FI74023C

FI74023C - Foerfarande foer framstaellning av etrar till anvaendning som laekemedel.

Info

Publication number: FI74023C
Application number: FI834342A
Authority: FI
Inventors: John Westley; Louise H Foley; Lilian H Sello
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1982-11-29
Filing date: 1983-11-28
Publication date: 1987-12-10
Also published as: PT77750A; IL70324A; AU575791B2; HUT35258A; GR81298B; NO156793C; NO834374L; PH18658A; EP0112517B1; NZ206388A; EP0112517A1; CA1218059A; US4565862A; IE56648B1; PT77750B; DK158740C; IE832787L; FI74023B; IL70324A0; DE3363094D1

Description

1 74023

Menetelmä lääkeaineina käytettävien eetterien valmistamiseksi

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää antibi-5 ootti X-14868A:n eetterien valmistamiseksi, joilla on kaava OMe 10 J.

a OMe 'Me M^^Vy^Me q 15 0H hYh °

He Me H Me H H H ^ *

OK

C02H

jossa R on C2-C7-alkyyli tai alempi hydroksialkyyli, 20 ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien happoadditio-suolojen valmistamiseksi.

Lyhennys "Me" edellä olevassa kaavassa tarkoittaa metyyliä.

Yhdiste X-14868A on tunnettu yhdiste, jota on 25 kuvattu US-patenttijulkaisussa no. 4 278 663, joka on julkaistu 14. kesäkuuta 1981. Tässä patenttijulkaisussa kuvataan samoin menetelmää antibiootin valmistamiseksi käyttäen Nocardia sp. X-14868A:ta, jolloin Nocardia sp. X-14868 on talletettuna numerolla ATCC 31585 American 30 Type Culture Collection1 isä, Rockville'ssä, Maryland'issa ja on yleisön saatavilla.

Kaavan I mukaisia uusia yhdisteitä valmistetaan saattamalla antibiootti X-14868A, jolla on kaava 35 2 74023 OMe A^OMe 5 OMe OH Jm

Me OMe JL Z σ Me T rMe.H'i > _ 0 Me

rJ-X-OC ίΛ/S VY

I OH H T H O'? jXq/; \0.i ' aV,-|·· M<<

Co h Me Me H Me H H H 0 *H

10 reagoimaan primäärisen tai sekundäärisen, 2-7 C-atomia sisältävän alkoholin kanssa tai difunktionaalisen alkoholin, esim. 2-7 C-atomia sisältävän diolin kanssa H+- muodossa olevan happamen ioninvaihtohartsin läsnäollessa, "t* 15 kuten H -muodossa olevan sulfonihappohartsin, kuten esim. H+-muodossa olevan DOWEX 50W:n läsnäollessa. Reaktio suoritetaan käyttäen alkoholia tai diolia liuottimena tai inertissä liuottimessa suunnilleen ympäristön lämpötilassa, esimerkiksi huoneen lämpötilassa.

20 Esimerkkejä sopivista alkoholeista ovat suoraket- juiset tai haaratuneet alkoholit, joissa on 2-7 C-atomia, kuten esim. etanoli, n- ja isopropanoli, n-butanoli, n-heksanoli ja vastaavat. Esimerkkejä sopivista dioleis-ta ovat difunktionaaliset alkoholit, joissa on 2-7 C-ato- 25 mia, kuten esim. etyleeniglykoli, n-butyleeniglykoli ja vastaavat.

Kuten tästä selityksestä ilmenee, kuuluvat tiettyjen eetterien sekä (R) että (S) konfiguraatiot esillä olevan keksinnön piiriin.

30 Esillä olevan keksinnön mukaisilla yhdisteillä on aktiviteettia antikokkidiostaattisina aineina. Niinpä on esimerkiksi antibiootti X-14868A:n n-propyylieetterillä ja etyylieetterillä aktiviteettia, konsentraation ollessa suunnilleen 20 - suunnilleen 35 ppm, testissä, joka 35 suoritettiin 2 viikon ikäisillä patteri-kananpojilla se- 3 74023 koitettuja Eimeria-alue-isolaatteja vastaan. Testi koostuu rutiinilaboratoriomenetelmästä kokkidioosi. Tällöin käytetään ei-infektioituja käsittelemättömiä kontrolleja (UUC) ja infektoituja käsittelemättömiä 5 kontrolleja (IUC). Kananpojille annetaan lääkehoitoa kahtena päivänä ennen infektiota 8 peräkkäisenä päivänä. Kananpoikiin infektoidaan 40000 E. acervulina'n, E. mivati'n, E. maxima'n, E. necatrix'in ja E. tenella'n aluekannan varhaismunuaissolua. Kutakin ryhmää kohden IQ käytetään 10 kananpoikaa. Tulokset on ilmoitettu seu-raavassa taulukossa:

Konsen- Painon Kuollei-_Vaurioiden lukumäärä traatio nousu, suus, % Yl- Kes- Umpi- Keski- rehussa, % häällä kellä suoli arvo ppm 15 UUC_0 100 0_(M)_0,0 0,0 0,0 IUC_0 48 40_3j_l_3,0 3,2 3,1 X-14868A:n 35 73 0 0,0 0,0 0,0 0,0 etyyli- 25 75 0 0,5 0,0 0,0 0,2 eetteri _20 81 0_U5_1,5 1,6 1,5 20 X-14868A:n 35 55 0 0,0 0,0 0,0 0,0 n-propyyli- 25 g? Q 0,1 0,0 0,0 0,03 eetteri _20_72 0_U5_1,5 1,4 1,5 25 Esillä olevan keksinnön mukaisilla yhdisteillä on aktiviteettia malarialääkkeinä. X-14868A:n etylee-niglykoli-, n-heksyyli-, etyyli-, n-butyyli- ja n-pro-pyylieetteriä testattiin vertaamalla klorokiniiniin ja pyrimetamiiniin, jotka ovat tunnettuja malarialääkkeitä. 30 Yhdisteitä testattiin kaksi kertaa käyttäen in-vitro-Screening-testiä Plasmodium falciparum'in kahta kantaa vastaan. Aktiviteetti (ID^q) ilmoitetaan pitoisuutena jug/1. Tulokset on esitetty kahta arvoa käyttäen seuraavasti : 4 74023

