FI69098B - Foerfarande foer framstaellning av glukoson genom att oxidera glukos enzymatiskt - Google Patents

Description

1 69098

Menetelmä glukosonin valmistamiseksi hapettamalla glukoosia entsymaattisesti

Keksintö koskee uutta menetelmää glukosonin valmis-5 tamiseksi hapettamalla glukoosia entsymaattisesti glukoosi- 2-oksidaas.in avulla. Saatu glukosoni voidaan muuttaa puhtaus-asteeltaan ravinnoksi kelpaavaksi fruktoosiksi.

Kaupalliset menetelmät tärkeän makeutusaineen, fruktoosin, valmistamiseksi perustuvat yleensä kaksivaiheiseen 10 menetelmään: ensin hydrolysoidaan polysakkaridi, kuten tärkkelys, glukoosiksi, ja sitten isomeroidaan siten valmistettu glukoosi fruktoosiksi. Jälkimmäisessä vaiheessa, kuten on tunnettua, muodostuu glukoosin ja fruktoosin seos, josta fruktoosi on vaikeasti eristettävissä. Kaupallinen erotus-15 menetelmä sisältää kalliiden ja aikaavievien kiteytysmene-telmien käytön. Tarkempia kuvauksia eri menetelmistä glukoosin isomeroimiseksi löytyy kirjallisuudesta, esim. US-patent-tijulkaisut n:o 3 788 945 ja 3 616 221.

Glukoosi voidaan muuttaa fruktoosiksi myös entsyy-20 min, nimittäin glukoosi-2-oksidaasin, avulla, jolloin muodostuu glukoson.ia (D-arabino-2-heksosuloosia) , joka puolestaan voidaan pelkistää fruktoosiksi sinkillä ja etikkahapol-la ^Fol.ia Microbiol. 23 (1 978), ss. 292 - 298 ja CS-patentti-julkaisu n:o 175 897^.

25 Glukoosi-2-oks.idaasin reaktio glukoosin kanssa glu kosonin valmistamiseksi tuottaa myös ekvimolaarisen määrän vetyperoksidia. Siten muodostuneen vetyperoksidin käyttöä alkeenien muuttamiseen vastaaviksi halogeenihydriineiksi ja epoksideiksi on ehdotettu EP-hakemusjulkaisussa n:o 7 176; 30 julkaisun mukaan vetyperoksidi muodostetaan in situ lisäämällä glukoosi-2-oksidaasia ja glukoosia reaktioseokseen, joka sisältää halogenointientsyymiä ja epäorgaanista haloge-nidilähdettä, johon valittu aikeeni on tarkoitus liittää. EP-hakemusjulkaisusta ilmenee lisäksi, että glukoosin entsy-35 maattisen hapetuksen tuote, glukosoni, voidaan muuttaa fruktoosiksi yksinkertaisen kemiallisen hydrogenoinnin avulla.

2 69098

Mainitulla menetelmällä valmistettu fruktoosi voi. kuitenkin sisältää epäpuhtautena merkittäviä määriä sivutuotteita, jotka ovat peräisin sekä glukoosin entsymaatti-sesta muuttamisesta että alkeenin muutosreaktiosta. Erity.i-5 sesti jälkimmäinen reaktio tuottaa halogeenihydriinejä ja alkyleenioksideja, esimerkiksi etyleenioksidia, jotka ovat hyvin myrkyllisiä aineita jopa ppm-luokkaa olevina pitoisuuksina. Siten tällaisella menetelmällä valmistettu fruktoosi vaatii huolellisen ja kalliin puhdistuksen, jotta 10 päästäisiin ravinnoksi kelpaavaan puhtausasteeseen. Lisäksi mahdollisuus, että fruktoosi kontaminoituu sivureaktioiden vaikutuksesta alkuperäisen valmistusvaiheen aikana, on melko suuri hyvin reaktiokykyisten tuotteiden, halogeeni-hydriinien ja alkyleenioksidien takia ja tarvitaan melkoi-15 siä puhdistuskäsittelyjä ravintona käytettävältä fruktoosilta vaadittavan korkean puhtausasteen saavuttamiseksi.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että glukoosin entsymaattinen hapetus suoritetaan ensimmäisessä vyöhykkeessä, jolloin saadaan glukosonia, ja 20 samalla muodostuu vetyperoksidia, joka erotetaan ensimmäisestä vyöhykkeestä puoliläpäisevän kalvon avulla toiseen reaktiovyöhykkeeseen glukosonin jäädessä ensimmäiseen vyöhykkeeseen, ja annetaan alkeenin reagoida vetyperoksidin kanssa toisessa vyöhykkeessä alkeenin hapetustuotteiden 25 muodostamiseksi, mainitun kalvon läpäistessä vain yhdisteet, joiden molekyylipaino on pienempi kuin noin 100.

