FI88166C - Bis-aldonsyraamider och foerfarande foer deras framstaellning - Google Patents

Description

OOI f £ o u I G O

BIS-ALDONIHAPPOAMIDEJA JA MENETELMÄ NIIDEN VALMISTAMISEKSI - BIS-ALDONSYRAAMIDER OCH FÖRFARANDE FÖR DERAS FRAMSTÄLLNING

Keksintö koskee kaavan I mukaisia bis-aldonihappoamideja

O

R10-CH2—CH (OH)-CH (OR2 )-CH (OR5 )-CH (OH) -C-N (R4 ) A (I) h 12 3 jossa kaavassa joko kaikki ryhmät R , R ja R edusta- 12 3

vat vetyatomia tai kaksi ryhmistä R , R ja R edustavat vetyatomia ja kolmas edustaa ryhmää, jonka kaava on jokin kaavoista II - VII

ch2oh HD A Ov /H \nr- s. A (id «VV*

H OH JHgOH

HOy-0 H

( H /5* (III)

1W

OH

2 C 81 6 6 CH,® ch2oh *

H _o Hyl-°v H

(H /ΠΓ (IV) \n (V) \OH Οψ\ HO \_¥ HOj -' * ]

H H

CH20H ch2oh

Λ A °\ H H )-O H

L JsL- 0--Lh J-o--(VI)

H OH H OH

_ CHgOH - CH„0H H > 0 /" \-°--(VII> ry- V OH H ) HOI'_' H L H OH Jffl

H OH

m tarkoittaa lukua 0, 1, 2, 3, 4,5 tai 6, A kaavassa I tarkoittaa suora- tai haaraketjuista, 2 - 22 hiiliatomia sisältävää tyydyttynyttä alkyleeniryh-mää, joka voi haluttaessa olla substituoitu yhdellä tai useammalla ryhmällä -CC^R^, ja tämän alkyleeniryhmän voi haluttaessa keskeyttää -O-, -S- -S-S-, ~si°)n"/ o

Il g -C-NH- ja/tai -NR - tai sykloalkyleeni tai aryleeni, joita voi olla korkeintaan viisi, tai A edustaa yksinkertaista sidosta tai ryhmää, jonka kaava on 3 CC166 -O— CH2 —O— n on 1 tai 2, 4 5 6 ryhmät R , R ja R voivat samanaikaisesti tai kukin toinen toisestaan riippumatta edustaa vetyatomia tai C1 - Cg-alkyyliryhmää, ja näiden yhdisteiden epäorgaanisten tai orgaanisten happojen kanssa muodostamat suolat, edellyttäen, että bis-glukonihappoamidien ollessa kyseessä 12 3 4 a) ryhmät R , R , R ja R eivät samanaikaisesti ole vetyatomeja, ja että 2 13 b) kun R on kaavan II mukainen ryhmä ja R , R ja 4 R ovat kaikki vetyatomeja, A ei tällöin ole -(Cl^^"» ja että 2 c) kun R on kaavan VI mukainen ryhmä, jossa m on 0, 13 4 1, 2, 3 tai 5 ja R , R jaR ovat kaikki vetyatomeja ja A on subsittuoimaton, suoraketjuinen alkyleeniryhmä, tällöin on ketjun jäsenten lukumäärä pariton luku.

Keksinnönmukaiset yhdisteet ovat hyödyllisiä välituottei-:ta. Näistä saadaan reaktiolla sulfatointiaineiden kans-sa erittäin arvokkaita aktiivisia yhdisteitä, joilla on yllättäviä farmakologisia ominaisuuksia. Eräitä bis-aldonihappoamideja tunnetaan ennestään ja niiden suhteen viitataan seuraaviin kirjallisuuslähteisiin: F. Scholnick, : P.E. Pfeffer, J. Dairy Sei. 63 (3), 471 (1980); W.N.

Emmerling, B. Pfannemiiller, Starch 33 (6), 202 (1981); G. Ziegast, B. Pfannemiiller, Makromol. Chem. 185,(1984) 1855; J. Masse et ai., C. R. Acad. Sei., Ser. 3, 301 (1), (1985) 27; K. Dill et ai., Inorg. Chim. Acta, 106 (4), v : (1985) 203. Ennestään tunnettujen yhdisteiden ei kuiten- :: kaan missään vaiheessa mainita olevan välituotteita edellä mainittujen aktiivisten yhdisteiden valmistuksessa. Emmerling ja Pfannemiiller käyttivät niitä amyloosiketju-jen entsymaattisessa synteesissä perunan fosforylaasin avulla. Scholnick ja Pfeffer ja myös K. Dill et ai.

< 8166 4 ovat tutkineet niiden kelatoivia ominaisuuksia ja J.

Masse et ai. ovat tutkineet niiden vaikutusta viljakasvien kasvuun ja klorofyllipitoisuuteen.

Esillä olevan keksinnön yhteydessä manittuihin eri subs-tituentteihin ja ryhmiin (eri kaavoissa, jotka on mainittu) pätee seuraava:

Aldonihapot, jotka ovat pohjana esillä olevan keksinnön mukaisilla bis-aldonihappoamideille, ovat yleisen kaavan X mukaisia R10—CH2—CH(OH)—CH(OR2)—CH(OR3)—CH(0H)—C02H (X) 12 3 jossa kaavassa R , R ja R ovat edellä määriteltyjä.

Nämä aldonihapot ovat läsnä D-muodossa, L-muodossa tai rasemaattimuodossa, miellellään siinä muodossa, joka on luonnostaan vallitseva.

Esimerkkeinä näistä kaavan X mukaisista aldonihapoista voidaan mainita allonihappo, altronihappo, galaktonihap-po, glukonihappo, guloninappo, idonihappo, mannonihappo ja talonihappo, jotka ovat heksonihappoja, ja mielellään kyseeseen tulevat galaktonihappo, glukonihappo, gulonihap-po ja mannonihappo. Muita esimerkkejä ovat johdannaiset, joissa tällainen heksonihappo on 3-, 4- tai 6-asemassa olevan happiatomin välityksellä liittynyt glykosidisesti ryhmään, jota edustaa joku kaavoista II - VII. Sidos voi tässä olla *<- tai f>-glykosidinen. Ryhmät II - V ovat galaktopyranosyyli- ja mannopyranosyyliryhmiä. Ryhmät VI ja VII ovat glukopyranosyyliryhmiä(kun m = 0) j a o( (l-*4) - tai β (l-*4) -kytkettyj ä oligopyranosyyliryhmiä (kun m = 1 - 6). Mielellään on indeksi nr‘kaavoissa VI - VII 0 tai 1. Aldonihappoon liittyneet sakkaridiyk-siköt ovat tavallisesti läsnä D-muodossa. Esimerkkeinä yleisen kaavan X mukaisista heksonihapoista, jotka on substituoitu jonkun kaavan II - VII mukaisella ryhmäl- 5 ecu: lä, mainittakoon glukopyranosyyliglukonihapot, glukopy-ranosyylimannonihapot, glukopyranosyyligalaktonihapot, galaktopyranosyyliglukonihapot, mannopyranosyyliglukoni-hapot, mannopyranosyylimannonihapot ja oligopyranosyyli-glukonihapot. Tässä asetetaan etusijalle laktobionihap-po (4-0/3-D-galaktopyranosyyliglukonihappo), gentiobio-nihappo, melibionihappo (6-0-K-D-galaktopyranosyyligluko-nihappo), mannobionihappo, sellobionihappo (4-0-y(}-DTgluko-pyranosyyliglukonihappo) ja maltobioniahppo (4-0-K-D-glukopyranosyyliglukonihappo) sekä maltotrionihappo ja sellotrionihappo.

Esimerkkejä epäorgaanisista ja orgaanisista suoloista ovat ammonium-, litium-, natrium-, kalium-, magnesium-, kalsium- ja alumiinisuolat sekä suolat, jotka ovat muodostuneet etanoliamiinin, trietanoliamiinin, morfolii-nin, pyridiinin tai piperidiinin kanssa. Natrium-, kalium-, kalsium-, alumiini- ja etanoliamiinisuolat asetetaan etusijalle.

• *

Esimerkkejä suora- tai haaraketjuisista, tyydyttyneistä, * : : 2-22 hiiliatomia sisältävistä alkyleeniryhmistä, jotka : eudstavat ryhmää A, ovat etyleeni, tri-, tetra-, penta-, ·;· heksa-, hepta-, okta-, nona-, deka-, undeka-, dodeka-, tetradeka-, heksadeka-, oktadeka-, ikosa- ja dokosamety-leeni ja myös metyylimetyleeni, metyylipropyleeni, metyy-libutyleeni, metyylipentyleeni ja dimetyylietyleeni. Etusijalle asetetaan etyleeni, tri-, tetra-, heksa-, nona-, dodeka- ja dokosametyleeni ja myös metyylietyleeni ja metyylipentyleeni.

Esimerkkejä aryleeniryhmistä, jotka saattavat keskeyttää a lky leeni ryhmän A, ovat fenyleeni, naftyleeni, antrylee-.···. ni, tenantry leeni ja f luorenyleeni. Tässä yhteydessä '· asetetaan etusijalle orto-, meta- ja para-fenyleeniryhmä.

f, OI cc g O I D υ

Esimerkkejä sykloalkyleeniryhmistä, jotka voivat keskeyttää alkyleeniryhmän A ovat syklopentyleeni, sykloheksylee-ni, sykloheptyleeni js syklo-oktyleeni, joista 1,3- ja 1,4-sykloheksyleeni asetetaan tässä etusijalle.

Suora- tai haaraketjuinen, tyydyttynyt alkyleeniryhmä A sisältää mielellään 2-12 hiiliatomia. Jos joku mainituista ryhmistä keskeyttää suora- tai haarektjuisen, tyydyttyneen alkyleeniryhmän A, on näitä ryhmiä mielellään 1 tai 2.

Erityisesimerkkejä määritelmän mukaisesti ryhmää A edustavista alkyleeniryhmistä ovat ryhmät, jotka on johdettu seuraavisrta o( ,ω-diamiineista:

HN-( CH ) NH

I 2 2 I

CH3 CH 3 CO R5 I ^ H2N-CH -(CH2}4- NH2

Lysiinin (R5 = H) ja*sen esterien (R5 = C2 - Cg-alkyyli) enantiomeerit.

S-atomin tai -atomeja sisältäviä: R502C-HC(NH2)-CH2S-CH2-(NH2)CH-C02R5

Lantioniinin (= H) ja sen esterien (R^ = C^-Cg-alkyyli) diastereomeerit.

r5o2c-hc(nh2)-(ch2)x-s-s-(ch2)x-(nh2>ch-co2r5 5 5

Kystiinin (x = 1, R = H) ja sen esterien (R = C^-Cg- alkyyli) diastereomeerit.

5 5

Homokystiinin(x = 2, R = H) ja sen esterien (R =C^-Cg-alkyyli) diastereomeerit.

H02C-CH(NH2 ) - (CH2 ^-S-CHj-CHiNHj) -COjH

'01 r.' ' 7 o l v u

Kystationiinin diascereomeerit.

NH-ryhmän tai -ryhmiä sisältävät: H2N(-CH2-CH2-NH)x-CH2-CH2-NH2 x = 1 dietyleenitria- miini x = 2 trietyleenitetr-amiini x = 3 tetraetyleenipent-amiini H2N-(CH2)2“NH-(CH2)3-NH-(CH2)2-NH2 1,9-diamino-3,7-diatsa- nonaani H2N-(CH2)3-NH-(CH2)2~nh~(CH2)3_NH2 ^·l°-diamino-4»7-diatsa- dekaani H2N-(CH2)g-NH-(CH2)g-NH2 bis-(6-aminoheksyyli)- amiini H2N-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH3)3-NH2 spermiini H2N-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2 spermidiini H2N-(CH2)3-NH-(CH2)3-NH-(CH2)3-NH2 1,ll-diamino-4,8-diatsa- undekaani O-atomin sisältävä; H2N-(CH2)2~0_(CH2)2~NH2 bis-(2-aminoetyyli)eet- : teri

Ryhmä A on mielellään jokin seuraavista: 5— : *v 8 ' G1 6 6 -CH-CH2-CH2-CH2- I 5 co2r -CH-CH2-Sp-CH2-CH- jossa p = 1 tai 2 c I 5

COgR C02R

-(ch2)2-s-s-(ch2)2- -(ch2)3-0-(ch2)4-0-(ch2)3- -(ch2)3-nh-(ch2)3- -(CH2)6-NH-|-(CH2)3-|NH-(CH2)6- 0 o 4 5 6

Esimerkkejä C^-Cg-ryhmistä, joita R , R ja R voivat olla, ovat metyyli, etyyli, n-propyyli, n-butyyli, n-pen-tyyli, n-heksyyli, isopropyyli, isobutyyli, tert.-butyyli, ja neopentyyli, joista metyyli, etyyli, n-propyyli, iso*·— propyyli; tert.-butyyli ja n-butyyli asetetaan etusijalle.

