FI84179B

FI84179B - Foerfarande foer framstaellning av ett dihydrat av kristalliniskt kalciumpseudomonat.

Info

Publication number: FI84179B
Application number: FI852407A
Authority: FI
Inventors: Geoffrey Harold Baker; Merle Beal
Original assignee: Beecham Group Plc
Priority date: 1984-06-19
Filing date: 1985-06-17
Publication date: 1991-07-15
Also published as: IE851506L; GB8415579D0; DK275585A; IL75536A0; FI88796C; PL254033A1; NZ212433A; DE3575428D1; DK164506B; ATE49600T1; US5792790A; JPH0723373B2; PH22951A; JO1420B1; IE58118B1; PT80657A; ES544329A0; HUT38654A; JPS6117583A; US5191093A

Description

1 84179

Menetelmä kiteisen kalsiumpseudomonaatin dihydraatin valmistamiseksi Tämä keksintö kohdistuu kiteiseen kalsiumpseudomonaattiin ja menetelmään sen valmistamiseksi. Tuotetta voidaan käyttää ihmis- ja eläinlääketieteessä ja eläimissä kasvua edistävänä aineena.

Pseudomonihappo on antibiootti, jota tuotetaan viljelemällä Pseudomonas fluorescens-bakteeria aerobisesti. Alla olevan kaavan 1 mukainen yhdiste sekä sen suolat ja esterit on esitetty UK-patenttijulkaisussa no 1 395 907, jossa niille esitetään myös patenttivaatimukset.

OH

CH3 HO

yY 0(CH2)8C02H

H3C CH3 ° OH 0 (I)

Pseudomonihapon kalsiumsuola on julkaistu UK-patenttijulkaisuissa no 1 577 545 ja no 1 577 730.

Tämän suolan helposti eristettävissä olevan amorfisen muodon on todettu olevan niukasti veteen liukenevaa, ja sen sulamispiste on alhainen ja lämpöstabiilisuus heikko.

Nyt on todettu, että kiteisessä muodossa eristetyn kalsiumpseudomonaatin sulamispiste on korkea, ja sen lämpöstabiilisuus on erinomainen verrattuna sekä amorfiseen kalsiumpseudomonaattiin että itse pseudomonihappoon.

Kiteistä kalsiumpseudomonaattia ei olla erityisesti julkaistu edellä mainituissa patenttijulkaisuissa eikä missään muussakaan julkaisussa, joten se on uusi yhdiste.

Näin ollen tässä keksinnössä saadaan aikaan kiteistä kal- siumpseudomonaatin dihydraattia.

2 84179

Edelleen tämän keksinnön muuna piirteenä on kiteisen kal-siumpseudomonaatin dihydraatin aikaansaaminen, joka yhdiste on olennaisesti vapaa amorfisesta kalsiumpseudomonaatista.

Kiteisessä muodossa olevalla kalsiumpseudomonaatin dihydraa-tilla, joka on olennaisesti vapaa amorfisesta kalsiumpseudomonaatista, saadaan sopivasti olennaisesti kuvassa 1 esitetyn mukainen jauheen röntgensäde-diffraktogrammi (käyttäen kupari-Ka-säteilyä).

Kiteisessä muodossa olevalla kalsiumpseudomonaatin dihydraa-tilla, joka on olennaisesti vapaa amorfisesta kalsiumpseudomonaatista, saadaan sopivasti olennaisesti kuvassa 2 esitetyn mukainen infrapunaspektri (nujolissa).

Tässä keksinnössä saadaan aikaan kiteistä kalsiumpseudomonaatin dihydraattia, jota voidaan käyttää ihmis- tai eläinruumiin käsittelemiseen.

3 84179

Edelleen tässä keksinnössä saadaan aikaan menetelmä kiteisen kalsiumpseudomonaatin dihydraatin valmistamiseksi, jossa menetelmässä pseudomonaatti-ionien annetaan reagoida kal-siumionien kanssa vesipitoisessa liuottimessa, minkä jälkeen kiteinen kalsiumpseudomonaatin dihydraatti otetaan talteen tästä liuoksesta.

Menetelmä toteutetaan mieluiten siten, että kalsiumionien lähde lisätään pseudomonihapon tai pseudomonaattisuolan vesiliuokseen.

Pseudomonihapon tai pseudomonaatti-ionien liuos on mieluiten saatu viljelemällä Pseudomonas fluorescens-bakteereita (NCIB 10586) aerobisesti. Tällainen liuos voi olla se viljelyalus-ta, jossa näitä organismeja on kasvatettu tai se on voitu valmistaa siten, että tällainen alusta puhdistetaan esim. uuttamalla pseudomonihappo tällaisesta kasvatusalustasta polaarista, orgaanista, veteen sekoittumatonta liuotinta käyttäen, kuten on esitetty julkaisussa EP-0 005 614, minkä jälkeen pseudomonihappo uutetaan takaisin vesiliuokseen, mieluiten heikosti alkaliseen vesiliuokseen. Vaihtoehtoisesti pseudomonihapon tai pseudomonaatti-ionien liuos on voitu valmistaa siten, että pseudomonihappoa tai sen suolaa liuotetaan vesipitoiseen liuottimeen.

