FI78917C - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt aktiva substituerade dipeptider. - Google Patents

Description

1 78917

Menetelmä valmistaa terapeuttisesti aktiivisia substituoituja dipeptideja - Förfarande för framställning av terapeutiskt aktiva substituerade dipeptider

Enkefaliini on luonnon opiaatti reseptori-agonisti. Sen uskotaan olevan seos kahdesta pentapeptidistä: H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH (metioniini-enkefaliini) ja H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH (leusiinienkefaliini). Jäljempänä käytetään enkefaliini nimeä geneerisesti kattamaan kaikki tällaiset yhdisteet.

Belyzzi et ai., Natura, 260, 625 (1976), ovat ilmoittaneet, että enkefaliinia inisoitaessa rottien aivokammioon saadaan analge-siatila. Alalla tiedetään myös, että enkefaliiniin vaikuttaa geneerisesti enkefalinaaseina tunnettu entsyymiryhmä. Myös nämä entsyymit esiintyvät luonnossa ja ne inaktivoivat enkefaliinin.

Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa No. 79105015.6, julkaisu No. 12401, on esitetty eräitä dipeptidijohdoksia, joilla kuvataan olevan antihypertensiivisiä vaikutuksia.

Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa No. 81110337.3, julkaisu No. 54862, on esitetty eräitä dipeptidiyhdisteitä, joilla on enkefalinaasia inhiboiva aktiivisuus.

Käsillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä valmistaa terapeuttisesti aktiivisia substituoituja dipeptideja, joiden kaava I on T*

RlC*H-NH-C *H-CONH(CH2)-C*-COR6 (I) COR2 R3 R5 tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja, jossa kaavassa: 2 78917

Rl on fenyylialempialkyyli tai difenyylialempialkyyli, R2 on hydroksi, -OCI^OCO-alempialkyyli tai ryhmä R7 R8 0^0 I ! -och2-ch-ch2 jossa R7 ja Rg tarkoittavat toisistaan riippumatta Ci~Cg alkyylia tai r2 on -O-alempialkyyli-O-fenyyli, -O-CH2-CHOH-CH2-OH, fenyyli-Ci~C4-alkoksi tai aminofenyyli-Ci~Cg-alkoksi, R3 on 1-bentsyyli tai fenyylibentsyyli, R4 on vety, alempialkyyli tai hydroksi, R5 on vety, ja

Rg on hydroksi, fenyyli-Ci~C4-alkoksi, -0CH20C0-alempialkyyli, Ci-Cg-alkoksi tai ryhmä -OCH2-CH-CH2,

V

R7 r8 jossa R7 ja Rq toisistaan riippumatta tarkoittavat Ci-Cg-alkyylia.

Tähdet kaavassa I merkitsevät niitä hiiliatomeja, jotka voivat olla asymmetrisiä (kiraalisia) keskuksia. Keksinnön mukaan voidaan valmistaa kaikkia isomeerejä näissä keskuksissa sekä puhtaassa muodossa että seoksena.

Eräs mielenkiintoinen ryhmä kaavan I mukaisia yhdisteitä ovat ne, joissa R4 on hydroksi tai alempi alkyyli so. R4 ei merkitse vetyä. Esimerkkejä tällaisista R4 ryhmistä ovat hydroksi ja metyyli.

Tässä yhteydessä käytettynä ja ellei toisin ole mainittu nimitykset alkyyli ja alkoksi tarkoittavat sellaisia ryhmiä, joissa 11 3 78917 on 1 - 6 hiiliatominen suora tai haarautunut hiiliketju. Nimitys pivaloyylioksimetyyli on triviaalinimi tai yleisnimi (2,2-di-metyyli-l-oksopropoksi) metyyli ryhmälle.

Eräät rakennekaavan I mukaiset yhdisteet muodostavat suoloja farmaseuttisesti hyväksyttävien happojen kanssa. Käyttökelpoisia ovat suolahappo, rikkihappo, etikkahappo, maleiinihappo, fumarihappo ja vastaavat hapot.

Sellaiset rakennekaavan I mukaiset yhdisteet, joissa R2 ja/tai Rg tarkoittavat hydroksi, muodostavat suoloja farmaseuttisesti hyväksyttävien emästen kanssa. Tähän tarkoitukseen kalsiumhyd-roksidi sekä natrium- ja kaliumkarbonaatti. Mahdollisia ovat lisäksi myös suolat, jotka on muodostettu farmaseuttisesti hyväksyttävien amiinien kanssa, joita ovat esimerkiksi ammoniakki, N-metyyliglukamiini, bentsyyliamiini ja morfoliini.

Yksittäisiä tämän keksinnön piiriin kuuluvia yhdisteitä, joilla on rakennekaava I, ovat seuraavat: 1. N-[N-[L-l-(2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi)metoksi]karbonyyli]- 2-fenyylietyyli]-L-fenyylialanyyli]-β-alaniini, (2,2-dimetyyli-

l-oksopropoksi )metyyliesteri ; yhdiste B

2. N-[N-[L-l-[fenyylimetoksi]karbonyyli]-2-fenyylietyyli]-L-fenyylialanyyli]-P-alaniini, (2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi]-metyyliesteri; yhdiste A

3. N-[N-[L-l-karboksi-2-(4-fenyyli)fenyylietyyli]-L-fenyylialanyyli ]-0-alaniiniy yhdiste J

4. N-[N-[L-l-karboksi-2-fenyylietyyli]-L-(4-fenyyli)fenyyli-alanyyli]-0-alaniini; yhdiste K

4 78917 5. N-[L-l-karboksi-2-fenyylietyyli]-1-fenyylialanyyli-β-alaniini, 2,2-dimetyyli-l,3-dioksolan-4-yylimetyyliesteri sp. 153 - 8°C.

6. N-[N~[L-l-karboksi-2-fenyylietyyli]-L-fenyylialanyyli]-L-(rf-metyyli)-(3-alaniini; yhdiste G

7. N-[N-[(L-l-karboksi-2-fenyylietyyli)]-L-fenyylialanyyli]-/3-alaniini, 2-fenoksietyyliesteri; sp. 141 - 144°C, valkoiset kiteet 8. N-[N-[L-[l-[(2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi)metoksi]-karbo-nyyli] - 2-f enyylietyyli ] -L-f enyylialanyyli ]-/3-alaniini ; sp. 93 - 95°C, valkoiset kiteet 9. N-[N-[L-[1-[(2,3-dihydroksi)-1-propoksi]karbonyyli]— 2— fenyylietyyli]-L-fenyylialanyyli]-0-alaniiniy

valkoinen amorfinen kiinteä aine, muuttuu: 85°C, hajoaa: 180°C

10. N-[N-[L-[l-[(2,2-dimetyyli-l,3-dioksolan-4-yyli)metoksi]-karbonyyli ] -2-f enyylietyyli ] -L-f enyylialanyyli ] -/3-alaniini; sp. 80 - 82°C, valkoiset kiteet 11. N-[N-[L-[1-1(2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi)metoksi]-karbonyyli]-2-(4-fenyyli)fenyylietyyli]-L-(4-fenyyli)fenyyli-alanyyli]-0-alaniini; sp. 138 - 140°C, valkoinen kiinteä aine

12. N-[N-[L-[1-[(2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi)metoksi]-karbonyyli ] -2-f enyylietyyli ] -L-f enyylialanyyli ] -D, L-oc-metyyli-0-alaniini; valkoiset kiiteet, sp. 79 - 85°C

13. N-[N-[L-[1-[(2-fenoksi)etoksi]karbonyyli]-2-fenyylietyyli]-L-f enyylialanyyli ]-D,L-o(-metyyli-P-alaniini; sp. 107 - 111°C, valkoinen 5 78917 14. N-[N-[L-[1-[(2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi)metoksi]-karbo-nyyli]-2-fenyylietyyli]-L-(4-fenyyli)-fenyylialanyyli)-D,L-ot-metyyli-fl-alaniini; sp. 129 - 130°C, valkoinen kiinteä aine 15. N-[N-[L-[1-[(2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi)metoksi]-karbo-nyyli]-2-[4-fenyyli)fenyylietyyli]-L-(4-fenyyli)fenyylialanyyli ]-D,L-Oi-metyyli-$-alaniini, amorfinen kiinteä aine 16. N-[N-[L-[1-[(2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi)metoksi]-karbo- nyyli]-2-f enyylietyyli]-L-f enyylialanyyli 1-oi-metyylialaniini; keltainen öljy, toU2^ = -18,3° (DMF, C = 1)

