FI69097C - Foerfarande foer framstaellning av glukoson genom att oxidera glukos enzymatiskt - Google Patents

Description

69097

Menetelmä glukoson.in valmistamiseksi hapettamalla glukoosia entsymaattisesti Tämä keksintö koskee uutta menetelmää glukoson.in 5 valmistamiseksi hapettamalla glukoosia entsymaattisesti glu-koosi-2-oksidaasin avulla. Saatu glukosoni voidaan muuttaa ravinnoksi kelpaavaksi fruktoosiksi.

Kaupalliset menetelmät tärkeän makeutusaineen, fruktoosin, valmistamiseksi perustuvat kaksivaiheiseen menetel-10 mään: ensin hydrolysoidaan polysakkaridi, kuten tärkkelys, glukoosiksi, ja näin valmistettu glukoosi isomeroidaan fruktoosiksi. Muodostuneesta glukoosin ja fruktoosin seoksesta erotetaan fruktoosi; viimeksimainittu erotus on vaikea suorittaa. Kaupallisiin menetelmiin sisältyy kalliiden ja ai-15 kaav.ievien kiteytysmenetelm.ien käyttö. Tarkempia kuvauksia erilaisista glukoosin isomerointimenetelmistä löytyy kirjallisuudesta, esim. US-patenteista n:o 3 788 945 ja 3616 221.

Glukoosi voidaan muuttaa fruktoosiksi myös entsyy-20 min, nimittäin, glukoos.i-2-oksidaasin, avulla, jolloin muodostuu glukosonia (D-arabino-2-heksosuloosi), joka vuorostaan voidaan pelkistää fruktoosiksi sinkillä ja etikkahapol-la ^Folia Microbiol. 23 (1978), ss. 292 - 298 ja CS-patent-ti n:o 175 8977.

25 Glukoosi-2-oksidaasin reagoidessa glukoosin kanssa muodostuu glukosonin lisäksi ekvivalenttinen moolimäärä vetyperoksidia. Näin muodostuneen vetyperoksidin käyttämistä alkeenien muuttamiseksi vastaaviksi halogeenihydriineiksi ja epoksideiksi on ehdotettu EP-patenttihakemuksessa n:o 30 7 176; hakemuksen mukaan vetyperoksidi muodostetaan in situ lisäämällä glukoosi-2-oksidaasia ja glukoosia reaktioseok-seen, joka sisältää halogenointientsyymiä ja epäorgaanisen halogenidin lähdettä, johon valittu aikeeni on tarkoitus liittää. EP-patenttihakemuksesta ilmenee lisäksi, että glu-35 koosin entsymaattisen hapetuksen tuote, glukosoni, voidaan muuttaa fruktoosiksi yksinkertaisen kemiallisen hydrauksen avulla.

69097

Mainitulla menetelmällä valmistettu fruktoosi voi kuitenkin sisältää epäpuhtautena merkittäviä määriä sivutuotteita, jotka ovat peräisin sekä glukoosin entsymaatti-sesta konversiosta että alkeenin muutosreaktiosta. Erityi-5 sesti jälkimmäisessä reaktiossa syntyy halogeenihydriinejä ja alkyleenioksideja, esim. etyleenioksidia, jotka ovat erittäin myrkyllisiä aineita jopa miljoonasosapitoisuuksi-na. Siten mainitulla menetelmällä valmistettu fruktoosi vaatii ravinnoksi kelpaavaa luokkaa olevan puhtauden saavut-10 tamiseksi huolellisen ja kalliin puhdistuksen. Lisäksi fruktoosin kontaminoitumisen mahdollisuus prosessin alkuvaiheessa sivureaktioiden seurauksena on melko suuri hyvin reaktiokyky! s ten tuotteiden, halogeenihydriinien ja alkyleeni-oksidien takia, ja tarvitaan lisäpuhdistuskäsittelyjä ra-15 vintona käytettävän fruktoosin korkean puhtausasteen saavuttamiseksi .