Menetelmässä käytettävä vesipitoinen liuotin voi olla vettä tai veden ja orgaanisen liuottimen seos.

Käytetty orgaaninen liuotin voi olla veteen sekoittuvaa tai veteen sekoittumatonta. Orgaaninen liuotin on mieluiten veteen sekoittuvaa.

Sopivia orgaanisia liuottimia ovat metanoli, propanoli ja asetoni.

Orgaanisena liuottimena käytetään mieluiten metanolia ja asetonia.

4 84179

Kalsiumpseudomonaatin dihydraatin talteenottaminen toteutetaan mieluiten kiteyttämällä tai saostamalla vesipitoisesta liuotti-mesta, mieluiten vedestä.

Kun vesipitoinen liuotin on veden ja orgaanisen liuottimen muodostama seos, niin talteenottamista voidaan helpottaa laimentamalla vesipitoinen liuotin vedellä tai siten, että orgaaninen liuotin poistetaan selektiivisesti. Selektiivinen poistaminen suoritetaan mieluiten haihduttamalla.

Menetelmän suositeltavimmassa muodossa vesipitoisessa liuotti-messaolevan pseudomonihapon liuoksen annetaan reagoida kalsium-ionien lähteen kanssa. Kalsiumionien lähteenä käytetään mieluiten kalsiumoksidia.

Vesipitoinen liuotin on sopivasti veden ja metanolin seos, jolloin metanoli poistetaan selektiivisesti ennen talteenottamista, mieluiten haihduttamalla.

Kalsiumpseudomonaatin dihydraatti otetaan mieluiten talteen saostamalla tai kiteyttämällä, mieluiten vedestä.

Tämän menetelmän vaihtoehtoisessa, suositeltavassa muodossa vesipitoiseen liuottimeen valmistetun pseudomonihapon suolan liuoksen annetaan reagoida kalsiumionien lähteen kanssa, joka lähde on mieluiten liukoista kalsiumsuolaa. Pseudomonihapon suoloina käytetään mieluiten litium-, natrium- ja kaliumsuoloja. Erityisen suositeltava suola on natriumsuola.

Liukoinen kalsiumsuola on sopivasti kalsiumkloridi tai kalsium-asetaatti, mieluiten kalsiumkloridi.

Kalsiumpseudomonaatin dihydraattia voidaan myös valmistaa siten, että kalsiumpseudomonaattia liuotetaan vesipitoiseen liuottimeen, jonka jälkeen dihydraatti otetaan talteen kiteyttämällä tai saos- 5 84179 tamalla, mieluiten vedestä.

Ohessa käytetyllä käsitteellä "kalsiumpseudomonaatti" tarkoitetaan sitä kalsiumsuolan muotoa, Joka on amorfinen ja joka ei ole hydratoitunut.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Julkaistussa UK-patenttihakemuksessa no 2 097 670 esitetään pseudomonihapon ja sen suolojen sekä estereiden käyttö kasvua edistävänä aineena karjassa. Kiteisen kalsiumpseudo-monaatin yllättävän lämpöstabiilisuuden arvellaan saavan aikaan pseudomonihapon stabiilimman muodon, jota voidaan käyttää kasvua edistävänä aineena, etenkin sellaisina lääke-ainevalmisteina, joihin liittyy kohenneita lämpötiloja.

Näin ollen tässä keksinnössä saadaan aikaan menetelmä, joka parantaa karjan painon lisääntymistä sekä rehun hyväksikäytön tehokkuutta ja jossa menetelmässä karjalle annetaan 6 84179 kasvua edistävä, ei-toksinen määrä kiteistä kalsiumpseudo-monaattia tai sen hydraattia.

Menetelmässä käytetään mieluiten kiteistä kalsiumpseudo-monaatin dihydraattia. Kiteistä kalsiumpseudomonaattia tai sen hydraattia voidaan antaa kaikille karjaeläimille, kuten sioille, siipikarjalle ja märehtijöille, kuten naudoille ja lampaille. Se soveltuu erityisesti porsaiden painon lisääntymisen sekä rehun hyväksikäytön tehokkuuden parantamiseen.

Kiteistä kalsiumpseudomonaattia tai sen hydraattia, mieluiten dihydraattia voidaan antaa suun kautta, mieluiten karjalle annettavaan rehuun tai veteen sekoitettuna. Vaivatto-mimmin sitä annetaan rehuun sekoitettuna, pitoisuutena 2-300 ppm, mieluummin alle 100 ppm:n pitoisuutena, esim. pitoisuutena 10-40 ppm.

Rehun seassa tapahtuvaa antamista varten kiteinen kalsium-pseudomonaatista tai sen hydraatista, mieluiten dihydraatis-ta, tehdään vaivattomimmin esiseos yhdessä sopivan kantaja-aineen kanssa.