Esillä oleva keksintö koskee myös menetelmää yleisen kaavan I mukaisten bis-aldonihappoamidien valmistamiseksi.

Tässä yhteydessä annetaan aldonihappojen X laktonien 4 4 reagoida liuottimessa yleisen kaavan R HN-A-NHR mukaisen 4 diaminoyhdisteen kanssa, jossa R on edellä määritelty, vastaavasti kuin kirjallisuudesta tunnetuissa menetelmissä (ks. edellä mainittuja kirjallisuusviitteitä). Lakto-neja voidaan käyttää sekä yleisen kaavan VIII mukaisessa 1,5-laktonimuodossa että yleisen kaavan IX mukaisessa 1,4-laktonimuodossa.

yP

, /°“C\ (R 0 C H 2) CH^ ^CH(OH) (VIII) (R20)CH-CH( OR3) 9 8 81 6 6 /> o—<r

Pr1 o — CH, — CH(OH )"] CH CH(OH) <IX) L 2 J \cii(OR3) Nämä saadaan eliminoimalla vettä aldonihapoista X. Aldoniha-pot voidaan valmistaa kirjallisuudesta tunnetuilla menetelmillä (esim. W.N. Emmerling, B. Pfannemiiller, Starch 3_3 (6) (1981), 202; R. Schaffer, H.S. Isbell, J. Am.

Chem. Soc. 81 (1959), 2178; H.W. Diehl et ai., Carbohydrate Research 3J5 (1974), 364) suorittamalla vastaavan aldoo-sin hapetus sähkökemiallisesta tai hypohaliitin avulla.

Esillä olevien bis-aldonihappoamidien valmistamiseksi saatetaan 2 moolia aldonolaktonia reagoimaan yhden moolin kanssa diaminoyhdistettä.

Sopivia liuottimia reaktiolle ovat metanoli, etanoli, etyleeniglykoli, dimetyylisulfoksidi, dimetyyliformami-di tai N-metyylipyrrolidoni. Dimetyyliformamidi asetetaan etusijalle.

Reaktioajat ovat useista tunneista useisiin vuorokausiin, mielellään välillä 5-8 tuntia.

Reaktiolämpötilat ovat huoneenlämpötilan ja vastaavan liuottimen kiehumispisteen välillä, mielellään välillä 40 - 80°C.

Aldonihappoamidit joko kiteytyvät reaktioliuoksesta tai ne voidaan saostaa lisäämällä orgaanista liuotinta. Sopivia tähän ovat metanoli, etanoli, isopropanoli tai asetoni, mielellään isopropanoli.

Keksinnönmukaisen menetelmän edullisessa toteutusmuodossa valmistetaan kaavan I mukaiset yhdisteet kaavan X mukai- ίο C 81 6 ό sista aldonihapoista ilman laktonien eristämistä.

Tässä yhteydessä valmistetaan vapaan aldonihapon X vesi-liuos kationinvaihdinta käyttämällä aldonihapon X alkali-metalli- tai maa-alkalimetallisuolasta, jota voidaan ostaa, tai joka voidaan syntetisoida kirjallisuudesta tunnetuilla menetelmillä (ks. edellä), ja vesiliuos konsentroidaan oleellisesti. Aldonihappoa X vastaavat lak-tonit valmistetaan tämän jälkeen ilman eristämistä poistamalla vettä. Tätä tarkoitusta varten jäännös, joka edustaa aldonihapon ja laktonin vesipitoista seosta, liuotetaan korkealla kiehuvaan liuottimeen. Esimerkkejä korkealla kiehuvista liuottimista ovat dime tyylisulfoksidi, dimetyyliformamidi, N-metyylipyrrolidoni, dimetoksi-metyylieetteri jne., joista dimetyyliformamidi asetetaan etusijalle. Sitten lisätään toinen, matalalla kiehuva liuotin, joka kykenee muodostamaan aseotroopin veden kanssa. Sopivia tällaisia liuottimia ovat esimerkiksi n-pentaani, n-heksaani, sykloheksaani, bentseeni jne., joista n-heksaani asetetaan etusijalle. Tämän jälkeen vesi eliminoidaan aldonihapoista kvantitatiivisesti ve-denerottimiessa. Sitten matalalla kiehuva liuotin tislataan pois ja laktoni, joka on jäljellä olevassa, korkealla kiehuvassa liuottimessa, saatetaan ilman eristämistä reagoimaan diaminoyhdisteen kanssa. Reaktiolämpötilat ovat välillä 20 - 120°C, mielellään välillä 50 - 80°C. Reaktiotuotteet saadaan orgaanisella liuottimealla saos-tamalla. Sopivia liuottimia tähän tarkoitukseen ovat esimerkiksi dietyylieetteri ja muut eetterit, metanoli, etanoli, isopropanoli, karboksyylihappojen esterit ja asetoni. Isopropanoli ja asetoni asetetaan etusijalle. Tarvittaessa voidaan yhdisteet vapauttaa reagoimattomista lähtöaineista käsittelemällä happamilla ja emäksisillä ioninvaihtimilla.

Esillä olevan keksinnön kohteena olevat kaavan I mukai- 11 n n 1 /' x 1 (, u luo set bis-aldonihappoamidit voidaan jatkoprosessoida poly-sulfatoiduiksi tuotteikseen, jotka ovat farmakologisesti hyödyllisiä aineita. Näillä lopputuotteilla on antitrom-boottisia ja anti-inflammatorisia ominaisuuksia. Näin ollen voidaan tuotteita käyttää .koko reumaattisten sairauksien kierron hoidossa sekä laskimo- ja valtimotulp-pien ennaltaehkäisyssä ja hoidossa sekä ihmisten että eläinten lääkityksessä. Käyttö ihmisissä asetetaan etusijalle.

Keksinnönmukaisista välituotteista saatujen lopputuotteiden antitromboottinen aktiivisuus on erityisen yllättävä.

Tähän asti on veritulppien ennaltaehkäisyyn käytetty pääasiassa hepariinia. Hepariini on mukopolysakkaridi, jota eristetään eläinkudoksesta, erityisesti sian ileu-mista (Thomas, D.P. (1981), teoksessa Clinics Haematology, Voi. 10, ss. 443 - 458, Saunders Comp. Ltd., 1981). Hepa-riinin lisäksi on myös muilla mukopolysakkarideilla, kuten dermataanisulfaatilla tai heparaanisulfaatilla, antitromboottisia ominaisuuksia (Rosenberg, R.D., . Rosenberg, J.S., J. Clin. Invest. 74, 1-6; Sie, P., Ofosu, F., Fernandez, F., Buchanan, M.R., Petitou, M., Boneu, ;·; B. (1986) Br. J. Haematol. 64, 707 - 714). Ennestään tunnetaan esim. patenttijulkaisusta DE-PS 3 118 588 puolisynteettinen kondroitiinipolysulfaatti, jolla on mm. antitromboottisia ominaisuuksia. Kuitenkin vain hepariini on terapeuttisessa käytössä. Äskettäin on kliiniseen käyttöön valmistettu useita molekyylimassaltaan pieniä hepariineja. Tällöin ne ovat aineita, joita saadaan hepariinista erilaisia kemiallisia tai entsymaattisia depolymerointimenetelmiä käyttäen (Thomas, D.P., Merton, R.E. (1982) Thrombos. Res. 28, 343 - 350; Walenga, J.M., Fareed, J., Petitou, M., Samana, M., Lormeau, J.C.,

Choay, J. (1986) Thrombos. Res. 43, 243 - 248; Roller, M., Schoh, U., Buchmann, P., Largiader, F., von Felten, 12 f? 81 6 6 A., Frick., P.G. (1986) Thrombos. Haemostas. 56, 243 - 246).

Hepariinien ja molekyylimassaltaan pienten hepariinien haittana on se, että ne ovat peräisin luonnosta (saatu esimerkiksi eläimistä). Näin ollen niissä on läs^nä pieniä määriä eläinkudoksesta olevia antigeenejä, jotka voivat aiheuttaa anafylaktisia reaktioita, kuten verihiutaleiden määrän alenemista, trombooseja ja embolusten muodostumista. Nämä sivuvaikutukset, jotka kylläkin ovat harvinaisia, saattavat olla vakavia ja kliinisesti vaikeasti hallittavissa.

Sitä vastoin ovat keksinnönmukaiset lopputuotteet täysin synteettisiä ja näin ollen vapaita eläinperäisistä antigeeneistä.

Vielä eräs, käytännössä tavallisempi komplikaatio, kun trombooseja ennaltaehkäistään hepariinilla ja molekyyli-massaltaan pienellä hepariinilla, on verenvuotojen esiintyminen. Aineilla, jotka aiheuttavat vähemmän verenvuotoja ja samalla ovat antitromboottiselta vaikutukseltaan yhtä hyviä, saattaa näin ollen olla huomattavia terapeuttisia etuja.

Esillä oleva keksinnön mukaisille lopputuotteille suoritettiin useita farmakologisia kokeita, joilla selvitettiin niiden antitromboottista ja anti-inflammatorista aktiivisuutta.

1. Fibrinolyysin kiihdyttäminen

Kliinisesti merkitsevien (suhteellisen suurten) trombien muodostuminen voidaan estää eri tavoin. Ensinnäkin voidaan eliminoida tekijät, jotka liittyvät primääristen trombien muodostumiseen, kuten verihiutaleiden aggre- 13 CC1 66 goitumiseen tai verenhyyytymisjärjestelmään. Toisaalta voidaan primäärisen trombin liukenemista kiihdyttää tehostamalla endogeenistä fibrinolyysiä. Endogeenisen fibrinolyysin tehostamisella voidaan myös auttaa jo kliinisesti merkittävien trombien liukenemista. Aineen fib-rinolyyttisellä vaikutuksella on näin ollen suuri merkitys trombien ennaltaehkäisyssä ja hoidossa. Keksinnön-mukaisten lopputuotteiden fibrinolyyttinen vaikutus määritettiin seuraavalla kokeella. Koetta on vähäisessä määrin muunnettu siitä menetelmästä, joka tunnetaan kirjallisuudesta fibrinolyyttisen vaikutuksen määrittämiseksi (Kluft, C. (1979) Thromb. Haemostas. 4_1, 365 -383).

Fibrinolyysikoe

Fibrinolyysi määritettiin käyttämällä plasminogeeniä sisältäviä fibriinimaljoja.

Petri-maljat, joiden halkaisija oli noin 9 cm, esiläm-mitettiin 40°C:seen. Maljoihin pipetoitiin Selmalla pyörittämällä sekoittaen 3 ml fibrinogeenin (Behring-’ . werke, Marburg) 2%:sta vesiliuosta, 1 ml plasminogeeni- ; liuosta, 2 CTA/ml (Behringwerke, Marburg), 3 ml 1 %:sta ; · agaroosiliuosta (Serva, Heidelberg), joka oli tehty 50 mM Tris.HCl-liuokseen, pH 7,8, ja 1 ml trombiiniliuos-.* ta (Behringwerke, Marburg) (15 yksikköä/ml), joka oli tehty veteen. Maljat jäähdytettiin ja niihin painettiin kolot, joiden halkaisija oli 5 mm.

