FI86432B - Foerfarande foer framstaellning av nya tillvaexthormon-frigoerande peptider. - Google Patents

Description

1 86432

Menetelmä uusien kasvuhormonia vapauttavien peptidien valmistamiseksi Käsiteltävänä oleva keksintö koskee menetelmää 5 uusien kasvuhormonia vapauttavien peptidien valmistamiseksi.

Hiljattain (1) R. Guillemin, P. Brazeau, P. Böhlen, F. Esch, N. Ling ja W.B. Wehrenberg (Science, 218, 585 (1982)) ja (2) J. Spiess, J. Rivier, M. Thorner ja W. Vale 10 (Biochemistry, 21, 6037 (1982) ovat eristäneet ja karakterisoineet kasvuhormonia vapauttavia tekijöitä (GRF) ihmisen haimasaarekekasvaimesta (hpGRF) sekä osoittaneet niillä olevan kasvuhormonia (GF) vapauttavaa aktiivisuutta in vivo ja in vitro rotan aivolisäkkeen etulohkossa. Li-15 säksi Spiess et ai. raportoivat viitteessä (2), että synteettisellä hpGRF( 1-29 )-NH2:11a, joka on luonnon hpGRFLb:n amidoitu fragmentti, on täysin sisäsyntyinen biologinen aktiivisuus.

2 86432

' 1 I — I

00 o ao no ao £ ~ 'Z *- — <r u

^ >> CO >. Q

*""* r*~"' r~~* < ϋ < o <

* * ll I

}- ao I- ao u oj u ω u οι < to < to

'1 II I

m 3 33 3 ^ <U —I O)

-3 O JO -J

' I I ( I

^ C C c c ^ o o o o

1 I II I

C ^ C >N

W »—« (/5 ^ u < o < o

1 I I I I

3 U 3 l_ 3 <U 0)0 4)

, to J to J

'1 li I

~ 3 - 3 — CO ^ <0 — Γ3 > o > o >

'1 II I

"j >n « >, (Λ Ή ^ ^

W J O JO J

U) 1 I I I I

C CO C =0 C ao Q) — u — u > < O < O <

M 1 I II I

ω U c U c U CM

5 Λ' —* >* — >^ — g *7 O E- O Hz

o 1 11 II

Jr ^ eO O' uoOC' u cο σ'

(2 ,¾ U CM O U CM CJUfM

"5 V < to < CO < § ' 1 1 ' '1

-H ,n u C u C U

c: J2 0> cc o wo 5 < CO < to <00

...: ' 11 I I

" · c ^ u U Ul U J_l m £ <U JZ <c j= o ® *7 = Η Σ Η Σ ... Ό λ, 1 11 * -H OJ φ O O 01 0) ***: j £ — jz ~ £: ~ Q. , *-“* Οι — CL I—

·,·. ¢) J 1 '1 I I

- (¾ ω O- CM 0)0. 0)C- *""* Cfl ΙΞ ·—* ζΛ y; G *7 < Z — < >— < ..: a) ' I 1 ii ii •Γ-l ^ C 3 < CO C ac * * d "“j —< o < ^h_ _ J <oj <o <o

+) ' « 1 ll I I

<0 “* 3 a0 O. 3 0.3 >«0)U WO) wo 3 <Cj< <_j <_j : « i ' I ii I , 0 CO CO 3 CO 3 • * ’"“J <D ' l—" O * Ql 7 “J O <C —J <.

1 I II i ( b1 (Λ ao u w u w ..: = H j < h j = h j . . * ^ /*N .—.

:' < o e?' . . <t C -J· cm

* I · H I I

* - ^ £ ·—* * ^ U S»/

O »—> U. O J

si cc —* Ci

U 3 O <0 O

G. O Q. > Cl

J ' JC

3 86432 L-aminohapon koodaus IUPAC-IUB:n biokemiallisen nomenklatuurikomission mukaan (Biochemistry, 11, 1726-1732 (1972)) on seuraavaa:

His = histidiini, Ser = seriini, Asp = asparagii-5 nihappo, Ala = alaniini, Gly = glysiini, Val = väliini, Phe = fenyylialaniini, Thr = treoniini, Asn = asparagiini, Tyr = tyrosiini, Arg = arginiini, Leu = leusiini, Lys = lysiini, Gin = glutamiini, Met = metioniini, lie = isoleu-siini, Glu = glutamiinihappo.

10 Koska nämä hpGRF-peptidit sisältävät 29-44 amino- happoyksikköä, joiden molekyylipainot vaihtelevat alueella 3085-5035 daltonia, on toivottavaa lisätä niiden tehoa siten, että sopivien kasvuhormonipitoisuuksien vapauttamiseksi nisäkkäissä voidaan niiden annostusta käytännössä 15 vähentää. Niinpä käsiteltävänä olevan keksinnön eräänä kohteena on tarjota tehokkaampia, hpGRF:ää muistuttavia peptidejä, joilla voidaan lisätä kasvuhormonin vapautuminen sopivalle tasolle nisäkkäissä.

Tämä päämäärä saavutetaan yllättäen korvaamalla 20 luonnonaminohapot 1-, 2- ja 3-asemassa ja derivatisoimalla hpGRF:n 1-29 N-terminaalinen aminohappotähde seuraavassa esitetyllä kaavan (I) mukaisella rakenteella. Nämä tulokset ovat yllättäviä, erityisesti ottaen huomioon julkaisut | ”· N. Ling ja P. Brauzeau (The Endocrine Society Program and .. . 25 Abstracts, 65th Annual Meeting, nro 295, 8-10. kesäkuuta ; 1983, San Antoniossa, Texasissa), joiden mukaan Ac-Tyr1- ja D-Tyr1-hpGRF-analogien teho on vähäinen luonnon peptidiin verrattuna, sekä J. Rivier et ai. (Abstract 8th American Peptide Symposium, 22-27. toukokuuta, 1983, esitelmä 10-30 B), jotka hpGBF (l-27):n kohdalla ilmoittavat: "Tyr-jään- nös on jossain määrin manipuloitavissa, mikäli vapaa ami-nopääte säilytetään".