Sopivia kantaja-aineita ovat inertit tavanomaiset aineet, kuten jauhemainen tärkkelys. Myös muita tavanomaisia esi-seosten kantaja-aineita voidaan käyttää.

Niihin ihmisissä esiintyviin tarttuviin sairauksiin, joiden torjumiseen tämän keksinnön mukaiset yhdisteet ovat erityisen käyttökelpoisia, kuuluvat sukupuolisesti välittyvät taudit; hengityselinten infektiot; bakteerin aiheuttama aivo-selkäytimen tulehdus; sekä ihon ja pehmeiden kudosten tulehdukset .

Eläimissä niitä voidaan käyttää karjan utaretulehduksen, sikojen punataudin sekä eläimissä, kuten kalkkunoissa, kananpojissa, sioissa ja naudoissa esiintyvien, mykoplasman 7 84179 aiheuttamien tulehdusten ja silmien tulehdusten käsittelemiseen.

Eräitä ihmisissä ja eläimissä esiintyviä sairauksia, jotka ovat mykoplasman aiheuttamia tai joissa niiden merkitys on huomattava ja joita sairauksia vastaan tämän keksinnön mukaiset yhdisteet ovat tehokkaita, ovat seuraavat:

Linnut M. gallisepticum - kananpoikien ja kalkkunoiden krooninen hengityselinten sairaus (ilmapussien muodostuminen)

Nauta M. bovis - utaretulehdus, hengityselinten sairaudet sekä karjan niveltulehdus M. dispar - vasikoiden keuhkokuume Siat M. hyopneumoniae - sikojen paikallinen keuhkokuume M. hyorhinis - sikojen niveltulehdus M. hyosynoviae

Ihminen M. pneumoniae - primääri epätavallinen keuhkokuume Tämän keksinnön mukaiset yhdisteet ovat erityisen käyttökelpoisia eläimissä, kuten sioissa, naudoissa ja lampaissa esiintyvän mykoplasman ja/tai bakteereiden aiheuttaman keuhkokuumeen käsittelemiseen, koska nämä aineet ovat myös aktiivisia bakteereita Bordetella bronchiseptica, Pasteuralla multocida ja Haemophilus spp vastaan, joilla bakteereilla on usein osuutta tähän sairauteen.

Nämä valmisteet voidaan saattaa sellaiseen muotoon, että niitä voidaan antaa millä tavalla tahansa, antotavan riippuessa käsiteltävästä sairaudesta. Nämä valmisteet voivat olla tabletteina, kapseleina, jauheina, rakeina, pastilleina, nestemäisinä tai hyytelö- 8 84179 mäisinä valmisteina, kuten myös suun kautta annettavina, paikallisesti käytettävinä tai steriileinä, ruuansulatuskanavan ulkopuolisesti annettavina suspensioina.

Suun kautta annettavat tabletit ja kapselit voivat olla yksikkö-annoksina, ja ne saattavat sisältää tavanomaisia täyteaineita, kuten sitovia aineita, esimerkiksi siirappia, arabikumia, gelatiinia, sorbitolia, kasvikumia tai polyvinyyli-pyrrolidonia; täyteaineita, esimerkiksi laktoosia, sokeria, maissitärkkelystä, kalsiumfosfaat-tia, sorbitolia tai glysiiniä; tableteissa käytettävää liukastinta, kuten magnesiumstearaattia, talkkia, polyetyleeniglykolia tai pii-oksidia; liukenemisen apuaineita kuten perunatärkkelystä; tai hyväksyttäviä kostutusaineita, kuten natriumlauryylisulfaattia. Nämä tabletit on voitu pinnoittaa niillä menetelmillä, jotka ovat hyvin tunnettuja normaalissa farmaseuttisessa käytännössä. Suun kautta annettavat valmisteet voivat olla esimerkiksi vesipitoisina tai öljymäisinä suspensioina, liuoksina, emulsioina, siirappeina, tai eliksiireinä, tai ne voivat olla kuivana tuotteena, jotka ennen käyttöä saatetaan lopulliseen muotoonsa vedellä tai muulla sopivalla välitysaineella. Tällaiset nestemäiset valmisteet voivat sisältää tavanomaisia lisäaineita, kuten suspendoivia aineita, esimerkiksi sorbitolia, siirappia, metyyliselluloosaa, glukoosisiirappia, gelatiinia, hydrogenoituja syötäviä rasvoja;emulgoivia aineita, esimerkiksi lesitiiniä, sorbitaani-mono-oleaattia tai arabikumia, vettä sisältämättömiä välitysaineita (joihin voi kuulua syötäviä öljyjä) , esimerkiksi manteliöljy, fraktioitua kookospähkinäöljyä, öl-jymäisiä estereitä, kuten glyseriiniä, propyleeniglykolia tai etyylialkoholia; säilöntäaineita, esimerkiksi metyyli- tai pro-pyyli-p-hydroksibentsoaattia tai sorbiinihappoa, ja toivottaessa tavanomaisia aromia antavia tai värjääviä aineita.