D

17. N-[N-[L-[1-[(2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi Jmetoksi]-karbo- nyyli]-2-(4-metoksi)fenyylietyyli]-L-fenyylialanyyli-D,L-a- metyyli-/i-alaniini-bentsyyliesteri; kirkas öljy, [X]26 = -19,5° [DMF, C = 1,3]

D

18. N-[N-[L-[1-[(2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi)metoksi]-karbo-nyyli]-2-(4-metoksi)fenyylietyyli]-L-fenyylialanyyli-Ä-alaniini, väritön viskoosi siirappi 19. N-[(D-l-karboksi-2-fenyylietyyli1-L-leusyyli-L-fenyyli-alaniini, sp. 191 - 192°C, väritön kiinteä aine 20. N-[N-[(S)-[l-[(R,S)-(2,2-dimetyyli-l,3-dioksalan-4-yyli)-metoks i]-karbonyyli]-2-fenyylietyyli]-(L)-fenyylialanyyli]- (R) -2-hydroksi-/3-alaniini, sp. 125 - 128°C, valkoisia kiteitä 21. N-[N-[(S)-[1-[(R,S)-(2,2-dimetyyli-l,3-dioksalan-4-yyli)-metoksi]-karbonyyli]-2-fenyylietyyli]-(L)-fenyylialanyyli]- (S) -2-hydroksi-^-alaniinin metyyliesteri, sp. 78 - 82°C, valkea kiinteäaine

Keksinnön piiriin kuuluvat myös edellä lueteltujen yksittäisten yhdisteiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

6 78917

Rakennekaavan I mukaisten yhdisteiden analgeettista vaikutusta voidaan hyödyntää monina alan tuntemina annostusmuotoina kuten oraaliseen antamiseen tarkoitettuina tabletteina, kapseleina tai heliksiireinä tai parenteraaliseen antamiseen tarkoitettuina steriileinä liuoksina tai suspensioina. Näiden farmaseuttisten annostusmuotojen valmistuksessa käytetään tämän keksinnön mukaisen yhdisteen lisäksi edullisesti farmaseuttisesti hyväksyttäviä ja yhteen sopivia apuaineita, sideaineita, säilytys-aineita, stabilointiaineita, falvorlaineita ja vastaavia. Kussakin annostusmuodossa aktiivista yhdistettä annetaan annosvälillä n. 1 - 100 mg/kg. Annokset annetaan 3-8 tunnin välein. Annostuksen määrä ja taajuus riippuu kuitenkin sellaisista tekijöistä kuin kivun voimakkuus, potilaan fyysinen yleistila, mukaan lukien potilaan ikä ja paino, ja muista alan ammattimiesten tietämistä tekijöistä.

Tämän keksinnön mukaiset yhdisteet voidaan valmistaa käyttämällä polypeptidialalla yleisesti tunnettuja rekatioita ja reagensse-ja.

Yleisesti puhuen valmistetaan kaavan I mukaiset yhdisteet jollakin sopivalla seuraavalla menetelmällä (seuraavissa kaavoissa p, R^, R2, R3, R4, R5 ja Rg tarkoittavat samaa kuin edellä, mukaan lukien edellä annetun ehdon poissulkevat merkitykset ja mukaan lukien reaktiivisten ryhmien mahdolliset suojaukset); a) pelkistetään kaavan XX mukainen yhdiste C=N-kak-soissidoksessa Τ’

R1-C=N-CH-CONH(CH2)-CR4R5COR6 -* I

cor2 (XX)

II

7 78917 b) kaavan VIII mukainen aminohappo kytketään kaavan V mukaisen aminohapon kanssa

Rl-C-NHCH-C02H + H2N (CH2)-CR4R5CORg -» I

COR2 (VIII) (V) minkä jälkeen poistetaan mahdolliset suojaryhmät ja tämän jälkeen haluttaessa tai tarvittaessa muunnetaan näin saatu yhdiste edellä määritellyn alaiseksi yleiskaavan I mukaiseksi yhdisteeksi tai muuksi yhdis-teeksi/tai muodostetaan sen suola ja haluttaessa eristetään parhaana pidetty isomeeri.

Edellä kuvatuissa menetelmissä käytetyt eri välituotteet voidaan saada noudattamalla suoraan eurooppalaisessa patenttihakemuksessa, julkaisu No. 54862, kuvattuja menetelmiä tai niiden kanssa analogisia menetelmiä.

Joukko välituotteita, joita tarvitaan tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi, on kaupallisesti saatavissa olevia tai ne voidaan valmistaa helposti ammattimiehen tuntemin menetelmin. Hyvin monien tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden valmistuksessa tarvittavia välituotteita on kuvattu peptidikemiaa käsittelevissä julkaisuissa ja teoksissa tai niiden valmistus sisältyy näihin. Esimerkkejä ovat mm. J.H. Jones, "Comprehensive Organic Chemistry", Voi. 2, D. Barton ja W.D. Ollis, toim. Pergamon Press, 1979 sivut 819 - 823 ja viitteet 2, ja 29 - 31. Tämän julkaisun asiaa koskevat kohdat on tässä yhteydessä mainittu viitteenä.

Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksinnön mukaisten yhdisteiden valmistamista.

78917

Esimerkki 1 N-[N-[L- l-karboksi-2-(4-fenyyli) fenyylietyyli] -L-fenyylialanyyli] 3-alaniini-bentsyyliesteri.

A. 4-fenyylifenyylipalorypälehappo 40 g kalium t-butoksidia lisättiin pieninä erinä ja sekoittaen 150 mitään dietyylioksolaattia. Aluksi eksotermisen reaktion laannuttua kuumennettiin reaktoseosta höyryhauteessa typen alla kiinteän aineksen liuottamiseksi. Huoneenlämpötilaan jäähdyttämisen jälkeen lisättiin yhtenä eränä 79 g 4-bifenyvlietikkahappo-metyyli-esteriä. Seosta sekoitettiin 2 tuntia 65 - 70°C:ssa ja samalla poistettiin matalalla kiehuva aines tyhjiössä. Huoneenlämpötilaan jäähdyttämisen jälkeen sekoitettiin jäähdyttäen viskoosista jäännöstä, 200 ml eetteriä ja 350 ml vettä, Eetterikerros erotettiin ja uutettiin kerran 1Q0 ml :11a vettä. Vesikerrokset yhdistettiin, uutettiin kerran eetterillä, tehtiin happameksi väkevällä suolahapolla (jäähdytettiin) ja uutettiin kaksi kertaa 300 ml :11a eetteriä. Osa kiintoaineksesta ei liuennut eetterikerrokseen ja nämä erotettiin suodattamalla. Tämän jälkeen eetterikerros haihdutettiin kuiviin ja puolikiinteä jäännös yhdistettiin aikaisemmin saadun kiintoaineksen kanssa. Kiintoaineksen ja puolikiinteän jäännöksen seokseen lisättiin seos, joka sisälsi 160 ml väkevää suolahappoa ja 350 ml etikkahappoa, ja saatua seosta kuumennettiin ref-luksoiden 2,5 tuntia. 50°C:een jäähdytettäessä saostui kiinteää ainetta, joka suodatettiin ja pestiin 150 ml :11a vettä. Märkä kiinteä aine sekoitettiin 150 ml:n kanssa asetonitriiliä 50 min. ajan, sen jälkeen suodatettiin ja kuivattiin suurtyhjiössä huoneenlämpötilassa 3 tunnin ajan. Saatiin 42r2 g otsikkoyhdistettä, sulamispiste 215-218°C, B . N- [N-[κ-tert. -butyylioksikarbonyyli] -L-fenyylia.lanyyliJ ^-β -alaniini-bentsyyliesteri , Jäähauteessa sekoitettuun seokseen, joka 75 mljssa kuivaa N., Kt-dinietyyliformamidia sisälsi 0,023 moolia kutakin seuraavaa 9 78917 yhdistettä; di^t*Tbutyylidikarbonaatti, L-fenyylialaniini, gaalani inibentsyyl tester i-p^-tolueenisul f o.naatti f. hydroksibentsotriat-soli ja N-dimetyyliarninopropyyli-NJ-etyylikarbodi-imidi, lisättiin 5 ml N^etyyli-morfoliinia ja seosta sekoitettiin 3 tuntia huoneen lämpötilassa, kaadettiin sen jälkeen 600 ml jäävettä ja uutettiin 3 kertaa 150 ml :11a eetteriä. Eetterikerrokset yhdistettiin ja uutettiin kerran 150 ml :11a 0,3N suolahappoa, sen jälkeen 2 kertaa 300 ml :11a vettä ja tämän jälkeen kuivattiin nat-riumsulfaatilla, suodatettiin ja haihdutettiin kuiviin tyhjiössä 28°C:ssa. Saatiin 9,0 g kumimaista kiinteää ainetta.

