NO169172B - Analogifremgangsmaate ved fremstilling av terapeutisk aktive substituerte dipeptider - Google Patents

Description

Enkefalin er en naturlig opiumholdig reseptoragonist og er antatt å være en blanding av to pentapeptider: H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH (methionin-enkefalin), og H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH (leucin-enkefalin). Heretter anvendes navnet enkefalin generisk for å omfatte alle slike forbindelser.

Det har vært angitt av Beluzzi et al., Nature, 260, 625 (1967) at når enkefalin injiseres i hjerneventrikkelen i rotter, oppnås en dyp analgetisk virkning. Det er også kjent innen faget at enkefalin påvirkes av en gruppe av enzymer kjent generisk som enkefalinaser, som også er naturlig fore-kommende , og som derved inaktiveres.

Europa patentsøknad 79105015.6, publikasjon nr. 12401, beskriver visse dipeptidderivater som er beskrevet å utvise antihypertensiv virkning.

Europa patentsøknad 81110337.3, publikasjon nr. 54862, beskriver visse dipeptidforbindelser som utviser en enkefalinaseinhiberende aktivitet.

Foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive forbindelser av formelen

og farmasøytisk akseptable salter derav, hvori

R-^ er fenyl-lavere alkyl eller difenyl-lavere alkyl;

1*2 er hydroxy, -OCF^OCO-lavere alkyl, gruppen

hvori R7 og Rg er lavere alkyl, eller R2 er -0-lavere alkyl-O-fenyl; 0-CH2-CHOH-CH2-OH, fenyl-lavere alkoxy eller amino-fenylalkoxy;

R^ er benzyl eller fenylbenzyl;

R 4 er hydrogen, lavere alkyl eller hydroxy;

R^ er hydrogen;

Rg er hydroxy, fenyl-lavere alkoxy, -OCf^OGO-lavere- alkyl, gruppen

lavere alkoxy eller fenoxy-lavere alkoxy;

R7 og Rg er lavere alkyl;

p er 1

I formel I angir stjernene de carbonatomer som kan være asymmetriske (chirale) sentra. Oppfinnelsen omfatter fremstilling av alle isomerer ved disse sentra, både i ren form og i blanding.

En gruppe av forbindelser av formel I av interesse er de hvori R4 ikke betegner hydrogen, dvs. lavere alkyl eller hydroxy, fortrinnsvis methyl. Foretrukne betydninger for de andre grupper representert i formel I når R4 har en slik betyd-ning er som følger : Rx er benzyl eventuelt parasubstituert med fenyl eller 2-fenylethyl, og fortrinnsvis benzyl eller p-fenylbenzyl, R2 og R6 er lik eller forskjellig og er hydroxy, methoxy, ethoxy, benzyloxy, 2-fenylethoxy, 1-glyceryl, og er fortrinnsvis valgt fra hydroxy, 2-fenoxyethoxy, 1-glyceryl,

R3 er benzyl eller p-fenyl-benzyl, og

R5 er hydrogen.

En annen gruppe av forbindelser av interesse er de hvori én av R2 og Rg er valgt fra 2-fenoxyethoxy, 1-glyceryl, eller

og den andre er valgt fra de foregående grupper eller er hydroxy, methoxy, ethoxy eller benzyloxy: og når R2 og R6 har slike betydninger er de foretrukne betydninger for R3 og R5 som angitt i foregående avsnitt, og foretrukne betydninger for R4 er hydrogen og methyl.

p er 1.

Som anvendt her med mindre annet er angitt, betegner uttrykkene alkyl og alkoxy slike grupper som har rettkjedede eller forgrenede carbonkjeder med fra 1 til 6 carbonatomer.

Visse av forbindelsene av strukturformel I danner salter med farmasøytisk akseptable syrer. Saltsyre, svovel-syre, eddiksyre, maleinsyre, fumarsyre o.l. kan anvendes.

Forbindelser av strukturformel I hvori R2 og/eller

R6 er hydroxy danner salter med farmasøytisk akseptable baser. Natrium, kalium og calciumhydroxyd såvel som natrium og kaliumcarbonat er eksempler på egnede baser for dette formål. I tillegg tas i betraktning salter dannet med farmasøytisk akseptable aminer slik som f.eks. ammoniakk, N-methylglucamin, benzylamin og morfolin.

Forbindelsene av strukturformel I kan fremstilles under anvendelse av reaksjoner og reaktanter som er vel kjent innen polypeptidfaget.

Analogifremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved at det anvendes en egnet metode valgt fra følgende metoder hvori p, Rlr R2, R3, R4, R5 og R6 er som ovenfor definert, innbefattende egnet beskyttelse av enhvert reaktiv gruppe;

(a) reduksjon av en forbindelse av formel XX ved C=N-dobbeltbindingen

(b) kopling av en aminosyre av formel VIII til en aminosyre av formel V

etterfulgt av fjerning av enhver beskyttende gruppe om nød-vendig, under dannelse av den ønskede forbindelse av formel I, og, om ønsket, omdannelse av denne til et salt derav.

Den etterfølgende generelle prosedyre kan anvendes for å fremstille forbindelsene av formel I fra lett tilgjengelige eller lett fremstillbare utgangsmaterialer:

Prosedyre

I den foregående reaksjonsrekke beskyttes aminofunk-sjonen i forbindelse VI med en aminobeskyttende gruppe som vanligvis anvendes innen faget (G) slik som benzyloxycarbonyl, t-butyloxycarbonyl e.l. Forbindelse VI kondenseres med et aminoesterderivat V hvori Rg er beskyttet om nødvendig eller ønsket, og eksempelvis kan en slik beskyttet Rg-gruppe være benzyloxy, t-butyloxy, lavere alkoxy e.l. Kondenseringsmidler slik som dicyclohexylcarbodiimid eller difenylfosforylazid kan anvendes. Også aktiverende midler slik som 1-hydroxybenzotriazol kan anvendes i reaksjonen.