Keksinnön kohteena on menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen peptidin valmistamiseksi, jolla on kaava 35 R1-A-B-C-Ala-Ile-Phe-Thr-X-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln- 4 86432

Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Y-Ser-Arg-NH2 (I) jossa R1 on vety tai suora tai haarautunut Ci-C^-alkanoyyli; A on tyrosyyli, D-tyrosyyli tai histidyyli; B on alanyyli tai D-alanyyli; C on aspartyyli tai D-aspratyyli; X on 5 asparaginyyli tai D-asparaginyyli; Y on norleusyyli tai metionyyli; sillä ehdolla, että kun R1 on vety ja B on alanyyli ja C on aspartyyli ja X on asparaginyyli ja Y on metionyyli, A ei voi kaavassa (I) olla tyrosyyli, sekä sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi. 10 Kaavan (I) mukaisten yhdisteiden edullisemmassa ryhmässä R1 on vety tai asetyyli.

Tässä käytetyllä sanonnalla "farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat" tarkoitetaan myrkyttömiä, farmaseuttisesti teollisuudessa yleisesti käytettyjä alkalimetal-15 li-, maa-alkalimetalli-, ammonium-, organoammonium- ja me-tallisuoloja. Näihin suoloihin kuuluvat, niihin kuitenkaan rajoittamatta, natrium-, kalium-, litium-, kalsium-, magnesium-, sinkki-, ammonium-ja trimetyyliammoniumsuolat, jotka valmistetaan tekniikan tason tuntemin menetelmin. 20 Sanonta tarkoittaa myös myrkyttömiä happoadditiosuoloja kuten hydrokloridia, hydrobromidia, asetaattia, fosfaattia, sulfaattia, sitraattia, lauraattia, stearaattia, pa-moaattia ja oleaattia niihin kuitenkaan rajoittumatta. Myös happoadditiosuolat valmistetaan tekniikan tason tun-25 ternin menetelmin.

Vakionomenklatuurin mukaisesti käsiteltävänä olevassa patenttiselityksessä ja patenttivaatimuksissa käytettyjen kiraalisten aminohappotähteiden lyhenteet ovat seuraavat: 30 Lyhenne_Nimi_

His L-histidyyli

Ser L-serinyyli

Asp L-aspartyyli D-Asp D-aspartyyli 35 Ala L-alanyyli 5 86432

Lyhenne_Nimi_ D-Ala D-alanyyli

Vai L-valinyyli

Phe L-fenyylialanyyli 5 Thr L-treonyyli

Asn L-asparaginyyli D-Asn D-asparaginyyli

Tyr L-tyrosinyyli

Arg L-arginyyli 10 Leu L-leusyyli

Nle L-norleusyyli

Lys L-lysyyli

Gin L-glutaminyyli

Met L-metionyyli 15 Ile L-isoleusyyli D-Tyr D-tyrosyyli

Jollei muuta mainita, tässä ilman etuliitettä L mainitut aminohappotähteet tarkoittavat luonnossa esiintyvää absoluuttista L-konfiguraatiota. Ryhmä R1 tarkoittaa 20 vakionomenklatuurin mukaisesti peptidin N-pääteaminohapos- sa olevaa substituenttia (1-asema).

Muut tässä selityksessä käytetyt lyhenteet ovat: Fmoc fluorenyylimetyylioksikarbonyyli BOC tert-butyylioksikarbonyyli 25 Tos p-tolueenisulfonyyli HPLC suuren erotuskyvyn nestekromatografia TLC ohutkerroskromatografia TFA trifluorietikkahappo 30 Ac asetyyli • Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä vaatimuksessa 1 mainitaan.

Kaavaa (I) olevien peptidien kiintofaasisynteesi ···’ voidaan suorittaa Beckman 990 automaattisella peptidisyn- • : 35 tetisoijalla. Preparatiivinen HPLC voidaan suorittaa pak- 6 86432 suseinäisessä lasikolonnissa (2,5 X 45 cm), joka sisältää Whatman LRP-1 käänteisfaasitäytteen ja joka on varustettu Fluid Metering Companyn pumpulla ja sykkeenvaimentimella. Aminohappoanalyysit voidaan suorittaa Beckman 119 CL ana-5 lysaattorilla ja tulokset käsitellä System AA laskevalla integraattorilla.

Kaavan (I) mukaisten yhdisteiden valmistuksessa käytetyt aminohappojohdannaiset ovat saatavissa monista kemikaaleja myyvistä yrityksistä, joista mainittakoon 10 Bachem, Inc., Torrance, California ja Chemical Dynamics, Inc., Plainfield, New Jersey.

Kaavan I mukaiset peptidit voidaan mukavasti valmistaa kiintofaasivakiotekniikkojen avulla, esim. aminohappo, jonka C-terminaalinen pää on suojattu, voidaan 15 liittää kloorimetyylihartsiin, hydroksimetyylihartsiin, bentshydryyliamiini(BHA)hartsiin tai p-metyylibentsyyli-hydryyliamiini(p-Me-BHA)hartsiin. Erästä tällaista kloori-metyylihartsia myy Bio Rad Laboratories, Richmond, California, kauppanimellä BiopBeads SX-1. Hydroksimetyy1ihart-20 sin valmistusta kuvaavat Bodansky et ai., Chem. Ind. (-Lontoo) 38, 1597 (1966). BHA-hartsin ovat kuvanneet Piettä _ . ja Marshall, Chem. Commun. 650 (1970) ja sitä myy kaupal lisesti Bachem, Inc., Torrance, California.

Keksinnön erään toteuttamismuodon mukaisesti kaavaa 25 (I) olevat peptidit valmistetaan vakiomenettelyin pepti dien kiintofaasisynteesin kautta, joskin ne voidaan myös valmistaa käsittelemällä peptidihartsia ammoniakilla, jol-loin saadaan haluttu sivuketjusuojattu amidi, tai alkyyli-amiinilla, jolloin saadaan sivuketjusuojattu alkyyliamidi 30 tai dialkyyliamidi.

Käytettäessä kloorimetyyli- tai hydroksimetyyli-hartsia asianmukaisen aminohapon α-aminosuojaryhmänä on Fmoc ja sivuketjun suojaryhmänä tert-Bu- bentsyylin asemesta .

35 Sivuketjun suojaus voidaan myöhemmin poistaa taval- ____ liseen tapaan käsittelemällä HF:llä, jolloin saadaan vapaat peptidiamidit, -alkyyliamidit tai dialkyyliamidit.

7 86432

Yllä käsitelty kiintofaasimenettely on tekniikan tasolla tunnettu ja sen ovat olennaisilta osiltaan kuvanneet Stewart ja Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman and Company, San Fransisco, California (1969).