Keksinnön erään oleellisen sovellutuksen mukaisesti aikeeni muutetaan glykoliksi reaktiolla vetyperoksidin kanssa. Tätä reaktiota katalysoivat osmium, vanadiini tai 30 kromioksidi tai ultraviolettisäteily, viitteissä: J. A. C. S. 58 (1936), 1302 ; ja 59 (1937), ss. 543, 2342 ja 2345, kuvatun menetelmän mukaisesti.

Keksinnön toisen sovellutuksen mukaisesti aikeeni muutetaan halogeenihydriiniksi ja sitten alkuperäistä alkee-35 nia vastaavaksi alkyleenioksidiksi tai glykoliksi antamalla alkeenin reagoida vetyperoksidin, halogeno.intientsyymin ja 69098 halogenidilähteen kanssa, jolloin muodostuu halogeenihydrii-niä, joka sitten muutetaan epoksidiksi tai glykoliksi menetelmillä, joita kuvataan EP-hakemusjulkaisussa n:o 7 176.

Tässä menetelmässä käytettävien kalvojen tarkoituk-5 sena on muodostaa kaksi erillistä vyöhykettä ja mahdollistaa vetyperoksidin liikkuminen ensimmäisestä vyöhykkeestä toiseen. Kalvojen tulisi siksi olla huokoskooltaan sellaisia, että ne mahdollistavat vetyperoksidin siirtymisen selektiivisesti, mutta estävät ensimmäisessä vyöhykkeessä ole-10 vien suurempien molekyylien läpäisyn. Tällaisia kalvoja on kaupallisesti helposti saatavissa, ja voidaan määritellä kalvon läpi kulkevien liuenneiden partikkele.iden molekyyli-painon mukaan. Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä tulisi käyttää kalvoja, jotka läpäisevät aineet, joiden molekyy-15 lipaino on pienempi kuin noin 100, edullisesti pienempi kuin 50.

Vetyperoksidin siirtymisen mainitun kalvon läpi tekee mahdolliseksi se, että muodostuu tasapainotila, joka perustuu vetyperoksidin suhteellisiin pitoisuuksiin kalvon 20 kummallakin puolella. Kun vetyperoksidin pitoisuus ensimmäisessä vyöhykkeessä kasvaa, vetyperoksidia pyrkii siirtymään toiseen vyöhykkeeseen, kunnes tasapaino on palautunut. Reaktio alkeenin kanssa toisessa vyöhykkeessä suurentaa vetyperoksidin virtausnopeutta kalvon läpi toisen vyöhykkeen suun-25 taan tasapainon saavuttamiseksi.