Lääkeaine voidaan valmistaa voiteen, veden tai salvan muotoon iholla paikallisesti käytettäväksi. Ne voidemaiset ja salvan muodossa olevat käyttömuodot, joissa lääkeainetta voidaan käyttää, ovat tavanomaisia, alalla hyvin tunnettuja käyttömuotoja, jotka on kuvattu esimerkiksi tavanomaisissa farmaseutiikan ja kosmetiikan oppikirjoissa, kuten kirjassa Harry's Cosmeticology, kustantaja Leonard Hill Books, sekä brittiläisessä farmakopeassa British Pharmacopoeia.

9 84179 Näitä käyttömuotoja voidaan käyttää sideharsoon sisältyneinä.

Nämä käyttömuodot saattavat sisältää myös muita lääkitseviä aineita, kuten bakteereita, sieniä ja viruksia torjuvia aineita, sekä tulehduksia estäviä aineita, esimerkiksi klooritetrasykliiniä, mikonatsolia, idoksuridiinia ja fenatsonia.

Peräpuikot sisältävät tavanomaista, peräpuikoissa käytettävää perusainetta, toisin sanoen kaakaovoita tai muita glyseridejä.

Ruuansulatuskanavan ulkopuolisesta annettavat, nestemäiset, yksikkö-annoksen muodossa olevat muodot valmistetaan lääkeainetta ja steriiliä välittäjäainetta käyttäen. Lääkeaine on voitu suspendoida välittäjäaineeseen, aina välittäjäaineesta ja käytettävästä pitoisuudesta riippuen. Tähän välittäjäaineeseen voidaan liuottaa edullisesti apuaineita, kuten paikallisesti puuduttavia aineita, säilöviä ja puskuroivia aineita. Säilyvyyden parantamiseksi valmiste voidaan pakastaa sen jälkeen, kun se on täytetty ampulliin, ja vesi voidaan poistaa vakuumissa. Tämän jälkeen kuiva, lyofilisoitu jauhe suljetaan ampulliin. Lääkeaine voidaan steriloida etyleenioksidil-la ennen sen suspendoimista steriiliin välittäjäaineeseen. Valmisteeseen on edullisesti sisällytetty pinta-aktiivista ainetta tai kostuttavaa ainetta lääkeaineen tasaisen leviämisen helpottamiseksi.

Käytettäessä lääkeainetta paikallisesti korvassa, se on voitu valmistaa suspensioksi sopivaa nestemäistä kantaja-ainetta, kuten vettä, glyserolia, laimennettua etanolia, propyleeniglykolia, poly-etyleeniglykolia tai kiinteitä öljyjä käyttäen.

Käytettäessä lääkeainetta paikallisesti silmässä se on valmistettu suspensioksi sopivaa steriiliä vesipitoista tai vettä sisältämätöntä välittäjäainetta käyttäen. Siihen on voitu samoin sisällyttää lisäaineita, kuten puskureita, esimerkiksi natriummetabisulfiittia tai dinatriumedetaattia; säilöntäaineita, bakteereiden ja sienten kasvua estävät aineet, kuten fenyylielohopea-asetaatti tai -nitraatti, bentsalkoniumkloridi tai klooriheksidiini mukaan lukien, sekä siihen on voitu lisätä paksuntavia aineita, kuten hypromelloosia.

Lääkeainetta voidaan levittää iholle myös aerosolina.

10 84179

Paikallisesti käytettävien valmisteiden annostus riippuu luonnollisesti käsiteltävän alueen suuruudesta. Silmissä ja korvissa käytettävät annokset ovat suuruudeltaan tyypillisesti alueella 10-100 mg lääkeainetta.

Eläimissä esiintyvien nisäkässairauksien, erityisesti naudan utaretulehduksen, sisäiseen hoitoon käytettävät eläinlääketieteelliset valmisteet sisältävät tavallisesti lääkeaineen suspension, joka on valmistettu öljymäiseen välittäjäaineeseen.

Valmisteet saattavat sisältää 0,1-99 paino-%, mieluiten 10-60 paino-% lääkeainetta, riippuen sen antamistavasta. Valmisteiden ollessa yksikköannosten muodossa kukin yksikkö-annos sisältää mieluiten 50-500 mg lääkeainetta. Täysikasvuisen ihmisen hoitamiseen käytetyt annokset ovat suuruudeltaan mieluiten 100 mg:sta 3 grammaan vuorokautta kohden, esim. 250 milligrammasta 2 grammaan lääkeainetta vuorokaudessa, riippuen antamistavasta sekä antamiskertojen esiintymistiheydestä .

Vaihtoehtoisesti lääkeainetta voidaan antaa nautittavan kokonaisruokavalion osana. Tässä tapauksessa käytetyn lääkeaineen määrä voi olla vähemmän kuin 1 paino-% nautittavan ruuan määrästä, ja se on mieluiten vähemmän kuin 0,5 paino-% tästä määrästä. Eläinten ruokavalio voi koostua tavallisista rehuaineista, joihin lääke voidaan lisätä, tai lääkeaine on voitu sisällyttää johonkin esiseokseen, joka sekoitetaan rehuaineisiin.