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että glukoosin entsymaattinen hapetus suoritetaan ensimmäisessä vyöhykkeessä, jolloin saadaan glukosonia ja sa-20 manaikaisesti muodostuu vetyperoksidia, ja vetyperoksidi erotetaan mainitusta ensimmäisestä vyöhykkeestä puoliläpäisevän kalvon läpi toiseen vyöhykkeeseen, glukosonin jäädessä ensimmäiseen vyöhykkeeseen, mainitun kalvon läpäistessä vain yhdisteet, joiden molekyylipaino on pienempi kuin noin 25 100.

Keksinnön erään oleellisen sovellutuksen mukaisesti toinen reaktiovyöhyke sisältää vetyperoksidia pelkistävää ainetta, joka siirtyy puoliläpäisevän kalvon läpi. Pelkistävän aineen läsnäolo toisessa vyöhykkeessä nopeuttaa 30 vetyperoksidin siirtymistä ensimmäisestä vyöhykkeestä toiseen vyöhykkeeseen. Tähän sovellutukseen käytettävät pelkistimet ovat alan asiantuntijain hyvin tuntemia ja niitä ovat erilaiset systeemit, kuten orgaaniset pelkistimet, epäorgaaniset pelkistimet ja entsyymit. Sopivia pelkistimiä ovat 35 esimerkiksi aldehydit, jotka hapettuvat helposti vastaaviksi karboksyylihapoiksi, ja oksalaatti-, sulfiitti-, fosfi.it-ti- ja jodid.i-ionit, sekä erilaiset kationit, kuten siirty- 3 69097 mämetallien (Fe, Co, Ni, Cr ja näiden kaltaisten) kompleksi-ionit. Pelkistäviä entsyymejä ovat mm. katalaasi ja peroksi-daasi. Katalaasia saadaan hiivasta, munista ja verestä, kun taas peroksidaasia saadaan esimerkiksi piparjuuresta.

5 Toisessa vyöhykkeessä olevan pelkist.imen määrällä ei ole ratkaisevaa merkitystä, mutta suositeltavaa on käyttää sitä määrin, joka merkittävästi alentaa ensimmäisessä reaktiovyöhykkeessä muodostuneen vetyperoksidin määrää. Täten stökiömetriset määrät pelkist.intä varmistavat vetyper-10 oksidin täydellisemmän poistumisen ensimmäisestä reaktiovyö-hykkeestä ja stökiömetris.iä määriä suurempienkin määrien käytöllä on käytännöllistä merkitystä erityisesti tapauksissa, jolloin valittu pelkistin on helposti saatavissa ja taloudellista.

15 Stökiömetris.iä määriä pienemmänkin pelkist.inmäärän käyttö sisältyy esillä olevaan keksintöön, mutta se on tehottomampaa .

Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävien kalvojen tarkoituksena on erillisen vyöhykkeen muodostami-20 nen ja vetyperoksidin siirtymisen mahdollistaminen ensimmäisestä vyöhykkeestä toiseen. Kalvojen huokoskoon tulisi siksi olla sellainen, että se mahdollistaa vetyperoksidin siirtymisen selektiivisesti, estäen kuitenkin suurempien molekyylien läpikulun. Sellaisia kalvoja on kaupallisesti hel-25 posti saatavissa ja ne määritellään kalvon läpäisevien par- tikkeleiden molekyylipainon mukaan. Tämän keksinnön yhteydessä tulisi käyttää kalvoja, jotka läpäisevät aineet, joiden molekyylipaino on pienempi kuin noin 100, edullisesti pienempi kuin 50.

30 Vetyperoksidin siirtymisen edellä mainitun kalvon läpi tekee mahdolliseksi se, että muodostuu tasapainotila, joka perustuu vetyperoksidin suhteellisiin konsentraatioihin kalvon kummallakin puolella. Vetyperoksidin konsentraation kasvaessa ensimmäisessä vyöhykkeessä, vetyperoksidia pyrkii 35 siirtymään toiseen vyöhykkeeseen, kunnes tasapaino on palautunut. Pelkist.imen lisääminen toiseen vyöhykkeeseen lisää 4 69097 vetyperoksidin virtausnopeutta kalvon läpi siirtäen tasapainotilaa toisen vyöhykkeen suuntaan, josta syystä pelkis-timen käyttöä pidetään yleensä edullisena.