5 β 86432

Virtauskaavio I

/D-Ala^/-hpGRF(1-29)-NI^ :n valmistus BHA -hartsi + Boc-Arg(Tos) 5 (CH3)2CH-N=C=N-CH(CH3)2

V/ch2ci2 JA

Boc-Arg(Tos) -BHA -hartsi (а) CH2Cl2"Pesu IQ (b) 33% TFA/CH2CI2,kahdesti (c) CH2Cl2"Pesu

(d) Et OH >B

(e) CH2Cl2-Pesu (f) EC3N/CHCI3 , kahdesti 15 ^(g) CH2CI2 ~Pesn _

Boc- Arg(Tos)-BHA -nartsi

(1) Boc-Set(0CH2), A, B

(2) Boc-Met, A, B

20 (3) Boc-Ile, A, B

(4) Boc-Asp(0CH2), A, B

(5) Boc-Gln, A, B

(б) Boc-Leu, A, B

(7) Boc-Leu, A, B

25 (8) Boc-Lys(4-C10CH2OCO), A, B

(9) Boc-Arg(Tos), A, B

(10) Boc-Ala, A, B

(11) . Boc-Ser (0CH2), A, B

(12) Boc-Leu, A, B

:Λ*: 30 (13) Boc-Gln, A, B

(14) Boc-Gly, A, B .·.·. (15) Boc-Leu, A, B

(16) Boc-Val, A, B

*:*' (17) Boc-Lys(4-C10CH2OCO) , A, B

V.: 35 (18) Boc-Arg(Tos) , A, B

\/19) Boc-Tyr^-Br0CH2oco), a. β 9 86432

Virtauskaavio I (jatkoa) 5 (20) Boc-Ser(0CH2), A> B,

MeOH -resu, sykli B

(21) Boc-Asn, A, B

(22) Boc-Thr(0CH2)> A- B

(23) Boc-Phe, A, B

10 (24) Boc-Ile, A, B '

(25) Boc-Ala, A, B

(26) Boc-Asp(0CH2) , A> B

(27) Boc-D-Ala, A, B

(28) Boc-Tyr, A, B

15 V

D-Ala2hpGRF(l-29) -BHA"hartsi ( a ) H F, diiretyylisulf idi, p-kresoli 20 (b) Et20 -pesu '·· (c) HOAc , Sephaclcx G-50 pylväskroma- tografia •: · · · (d ) kylmäkuivaus „ (e) kramatografia: oktadesyylisilaani- : 2b silika, 15-50 % CH3CN/H20/0.1% TFA/5,6 kg/an2 ( f ) kyiiräkuivaus

.... V

3Q [D-A1 a 2]-hpGRF(1 - 29)-NH2 10 86432 N-päätteisen alkanoyylipeptidin valmistamiseksi hartsiin sidottua peptidiä sekoitetaan liuoksissa, joissa on 5-20 % asianmukaista happoanhydridiä CH2Cl2:ssa, joka sisältää trietyyliamiinia tai muita tavallisesti käytet-5 tyjä happoakseptoriemäksiä, 20-120 minuuttia huoneenlämpö-tilassa. Tämän jälkeen käytetään vakioreagensseja peptidin lohkaisemiseksi hartsista ja saadaan haluttu kaavaa (I) oleva peptidi.

Yllä kuvatun menettelyn avulla voidaan valmistaa 10 seuraavat peptidit: [N-asetyyli]-hpGRF(1-29)-NH2 [D-Tyr1] -hpGRF( 1-29 )-NH2 [N-asetyyli-D-Tyr’ ]-hpGRF(1-29)-NH2 [N-asetyyli,D-Ala2]-hpGRF(1-29)-NH2 15 [D-Asp3] -hpGRF( 1-29 ) -NH2 [N-asetyyli, D-Asp3]-hpGRF( 1-29 )-NH2 [D-Tyr1, D-Ala2] -hpGRF( 1-29 )-NH2 [N-asetyyli-D-Tyr1, D-Ala2] -hpGRF( 1-29 ) -NH2 [His1, D-Ala2] -hpGRF( 1-29 )-NH2 20 [N-asetyyli-His1, D-Ala2] -hpGRF( 1-29 )-NH2 [D-Tyr1, D-Ala2, D-Asp3] -hpGRF( l-29)-NH2 [N-asetyyli-D-Tyr1, D-Ala2, D-Asp3]-hpGRF( 1-29 )-NH2 [His1, D-Ala2-Asp3]-hpGRF( 1-29 )-NH2 [N-asetyyli-His1, D-Ala2, D-Asp3] -hpGRF( 1-29 )-NH2 25 [D-Asn8] -hpGRF( 1-29 ) -NH2 [D-Ala2, Nle27]-hpGRF( 1-29 )-NH2 [ His1, D-Ala2, Nle27] -hpGRF( 1 -29 ) -NH2 [D-Ala2, D-Asn8, Nle27]-hpGRF( 1-29 )-NH2 [D-Asp3, D-Asn8, Nle27] -hpGRF( 1-29 )-NH2 - 30 [D-Ala2, D-Asp3, D-Asn8, Nle27]-hpGRF( 1-29 )-NH2 [Asp3]-hpGRF( 1-29 )-NH2 [N-asetyyli, Asp3]-hpGRF( 1-29 )-NH2

On havaittu käytännössä, että keksinnön mukaisesti * valmistetut kaavaa (I) olevat yhdisteet pystyvät lisäämään . 35 kasvuhormonin vapautumista nisäkkäissä annettaessa yhdis teitä niille määränä, joka pystyy aikaansaamaan mainitun 11 86432 vaikutuksen nisäkkäissä, eli määränä 0,000001-0,1 mg/kg nisäkkään kehonpainoa/päivä mainittua kaavaa (I) olevaa yhdistettä.

Nämä peptidit ovat käyttökelpoisia kasvuhormoniva-5 jaukseen liittyvien oireiden hoitamiseen lisäämään villan kasvua, lisäämään lihakarjan kasvunopeutta, parantamaan lihakarjan ruhon laatua (ts. enemmän ja proteiinia ja vähemmän rasvaa), parantamaan lihakarjan ja lypsylehmien rehun hyväksikäyttöä, lisäämän lypsykarjan maidontuotantoa 10 ja parantamaan haavoja.

Seuraavat esimerkit helpottavat keksinnön ymmärtämistä ja niiden ensisijaisena tehtävänä on valaista eräitä keksinnön erityiskohtia.