Tämän menetelmän käytöllä on huomattavia etuja erityisesti muutettaessa glukoosi edelleen fruktoosiksi. Vetyperoksidin siirtyminen pois ensimmäisestä vyöhykkeestä tietenkin nopeuttaa glukoosin entsymaattista hapettumista 30 siten, että reaktio pyrkii tapahtumaan täydellisemmin, ja että reaktioajat voivat olla normaalisti vaadittavia lyhyempiä. Lisäksi ensimmäinen reaktiovyöhyke on miltei kokonaan vapaa kontaminoivista aineista, jotka kerääntyvät pääasiallisesti toiseen reaktiovyöhykkeeseen, jossa muodostunut ve-35 typeroksidi reagoi. Ensimmäisessä reaktiovyöhykkeessä muodostunutta glukosonia voidaan käyttää sellaisenaan hydroge-nointivaiheeseen, tai se voidaan väkevöidä tai käsitellä muu- 4 69098 ten halutulla tavalla. Glukosoniliuos on miltei vapaa muista kontaminaatioista kuin pienestä määrästä reagoimatonta glukoosia tai glukoosidimeeriä tai -trimeeriä ja alkuperäisen glukoosilähteen mukana mahdollisesti tulleista kontami-5 no.ivista aineista. Glukoosi-lähtöaine on yleensä glukoosi-yksiköltä sisältävän luonnontuotteen, tavallisimmin tärkkelyksen, hydrolysaatti, joka sisältää liukenevia kontaminoi-via aineita, kuten muita sokereita, esimerkiksi maltoosia, joita muodostuu tärkkelyksen hydrolyysissä.

10 Siten ensimmäisen vyöhykkeen reaktiotuotteen pelkis tyksessä saadaan tuote, fruktoosi, joka on suhteellisen puhdas kontaminoivista aineista, jotka vaikuttavat tuotteen puhtausasteeseen ravintona käytettäessä; kontaminoivat aineet ovat peräisin ainoastaan glukoosin luonnollisista läh-15 teistä, esimerkiksi tärkkelyksistä, kuten maissitärkkelyksestä.

Alkeenireaktiovyöhyke on myös puhtaampi kuin on saavutettavissa annettaessa molempien reaktioiden tapahtua samassa reaktorissa.

20 Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävät kal vot ovat mitä tahansa vesipitoisissa järjestelmissä tavallisesti käytettäviä kalvoja, ja niitä on olemassa laaja valikoima. Tavallisemmat kalvot muodostuvat nationista, styree-n.ipolymeeristä, tavallisesti polystyreenitefIonista tai sel-25 luloosaesteristä, kuten selluloosa-asetaatista tai -prcpio-naatista. Ensimmäisessä sovellutuksessa kalvo asennetaan reaktoriin siten, että muodostuu kaksi vyöhykettä, ja että kahden vyöhykkeen sisältöjen tahaton sekoittuminen estyy. Toisessa sovellutuksessa erilliset reaktorit voidaan liit-30 tää toisiinsa valitun kalvon avulla, joka muodostaa yhdistämisessä välttämättömän välipinnan. Jotta vetyperoksidi siirtyisi mahdollisimman hyvin ensimmäisestä vyöhykkeestä toiseen, ovat edullisia kalvot, joilla on merkittävä vapaa pinta-ala, mistä syystä ensimmäinen sovellutus on edullisem-35 pi.

5 69098

Glukoosi-2-oksidaasi voi olla entsyymiliuoksena vedessä sidpttuna entsyyminä tai sidottuina soluina tai huo-vastona tai vapaina soluina tai huovastona. Koska entsyymi on solunsisäinen, valitun mikro-organismin soluja tai huo-5 vastoa käytetään tavallisimmin yksinkertaisesti suspendoi-malla ne reaktioliuokseen. Entsyymien aktivaattoreita ja niiden suojaajia voi olla myös läsnä. Esimerkiksi, kuten on kuvattu edellä mainitussa viitteessä /Folia Microbiol. 23 (1978),ss. 292 - 2987, fluoridi-ionin läsnäolo edistää glu-10 koosin entsymaattista hapetusta O. mucida'n avulla. Entsyymien suojaajia, esimerkiksi Co-, Mn- ja Mg-suoloja, voidaan myös käyttää. Entsymaattisen hapetusreaktion annetaan tapahtua käytännöllisesti katsoen täydellisesti, mikä voidaan määrittää tutkimalla seoksen glukoosipitoisuus yhtä suuria 15 määriä käyttäen tai määrittämällä glukosoni kolorimetrises-ti tai määrittämällä vetyperoksidi. Tavallisesti reaktio-ajat 24 - 48 tuntia ovat riittäviä riippuen entsyymin voimakkuudesta tai aktiivisuudesta.