Tämän keksinnön mukaisen menetelmän avulla saavute-5 taan merkittäviä etuja erityisesti jatkokäsittelyn osalta glukosonin muuttamiseksi fruktoosiksi. Vetyperoksidin siirtyminen ensimmäisestä reaktiovyöhykkeestä vaikuttaa glukoosin entsymaattisen hapettumisen nopeuteen siten, että reaktio pyrkii tapahtumaan täydellisemmin ja reaktioajat voivat 10 olla lyhyempiä kuin normaalisti edellytetään. Lisäksi ensimmäinen reaktiovyöhyke on miltei kokonaan vapaa kontaminoi-vista aineista, joita kertyy pääasiallisesti toiseen reak-tiovyöhykkeeseen, jossa muodostunut vetyperoksidi reagoi. Ensimmäisessä reaktiovyöhykkeessä muodostettua glukosoni-15 liuosta voidaan käyttää sellaisenaan hydrausvaiheessa tai se voidaan haluttaessa väkevöidä tai jatkokäsitellä muulla tavoin. Glukosoniliuos sisältää korkeintaan pieniä määriä reagoimatonta glukoosia tai glukoosi-dimeeriä tai -trimeeriä, edellyttäen tietenkin, että lähtöaineliuos on puhdasta. Glu-20 koosi-lähtöaine on tavallisesti glukoosiyksiöitä sisältävän luonnontuotteen, yleisimmin tärkkelyksen, hydrolysaatti, joka sisältää liukoisia epäpuhtauksia, kuten muita hiilihydraatteja, esim. maltoosia, jota muodostuu tärkkelyksen hyd-rolyysissä, jotka epäpuhtaudet eivät ole haitallisia. Näin 25 ollen ensimmäisen vyöhykkeen reaktiotuotteen pelkistyksessä saadaan tuote, fruktoosi, joka on verraten vapaa tuotteen ra-vintokelpoisuuteen vaikuttavista epäpuhtauksista.

Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävät kalvot ovat mitä tahansa yleisesti vesipitoisissa järjestel-30 missä käytettäviä kalvoja. Tavallisimmin kalvot ovat polyamidia , styreenipolymeeriä, polystyreeni/polytetrafluorietee- n.iä tai selluloosaesteriä (kuten selluloosa-asetaattia tai -propionaattia). Ensimmäisessä sovellutuksessa kalvo asennetaan reaktoriin kahden vyöhykkeen saamiseksi siten, että 35 näiden kahden vyöhykkeen sisältämien aineiden tahaton sekoittuminen estyy. Toisessa sovellutuksessa erilliset reaktorit voidaan liittää valitun kalvon avulla, joka muodostaa liitos- 5 69097 kohtaan välttämättömän välipinnan. Vetyperoksidin siirtymisen ensimmäisestä vyöhykkeestä toiseen vyöhykkeeseen saamiseksi mahdollisimman suureksi ovat edullisia kalvot, joissa vapaa pinta-ala on huomattavan suuri, josta syystä ensim-5 mäinen sovellutus on edullisempi.

Glukoosi-2-oksidaasi-entsyymi voi olla entsyymin vesiliuoksena, immobilisoituna entsyymiä tai immobilisoitui-na soluina tai huovastona tai vapaina soluina tai huovasto-na. Koska entsyymi on solunsisäinen, valitun mikro-organis-10 min soluja tai huovastoa käytetään tavallisimmin vain sus-pendoimalla ne reaktioliuokseen. Läsnä voi olla myös entsyymin aktivaattoreita ja suojaajia. Esimerkiksi, kuten on kuvattu edellä mainitussa artikkelissa /Folia Microbiol. 23, s* (1978), ss. 292 - 2987, fluoridi-ionin läsnäolo edistää glu-15 koosin entsymaattista hapettumista 0. mucida'n avulla. Entsyymien suojaajiakin, esim. Co-, Mn- ja Mg-suoloja, voidaan käyttää.