C. H- (L-fenyylialanyylii^-g-alaniinibentsyyliesterihydrokloridi 4,0 g esimerkin 1 B tuotetta 25 ml:ssa etyyliasetaattia sekoitettiin 10 minuutin ajan 0°C:ssa kaasumaisen kloorivedyn kanssa. Sekoitettiin 0°C:ssa puolitoista tuntia, sen jälkeen 10°C:ssa 30 minuuttia. Ylimääräinen kloorivety poistettiin johtamalla liuot-timeen typpikaasuvirta. Liuos kaadettiin voimakkaasti sekoittaen 200 mlraan eetteriä, saostunut kiinteä aine otettiin talteen suodattamalla ja sen jälkeen kuivattiin huoneenlämpötilassa suurtyh-jiössä 2 tunnin aikana, jolloin saatiin 3,35 g tuotetta.

D. N-|Tn-£l- l-karboksi-2-(4-fenyyli)fenyylietyyl^-L-fenvylialanyy-li]-3-alaniini-bentsyyliesteri.

Seos, joka sisälsi 9,10 g H-(L-fenyylialanyyli)-3-alaniini-bent-syyliesteri-hydrokloridia ja 8,40 g esimerkin IA yhdistettä 500 mlissa tetrohydrofuraanin ja eetterin (9:1) seosta, käsiteltiin trietyyliamiinilla pH-arvoon 6,6 ja sekoitettiin huoneenlämpötilassa 1,5 tuntia, 2 tunnin aikana lisättiin tipoittain ja samalla sekoittaen liuos, joka sisälsi 2,Q g natriumsya.noboorihydridiä 100 mlsssa tetra,hydrofuraanin ataboliri ja seosta. Sekoittamista jatkettiin yön yli huoneeniämpötila.ssa . Reaktioseos väkevöitiin 75 ml »aan tyhjiössä 40°Ctssa<i Jäännöstä sekoitettiin 400 ml kanssa 0,5H suolahappoa ja 400 ml kanssa eetteriä yhden tunnin ajan, Eet-terikerros kuivattiin natriumsulfaatilla, suodatettiin ja haihdu^ tettiin kuiviin tyhjiössä, Saatiin keltainen viskoosinen siirappi, 1° 78917 joka liuotettiin 25 mlja.an etanolia, Jäähdytettäessä yön yli muodostui kiinteää ainesta, joka erotettiin suodattamalla, pestiin kylmällä etanolilla (4,2 g} ja kromatografoltiin pylväässä, joka sisälsi 30Q g silikageeliä, käyttämällä liuotinseoksena CHCl^JCH^OHjCH^CC^H (2QQ;1Q;21. Efluentti jaettiin jakeisiin, jotka haihdutettiin kuiviin tyhjiössä. Tällä tavoin saatiin 600 mg kiinteätä tuotetta, joka muodostui otsikkoyhdisteestä, sulamispiste 192-194°C.

Esimerkki 2 Ν-[Ν- [ΐ^ 1 T-karboksi-2- (4-fenyyliJ fenvylietyvlij -L-fenyyli-alanyy-lij -r S^alaniini.

Suspensiota, joka sisälsi 590 mg esimerkin 1 tuotetta 100 ml:ssa etanolia, ravisteltiin yön yli 200 mg:n kanssa 10% M/C-katalyyt-tiä Parrin laitteessa. Saatu seos laimennettiin 40 ml :11a etanolia ja 10 ml :11a vettä, minkä jälkeen sitä kuumennettiin hetki höyryhauteella, kunnes valkoinen sakka oli liuennut kokonaan. Jäähdyttämisen jälkeen katalyytti erotettiin suodattamalla, suodos haihdutettiin 5 ml:ksi 50°C:ssa tyhjiössä. Kiinteä aines erotettiin suodattamalla, pestiin etanolilla ja kuivattiin huoneen lämpötilassa suurtyhjiössä 6 tunnin aikana, jolloin saatiin 155 ml otsikkoyhdistettä, s.p. 226-228°C.

26 α j =16,8 (C=Q, 5 , DMFl .

Analyysi, laskettu; C, 7Q, 4 0 f H, 6,13; M, 6,Q8,

Saatu; C, 70,54; H.,, 6,26; N, 5,97,

Esimerkki 3 N-^N-^L- [l-r [pivaloyylioks-lmetoksi £karbonyyli [%2-fenyylietyyli)J-; L-fenyylialanyyl±]-β-alaniini, pivaloyylioksimetyyliesteri.

A. N-(tert.-butvyli oksikarbonyyli)-β-alaniini, pivaloyylioksi- 11 7891 7 metyyliesteri.

Trietyyliamiinia (32,4 mil lisättiin N-tert,-butyylioksikarbo-nyyli β-alaniiniin (4Q gL K,NJ-dimetyyliforjnamidissa huoneenlämpötilassa typpikaasun alla 1 litran pyöreäpohjäisessä kolvissa. Liuosta sekoitettiin 15 minuuttia ja 0°C:ssa lisättiin tipoittain kloorimetyylipivolaattia (36,6 g) M. Rasmussen & N.J. Leonard, J. Amer. Chem. Soc., 89, 5439 (1967) Liuosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa yön yli. Sen jälkeen seos laimennettiin etyyliasetaatilla, suodatettiin, pestiin vedellä ja sen jälkeen suolaliuoksella ja haihdutettiin. Käin saatiin 70 g puhdistamatonta ainetta, joka kromatografoitiin (silikageeli) eluoimalla 15%:lla etyyliasetaatti-heksaanilla, Tuotetta saatiin 62,5 g.

B. S-alaniini, pivaloyylioksimetyyliesteri, trifluoriasetaatti.

Trifluorietikkahappoa (1QQ ml) lisättiin esimerkin 3A tuotteen (62 g), liuokseen metyleenikloridissa (180 ml) 0°C:ssa. Seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 2 tuntia ja liuotin poistettiin tyhjiössä, jolloin saatiin 100 g tuotetta vaaleankeltaisena öljynä , C, N- [L- 1- (fenyylimetoksi) karbonyyli-2-fenyylietyyli)]] -L-fenyy-lialaniini.

L-fenyylialaniinibentsyyliesteri-hydrokloridia suspendoitiin 190,4 g (0,652 moollal 96Q ml jaan absoluuttista metanolia, lisättiin 6,7 litraa kuivaa (3A seulat) tetrahydrofuraania ja lietettä sekoitettiin, samalla kuin lisättiin n. 5Q ml trietyyliamii-nia pH-arvon säätämiseksi yälille 6,5 7,0, pH tarkistettiin EM Reagents Coloj?pHast indikaattoriliuskoilla, a,lue pH 5-1Q, jotka oli ennen käyttöä kostutettu vedellä., neutraalien lietteeseen lisättiin 200 g (0,98 moo.lia). natriumfenyylipuruvaatti»-hydraattia (Sigma) ja sen jälkeen 24Q g murskattua 3A m°lekyyliseulaa, (Seula voidaan jauhaa huhmareessa eikä sen tarvitse olla hienojakoista, Jos se on liian hienojakoista se on vaikea erottaa suodattamalla) .

12 7891 7

Lietettä, sekoitettiin ympäristölämpötilassa samalla kun 5 tunnin aikana lisättiin tipoittaan lj.uosf joka sis.äl^i 61,6 g (0,98 moo·'-lial natriumsyanoboorthydridiä, 40 ml metanolia ja 300 ml kuiyaa tetrahydrofuraania, Reaktioseosta sekoitettiin ympäristölämpöti-lassa 48-72 tuntia samalla kun seurattiin ohutlevykromatografi-sesti bentsyyliesterin häviämistä, "Molekyyliseula poistettiin reaktioseoksesta suodattamalla ja pestiin hyvin kuumalla metano-lilla, koska osa tuotteesta saostuu niiden päälle.