Seosta, jossa oli 0,1 ml plasmaa (ihmisen standardiplas-ma, Behringwerke, Marburg), 0,8 ml vettä ja 0,1 ml testattavan aineen liuosta eri väkevyyksinä, inkuboi-tiin 10 minuuttia 37°C:ssa. Sitten lisättiin 0,9 ml 0,025 % etikkahappoa ja saatua seosta inkuboitiin 5 minuuttia 4°C:ssa ja sen jälkeen sentrifugoitiin 5 minuuttia kiihtyvyydellä 2000 g. Sakka sekoitettiin 0,1 14 88166 mlraan puskuria (20 mM Tris.HCl, 100 mM NaCl, 2,7 mM EDTA, pH 7,8).

0,02 ml tätä liuosta ja 0,005 ml 14,3 mM flufenamiinihap-poliuosta (Sigma, Taufkirchen) puskurissa pipetoitiin fibriinimaljojen sijoituskoloihin. Kun oli inkuboitu 24 tuntia 37°C:ssa, mitattiin lyysikehät planimetrisesti. Arvot, jotka saatiin vähentämällä lyysikehien pinta-aloista ne lyysikehien pinta-alat, jotka oli saatu ilman ainelisäystä, olivat fibrinolyysiä kohottavan aktiivisuuden mitta.

Tulos: Saatu tulos on esitetty alla olevassa taulukossa.

Aine esimerkistä Fibrinolyysi pitoisuudessa 2 jig/ml (mm2) 23 21,6 20 19,2 24 17,8

Heapriini 14,8 2. Veren hyytymisen estäminen

Veren hyytymisen estyminen voidaan mitata yksinkertaisella tavalla käyttämällä aktivoitua osittaista tromboplas-tiiniaikaa (engl. activated partial thromboplastin time, aPTT). Se antaa tietoa aktivoituneen hyytymisjärjestel-män yleisestä inhiboitumisesta. Jotta saataisiin vähennetyksi verenvuotojen esiintymistä, on tässä toivottavaa, että veren hyytymisen estyminen on niin vähäistä kuin mahdollista.

Hyytymiskoe, aPTT

p

Seosta, jossa on 0,1 ml plasmaa ja 0,1 ml Pathromtin :iä 8 8166 13 (Behringwerke, Marburg), inkuboidaan 2 minuuttia 37°C:ssa ja sen jälkeen lisätään 0,1 ml 25 mM CaC^-liuosta. Hyy-tymisaika mitataan Schnitger & Gross-koagulometrillä.

Seos tehdään viittä erillistä määritystä varten per konsentraatio. Standardina käytetään hepariinia, joka sisältää 175 yksikköä /ml (Pharmaindustrie).

Hyytymisajan piteneminen muunnetaan hepariiniyksiköiksi käyttämällä kalibrointikäyrää. Koska kalibrointikäyrät eivät ole yhdensuuntaisia, valitaan vertailupisteeksi 150 %:n piteneminen verrattuna sokkoarvoon.

Tulos: Seuraavassa taulukossa on esitetty keksinnönmu- aisten lopputuotteiden tulokset hepariiniyksiköinä

Aine esimerkistä yksikköä/mg 23 30,9 25 5,85 20 42,1 24 14,1 31 10,2 34 15,1

Heapriini 175 ;-· Fragmiini 64,5 (molekyylimassaltaan pieni heapriini) 3. Vaikutus verenvuotoaikaan

Rotilta katkaistiin noin 2 nm pala hänn.ästä. Aika, jonka kuluessa verenvuoto lakkasi, mitattiin. Eläimille annettiin koeyhdistettä eri pitoisuuksina tai fysiologista suolaliuosta (verrokki) 5 minuuttia ennen verenvuodon aiheuttamista. Käsittely suoritettiin ryhmille, joissa oli 20 eläintä. Verenvuotoajän piteneminen verrattuna verrokkiin ilmoitettiin prosentteina.

ie 1:0166

Aine esimerkistä Verenvuotoajän piteneminen (%)

Annos (mg/kg) 0,25 0,5 2 20 - 5,1 35,1

Hepariini 55,4 120 4. Anti-inflammatorinen vaikutus

Tulehdusprosesseissa vapautuu fagosyyteistä (polymorfo-nukleaarisista leukosyyteistä ja makrofageista) suuria määriä reaktiivisia happilajeja, kuten superoksidiradikaa-leja ja hydroksyyliradikaaleja. Nämä radikaalit osallistuvat kudoksen tuhoamiseen. Aineet, jotka estävät radikaa-linmuodostusta leukosyyteissä, ovat näin ollen hoidollisesti hyvin mielenkiintoisia haluttaessa hallita tulehdustiloja (Flohe, L., Giertz, H., Beckmann, R. (1985) teoksessa The Pharmacology of Inflammation, Voi. 5 (Bonta, I et ai., toim.), ss. 255 - 281, Elsevier, Amsterdam-New-York).

Leukosyyttien aikaansaama radikaalienmuodostus voidaan mitata mittaamalla kokonaisesta verestä luminolilla voimistettu kerniluminesenssi (Peter, M. et ai., (1985) teoksessa Chi. Forum 85 (Stelzner, F., toim), ss. 81 - 84, Springer Verlag, Berliini).

Anti-inflammatorisen vaikutuksen koe

Koeyhdisteet liuotetaan PBS-puskuriin ja valmistetaan sarjalaimennukset PBS-puskuriin. 600 ui PBS-puskuria, 100 ui koeyhdisteen liuosta, 100 ui zymosan-suspensiota (100 mg/ml) ja 100 ui sitratoitua kanin verta pipetoidaan kyvetteihin, jotka sopivat 1251 Luminometer-laitteeseen (LKB). Mittaus aloitetaan lisäämällä 100 ui 10 Lu-minol-liuosta. Kemiluminesenssi mitataan joka 5. minuut- f; 81 6 6 17 ti 90 minuutin ajan kustakin näytteestä. Määritetään maksimaalinen kerniluminesenssi. Vertailuarvona käytetään näytettä, jossa ei ole koeyhdistettä. Sokkoarvona käytetään näytettä, johon ei ole lisätty zymosania. Samaa ainetta kohti suoritetaan kolme riipumatonta määritystä. Jäännös-luminesenssi lasketaan seuraavan kaavan mukaan: CL =v(aine) - CLmav (sokko) max max - x 100 CL„ (verrokki) - CL„, (sokko) max max 50 %:nen CL-inhibitio (IC^Q-arvot) saadaan puolilogarit-miselta käyrältä, jossa on esitetty jäännöskemilumine-senssi logartimista pitoisuutta vastaan.

Tulos:

Seuraavassa taulukossa on esitetty Luminolilla voimistetun kemiluminesenssin (CL) inhiboituminen keksinnönmukaisten lopputuotteiden toimesta.

,: · Aine esimerkistä IC50 ·:·: 23 225 25 155 Λ: 20 540 V: 24 220 31 170

Indometasiini 240

Seuraavissa esimerkeissä valotetaan keksinnönmukaisten yhdisteiden valmistusta ja niiden jatkoprosessointia.

Esimerkki 1 N,Ν'-1,3-propaanidiyylibis-D-glukonihappoamidi 18 C o 1 66 7,13 g D(+)-glukono-l,5-laktonia liuotetaan 40 ml:aan amiinivapaata dimetyyliformamidia ja sen jälkeen lisätään 1,67 ml 1,3-diaminopropaania. Sitten seos lämmitetään 60°C:seen ja sekoitetaan 5 tuntia. Syntynyt sakka suodatetaan pois, pestään metanolilla ja kuivataan. Näin saadaan 7,96 g valkoista jauhetta.

Sulamispiste: 165 - 173°C

IR (KBr): ·» = 3540, 2960, 2915, 2890, 1660, 1537, 1100, 1040 cm'1 1H-NMR (D20): έ> 1,7 6 (dt, 2H, 6,5 Hz); 3^0 (t, 4H, 6,5 Hz); 3,4 - 4,0 (m, 8H); 4,09 (m, 2H); 4,30 (d, 2H, 3 Hz); 4,70 (Η2ο, sisäinen standardi).

Esimerkki 2 N,N1-1,12-dodekaanidiyylibis-D-glukohihappoamidi 7,1 g D-glukono-l,5-laktonia suspendoidaan 90 ml:aan dimetyyliformamidia ja sen jälkeen lisätään 4,0 g 1,12-diaminododekaania ja saatua seosta sekoitetaan 5 tuntia 60°C:ssa. Sitten seos jäähdytetään ja sekoitetaan 0,3 litraan metanoliaja kiinteä aine kerätään talteen ja pestään metanolilla. Sitten kiinteä aine suspendoidaan 1 N suolahappoon, sekoitetaan 1 tunti huoneenlämpötilassa ja kiinteä aine kerätään taas talteen ja pestään vedellä, asetonilla ja lopuksi dietyylieetterillä. Näin saadaan 9,9 g valkoista jauhetta.

Sulamispiste: 192 - 195°C

IR (KBr) » = 2920, 2850, 1630, 1550, 1085, 1027 cm'1 1H-NMR (DMSO-dc): S 0,7 - 1,8 (m, 20H); 3,06 (m, 4H);

O

3,25 - 3,75 (m, 8H); 3,75 - 4,2 (m, 4H); 4,40 (s, 10H); 7,51 (t, 2H, 5,5 Hz); sisäinen standardi: tetrametyyli-silaani

Esimerkki 3 N,N1-1,3-propaanidiyylibis-/4-0-^-D-qalaktopvranosvyli-D-glukonihappoamidi 19 o 31 6 β 395,4 g kalsiumlaktobionaattia liuotetaan 1,2 litraan vettä ja saatua liuosta käsitellään 1 tunti 0,7 litralla Lewatit S 100:aa (H+-muoto) erämenetelmällä. Seos suodatetaan imulla ja vaihdin pestään 2 kertaa 1 litralla vettä. Yhdistetyt eluaaatit väkevöidään oleellisesti ottaen tyhjössä. Sitten lasimainen jäännös liuotetaan 800 ml:aan amiinivapaata dimetyyliformamidia, lisätään 800 ml n-heksaania ja saatu seos kuumennetaan kiehumispisteeseen vedenerottajassa samalla voimakkaasti sekoittaen. Kun veden erottuminen on tapahtunut täydellisesti, n-heksaani tislataan pois, lisätään 43 ml 1,3-diaminopropaania ja saatua seosta sekoitetaan 7 tuntia 63°C:ssa. Sitten seos sekoitetaan 5 litraan isopropanolia ja kiinteä aine kerätään talteen ja pestään 1 litralla isopropanolia. Kuivauksen jälkeen saadaan 350 g valkoista kiinteätä ainetta. Puhdistusta varten tämä liuotetaan 2 litraan vettä. Saatua liuosta käsitellään 1 tunti 100 ml:11a Lewatit S 100:aa (H+-muoto) ja sen jälkeen 100 ml:11a Amberlyst A21:tä (OH ~-muoto). Kun suoritetaan kylmäkuivaus, saadaan otsikon tuote puhtaassa muodossa.

Sulamispiste: 125 - 132°C

IR (KBr): »> = 2930, 1645, 1550, 1080 cm-1 1H-NMR (D20): S 1,75 (d, 2H, 6Hz); 3,27 (t, 4H, 6Hz); [I. 3,4 - 4,1 (m, 20H) ; 4,15 (t, 2H, 3Hz) ; 4,39 (d, 2H, 3Hz); 4,54 (d, 2H, 7Hz); 4,70 (HjO, sisäinen standardi) .’f 13C-NMR (D20): i 30,79; 38,99; 63,73; 64,65; 71,30; 73,12; 73,74; 74,14; 74,50; 75,06; 75,18; 77,99; 83,71; 106,10; 176,84; sisäinen standardi: CH^OH δ51,56

Esimerkki 4 N,N1 -1,6-heksaanidiyyIibis-/4-OTAD-qalaktopyranosvYli-D-: : glukonihappoamidi 17,0 g laktobiono-1,5-laktonia suspendoidaan 100 ml:aan amiinivapaata dimetyyliformamidia, lisätään 2,9 g 1,6-di-aminoheksaania ja saatua seosta sekoitetaan 6 tuntia 20 CG166 80°C:ssa. Sitten seos jäähdytetään, suodatetaan ja suodos sekoitetaan 1 litraan dietyylieetteriä. Osittain öljy-mäinen sakka liuotetaan 50 ml:aan vettä ja käsitellään 80 ml:lla ioninvaihdinta (Merck 4765, H+-muoto). Seos suodatetaan ja lyofilisoidaan, jolloin saadaan 19,5 g värintöntä jauhetta, joka hajoaa 175°C:sta lähtien muodostaen ruskeata väriä.