Entsymaattisen hapetusreaktion annetaan tapahtua käytännöllisesti katsoen loppuun, mikä voidaan määrittää 20 tarkkailemalla seosta ottamalla näytteitä glukoosipitoisuu-den määrittämiseksi tai suorittamalla kolorimetrinen gluko-sonin määritys tai määrittämällä vetyperoksidi. Reaktioaika on tavallisesti noin 24 - 48 tuntia.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävän glu-25 koosi-2-oksidaasin tuottamiseen voidaan käyttää hyvin monenlaisia mikro-organismeja. Kirjallisuudessa on mainittu tähän tarkoitukseen käytetyn mm. seuraavia organismeja: 1) Aspergillus parasiticus /Biochem. J. 31 (1937), s. 10337· 30 2) Iridophycus flaccidum /Science 124 (1956), s.

171>.

3) Oudemansiella mucida /Folia Microbiol. 13 (1968), s. 334; ja sama julkaisu 23 (1978), ss. 292 - 2987· 4) Gluconobacter roseus /J. Gen. Appi. Microbiol. 1 35 (1955), s. 152?.

5) Polyporus obtusus 7Bi°chern* Biophys. Acta 167 (1968), s. 5017.

6) Corticium caeruleum /Phytochemistry 1977 Voi. 16, ss. 1895 - 18977· 69097 Lämpötilalla ei ole ratkaisevaa merkitystä entsy-maattiseen hapetusreaktioon. Reaktio voidaan suorittaa huoneen lämpötilassa tai hieman korkeammassa lämpötilassa, käytettävän entsyymisysteemin ollessa kohtuullisen lämpöstabii-5 li. Erityisesti on suositeltavaa, käytettäessä lämpöstabii-leja entsyymisysteemejä, että reaktio suoritetaan 50°C:ssa ja sitä korkeammassa lämpötilassa, jolla alueella reaktio-seoksen bakteerikontam.inaatiot saadaan minimoiduksi. Vaihtoehtoisesti entsymaattisessa reaktioseoksessa voi olla anti-10 bakteerisia aineita runsaan bakteerikasvun estämiseksi.

Ensimmäisessä reaktiovyöhykkeessä ei luonnollisesti saa olla merkittäviä määriä vetyperoksidin pelkistintä, jotta päästäisiin tämän menetelmän mukaisiin edullisiin tuloksiin. Täten systeemin on oltava pääasiallisesti vapaa vety-15 peroksidia pelkistävistä aineista, so. pelk.istämätön systeemi .

Tämän valmistusmenetelmän yhteydessä on mahdollista, että jonkin verran ainetta diffundoituu toisesta reaktiovyö-hykkeestä ensimmäiseen vyöhykkeeseen, erityisesti jos toises-20 sa vyöhykkeessä on läsnä anioneja, kationeja tai muita pienimolekyylisiä yhdisteitä. Sen vuoksi on tavallisesti suositeltavaa käyttää pelkistimiä, jotka joko eivät diffundoidu, esim. peroksidaasi- ja katalaasientsyymejä, erityisesti im-mobilisoidussa muodossa, tai jotka hapettuessaan muodostavat 25 elintarvikkeina hyväksyttäviä tuotteita, esim. ferri- tai sulfaatt.iyhdisteitä, joita muodostuu vetyperoksidin hapettaessa ferro- ja sulf iitt.i-ione ja. Tämän suositeltavan menetelmän avulla saadaan riittävästi estetyksi ensimmäisen reaktio-vyöhykkeen ei-toivottava kontaminoituminen.

30 Erityisen edullisen menetelmän mukaan erottuneen ve typeroksidin annetaan reagoida hiivan, kokomaidon tai munien kanssa pastöroitumisen aikaansaamiseksi huoneen lämpötilassa, jolloin ilmeisenä etuna on mahdollisuus välttää pastöroinnissa tavallisesti käytettävän normaalia korkeamman läm-35 pötilan käyttöä. Täten hiiva, maito ja munat voivat kukin toimia pelkistimenä toisessa vaiheessa.

n 69097

Glukosonin pelkistys fruktoosiksi suoritetaan tunnetuilla menetelmillä, joihin sisältyy kemiallinen pelkistys, kuten esimerkiksi sinkillä ja et.ikkahapolla, samoin kuin katalyyttinen hydraus tavanomaisilla metallikatalyy-5 teillä. Näistä edullinen metallikatalyytti on Raney-nikkeli, koska se soveltuu käytettäväksi valmistettaessa rav.intokäyt-töön soveltuvaa fruktoosia. Yleensä glukosoni hydrataan korotetussa paineessa ja korotetussa lämpötilassa metallika-talysaattorin läsnäollessa, kunnes haluttu hydrautumisaste 10 on saavutettu. Paine voi olla välillä 100 - 700 atm ja suurempikin, ja lämpötila on enintään noin 200°C. Edullisesti o lämpötila on 100 -150 C ja paine noin 500 atm.