Det resulterende dipeptid IV avbeskyttes ved amin-enden ved behandling med syrer eller ved hydrogener ing under anvendelse av f.eks. hydrogen og en metallkatalysator. Det resulterende produkt (III) kondenseres deretter (i henhold til metode (b) som ovenfor definert) med en ketosyre eller keto-ester (II) i et egnet løsningsmiddel slik som vann eller acetonitril ved en hovedsakelig nøytral pH i nærvær av et reduksjonsmiddel slik som natriumcyanborhydrid eller ekvivalent virkende reduksjonsmiddel. Alternativt kan Schiff-basen som resulterer fra begynnelseskondensasjonen av II og III reduse-res (i henhold til metode (a) som ovenfor definert), f.eks. ved katalytisk reduksjon under dannelse av I under anvendelse av hydrogen ved et trykk på 1-4 atmosfærer. Den katalytiske reduksjon kan utføres under anvendelse av Raney-nikkelkataly-sator eller 10% palladium på carbon e.l. Forbindelsene av formel I som har en carboxylendegruppe kan fremstilles fra en tilsvarende ester ved hydrolyse eller hydrogenolyse.

I den foregående reaksjonsrekke er substituentene R^, B- 2' R3 r R4 1 R5 og Rg og p som tidligere definert, G er en egnet beskyttende gruppe, f.eks. benzyloxycarbonyl eller t-butyloxycarbonyl.

I de foregående reaksjonssekvenser hvori vann dannes av reaktantene (f.eks. kondensasjonen av forbindelse II og III i metode a), kan reaksjonen utføres ved azotrop destillasjon av det dannede vann med egnede høytkokende løsningsmidler slik som toluen eller xylen. Alternativt kan reaksjonene utføres i nærvær av dehydratiseringsmidler slik som molekylsiler eller lignende.

Forskjellige mellomprodukter for anvendelse i de beskrevne metoder og prosedyrer kan erholdes ved å følge direkte de prosedyrer eller analoge prosedyrer som er beskrevet i Europa patentsøknad 5486 2.

Ennvidere er et utall av mellomproduktene for fremstilling av forbindelsen ifølge oppfinnelsen kommersielt tilgjengelige, eller de kan lett fremstilles etter kjente metoder. Mellomprodukter for fremstilling av et betydelig antall av forbindelsene ifølge oppfinnelsen er.beskrevet, eller fremstillingen derav er omfattet i publikasjoner og avhandlin-ger vedrørende peptidkjemien, slik som J.H. Jones, i "Compre-hensive Organic Chemistry", Vol.2, D. Barton og W.D. Ollis, Utgivere, Pergamon Press, 1979 sidene 819-823 og referanser 2, og 29-31 .

De etterfølgende eksempler illustrerer fremstillingen av forbindelsene ifølge oppfinnelsen.

Eksempel 1

N- In- [L-1-carboxy-2-(4-fenyl)-fenylethyl] -L-fenylalanyl] - Q-alaninbenzylester

A. 4- fenylfenylpyrodruesyre

40 g kalium-t-butoxyd ble tilsatt til 150 ml diethyl-oxalat i små porsjoner under omrøring. Etter at den eksoterme begynnelsesreaksjon hadde avtatt, ble reaksjonsblandingen oppvarmet på et dampbad under nitrogen for å oppløse de faste

materialer. Etter nedkjøling til romtemperatur ble 79 g 4-bifenyleddiksyremethylester tilsatt i én porsjon. Blandingen ble omrørt ved 60-70°C i to timer mens lavtkokende materiale ble fjernet under vakuum. Etter avkjøling til romtemperatur ble det viskøse residuum omrørt med 20 0 ml ether og 350 ml vann under avkjøling. Etherlaget ble fraskilt og ekstrahert én gang med 100 ml vann. De vandige lag ble kombinert, ekstrahert én gang med ether, surgjort med konsentrert HCl (kjøling) og ekstrahert med 2 x 300 ml ether. Noe fast materiale ble ikke oppløst i etherlaget og ble filtrert. Etherlaget ble deretter fordampet til tørrhet og det halvfaste residuum ble kombinert med de foregående faste materialer. En blanding av 160

ml konsentrert HC1 og 3 50 ml eddiksyre ble tilsatt til den faste/halvfaste residuumblanding, og den resulterende blanding ble oppvarmet under tilbakeløpskjøling i 2,5 time. Etter avkjøling til 50°C utfeltes et fast materiale som ble filtrert og vasket med 150 ml vann. Det våte, faste materiale ble omrørt med 150 ml acetonitril i 5 minutter, ble deretter filtrert og tørket under høyvakuum ved romtemperatur i 3 timer. 42,2 g av tittelforbindelsen med smeltepunkt 215-218°C ble erholdt.

B. N- [N- pST-tert-butyloxycarbonyl] -L-fenylalanyl] -$-alanin-benzylester

Til en omrørt blanding av 0,0 23 mol hver av di-t-butyldicarbonat, L-fenylalanin, 8-alaninbenzylester-p-toluen-sulfonat, hydroxybenzotriazol, N-dimethylaminopropyl-N<1->ethyl-carbodiimidhydroklorid i 75 ml tørr N,N-dimethylformamid i et isbad ble tilsatt 5 ml N-ethylmorfolin, og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 3 timer og ble deretter helt over i 6 00 ml isvann og ekstrahert med 3 x 150 ml ether. Ether-lagene ble kombinert og ekstrahert 1 gang med 150 ml 0,3N_.HC1, deretter 2 ganger med 3 00 ml vann og ble deretter tørket over Na^SO^, filtrert og fordampet til tørrhet ved 28°C i vakuum. 9,0 g av et gummiaktig fast residuum ble erholdt.