IR: υ = 2930, 2860, 1645, 1548, 1080 cm"1 1H-NMR (D20): A 1,0 - 1,8 (m, 8H); 3,25 (t, 4H, 5,5 Hz); 3.3 - 4,1 (m, 2OH); 4,15 (t, 2H, 3 Hz); 4,38 (d, 2H, 3Hz); 4,55 (d, 2H, 7Hz); 4,70 (H20); sisäinen standardi: 3-triemtyylisilyylipropaanisulfonihapon Na-suola 13C-NMR (D20): i 28,19; 30,89; 41,63; 63,68; 64,64; 71,25; 73,06; 73,72; 74,12; 74,96; 75,18; 77,97; 83,61; 106,08; 176,42; sisäinen standardi: CH^OH A51,54

Esimerkki 5 N ,N1 -1,12-dodekaanidiyylibis-/4-Q-^P-qalaktopvranoswli-D-glukonihappoamidi 40,8 g laktobiono-1,5-laktonia suspendoidaan 150 ml:aan amiinivapaata dimetyyliformamidia, lisätään 12,0 g 1,12-diaminododekaania ja saatua seosta sekoitetaan 6 tuntia 60°C:ssa. Saatu seos lisätään tipoittain ja saunalla sekoittaen 1,5 litraan isopropanolia. Sakka pestään isopropanolilla ja liuotetaan 250 ml:aan vettä. Liuos käsitellään ensin 20 ml:11a hapanta ioninvaihdinta (Lewa-tit S 100) ja sen jälkeen emäksisellä ioninvaihtimella (Merck 4767). Kun lyofilisoidaan, saadaan 35,0 g väritöntä jauhetta.

Sulamispiste: 70 - 81°C

IR: l> = 2920, 2850, 1645, 1550, 1080 cm"1 1H-NMR (D2O):60,8 - 1,9 (m, 20H); 3,24 (t, 4H, 5,5Hz); 3.4 - 4,1 (m, 20H); 4,17 (t, 2H, 3Hz); 4,38 (d, 2H, 3Hz); 4,55 (d, 2H, 7Hz); 4,68 (H20, sisäinen standardi) 13C-NMR (D20): i 29,02; 31,36; 31,70; 41,86; 63,64; 64,69; 71,20; 73,08; 73,72; 74,17; 75,03; 75,20; 77,97; 83,72; 21 C 31 6 6 106,12; 176,24; sisäinen standardi: CH^OH Γ. 51,56.

Esimerkki 6 N,N1-1,9-nonaanidiyylibis-/4-0-^-D-galaktopyranosyyli-D- glukonihappoamidi

Valmistus ja puhdistus suoritetaan analogisesti verrattuna esiemrkkiin 5. 15,0 g otsikon yhdistettä saadaan 15,0 g:sta laktobiono-1,5-laktonia ja 3,47 g:sta 1,9-diamino-nonaania.

IR: u = 2930, 2860, 1660, 1545, 1080 cm"1 1H-NMR (D20): S 0,9 - 1,8 (m, 14H); 3,20 (t, 4H, 5,5

Hz); 3,3 - 4,1 (m, 20H); 4,15 (t, 2H, 3Hz); 4,38 (d, 2H, 3Hz); 4,55 (d, 7Hz); 4,68 (H20, sisäinen standardi)

Esimerkki 7 N,N1-1,12-dodekaanidiyylibis-( 4-O-jfo -qlukopyranosyyli-D-glukonihappoamidi) 2,04 g sellobiono-1,5-laktonia (H.W. Diehl et ai., Carbo-:Y: hydr. Res. 38, 364 (1974)) saatetaan reagoimaan 0,60 g:n kanssa 1,12-diaminododekaania analogisesti verrat-. .·. tuna esimerkkiin 5, jolloin saadaan 0,60 g otsikon yhdis- tettä.

IR: »> = 2925, 28S0, I645, 1545, 1075, 1040 cm"1 1H-NMR (D20): S 0,7 - 1,9 (m, 20H); 3,0 - 4,6 (m, 30H); 4,68 (H20 sisäinen standardi)

Esimerkki 8 Ν,Ν*-1,12-dodekaanidiyylibis-(4-0-&-D-qlukopyranosyyli-D-glukonihappoamidi 20,0 g kalsiummaitobionaattia (W.N. Emmerling, B. Pfanne-miiller, Starch 32, 202 (1981)) saatetaan reagoimaan 1,12-diaminododekaanin kanssa analogisesti esimerkkiin 3 ver-: rattuna, jolloin saadaan 17,8 g tuotetta.

22 18166 IR: ι) = 2925, 2850, 1650, 1545, 1145, 1075, 1030 cm'1 1H-NMR (D20): & 0,7 - 1,9 (m, 20H); 3,20 (t, 4H, 5,5Hz); 3.3 - 4,4 (m, 24H); 5,15 (d, 2H, 3Hz ); 4,68 (H20, sisäinen standardi)

Esimerkki 9 N,Ν' -1,12-dodekaanidiyylibis-( 6-0-<*-D-galaktopyranosyyli-D-glukonihappoamidi) 3,96 g kaliummelibionaattia (Sigma Chemie) saatetaan reagoimaan 1,00 g:n kanssa 1,12-diaminododekaania analogisesti verrattuna esimerkkiin 3, jolloin saadaan 3,3 g otsikon yhdistettä.

Sulamispiste: 114-123°C

IR (KBr): P = 2925, 1855, 1645, 1550, 1150, 1080, 1030, 980 cm"1 1H-NMR (D20): 6 0,8 - 1,8 (m, 20H); 3,20 (m, 4H) ; 3,4 - 4,2 (m, 22H); 4,29 (d, 2H, 3Hz); 4,95 (s, 2H); 4,68 (H20, sisäinen standardi)

Esimerkki 10 N, Ν' -1,3-propaanidiyylibis-(6-O-ct-D-galaktopyranosyyli-D-glukonihappoamidi

Valmistus on analoginen esimerkkiin 9 verrattuna. 3,0 g tuotetta saadaan 3,96 g:sta kaliummelibionaattia ja O, 37 g:sta 1,3-diaminopropaania.

Sulamispiste: 90 - 96°C

IR (KBe): V = 2925, 1645, 1550, 1152, 1080, 1030, 975 cm 1 1H-NMR (D20): 6 1,76 (dt, 2H, 6,5Hz); 3,30 (t, 4H, 6,5Hz); 3.4 - 4,2 (m, 22H); 4,33 (d, 2H, 3Hz); 4,96 (s, 2H); 4,70 (H20, sisäinen standardi) 13C-NMR (D20): h 30,73; 38,96; 63,75; 70,94; 74,13; 71,90; 72,12; 73,06; 73,52; 74,52; 75,97; 100,99; 176,91

Esimerkki 11 N,Ν' - 0(,¾1 -m-ksyleenidiyylibis-/4-0-l-D-qalaktopyranosyyli- D-qlukonihappoamidi 23 O C1 66

Kun 17,0 g laktobiono-1,5-laktonia ja 3,3 ml 3-(aminome-tyyli)bentsyyliamiinia käytetään esimerkin 5 mukaisessa menetelmässä, saadaan 12,2 g otsikon yhdistettä samalla tavoin värittömänä jauheena.

IR: M = 2920, 1665, 1545, 1080 cm"1 1H-NMR (D20): 6 3,3 - 4,6 (m, 30H); 4,68 (iUO); 7,24 (m, 4H)

Esimerkki 12 N,N' -4,4 1 -disykloheksyylimetaanidiwlibis-/4-Q-/3-D-qalakto-pyranosyyli-D-glukonihappoamidi

Valmistus ja puhdistus tapahtuvat esimerkin 5 mukaisesti lähtemällä 17,0 g:sta laktobiono-1,5-laktonia ja 5,3 g:sta 4,4'-diaminodisykloheksyylimetaania.

Saanto: 21,3 g IR: V = 2930, 2850, 1645, 1545, 1080 cm"1 1H-NMR (D20): S 0,6 - 2,2 (m, 2 H); 3,2 - 4,6 (m, 28H); 4,68 (H2) . Esimerkki 13 N,N1-1,6-(3 .4-ditiaheksaanidiyylibis) -4-Q-/#-D-qalaktopyra-nosyyli-D-qlukonihappoamidi 6,9 ml trietyyliamiinia lisätään huoneenlämpötilassa seokseen, jossa on 17,0 g laktobiono-1,5-laktonia ja 5,63 g kystamiinidihydrokloridia 50 ml:ssa amiinivapaata dime-tyyliformamidia, ja saatua seosta sekoitetaan 6 tuntia 60°C:ssa. Sitten seos saostetaan käyttämällä 500 ml etanolia ja saatu sakka jatkokäsitellään samoin kuin esimerkissä 5. Näin saadaan 13,2 g valkoista jauhetta.

IR: 0 = 2925, 1650, 1545, 1080 cm"1 ,, R8166 24 1H-NMR (D20 ): b 2,90 (t, 4H, 6Hz ) ; 3,2 - 4,1 (m, 24H); 4,16 (t, 2H, 3HZ); 4,38 (d, 2H, 3Hz); 4,55 (d, 2H, 7Hz); 4,68 (H20, sisäinen standardi)

Esimerkki 14 N,Ν' -1,7- ( 4-atsaheptaanidiyylibis) -4-0-y5-D-galaktopyrano-syyli-D-glukonihappoamidi 17,0 g laktobiono-1,5-laktonia suspendoidaan 100 ml:aan amiinivapaata dimetyyliformamidia, lisätään 2,28 ml bis-(3-aminopropyyli)amiinia huoneenlämpötilassa ja saatua seosta sekoitetaan 10 tuntia. Tämän jälkeen sekoitetaan 4 tuntia 40°C:ssa ja suodatetaan. Suodos sekoitetaan 900 ml:aan asetonia, jolloin saadaan 23,0 g valkoisia kiteitä asetonipesun ja kuivauksen jälkeen. Nämä kiteet liuotetaan 80 ml:aan vettä ja seostetaan käyttämällä 900 ml asetonia. Osittain öljymäinen sakka liuotetaan 150 ml:aan vettä, suodatetaan ja lyofilisoidaan. Saanto: 16,5 g.

IR: » = 2920, 1650, 1545, 1080 cm'1 1H-NMR (D20): S 1,82 (d, 4H, 6Hz); 2,91 (t, 4H, 6Hz) ; 3,30 (t, 4H, 6Hz); 3,45 - 4,6 (m, 26H); 4,68 (H20)

Esimerkki 15 N,N'-1,12-(4,9-dioksadodekaanidiyylibis)-4-O-yfo-qalakto-pyranosyyli-D-glukonihappoamidi

Valmistus ja puhdistus suoritetaan analogisesti verrattuna esimerkkiin 5. 18,9 g otsikon yhdistettä saadaan 17,0 g:sta laktobiono-1,5-laktonia ja 5,1 g:sta 1,12-diamino- 4,9-dioksadodekaania.

1H-NMR: $ 1,4 - 2,0 (m, 8H); 3,1 - 4,1 (m, 32H); 4,6 (t, 2H, 3Hz); 4,38 (d, 2H, 3Hz); 4,55 (d, 2H, 7Hz)

Esimerkki 16 N,N'-dimetyyli-Ν,Ν1-1,2-etaanidiyylibis-(4-0-/?-D-qalakto- { η λ s s 25 ' ^ t o pyranoswli-D-glukonihappoamidi)

Valmistus ja puhdistus suoritetaan analogisesti verrattuna esimerkkiin 5. 3,0 g otsikon yhdistettä saadaan 3,40 g:sta laktobiono-1,5-laktonia ja 0,44 g:sta N,N'-dimetyylietyleenidiamiinia.