Yhdiste Plasmodium falciparum

Kanta 13 T9„ Cion 9 6 5 Klorokiini 390 - 550 44 - 75

Pyrimitamiini 55 - 61 68 - 70 X-14868A:n n-propyyli- eetteri 300 - 840 560 - 450 X-14868A:n etyylieetteri 142 - 270 205 - 145 X-14868A:n n-butyylieetteri (natriumsuola) 500 -1200 1150 - 830 X-14868A:n etyleeniglykoli- eetteri (natriumsuola) 39 - 76 48 - 39 X-14868A:n n-heksyyli- eetteri (natriumsuola) 930 - 650 X-14868A:n n-pentyyli- eetteri (natriumsuola) 1600 - 800

Antibiootti X-14868A:n 1,3-propaanidiolieetterin antikokkidiostaattisen vaikutuksen arvioimiseksi suori-20 tettiin toinen tutkimus sekoitettuja Eimeria-lajeja kohtaan käyttäen 2 viikon ikäisiä patteri-kananpoikia.

Tässä tutkimuksessa käytetyt Eimeria-kannat saatiin kaupallisesti saatavista kananpojista, joita ei käytetty aikaisemmissa tutkimuksissa. Vertailutarkoituksiin käy-25 tettiin antibiootteja monensiin!, lasolosidi ja antibiootti X-14868A. Kaikissa tutkimuksissa käytetään 2 viikon ikäisiä Hubbard Cross-kananpoikia, joita saadaan kaupallisesti eräästä hautomalaitoksesta, ja joita oli pidetty sähkölämmitteisessä patterissa, jossa oli metal-30 lilankapohja. Kulloinkin kolmeen identtiseen ryhmään valitaan 10 kananpoikaa painon ja sukupuolen mukaan (50 % naaras- ja 50 % uroskananpoikia). Kananpoikia hoidetaan 2 päivän ajan ennen infektiota lääkkeillä ja aina kokeen päättymiseen saakka, s.o. 6 päivän ajan infektios-35 ta annetaan antibiootteja. Jokaiseen kokeeseen käytetään 5 74023 ei-infektoituja käsittelemättömiä kontrolleja ja infek-toituja, käsittelemättömiä kontrolleja.

Kananpoika-alkuseoksena käytettiin täydellisen rehukoostumuksen perusrehuannosta, joka ei sisältänyt 5 lääkkeitä. Lääkkeitä sisältävää rehua valmistetaan lisäämällä haluttu konsentraatio lääkeainetta perusrehu-annokseen. Jokainen lääkeainekonsentraatio sekoitettiin huolellisesti ennen käyttöä rehuaineseokseen, jotta saataisiin yhtenäinen seos. Jokaisessa tapauksessa an-10 nettiin lääkettä sisältävää rehua 2 päivän ajan ennen infektiota kokonaiskestoajän ollessa 8 peräkkäistä päivää.

Infektio saatiin aikaan suun kautta, ja nimittäin istuttamalla suoraan suspensiota, joka sisälsi 15 E. acervulina/E. mivati - 500 000, E. maxima - 100 000, E. tenella - 100 000 ja E. brunetta - 50 000 itiöitä muodostunutta varhaismunasolua, joita oli ravisteltu hyvin ja jotka oli suspensoitu steriiliin tislattuun veteen, määrän ollessa 1 ml, eläinten struumaan tylpän 20 neulan avulla, joka oli liitetty kalibroituun injektio-ruiskuun .

Kokeen päätyttyä eloonjääneet kananapojat tapetaan ja karkeiden vaurioiden tutkimiseksi niille tehdään ruumiinavaus. Ruumiinavaus tehdään myös kaikille niil-25 le kananpojille, jotka ovat kuolleet kokeen aikana.

Diagnoosi perustui vaurion paikkaan ja morfologiaan. Tulokset ilmoitetaan keskimääräisenä infektioasteena (ADI) seuraavan laskusysteemin mukaan: 0 = normaali, 1 = lievä, 2 = kohtalainen, 3 = voimakas ja 4 = kuol-30 lut.

Tämän lisäksi esitettiin painonnousu (%).

6 74023 I 3 I C-P :3-Η w :3 3 cm

gCO OVO O O I—I LO O (N

•H 3-H ' > ^ V - - ^

,14 C -P O CM OOOOrHfN O O r-H Ο !—I

W-H M 0):(0 0) X i-ι M-i Ή

rH

0 r-

3 O 00 OOrHini—ICM CM l£> CM ΟΊ O

W ' ' »-·*»>- »

-H O CN OOOOHfM OOrHOCN

CU 6 D

:(0 r-f τ-i co r-~

0) O^J· O O O CO OI rH O CM rH in iH

x »» ·>»** *

CO O (N OOOOOCN O O rH O rH

0) « :(0 r-(

iH

:(0 or" oor-it^oro >h co in rH

:(ö ^ ^ ,C o m ο ο ο ο ,η cm o o I—ι ο i—i

r-H

>H

OP

C oo ι—if—ι m ι—ι cm <y* vo o co σι o 03 otn t^· oo <Ti <Ti co in oo ο oo σ\ oo

C to ι—I .H

•H 3 (0 0 Ph C

0 •H g -P 0« 3 0.