Seuraava esimerkki valaisee keksintöä.

Esimerkki 15 O. mudica-huovastoa kasvatetaan CS-patentin n:o 175 897 esimerkin 1 mukaisesti ja 15 g:aa vastaava (kuiva-paino) määrä huovastoa suspendoidaan 10 litran reaktoriin, joka on jaettu vetyperoksidin läpäisevällä kalvolla siten, että muodostuu kaksi vyöhykettä. Toisessa vyöhykkeessä on 20 3 litraa 2,5-% glukoosiliuosta, jossa on 0,05 moolia natrium- fluor.idia, ja toisessa on DEAE-selluloosan avulla (Cellex-D, valmistaja Bio-Rad Laboratories) immobilisoitua katalaasi-entsyym.iä suspendoituna 3 litraan vettä.

Ensimmäisen vyöhykkeen suspensiota sekoitetaan 25 25°C:ssa ja siihen johdetaan happea; myös toista vyöhykettä sekoitetaan. 24 tunnin kuluttua huovasto erotetaan ensimmäisen vyöhykkeen liuoksesta ja saatua kirkasta liuosta hydrataan sitten vedyllä Raney-nikkelin läsnäollessa 500 atm:n paineessa 100°C:ssa. Reaktioseos suodatetaan katalysaatto-30 rin poistamiseksi, suodos tehdään värittömäksi hiilellä, de-.ion.isoidaan ioninvaihtajän avulla (anioninen ja kationinen) ja väkevöidään fruktoosisi!rapiksi alipaineessa. Vaihtoehtoisesti vesiliuos väkevöidään ja fruktoosin annetaan kiteytyä.

35 Saatu fruktoosi, joko siirappimainen tai kiteinen tuote, on puhtausasteeltaan ravinnoksi sopivaa.

Tässä esimerkissä käytetty kalvo läpäisee molekyylit, joiden molekyylipaino on pienempi kuin 50.

8 69097

Oleellisesti samat tulokset saavutetaan korvattaessa O. mucida seuraavilla organismeilla:

Polyporus obtusus Radulum casearium 5 Lenzites trabea

Irpex flanus Polyporus versicolor Pellicularia filamentosa Armillaria mellea 10 Sch.izophyleum commune

Cort.icium caeruleum.

tt

Claims (10)

69097

1. Menetelmä glukosonin valmistamiseksi hapettamalla glukoosia entsymaattisesti glukoosi-2-oksidaasin avulla, 5 tunnettu siitä, että glukoosin entsymaattinen hapetus suoritetaan ensimmäisessä vyöhykkeessä, jolloin saadaan glukosonia ja samanaikaisesti muodostuu vetyperoksidia, ja vetyperoksidi erotetaan mainitusta ensimmäisestä vyöhykkeestä puoliläpäisevän kalvon läpi toiseen vyöhykkeeseen, glu- 10 kosonin jäädessä ensimmäiseen vyöhykkeeseen, mainitun kalvon läpäistessä vain yhdisteet, joiden molekyylipaino on pienempi kuin noin 100.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toisessa vyöhykkeessä on vetyperok- 15 sidia pelkistävää ainetta.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pelkistävä aine on entsyymi.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymi on peroksidaasi tai 20 katalaasi.

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pelkistävä aine on anioni tai kationi.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että mainittu anioni on sulfiitti-ioni.

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu kationi on ferroioni.

8. Menetelmä patenttivaatimusten 1-7 mukaisella 30 menetelmällä saadun tuotteen edelleenkäsittelemiseksi, tunnettu siitä, että se pelkistetään fruktoosiksi.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pelkistys suoritetaan hyd-raamalla katalyyttisesti.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että katalyytti on Raney-nikkeli.