Sulamispiste: 125 - 133°C

IR (KBr): V = 2930, 1640, 1400, 1075 cm-1 1H-NMR (D20): 6 2,99, 3,16 (2s, 6H); 3,3 - 4,3 (m, 28H); 4,49 (d, 2H, 7Hz); 4,68 (H20, sisäinen standardi)

Esimerkki 17 N,Ν'-1,5-(1-etoksikarbonyyli)pentaanidiyylibis-(4-0-/3--D-qalaktopyranosvvli-D-qlukonihappoamidij 2,47 g lysiinin etyyliesteridihydrokloridia suspendoi-daan 40 ml:aan amiinivapaata dimetyyliformamidia, lisätään 3,0 ml trietyyliamiinia ja saatua seosta sekoitetaan 15 minuuttia. Sitten lisätään 6,8 g laktobiono-1,5-laktonia, saatu seos lämmitetään 60°C:seen ja sekoitetaan . . 1 vuorokausi. Sitten seos suodatetaan ja suodos sekoite- taan 400 ml:aan isopropanolia. Sakka kerätään talteen, ‘ liuotetaan 60 ml:aan dimetyyliformamidia ja saostetaan uudestaan käyttämällä 300 ml isopropanolia. Saostus tois-tetaan, sakka pestään isopropanolilla ja dietyylieetteril-: lä, jolloin saadaan 4,05 g valkoista jauhetta.

: Sulamispiste: 106°C

IR: *» = 2930, 1735, 1655, 1550, 1075 cm-1 1H-NMR (D20): ^ 1,25 (t, 3H, 7Hz); 1,22 - 2,2 (m, 6H); .·:·! 3,25 (t, 2H, 5,5Hz); 3,4 - 4,6 (m, 29H); 4,68 (HjO, sisäinen standardi) **·"- Esimerkki 18

Dekanatrium N,N1 -1,3-propaanidiwlibis-(2,3,4,5,6-penta-Q-sulfo-D-glukonihappoamidi 26 P.3166 4,30 g N,Ν'-1,3-propaanidiyylibis-D-glukonihappoamidia suspendoidaan 50 ml:aan kuivaa dimetyyliformamidia, lämmitetään 40°C:seen ja lisätään 23,9 g pyridiini-rikkitriok-sidikompleksia samalla sekoittaen. Muutaman minuutin kuluttua tuote saostuu pyridiumsuolamuodossa, joka on öljy. 1 tunnin kuluttua seoksen annetaan jäähtyä ja emäliuos dekantoidaan pois. Öljy liuotetaan 50 ml:aan vettä ja pH säädetään arvoon 10 lisäämällä 6 N natrium-hydroksidiliuosta. Liuos täytetään 90 ml:ksi vedellä ja sekoitetaan 350 ml:aan 1 %:sta natriumasetaattiliuosta. Sakka pestään metanolilla ja kuivataan. Näin saadaan 18,6 g väritöntä jauhetta. Tämä liuotetaan 186 ml:aan vettä. Liuokseen sekoitetaan 227 ml metanolia ja annetaan seisoa 15 tuntia. Emäliuos dekantoidaan laskeutuneesta öljystä ja viimeksimainittu hierretään metanoliin. Saostus toistetaan, kunnes otsikon yhdiste on puhdasta.

Tuote hajoaa 190°C:sta muuttuen samalla väriltään ruskeaksi. IR (KBr): *.2960, 1670, 1555, 1250, 1073, 1045, 1019, 770 cm ^ XH-NMR (D20): /'il,87 (dt, 2H, 7Hz); 3,36 (dt, 4H, 7Hz); 3,9 - 4,6 (m, 4H); 4,8 - 5,4 (m, 8H); 4,68 (H20, sisäinen standardi).

/<x/2q = +26,2 (c = 5 vedessä)

Alkuaineanalyysi: laskettu: N 22,10 % S 1,93 % löydetty N 22,29 % S 1,83 % 13C-NMR (D-Gi: 6 29,97; 39,69, 69,06; 77,68; 78,10;

78,39; 79,65; 171,33; sisäinen standardi CH2OH

*51,56

Esimerkki 19

Dekanatrium N,Ν'-1.12-dodekaanidiyylibis-(2,3,4,5,6-penta- O-sulfo-D-qlukonihappoamidi) 5,60 g N,N'-1,12-dodekaanidiyylibis-D-glukonihappoamidia saatetaan reagoimaan 25,5 g:n kanssa pyridiini-rikkitriok- 27 o 01 66 sidikompleksia ^lalogisesti esimerkkiin 18 verrattuna, jolloin saadaan 20,5 g epäpuhdasta tuotetta.Puhdas tuote saadaan suorittamalla geelikromatografia vesiliuoksena Sephadex G 25-pylväässä. Kun pakkaskuivataan, saadaan värintöntä jauhetta, joka hajoaa välillä 175 - 189°C värjäytyen ruskeaksi.

IR (KBr) : «> = 2930, 2855, 1665, 1555, 1250, 1072, 1042, 1010 cm ^ 1H-NMR (D20): δ 1,0 - 19 (m, 20H); 3,32 (m, 4H); 4,2 - 4,6 (m, 4H) ; 4,9 - 5,3 (m, 8H) ; 4,68 (i^O sisäinen standardi) 13C-NMR (D20): < 28,72; 30,52; 31,02; 42,30; 69,22; 77,67; 78,34; 78,65; 79,91; 171,09; sisäinen standardi CH3OH <51,56.

Esimerkki 20

Heksadekanatrium N,Ν'-1,3-propaanidiyylibis-/2,3,5,6-tetra-O-sulf0-4-0-(2,3,4,6-tetra-O-sulfo-^-D-qalaktopyra-nosyyli)-D-glukonihappoamidi/ ·'·' 79,1 g kalsiumlaktobionaattia liuotetaan 240 ml:aan vettä * " ja saatu liuos käsitellään 240 ml:11a Lewatit S 100:aa (H+-muoto). Ioninvaihdin pestään käyttämällä 3 x 200 1' ml vettä ja yhdistetyt liuokset väkevöidään niin pitkälle Y: kuin mahdollista. Lasimainen jäännös liuotetaan 700 ml:aan amiinivapaata dimetyyliformamidia ja kuumennetaan kiehumispisteeseen 600 ml:ssa n-heksaania vedenerottajassa. Kun veden erottuminen on tapahtunut täydellisesti, n-heksaani haihdutetaan pois ja liuokseen lisätään huoneenlämpötilassa liuos, jossa on 7,7 g 1,3-diaminopropaania 50 ml:ssa dimetyyliformamidia. Saatua seosta sekoitetaan 5 tuntia 60°C:ssa ja sen jälkeen sen annetaan jäähtyä noin 30°C:een ja laimennetaan 450 ml:11a dimetyyliformamidia ja sen jälkeen lisätään nopeasti erissä ja samalla sekoittaen 400 g pyridiinirikkitrioksidikompleksia. Saatua seosta sekoitetaan 1 tunti välillä 40 - 45°C ja sen jälkeen 28 C8166 annetaan jäähtyä. Emäliuos dekantoidaan laskeutuneesta öljystä, joka liuotetaan 500 ml:aan vettä ja liuoksen pH säädetään arvoon 10 lisäämällä 30 %:sta natriumhydrok-sidiliuosta. Liuos täytetään vedellä 1,5 litran tilavuuteen ja sekoitetaan 4,5 litraan 1 %:sta natriumasetaatin metanoliliuosta. Sakkaa sekoitetaan 1 litran kanssa metanolia, suodatetaan imulla ja kuivataan. Näin saadaan 1250 g kellertävää jauhetta. Tämä liuotetaan 2 litraan vettä, lisätään 250 ml 30 %:sta vetyperoksidia ja saatua seosta sekoitetaan 1 tunti 45°C:ssa. Seos jäähdytetään, neutraloidaan ja täytetään 2,5 litraksi vedellä. Saatu liuos sekoitetaan 3,06 litraan metanolia ja annetaan seisoa 15 tuntia. Emäliuos dekantoidaan laskeutuneesta öljystä ja viimeksimainittu hierretään metanolin kanssa. Kuivauksen jälkeen saadaan 188,5 g väritöntä jauhetta. Saostusmenettely toistetaan neljä kertaa, jolloin saadaan lopputulokseksi noin 50 g otsikon tuotetta puhtaana värittömänä jauheena, joka muuttuu ruskeaksi 172°C:r. yläpuolella, mutta ei sula alle 250°C:ssa.

IR (KBr): P = 2965, 1665, 1552, 1250, 1055, 1020/927, 820 cm”1 1H-NMR<1 (D20) : / 1,82 (t, 2H, 6,5Hz); 3,35 (t, 4H, 6,5Hz); 3,9 - 4,4 (m, 8H); 4,4 - 4,8 (m, + HjO-signaali kohdassa 4,68 sisäisenä standardina); 4,8 - 5,4 (m, 10H) 13C-NMR (D20): b 30,31; 39,77; 68,36; 68,92; 74,22; 77,49; 77,79; 78,39; 78,76; 80,15; 103,55; 171,76; sisäinen standardi: CH^OH S 51,56 /a/^Q = +13,3° (c = 5 vedessä)

Alkuaineanalyysi: laskettu: N 1,17 % S 21,49 % löydetty: N 1,16 % S 21,61 %

Esimerkki 21

Pentadekanatrium pentadeka-O-sulfo-N.N'-1,3-propaanidiyy-libis( 4-O-ft-D-qalaktopyranosyyli-D-glukonihappoamidi) 29 C3166 3,77 g Ν,Ν-1,3-propaanidiyylibis( 4-0-/J-D-galaktopyranosyy-li-D-glukonihappoamidia) liuotetaan 60 ml:aan kuivaa dime-tyyliformamidia ja sen jälkeen lisätään erissä samalla 40°C:ssa sekoittaen 13,5 g pyridiini-rikkitrioksidikomp-leksia. 1 tunnin kuluttua seos käsitellään samoin kuin esimerkissä 18, jolloin saadaan 10,3 g kellertävää, sulfaat-tipitoista epäpuhdasta tuotetta. Tämä liuotetaan 90 ml:aan vettä, lisätään 10 ml 30 %:sta vetyeproksidia ja saatua seosta sekoitetaan 1 tunti 45°C:ssa. Jäähdytyksen jälkeen sekoitetaan mukaan 230 ml metanolia ja saadun seoksen annetaan seisoa 15 tuntia. Emäliuos dekantoidaan pois laskeutuneesta öljystä ja viimeksimainittu hierretään käyttämällä metanolia, jolloin saadaan 6,72 g sulfaat-tivapaata tuotetta (rikkipitoisuus 20,6 %). Tämä liuotetaan 67 ml:aan vettä, mukaan sekoitetaan 82 ml metanolia ja saadun seoksen annetaan seisoa 15 tuntia. Emäliuos dekantoidaan laskeutuneesta öljystä ja mukaan sekoitetaan vielä 74 ml metanolia. 15 tunnin kuluttua öljy eristetään ja sille suoritetaan farktionaalinen kiteytys useita kertoja kuten edellä, jotta otsikon yhdiste saadaan puhtaana. Näin saadaan 0,53 g värintöntä jauhetta, joka hajoaa 180°C:sta lähtien värjäytyen ruskeaksi.