3 m m in in p - - ' ' > P 3 oo incNor-mtN ot^moo C W rH rH rH rH oo

3 W rH rH

co 3 CÄ O 0) x u

Η -H

•H C 1-1 -H

-P C 3 3 -P -Η -H

P ·· 3 -P -P Ό C

0 < Q< -P Ο <! -Η -H

O U U oo 0 3 O® W-H

•H ID D lO p 3 -H ID O W

Λ D H 00 Qj-H X) 00 r-i c •Η I Η ·Η «3* 3 3

-P H CO O -P rH WC

C I *> -H Cl 3 0 < c x »32 7 74023 X-14868A:n antibioottieetterin - seuraavassa "antibiootiksi" tai "antibioottisiksi yhdisteiksi "nimitetty - annostelu ehkäisee ketoosia ja hoitaa sitä sekä parantaa rehun hyväksikäyttöä märehtijöillä tai sioil-5 la. Ketoosista vastuussa oleva mekanismi on propionaat- ti-yhdisteiden alentunut tuotanto. Nykyisin suositeltuna hoitomuotona pidetään propionihapon antamista tai sellaisen rehun antamista, joka tuottaa etupäässä propionaat-teja. On selvää, että tavallisen rehun propionaatti-10 tuotannon kiihdyttäminen vähentää ketoosin esiintymistä.

Todettiin, että X-14868A:n eetteri kohottaa rehun hyväksikäytön tehokkuutta märehtijöillä, jos nämä X-14868A:n eetterit annostellaan eläimille suun kautta. Antibiottien yksinkertaisin antotapa on sekoittaa nämä 15 eläimen ravintoon.

Antibiootteja voidaan kuitenkin annostella hyödyllisesti myös toisella tavalla. Ne voidaan esim. sekoittaa tabletteihin, juomiin, suuriin pillereihin tai kapseleihin ja antaa näin eläimille. Tällaisina 20 annostusmuotoina olevia antibiottisten yhdisteiden valmisteita voidaan valmistaa eläinlääketieteessä sinänsä tunnettujen menetelmien mukaisesti.

Kapseleita valmistetaan tavanomaisella tavalla täyttämällä halutunmuotoiset gelatiinikapselit halutuil-25 la antibiooteilla. Haluttaessa antibiootit voidaan lai mentaa inertillä, kiinteällä laimennusaineilla, kuten esim. sokerilla, tärkkelyksellä tai puhdistetulla kiteisellä selluloosalla, tilavuuden kohottamiseksi tarkoituksenmukaisuussyistä .

30 Tabletteja valmistetaan tavanomaisia farmaseut tisia menetelmiä käyttäen. Yksi tabletti sisältää yleensä vaikuttavan aineen lisäksi perusainetta, desintegraat-toria, adsorbenttia, sideainetta ja liukuainetta. Tyypillisiä perusaineita ovat esim. maitosokeri, hieno 35 puuterisokeri, natriumkloridi, tärkkelys ja manniitti.

8 74023 Tärkkelys on samoin hyvä desintegraattori, kuten myös algiinihappo. Pinta-aktiivisia aineita, kuten natrium-lauryylisulfaattia ja dioktyylinatriumsulfosukkinaat-tia käytetään samoin silloin tällöin. Tavallisesti käy-5 tettyjä adsorbentteja ovat esimerkiksi tärkkelys ja maitosokeri, kun taas magnesiumkarbonaattia käytetään öl-jymäisten aineiden ollessa kyseessä. Usein käytettyjä sideaineita ovat gelatiinit, arabikurai, tärkkelys, dekst-riini, ja erilaiset selluloosa-johdannaiset. Usein käy-10 tettyjä liukuaineita ovat esim. magnesiumstearaatti, talkki, parafiinivaha, erilaiset metallisaippuat ja polyetyleeniglykoli.

Antibiootteja voidaan samoin antaa suurina pillereinä fboli"), joilla on hidastettu vaikutus.

15 Tällaisia suuria pillereitä valmistetaan tabletteina, jolloin kuitenkin lisätään yhtä ainetta antibioottien liukenemisen hidastamiseksi. Suuret pillerit on tarkoitettu vapautumaan pitemmän ajanjakson kuluessa. Hidas liukeneminen taataan valitsemalla veteeniiukenematon 20 antibiootti-muoto. Esimerkiksi voidaan lisätä rauta- viila jauhoa, tällaisen suuren pillerin tiheyden kohottamiseksi, jotta tämä pysyy pötsin pohjalla.

Antibioottien liukenemista hidastetaan käyttämällä liukenematonta materiaalia olevaa matriisia, jo-25 hon vaikuttava aine upotetaan. Esimerkiksi voidaan käyt tää kasvisvahaa, puhdistettua mineraalivahaa ja veteen liukenemattomia polymeerisiä aineita.

Antibiootti-juomia valmistetaan tarkoituksenmukaisesti valitsemalla vesiliukoinen antibiootti-muoto.

30 Jos halutaan liukenematon muoto, niin silloin voidaan valmistaa suspensio.Valinnan mukaan voidaan valmistaa juoma, joka on liuoksena fysiologisesti moitteettomassa liuottimessa, kuten esimerkiksi polyetyleeniglyko-lissa.

35 Antibioottien liukenemattomien muotojen suspen- „ sioita voidaan valmistaa ei-liuottimissa, kuten esim.

9 74023 kasvisöljyissä, esim. maapähkinä-, maissi- tai seesam-öljyssä, glykolissa, kuten esim. propyleeniglvkolissa tai polyetyleeniglykolissa, tai vedessä, aina valitun antibiootti-muodon mukaan.