Suodos väkevöitiin pyöröhaihduttimessa siirapiksi 50°C:ssa. Tämä siirappi liuotettiin 2,4 litraan eetteriä 12 litran pvöreäpohjäisessä kolvissa ja sekoitettiin jäähauteella samalla kuin lisättiin 2,4 litraa 2,5% ;sta vesipitoista suolahappoa. Muodostunut suuri HCN-määrä johdettiin natriumhydroksidiloukkuun. Seosta sekoitettiin 2,5 - 3 tuntia, jolloin välipinnalle vähitellen muodostui valkoista kiinteätä ainetta ja syanivedyn keittyminen lakkasi.

2-faasinen seos suodatettiin (suurin osa vesifaasista voidaan poistaa separaattorissa ennen suodattamista, koska tuote jää välipinnalle) ja kiinteä aine pestiin hyvin eetterillä ja kuivattiin tyhjiössä alle 50°C:ssa; saanto 80-90 g, sulamispiste 175-180°C. Tämä aine oli 90-95 %:sesti puhdasta L,L-isomeeriä ohutievykromatografisen määrityksen perusteella. Raaka tuote liuotettiin uudelleen noin 10 litraan kiehuvaa absoluuttista metanolia, pieni määrä valkoista epäorgaanista liukenematonta ainesta erotettiin suodattamalla ja suodos väkevöitiin 5 litraksi kiehumispisteessä, jolloin muodostui höytyisiä valkoisia kiteitä. Tuotteen annettiin hitaasti jäähtyä huoneenlämpötilaan ja sen jälkeen 0°C:een 2-3 tunnin aikana. Kiinteä aine otettiin talteen ja kuivattiin tyhjiössä 50°C:ssa; saanto 57-60 g, s.p. 185-186°C, [α ^ β26 5,9 τ· 6,3° * (DijSQ, C=l) . Tuote sisälsi yli 98% L,L-risomeeriä ohutlevykromatografisen määrityksen ja kor-keapainenestekromatografiän perusteella. (useiden ajojen tu loksia) .

i3 7891 7 D. H- (Lrl^bents y y 1iok sikarbonyy11 - 2 - fe ny yl i e t y y 1 i) -L-fenyyli-a 1 a ή i ± n i^-p iy a loyy 1 ioksime tyy 1 ies ter i .

Liuos, joka sisälsi 4,03 g (10 jn moolia). esimerkin 3C tuotetta ja 1,5 ml (11 m moolial trietyyliamiinia 2Q mlsssa dimetyyliformami-dia, käsiteltiin ympäristön lämpötilassa 1,6 ml: 11a (11 in moolia) kloorimetyylipivalaattia, sekoitettiin 24 tuntia 50-6Q°c:ssa ja saatu liuos kaadettiin veteen ja uutettiin 3 kertaa 100 ml :11a eetteriä. Pieni määrä liukenematonta ainesta erotettiin suodattaa maila ja eetterifaasi pestiin vedellä, kuivattiin ja väkevöitiin öljyksi; saanto 4,8 g; NMR vastasi otsikkoyhdisteen rakennetta.

E. N- (L-karboksi-2-fenyylietyyli)-L-fenyylialaniini, pivaloyyli^ oksimetyyliesteri.

Esimerkin 3D puhdistamaton diesteri hydrattiin Parrin laitteessa 2 4,2 kp/cm paineessa 3 tunnin aikana seoksessa, joka sisälsi 50 ml metanolia ja 5 ml vettä, kun mukana oli 0,4 g 10% Bd/C -katalyyttiä. Saatu reaktioseos suodatettiin ja väkevöitiin kosteaksi, kiinteäksi aineeksi, joka sen jälkeen kiteytettiin uudelleen meta-noli/vedestä. Valkoiset kevyet neulaset suodatettiin ja kuivattiin tyhjiössä; saanto 3,0 g, sulamispiste 122-124°C. TLCrssä näkyi oleellisesti yksi täplä, R^ 0,2, CHCl^/MeOH/HOAc 100: 1:0,0,5.

F. H- L-l-pivaloyylioksimetyylikarbonyyli-2-fenyylietyyli)-L-fenyyli-alaniini-g-alaniini, pivaloyylioksimetyyliesteri.

Seos, joka sisälsi 1,0 g (2,3 m moolial esimerkin 3E tuotetta ja 0,89 g (2,3 m moolia), esimerkin 3B tuotetta 25 ml:ssa dimetyyli-formamidia, käsiteltiin 1,01 ml :11a (8 m moolial il-retyyli-raorfo-liinia ja sen jälkeen 352 mgilla (2,3 m moolia) 1-hydroksihentso^ triatsQli-Jxydr.a.att.ia ja 439 mg (2,3 m moolial lT--(3-dimetyyliamino-nropyylilT3-etyylika,rbodi-imidi-hydroklori.dla, Seosta sekoitettiin ympäristön lämpötilassa yön yli. Ohutlevykromatografiän perusteella lähtöainetta oli vielä mukana, Reaktioseosta kuumennettiin 6 tuntia 40-50°C:ssa ja annettiin seistä huoneen lämpötilassa yön yli. Seos kaadettiin veteen ja uutettiin useita kertoja i4 7891 7 eetterillä. Sen jälkeen eetterifaasi pestiin hyvin vedellä, kuivattiin ja väkevöitiin öljyksi. (1,2 g), öljy kroinatografoitiin merkin ohutleyykromatograf ia-s.ilikageelillä 6Q~G, jolloin saatiin 0,9 g öljyä, joka muodosti yhden täplän, 0,4, EtOAc/Hexane 1:2 -systeemissä (samaa systeemiä käytettiin pylväskromatogra-fiassa) . Analyysi: Laskettu C33H44N2°9: C' 64,69; H, 7,24; H, 4,57. Saatu: C, 64,47; H, 7,20; N, 4,29.[a]D26 - 21,7° (DMF, 01,0).

Esimerkki 4 il-[n-[l-[1-[(2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi)metoksi]karbonyylij -2-(4-fenyyli)-fenyylietyylij-L-fenyylialanvyliJ-S-alaniini.

A. N-[D,L-l-karboksi-2-(4-fenyyli)fenyylietyylij -L-fenyyli-ala-niini, bentsyyliesteri.

Sekoitettu suspensio, joka sisälsi 4-fenyylifenyylipalorypälehap-poa (24,0 g) ja L-fenyylialaniini-bentsvyliesteri-hydrokloridia (23,2 g) yhdessä litrassa tetzahydrofuraani/etanolia (9:1), säädettiin pH-arvoon 6,6 lisäämällä vähitellen trietyyliamiinia. Säädön aikana kaikki kiinteä aines liukeni. Saatua liuosta sekoitettiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen lisättiin ti-poittain ja samalla sekoittaen natriumsyanoboorihydridin (3,5 g) liuos samassa liuottimessa. Reaktioseosta sekoitettiin yön yli huoneenlämpötilassa.

Sen jälkeen reaktioseos väkevöitiin alipaineessa 200 ml:ksi. Jäännös kaadettiin 600 ml jaan 0,3N suolahappoa samalla jäähdyttäen ja sekoittaen. Tällöin erosi kumimainen kiinteä aine. Vesipitoinen aines erotettiin dekantoimalla ja saatua kiinteätä ainetta sekoitettiin 120 mljn kanssa etanolia* Saatu kiinteä aines erotettiin suodattamalla, ja märkää kiinteää ainesta sekoitettiin 1G0 ml;n kanssa, uutta etanolia. Seisotettiin yön yli, minkä jälkeen kiinteä aines erotettiin suodattamalla ja kuivattiin, jolloin saatiin 22,3 g kiinteätä tuotetta.

is 78917 E. R-[D,L- [l- f (2,2-dime tyyli—l*-oksopropoksi Ime toksi3 *“karbonyyli] - 2-(4-fenyyliIfenyylietyylij-L-fenyylialaniini, bentsyyliesteri.

