflammationer, såsom rheumatisme eller sygdom-20 me, såsom cancer, og det er nødvendigt at forhindre måling af en lavmolekylær hyaluronsyre, der er udenfor analysefremgangsmåden ifølge opfindelsens mål.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen bestemmer man mængden af den højmolekulære hyaluronsyre af in-25 teresse som et sandwich-kompleks, hvori et hyaluronsyrebindende protein er koblet til denne hyaluronsyre ved to eller flere positioner. Derfor er lavmolekylære hyalu-ronsyrer, der kun besidder ét bindingsted til det hyaluronsyrebindende protein, ude af stand til at danne et 30 kompleks af sandwich-struktur af en art, som beskrevet ovenfor og vil derfor ikke påvises ved en fremgangsmåde som den ifølge opfindelsen.

Analyse af hyaluronsyre ved kendt teknik afhænger af en kompetitiv reaktion, men fremgangsmåden ifølge 35 opfindelsen afhænger ikke deraf. Derfor har denne fremgangsmåde den fordel, at den ikke kræver anvendelse af 7 DK 172249 B1 hyaluronsyre som et på forhånd renset reagens, og at den kan udføres meget nemt.

Analysefremgangsmåden ifølge opfindelsen er så høj følsom, at den kan påvise og måle højmolekylær hyalu-5 ronsyre, selv om den kun er til stede i en spormængde, der er så lille som 10 ng.

Det følgende Eksempel skal yderligere illustrere opfindelsen.

Beskrivelsen hertil består af to dele, første del 10 angår fremgangsmåden til fremstilling af et renset hya-luronsyrebindende protein til anvendelse i analysefremgangsmåden ifølge opfindelsen, og anden del beskriver konstruktion af kalibreringskurver ved udførelse af analysefremgangsmåden ifølge opfindelsen og under anvendel-15 se af prøver, der indeholder kendte koncentrationer af højmolekylær hyaluronsyre.

I det følgende betegner M mol/L og % betyder g/100 ml.

Rensning af hyaluronsyrebindende protein: 20

Til opnåelse af ekstraktion og rensning af et hyaluronsyrebindende protein til anvendelse ifølge opfindelsen udførte man følgende i overensstemmelse med fremgangsmåden efter A. E. Laurent et al. beskrevet i 25 Analytical Biochemistry, 109, 386-394 (1980).

Bindevæv fra kvægmuler (300 g; fra Tokyo Shibaura Zoki Co., Ltd.) blev skåret i små stykker med sakse og anbragt i en 0,5 M natriumacetatopløsning (pH 5,8), med indhold af 4 M guanidinhydrochlorid (Wako Pure Chemical 30 Industries, Ltd.) og holdt dér ved 4°C (denne opløsning betegnes herefter pufferopløsning A) og ekstraheret under omrøring natten over ved 4°C.

Efter centrifugering 20 minutter ved 13.000 g fraskilte man supernatanten, dialyserede den med destil-35 leret vand og frysetørrede den. Man knuste det faste stof til opnåelse af en pulverformet råekstrakt.

DK 172249 B1 8

Den pulverformede råekstrakt blev behandlet med trypsin ved følgende fremgangsmåde. Man opløste den pulverformede råekstrakt (1600 mg) og 0,8 mg trypsin (Sigma) i 25 ml af en 0,1 M Tris-HCl pufferopløsning (pH 5 7,3) med indhold af 0,1 M natriumacetat og holdt opløs ningen ved 37°C i to timer. Efter tilsætning af 1 mg sojabønne-trypsininhibitor (Sigma) og 19,1 g guanidin-hydrochlorid tilsatte man en 0,5 M natriumacetatopløsning til opnåelse af et totalrumfang på 50 mol.

10 Man underkastede opløsningen, der indeholdt det trypsinbehandlede hyaluronsyrebindende protein, affinitets-kromatografi til fremstilling af et renset hyaluronsyrebindende protein ved følgende fremgangsmåder.