Sopiva menetelmä lääkeaineen antamiseksi eläimille on lisätä sitä eläinten juomaveteen. Tässä tapauksessa lääkeaineen pitoisuus juomavedessä on noin 5-500 pg/ml, esim. pitoisuus 5-200 pg/ml on sopiva.

Edelleen tässä keksinnössä saatuja tuotteita käytetään menetelmässä ihmisissä ja eläimissä esiintyvien, bakteerei-den tai mykoplasmojen aiheuttamien tulehdusten hoitamiseksi, 11 84179 jossa menetelmässä käsittelyä tarvitsevalle ihmiselle tai eläimelle annetaan tehokas, ei-toksinen määrä kiteistä kalsiumpseudomonaattia tai sen hydraattia. Erityisiin ihmisissä ja eläimissä esiintyviin, bakteereiden ja/tai myko-plasmojen aiheuttamiin tulehduksiin, joita voidaan hoitaa tällä tavalla, kuuluvat sukupuolitaudit, hengityselinten tulehdukset, kuten bakteeriperäinen keuhkoputkentulehdus, bakteeriperäinen aivokalvontulehdus, epäspesifinen virtsaputkentulehdus ja keuhkokuume ihmisissä, sekä eläimissä esiintyvät hengityselinten tulehdukset, utaretulehdus, sikojen punatauti ja keuhkokuume.

Kuvaus 1

Amorfinen, vedetön kalsiumpseudomonaatti A 50 % metanolin (0,5 1) vesiliuoksessa olevaan pseudomoniha-pon A (35 g, 0,07 mol) liuokseen lisättiin annoksittain kalsiumoksidia (2,75 g, 0,049 mol), jolloin saatiin neutraali liuos (pH 7,1). Tätä liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa tunnin ajan, suodatettiin ja suodos haihdutettiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin kiinteätä vaahtoa. Vaahtoa hierottiin kuivan eetterin (0,5 1) kanssa tunnin ajan, minkä jälkeen seos suodatettiin, jolloin saatiin otsikon mukaista yhdistettä valkeana jauheena (33 g, 90 %), sulamispiste 70-76°C; γmax (KBr) 3600-3100, 2915, 1710, 1650 ja 1600-1530 cm-1; <max (EtOH) 220 nm (em 29840); δΗ (CD30D) 5,75 (1H, s, 2-H), 4,08 (2H, t,9'-H2), 3,9-3,7 (4H, m, 5-H, 7-H, 13-H, 16a-H), 3,58 (1H, m, 16b-H), 3,37 (1H, dd, 6-H), 2,8 (1H, m, 10-H), 2,7 (1H, dd, 11-H), 2,6 (1H, m, 4a-H), 2,22 (3H, m, 4b-H, 2'-H2), 2,2 (3H, s, 15-H3), 1,95 (1H, m, 8-H), 1,75-1,5 (6H, m, 9-H2), 12 841 79 3 -H2, β’-Η^. 1,4-1,3 (9H,m,12-H, 4'-H2, 5' -H2, 6' -H2, l'-Tl ) , 1;22 (3H, d, 14-H3) ja 0,95 (3H, d, 17-H3); 6c(CD3OD) 168,1 (C-1) , 158,9(0-3),-118,2(0-2), 76,1 (C-13), 70,7 (C-7) , 69,9 (C-6) , 66.3 (C-16), 64,7 (C-9), 61,3 (C-11), 56,8 (C-10), 43,8 (C-4), 43,6 (C-12), 41,4 (C-8), 38,1 (C-2'), 32,9 (C-9), 30,6, 30,5, 30.3 (C-4', 5'ja 6*), 29,8 (C-8'), 27,0 (C-3'ja 7'), 20,4 (C-14), 19.4 (C-15) ja 12,3ppm (C—17); m/e (Rel.int.) (positiivinen ioni FAB) 539 Qpseudomonaatti) Ca)+, 78 % (Todettu: C, 60,16; H, 8,77; Ca, 3,86. Yhdiste c52H86018Ca edellyttää C, 60.09; Η, 8'-34; Ca, 3.86%.

Lämpöstabiilisuutta koskevat tiedot: koskee kiteistä kalsium-pseudomonaatin dihydraattia, amorfista kalsiumpseudomonaattia ja pseudomonihappoa.

Näyte Kiteinen Vedetön Pseudomoni- kalsium- amorfinen happo dihydraatin kalsium- suola suola

Sulamis- 125-137°C 70-76°C 73-75° piste (vedettömänä)

Panoksen 92,1 89,9 91,9 puhtaus prosentteina *

Prosenttinen osuus alkuperäisestä aktiivisuudesta, kun** säilytetty 1 vrk, 50°C 98^9 83>3 77’9 8 vrk, 80°C 97 29 0 2 viikkoa, 37oc 100,2 97,7 98,6 50°c 98,7 80,1 55,7 80°C 94 14 0 * Ilmoitettu puhtaan, vapaan pseudomonihapon prosenttisena osuutena. ** Ilmoitettu prosenttisena osuutena alkuperäisestä puhtaudesta.