C. N-( L- fenylalanyl)- g- alaninbenzylesterhydroklorid

4,0 g av materialet fra eksempel 1B i 25 ml ethylacetat ved 0°C ble omrørt med gassformig HC1 i 10 minutter. Blandingen ble omrørt ved 0°C i 1,5 time og deretter ved 10°C i 30 minutter. En strøm av N2 ble ført gjennom løsningsmidlet for å utdrive overskuddet av HC1. Løsningen ble helt over i 200 ml ether under kraftig omrøring, og det utfelte faste materiale ble filtrert og ble deretter tørket ved romtemperatur under høyvakuum i 2 timer under dannelse av 3,35 g produkt.

D. N-[N-[l-1-carboxy-2-(4-fenyl)-fenylethyl]-L-fenylalanyl]-B- alaninbenzylester

En blanding av 9,10 g N-(L-fenylalanyl)-8-alaninbenzylesterhydroklorid og 8,40 g av forbindelsen fra eksempel 1A i 500 ml av en blanding av tetrahydrofuran-ether (9:1) ble behandlet med triethylamin til pH 6,6 og ble omrørt ved romtemperatur i 1,5 time. En løsning av 2,0 g natriumcyanborhydrid i en blanding av 100 ml tetrahydrofuranethaaol ble dråpevis tilsatt i løpet av 2 timer under omrøring. Omrørin-gen ble fortsatt ved romtemperatur over natten. Reaksjonsblandingen ble konsentrert til 75 ml ved 40°C i vakuum. Residuet ble omrørt med 400 ml hver av 0,5N HC1 og ether i 1 time. Etherlaget ble tørket over natriumsulfat, ble filtrert og fordampet til tørrhet i vakuum. En gul viskøs syre ble erholdt som ble oppløst i 25 ml ethanol. Fast materiale ble dannet ved henstand over natten i kjøleskap, og ble filtrert fra, vasket med kald ethanol (4,2 g) og ble kromatografert over en kolonne av 300 g silicagel under anvendelse av en løsnings-middelblanding bestående av CHC13:CH3OH:CH3C02H (200:10:2) . Eluatet ble oppdelt i fraksjoner som ble fordampet til tørrhet i vakuum. På denne måte ble det erholdt 6 00 mg av et fast produkt bestående av tittelforbindelsen med smeltepunkt 19 2-194°C.

Eksempel 2

N-[N-[L-1-carboxy-2-(4-fenyl) -fenylethyl] -L-f enylalanyl] -3-alanin

En suspensjon av 59 0 mg av produktet fra eksempel 1 i 100 ml ethanol ble ristet over natten med 200 mg 10% Pd/C i en Parr-apparatur. Den resulterende blanding ble fortynnet med 4 0 ml ethanol og 10 ml vann og ble deretter oppvarmet kort på et dampbad inntil alt det hvite bunnfall var blitt oppløst. Etter avkjøling ble katalysatoren filtrert fra. Filtratet ble fordampet ved 50°C under vakuum til 5 ml. Det faste materiale ble filtrert, vasket med ethanol og ble tørket ved romtemperatur under høyvakuum i 6 timer under dannelse av 155 mg av tittelforbindelsen med smeltepunkt 226-228°C.

[ct]D26 = 16,8 (C = 0,5, DMF)

Analyse, beregnet: C 70,40, H 6,13, N 6,08 Funnet: C 70,54, H 6,26, N 5,97

Eksempel 3

N-[N-[L-[1-[pivaloyloxymethoxy]-carbonyl] -2-fenylethyl)] -L-fenylalanyl] - g- alanin, plvaloyloxymethylester

A. N-( tert- butyloxycarbonyl)- g- alanin, pivaloyloxymethylester

32,4 ml triethylamin ble tilsatt til 40 g N-tert-butyloxycarbonyl-g-alanin i N,N<1->dimethylformamid ved romtemperatur under en nitrogenatmosfære i en 1-liters rundkolbe. Løsningen ble omrørt i 15 minutter og 36,6 g klormethylpivalat [m. Rasmussen & N.J. Leonard, J. Amer. Chem. Soc, 39, 5439

(1967)] ble dråpevis tilsatt ved 0°C. Løsningen ble omrørt ved romtemperatur over natten. Blandingen ble deretter fortynnet med ethylacetat, ble filtrert, vasket med vann og deretter saltvann og ble fordampet under dannelse av 70 g urent materiale som ble kromatografert (silicagel) og eluert med 15% ethylacetat-hexan under dannelse av 62,5 g produkt.

B. g- alanin, pivaloyloxymethylester, trifluoracetat

100 ml trifluoreddiksyre ble tilsatt til en løsning av 62 g av produktet fra eksempel 3A i 180 ml methylenklorid ved 0°C. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer og løsningsmidlet ble fjernet i vakuum under dannelse av 100 g produkt som en lys gul olje.