Man blandede 50 ml af opløsningen, der indeholdt 15 det trypsin-behandlede hyaluronsyrebindende protein med 50 ml af en separat præpareret hyaloronsyrekoblet Seph-arose® (se nedenfor angående fremgangsmåden til dens fremstilling) og anbragte øjeblikkeligt blandingen i en dialysemembran, hvorefter man dialyserede mod 9 rumfang 20 destilleret vand natten over ved 4°C. Efter dialysen pakkede man hele rumfanget af gelen i en søjle med en indre diameter på 3,2 cm. Man vaskede søjlen med en 1 M natriumchloridopløsning til fjernelse af ikke-adsor-beret materiale.

25 Ikke ønsket protein blev fjernet ved vask i ræk kefølge med 1-3 M natriumchlorid, og man genudvandt ad-sorbatet ved eluering med pufferopløsning A.

De udvundne fraktioner blev koncentreret med DIAFLO PM-10 (Amicon®) til et totalrumfang på 4 ml og pas-30 seret gennem en Sepharose® 6 B søjle (3,1 cm^ x 43 cm). Fraktionerne med anden og tredie top blev samlet, hvorefter man adskilte og koncentrerede med DIAFLO PM-10 til fremstilling af reagenser med indhold af hyaluronsyrebindende protein.

35 9 DK 172249 B1

Fremstilling af hyaluronsyrekoblet Sepharose®

Man satte et vandopløseligt carbodiimid (1,4 g) til en blanding af 600 mg natriumhyaluronat (Seikagaku 5 Fine Biochemicals), 75 ml AH-Sepharose® (Pharmacia Fine Chemicals) og 200 ml destilleret vand og lod blandingen henstå ved stuetemperatur i 24 timer. Man standsede reaktionen ved tilsætning af 10 ml eddikesyre, indsamlede den dannede gel og vaskede den i rækkefølge med 1000 ml 10 af hver af 1 M NaCl, 0,1 M Tris-HCl (pH 8,1) med indhold af 1 M NaCl, 0,05 M formiatester (pH 3,1), destilleret vand og 0,5 M natriumacetat (pH 5,7) til opnåelse af en hyaluronsyrebundet Sepharose®.

15 Fremstilling af et kompleks mellem biotin og hyaluron-syreblndende protein_

Man koblede det hyaluronsyrebindende protein til biotin ved følgende fremgangsmåder som et første trin til kobling med et markør POD.

20 Til 1 mg af en opløsning af et hyaluronsyrebin dende protein i 1 ml NaHC03 satte man biotin-O-Su (PIERCE Chemical Company) i en mængde på 1 mg i 1 ml di-methylsulfoxid, og man anbragte blandingen ved stuetemperatur i fire timer.

25 Opløsningen blev passeret gennem Sephadex® G 25, pakket i en søjle (Søjler PD-10), der var bragt i ligevægt med en 10 mM natriumpuf fer-opløsning (pH 7,4) med indhold af 0,1% NaN3, og 0,9% NaCl (denne opløsning betegnes herefter som PBS).

30 Man opsamlede proteinfraktionerne, blandede med 1,5 3 g guanidinhydrochlorid og anbragte det på en suspension af hyaluronsyrekoblet Sepharose® gel, der var blevet fremstillet ved blanding af en hyaluronsyrekoblet Sepharose® gel (10 ml vådt rumfang) med 40 ml af en puf-

35 feropløsning (25 mM natriumphosphat med 1,5 M NaCl; pH

7,0), med indhold af 0,1% BSA (denne pufferopløsning be- 10 DK 172249 B1 tegnes herefter som pufferopløsning B). Man opbevarede gelsuspensionen natten over ved 4°C.