5 Sopivat fysiologisesti hyväksyttävät lisäaineet ovat välttämättömiä, jotta antibiootit pysyisivät suspensiossa. Lisäaineet voivat olla paksuntamisaineita, kuten esim. karboksimetyyliselluloosaa, polyvinyylipyrro-lidonia, gelatiineja tai alginaatteja. Erilaisia vaah-10 toa muodostavia aineita käytetään antibiootin pitämi seen suspensiossa. Esimerkkejä ovat lesitiini, alkyvli-fenoli/polyetyleenioksidiadduktit, naftaliinisulfonaatit, alkyylibentseenisulfonaatit ja polyoksietyleenisorbi-taaniesterit ja niitä käytetään suspensioiden valmista-15 miseksi nestemäisissä ei-liuottimissa.

Suspensioiden valmistukseen voidaan käyttää lisäksi erilaisia aineita, jotka vaikuttavat hydro-fiilisyyteen, tiheyteen ja pintajännitykseen. Esimerkkejä ovat silikonivaahdonestoaineet, glykolit, sorbiit-20 ti ja sokeri, joita käytetään suspensoimisaineina.

Antibiootit tarjotaan kasvattajalle suspensiona tai kuivaseoksena vastaavan apuaineen kanssa, jotta kuivaseos voidaan laimentaa ennen käyttöä.

Antibiootit voidaan samoin lisätä märehtijän 25 juomaveteen. Tällöin lisätään vesiliukoista tai veteen suspensoituvaa antibiootti-muotoa juomaveteen vastaavan suuruisena määränä. Antibioottien valmistus juomaveteen sekoittamista varten noudattaa samoja periaatteita kuin juomien valmistus.

30 Tarkoituksenmukaisin tapa eläinten hoitamiseksi antibiooteilla on antibioottien annostelu yhdessä eläin-rehun kanssa. Tällöin voidaan käyttää mitä tahansa eläinrehuja, esim. tavanomaisia kuivarehuja, nestemäisiä rehuja ja tabletoitua rehua.

35 Menetelmät lääkeaineiden saattamiseksi eläinre- 10 74023 huun ovat hyvin tunnettuja. Tavallisesti valmistetaan lääke-rehua varten konsentroitu esiseos. Niinpä esim. tyypilliset lääkeaineita sisältävät rehuseokset voivat sisältää suunnilleen 0,1 - suunnilleen 25 g lääkeainet-5 ta tonnia esiseosta kohden. Tämä laaja alue johtuu val miin rehun halutusta, laajasta konsentraatioalueesta.

Esiseokset voivat olla sekä nestemäisessä että myös kiinteässä muodossa.

Märehtijän rehuvalmiste, joka sisältää tarkan 10 määrän antibiootteja tavanomaista hoitoa varten, tunnetaan erittäin hyvin. On välttämätöntä laskea se osuus yhdistettä, joka on tarkoitettu jokaisen yksittäisen eläimen annosteluun ja on otettava huomioon se osuus rehua/päivä, jonka eläin syö ja antibioottien konsent-15 raatio esiseoksessa ja sitten on laskettava antibioottien tai esiseoksen tarkka konsentraatio rehussa.

Kaikki menetelmät rehun valmistamiseksi, sekoittamiseksi ja tabletoimiseksi, jollaisia yleensä käytetään märehtijöiden rehun ollessa kyseessä, soveltuvat 20 antibioottisia yhdisteitä sisältävien rehujen valmistuk seen.

Kuten edellä osoitettiin, aiheuttaa antibioottien suun kautta tapahtuva annostelu edullisen muutoksen propionaatti/asetaatti-suhteessa pötsissä. Tämän vuok-25 si voidaan edellyttää, että sama hoito vaikuttaa samoin edullisesti yksivatsaisilla eläimillä, jotka saattavat kuitumaisen kasvismateriaalin käymistilaan umpisuolessa, sillä voidaan odottaa, että antibioottien suun kautta tapahtuneen annostelun jälkeen esiintyy edullinen muutos 30 propionaatti/asetaatti-suhteessa. Hevoset, siat ja kaniinit ovat esimerkkeinä eläimistä, jotka sulattavat osan ravinnostaan saattaakseen sen käymistilaan umpisuolessa.

> 11 7402 3

Haihtuvien rasvahappojen tuotannon määritys Pötsinesteen lähteenä käytetään nautaa, joka on kirurgisesti modifioitu muodostamalla avanne pötsiin.

Pötsin vahingoittumattomuus taataan pötsikanyylillä 5 (liitosputkella) (Bar Diamond Labs, Pharma, Idaho), joka avataan pötsinestenäytteiden ottoa varten. Eläintä ruokitaan 2 kertaa päivässä seoksella, joka sisältää 68% konsentraattia (AHRES-rehuannos =39) 20 %:iin viljaa. Pötsinestenäyte otetaan ennen aamuruokintaa. Pötsineste 10 seulotaan 4 kertaisen juustoliinan lävitse 1 gallonan

Nalgeneastiassa ja säilytetään hiilidioksidi-atmosfäärissä. 1000 ml seulottua pötsinestettä lisätään 2000 ml:aan jääkylmää puskuria, jonka on spesifioinut "Cheng et ai." "julkaisussa" J.Dair. Sei., 38, 1225 (1955). Tämän 15 puskuriaineen koostumus on seuraava:

Na2HP04 0,316 g/1 MgSC>4 0,112 KH2P04 0,152 CaCl2 0,038

NaHC03 2,260 FeS04.7H20 0,008 2Q NaCl 0,375 ZnS04.7H20 0,004 KC1 0,375 CUS04.5H20 0,002