C. N-[l-1-(fenylmethoxy)-carbonyl-2-fenylethyl)] -L-fenylalanin

19 0,4 g (0,652 mol) L-fenylalaninbenzylesterhydroklorid ble suspendert i 96 0 ml absolutt methanol, 6,7 1 tørr (3A siler) tetrahydrofuran ble tilsatt og oppslemningen ble omrørt mens ca. 50 ml triethylamin ble tilsatt for å bringe

pH til 6,5-7,0. pH ble kontrollert med EM Reagents ColorpHast-indikatorremser, område pH 5-10, fuktet med vann før bruk. Til den nøytrale oppslemning ble tilsatt 200 g (0,98 mol) natrium-fenylpyruvathydrat (sigma), etterfulgt av 240 g knust 3A molekylsiler. (Silene kan knuses i en morter og behøver ikke å finpulveriseres. Hvis disse er for fine er de vanskelige å fjerne ved filtrering.) Oppslemningen ble omrørt ved omgivende temperatur mens en løsning av 61,6 g (0,98 mol) natriumcyanborhydrid i 40 ml methanol pluss 300 ml tørr tetrahydrofuran ble dråpevis tilsatt i løpet av 5 timer. Reaksjonsblandingen

ble omrørt ved omgivende temperatur i 48 til 72 timer mens forsvinningen av benzylester ble overvåket ved tynnskiktkromatografi. Reaksjonsblandingen ble filtrert for å fjerne siler, silene ble vasket grundig med varm methanol idet noe produkt var utfelt på disse.

Filtratet ble konsentrert på en rotasjonsfordamper ved 50°C til en sirup. Denne sirup ble oppløst i 2,4 1 ether i en 12 l's rundkolbe og ble omrørt på et.isbad mens 2,4 1 2,5%-ig vandig HC1 ble tilsatt. Det store volum av HCN som ble utviklet ble ført gjennom en natriumhydroxydfelle. Blandingen ble omrørt i 2,5 til 3 timer mens et hvitt fast materiale gradvis ble dannet ved grenseflaten og utviklingen av HCN stoppet. 2-faseblandingen ble filtrert (mesteparten av den vandige fase kan fjernes i en separator før filtrering idet produktet forblir ved grenseflaten) og det faste materiale ble vasket grundig med ether og ble tørket i vakuum under 50°C. Utbytte 80-90 g med smeltepunkt 175-180°C.

Dette materiale er 90-95% rent L,L-isomer som fastslått ved tynnskiktskromatografi. Det urene produkt ble oppløst på nytt i ca. 10 1 kokende, absolutt methanol, noe fint hvitt uorganisk uløselig materiale ble filtrert og filtratet ble konsentrert til 5 1 ved kokepunktet hvoretter flokkulerende hvite krystaller kom til syne. Produktet fikk avkjøles langsomt til romtemperatur og deretter til 0°C i 2-3 timer. Det faste materiale ble oppsamlet og tørket i vakuum ved 50°C. Utbytte 57-60 g, sm.p. 185-186°C, [a]D26 5,9 til 6,3° <*> (DMSO, C=1). Produktet utgjorde mer enn 98% av L,L-isomeren som bestemt ved tynnskiktkromatografi og høytrykks væskekromato-grafi. <*> (resultat av flere forsøk). D. N-(L-1-benzyloxycarbonyl-2-fenylethyl)-L-fenylalanin,

pivaloyloxymethylester

En løsning av 4,03 g (10 mmol) av produktet fra eksempel 3C og 1,5 ml (11 mmol) triethylamin i 20 ml DMF ble behandlet ved omgivende temperatur med 1,6 ml (11 mmol) klormethylpivalat, ble omrørt ved 50-60°C i 24 timer og den resulterende oppslemning ble helt over i vann og ekstrahert med 3 x 100 ml ether. Noe uløselig materiale ble filtrert fra og etherfasen ble vasket med vann, ble tørket og konsentrert til en olje. Utbytte 4,8 g. NMR var i overensstemmelse med strukturen av tittelforbindelsen.

E. N-(L-carboxy-2-fenylethyl)-L-fenylalanin, pivaloyloxy-methylester

Den urene diester fra eksempel 3D (4,8 g) ble hydrogenert i en Parr-apparatur ved 4,2 kg/cm 2 i 50 ml methanol pluss 5 ml H20 i nærvær av 0,4 g 10% Pd/C i 3 timer. Den resulterende reaksjonsblanding ble filtrert og konsentrert til et fuktig fast materiale som ble omkrystallisert fra methanol/H20. Hvite fnuggete nåler ble filtrert fra og tørket i vakuum. Utbytte 3,0 g med smeltepunkt 122-124°C. TLC viste hovedsakelig én flekk, Rf 0,2, i CHCl3/MeOH/HOAc 100:1:0,0,5.

F. N-(L-1-pivaloyloxymethylcarbonyl-2-fenylethyl)-L-fenylalanin- g- alanin, pivaloyloxymethylester

En blanding av 1,0 g (2,3 mmol) av produktet fra eksempel 3E og 0,89 g (2,3 mmol) av produktet fra eksempel 3B i 25 ml DMF ble behandlet med 1,01 ml (8 mmol) N-ethylmorfolin, etterfulgt av 352 mg (2,3 mmol) 1-hydroxybenzotriazolhydrat og 439 mg (2,3 mmol) 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydroklorid, og ble omrørt ved omgivende temperatur over natten. Tynnskiktkromatografi viste at utgangsmaterialet frem-deles var tilstede. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 40-50°C i 6 timer og fikk stå ved romtemperatur over natten. Blandingen ble helt over i vann og ekstrahert med flere porsjoner ether, etherfasen ble deretter vasket grundig med vann, ble tørket og konsentrert til en olje (1,2 g). Oljen ble kromatografert på silicagel 60-G fra Merck av tynnskiktkromato-graf ikvalitet, under dannelse av 0,9 g olje som utviste én enkelt flekk, Rf 0,4 i EtOAc/Hexan 1:2 (samme system som anvendt for kolonnekromatografi). Analyse: Beregnet for C33<H>44<N>2°9: C 64,69, H 7,24, N 4,57.

Funnet: C 64,47, H 7,20, N 4,29.

[a] D26 -21 ,7° (DMF, C = 1 ,0) .