Trietyyliamiinia (3,,05 ml) lisättiin N-£D,L-l-karboksi-2-(4-fenyy-lilfenyylietyylij-L-fenyylialaniini, bentsyyliesteri (9,6 g) liuokseen 30 ml:ssa dimetyyliformamidia. Seosta sekoitettiin 20 minuuttia huoneenlämpötilassa ja sen jälkeen lisättiin kloori-metyylipivalaattia (3,15 ml). Saatua seosta kuumennettiin 4 tunt-tia 45 - 55°C:ssa hauteessa samalla sekoittaen ja seosta sekoitettiin tämän jälkeen huoneen lämpötilassa yön yli. Saatu seos laimennettiin 300 ml vettä ja uutettiin 3 kertaa 150 ml :11a eetteriä, yhdistetyt eetterikerrokset uutettiin kaksi kertaa 100 ml :11a vettä ja eetteriliuos kuivattiin vedettömällä natriumsulfaatilla. Suodattamalla ja haihduttamalla tyhjiössä saatiin 7,5 g siirappi-maista tuotetta.

Tämä aine kromatografoitiin 135 g silikageeliä eluoiden etyyli-asetaatin ja sykloheksaanin (85:15) seoksella. Haluttua tuotteiden diasteriomeerista seosta sisältävät jakeet tunnistettiin ohut-levykromatografisesti, yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin tyhjiössä jolloin saatiin 5,9 g siirappimaista tuotetta.

C . K-[D,L- [l- [(2,2-Dimetyyli-l-oksopropoksi).metoksi3 -karbonyylij 2-(4-fenyyli)fenyylietyyli] -L-fenvylialaniini.

Edellä saadun tuotteen (5,9 g) liuos 175 ml:ssa etanolia hydrat- 2 tiin kahden tunnin ajan 1,05 - 2,1 kp/cm paineessa 750 mg:11a 10% Pd/C katalyyttiä kahden tunnin aikana, Reaktioseos laimennettiin lisäämällä 250 ml etanolia ja lämmitettiin 45°C:een saostuneen tuotteen liuottamiseksi, Katalyytti erotettiin suodattamalla lämpimästä liuoksesta ja suodos haihdutettiin, jolloin saatiin tuotetta yhteensä 4,4 gt D. N-([N-[l-[1- (] ( 2-Dimetyyli-l-oksopropoksi) metoksi] -karbonvylij - 2- (4-fenvyli) fenvylietyyliJ-L-fenyylialaniini- S-alaniini, bentsvyli- esteri.

16 7891 7 N-etyylimorfoliinia (1,2 ml) lisättiin sekoitettuun seokseen, joka sisälsi edellä valmistettua tuotetta (3,25 g), X-(H, H-dime-tvyliaminopropyyli)-K'-etyylikarbodi-imidi-hydrokloridia (1,7 g), hydroksibentsotriatsolia (1,3 g) ja 3-alaniinibentsyyliesteri-p-tolueenisulfonaattia (3,0 g) 25 ml:ssa dimetvylifornamidia. Seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 3 tuntia, laimennettiin 200 ml :11a jäävettä ja uutettiin kaksi kertaa 125 milliä eetteriä. Yhdistetyt uutteet pestiin 250 ml :11a vettä ja kuivattiin vedettömällä magnesiumsulfaatilla. Suodattamalla ja haihduttamalla saatiin 5,25 g jäännöstä. Ohutlevykromatografin (silikageeli CHCl^/EtOAc - 10:1) päätuotteita oli kaksi, R^=0,36 ja R^=0,32 (osittain päällekkäin). Tämä aine kromatografoitiin 350 g:lla si-likageeliä (ohutlevykromatografia -laatu) eluoimalla CHCl^-EtOAc (100c 5) seoksella. FUhtaita yksittäisiä komponentteja sisältävät jakeet tunnistettiin ohutlevykromatografiän avulla, yhdistettiin ja haihdutettiin. Tällä tavoin saatiin 650 mg nopeammin liikkuvaa komponenttia (L,L-diasterioisomeeri) sekä 590 mg L,D-diasterio-isomeeriä.

Lopullinen tuote saatiin hydraamalla liuos, joka sisälsi 650 mg edellä saatua L,L-diasterioisomeeriä 50 ml:ssa etanolia, 3 tunnin 2 aikana 1,05 - 3,15 kp/cm paineessa 50 mg:lla 10? Fd/C -katalyyttiä. Katalyytti erotettiin suodattamalla ja suodos haihdutettiin tyhjiössä kuiviin 30°C:ssa. Jäännös kromatografoitiin 50 g:lla TLC-silikageeliä eluoimalla aluksi 300 ml :11a CHCl^/EtOAc (10:1) seoksella ja sen jälkeen CHCl3/CH3OH/AcOH (600:10:2) seoksella. Puhdasta tuotetta sisältävät jakeet tunnistettiin ohutlevykromato-grafialla (silikageeli)CHC13/CHC13/CH3OH/AcOH (600:10:2), Rf = 0,31. Nämä jakeet yhdistettiin, haihdutettiin ja jäännös kuivattiin huoneenlämpötilassa yön aikana suurtyhjiössä, Jäännös kiteytettiin uudelleen eetteristä ja tuote kuivattiin 3,5 tunnin aikana suurtyhjiössä. Saatiin 250 mg kiinteätä tuotetta s.p, 101 -10 3°C, £cx ] D26-22° (c = 0,5, DMF) .

17 7891 7

Esimerkki 5 K- [M- [l- [l- (2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi] metoksij karbonyyljj -2-fenyylietyylij-L-fenvylialanyyli]-β-alaniini

Seos, joka sisälsi 0,9 a (2,1 m moolia) H-(L-l-karboksi-2-fenyyli-etyyl i) -L-fenyy 1 ialaniini-pivaloyyl ioksiir.etyy lies teriä (esimerkki 3E) ja yhtä suuret moolimäärät β-alaniinibentsyyliesteri-p-toluee-nisulfonaattia (73 mg), 1-hydroksibentsotriatsolihydraattia (321 mg) ja 1- (3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyyli-karbodi-imidi-hvdro-kloridia (401 mg), liuotettiin 20 ml:aan dimetyyliformamidia, joka sisälsi 0,8 ml (6,3 m moolia) K- etyylimorfoliilia. Seosta sekoitettiin yön yli ympäristön lämpötilassa.

Keltainen liuos kaadettiin veteen (150 ml) ja uutettiin kolme kertaa 100 ml :11a eetteriä. Eetterifaasi pestiin vedellä, kuivattiin ja väkevöitiin Öljyksi, 1,1 g. Ohutlevykromatografiässä tuote muodosti. yhden täplän ja sisälsi vain vähän epäpuhtautta.

Koko tuote kromatografoitiin 150 g:11a silikageeliä eluoimalla etyyliasetaatti/heksaanilla (30:70). Jakeet yhdistettiin ja väkevöitiin öljyksi £a ]D26 - 20,0° (DMF, c = 1).

2

Edellä kuvattu tuote (1,5 g) hydrattiin 2,8 kp/cm paineessa kolmen tunnin aikana 100 ml:ssa absoluuttista etanolia käyttämällä katalyyttinä 0,2 g 10% Pd/C.

Katalyytti erotettiin suodattamalla ja suoclos väkevöitiin öljyksi, joka kiteytyi, kun sitä kuivattiin yön ajan suurtvhjiössä. Heksaa-nin alla seisotettaessa saatiin hienojakoisia värittömiä kiteitä, joista suodattamalla ja kuivaamalla saatiin 1,2 g tuotetta s.p. 93-95°C, [ a jD26 - 27,3° (DMF, C = 1)_K

Noudattamalla edellisen kuvauksen ja esimerkkien menetelmiä ja käyttämällä sopivia välituotteita voidaan valmistaa edellä luetteloidut yhdisteet 1 ·*· 63.

ie 7891 7

Seuraavassa taulukossa lyhennykset ja ^7^7 tarkoittavat bentsyy1iryhmiä. tarkoittaa fenyyliryhmää. Käyttämällä edel lä kuvattuja menetelmiä valmistettiin esimerkkimäisesti seuraavat keksinnön yhdisteet. Ellei toisin ole mainittu, on kaikilla yhdisteillä absoluuttinen L-stereokemia kiraalisuuskeskuksessa ja on vety.