Puskuroitua pötsinestettä pidetään 1 litran erotussuppilossa. Puskuroidun pötsinesteen anaerobisen 25 luonteen ja homogeenisuuden säilyttämiseksi, päästetään vakio-C02:ta nesteen läpi. Yksilöllisiin fermentaatioi-hin käytetään 125 ml:n Erlenmeyer-kolveja. Jokainen kolvi, johon on tarkoitus lisätä yhdistettä, sisältää 0,75 g hienoksi jauhettua 80 %:sta konsentraattia: 30 20 % Alfaalfa-heinää. Kolvit, joita käytetään lääkeai neista vapaisiin kontrolleihin, sisältävät 0,82 g hienoksi jauhettua perusrehuannosta. 0,6 ml estiyhdistet-tä liuotetaan sopivaan liuottimeen ja lisätään jokaiseen kolviin, minkä jälkeen annetaan laskeutua yön aikana.

35 Jokainen yhdiste tutkitaan loppukonsentraation ollessa 12 74023 50 ppm. Liuottimet, jotka eivät sisällä testiyhdistettä, lisätään lääkeaineista vapaisiin kontrollitermentaa-tiokolveihin. Momensiiniä 50 ppm:n pitoisuudessa käytetään positiivisena kontrollina.

5 60 g puskuroitua pötsinestettä lisätään jokaiseen testiyhdistettä sisältävään kolviin, ja 65,9 g lisätään kontrollikolveihin. Kolvit, joihin lisättiin kaikkia komponentteja, suljetaan yksitie- kaasuventtiilillä, joka mahdollistaa kaasun haihtumisen, joka syntyy käy-10 misen tuloksena. 6 ml:n näytteet otetaan kaikista kontrol- likolveista ("0-aika"-näytteet). Kolveja inkuboidaan 4 tunnin ajan ravistellaan (120 liikettä minuutissa).

Pötsineste kaadetaan 25 x 150 ml:n lasiputkiin ja annetaan seistä suunnilleen 15 minuutin ajan jäähau-15 teessä karkean materiaalin erottumiseksi. 2 ml:aan 25 %:sta (paino/tilavuus) metafosforihappoa (J.T.Baker) 13 ml:n pölykarbonaattisentrifugiputkessa (Autoclear, IEC) lisätään 6 ml pötsinestettä. Jokainen putki suljetaan ja sekoitetaan perusteellisesti. Putkien annetaan 20 seistä 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa ja sitten sentrifugoidaan 10 minuutin ajan kierrosluvun ollessa 16,000 "874 angle head" IEC B20-sentrifugissa. 1 ml sisäistä standardia (0,25 % 2-metyylivaleriaananhappo, Aldrich Chemical Company) lisätään sitten 4 ml:aan 25 ylintä osaa. Saatu seos suodatetaan käyttäen "Swinnex"-suodatinta ja 5 ml:n ruiskua 0,22 mikronin Milli pore-suodattimen läpi. Suodos suljetaan 1 ml:n lasiputkiin, joissa on puristettu kumimembraani.

Jokainen putki, joka edustaa kulloinkin yksilöl-30 listä fermentaatiota, analysoidaan kaasu-neste-kroma- grafiaa käyttäen haihtuvien rasvahappojen suhteen.

Jokainen putki analysoidaan injektoimalla kolme kertaa peräkkäin kolonneihin. Asetaatin, propionaatin, i-butyraatin, n-butyraatin, i-valeraatin ja n-valeraa-35 tin konsentraatiot lasketaan vertaamalla haihtuvien ras vahappojen standardi-liuoksen analyyseihin sisäistä 13 74023 standardointimenetelmää käyttäen.

Yhden yhdisteen aktiviteetti määritetään mittaamalla suhteelliset muutokset propionaatin (C3) ja ase-taatin (C2) ja n-butyraatin (C^) tuotannossa, s.o. haihtuvien rasvahappojen molaarisesta suhteesta.

Lisäys suhteessa (C^/Cj+C^), mikä saadaan jokaisella yhdisteellä kontrolliin verrattuna, ilmaistaan prosenttimääränä kasvusta, joka saadaan positiivisella kontrollilla. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa. Haihtuvien rasvahappojen molaarinen suhde saatu aikaan yhdisteiden käymisessä 50 pptn;n pitoisuudesta

Yhdiste Haihtuvien rasva- Kasvu kont- % monensii- happojen molaa- rolliin ver- nilla saadus-rinen suhde rattuna ta kasvusta Käsittelemätön kontrolli 0,356

Monensiini 0,549 0,193 100 X-14868A:n n-propyyli- eetteri 0,497 0,141 73,1 X-14868A:n etyylieetteri 0,541 0,185 95,9 X-14868A:n n-butyyli- eetteri 0,502 0,146 75,6 X-14868A:n etyyligly- kolieetteri 0,574 0,218 113,0 X-14868A:n n-heksyyli- eetteri 0,549 0,193 100,0 X-14868A:n n-pentyyli- eetteri 0,482 0,126 65,3 X-14868A:n butyleeni- glykolieetteri 0,174 99,4 14 74023

Eetterien happomuodon suoloja valmistetaan menetelmien mukaan, jotka tunnetaan parhaiten polyeetteriyh-disteiden valmistuksesta, esimerkiksi pesemällä vapaat hapot liuoksessa sopivalla emäksellä tai suolalla. Esi-5 merkkejä tällaisista farmaseuttisesti hyväksyttävistä emäksistä, jotka kykenevät esilläolevan keksinnön tarkoituksessa tuottamaan suoloja, ovat alkalimetalliemäkset, kuten natriumhydroksidi, kaliumhydroksidi, litiumhydroksi-di ja vastaavat; maa-alkalimetalliemäkset, kuten kalsium-10 hydroksidi, bariumhydroksidi ja vastaavat ja ammonium- hydroksidi. Alkalimetalli- tai maa-alkalimetallisuoloja, jotka soveltuvat sopivien farmaseuttisesti hyväksyttävien happoadditiosuolojen muodostukseen, ovat anionit, kuten karbonaatit, bikarbonaatit ja sulfaatit.