13 841 79

Biologiset tiedot a) Mykoplasma

Esimerkkien mukaisten yhdisteiden aktiivisuus eri mykoplasmaorga-nismeja vastaan testattiin in vitro, käyttäen Friis-kasvatusalus-taa, joka oli tehty kiinteäksi 0,9 %:lla agaroosia, ja johon siirrostettiin 10 - 10 organismia (C.F.U.). Pienimmät myko- plasmojen kasvua estävät pitoisuudet (MIC) määritettiin 6 vuorokautta 37 °C:n lämpötilassa tapahtuneen inkuboinnin jälkeen, ja nämä pitoisuudet on esitetty taulukossa 1.

b) Eläinlääketieteelliset bakteerit

Esimerkkien mukaisten yhdisteiden aktiivisuus eri eläinlääketie-teellisesti tärkeitä bakteereita vastaan määritettiin in vitro käyttäen kaksinkertaisia laimennussarjoja sekä Diagnostic Sensitivity 4

Testagaria, johon siirrostettiin 10 organismia. MIC-arvot määritettiin 18 tuntia 37°C:n lämpötilassa tapahtuneen inkuboinnin jälkeen ja ne on esitetty taulukossa 2.

c) Ihmiseen vaikuttavat bakteerit

Esimerkkien mukaisten yhdisteiden aktiivisuus sellaisia eri bakteereita, joilla on tärkeä osa ihmisessä esiintyvissä sairauksissa, vastaan määritettiin in vitro käyttäen laimennossarjoja ja ravinto-agaria, joka sisälsi 5 % hevosen verta. MIC-arvot määritettiin 18 tuntia 37°C:n lämpötilassa tapahtuneen inkuboinnin jälkeen, ja ne on esitetty taulukossa 3.

Seuraavissa taulukoissa käytettiin seuraavia lyhenteitä: NT - ei määritetty NG - ei kasvua C - kontaminoitunut

Kalsiumpseudomonaatirr dihydraatin MIC-arvot (pg/ml) mykoplasmoja vastaan

Taulukko 1 u 84179

Organismi MIC

(jug/ml)

M. hyopneumoniae NB12 NG

M. hyopneumoniae JF 435 2,5 M. hyopneumoniae HK (2) 2,5 M. hyopneumoniae Str 11 2,5 M. hyopneumoniae J2206/183b 2,5 M. hyopneumoniae MS16 2,5 M. hyopneumoniae'PW/C/210 2,5 M. hyopneumoniae LABER 2,5 M. hyopneumoniae UCD1 2.5 M. hyopneumoniae ΤΑΜ 6N 2,5 M. hyopneumoniae ATTCC 25095 2,5 M. hyopneumoniae NCTC 10110 2,5 + MEAN 2,5 M. hyorhinis ATCC 23234 1,0 M. hyorhinis ATCC 25021 1,0 M. hyosynoviae ATCC 25591 0,5 M. bovis NCTC 10131 0, 025 M. bovigenitalium ATCC 14173 0,1

M. dispar NCTC 10125 NG

M. gallisepticum S6 >10 M. pneumoniae ATCC 15492 5

Kalsiumpseudomonaatin- dihydraatin MIC-arvot (pg/ml) eläinlääke tieteellisiä bakteereita vastaan

Taulukko 2 15 841 79

Organismi MIC

agarilla E. coli NCTC 10418 80 E. coli El 80 S. dublin S7 80 S. typhimurium S18 80

Bord.bronchiseptica B08 ’ 5,0

Bord.bronchiseptica B09 1,3

Past.multocida PA1 0.07

Past.multocida PA2 NG

Past.haemolytica PA5 2.5

Erysipelothrix rhusiopathiae NCTC 20 8163

Corynebacterium pyogenes CY1 >80

Staph.aureus B4 (resist.peni- siliinille) 0,16

Staph.aureus 152 (herkkä pe-nisiliinille) 0,16

Staph.aureus Oxford < ,1

Strep.suis (ryhmä D) SPS11 0,63

Strep.uberis SPU1 0,07

Strep .dysgalaciae SPD1 0; 1 6

Strep.agalactiae SPA1 0.16 B . subtilis ATCC 6633 0,07

Staph, aureus (Mexi) 0,16

Staph.aureus M60 0,16

Moraxella Bovis 0,31

Kalsiumpseudomonaatin- dihydraatin MIC-arvot (pg/ml) ihmiseen vaikuttavia bakteereita vastaan

Taulukko 3 16 841 79

Organismi MIC

(pg/ml) E. coli NCTC 10418 128 E. coli ESS 2 R. mirabilis 889 128 K. aerogenes A >128 P. aeruginosa 10662 >128