Eksempel 4

N-[N-[L-[1-[(2,2-dimethyl-1-oxopropoxy)-methoxy] -carbonyl] -2-( 4- fenyl) - fenylethyl] - L- fenylalanylj - g - alanin A. N-Q},L-1-carboxy-2- (4-fenyl)-fenylethyl] -L-fenylalanin,

benzylester

En omrørt suspensjon av 24 g 4-fenylfenylpyruvsyre og 23,2 g L-fenylalaninbenzylesterhydroklorid i 1 1 THF/ethanol (9:1) ble bragt til pH 6,6 ved gradvis tilsetning av triethylamin. I løpet av denne prosess ble alt fast materiale oppløst. Etter omrøring av den resulterende løsning i 2 timer ved romtemperatur ble en løsning av 3,5 g natriumcyanborhydrid i samme løsningmiddel dråpevis tilsatt under omrøring. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur over natten.

Reaksjonsblåndingen ble deretter konsentrert til 200 ml under redusert trykk. Residuet ble helt over i 600 ml 0,3N HC1 under avkjøling og omrøring. Et gummiaktig fast materiale ble fraskilt. Det vandige materiale ble dekantert fra og det gjenværende faste materiale ble omrørt med 120 ml ethanol.

Det resulterende faste materiale ble filtrert og det våte faste materiale ble omrørt med 100 ml frisk ethanol. Etter henstand over natten ble det faste materiale filtrert og tør-ket under dannelse av 22,3 g fast produkt.

B. N- [p,L- [1- [(2, 2-dimethyl-1-oxopropoxy) -methoxy]-carbonyl] -

2-( 4- fenyl)- fenylethyl]- L- fenylalanin, benzylester

3,05 ml triethylamin ble tilsatt til en løsning av 9,6 g N-[p,L-1-carboxy-2-(4-fenyl)-fenylethyl] -L-fenylalanin benzylester i 30 ml dimethylformamid. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 20 minutter og 3,15 ml klormethylpivalat ble tilsatt. Den resulterende blanding ble oppvarmet i et bad til 4 5-55°C

i 4 timer under omrøring, og ble deretter omrørt ved romtemperatur over natten. Den resulterende blanding ble fortynnet med 300 ml vann og ble ekstrahert med 3 150 ml's porsjoner ether. De kombinerte etherlag ble ekstrahert 2 ganger med 100 ml's porsjoner av vann og etherløsningen ble tørket over vannfritt Na2S04. Filtrering og fordampning i vakuum ga 7,5 g av et sirupaktig produkt.

Dette materiale ble kromatografert på 135 g silicagel og ble eluert med en blanding av ethylacetat-cyclohexan (85:15), Fraksjoner inneholdende den ønskede diastereomere blanding av produkter ble identifisert ved tynnskiktkromatografi, ble kombinert og fordampet til tørrhet i vakuum under dannelse av 5,9 g av produkt som en sirup.

C. N- [D,L- [1 - |]( 2, 2-dimethyl-1 -oxopropoxy) -methoxy] -carbonyl] -

2-( 4- fenyl)- fenylethyl] - L- fenylalanin

En løsning av 5,9 g av det ovenfor angitte produkt i 175 ml ethanol ble hydrogenert ved 1,05-2,1 kg/cm over 750 mg 10% Pd/C i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med ytterligere 250 ml ethanol og ble oppvarmet til 45°C for å oppløse det utfelte produkt. Katalysatoren ble filtrert fra den varme løsning og filtratet ble fordampet under dannelse av totalt 4,4 g produkt.

D. N- [n- [l- jj - [( 2, 2-dimethyl-1 -oxopropoxy) -methoxy^-carbonyl] - 2-(4-fenyl)-fenylethyl]-L-fenylalanyl]-3-alanin, benzylester

1,2 ml N-ethylmorfolin ble tilsatt til en omrørt blanding av 3,25 g av det ovenfor erholdte produkt, 1,7 g N-(N,N-dimethylaminopropyl)-N<1->ethylcarbodiimidhydroklorid, 1,3 g hydroxybenzotriazol og 3,0 g 8-alaninbenzylester-p-toluensul-fonat i 25 ml dimethylformamid. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 3 timer, ble fortynnet med 200 ml isvann og ble ekstrahert i 2 125 ml's porsjoner ether. De kombinerte ekst-rakter ble vasket med 250 ml vann og ble tørket over vannfritt MgS04. Filtrering og fordampning ga 5,25 g residuum. Tynn-skiktkromatograf i (silicagel, CHCl^/EtOAc - 10:1) viste to hovedprodukter, R^ = 0,36 og R^ = 0,32 (delvis overlappende). Dette materiale ble kromatografert på 350 gsilicagel (tynnskikt-kromatograf ikvalitet) , og ble eluert med CHCl-j-EtOAc (100:5). Fraksjoner inneholdende de rene individuelle komponenter ble . identifisert ved tynnskiktkromatografi, ble kombinert og fordampet. På denne måte ble 650 mg av den hurtigere bevegelig komponent (L,L-diastereoisomer) erholdt sammen med 59 0 mg av L,D-diastereoisomeren.

Sluttproduktet ble erholdt ved hydrogenering av en løsning av 650 mg av L,L-diastereoisomeren i 50 ml ethanol over 50 mg 10% Pd/C ved 1,05-3,15 kg/cm<2> i 3 timer. Katalysatoren ble filtrert fra og filtratet ble fordampet til tørrhet i vakuum ved 3 0°C. Residuet ble kromatografert på 50 g silicagel av tynnskiktkromatografikvalitet og ble først eluert med 3 00 ml CHCl3/EtOAc (10:1) og deretter med CHC13/CH3OH/AcOH

(600:10:2). Fraksjoner inneholdende rent produkt ble identifisert ved tynnskiktkromatografi (silicagel) CHCl3/CH3OH/AcOH (600:10:2), Rf = 0,31. Disse fraksjoner ble kombinert, fordampet og residuet ble tørket ved romtemperatur i høyvakuum over natten. Residuet ble omkrystallisert fra ether og produktet ble tørket ved 45°C i 3,5 time i høyvakuum. Det ble erholdt 250 mg fast materiale, sm.p. 101-103°C, [a]D26 -22° (c = 0,5,

DMF) .