Esimerkki 1 15 Suojattu (ihmishaiman kasvuhormonia vapauttava tekijä) (9-29)-bentshydryyliamiinihartsi Lisättiin 6,0 g (3,0 mmol) bentshydryyliamiini-po-lystyreenihartsia (myy Bachem, Inc., Torrance, California) kloridimuodossa Beckman 990 automaattisen peptidisynteti-20 sojän reaktioastiaan, joka oli ohjelmoitu suorittamaan seuraava synteesi- ja pesujakso: . (a) CH2C12, (b) 33 % trifluorietikkahappoa CH2Cl2:ssa (kaksi kertaa, ‘ kumpikin 1 ja 25 minuuttia), 25 (c) CH2C12, (d) C2H5OH, (e) CH2C12, (f) 10 % (C2H5)3N:ää CHCl3:ssa (kaksi kertaa, kumpikin 2 minuuttia) ja (g) CH2C12.

Sekoitettiin tunti neutraloitua hartsia, tert-bu-tyylioksikarbonyyli(Boc)-N-tosyyli-l-arginiinia /Boc-Arg-30 (Tos)/ ja 6 mmol di-isopropyylikarbodi-imidiä CH2Cl2:ssa ja sitten muodostunut aminohappohartsi kierrätettiin yllä kuvatun pesuohjelman vaiheiden (a)-(g) kautta. Tämän jäl-_ keen seuraavat L-aminohapot (3 mmol) kytkettiin peräkkäin saman reaktiojakson avulla: Boc-Ser(bentsyyli), Boc-Met, *: 35 Boc-Ile, Boc-Asp(bentsyyli), Boc-Gln, Boc-Leu, Boc-Leu, —i Boc-Lys(4-kloorikarbentsoksi), Boc-Arg(Tos), Boc-Ala, Boc- i2 86432

Ser(bentsyyli), Boc-Leu, Boc-Gln, Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Val, Boc-Lys(4-kloorikarbentsoksi) Boc-Arg(tosyyli), Boc-Tyr(4-bromikarbentsoksi) ja Boc-Ser(bentsyyli) sillä erolla, että Boc-Gln kytkettiin dimetyyliformamidin läsnäol-5 lessa 1-hydroksibentsotriatsolissa (6 mmol).

Sitten täydellinen peptidi-bentshydryyliamiinihart-si, josta N-päätteinen Boc-ryhmä oli poistettu, pestiin CH3OH:lla ja kuivattiin ilmassa ja saatiin 11,79 g materiaalia.

10 Esimerkki 2

Suojatun D-tyrosiini-l-(ihmishaiman kasvuhormonia vapauttava tekijä) (1-29)-bentshydryyliamiinihart-sin valmistus 0,98 g:11a (0,25 mmol) peptidi-bentshydryyliamiini- 15 hartsia, jossa oli peptidin tähteet 9-29, suoritettiin esimerkissä 1 kuvattu synteesi- ja pesujakso. Sekoitettiin neutraloitua hartsia, 0,75 mmol Boc-L-asparagiinia, 0,75 mmol di-isopropyylikarbodi-imidiä ja 0,75 mmol 1-hydroksi-bentsotriatsolia.

20 Sitten seuraavat aminohappojohdannaiset (0,75 mmol) kytkettiin peräkkäin saman käsittelyjakson avulla kuin esimerkissä 1: Boc-Thr(bentsyyli), Boc-Phe, Boc-Ile, Boc-Ala, Boc-Asp(bentsyyli), Boc-Ala ja Boc-D-Tyr. Sitten täy-’ dellinen (1-29) peptidihartsi kierrätettiin esimerkissä 1 .. . 25 kuvatun synteesi- ja pesuvakio-ohjelman läpi N-päätteisen Boc-ryhmän poistamiseksi.

Esimerkki 3 D-tyrosiini-l-(ihmishaiman kasvuhormonia vapauttavan (1-29) amidin) [ (D-Tyr1 )-hpGRF( 1-29 )-NH2] val-: 30 mistus : : Seosta, jossa oli 0,75 mmol esimerkissä 2 kuvattua (1-29)peptidiä, 10 ml vetyfluoridia, 26 ml dimetyylisulfi-dia ja 4 ml p-kresolia, sekoitettiin 75 minuuttia 0°C:ssa. Sitten reagenssien ylimäärä poistettiin haihduttamalla no-'35 peasti kuivassa typpivirrassa, lisättiin 35 ml vetyfluoridia ja seosta sekoitettiin vielä 45 minuuttia 0°C:ssa. Ve- i3 86432 tyfluoridin ylimäärä haihdutettiin typpivirrassa ja jäännös plus vapaa peptidi pestiin p-kresolivapaaksi suurella tilavuudella dietyylieetteriä.

Peptidi uutettiin 50 %:seen etikkahappoliuokseen ja 5 liuos kaadettiin Sephadex G-50:tä sisältävään pylvääseen (2,5 x 95 cm), joka eluoitiin 2-m etikkahapolla. Eluoitumista tarkkailtiin aallonpituudella 280 nm ja fraktiot, jotka saatiin UV-pääabsorptiopiikin kohdalla, yhdistettiin ja kylmäkuivattiin. Kylmäkuivatun jauheen liuos 10 eluoitiin pylväässä (1,5 x 45 cm), joka sisälsi oktadekyy-lisilaanisilikaa, hiukkaskoko 15-20 meshiä, huokoskoko 300 A (myyjä Vydac, Hesperia, California). Käytettiin eluoin-tilineaarigradienttia 15-50 % asetonitriiliä 0,1 %:ssa trifluorietikkahappoliuoksessa ja pumppauspaineessa 5,6 15 kg/cm2. Poistuvia fraktioita tarkkailtiin aallonpituudella 280 nm ja jokainen fraktio tutkittiin analyyttisen HPLC:n avulla aallonpituudella 215 nm yhdistettyjen fraktioiden maksimihomogeenisuuden varmistamiseksi. Kylmäkuivaamalla nämä fraktiot saatiin 32 mg otsikkopeptidiä valkoisena 20 jauheena.