IR (KBr): V = 2960, 1660, 1550, 1250, 1055, 1020, 930, ' j # 8 2 0 cm 3 1H-NMR (D20): b 1,87 (t, 2H, 6Hz); 3,42 (t, 4H, 6Hz) ; 3,9 - 4,5 (m, 8H); 4,5 - 4,85 (m + H20-signaali kohdassa 4,68 sisäisenä standardina); 4,85 - 5,3 (m, 10H); 13C-NMR (D20): 6 30,53; 39,79; 68,46; 69,11; 72,28; 74,36; 74,56; 77,43; 77,88; 78,14; 78,49; 79,03; 79,61; 79,84: 80,43: 103,45; 171,82: 172,61: sisäinen standardi CH3OH $51,56 Alkuaineanalyysi . laskettu: N 1,23% S 21,04% löydetty: N 1,21 % S 20,91 % 30 ί 0 1//- (-0 100

Esimerkki 22

Heksadekamorfolinium N,Ν'-1,3-propaanidiyylibis-/2,3,5,6-tetra-O-sulfo-4-CH 2,3,4,6-tetra-O-sulfo-/3-P-qalaktopyra-nosyyli)-D-qlukonihappoamidi/

Liuosta, jossa on 1,76 g esimerkin 20 mukaista natriumsuo-laa, käsitellään 15 minuuttia 16 ml:11a Lewtit S-100:aa (H+-muoto), ioninvaihdin suodatetaan pois ja suodokseen lisätään 1,03 g morfoliinia. Kun pakkaskuivataan, saadaan 2,40 g kellertävää jauhetta. Hajoaa 120°C:sta lähtien ja värjäytyy mustaksi 210°C:ssa.

IR (KBr): />«2950, 2780, 1665, 1563, 1450, 1426, 1250, 1097, 1015, 925, 893, 868, 810 cm-1 1H-NMR (D20): 6 1,82 (dt, 2H; 6,5Hz); 3,15 (m, 64H); 3,35 (m, 4H); 3,90 (m, 64H); 4,0 - 4,4 (m, 8H); 4,4 - 4.8 (m, +H20-signaali kohdassa 4,70 sisäisenä standardina); 4.8 - 5,4 (m, 10H)

Esimerkki 23

Heksadekanatrium N,N'-1,6- heksaanldiyylibis /2,3,5,6-tetra- O-sulf O-4-0- (2,3,4,6-tetra-O-sulf o-/*-D-galaktopyranosyy-li)-D-qlukonihappoamidi/ 16,3 g N,Ν'-1,6-heksaanidiyylibis(4-O-^-D-galaktopyrano-syyli-D-glukonihappoamidia)saatetaan reagoimaan 75,0 g:n kanssa pyridiini-rikkitrioksidikompleksia analogisesti verrattuna esimerkkiin 18. Ensimmäisessä saostuksessa saadaan 56,9 g kellertävää jauhetta, joka puhdistetaan samoin kuin esimerkissä 20. Lopuksi saadaan noin 15 g puhdasta otsikon yhdistettä värittömänä jauheena, joka sintrautuu 120°C:sta alkaen. Hajoaminen 170°C:sta alkaen ruskeaksi värjäytyen.

IR (KBr): V = 2930, 2860, 1655, 1550, 1250, 1055, 1020, 928, 810 cm 1 1H-NMR (D20): <i 1,1 - 1,9 (m, 8H) ; 3,37 (m, 4H) ; 3,9 - 4,5 (m, 8H); 4,5 - 4,85 (m + H20-signaali kohdassa 4,68 sisäisenä standardina); 4,85 - 5,3 (m, 10H) '•>0 Λ tl ' 31 loo 13C-NMR (D20): i 28,42; 30,74; 42,17; 68,56; 69,01; 74,39; 77,20; 77,80; 78,37; 78,94; 80,47; 103,21; 171,27; sisäinen standardi CH^OH $51,56 /0(/20 = +9,9 (c = 5 vedessä)

Esimerkki 24

Heksadekanatrium Ν,Ν'-1,9-nonaanidiyylibis/2,3,5,6-tetra- O-sulf 0-4-O- ( 2,3,4,6-tetra-O-sulf o-/3-D-galaktopyranosw-li)-D-qlukonihappoamidi)

Valmistus ja puhdistus ovat analogiset verrattuna esimerkkiin 23. 45,0 g epäpuhdasta tuotetta saadaan 15,0 g:sta N,N' -1,9-nonaanidiyylibis( 4-0-/J-D-galaktopyranosyyli-D-glu-konihappoamidia) ja 63,0 g:sta pyridiini-rikkitrioksidi-kompleksia. Puhdistuksen jälkeen saadaan 10,5 g väritöntä jauhetta. Hajoaminen välillä 192 - 210°C ruskeaksi värjäytyen.

IR (KBr): 0-2935, 2850, 1665, 1555, 1250, 1057, 1020, 925, 815 cm"1 1H-NMR (D20): % 0,9 - 1,9 (m, 14H); 3,29 (t, 4H, 6,5 :Y; Hz); 3,8 - 4,45 (m, 8H); 4,45 - 4,8 (m +H20-signaali ·:·. kohdaassa 4,68 sisäisenä standardina); 4,8 - 5,4 (m, 10H) 13C-NMR (D20); $ 28,77; 30,83; 31,09; 31,32; 42,19; ; 68,69; 68,99; 74,46; 77,12; 77,79; 78,33; 78,93; 80,51; 103,11; 121,21; sisäinen standardi CH^OH i51,56

Esimerkki 25

Heksadekanatrium N.N,-l,12-dodekaanidiwlibis/2.3.5,6-tetra-O-sulf0-4-O-(2,3,4,6-tetra-O-sulfo-^-D-qalakto-pyranosyyli)-D-glukonihappoamidi/

Valmistus ja puhdistus ovat anlogiset verrattuna esimerkkiin 23. 13,30 g epäpuhdasta tuotetta saadaan 4,23 g:sta N,N' -1,12-dodekaanidiyylibis(4-0-/3-D-galaktopyranosyyli-D-glukonihappoamidia) ja 19,1 g:sta pyridiini-rikkitriok- 32 C 31 66 sidikompleksia. Puhdistuksen jälkeen saadaan 3,5 g puhdasta otsikon yhdistetä värittömänä jauheena. Hajoaminen välillä 188 - 198°C ruskeaksi värjäytyen.

IR (KBr): 0 = 2940, 2880, 1665, 1555, 1250, 1055, 1020, 930, 820 cm'1 1H-NMR (D20): h 0,9-1,9 (m, 20H); 3,35 (t, 4H, 6,5Hz); 3,9-4,5 (m, 8H); 4,5-4,8 (m, +H20-signaali kohdassa 4,70 sisäisenä standardina); 4,8-5,4 (m, 10H) 13C-NMR (D20): ä28,74; 30,80; 31,09; 31,44; 42,18; 68,76; 68,96; 74,50; 77,08; 77,80; 78,29; 78,94; 80,51; 103,07; 171,19; sisäisenä standardina CH3OH^51,56

Esimerkki 26

Heksadekanatrium N,Ν'-1,12-dodekaanidivYlibis/2,3,5,6-tet-ra-O-sulf o-O- (2,3,4,6-tetra-O-silf o-/3-D-glukopyranoswli) -D-glukonihappoamidi 0,68 g epäpuhdasta tai 0,10 g puhdasta tuotetta saadaan 0,34 g:sta N,Ν'-1,12-dodekaanidiyylibis( 4-0-/3-D-glukopyra-nosyyli-D-glukoninappoamidia) ja 1,12 g:sta pyridiini-rikkitrioksidikompleksia kuten esimerkissä 23. Hajoaminen väliltä 148 - 159°C ruskeaksi värjäytyen.

IR (KBr) V = 2930, 2855, 1670, 1560, 1250, 1070, 995, 935, 800 cm 1 1H-NMR (D20): S 0,8 - 1,8 (m, 20H); 3,30 (m, 4H); 3,7 - 4,8 (m + H20-signaali kohdassa 4,68 sisäisenä standardina); 4,8 - 5,3 (m, 10H) 13C-NMR (D20): £28,92; 30,95; 31,32; 31,64; 42,34; 69,20; 70,12; 75,57; 77,44; 77,67; 77,85; 79,33; 79,41; 79,97; 81,08; 102,53; 171,27; sisäinen standardi CH^OHi 51,56

Esimerkki 27

Heksadekanatrium N,Ν'-1,12-dodekaanidiyylibis/2,3,5,6-tet-ra-O-sulf0-4-0-(2,3,4,6-tetra-O-sulfo-^-D-qlukopyranosvy-li)-D-glukonihappoamidi/ 47,5 g epäpuhdasta tai 3,0 g puhdasta tuotetta saadaan 12,8 g: s ta N, Ν' -1,12-dodekaanidiyylibis (4 -O-0(-D-glukopyr anosyy-li-D-glukonihappoamidia) ja 64,6g:sta pyridiinirikkitriok- 33 C 31 6 6 sidikompleksia samoin kuin esimerkissä 23. Hajoaminen 175 - 189°C:sta lähtien ruskeaksi värjäytyen.

IR (KBr): * = 2930, 2860, 1660, 1560, 1250, 1000, 943, 805 cm-·1 1H-NMR (D20): S 1,0 - 1,9 (m, 20H); 3,27 (m, 4H); 4,0 - 4,82 (m + signaali H20:lle kohdassa 4,68 sisäisenä standardina); 4,82 - 5,25 (m, 10H); 5,52 (d, 2H, 3Hz) 13C-NMR (D20): §28,84; 30,69; 31,15; 31,47; 42,41; 68,51; 69,29; 71,95; 76,14; 76,82; 77,91; 78,30; 78,44; 79,98; 98,93; 171,27

Esimerkki 28

Heksadekanatrium N,Ν'-1,12-dodekaanidiyylibis/2,3,4> 5-tetra- O-sulfO-6-0-(2,3,4,6-tetra-O-sulfo-^-D-galaktopyranosyy-li)-D-qlukonihappoamidi/ 9,7 g epäpuhdasta tai 3,4 g puhdasta tuotetta, joka sint-rautuu 57°C:ssa, saadaan analogisesti verrattuna esimerkkiin 23 3,30 g:sta N,Ν'-1,12-dodekaanidiyy Iibis ( 6-0- ~ D-galaktopyranosyyli-D-glukonihappoamidia) ja 14,9 g:sta pyridiini-rikkitrioksidikompleksia. Hajoaminen 182°C:sta ruskeaksi värjäytyen.

IR (KBr): u = 2930, 2855, 1650, 1555, 1250, 1050, 1027, .·. 830 cm"1 1H-NMR (D20): S 1,0 - 1,9 (m, 20H); 3,25 (m, 4H); 2,9 - 4,4 (m, 8H); 4,4 - 4,8 (m + HjO-signaali kohdassa 4,68 sisäisenä standardin); 4,8 - 5,25 (m, 10H); 5,38 (d, 2H, 3Hz) 13C-NMR (D20): S 28,72; 30,58; 31,03; 31,34; 42,30; 69,14; 69,77; 70, 66; 74,51; 74,92; 77,91; 78,21; 78,49; 78,93; 80,75; 99,12; 171,26; sisäisenä standardina CH^OH £ 51,56

Esimerkki 29

Heksadekanatrium N,N1 -1,3-propaanidiwlibis/2,3,4,5-tetra- O-sulf O-6-0- (2,3,4,6-tetra-O-sulf o-4to-qalaktopyranoswli) - 34 r ο, η ,- /- (. ό 10 0 D-qlukonihappoamidi 0,96 g epäpuhdasta tai 0,50 g puhdasta tuotetta saadaan 0,34 g:sta N,N' -1,3-propaanidiyylibis/6-0-e<-D-galakto-pyranosyyli-D-glukonihappoamidia) ja 2,0 g:sta pyridiini-rikkitiroksidikompleksia kun toimitaan analogisesti esimerkkiin 23 verrattuna. Hajoaminen 168°C:sta ruskeaksi värjäytyen.

IR (KBr): V = 1640, 1550, 1250, 1050, 1025, 830 cm-1 1H-NMR (D20): l 1,85 (t, 2H, 6,5Hz); 3,35 (t, 4H, 6,5Hz); 3,9 - 4,4 (m, 8H); 4,4 - 4,8 (m + ^O-signaali kohdassa 4.68 sisäisenä standardina); 4,8 - 5,25 (m, 10H); 5,36 (d, 2H, 3Hz) 13C-NMR (D20): S 30,13; 39,84; 69,17; 69,86; 70,74; 74,53; 74,97; 78,00; 78,17; 78,37; 79,00; 80,81; 99,18; 171,70; sisäinen standardi CH-jOH S 51,hl

Esimerkki 30

Heksadekanatrium N,N1 -ct.ft1 -m-ksyleenidiyylibis/2,3,5,6-tetra-O-sulfo-4-O-(2,3,4,6-tetra-O-sulf o-/3-P-qalaktopyra-nosyyli)-D-glukonihappoamidi/ 28.0 g epäpuhdasta tai 5,3 g puhdasta tuotetta saadaan 12.0 g:sta N,N'-*,<*' -m-ksyleenidiyylibis(4-0-/3-D-galakto-pyranosyyli-D-glukonihappoamidia) ja 58,8 grsta pyridiini-rikkitrioksikompleksia analogisesti verrattuna esimerkkiin 23. Hajoaminen 157°C:sta lähtien ruskeaksi värjäytyen.