Eksempel 5

N- [N- [l- [1 - (2, 2-dimethyl-1 -oxopropoxy) -methoxy] -carbonyl] -2-f enylethyl] - L- f enylalanyl] - g- alanin

En blanding av 0,9 g (2,1 mmol) N-(L-1-carboxy-2-fenylethyl)-L-fenylalanin, pivaloyloxymethylester (eksempel 3E) og ekvimolare mengder av 73 mg g-alaninbenzylester-p-toluen-sulfonat, 321 mg 1-hydroxybenzotriazolhydrat og 401 mg 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid HC1 ble oppløst i 20 ml DMF inneholdende 0,8 ml (6,3 mmol) N-ethylmorfolin og blandingen ble omrørt ved omgivende temperatur over natten.

Den gule løsning ble helt over i 150 ml vann og ble ekstrahert med 3 x 100 ml ether. Etherfasen ble vasket med vann, ble tørket og konsentrert til 1,1 g av en olje som utviste én hovedflekk med mindre forurensning ved tynnskikt-kromatograf i .

Det totale produkt ble kromatografert på 150 g silicagel og ble eluert med ethylacetat/hexan (30:70). Fraksjonene ble kombinert og konsentrert til en olje [a]D26 - 20,0° (DMF, c = 1) .

1,5 g av det ovenfor beskrevne produkt ble hydrogenert ved 2,8 kg/cm<2> i 100 ml absolutt EtOH over 0,2 g 10% Pd/C i 3 timer.

Katalysatoren ble filtrert og filtratet ble konsentrert til en olje som ble krystallisert ved tørking i høyvakuum over natten. Ved henstand i hexan ble det erholdt fine farve-løse krystaller som ved filtrering og tørking ga 1,2 g produkt sm.p. 93-95°C, [a] D26 - 27,3° (DMF, c = 1).

Ved å følge prosedyrene beskrevet i den foregående beskrivelse og eksempler, men å anvende egnede mellomprodukter, kan hver av de tidligere spesifiserte forbindelser 1-63 fremstilles .

I den etterfølgende tabell indikerer forkortelsene CgH^CH2 og C^H^ benzylgruppene og CgHj. indikerer fenylgruppen. Ved å følge de ovenfor beskrevne metoder ble følgende forbindelser fremstilt. Unntatt der hvor det spesielt er angitt har alle forbindelser L absolutt stereokjemi ved de chirale sentra, og Rj- er lik hydrogen.

Eksempel 6

A. N-(L-1-(fenylmethoxycarbonyl)-2-fenylethyl)-L-fenylalanin,

cyanomethylester

En løsning av 4,03 g (10 mmol) av produktet fra eksempel 3C og 2,1 ml (15 mmol) triethylamin i 150 ml aceton ble behandlet dråpevis ved romtemperatur med 0,95 ml (15 mmol) kloracetonitril. Den resulterende løsning ble oppvarmet til tilbakeløpskokning over natten. Den ble deretter konsentrert til tørrhet og fordelt mellom vann og ether. Etherfasen ble vasket med flere porsjoner vann, ble tørket og konsentrert til en olje. 4,5 g av materialet ble således erholdt, og ble anvendt direkte i neste trinn.

B. N-(L-1-(fenylmethoxycarbonyl)-2-fenylethyl)-L-fenylalanin, 2 , 2- dimethyl- 1, 3- dioxolan- 4- yl- methylester 4,4 g (10 mmol) av produktet fra foregående trinn og 25 ml (20 mmol) 2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl-methanol (Aldrich Chemical Co.) ble kombinert, hvorpå 1,4 ml (10 mmol) triethylamin og 20 mg N,N-dimethy1-4-aminopyridin ble tilsatt. Den resulterende blanding ble omrørt under en nitrogenatmosfære ved 55-60°C i 16 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter helt over i vann og ble ekstrahert med flere porsjoner ether. De kombinerte etherekstrakter ble vasket med flere porsjoner vann, ble tørket og konsentrert under dannelse av 5,7 g av en olje. Dette produkt ble kromatografert på 400 g Merck silicagel 60G, og ble eluert med ethylacetat-hexan-blandinger. Fraksjoner som viste seg å være rene ved tynnskiktkromatografi ble kombinert og fordampet til tørrhet under dannelse av 4,2 g olje,

La] <26> -6,2° (c 1,3, DMF) .

C. N-(L-1-(2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl-methoxycarbonyl) -2-f enylethyl)- L- fenylalanin

Produktet fra foregående trinn ble oppløst i 50 ml tetrahydrofuran og ble hydrogenert i en Parr-apparatur over 0,4 g 10% palladium på carbon ved romtemperatur og 4,2 kg/cm<2>

i 4 timer. Katalysatorene ble filtrert og filtratet ble fordampet i vakuum under dannelse av 3 g av et voksaktig residuum som ble krystallisert fra ethylacetat under dannelse av 2,6 g krystaller med smeltepunkt 140-2°C.

D. N-(N-(L-(1-(2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)-methoxy)-carbonyl)-2-fenylethyl)-L-fenylalanyl)-g-alanin, benzylester

En blanding av 2,5 g (5,8 mmol) av produktet fra foregående trinn, 2,2 g (6,4 mmol) g-alaninbenzylester-p-toluen-sulfonat, 887 mg (5,8 mmol) 1-hydroxybenzotriazolhydrat, 1,1 g (5,8 mmol) 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydro-klorid og 23 ml (18 mmol) N-ethylmorfolin i 20 ml dimethylformamid ble omrørt ved romtemperatur over natten.