i9 7891 7 ^ ^ ^ •h SR u-· lu u. x +) ^ S 2: g 0

Q Σ 0 O O O

g Σ •H LO O O O » O r— r— >—

CO —* — >— - OI t I

— — I I I

o 00 o 0 q · · · r- I—1 LO r- ro 0

Ö CM CM CM CM CO

L_l I I I I I

0 0 r— lo

• III

Λ >1 <— o ·ο

lo (Λ '7 . - . «O-00CM ,-H

^ - " - - - CM :o 0 CXj <- *- <- '- ’- '- '- r— uo n co ro co CC —^ -—- LT) -— ·—- ro co n: ro ro

ry XX m CO X X

co co ro x o <_) co * «— 3: co 1 — o · co I co co <0 co o co x <_>

I O O CM CM CM O O O

0£ | CO O X X — O <_)

o_ O O CO CO CM O O

CM CM O O X CM CM

XXI I <_) X X

CM OO — CO <_>

X OO OO O

c_> Il II I

X

z O «J· ro ro o xxxxxxxx

CC CO CO

ro cc

X

* co

X

_ 1 I I I I I I 1 ro r^r«,rMi^»r^r^r^ r~- XXXXXXX x 01 r^r^r^r^-r^f^r^ f~-

CM CO CO CO CO CO CO CO O

X

o o

X

* ro cm ro 0 ro ro ro

XXX CO

CO CO CO X

' LO ·— — —^ VO

Q£ CMXCOCOCOXXX <_>

LO O O O O O O CM

OC O O CO O X

CM O O O CO

X CM CM CM O

CO X X X I

O CO O CO

' o o o

I I I

II I I I I I I I

CM CM CM CM CM CM CM CM

XXXXXXX X

CO CO CO CO CO O O CO

LO LO LO LO LO LO LO LO

XXXXXXX X

vö vjD VO vO vO vo vO VO

O CO O CO CO CO CO CO

<u 4-1 tn

•H

Ό _ x: ia η < co co o lu o. t9 31 20 7891 7 - I ' ~ ^ • U_ Σ. <

> Σ. O

<— a o - (/1 vo vo • o o o — —-

CO VO I

o a · r-ι vo i->

Ö r- I

V—I I

C

o Q] o o 5 00 en £

CL I » V

• VO Oi S

E CM CM « CM CM ^

Ol| «— r— m m x o VO <_>

X X O

oc o o O

o

CM

X

<_) o a: xxx co cn cn Φ in % 'cm -¾ X 0) <_> λ; <^r ω n X I 3

I νο r·» D

OC (_) X cn

X I |M -H

r~- vo o ^ o x 12 vo d

tj M

T ω a.

X

O w I cn 0 $ CVJ I g o; x x x'1’ g 8 ° ° «> 3 8 x q ui 1 .-a h . cn ~ c oil $ §

CM CM .. -H

— X X X rH u

mo ο ο a (U

QC O VO Vf) (D

I 3= x Π3 £

vo vo vo d O

x o (_> E in

VO (D -H

o a; p CU Qv P d

In <1) ·$ W 4-> m •h cn Ό ^ "O _J Q ^ .O (0 21 7891 7

Esimerkki 6 A. H (L-l- (FenyvlimetoksikarboriYyli) -2^fenyylietyvli) -L-fenyyli-alaniini, syanometyyliesteri,

Liuokseen, joka sisälsi 4,03 g (10 mmol) esimerkin 3C tuotetta ja 2,1 ml (15 mmol) trietyyliamiinia ja 150 ml asetonia lisättiin tipoittain 0,95 ml (15 mmol) klooriasetonitriiliä huoneen lämoö-tilassa. Saatu liuos kuumennettiin paluujäähdyttäen yön yli. Liuos haihdutettiin kuiviin ja uutettiin vedellä ja eetterillä. Fet-terifaasi pestiin useamman kerran vedellä, kuivattiin ja haihdutettiin öljymäiseksi jäännökseksi. Näin saatiin 4,5 g ainetta, jota käytettiin suoraan seuraavaan vaiheeseen.

B. (L-l-(Fenyylimetoksikarbonyyli)-2-fenyylietyyli)-L-fenyy-lialaniini, 2,2-dimetyyli-l,3-dioksolan- 4-yyli metyvliesteri.

Fdellä kuvatun vaiheen tuote ( 4,4 g, 10 mmol) ja 25 ml (20 mmol) 2,2-dimetyyli- 1,3-dioksolan- 4-yyli metanolia (Aldrich Chemical Co.) yhdistettiin ja tämän jälkeen lisättiin trietyyliamiinia (1,4 ml, 10 mmol) ja N, N-dimetyyli-4-aminopyridiiniä (20 mg).

Näin saatua seosta sekoitettiin typpi-ilmakehässä lämpötilassa 55-60°C 16 tuntia. Reaktioseos kaadettiin tämän jälkeen veteen ja uutettiin useamman kerran eetterillä. Yhdistetyt eetterijakeet pestiin useamman kerran vedellä, kuivattiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 5,7 g öljymäistä tuotetta. Tuote kromatografoi-tiin käyttäen 400 g Merck silikageeliä 60G, eluoitiin etyyliase-taatti-heksaaniseoksella, Ne jakeet, jotka ohutlevykromatografiällä osoittautuivat puhtaiksi, yhdistettiin ja haihdutettiin kui- r* -.26 viin, jolloin saatiin 4,2 g öljyä, [a JD = -6,2° (c 1,3, DMF).

C. N-(L-l-(2,2-dimetyyli-l,3-dioksolan-4-yyli metoksikarbonyvli)-2r-fenyylietyvli) -L-rfenyylialaniini .

Edellisen vaiheen tuote liuotettiin 50 ml»aan tetrahydröfuraania ja hydrogenoitiin Parr-laitteessa käyttämällä 0,4 g 10% :sta Palladium-hiiltä huoneenlämpötilassa ja 60 psig 4 tuntia.

22 7891 7

Katalyytti suodatettiin ja suodos haihdutettiin tyhjiössä, jolloin saatiin vahamainen jäännös (3 g) joka uudelleen kiteytettiin etyyliasetaatilla, jolloin saatiin 2,6 g kiteitä, sp. 140- 2°.

D. N-(N-(L-(1-(2,2-dimetyvli-l,3-dioksolan-4-yyli)metoksi)-karbonyvli)-2-fenyylietyvli)-L-fenyylialanyvli)-β-alaniini, bent-syvliesteri.

Edellisen vaiheen tuote (2,5 g, 5,8 mmol), 2,2 g (6,4 mmol) β-alaniinibentsyyliesteri p-tolueenisulfonaattia, 887 mg (5,8 mmol) 1-hydroksibentsotriatsolihydraattia, 1,1 g (5,8 mmol) l-(3-dime-tyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidihydrokloridia ja 23 ml (18 mmol) N-etvylimorfoliinia ja 20 ml dimetyyliformamidia sekoitettiin huoneen lämpötilassa yön yli.

Mäin saatu keltainen liuos kaadettiin veteen ja uutettiin useamman kerran eetterillä. Yhdistetyt eetterijakeet pestiin toistuvasti vedellä, kuivattiin vedettömällä kaliumkarbonaatilla ja väkevöitiin öljymäiseksi tuotteeksi (3,3 g). Käin saatu tuote kromatografoitiin käyttämällä 300 g Merck-silikageeliä 60, eluoi-tiin heksaani-etyyliasetaatilla (2:1). Me jakeet, jotka ohutlevy-kromatografiällä (silikageeli ^254' etyyliasetaatti-heksaani (1:1)) osoittautuivat homogeenisiksi yhdistettiin ja liuotin haihdutettiin, jolloin saatiin 2,7 g öljymäistä tuotetta, jota käytettiin suoraan seuraavaan vaiheeseen.

E. H~ (N-(L-(1-(2,2-dimetyyli-l,3-dioksolan-4-yyli)metoksi)-kar-bonyyli)-2-fenyylietyyli)-L-fenvylialanyyli)-β-alaniini.

Edellisen vaiheen tuote (2,2 g) liuotettiin 50 ml:aan absoluuttista etanolia ja hydrogenoitiin Barr-laitteessa käyttämällä 0,2 g 10% palladium/hiiltä 5Q psig 4 tunnin ajan huoneen lämpötilassa,, Katalyytti suodatettiin ja suodos haihdutettiin, jolloin saatiin öljymäinen tuote (1,9 g) joka muuttui kiinteäksi. Uudelleen kiteytys eetterillä lämpötilassa -eo^gantoi 1,8 g kiinteää ainetta, jonka sulamispiste 80-2°, £ a J β = -22,7° (c 1, DMF) .