Hele rumfanget af suspensionen blev pakket i en søjle, og man vaskede i rækkefølge søjlen med 250 ml af 5 pufferopløsning B, 250 ml pufferopløsning B med indhold af en proteaseinhibitor (en blanding af EDTA, trypsin-inhibitor, phenylmethylsulfonylfluorid, iodacetat, e-aminocapronsyre, benzamidin og pepstatin) og 3 M NaCl opløsning. Derefter eluerede man adsorbatet med puf-10 feropløsning A og udvandt det.

Man koncentrerede det udvundne adsorbat, så ab-sorbansen i ultraviolet lys (280 nm) var i det mindste 0,2.

Man anbragte koncentratet i småglas og opbevarede 15 det frosset til fremstilling af reagenser med et kompleks af hyaluronsyre-koblet protein og biotin.

Eksempel 1 20 Analyse for højmolekylær hyaluronsyre

Man overtrak jævnt en Falcon-plade (Becton Dikinson) med 50 μΐ af en NaHC03-opløsning af det rensede hyaluronsyrebindende protein med en koncentration på 2 5 20 vig/ml og opbevarede natten over ved 4°C.

Overfladen af Falcon-pladen, der var blevet overtrukket med det hyaluronsyrebindende protein, blev dækket med et blokerende middel, der blev tilsat på form af 0,5% bovin γ-globulin i opløsning. Derefter anbragte 30 man pladen ved stuetemperatur i to timer.

Efter tre gange vask af pladen med 0,85 M NaCl-opløsning med indhold af 0,05% Tween® 20 tilsatte man 50 jjI af en standardprøve, der var en 1:11 fortynding med indhold af 10 ng/ml højmolekylær hyaluronsyre til pladen 35 og opbevarede ved stuetemperatur i to timer. Det kunne bekræftes, at man kunne opnå lige så gode resultater ved 11 DK 172249 B1 at tilsætte en prøve af hyaluronsyre under anvendelse af en opløsning af blokerende materiale i stedet for serum.

Pladen blev vasket tre gange med en 0,85 M NaCl opløsning med indhold af 0,05% Tween® 20 og man tilsatte 5 det tidligere fremstillede biotin-hyaluronsyrebindende protein-kompleks (fortyndet til 1:300 med en opløsning af 0,5% bovin-y-globulin som blokerende materiale) i et overskud i forhold til hyaluronsyre. Pladen blev opbevaret ved stuetemperatur i to timer.

10 Derefter blev pladen vasket tre gange med en 0,85 M NaCl opløsning med indhold af 0,05% Tween® 20 og tilsatte avidin-POD (VECTOR) fortyndet 1:3000 med opløsningen af 0,5% bovin y-globulin som blokerende materiale. Pladen blev anbragt ved stuetemperatur i 45 minut-15 ter.

Pladen blev vasket tre gange med en 0,85 M NaCl opløsning med indhold af 0,05% Tween® 20, og man tilsatte 100 μΐ af en opløsning af 2 mg/ml ortho-phenylendia-min (Nakarai Kagaku Co., Ltd.; med indhold af 0,015% 20 H202, 0,018 M citronsyre, 0,064 M natriumhydrogenphos- phat og 0,1% salicylsyre). Man opbevarede pladen ved stuetemperatur i 30 minutter, hvorefter man afsluttede nedbrydningen af ortho-phenylendiamin ved tilsætning af 8 N H2S04 som to dråber.

25 Man analyserede reaktionsopløsningen, der var farvet ved nedbrydning af ortho-phenylendiamin for ab-sorbans ved 492 nm med et spektrofotometer.

Yderligere prøver blev fremstillet ved de ovenfor beskrevne procedurer for standard hyaluronsyrekoncentra-30 tioner på 50, 100, 500 og 1000 ng/ml. Man målte absor-bancen ved 492 nm af farven, produceret ved nedbrydning af orthophenylendiamin med et spektrofotometer. Resultaterne vises i fig. 1, fra hvilken man kan se, at man ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan påvise og 35 mængdebestemme en højmolekylær hyaluronsyre med en nøjagtighed på ca. 10 ng.