Analyyttisessä HPLC-analyysissä saatiin tällä aineksella yksi piikki 38 minuutin kohdalla käytettäessä pylvästä (0,4 x 25 cm), jonka täytteenä oli Vydac oktade-kyylisilaanisilika (hiukkaskoko 5 meshiä, 300 A), jonka 25 läpi pumpattiin 2 ml/min lineaarigradientilla 20-40 % asetoni triiliä 0,1 %:sessa trifluorietikkahappoliuoksessa. TLCrssä silikageelillä käyttäen liuotinsysteemiä isobuta-noli-pyridiinietikkahappo-vesi (15:10:3:12) saatiin yksi täplä visualisoituna kloori-tärkkelyssumutusreagenssilla. 30 Aminohappoanalyysi 6-m HCl-hydrolysaatilla antoi seuraavat aminohapposuhteet: Asp 3,08, Thr 1,08, Ser 3,01, Glu 2,22, Gly 1,10, Ala 3,30, Vai 0,87, Met 0,97, Ile 1,69, Leu 3,61, Tyr 1,60, Phe 1,05, Lys 2,07, Arg 3,28.

i4 8 6 432

Esimerkki 4

Suojatun N-asetyyli-(ihmishaiman kasvuhormonia vapauttava tekijä) (1-29)-bentshydryyliamiinihartsin valmistus 5 Suoritettiin esimerkissä 2 kuvatut kytkemisjaksot 0,98 g:11a (0,25 mmol) esimerkissä 1 valmistettua peptidi-bentshydryyliamiinihartsia sillä erolla, että D-Tyr:in asemesta käytettiin L-Tyr:iä. (1-29)peptidihartsi, josta N-päätteinen Boc-ryhmä oli poistettu, asetyloitiin sekoit-10 tamalla 30 minuuttia liuoksessa, jossa oli 10 % asetanhyd-ridi-Et3N: ää metyleenikloridissa.

Esimerkki 5 N-asetyyli-(ihmishaiman kasvuhormonia vapauttava tekijä) (l-29)amidin [N-asetyyli-hpGRF(1-29)-NH2] 15 valmistus 0,75 mmol esimerkissä 4 kuvattua peptidihartsia käsiteltiin vetyfluoridiseoksilla ja puhdistettiin esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Kylmäkuivattu, puhdistettu peptidi painoi 16,2 mg.

20 Esimerkissä 3 kuvatuissa analyyttisen HPLC:n olo suhteissa tällä aineksella saatiin yksi piikki, joka il- ____ mestyi 36,5 minuutin kuluttua. TLCtssä, jonka olosuhteet myös on kuvattu esimerkissä 3, saatiin yksi täplä. Amino-happoanalyysi 6-m HCl-hydrolysaatilla antoi seuraavat ami-.. . 25 nohapposuhteet: Asp 3,05, Thr 1,08, Ser 2,96, Glu 2,20, ;* Gly 1,20, Ala 3,30, Vai 0,81, Met 1,00, Ile 1,65, Leu 3,50, Tyr 1,61, Phe 1,20, Lys 2,10, Arg 3,17.

Esimerkki 6

Suojatun D-alaniini2-( ihmishaiman kasvuhormonia va- 30 pauttava tekijä) (1-29)-bentshydryyliamiinihartsin valmistus '· Suoritettiin esimerkissä 2 kuvatut kytkemisjaksot 0,98 g:11a (0,25 mmol) esimerkissä 1 valmistettua peptidi-bentshydryyliamiinihartsia sillä erolla, että 2-asemassa 35 käytettiin D-alaniinia L-alaniinin sijasta ja 1-asemassa L-tyrosiinia D-tyrosiinin sijasta.

is 86432

Esimerkki 7 D-alaniini2-( ihmishaiman kasvuhormonia vapauttavan (1-29 )-amidin) [D-Ala2)-hpGRF( 1-29 )-NH2] valmistus 0,25 mmol esimerkissä 6 kuvattua peptidihartsia kä-5 siteltiin vetyfluoridiseoksilla ja puhdistettiin esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Puhdistettu, kylmäkuivattu peptidi painoi 27,9 mg. Esimerkissä 3 kuvatuissa analyyttisen HPLC:n olosuhteissa tällä aineksella saatiin yksi piikki, Joka ilmestyi 35 minuutin kuluttua. Esimerkissä 3 kuva-10 tuissa olosuhteissa TLC antoi yhden täplän. Aminohappo-analyysi 6-m HCl-hydrolysaatilla antoi seuraavat aminohap-posuhteet: Asp 3,06, Thr 1,07, Ser 3,05, Glu 2,19, Gly 1,02, Ala 3,29, Vai 0,94, Met 1,10, Ile 1,72, Leu 3,66, Tyr 1,62, Phe 0,90, Lys 2,07, Arg 3,19.

15 Esimerkki 8

Suojatun D-asparagiinihappo3-( ihmishaiman kasvuhormonia vapauttava tekijä) (1-29)-bentshydryyliamii-nihartsin valmistus

Suoritettiin esimerkissä 2 kuvatut kytkemisjaksot 20 0,98 g:11a (0,25 mmol) esimerkissä 1 valmistettua peptidi- bentshydryyliamiinihartsia sillä erolla, että 3-asemassa käytettiin D-asparagiinihappoa L-asparagiinihapon sijasta ja 1-asemassa L-tyrosiinia D-tyrosiinin sijasta.

Esimerkki 9 25 D-asparagiinihappo3-(ihmishaiman kasvuhormonia va pauttavan (1-29)-amidin) [ (D-Asp3 )-hpGRF(1-29)-NH2] valmistus 0,25 mmol esimerkissä 8 kuvattua peptidihartsia käsiteltiin vetyfluoridiseoksilla ja puhdistettiin esimer-: 30 kissä 3 kuvatulla tavalla. Puhdistettu, kylmäkuivattu peptidi painoi 15,3 mg. Esimerkissä 3 kuvatuissa analyyttisen HPLCrn olosuhteissa tällä aineksella saatiin yksi piikki, .···, joka ilmestyi 34 minuutin kuluttua. Esimerkissä 3 kuva- tuissa olosuhteissa TLC antoi yhden täplän. Aminohappo-v 35 analyysi 6-m HCl-hydrolysaatilla antoi seuraavat aminohap-posuhteet: Asp 3,17, Thr 1,22, Ser 3,08, Glu 2,36, Gly 16 86432 1,06, Ala 3,30, Vai 0,96, Met 0,84, Ile 1,76, Leu 3,71, Tyr 1,00, Phe 0,92, Lys 2,21, Arg 3,30.