15 Esimerkkejä orgaanisista emäksistä, jotka muodos tavat polyeetteriyhdisteiden kanssa farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja, ovat alemmat alkyyliamiinit ja primääriset, sekundääriset ja tertiääriset hydroksi alempi alkyyliamiinit, kuten esim. etyyliamiini, isopropyy-20 liamiini, dietyyliamiini, metyyli-n-butyyliamiini, etano- liamiini ja dietanoliamiini.

Erityisen edullisenapidetty amiini on N-metyyliglu-kamiini. N-metyyliglukamiinin suolat ovat erityisen arvokkaita vesiliukoisuutensa johdosta, mikä tekee ne paren-25 teraaliseen käyttöön soveltuviksi.

Esillä olevan keksinnön mukaiset yhdisteet ovat tyypillisesti aktiivisia kohotettaessa rehun hyväksikäytön tehokkuutta, jos niitä annostellaan suun kautta märehtijöille annostuksen ollessa noin 0,003 mg/kg/päivää -30 noin 0,75 mg/kg/päivä. Parhaiten tyydyttäviä tuloksia saadaan annostuksen ollessa noin 0,03 mg/kg/päivä -noin 0,075 mg/kg/päivä.

15 74023

Esimerkki 1

Vapaana happona olevan antibiootti X-14868 etyylieetterin valmistus

Antibiootti X-14868A:n vapaa happo (1,2 g, 0,00128 5 moolia) liuotetaan absoluuttiseen etanoliin (40 ml), minkä jälkeen lisätään H+-muodossa olevaa ioninvaihto-hartsia AG 50W-X4:ää (200-400 mesh) (2,0 g varastoitu yön ajan etanolin alla, suodatettu ja ennen käyttöä pesty juuri valmistetulla etanolilla). Tätä seosta sekoi-10 tetaan 3 tunnin ajan huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen hartsi erotetaan ja pestään etanolilla. Yhdistetyt etano-lisuodokset konsentroidaan suunnilleen 10 ml:n tilavuuteen ja tätä liuosta pidetään yön ajan kylmässä (0r5°C). Suodattamalla saadaan haluttu tuote valkoisina 15 kiteinä, sulamispisteen ollessa 166-168°C.

Esimerkki 2

Vapaana happona olevan antibiootin X-14868A:n n-propyylieetterin valmistus_

Antibiootti X-14868A:n vapaa happo (6,2 g, 20 0,066 moolia) liuotetaan huoneen lämpötilassa 1-n-pro- panoliin (80 ml), ja lisätään H+-muodossa olevaa ionin-vaihtohartsia AG 50W-X4:ää (200-400 mesh) (6,0 g varastoitu yön ajan 1-propanolin alla, suodatettu ja ennen käyttöä pesty 1-propanolilla). Saatua seosta sekoitetaan joko 25 4 tunnin ajan huoneen lämpötilassa tai niin kauan kunnes ohutkerroskromatografia (eetteri, heksaani, metanoli, asetoni, NH^OH suhteessa: 7:3:0,5:1:0,02) osoittaa, että reaktio on päättynyt.

Hartsi suodatetaan ja pestään 1-propanolilla.

30 Yhdistetyt suodokset konsentroidaan ensiksi rotaatio- haihduttimessa ja sitten vesisuihkuvakuumissa ja haluttu tuote saadaan valkoisena vaahtona. Näytteellä, joka kiteytetään minimaalisen pienestä määrästä 1-propanolia, on sulamispisteenä 109-111° (hajoten).

is 74023

Esimerkki 3

Natriumsuolana olevan antibiootti X-14868A:n n-butyylieetterin valmistus_ 1 g antibiootit X-14868A:n natriumsuolaa liuote-5 taan huoneen lämpötilassa sekoittaen 20 ml:aan n-butyyli- alkoholia. Tähän liuokseen lisätään 5 g H+-muodossa olevaa AG50W-X4:ää (200-400 mesh), jota hartsia liuotettiin edeltäkäsin yön ajan n-butyylialkoholissa, sitten suodatettiin ja pestiin n-butyyli-alkoholilla. Reaktioseosta 10 sekoitettiin 4 tunnin ajan huoneen lämpötilassa.

Reaktioseos suodatetaan ja suodos konsentroidaan vakuumissa. Jäännös liuotetaan etyyliasetaattiin ja pestään natriumkarbonaattiliuoksella (huoneen lämpötilassa kyllästetty), sitten pestään vedellä ja kuivataan natrium-15 sulfaatilla. Suodattamisen ja konsentroinnin jälkeen jään nös kiteytetään asetonitriilistä lisäämällä vettä. Sulamispiste on 146-150°C.