Den resulterende gule løsning ble helt over i vann og ekstrahert med flere porsjoner ether. De kombinerte etherekstrakter ble vasket gjentagne ganger med vann, ble tørket over vannfritt kaliumcarbonat og ble konsentrert til 3,3 g av en olje. Dette materiale ble kromatografert på 3 00 g Merck silicagel 60, og eluert med hexan-ethylacetat (2:1). Fraksjoner som ved tynnskiktskromatografi viste seg å være homogene (silicagel ^254' etnylacetat-nexan (1:1)) ble kombinert, og løsningsmidlet ble fordampet under dannelse av 2,7 g av et oljeaktig produkt som ble anvendt direkte i etterfølgende trinn.

E. N-(N-(L-(1-(2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)-methoxy)-carbonyl)- 2- fenylethyl)- L- fenylalanyl)- g- alanin

Produktet fra foregående trinn (2,2 g) ble oppløst i

50 ml absolutt ethanol og hydrogenert i en Parr-apparatur under anvendelse av 0,2 g 10%-ig palladium/carbon ved 3,5 kg/cm 2 i 4 timer ved romtemperatur. Katalysatoren ble filtrert og filtratet ble konsentrert til en olje (1,9 g) som stivnet. Omkrys-tallisering fra ether ved -80°C ga 1,8 g fast materiale, sm.p. 80-2°C, [a] 26 = -22,7° (c 1, DMF). Tynnskiktskromatograf i viste én enkelt flekk, R^= 0,35 (kloroform-methanol-eddiksyre 500:25:2,5) .

F. N-(N-(L-(1-(2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)-methoxy)-carbonyl)-2-fenylethyl)-L-fenylalanyl)-g-alanin, maleat

( 1:1)

5,0 g av produktet fra foregående trinn ble oppløst

i 200 ml ether og ble behandlet med en løsning av 1,16 g maleinsyre i 200 ml ether. Krystaller ble langsomt dannet under henstand over natten ved 5-10°C i kjøleskap. Disse ble filtrert

og tørket under dannelse av 4,7 g salt, sm.p. 127-9°C, [a] ^ = -16,3° (c 1, DMF). Analyse beregnet for c3 •] H38N2°i 1 : c 60,58, H 6,23, N 4,55. Funnet: C 60,33, H 6,31, N 4,48.

Forbindelsene av strukturformel I inhiberer aktiviteten av de enzymer som er betegnet som enkefalinaser. Forbindelsene er særlig anvendbare for inhibering av enkefalinase A, som er avledet fra striata fra både rotter og mennesker. I in vitro tester ble det funnet at utvalgte forbindelser av strukturformel I i et konsentrasjonsområde fra 10 — 9 til 10 —6M inhi-berte aktiviteten av det ovenfor angitte enzym med 50% eller mer.

Den etterfølgende testprosedyre ble anvendt for å bestemme enkefalinase A-inhiberingen av forbindelsene av struk-turf ormel I.

Enkefalin (ENK) nedbrytende aktivitet ble oppdelt i

de etterfølgende tre fraksjoner i henhold til metoden ifølge Gorenstein og Snyder, (Life Sei., 25, 2065 (1979): Enk'ase A

3 4 12

(Gly -Phe ), Aminopeptidase, (AP) (Tyr -Gly ), and Enk'ase B (Gly<2->Gly<3>)).

Enzymaktivitet ble separert ved å ta hjernevev (minus cerebellum) fra Sprague-Dawley rotter og homogenisere dette i 3 0 volumer j-.. 50 mM trisbuffer, pH 7,4, under anvendelse av en Brinkmann Polytron. Det resulterende homogenat ble sentri-fugert ved 50 000 x g i 15 minutter. Pelleten bestående av membranbundet enzymmateriale ble vasket ved resuspendering av dette i tris og resentrifugering av dette 4 ganger.

Etter vasking ble oppløseliggjørelse av membranpelle-ten oppnådd ved inkubering av denne i 4 5 minutter ved 3 7°C i nærvær av 15 volumer ( basert på den opprinnelige hjernevekt) 50 mM tris-1 % triton X-100 buffer, pH 7,4. Etter sentrifugering ved 100 000 x g i 60 minutter for å fjerne ikke-oppløseliggjort materiale ble den triton-løselige supernatant anbragt på en 1,5 x 30 cm DEAE Sephacel kolonne som på forhånd var ekvili-brert med 50 mM tris-0,1% triton, pH 7,4. Materialet ble eluert fra kolonnen under anvendelse av en 1-liters lineær NaCl gradient fra 0,0 til 0,4 M. Elueringsmidlet ble oppsamlet i 7 ml<1>s fraksjoner hvor hver ble bestemt med hensyn til enkefalinnedbrytende aktivitet. Under disse betingelser ble Enk'ase A-aktivitet funnet å bli eluert mellom 120 og 200 ml, etterfulgt av AP-aktivitet (260 til 400 ml) og til slutt Enk'ase B-aktivitet mellom 420 og 450 ml.

Enkefalinnedbrytende aktivitet ble overvåket under anvendelse av en radiometrisk bestemmelse. Substratet er 3 H-Met 5-ENK (50,1 Ci/mmol, New England Nuclear), fortynnet i 0,05 M trisbuffer, pH 7,4, slik at den endelige reaksjonsblan-dingskonsentrasjon er 40 nM. Det totale reaksjonsblandings-volum innbefattende enzym og substrat er 25 0 yl. Inkuberingen ble utført i 90 minutter ved 3 7°C. For å stoppe reaksjonen ble rørene overført til et kokende vannbad i 15 minutter.