Pasteurella multocida 1633 0,5

Haemophilus influenzae Q1 0,13

Haemophilus influenzae Wy21 0,13

Neisseria catarrhalis 1502 0,13

Bacillus subtilis 6633 0,5

Corynebacterium xerosis 9755 >128

Sareina lutea 8340 >128 S. aureus Oxford 0,13 S. aureus Russell 0,25 S. aureus W2827 0,25 S. aureus T2P- 0,25 S. aureus T22P- 0,25 S. aureus T63P+ 0,25 S. aureus T67P+ 0,5 S. aureus V331 0,5 S. aureus V352 0,5 S. pyogenes BcA 0,5 S. pyogenes CN10A 0,03 S. pyogenes 1947a 0,13 S. pyogenes 1953-A 0,13 S. agalactiae 2788-B 0,5 S. agalactiae 2798B 0,5 S. agalactiae 2866B 0,5 S- spp.64/848-C 0,5

Streptococcus Spp 2465C 0,5

Streptococcus Spp 2761C 0,5 17 841 79

Organismi MIC

_(yg/tnl)

Streptococcus Spp 2373C 0,5 S. faecalis Tunisia 128 S. faecalis I (ER+) 128 S. faecalis PAGE 128 S. faecalis I 128 S. pneumoniae CN33 0,03

Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä.

Esimerkki 1

Kalsiumpseudomonaatin dihydraatti 50 %:sessa metanolin vesiliuoksessa (1,5 1) olevaan pseudomonihapon (100 g, 0,2 mol) liuokseen lisättiin annoksittain kalsiumoksidia (7,1 g, 0,127 mol), jolloin saatiin neutraali liuos (pH 7,0).

Liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa tunnin ajan, jonka jälkeen liuotin haihdutettiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin vaahtoa. Tämä vaahto lisättiin vähitellen sekoittaen veteen (2 1) huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen, kun liuosta oli sekoitettu tunnin ajan, se suodatettiin ja suodoksen annettiin seisoa 48 tuntia huoneen lämpötilassa. Kiteinen tuote suodatettiin, jolloin saatiin otsikon mukaista tuotetta (31,0 g, 29%), sulamispiste 135-137°C; y (KBr) 3600-3100 , 1710, 1650 ja 1600-1530 cm-1 . (EtOH) 220 nm * IUäX f A rtlciX i ( Emax 30840); 6h (CD3OD) 5.75 (1H, s, 2-H), 4,08 (2H, t, 9 -H2), 3,9 -3.7 (4H, m, 5-H, 7-H, 13-H, 16 -H), 3,58 (1H, m, 16b-H) , 3,37 (1H, dd, 6-H ), 2,8 (1H, m, 10-H), 2;7 (1H, dd, 11-H), 2,6 (1 H, m, 4a-H), 2,22 (3H, m, 4 -H, 2% -H2), 2,2 (3H, s, 15-H3), 1,95 (1H, m, 8-H) , 1,75 - 1,5 (6H, m, 9-H^, 3' -H2, δ' -H2), 1.4 - 1,3 (9H, m, 12-H, 4' -H2, 5' -H2, θ' -H2, 7 - H2), 1,22 (3H, d, 14-H3) ja 0,95 (3H, d, 17-H3) ; ^(CD^D) 184,5 (C-Γ), 168,1 (C-1), 159 (C-3) , 118,2 (C-2) , 76 (C-5) , 71,6 (C-13), 70,6(C-7), 69,9 (C-6) , 66,2 (C-16'), 64,7 (C-9 '), 61,2 (C-11), 56,8 (C-10), 43.8 (C-4), 43,6(C-12), 41,4 (C-8), 38}5 (C-2'), 32,9 (C-9), 30,7, 30,5, 30,3, (C-4', δ' ja 6*), 29,8 (C-8 ), 27,2, 27,1 (c-3’ ja 7'), 20,4 (C-14), 19.4 (C—15) ja 12,3 ppm (C-17)

Todettu: C, 57,97; H, 8,35; Ca, 3,68.

Yhdisteessä C52H86°1gCa.2H20 tarvitaan C:tä 58,08 %; H:ta 8,44 %; ie 84179

Carta 3/37 %.

Todettu vesipitoisuus oli 3/70. 2^0 edellyttää 3,35 %. Kiteytymisen emäliuokset haihdutettiin alennetussa paineessa puoleen alkuperäisestä tilavuudestaan, jolloin 24 tuntia kestäneen seisottami-sen jälkeen saatiin kalsiumpseudomonaatin dihydraatin toinen saanto (39 g, 36 %), sulamispiste 132-134°C (vesipitoisuus 3,44 %).