Esimerkki 4

Natriumsuolana olevan antibiootti X-14868A:n 20 n-butyylieetterin valmistus_ 1 g antibiootti X-14868A:n natriumsuolaa liuotetaan sekoittaen huoneen lämpötilassa 20 mlraan n-butyy-lialkoholia. Tähän liuokseen lisätään 5 g H+-muodossa olevaa AG50W-X4:ää (200-400 mesh), jota hartsia liotet-25 tiin etukäteen yön ajan n-butyylialkoholissa, suodatet tiin ja pestiin n-butyylialkoholilla. Reaktioseosta sekoitetaan yön ajan huoneen lämpötilassa. Reaktioseos suodatetaan ja konsentroidaan vakuumissa. Jäännös liuotetaan metyleenikloridiin ja pestään natriumkarbonaatilla 30 (kyllästetty huoneen lämpötilassa) ja lopuksi pestään vedellä ja sitten kuivataan natriumsulfaatilla. Suodattamisen jälkeen liuos konsentroidaan ja kromatografioi-daan käyttäen 200 g, metyleenikloridilla preparoitua silikageelipylvästä, jolloin eluoidaan 1 litralla mety-35 leenikloridia, 3 litralla dietyylieetteri/heksaani/ase- 17 74023 töniä (7:3:1), ja sen jälkeen 2 litralla dietyylieet-teri/asetonia (7:3). Ne fraktiot, jotka sisältävät reaktiotuotetta, konsentroidaan ja kiteytetään asetonitriilis-tä lisäämällä vettä. Sulamispiste on 155°C.

5 Esimerkki 5

Natriumsuolana olevan antibiootti X-14868A:n n-amyylieetterin valmistus_

Natriumsuolana olevan antibiootti X-14868A:n n-amyylieetteriä valmistetaan vastaavasti kuten esimerkis-10 sä 3. kuvattiin, jolloin kuitenkin käytetään n-amyyli-alkoholia n-butyylialkoholin sijasta. Sulamispiste on 136-140°C.

Esimerkki 6

Natriumsuolana olevan antibiootti X-14868A:n 15 n-heksyylieetterin valmistus_

Natriumsuolana olevan antibiootti X-14868A:n n-heksyylieetteriä valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 3. kuvattiin, jolloin kuitenkin käytetään n-hek-syylialkoholia n-butyylialkoholin sijasta. Sulamis-20 piste 137-13 9°C.

Esimerkki 7

Natriumsuolana olevan antibiootti X-14868A:n etyleeniglykolieetterin valmistus_ 6 g natriumsuolaa X-14868A liuotetaan minimaali-25 sen pieneen tilavuusmäärään metyleenikloridi/asetonia.

Sen jälkeen kun on lisätty etyleeniglykolia (100 ml) ja 30 g H+-muodossa olevaa AG50W-X4 (200-400 mesh) hartsia (hartsia liotetaan etukäteen vyön ajan etyleeniglyko-lissa) sekoitetaan reaktioseosta yön ajan huoneen lämpö-30 tilassa. Reaktioseokseen lisätään vettä, hartsi suodatetaan ja suodos uutetaan kolme kertaa dietyylieetterillä. Eetterifaasit pestään vedellä, natriumkarbonaatilla, vedellä ja sitten jälleen vedellä ja kuivataan natriumsulfaa-tilla. Nestemäinen faasi poistetaan vakuumissa, ja jään-35 nös kiteytetään asetonitriilistä lisäämällä vettä. Sula- 18 74023 mispiste on 162-165°C.

Esimerkki 8

Kaliumsuolana olevan antibiootti X-14868A:n etyleeniglykolieetterin valmistus_ 5 Kaliumsuolana olevan antibiootti X-14868A:n etyleeniglysyylieetteriä valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 7 kuvattiin, kuitenkin käytetään natriumkarbonaatin sijasta kaliumhydroksidia ja reaktioseoksen eet-teripitoisten uutteiden kuivaaminen tapahtuu suodatta-10 maila celiitin läpi. Sulamispiste on 158-162°C.

Esimerkki 9

Natriumsuolana olevan antibiootti X-14868A:n 1,4-butyleeniglykolieetterin valmistus_

Natriumsuolana olevan antibiootti X-14868A:n 15 1,4-butyleeniglysyylieetteriä valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 7 kuvattiin, poikkeuksena ainoastaan, että käytettiin 1,4-butaanidiolia etyleeniglykolin sijasta. Tuote on valkoista (amorfista) vaahtoa ~ 22,7° klkroformissa, c = 1 %.

20 Esimerkki 10

Vapaana happona olevan antibiootti X-14868A:n 2-propanolieetteri_

Ionoforisen antibiootti X-14868A:n natriumsuola (1,1 g) liuotetaan 2-propanoliin (50 ml) huoneen lämpöti-25 lassa, minkä jälkeen lisätään H+-muodossa olevaa ionin- vaihtohartsia AG50W-X4:ää (200-400 mesh) (1,1 g varastoitu 2-propanolin alla, suodatettu ja pesty ennen käyttöä 2-propanolilla). Seosta sekoitetaan 24 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Hartsi suodatetaan ja pestään vasta valmis-30 tetulla isopropyylialkoholilla. Suodos suodatetaan en siksi rotaatiohaihduttimessa ja sitten vesisuihkupum-pussa ja saadaan valkoinen vaahto. Mikroanalyysi:

Laskettu C5qH86^17: C' ®2,61; H, 9,09 C, 62,73; H, 8,81.

19 74023

Esimerkki 11

Natriumsuolana olevan antibiootti X-14868A:n 1,3-propaanidioli (trimetyleeniglykoli) eetterin valmistus______ 5 5 g antibiootti X-14868A:n natriumsuolaa liuote taan 100 ml saan 1,3-propaanidiolia (trimetyleeniglyko-lia) sekoittaen huoneen lämpötilassa. Tähän liuokseen lisätään 20 g H+-muodossa olevaa AG502-X8 hartsia (200 -400 mesh), jolloin hartsia liotettiin etukäteen yön 10 ajan trimetyleeniglykolissa, suodatettiin ja pestiin tri- metyleeniglykolilla. Reaktioseosta sekoitetaan 3 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen kun on lisätty reaktioseokseen vettä, hartsi suodatetaan ja suodos uutetaan kaksi kertaa dietyylieetterillä. Yhdistetyt eetteri-15 faasit pestään vedellä, natriumkarbonaatilla ja jälleen vedellä ja kuivataan natriumsulfaatilla. Liuotinfaasi kromatografioidaan öljyksi ja kromatografioidaan mety-leenikloridilla preparoidulla silikageelipylväällä (200 g), jolloin eluoidaan 1 litralla dietyylieetteri/heksaania 20 (7:3) kahdella litralla dietyylieetteri/heksaani/aseto- nia (7:3:1) 1 litralla etyyliasetaatti/asetonia (8:2) ja sen jälkeen 1 litralla etyleeniasetaatti/asetonia (6:4).