Esimerkki 10

Suojatun N-asetyyli-D-tyrosiini1, D-alaniini2( ih-5 mishaiman kasvuhormonia vapauttava tekijä) (1-29)- bentshydryyliamiinihartsin valmistus Suoritettiin esimerkissä 2 kuvatut kytkemisjaksot 0,98 g:11a (0,25 mmol) esimerkissä 1 valmistettua peptidi-bentshydryyliamiinihartsia sillä erolla, että 2-asemassa 10 käytettiin D-alaniinia L-alaniinin sijasta.

Esimerkki 11 N-asetyyli-D-tyrosiini1, D-alaniini2- (ihmishaiman kasvuhormonia vapauttavan (1-29)-amiinin [(N-ase-tyyli-D-Tyr1, D-Ala2 )-hpGRF( 1,29) -NH2] -valmistus 15 0,25 mmol esimerkissä 10 kuvattua peptidihartsia käsiteltiin vetyfluoridiseoksilla ja puhdistettiin esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Puhdistettu, kylmäkuivattu peptidi painoi 5 mg. Esimerkissä 3 kuvatuissa analyyttisen HPLC:n olosuhteissa tällä aineksella saatiin yksi piikki, 20 joka ilmestyi 33 minuutin kuluttua. Esimerkissä 3 kuvatuissa olosuhteissa TLC antoi yhden täplän. Aminohappoana-lyysi 6-m HCl-hydrolysaatilla antoi seuraavat aminohappo-. suhteet: Asp 3,08, Thr 1,08, Ser 3,01, Glu 2,22, Gly 1,10,

Ala 3,30, Vai 0,87, Met 0,97, Ile 1,69, Leu 3,61, Tyr 25 1,60, Phe 1,05, Lys 2,07, Arg 3,28.

Esimerkki 12 --- Suojatun N-asetyyli-D-tyrosiini1, D-alaniini2, D- asparagiinihappo3-( ihmishaiman kasvuhormonia vapauttava tekijä) (1-29)-bentshydryyliamiinihartsin • 30 valmistus

Suoritettiin esimerkissä 4 kuvatut kytkemisjaksot 0,98 g:lla (0,25 mmol) esimerkissä 1 valmistettua peptidi-bentshydryyliamiinihartsia sillä erolla, että 3-asemassa * käytettiin D-asparagiinihappoa L-asparagiinihapon sijasta, . : : 35 2-asemassa käytettiin D-alaniinia L-alaniinin sijasta ja 1-asemassa D-tyrosiinia L-tyrosiinin sijasta.

i7 86432

Esimerkki 13 N-asetyyli-D-tyrosiini1, D-alaniini2, D-asparagii-nihappo3-(ihmishaiman kasvuhormonia vapauttavan (1- 29)amidin) [N-asetyyli-D-Tyr1, D-Ala2, D-Asp3)-5 hpGRF(1-29)-NH2] valmistus 0,25 mmol esimerkissä 12 kuvattua peptidihartsia käsiteltiin vetyfluoridiseoksilla ja puhdistettiin esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Puhdistettu, kylmäkuivattu peptidi painoi 12 mg. Esimerkissä 3 kuvatuissa analyyttisen 10 HPLC:n olosuhteissa tällä aineksella saatiin yksi piikki, joka ilmestyi 34 minuutin kuluttua. Esimerkissä 3 kuvatuissa olosuhteissa TLC antoi yhden täplän. Aminohappo-analyysi 6-m HCl-hydrolysaatilla antoi seuraavat aminohap-posuhteet: Asp 3,06, Thr 1,07, Ser 3,00, Glu 2,18, Gly 15 1,H, Ala 3,30, Vai 0,82, Met 0,97, Ile 1,62, Leu 3,43,

Tyr 1,69, Phe 0,92, Lys 2,03, Arg 3,13.

Esimerkki 14

Suojatun N-asetyyli-tosyyli-L-histidiini1, D-alaniini2- ( ihmishaiman kasvuhormonia vapauttava teki-20 jä) (1-29)-bentshydryyliamiinihartsin valmistus

Suoritettiin esimerkissä 4 kuvatut kytkemisjaksot 0,98 g:11a (0,25 mmol) esimerkissä 1 valmistetulle pep-tidibentshydryyliamiinihartsille sillä erolla, että 2-···*: asemassa käytettiin D-alaniinia L-alaniinin sijasta ja 1- 25 asemassa L-tosyylihistidiiniä L-tyrosiinin sijasta. Esimerkki 15 N-asetyyli-L-histidiini1, D-alaniini2-(ihmishaiman kasvuhormonia vapauttavan (1-29)-amiinin) [(N-aset-yyli-His1, D-Ala2 )-hpGRF( 1-29 )-NH2] valmistus 30 0,25 mmol esimerkissä 14 kuvattua peptidihartsia käsiteltiin vetyfluoridiseoksilla ja puhdistettiin esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Puhdistettu, kylmäkuivattu peptidi painoi 18 mg. Esimerkissä 3 kuvatuissa analyyttisen HPLC:n olosuhteissa tällä aineksella saatiin yksi piikki, 35 joka ilmestyi 31 minuutin kuluttua. Esimerkissä 3 kuvatuissa olosuhteissa TLC antoi yhden täplän. Aminohappo- ie 86432 analyysi 6-m HCl-hydrolysaatilla saatiin seuraavat amino-happosuhteet: Asp 3,06, Thr 1,10, Ser 3,00, Glu 2,26, Gly 1,10, Ala 3,30, Vai 0,79, Met 0,97, Ile 1,69, Leu 3,71, Tyr 0,81, Phe 0,96, His 0,95, Lys 2,15, Arg 3,30.

5 Esimerkki 16 D-asparagiini8-(ihmishaiman kasvuhormonia vapauttavan (1-29)-amidin) [ (D-Asn8)-hpGRF(1-29)-NH2] valmistus

Suoritettiin esimerkissä 2 kuvatut kytkemisjaksot 10 esimerkissä 1 valmistetulla peptidi-bentshydryyliamiini-hartsilla (0,25 mmol hartsia) sillä erolla, että L-Tyr käytettiin D-Tyr:n sijasta, ja että 8-asemassa käytettiin D-asparagiinia L-asparagiinin sijasta. Saanto oli 38 mg ja peptidin eluoitumisaika HPLCrssä oli 28 minuuttia virtaus-15 nopeudella 1,5 ml/min. Aminohappoanalyysi antoi Asp 3,05, Tgr 0,95, Ser 2,96, Glu 2,21, Gly 1,04, Ala 3,02, Vai 0,95, Ile 1,85, Leu 2,00, Met 0,97, Tyr 2,10, Phe 0,96, Lys 1,97, Arg 3,20.