IR (KBr): Jt = 2960, 1660, 1550, 1250, 1055, 1020, 930, 815 cm 1 *H-NMR (D20): i 3,9 - 4,85 (m+ H20-signaali kohdassa 4.68 sisäisenä standardina); 4,85 - 5,4 (m, 10 H); 7,38 (s, 4H) 13C-NMR (D20): h 45,51; 68,63; 69,15; 74,42; 77,24; 77,67; 77,91; 78,49; 79,08; 80,70; 103,29; 128,15; 128,86; 131,64; 140,80; 171,88; sisäisenä standardina CH3OH S 51,56 35 03166

Esimerkki 31

Heksadekanatrium Ν,Ν-4,41-disykloheksyylimetaanidiyy-libis/2,3,5,6-tetra-O-sulfo-4-O-(2,3,4,6-tetra-Olsulfo- /3 --D-galaktopyranosyyli)-D-glukonihappoamidi 70,7 g epäpuhdasta tai 15,2 g puhdasta tuotetta, joka sintrautuu 120°C:sta lähtien, saadaan analogisesti verrattuna esimerkkiin 23 25,7 g:sta N,N'-4,4'-disyklohek-syylimetaanidiyylibis (4-0-/i-D-galaktopyranosyyli-D-gluko-nihappoamidia) ja 114,7 g:sta pyridiini-rikkitrioksidi-kompleksia. Hajoaminen 180°C:sta ruskeaksi värjäytyen.

IR (KBr): l> = 2930, 2860, 1660, 1550, 1250, 1055, 1020, 928, 815 cm-1 1H-NMR (D20): S 0,6 - 2,4 (m, 20H); 3,65 (m, 2H); 3,9 - 4,5 (m, 8H); 4,5 - 4,85 (m + ^O-signaali kohdassa 4,68 sisäisenä standardina); 4,85 - 4,4 (m, 10H) 13C-NMR (D20): i30,18; 30,36; 30,75; 34,09; 44,40; 46,20; 49,45; 52,33; 68,27; 68,75; 74,35; 77,80; 78,41; 78,68; 79,49; 104,09; 170,61; sisäinen standardi CH^OH δ 51,56 = (c = 5 vedessä)

Esimerkki 32

Heksadekanatrium N,N'-1,6-(3,4-ditiaheksaanidiyylibis)-/2,3,5,6-tetra-O-sulfo-4-O-(2,3,4,6-tetra-O-sulfo-fi-D-qalaktopyranosyyli)-D-glukonihappoamidi__ 38,0 g epäpuhdasta ja 8,5 g puhdasta tuotetta saadaan 11,2 g:sta N,N'-1,6-(3,4-ditiaheksaanidiyylibis)4-0-/^-D-galak-topyranosyyli-D-glukonihappoamidia ja 53,4 g:sta pyridii-ni-rikkitrioksidikompleksia analogisesti verrattuna esimerkkiin 23. Hajoaminen 163°C:sta lähtien ruskeaksi värjäytyen.

IR (KBr); P = 2965, 1665, 1550, 1250, 1055, 1015, 930, 810 cm 3 1H-NMR (D20): S 2,96 (t, 4H, 6,5Hz); 3,69 (m, 4H); 4,0 - 4,47 (m, 8H); 4,45-4,8 (m + ^O-signaali kohdassa 36 C3166 4,68 sisäisenä standardina); 4,8 - 5,3 (m, 10H) 13C-NMR (D20): 6 38,72; 41,06; 68,68; 69,05; 74,48; 77,40; 77,87; 78,46; 80,46; 103,48; 171,86; sisäinen standardi CH^OH S 51,56

Esimerkki 33

Heksadekanatrium N,N'-1,7-(4-atsaheptaanidiyylibis)-/2,3, 5,6-tetra-Q-sulfo-4-Q- (2,3,4,6-tetra-O-sulf c-/fl-D-qalak-topyranosyyli)-D-glukonihappoamidi/ 15,4 g epäpuhdasta ja 2,2 g puhdasta tuotetta saadaan 11.0 grsta N,N'-1,7-(4-atsaheptaanidiyylibis)-4-0-/3-D-galaktopyranosyyli-D-glukonihappoamidia ja 50,0 g pyridii-ni-rikkitrioksidikompleksia analogisesti verrattuna esimerkkiin 23. Hajoaminen 165°C:sta ruskeaksi värjäytyen.

IR (KBr): 1> = 2960, 2925, 2855, 1650, 1550, 1250, 1055, 1020, 927, 820 cm"1 1H-NMR (D20): ί 2,(m, 2H); 3,17 (t, 4H, 7Hz); 3,44 (t, 4H, 6Hz); 3,9 - 4,4 (m, 8H); 4,4 - 4,85 (m + H20-sig-naali sisäisenä standardina kohdassa 4,68); 4,85 - 5,3 (m, 10H) 13C-NMR (D20): $ 28,11; 39,08; 48,12; 68,65; 69,24; 74,45; 76,94; 77,93; 78,46; 79,09; 80,71; 103,13; 172,06

Esimerkki 34

Heksadekanatrium N,II1 -1,12-(4,9-dioksadodekaanidiyylibis) -/2,3,5,6-tetra-O-sulf O-4-0- (2,3,4,6-tetra-O-sulf o-/3-D-galaktopyranosyyli)-D-glukonihappoamidi 37.1 g epäpuhdasta ja 9,3 g puhdasta tuotetta, joka sint-rautuu 120°C:sta lähtien, saadaan 18,2 grsta N,N'-1,12- (4,9-dioksadodekaanidiyylibis)4-0-/3-D-galaktopyranosyyli-D-glukonihappoamidia ja 59,0 grsta pyridiini-rikkitrioksi-dikojmpleksia samoin kuin esimerkissä 23. Hajoaminen 170°C:sta ruskeaksi värjäytyen.

IR (KBr); y = 2960, 2880, 1665, 1555, 1250, 1055, 1022, 928, 815 cm"1 37 F 31 66 1H-NMR (D20): S 1,64 (m, 4H); 1,88 (t,4H, 6,5 Hz); 3,0 - 3,9 (m, 12H); 3,9 - 4,45 (m, 8H); 4,45 - 4,8 (m + H20-signaali kohdassa 4,68 sisäisenä standardina); 4,8 - 5,3 (m, 10H) 13C-NMR (DjO): b 27,82; 30,78; 39,02; 68,64; 69,01; 70,54; 72,96; 74,44; 77,02; 77,79; 78,33; 78,94; 80,52; 103,10; 171,45; sisäinen standardi CH^OH 051,56 M/Jo = +9,0 (c = 5 vedessä)

Esimerkki 35

Heksadekanatrium N,N1-dimetyyli-Ν,Ν1-1,2-etaanidiyylibis-/2,3,5,6-tetra-O-sulfo-4-O-(2,3,4,6-tetra-O-sulf 0-/3-P-galaktopyranosyyli)-D-glukonihappoamidi/ 8,2 g epäpuhdasta ja 1,2 g puhdasta tuotetta saadaan 2,50 g:sta N,N1-dimetyyli-N,N'-1,2-etaanidiyylibis(4-0-^-D-galaktopyranosyyli-D-glukonihappoamidia) ja 12,4 g:sta pyridiini-rikkitrioksidikompleksia analogisesti verrattuna esimerkkiin 23. Hajoaminen väliltä 188 -200°C ruskeaksi värjäytyen.

IR (KBr) : v = 2970, 1650, 1250, 1015, 930, 815 cm"1 1H-NMR (D20): b 3,0 - 4,0 (m sisältäen s:n kohdassa 3,35, 10H); 4,0 - 4,7 (m, 14H); 4,70 (H20, sisäinen standardi); 4,9 - 5,4 (m, 10H); 5,54 (d, 2H, 4Hz); 13C-NMR (D20): 6 38,96; 48,28; 68,36; 69,25; 74,17; 75,11; 77,26; 77,73; 78,00; 78,45; 78,76; 79,80; 103,35; 171,25; sisäinen standardi CH-jOH 6 51,56

Esimerkki 36

Heksadekanatrium N,N1-1,5-(1-etoksikarbonyyli)-pentaani-diyylibis/2,3,5,6-tetra-O-sulfo-4-O-(2,3,4,6-tetra-O-sulf o-/3-D-qalaktopyranosyy li )-D-qlukonihappoamidi/ 8,7 g epäpuhdasta ja 1,2 g puhdasta tuotetta, joka sint-rautuu 60°C:sta lähtien, saadaan 3,6 g:sta N,N-1,5-(1-etoksikarbonyyli)-pentaanidiyylibis(4-O-^-D-galaktopyra- 38 C3166 nosyyli-D-glukonihappoamidia) ja 15,8 g:sta pyridiini-rikkitrioksidikompleksia esimerkin 23 mukaisesti. Hajoaminen 161°C:sta lähiten ruskeaksi värjäytyen.

IR (KBr) : l> = 1730, 1650, 1550, 1250, 1055, 1020, 930, 810 cm 1 1H-NMR (D20): i 1,0 - 2,2 (m, 9H, t kohdassa 1,31, 7Hz); 3,30 (m, 2H) ; 3,9 - 4,8 (m, jossa ^O-signaali kohdassa 4,68 sisäisenä standardina), 4,8 - 5,3 (m, 10H) 13C-NMR (D20): h 15,94; 29,68; 30,54; 33,17; 41,87; 55,93; 65,19; 68,23; 68,53; 69,04; 74,36; 77,33; 79,81; 78,45; 78,80; 79,61; 80,47; 103,36; 103,99; 171,39; 171,65; 176,12

Esimerkki 37 N,Ν'-1,3-propaanidiyylibis-D-qlukonihappoamidi 3,56 g D-glukono-jf--laktonia ja 0,84 ml 1,3-diaminopro-paania liuotetaan 40 ml:aan dimetyyliformamidia ja saatua seosta sekoitetaan 6 tuntia 60°C:ssa. Sitten seos sekoitetaan 200 ml:aan isopropanolia ja sakka pestään isopro-panolilla ja dietyylieetterillä. Kiinteä aine liuotetaan 20 ml:aan dimetyyliformamidia ja saostetaan jälleen käyttämällä 200 ml isopropanolia. Sakka liuotetaan veteen ja pakkaskuivataan. Näin saadaan 2,2 g värintönä jauhetta.

Sulamispiste: IR (KBr): 0 = 2930, 2890, 1645, 1545, 1440, 1080 cm"1 1H-NMR (D20): b 1,74 (dt, 2H, 6,5 Hz); 3,27 (t, 4H, 6,5Hz); 3,45 - 4,05 (m, 10H); 4,23 (d, 2H, 6Hz); 4,68 (H20, sisäinen standardi) 13C-NMR (D20): h 30,65; 39,02; 65,13; 72,64; 74,69; 75,00; 75,12; 176,78; sisäinen standardi CH^OH 6 51,56

Esimerkki 38 N,N -1,2-Propaanidiyylibis-D-qalaktonihappoamidi 39 0 3 1 66 4.1 g otsikon yhdistettä saadaan värittömänä jauheena analogisesti esimerkkiin 37 verrattuna 7,12 g:sta D-galaktono-^-laktonia ja 1,48 g:sta 1,2-diaminopropaania. Sulamispiste: 183 - 193°C, jossa hajoaminen ja värjäyty minen ruskeaksi IR (KBr): ^ “ 2940, 1656, 1552, 1109, 1055, 1044, 1028, 865 cm ^ 1H-NMR (D20): λ 1,18 (d, 3H, 6Hz); 3,1 - 4,6 (m, 15H); 4,68 (H20, sisäinen standardi) 13C-NMR (D20): 6 19,64; 19,77; 46,16; 47,87; 48,10; 65,90; 71,93; 72,64; 73,49; 177,75; 178,42; 178,54

Esimerkki 39 - N,Ν'-1,4-butaanidiyylibis-L-mannonihappoamidi 2,4 g otsikon yhdistettä saadaan värittömänä jauheena analogisesti esimerkkiin 18 verrattuna 3,56 g:sta L-manno-no-^-laktonia ja 0,90 g:sta putreskiinia. Hajoaminen lämpötila-alueesta 181 - 188°C lähtien ruskeaksi värjäytyen.