Prøveproduktene ble separert fra hverandre under anvendelse av tynnskiktkromatografi. En 4 yl's aliguot av reaksjonsblandingen ble anbragt på en Baker-flex Silica Gel 1B-plate (20 x 20 cm) sammen med umerkede standarder (Met <5->ENK, tyrosin, tyrosylglycin, tyrosylglycylglycin) og komponentene ble co-kromatografert i en isopropanol:ethylacetat:5% eddik-syreløsningsmiddelsystem (2:2:1) som var istand til å oppløse Met -ENK fra dets nedbrytningsprodukter. Den totale forsøkstid var ca. 17 timer. TLC-beholderne ble spylt med nitrogen før starten av forsøket. Etter forsøket ble markørene tydeliggjort med ninhydrinspray. Disse flekker, sammen med gjenværende plateregioner ble kuttet fra platen og radioaktiviteten svarende til hver ble overvåket under anvendelse av væske-skintillasjonstelling. IC^Q-verdier ble bestemt under anvendelse av lineær regresjonsteknikk.

Under anvendelse av denne prosedyre ble følgende nano-molare (nM) konsentrasjoner for de spesifiserte forbindelser funnet å inhibere virkningen av enkefalinase A med 50% (IC^q).

Den etterfølgende testprosedyre ble anvendt for å fastslå de angitte forbindelsers egenskaper når det gjelder å potensiere den analgesiske virkning av (DAla 2 -Met 5)-enkefalin-amid (DAEAM). Bakgrunn for anvendelse av denne prosedyre er gitt i Chipkin, R.E., Iorio, L.C., Barnett, A., Berger, J., og Billard, W., Regulatory Peptides: From Molecular Biology to Function, utgitt av E. Costa og M. Trabucchi, Raven Press, New York, 1982, sidene 235-242.

CF1 hanmus (19-23 g) fra Charles River Breeding Labs, Massachusetts, ble anvendt (N=10/dose eller dosekombinasjon). Haleslagtesting ble utført lik den beskrevet av Dewey og Harris, Methods in Narcotic Research, utgitt av S. Ehrenpreis og A. Neidle, sidene 101-109, Marcel Dekker, Inc., New York 1975 under anvendelse av en skadelig bestrålingsvarmestimulus.

Etter bestemmelse av kontrollatenstider (typisk 2-3 sekunder) ble musene først injisert (subkutant eller peroralt) med enten bærer eller legemiddel, og etter et egnet intervall, injisert intracerebroventrikulært (icv) med enten bærer (10 yl saltvann) eller DAEAM ifølge Haley og McCormic, Br., J. Pharmacol., 12,12 (1957). Haleslag-latenstider ble bestemt på nytt 30 minutter senere, idet disse tidligere var blitt bestemt til å være tiden for toppanalgesisk virkning for DAEAM, hvor en avbrytningstid på 10 sekunder ble anvendt.

Under anvendelse av denne prosedyre ble følgende EDj-q-verdier erholdt (den dose ved hvilken halvparten av testdyrene utviste analgesisk virkning) for de valgte forbindelser.

Det skal bemerkes at forbindelsene A, B, C, F og H er esterderivater, forbindelse H er et esterderivat av forbindelse G og forbindelse L er et amidderivat.

En slik derivatisering er blitt funnet å medvirke til

oral aktivitet til moderforbindelsen som utviser dårlig absorp-

sjon fra den gastrointestinale tractus. Disse derivater som ikke viser noen aktivitet in vitro ved 10^ nM (se tabell A) bioaktiveres in vivo for å utlevere moderforbindelsen (in vivo enkefalinase A-inhibitorer) til et virkningssete innen sentral-nervesystemet (se tabell B).

Claims (4)

1.. Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive forbindelser av formelen

og farmasøytisk akseptable salter derav, hvori er fenyl-lavere alkyl eller difenyl-lavere alkyl; R2 er hydroxy, -OCH2OCO-lavere alkyl, gruppen hvori R7 og Rg er lavere alkyl, eller R2 er -O-lavere alkyl-O-fenyl; 0-CH2-CHOH-CH2-OH, fenyl-lavere alkoxy eller amino-fenylalkoxy; R^ er benzyl eller fenylbenzyl; R4 er hydrogen, lavere alkyl eller hydroxy; R,, er hydrogen; R, er hydroxy, fenyl-lavere alkoxy, -OCH2OGO-lavere-alkyl, gruppen lavere alkoxy eller fenoxy-lavere alkoxy; R7 og Rg er lavere alkyl; p er 1; karakterisert ved at det anvendes en egnet metode valgt fra følgende metoder hvori p, R^, R2, R3' R4' R5 °9 R6 er som ovenfor definert, innbefattende egnet beskyttelse av enhver reaktiv gruppe; (a) reduksjon av en forbindelse av formel XX ved C=N-dobbeltbindingen (b) kopling av en aminosyre av formel VIII til en aminosyre av formel V etterfulgt av fjerning av enhver beskyttende gruppe om nød-vendig, under dannelse av den ønskede forbindelse av formel I, og, om ønsket, omdannelse av denne til et salt derav.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av N-[N-[L-[l-t(2,2-dimethyl-l,3-dioxolan-4-yl)-methoxy]-carbonyl]-2-fenylethyl]-L-fenylalanyl]-g<->alanin, karakterisert ved at tilsvarende utgangsmaterialer anvendes.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av N-[N-[L-Cl-[(2,2-dimethyl-l-oxopropoxy)-methoxy]-carbonyl]- 2-fenylethyl]-L-fenylalanyl]-g-alanin, karakterisert ved at tilsvarende utgangsmaterialer anvendes.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av N-[(L)-l-carboxy-2-fenylethyl]-L-fenylalanyl-L-fenylalanin, karakterisert ved at tilsvarende utgangsmaterialer anvendes.