12 DK 172249 B1

Hvis man ønsker at måle indholdet af blod i en højmolekylær hyaluronsyre til formål at diagnosticere inflammationer, såsom rheumatisme eller sygdomme, såsom cancer, er det praktisk at benytte et reagenssæt, der 5 består af et mærket hyaluronsyrebindende protein, adsor-beret på en fast fase og en standardprøve, der indeholder en højmolekylær hyaluronsyre, idet alle disse reagenser er fremstillet ved de forudgående beskrevne procedurer .

1 o

Fordelagtige virkninger ifølge opfindelsen

Som man vil kunne forstå af den foregående beskrivelse, er man ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen 15 i stand til selektivt at analysere for en højmolekylær hyaluronsyre uden indflydelse fra uønskede lavmolekylære specier. Da denne fremgangsmåde ikke afhænger af en kompetitiv reaktion til analysen for hyaluronsyre, kræver den ikke en renset form for hyaluronsyre som reagens 20 og tillader, at man kan påvise eller mængdebestemme så lidt som 10 ng af en højmolekylær hyaluronsyre ved en meget simpel procedure.

Af disse årsager er analysefremgangsmåden ifølge opfindelsen af stor klinisk værdi og kan benyttes effek-25 tivt ved diagnose af inflammationer, såsom rheumatisme eller af sygdomme, såsom cancer.

Claims (8)

13 DK 172249 B1

1. Fremgangsmåde til selektiv analyse for højmolekylær hyaluronsyre med mindst to bindingssteder for et hyaluronsyrebindende protein, kendetegnet ved, at man: 5 (a) adsorberer det hyaluronsyrebindende protein på en fast fase; (b) sætter en prøve med indhold af en hyaluronsyre af interesse til det hyaluronsyrebindende protein, der var adsorberet på en fast fase til opnåelse af, at hyalu- 10 ronsyren af interesse binder til det adsorberende hyaluronsyrebindende protein; (c) yderligere tilsætter enten et hyaluronsyrebindende protein og en markør eller et hyaluronsyrebindende protein, mærket med en markør, til dannelse af et kompleks 15 af sandwich-struktur, hvori hyaluronsyren af interesse er bundet mellem det hyaluronsyrebindende protein adsorberet på fast fase og det mærkede hyaluronsyrebindende protein; og (d) måler mængden af hyaluronsyren af interesse i for-20 hold til markøren i komplekset eller sandwich-strukturen.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man efter trin (a) behandler over fladen af den faste fase, hvorpå det hyaluronsyrebin- 25 dende protein er blevet adsorberet, med et blokerende middel, så andelen af denne, hvor det hyaluronsyrebindende protein ikke er adsorberet, er dækket med dette blokerende middel.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kende- 30 tegnet ved, at den faste fase er en plade, et rør, partikler, en membran eller en gel.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kende tegnet ved, at det hyaluronsyrebindende protein er 14 DK 172249 B1 en proteoglycan, et link protein eller en hyaluronec-tin.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at markøren er en isotop, en fluoro- 5 chrom, avidin, biotin, en kemoluminescerende substans eller et enzym.

6. Fremgangsmåde ifølge krav l, kendetegnet ved, at det blokerende middel er y-globu-lin, serumalbumin eller serum. 10 7. Sæt af reagenser til analyse for en højmole kylær hyaluronsyre med mindst to bindingssteder for et hyaluronsyrebindende protein, kendetegnet ved, at det som grundelementer omfatter et markørmærket hyaluronsyrebindende protein, et hyaluronsyrebindende 15 protein adsorberet på en fast fase og en standardprøve med indhold af en højmolekylær hyaluronsyre.

8. Sæt ifølge krav 7, kendetegnet ved, at ét eller flere af grundelementerne er som følger : 20 overfladen af den faste fase er behandlet ifølge krav 2; foretrukket med et blokerende middel ifølge krav 6; den faste fase er ifølge krav 3; det hyaluronsyrebindende protein er ifølge krav 4; og markøren er ifølge krav 5.