- IR (KBr): »* 2955, 2925, 2855, 1643, 1555, 1231, 1098, 1043, 1031, 880, 740, 640 cm"1 1H-NMR (D20): S 1,58 (m, 4H); 3,30 (m, 4H), 3,75 (m, 8H); 4,02 (d, 2H, 7Hz); 4,26 (d, 2H, 7Hz); 4,68 (H20, sisäinen standardi) 13C-NMR (D20): S 28,42, 41,38; 65,67; 72,58; 72,76; : 73,43; 75,19; 177,09

Esimerkki 40 N, N'-dilaktobionyylihydratsiini 6.1 g epäpuhdasta tuotetta saadaan analogisesti esimerkkiin 37 verrattuna6,8 g:sta laktobiono-1,5-laktonia ja O, 5 ml:sta hydratsiinihydraattia. Kun suoritetaan pyl-väskromatografia Fractogel TSK Hw 40S-pylväässä ja kyl-mäkuivataan, saadaan puhdas tuote värittömänä jauheena.

Esimerkki 41

Dekanatrium N,Ν'-1,3-propaanidiyylibis(2,3,4,5,6-penta-O- sulfo-D-qlukonihappoamidi) 40 Γ 31 66 9.8 g epäpuhdasta tai 6,4 g puhdasta tuotetta saadaan värittömänä jauheena analogisesti verrattuna esimerkkiin 18 2,2 g:sta N,N'-1,3-propaanidiyylibis-D-glukoni-happoamidia ja 12,3 g:sta pyridiini-rikkitrioksidikomp-leksia. Hajoaminen 185°C:sta ruskeaksi värjäytyen.

IR (KBr) : l> = 2960, 1675, 1555, 1250, 1070, 1010, 925, 805 cm"1 1H-NMR (D20): S 1,85 (m, 2H); 3,34 (m, 4H); 4,52 (d, 4H, 3,5Hz); 5,07 (m, 6H); 5,34 (d, 2H, 3,5Hz); 4,68 (H20 sisäisenä standardina) 13C-NMR (D20: b 30,05; 39,62; 68,78; 76,28; 76,41; 77,78; 80,14; 171,15; sisäisenä standardina CH^OH S 51,55

Esimerkki 42

Dekanatrium N,N1-1,2-propaanidiyylibis(2,3,4,5,6-penta- O-sulfo-D-galaktonihappoamidi) 13,0 g epäpuhdasta tai 9,8 g puhdasta tuotetta saadaan värittömänä jauheena analogisesti verrattuna esimerkkiin 18 3,3 g:sta N,N'-1,2-propaanidiyylibis-D-galaktonihappo-amidia ja 19,5 g:sta pyridiini-rikkitrioksidikompleksia. Hajoaminen 191°C:sta ruskeaksi värjäytyen.

IR (KBr): u = 2970, 1665, 1550, 1250, 1065, 1040, 1007, 900 cm"1 1H-NMR (D20): δ 1,26 (d, 3H, 6,5Hz); 2,9 - 4,3 (m, 3H); 4,3 - 4,6 (m, 4H); 4,68 (H20 sisäisenä standardina); 4.8 - 5,3 (m, 8H) 13C-NMR (D20): b 19,20; 45,94; 46,15; 47,61; 69,07; 78,42; 78,86; 79,90; 170,84; 171,03; 191,93; sisäisenä standardina CH^OH h 51,57 41 n Q 1 i?

L· o I O

Esimerkki 43

Dekanatrium Ν,Ν’-1,4-butaanidiyylibis(2,3,4,5,6-penta- O-sulfo-L-mannonihappoamidi) 10.5 g epäpuhdasta tai 7,2 g puhdasta tuotetta saadaan värittömänä jauheena analogisesti verrattuna esimerkkiin 18 2,5 g:sta Ν,Ν’-1,4-butaanidiyylibis-L-mannonihappoami-dia ja 14,1 g:sta pyridiini-rikkitrioksidikompleksia. Hajoaa 180°C:sta lähtien ruskeaksi värjäytyen.

IR (KBr) : l> = 2960, 2930, 2850, 1670, 1555, 1250, 1075, 1010, 925 cm-1 1H-NMR (D20): b 1,65 (m, 4H); 3,31 (m, 4H); 4,43 (m, 4H); 4,8 - 5,08 (m, 4H); 5,15 (m, 4H)? 4,68 (H20, sisäisenä standardina) 13C-NMR (D20): δ 27,98; 41,62; 69,15; 78,81; 79,36; 79,75; 170,93; sisäisenä standardina CH^OH 651,55

Esimerkki 44

Heksadekanatrium Ν,Ν1-bis/2,3,5,6-tetra-Q-sulfo-4-Q-(2,3, 4.6-tetra-0-sulfo-/3-D-qalaktopyranosyyli)glukonoyyli/hydr-·': atsiini 17.5 g epäpuhdasta tai 7,3 g puhdasta tuotetta saadaan analogisesti verrattuna esimerkkiin 18 6,0 g:sta Ν,Ν’ - dilaktobionoyylihydratsiinia ja 33,7 g:sta pyridiini-rikkitrioksidikompleksia.

Esimerkki 45 5,000 kg heksadekanatrium Ν,Ν’-1,3-propaanidiyylibis-/2,3,5,6-tetra-0-sulfo-4-0- (2,3,4,6-tetra-0-sulfo-/J-D-galaktopyranosyyli)-D-glukonihappoamidia/ liuotetaan kuivana aineena ja samalla sekoittaen 40 litraan injek-tiokelpoista vettä. Näin saadun liuoksen pH säädetään laimealla natriumhydroksidiliuoksella arvoon 7,5 ja täytetään 50,00 litraksi injektiokelpoisella vedellä ja suoda- 42 Γ31 66 tetaan kalvosuodattimen läpi, jonka huokoskoko on 0,2 jim. Liuos suodatetaan aseptisissa olosuhteissa 1 ml:n ampulleihin, jotka suljetaan tiiviisti.

Claims (11)

1. Bis-aldonihappoamidit, tunnetut siitä, että ne ovat yleisen kaavan I mukaisia 0 1 1 2 3 N 4 K O — CH., -CH (OH) — CH (OR^) — CH (ORJ ) — CH(OH)— C—N (R )4-A (I) L / J2 12 3 jossa kaavassa joko kaikki ryhmät R , R ]a R ovat vetyä- 12 3 meja tai kaksi ryhmistä R , R ja R edustavat vetyato mia ja kolmas edustaa ryhmää, jonka kaava on jokin kaavoista II - VII ch2oh „tj/» (II) H OH : CHgOH HOy-0 H ]/h \| y ft* (III) jvy i 6h CHgOH H .-0 A \r— ( ) β (IV) \0H Οψ hoY—rH ch2ch C 81 66 tx ... H H ch2oh Γ ch2oh \?Η H/g 0--l\^)H \p-0--(VI) H OH L H OH —lm - CHgOH :H20H ί/Γ~°\|-°__<VII) H / Ov \OH H/l /H \j~b —γ—V \°H H/l HOlN_V H L H OH Jrn H OH m tarkoittaa lukua 0, 1, 2, 3, 4, 5 tai 6, A kaavassa I tarkoittaa suora- tai haaraketjuista, 2 - 22 hiiliatomia sisältävää tyydyttynyttä alkyleeniryh- mää, joka voi haluttaessa olla substituoitu yhdellä tai useammalla ryhmällä -CC^R5, ja tämän alkyleenin voi haluttaessa keskeyttää -O-, -S-, -S-S-, -S(O) -O n II g -C-NH- ja/tai-NR - tai sykloalkyleeni tai aryleeni, joita voi olla korkeintaan viisi, tai A edustaa yksinkertaista sidosta tai ryhmää, jonka kaava on -O- ch2 « G 81 6 6 n on 1 tai 2, 4 5 . 6 ryhmät R , R ja R voivat samanaikaisesti tai kukin toinen toisestaan riippumatta edustaa vetyatomia tai C^ - Cg-alkyyliryhmää, ja näiden yhdisteiden epäorgaanisten tai orgaanis ten emästen kanssa muodostamat suolat, edellyttäen, että bis-glukonihappoamidien ollessa kyseessä 12 3 4 a) ryhmät R , R , R ja R eivät samanaikaisesti ole vetyatomeja, ja että 2 13 4 b) kun R on kaavan II mukainen ryhmä ja R , R ja R ovat samanaikaisesti vetyatomeja, A ei ole ja että 2 c) kun R on kaavan VI mukainen ryhmä, jossa m on 0, 13 4 1. 2, 3 tai 5 ja R , R ja R ovat samanaikaisesti vetyatomeja ja A on substituoimaton, suoraketjuinen alkylee-niryhmä, on ketjun jäsenten lukumäärä pariton luku.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset yhdisteet, tunnetut siitä, että R2 ja R3 ovat vetyatomeja.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukaiset yhdisteet, tunnetut siitä, että R3- tarkoittaa ryhmää III tai ryhmää VI, jossa m = 0.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset yhdisteet, tunnetut siitä, että R1 ja R3 ovat vetyatomeja.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukaiset yhdisteet, tunnetut 2 siitä, että R on ryhmä II tai ryhmä VI, jossa m = 0, tai ryhmä VII, jossa m = 0.

6. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 2-5 mukaiset yhdisteet, tunnetut siitä, että niissä kaavassa I on A polymetyleeniryhmä 3ossa P = 2 - 22.

7. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 2-6 mukaiset yhdisteet, tunnetut siitä, että niissä A kaavassa I on 46 33166 polymetyleeniryhmä -(CH2)p-/ jossa p = 2 - 12.

8. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 2-5 mukaiset yhdisteet, tunnetut siitä, että A kaavassa I on suoraket-juinen, 2-22 hiiliatomia sisältävä alkyleeniryhmä, joka voi olla ryhmien -0-, -S-, -S-S-, -S(0)n~, O Il 6 6 -C-NH- ja/tai -NR - katkaisema, jolloin n ja R ovat patenttivaatimuksessa 1 määriteltyjä.

9. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 6-8 mukaiset yhdisteet, tunnetut siitä, että A kaavassa I on substitu- oitu yhdellä, kahdella tai useammalla ryhmällä -C00R > 5 . λ jossa R on patenttivaatimuksessa 1 määritelty.

10. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisten bis-aldo-nihappoamidien valmistamiseksi, jotka ovat yleisen kaavan I mukaisia, tunnettu siitä, että yleisen kaavan VIII tai IX mukainen aldonolaktoni > / \ (R 0CH_ ) CH CH(OH) %\ J 3 (R 0)CH-CH(0R ) .0 0- Γ 1 -1 / \ j^R 0 — ch2 — cH ( OH )J CH yjH(OH) (IX) ^SCHiOR3 ) 4 4 saatetaan reagoimaan yleisen kaavan R HN-A-NHR mukaisen 4 ;diaminoyhdisteen kanssa, jossa kaavassa R ja A ovat patenttivaatimuksessa 1 määriteltyjä. B3166

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yleisten kaavojen VIII ja IX mukaiset aldo-nolaktonit valmistetaan in situ eliminoimalla vettä vastaavista yleisen kaavan X mukaisista aldonihapoista R10-CH2-CH(0H)-CH(0R2)-CH(0R3)-CH(0H)-C02H (X) ja saatetaan reagoimaan diaminoyhdisteen kanssa eristämättä . G 3166