23 7891 7

Ohutlevykromatografiässä saatiin yksi ainoa piste, Rf=0,35 (kloroformi-metanoli-etikkahappo 500:25:2,5).

F. N- (N-(L-(1 -(2,2-dimetyyli-1 ,3-dioksolan-4-yyli)metoksi)-karbonyyli ) -2-fenyylietyyli) -L-f enyylialanyyli ) - j0 -alaniini, maleaatti (1:1).

Edellisen vaiheen tuote (5,0 g) liuotettiin 200 ml:aan eetteriä ja käsiteltiin liuoksella, joka sisälsi maleiinihappoa 1,16 g) ja 200 ml eetteriä. Liuoksen seistessä yön yli jääkaapissa muodostui hitaasti kiteitä lämpötilassa 5 - 10°. Nämä suodatettiin ja kuivattiin, jolloin saatiin 4,7 g suolaa, sp. 127-9^6= -16,3° (c 1, DMF). Laskettu yhdisteelle C31H38N2O11: C; 60,58, H;6,23, N; 4,55. Saatu C; 60,33, H; 6,31, N; 4,48.

Rakennekaavan I mukaiset yhdisteet inhiboivat enkefalinaa-seilla kutsuttujen entsyymien aktiivisuutta. Näillä yhdisteillä voidaan erityisen hyödyllisesti inhiboida enkefali-naasia A, jota saadaan sekä rottien että ihmisten juoval-lisista lihaksista. Eräiden rakennekaavan I mukaisten yhdisteiden on havaittu in vitro -testeissä inhiboivan edellä mainitun entsyymin aktiivisuutta 50 % tai enemmän konsen-traatioalueella 10“® - 10~®M.

Seuraavalla koemenetelmällä määritettiin rakennekaavan I mukaisten yhdisteiden enkefalinaasi A entsyymiä inhiboiva vaikutus.

Enkefaliinia (ENK) hajoittava aktiivisuus erotettiin seuraa-vaksi kolmeksi jakeeksi Gorensteinin ja Snyderin menetelmällä, Life Sei., 2_5, 2065 (1 979): Enk'aasi A (Gly^-Phe^), Aminopeptidaasi, (AP) (Tyr^ - Gly2) ja Enk'aasi B (Gly2 -Gly3).

24 7891 7

Entsyymiaktiivisuus erotettiin ottamalla Sprague-Dawley -rotista aivokudos (minus cerebellum) ja homogenisoimalla se Brinkmannin Polytron -laitteen avulla 30 tilavuuteen 50 mM Tris-puskurilla pH 7,4. Saatua homogenaattia sentrugoidaan 15 minuuttia (50.000 xg). Membraaniin sitoutuneesta entsyymi-materiaalista muodostuva pelletti pestään suspendoimalla se uudelleen Tris-puskuriin ja sentrugoimalla neljä kertaa.

Pesun jälkeen membraanipelletti liuennetaan inkuboimalla sitä 45 minuuttia 37°C:ssä, kun mukana on 15 tilavuusosaa (laskettuna alkuperäisestä aivokudoksen painosta) 50 mM Tris-1 % Triton X-100 puskuria, pH 7,4. Liukenematon aines poistetaan sentrifugoimalla 60 minuuttia (100.000 xg), minkä jälkeen Tritoniin liukeneva supernatantti kerrostetaan 1,5 x 30 cm DFAF Sephacel pylvääseen, joka on jo tasapainotettu 50 mM Tris-0,1 % Triton-puskurilla, pH 7,4. Materiaali eluoidaan pylväästä käyttämällä 1 litra lineaarista HC1 gradienttia 0,0 - 0,4 M. Eeluantti otetaan talteen seitsemänä jakeena, joista jokaisesta määritetään enkefaliinia hajottava aktiivisuus. Näissä olosuhteissa havaitaan Enk'aasi A aktiivisuuden eluoituvan välillä 120 ja 200 ml, minkä jälkeen eluoituu AP -aktiivisuun (260 - 400 ml) ja lopuksi Enk'aasi B aktiivisuus välillä 420 ja 450 ml.

Enkefaliinia hajottavaa aktiivisuutta seurataan radiometrisen määrityksen avulla. Substraatti on ^H-Met^-ENK (50,1 Ci/mmol, New Englands Nuclear, joka on laimennettu 0,05 M Tris-puskuriin, pH 7,4, siten että valmiin reaktioseoksen konsentraatio on 40 nM. Koko reaktioseoksen tilavuus, jossa mukana on entsyymi ja substraatti, on 250 μι. Inkubointi suoritetaan 37°C:ssa 90 min. ajan. Reaktio pysäytetään siirtämällä putket 15 minuutiksi kiehuvaan vesihauteeseen.

25 7891 7 Määrittettävät tuotteet erotetaan toisistaan käyttämällä ohutlevykromatografiaa. Reaktioseoksesta ajetaan 4 μ1:η erä Baker-flex Silica Gel 1B levyllä (20 x 20 cm) yhdessä leimaa-mattomien standardien kanssa (Met^ - ENK, tyrosiini, tyro-syyliglysiini, tyrosyyli-glysyyli-glysiini) ja komponentit kormatografoidaan yhdessä isopropanoli: etyyliasetaatti: 5% etikkahappo-liuotinjärjestelmässä (2:2:1), joka kykenee erottamaan Met^-ENK:n hajoamistuotteisaan. Koko ajoaika on n. 17 tuntia. TLC-säiliöt käsitellään typellä ennen ajon aloittamista. Ajon jälkeen markkerit tehdään näkyviksi nin-hydriinisuihkeella. Nämä täplät leikataan levystä yhdessä levyn jäljelle jääneiden alueiden kanssa ja nestetuikelasku-rilla määritetään vastaavat radioaktiivisuudet. IC50 -arvot määritetään lineaariregressiolla.

Tällä menetelmällä saatiin mainituille yhdisteille seuraavat konsentraatiot nanomooleina (nM), jotka inhiboivat enkefali-naasi A -aktiivisuutta 50 % (IC50).

26 7891 7 ' - - - — ,,.. “m I I ------ — I ' 1 - (

TAULUKKO A

Yhdiste Enkefalinaasi A:n

Inhibition IC ^ g n M

A N.A.1 B N . A.1 C N.A.1 0 N.A.1 E 230 F 580 G 6.4 H N.A.1 J 2.5 K 0.9 L N.A.1

^ Ei aktiivisuutta annoksella <i°5 nM

Seuraavalla koemenetelmällä määritettiin paljonko mainitut yhdis- 2 5 teet tehostivat (DAla -Met )-enkefaliiniamidin (DAEAM) analgeet-tisia vaikutuksia. Tausta tämän menetelmän käytölle on annettu julkaisussa: Chipkin, R.E., Iorio, L.C., Barnett, A., Berger, J., ja Billard, W., Regulatory peptides* From Molecular Biology to Function, toim. E. Costa ja M. Trabuccbi, Raven Press, New York, 1982, sivut 235-242.

27 7891 7 Käytetään CFI uroshiirien (19-23 g), Charles River Breeding Labs, Mass., (N=10/annos tai annosyhdistelinä) . Hännän nytkähdystesti suoritetaan samalla tavoin kuin Dewey ja Harris, Methods in Narcotic Research, toim., S.Fhrenpreis ja A. Neidle, sivut 101-109, Marcel Dekker, Inc., New York, 1975, käyttämällä haitallista lämpöaaltokiihoketta. Vertailulatenssiaikojen (tyypillisesti 2-3 sekuntia) määrittämisen jälkeen hiiret ensin injisoidaan (se tai no) joko väliteaineella tai lääkkeellä ja sopivan välin jälkeen intrasereproventrikulaarisesti (icv) joko väliteaineella (10 μΐ suolaliuosta) tai DABAMjllä Haleyn ja MacCormicin mukaisesti,

Br., J. Iharmacol., 12,12 (1957) Hännän nytkähdyksenä latenssi-ajat määritetään uudelleen 30 min. kuluttua, koska tämän on aikaisemmin osoitettu olevan DAEAM:n analgeettisen vaikutuksen huippua jän. Cut-off aikana käytetään 10 sekuntia.

Tällä menetelmällä saatiin mainituille vhdisteille seuraavat EDr„ 50 -arvot (annos, jossa puolella koe-eläimistä esiintyi analgesia).

28 7891 7

TAULUKKO B

DAEAM:ia tehostava vaikutus

Yhdiste , ^ . .