Monenlaisia mikro-organismeja voidaan käyttää tuot-20 tamaan tässä menetelmässä käytettävää glukoosi-2-oksidaasia. Kirjallisuudessa kuvataan esimerkiksi seuraavia tähän tarkoitukseen sopivia mikro-organismeja: 1) Aspergillus parasiticus /Biochem. J. 31 (1937), s. 1033).

25 2) Iridophycus flaccidum /Science 123 (1956), s.

17l).

3) Oudemansiella mucida /Folia Microbiol. 1 3 (1968), s. 334, ibid. 23 (1978), ss. 292 - 2987- 4) Gluconobacter roseus /J. Gen. Appi. Microbiol. 1 30 (1 955) , s. 152).

5) Polyporus obtusus /Biochem. Biophys. Acta 167 (1 968) , s. 5019.

6) Corticium caeruleum /Phytochemistry 16 (1977), ss. 1895 - 18977.

6 69098

Entsymaattisen hapetusreaktion lämpötila ei ole kriittinen. Reaktio voidaan suorittaa huoneen lämpötilassa tai jonkin verran korkeammassa lämpötilassa, käytettävän entsyymijärjestelmän lämmönkestävyyden ollessa kohtalainen.

5 On erityisen edullista käyttää lämmössä stabiileja entsyymijärjestelmiä 50°C:ssa tai lämpimämmässä, missä lämpötiloissa reaktioseoksen bakteerikontaminaatiot ovat mahdollisimman pieniä. Entsymaattinen reaktioseos voi vaihtoehtoisesti sisältää antibakteerisiä aineita ylimääräisen baktee-10 rikasvun estämiseksi.

Ensimmäinen reaktiovyöhyke ei saisi tietenkään sisältää merkittäviä määriä vetyperoksidia pelkistävää ainetta, jotta päästäisiin tämän menetelmän mukaisiin edullisiin tuloksiin. Siten järjestelmän tulisi olla miltei vapaa ve-15 typeroksidia pelkistävistä aineista, so. ei-pelkistävä systeemi .

Tämän prosessin aikana on mahdollista, että jonkin verran ainetta diffundoituu toisesta reaktiovyöhykkeestä ensimmäiseen, erityisesti kun toinen reaktiovyöhyke sisäl-20 tää anioneja, kationeja tai pienimolekyylisiä yhdisteitä, mutta tällainen diffuusio ei ole merkittävää näissä olosuhteissa.

Glukosonin pelkistys fruktoosiksi suoritetaan tunnetuilla menetelmillä, joihin kuuluu kemiallinen pelkistys 25 esimerkiksi sinkin ja etikkahapon avulla sekä katalyyttinen hydrogenointi tavanomaisten metall.ikatalysaattorien avulla. Näistä on edullinen metallikatalysaattori Raney-nikkeli, koska sen käyttö soveltuu vaadittaessa fruktoosilta ravinto-käyttöön riittävää puhtausastetta. Yleensä glukosoni hydra-30 taan korotetussa paineessa ja korotetussa lämpötilassa metallikatalysaattor in läsnäollessa, kunnes on saavutettu haluttu hydrogenoitumisaste. Paine voi olla 100 - 700 atm tai jopa suurempi, ja lämpötila on enintään noin 200°C. Edullisesti lämpötila on 100 - 150°C ja paine noin 500 atm.

is 69098

Seuraava esimerkki valaisee keksintöä.