Esimerkki 17 20 D-alaniini2, norleusiini27 (ihmishaiman kasvuhormo nia vapauttavan (1-29)-amidin [(D-Ala2,Nle27)-hpGRF(1-29)-NH2] valmistus

Peptidi-bentshydryyliamiinihartsi valmistettiin kuten esimerkissä 1 siten, että kytkemisjaksossa korvattiin 25 27-asemassa L-metioniini L-norleusiinilla. L-norleusiinis-sa käytettiin Boc-suojaryhmää. Sitten tämä aines kytkettiin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla sillä erolla, että L-Tyr käytettiin D-Tyr:n sijasta ja siten, että D-alaniini korvasi 2-asemassa L-alaniinin. Käytetystä 0,25 millimoo-30 lista hartsia saatiin 71 mg ja eluoitumisaika HPLCissä oli 28,5 minuuttia virtausnopeudella 1,5 ml/min. Aminohappoanalyysi antoi Asp 3,06, Thr 1,00, Ser 2,96, Glu 2,20, Gly 1,06, Ala 3,10, Vai 0,90, Ile 1,78, Leu 4,08, Nle 1,00, Tyr 1,96, Phe 0,88, Lys 2,00, Arg 3,14.

19 86432

Esimerkki 18

Histidiini1, D-alaniini2, norleusiini27-( ihmishai-man kasvuhormonia vapauttavan (1-29)-amidin) [His1, D-Ala2, Nle27) -hpGRF( 1-29 ) -NH2] valmistus 5 Peptidi-bentshydryyliamiinihartsi valmistettiin kuten esimerkissä 1 siten, että kytkemisjaksossa korvattiin 27-asemassa L-metioniini L-norleusiinilla. Sitten tämä aines kytkettiin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla sillä erolla, että L-Tyr käytettiin D-Tyr:n sijasta ja si-10 ten, että L-histidiini korvasi 1-asemassa L-tyrosiinin ja D-alaniini 2-asemassa L-alaniinin. Käytetystä 0,25 milli-moolista hartsia saatiin 23 mg ja eluoitumisaika HPLC:ssä oli 27,5 minuuttia virtausnopeudella 1,5 ml/min. Amino-happoanalyysi antoi Asp 3,13, Thr 1,00, Ser 2,98, Glu 15 2,27, Gly 1,10, Ala 3,15, Vai 0,99, Ile 1,88, Leu 4,20,

Nle 1,05, Tyr 0,98, Phe 0,91, His 1,17, Lys 2,01, Arg 3,11.

Esimerkki 19 D-alaniini2, D-asparagiini®, norleusiini27-20 (ihmishaiman kasvuhormonia vapauttavan (1-29)- amidin) [ (D-Ala2, D-Asn®, Nle27 )hpGRF(1-29 )NH2] valmistus

Peptidi-bentshydryylihartsi valmistettiin kuten esimerkissä 1 siten, että kytkemisjaksossa korvattiin 27-. . 25 asemassa L-metioniini L-norleusiinilla. Sitten tämä aines kytkettiin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla sillä erolla, että L-Tyr käytettiin D-Tyr:n sijasta ja siten, että D-alaniini korvasi 2-asemassa L-alaniinin ja D-asparagiini 8-asemassa L-asparagiinin. Käytetystä 0,25 millimoolista 30 hartsia saatiin 41 mg ja eluoitumisaika HPLC:ssä oli 28,5 minuuttia virtausnopeudella 1,5 ml/min. Aminohappoanalyysi antoi Asp 299, Thr 1,00, Ser 2,87, Glu 2,14, Gly 1,06, Ala 3,04, Vai 0,93, Ile 1,80, Leu 4,02, Nle 0,98, Tyr 1,99, " Phe 0,90, Lys 2,01, Arg 3,08.

20 86432

Esimerkki 20 D-asparagiinihappo3, D-asparagiini8, norleusiini27-(ihmishaiman kasvuhormonia vapauttavan (1-29)-amidin ) [ (D-Asp3, D-Asn8, Nle27 ) -hpGRF(1-29 ) -NH2] 5 valmistus

Peptidi-bentshydryylihartsi valmistettiin kuten esimerkissä 1 siten, että kytkemisjaksossa korvattiin 27-asemassa L-metioniini L-norleusiinilla. Sitten tämä aines kytkettiin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla sillä erolla, 10 että L-Tyr käytettiin D-Tyr:n sijasta ja siten, että D-asparagiinihappo korvasi 3-asemassa L-asparagiinihapon ja D-asparagiini 8-asemassa L-asparagiinin. Käytetystä 0,25-millimoolista hartsia saatiin 114 mg ja eluoitumisaika HPLC:ssä oli 29,1 minuuttia virtausnopeudella 1,5 ml/min. 15 Aminohappoanalyysi antoi Asp 2,99, Thr 1,00, Ser 2,85, Glu 2,16, Gly 1,03, Ala 3,03, Vai 0,94, Ile 1,82, Leu 4,03, Nle 0,99, Tyr 1,97, Phe 0,92, Lys 2,06, Arg 3,05. Esimerkki 21 D-alaniini2, D-asparagiinihappo3, D-asparagiini8, 20 norleusiini27-(ihmishaiman kasvuhormonia vapautta van (1-29)-amidin) [ (D-Ala2, D-Asp3, D-Asn8, Nle27)-hpGRF27)hpGRF(1 -29 ) -NH2 ] valmistus

Peptidi-bentshydryylihartsi valmistettiin kuten esimerkissä 1 siten, että kytkemisjaksossa korvattiin 27-25 asemassa L-metioniini L-norleusiinilla. Sitten tämä aines kytkettiin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla sillä erolla, että L-Tyr käytettiin D-Tyr:n sijasta ja siten, että D-alaniini korvasi 2-asemassa L-alaniinin, D-asparagiinihappo 3-asemassa L-asparagiinihapon ja D-asparagiini 8-ase-30 massa L-asparagiinin. Käytetystä 0,25 millimoolista hartsia saatiin 67 mg ja eluoitumisaika HPLC:ssä oli 28 minuuttia virtausnopeudella 1,5 ml/min. Aminohappoanalyysi antoi Asp 3,01, Thr 1,00, Ser 2,90, Glu 2,20, Gly 1,05, Ala 3,08, Vai 0,95, Ile 1,86, Leu 4,01, Nle 0,96, Tyr ' ’ 35 1,95, Phe 0,93, Lys 2,05, Arg 3,11.