Esimerkki 2

Kalsiumpseudomonaatin dihydraatti

Pseudomonihappoa (93 %, -1400 g, 2,6 mol) liuotettiin metanoliin (7 1) ja suodatettiin ennen liuoksen laimentamista varovaisesti vedellä (5 1). Pseudomonihapon liuokseen, jota sekoitettiin, lisättiin annoksittain kalsiumoksidia (92 g, 1,64 mol). Kun tämän liuoksen pH saavutti arvon 7, seos suodatettiin, jolloin saatiin kirkas keltainen liuos, jonka pH oli kohonnut arvoon 7,9. Sen jälkeen, kun metanoli oli haihdutettu alennetussa paineessa, jolloin lopulliseksi tilavuudeksi saatiin 5,6 1, liuos laimennettiin vedellä (400 ml) ja sen annettiin kiteytyä. 24 tuntia kestäneen seisotta-misen jälkeen seos laimennettiin jälleen vedellä (2,5 1) ja kiteytyminen jatkui 18 tuntia. Kiteistä tuotetta sekoitettiin, jolloin saatiin lietettä, joka suodatettiin ja talteenotettu tuote pestiin Imettämällä se veteen (2,5 1). Valkea rakeinen tuote suodatettiin ja kuivattiin yön yli tuulettimella varustetussa uunissa huoneen lämpötilassa. Tuotetta jauhettiin hieman ennen sen kuivaamista lei-jupedistä muodostuvassa ilmakuivaimessa 2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa, jolloin saatiin kalsiumpseudomonaatin dihydraattia (1125 g 80 %), sulamispiste 135 °C; todettiin: vettä Karl Fischer-reaktiol-la 3,6 %; ZHjO edellyttää 3,35 %.

Valmistaminen toistettiin ja saannoiksi saatiin 1300 g, 93 % ja 1275 g, 91 %.

Esimerkki 3

Kalsiumpseudomonaatin dihydraatti

Metanolin (1 1) ja veden (750 ml) seokseen valmistettuun, suodatet- 19 841 79 tuun pseudomonihapon (200 g, 0,4 mol) liuokseen lisättiin annoksittain kalsiumoksidia (13,5 g, 0,24 mol), jolloin saatiin neutraali liuos (pH 7,2). Liuos-suodatettiin ja metanoli haihdutettiin suo-doksesta alennetussa paineessa. Vesipitoinen tiiviste laimennettiin suurin piirtein 1 litran tilavuuteen ja jätettiin kiteytymään 24 tunniksi huoneen lämpötilaan. Valkoinen kiteinen tuote suodatettiin ja pestiin vedellä (500 ml) ja kuivattiin 55 C°:ssa alennetussa paineessa. Tämän jälkeen tuotteen annettiin asettua tasapainoon kosketuksissa ilmakehän kanssa 12 tunnin ajan, jolloin saatiin kiteistä kalsiumpseudomonaatin dihydraattia (165 g, 77 %), sulamispiste 125-132 °C (vesipitoisuus Karl Fischerin reaktiolla 3,4 %) .

Esimerkki 4

Kalsiumpseudomonaatin dihydraatti

Pseudomonihappoa (1,0 g, 2,0 mmol) sekoitettiin veteen (20 ml) ja neutraloitiin hitaasti natriumhydroksidiliuoksella (1,8 ml, 1 M) (pH 7,1). Tähän seokseen lisättiin kalsiumkloridia (0,25 g, 2,25 mmol) ja sekoittamista jatkettiin, jolloin saatiin kirkas liuos. 18 tunnin seisottamisen jälkeen kiteinen tuote suodatet-. tiin, pestiin vedellä (5 ml) ja kuivattiin, jolloin saatiin kalsiumpseudomonaatin dihydraattia (0,5 g, 48 %), sulamispiste 133-136 °C.

Esimerkki 5

Kalsiumpseudomonaatin dihydraatti

Pseudomonihappoa (100 g) liuotettiin asetonin ja veden (100 ml ja 50 ml, vastaavasti) seokseen. Tähän lisättiin natriumhydroksidin liuosta (10 % paino/tilavuus) sekä lisäksi vettä, jolloin saatiin suurin piirtein natriumsuolan 10-12 %:nen (paino/tilavuus) liuos, pH 8. Tähän lisättiin kalsiumkloridin (23 g) vesiliuosta, sekä kiteytymiskeskuksia tarpeen mukaan, ja kalsiumpseudomonaatin annettiin kiteytyä 20-30 °C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen tuote eristettiin, pestiin ja kuivattiin, jolloin saantona oli 100 g kiteistä dihydraattia.

20 841 79

Esimerkki 6

Kalsiumpseudomonaatin dihydraatti

Pseudomonihapon tuotantoliuos uutettiin metyyli-isobutyyli-ketoni11a. Tämän jälkeen orgaaninen uutos tiivistettiin ja uutettiin takaisin natriumhydroksidin vesiliuokseen, pH 8.

Tuloksena oleva takaisin uutettu seos tiivistettiin tarvittaessa, jolloin saatiin suurin piirtein 10-%:inen (paino/ti-lavuus) natriumpseudomonaatin liuos. Tämän jälkeen tuotettiin kalsiumpseudomonaatin dihydraattia siten, että liuokseen lisättiin sopivaa saostavaa ainetta, kuten esimerkissä 5.