Esimerkki O. mudica-huovastoa kasvatetaan CS-patenttijulkaisun n:o 175 897 esimerkin 1 mukaisesti ja 15 g (kuivapai-5 no) huovastoa suspendoidaan 10 litran reaktorin, joka on jaettu vetyperoksidia läpäisevällä kalvolla kahteen vyöhykkeeseen, toisessa vyöhykkeessä olevaan 3 litraan 2,5-% glu-koosiliuosta, jossa on 0,05 moolia natriumfluoridia. Toisessa vyöhykkeessä, johon johdetaan etyleenikaasua, on kloo-10 riperoksidaasin ja halogenidi-ionin vesiliuos, joka on puskuroitu fosfaattipuskurilla (0,1-m kaliumfosfaatti), kuten on kuvattu EP-hakemusjulkaisussa n:o 7 176 (esimerkit 1 - 18) .

Ensimmäisessä vyöhykkeessä olevaa suspensiota se-15 koitetaan 25°C:ssa ja siihen johdetaan happea. 24 tunnin kuluttua huovasto erotetaan ensimmäisessä vyöhykkeessä olevasta liuoksesta ja saatu kirkas liuos hydrataan vedyllä Raney-nikkelin läsnäollessa 500 atm:n paineessa 100°C:ssa. Reaktioseos suodatetaan katalysaattorin poistamiseksi, suo-20 doksen väri poistetaan hiilen avulla, deionisoidaan ionin-vaihtajien avulla (an.ioninen ja kation.inen) ja väkevöidään fruktoosisiirapiksi alipaineessa. Vaihtoehtoisesti vesiliuos väkevöidään ja fruktoosin annetaan kiteytyä.

Fruktoosi, joka saadaan siirappina tai kiteisenä 25 tuotteena, on puhtausasteeltaan ravinnoksi sopivaa.

Halogeenihydriinit, jotka saadaan toisessa vyöhykkeessä tapahtuvassa reaktiossa, muutetaan vastaaviksi epok-sideiksi käsittelemällä natriumhydroksidilla.

Olennaisilta osiltaan samanlaisia tuloksia saadaan, 30 kun O. mucida korvataan seuraavilla mikro-organismeilla: Polyporus obtusus Radulum casear.ium Lenz.ites trabea Irpex flanus 35 Polyporus versicolor

Pell.icularia filamentosa Armi11aria mellea Schizophyleum commune Corticium caeruleum

Claims (6)

69098

1. Menetelmä glukosonin valmistamiseksi hapettamalla glukoosia entsymaattisesti glukoosi-2-oksidaasin 5 avulla, tunnettu siitä, että glukoosin entsymaat-tinen hapetus suoritetaan ensimmäisessä vyöhykkeessä, jolloin saadaan glukosonia, ja samalla muodostuu vetyperoksidia, joka erotetaan ensimmäisestä vyöhykkeestä puoliläpäisevän kalvon avulla toiseen reaktiovyöhykkeeseen glukosonin jäa- 10 dessä ensimmäiseen vyöhykkeeseen, ja annetaan alkeenin reagoida vetyperoksidin kanssa toisessa vyöhykkeessä alkeenin hapetustuotteiden muodostamiseksi, mainitun kalvon läpäistessä vain yhdisteet, joiden molekyylipa!no on pienempi kuin noin 100.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että alkeenin ja vetyperoksidin reaktiotuote on glykoli.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että alkeenin ja vetyperoksidin 20 reaktiotuote on vastaava alkyleenihalogeenihydriini.

4. Menetelmä patenttivaatimusten 1-3 mukaisellci menetelmällä saadun tuotteen edelleenkäsittelemiseksi, tunnettu siitä, että se pelkistetään fruktoosiksi.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että pelkistys suoritetaan kata-lyyttisesti hydrogenoimalla.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että katalysaattori on Raney-nikkeli.