Ne fraktiot, jotka sisältävät reaktiotuotetta, yhdistetään. Poistamalla liuotin vakuumissa saadaan valkoinen vaahto.

25 Mikroanalyysi: laskettu C50Hg5Na018.1/2H20 (1006,23) laskettu C 59,68, H 8,62, Na 2,29, H20 0,90. Löydetty C 59,91, H 8,76, Na 2,08 H20 1,02; 24,3° klorofor missa, c = 1 %.

Esimerkki 12 30 Natriumsuolana olevan antibiootti X-14868A:n (S) ja (R) 3-hydroksibutyylieetterin valmistus Natriumsuolana olevan antibiootti X-14868A:n (S) ja (R) 3-hydroksibutyylieetteriä valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 11 kuvattiin, kuitenkin käy-35 tetään 10 g natriumsuolaa X-14868A ja 1,3-butaanidiolia 20 7 4 0 2 3 trimetyleeniglykolin sijasta. Silikageelikromatografiän fraktioista 106-113 saadaan natriumsuolana olevan X-14868A:n (S) 3-hydroksibutyylieetterin valkoista vaahtoa. Mikroanalyysi: Laskettu C5iHg7Na0^g (1011,25) 5 laskettu C 60,58; H 8,67; Na 2,27.

löydetty: C 60,52; H 8,62; Na 2,29; (*28,3° kloroformissa, c = 1 %. Silikageeligromatografiän fraktioista 126-170 saadaan valkoista vaahtoa, nimittäin natrium-suolana olevan antibiootti X-14868A:n (R) 3-hydroksi-10 butyylieetteriä.

Mikroanalyysi: laskettu Cg^Hg-NaO^g (1011,25). laskettu Na 2,07; 25,9 kloroformissa, c = 1 %.

Natriumsuolana olevan antibiootti X-14868A:n (S) ja (R) 3-hydroksibutyylieetterin identtisyys vah-15 vistettiin käyttäen reaktioon 80 %:sesti puhdasta (S) ja (R)-l,3-butaanidiolia sekä vertailevaa ohutkerroskroma-tografiaa.

Esimerkki 13

Natriumsuolana olevan antibiootti X-14868A:n 20 5-hydroksipentyylieetterin valmistus_

Natriumsuolana olevan antibiootti X-14868A:n 5-hydroksipentyylieetteriä valmistetaan vastaavasti kuten esimerkissä 11 kuvattiin, kuitenkin käytetään 10 g antibiootin X-14868A natriumsuolaa ja 1,5-pentaanidiolia 25 trimetyleeniglykolin sijasta. Saadaan valkoinen vaahto, nimittäin natriumsuolana olevan antibiootin X-14868A:n 5-hydroksipentyylieetteri.

Mikroanalyysi: laskettu C^HggNaO^g (1025,27) laskettu C 60,92; H 8,75; Na 2,24,löydetty: C 60,78; 30 H 8,95; Na 2,14; 25,7° kloroformissa, c = 1 %.

21 74023

Esimerkki 14

Natriumsuolana olevan antibiootti X-14868A:n 1,2-propaanidiolieetterin valmistus_

Esimerkin 11 mukaisesti saadaan kuitenkin käyttä-5 mällä 1,2-propaanidiolia 1,3-propaanidiolin sijasta anti biootti X-14868A:n 1,2-propaanidiolieetteri.

Claims

74023

1 Me Me H u Me H v h H 4 C02H OR 15 jossa R on Cj-C^-alkyyli tai alempi hydroksialkyyli, tunnettu siitä, että yhdiste, jolla on kaava OMe A^OMe 20 l OMe QH Me i/ | Me Me Γοί0 ur0^rnho/i''’Me 0H H möH Me H Me H H H OH

25 C02H ^ saatetaan reagoimaan primäärisen tai sekundäärisen C^-C^-alkoholin kanssa tai difunktionaalisen C--C7-alkoholin kanssa H -muodossa olevan happamen ioninvaihtohartsin 30 läsnäollessa.

1. Menetelmä lääkeaineina käyttökelpoisten yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on kaava (I) 5 QMe A^^ÖMe Me PMe OMe f1 r<r"'",Me 10 I OH hYh° T)/? Jim Me (X)

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R on etyyli, n-propyyli, isopropyyli, n-bu-tyyli, n-pentyyli, n-heksyyli, 2-hydroksietyyli tai 4-hyd- 35 roksibutyyli tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n - 23 7 4 0 2 3 n e t t u siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa on 3- tai 2-hydroksipropyyli, (S)- tai (R)-3-hydroksibutyyli tai 5-hydroksipentyyli, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R on etyyli, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R on 2-hydroksietyyli, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mu- 15 kainen yhdiste, jossa R on n-heksyyli, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R on 4-hydroksibutyyli, tai sen 20 farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R on 3-hydroksipropyyli, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R on (S)-3-hydroksibutyyli, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R on (R)-3-hydroksibutyyli, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mu- 35 kainen yhdiste, jossa R on 2-hydroksipropyyli, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola. 24 74023