E [) (antamistapa) 50 A 155 mg/k (po) B 37 mg/k (po) C 100 mg/k (po) D 100 mg/k (po) E 30-60 mg/k (po) F 100 mg/k (se)1 G SOyMS (icv) H 100 mg/k (po) K 50 (icv)1 L 100 mg/k (po) ED100

Huomionarvoista on, että yhdisteet A, B, C, F ja H ovat esteri-johdoksia; yhdiste H on yhdisteen G esterijohdos ja yhdiste L on amidijohdos. Tällaisen deriyatisoinnin on havaittu antavan oraalista aktiivisuutta emäyhdisteellef joka absorpoituu huonosti ruoansulatuskanavasta, Nämä johdokset, joilla ei ole aktiivisuutta in vitro, konsentraatiossa 10^nM (kts. taulukko A), bioaktivoi-tuvat in vivo ja tuovat emäyhdisteen (in vivo enkefalinaasi A -inhibiittorit) keskushermostojärjestelmän vaikutuskohtaan (kts. taulukko B).

Claims (8)

29 7891 7

1. Menetelmä valmistaa terapeuttisesti aktiivisia substituoi-tuja dipeptideja, joiden kaava I on ?4 RlC*H-NH-C*H-C0NH(CH2)-C*-CORg (I) COR2 R3 R5 tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja, jossa kaavassa: Rl on fenyylialempialkyyli tai difenyylialempialkyyli, R2 on hydroksi, -0CH20C0-alempialkyyli tai ryhmä ^7 R8 cr^o » I -OCH2-CH-CH2 jossa r7 ja Re tarkoittavat toisistaan riippumatta C^-Cg alkyylia tai R2 on -O-alempialkyyli-O-fenyyli, -O-CH2-CHOH-CH2-OH, fenyyli-Ci~C4-alkoksi tai aminofenyyli-C]_-Cg-alkoksi, R3 on 1-bentsyyli tai fenyylibentsyyli, R4 on vety, alempialkyyli tai hydroksi, R5 on vety, ja R6 on hydroksi, fenyyli-Ci-C4~alkoksi, -0CH20C0-alempialkyyli, C^-Cg-alkoksi tai ryhmä -CX:H2-CH-CH2, V* r7 r8 jossa R7 ja R8 toisistaan riippumatta tarkoittavat C^-Cg-alkyylia, tunnettu siitä, että yhdiste on valmistettu jollakin 3o 78917 seuraavista menetelmistä, jolloin seuraavissa kaavoissa R]_, 1*2, R3, R4, R5 ja Rg tarkoittavat samaa kuin edellä mukaan lukien mahdollisten reaktiivisten ryhmien suojaukset, a) pelkistetään kaavan XX mukainen yhdiste ON kaksoissidok-sessa R1-C=N-CH-CONH(CH2)-CR4R5COR6 -* I cor2 (XX) b) kytketään kaavan VIII mukainen aminohappo kaavan V mukaisen aminohapon kanssa f3 Rl-C-NHCH-C02H + H2N(CH2)-CR4R5COR5 -> I COR2 (VIII) (V) minkä jälkeen poistetaan mahdolliset suojaryhmät ja tämän jälkeen tarvittaessa muodostetaan sen suola.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan (I) mukainen yhdiste patenttivaatimuksen 1 menetelmävaihtoehdolla b).

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa ainakin toinen ryhmistä R2 ja R6 on CH3CH3 O' O I I -o-ch2-ch-ch2 31 7891 7 tai (2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi)metoksi, ja toinen on valittu edellä määritellyistä ryhmistä ja lähtöaineissa R2 ja Rg tarkoittavat ryhmiä, jotka on määritelty tämän vaatimuksen mukaisesti.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jossa Rl on parafenyylibentsyyli, R2 on hydroksi, CH3 CH3 0*0 I I -o-ch2-ch-ch2 tai (2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi)metoksi ja lähtöaineessa ryhmät R^ ja R2 on määritelty tämän vaatimuksen mukaisesti.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jossa R4 on metyyli ja R5 on vety ja lähtöaineissa ryhmillä R4 ja R5 on vastaava merkitys.

6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jossa R^ ja R3 tarkoittavat samaa kuin patenttivaatimuksessa 4, R4 on vety tai metyyli ja lähtöaineissa ryhmillä Ri, R3 ja R4 on vastaava merkitys.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R4 on vety.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistettu yhdiste on: N-[N-[L-l-(2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi)metoksi Jkarbonyyli)]- 2-fenyylietyyli ]-L-fenyylialanyyli Ι-^θ-alaniini , (2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi)metyyliesteri; 32 7 8 9 1 7 N-[N-[L-l-(fenyylimetoksi)karbonyyli 3—2-fenyylietyyli]-l-f enyylialanyyli ] -/3-alani ini , (2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi)metyyliesteri; N-[N-[L-l-karboksi-2-(4-fenyyli)fenyylietyyli]-L-fenyylialanyyli ]-/3-alaniini; N-[N-[L-l-karboksi-2-fenyylietyyli]-L-(4-fenyyli)fenyylialanyyli ]-/3-alani ini; N-[N-[L-l-karboksi-2-fenyylietyyli]-L-fenyylialanyyli]-L-(οί-metyyli )-A-alani ini ? N- [N- [L-l-karboksi-2-fenyylietyyli ]-L-fenyylialanyyli ]-/3-alaniini, 2-fenoksietyyliesteri, N-[N-[L-[1-[(2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi)metoksi]-karbonyyli]- 2-f enyylietyyli ]-L-fenyylialanyyli ]-/?-alaniini, N-[N-[L-[1-[(2,3-dihydroksi)-l-propoksi]karbonyyli]-2-fenyylietyyli ]-L-f enyylialanyyli ]-/5-alaniini, N-[N-[L-[1-[2,2-dimetyyli-l,3-dioksolan-4-yyli)metoksi]-karbonyyli ] —2—f enyylietyyli ]-L-fenyylialanyyli ]-,^-alani ini , N-[N-(L-[l-[(2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi Jmetoksi]karbonyyli]- 2-(4-fenyyli)fenyylietyyli]-L-fenyylialanyyli]-$-alaniini, N-[N-CL-Cl-C(2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi)metoksi] -karbonyyli]- 2-f enyylietyyli] -L- ( 4-f enyy li ) fenyylialanyyli] -/^-al ani ini , 33 7891 7 N-[N-[L-[1-[(2,2-dimetyyli-l,3-dioksolan-4-yyli Jmetoksi]-karbo-nyyli]-2-fenyylietyyli]-L-(4-fenyyli)fenyylialanyyli]-β-alaniini, N-[N-[L-[1-[(2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi)metoksi]-karbonyyli]-2-(4-fenyyli)fenyylietyyli]-L-(4-fenyyli)fenyylialanyyli]-/3-alaniini, N-[N-1L-[1-[(2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi)metoksi Jkarbonyyli]- 2-f enyylietyyli ]-L-fenyylialanyyli ]-D,L-#-metyyli-/2-alaniini , N-[N-[L-[1-[(2-fenoksi)etoksi]karbonyyli]-2-fenyylietyyli]-L-f enyylialanyyli ]-D,L-o(-metyyli-/3-alaniini, N-[N-[L-[l-[(2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi)metoksi]-karbonyyli]- 2-fenyylietyyli]-L-(4-fenyyli)fenyylialanyyli]-D,L-#-metyyli-/5-alaniini, N-[N-[L-[1-[(2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi)metoksi]-karbonyyli]- 2-(4-fenyyli)fenyylietyyli]-L-(4-fenyyli)fenyylialanyyli]-D,L-o(-metyyli-^-alaniini, N-[N-[L-[1-[ (2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi)metoksi]-karbonyyli]- 2-f enyylietyyli ]-L-f enyylialanyyli ]-<X-metyylialaniini , N-[N-[L-tl-[(2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi)metoksi]-karbonyyli]- 2-fenyylietyyli]-L-fenyylialanyyli]-D,L-a-metyyli-/i-alaniini-bentsyyliesteri, N-[N-[L-[1-[(2,2-dimetyyli-l-oksopropoksi)metoksi]-karbonyyli]- 2- (4-metoksi ) f enyylietyyli ]-L-fenyylialanyyli-/5-alaniini, jossa lähtöyhdisteet valitaan halutun lopputuotteen muodostamiseksi . 34 7891 7