2i 86432

Kaavan (I) mukaisten peptidien biologinen vaikutus Kasvuhormonin vapautumiseen kohdistuva peptidivai-kutus määritettiin nisäkkäissä käyttämällä rottaa testi-eläinlajina.

5 Tässä määrityksessä käytettiin menettelyjä, jotka ovat kuvanneet W.A. Murphy et ai., Endocrinology 109:491-495 (1980).

Kasvuhormoni(GH )kokeissa anestetisoitiin koirasrot-tia (Charles River) NembutalRilla (6 mg 100 grammaa kohti 10 kehonpainoa), jota myös käytettiin ylläpitämään stimuloituja GH-pitoisuuksia plasmassa. Tarkalleen 30 minuuttia rottien anestetisoinnin jälkeen annettiin subkutaanibo-luksen muodossa 0,5 ml keittosuolaliuosta tai testipep-tidin keittosuolaliuosta. Viisitoista minuuttia peptidi-15 keittosuolaliuosruiskeen jälkeen kaulalaskimosta otettiin 1 ml:n verinäyte. GH-pitoisuudet määritettiin NIADDKD rotan GH RlA-komponenttien avulla.

hpGRF(1-29)-NH2:n rakenteen aktiivisuustutkimuksia Analogi Annos (pg/100 g Plasman GH

20 _kehonpainoa)_(nq/ml)_

Keittosuolaliuos - 333 ± 50 (5)* N-Ac-D-Tyr1, D-Ala2] - hpGRF( 1-29 )-NH2 0,05 499 ± 50 (5) [ N-Ac-D-Tyr1, D-Ala2 ] - 25 hpGRF( 1-29 )-NH2 0,2 680 ± 100 (7) [N-Ac-D-Tyr1, D-Ala2] - hpGRF(1-29)-NH2 0,8 2063 ± 251 (6) [N-Ac-D-Tyr1, D-Ala2] - hpGRF(1-29)-NH2 3,2 3818 ± 412 (6) '30 *) Rottien lukumäärä sulkeissa 22 86432 GRF(l-29)-NH2 Annos ( ,ug/100 g Plasman GHx) analogi kehonpainoa) (ng/ml)

Keittosuolaliuos - 366 ±81 (6) (a) D-Asn 4 1296 ± 118 (5) 5 10 2397 + 246 (6)

Keittosuolaliuos 278 ± 37 (6) 10 (b) D-Ala2-Nle27 0,1 465 ±75 (6) " 1,0 2287 ± 265 (6)

Keittosuolaliuos ...

- 214 ± 29 (6 ) 15 (c) His1-D-Ala2-Nle27 0,1 904 ± 111 .. 1,0 3379 ± 389 (6)

Keittosuolaliuos - 203 ± 39 (8) 20 2 8 27 (d) D-Ala -D-Asn -Nle 0f05 407 ±53 (6) .* " 0,5 1613 ± 138 (6) • · · · * : V 25 Keittosuolaliuos ” 383 ±79 (6) · — (e) D-Asp3-D-Asn8-Nle27 0,1 810 i 86 (6) 1,0 3213 ± 590 (6) * (f) D~Ala2-D-Asp3-D-Asn8- 0,1 767 ± 146 (6) :T: 30 " 27 1,0 2419 ± 252 (6)

Nle : Teho määritettiin vertaamalla yhdistettyihin standardeihin: GRF(l-29)-NH2 10 1185 ± 74 (78) •:*v 35 » 25 2570 ± 121 (70) x) Arvot ovat keskiarvo t keskiarvon keskivirhe (n).

Claims (5)

1. 23 8 6 4 3 2
2. 1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen peptidin valmistamiseksi, jolla on kaava R^A-B-C-Ala-Ile-Phe-
3. 5 Thr-X-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys- Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Y-Ser-Arg-NH2 (I) jossa R1 on vety tai suora tai haarautunut C1-C6-alkanoyyli; A on tyrosyyli, D-tyrosyyli tai histidyyli; B on alanyyli tai D-alanyyli; C on aspartyyli tai D-aspartyyli; X on asparaginyyli tai 10 D-asparaginyyli; Y on norleusyyli tai metionyyli; sillä ehdolla, että kun R1 on vety ja B on alanyyli ja C on aspartyyli ja X on asparaginyyli ja Y on metionyyli, A ei voi kaavassa (I) olla tyrosyyli, sekä sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, tunnettu 15 siitä, että aminohappo, jonka C-terminaalinen pää on suo jattu liitetään hartsiin kytkentäaineen läsnäollessa; pestään inertillä liuottimena; suojaus poistetaan hapon läsnäollessa; toistetaan tämä sekvenssi tarkoituksenmukaisessa järjestyksessä toisilla suojatuilla, kaavassa (I) mää-20 ritellyillä aminohapoilla vaiheittain lähtien peptidin C- terminaalisesta päästä; mahdollisesti peptidihartsi asety-loidaan; ja lopuksi irrotetaan peptidi hartsista, jolloin saadaan kaavan (I) mukainen peptidi.
4. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä kaavan ' 25 I mukaisen peptidin valmistamiseksi, tunnettu sii tä, että mainitulla peptidillä on kaava Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2 ja sen far- . . maseuttisesti hyväksyttävät suolat; Tyr-Ala-D-Asp-Ala-Ile-
5. 30 Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala- Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2 ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat; D-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2 ja sen far-• 35 maseuttisesti hyväksyttävät suolat; Ac-Tyr-Ala-Asp-Ala- 24 86432 Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2 ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat; Ac-His-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-5 Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2 ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat; Ac-D-Tyr-D-Ala-D-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-NH2 ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat; Ac-D-Tyr-D-Ala-Asp-10 Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu- Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-NH2 ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat; Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-D-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2 ja sen far-15 maseuttisesti hyväksyttävät suolat; Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile- Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2 ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat; His-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-20 Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2 ja sen far maseuttisesti hyväksyttävät suolat; Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-D-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2 ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat; Tyr-Ala-D-Asp-Ala-Ile-25 Phe-Thr-D-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala- -Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2 ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat; tai Tyr-D-Ala-D-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-D-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2 ja sen far-30 maseuttisesti hyväksyttävät suolat. 25 86432