FI64162C - Foerfarande foer framstaellning av antibakteriellt och som beta-laktamasinhibitorer verksamma etrar av klavulansyra - Google Patents

Description

Κ55^Ϊ1 ΓβΙ KUULUTUSJULKAISU

^ ( 1) UTLÄGGNINGSSKRIFT 64162 (51) K».lk?/lnt.CL3 c 07 D 498/04 SUOMI —FINLAND (M) PkMnttlhukumu· — Ι*ΜΜΜ·βΙα*»ι 762908 (22) Hikumtapilv·—AntBkninfadag 12.10.76 (23) Alkupllvi—GlMglwtadag 12.10.76 (41) Tullut lulkbufcsl — BltvK affwicllg iU. 0U. 77 PMMtti- j* rekirterihallltu. NihtivikXp**» kuuLJutk..**, pvm.-

Patent- och r*gister*tyrels*n ' 7 AmMcm uthgd och utijkriftm pubik^nd 30.06.83 (32)(33)(31) Pyydetty «cuolkaus—Buglrd priorkuc 13.10.75 23.Ol.76, O8.O5.76 Iso-Britannia-Stor-britannien(GB) äl897/75, 02629/76, I9OOO/76 Toteennäytetty-Styrkt (71) Beecham Group Limited, Beecham House, Great West Road, Brentford, Middlesex, Iso-Britannia-Storbritannien(GB) (72) Roger John Ponsford, Dorking, Surrey, Thomas Trefor Hovartn,

Ewhurst, Surrey, Iso-Britannia-Storbritannien(GB) (7U) Berggren Oy Ab (5I+) Menetelmä bakteereja tappavasti ja ^-laktamaasi—inhioiittoreina vaikuttavien klavulaanihapon eettereiden valmistamiseksi — Förfarande för framställning av antibakteriellt och som ^-laktamas-inhibitorer verksamma etrar av klavulansyra Tämä keksintö koskee menetelmää bakteereja tappavasti ja 3-laktamaasi-inhibiittoreina vaikuttavien klavulaanihapon eettereiden valmistamiseksi.

Belgialaisessa patentissa n:o 827 926 paljastetaan muun muassa klavulaanihappo ja sen suoloja ja estereitä, jolla klavulaanihapolla on kaava (I): p ck2oh Π W (i.

o \ co2h

Klavulaanihappo ja sen suolat ja esterit kykenevät inhibi-toimaan useista bakteereista peräisin olevia 3-laktamaaseja ja tästä hyödyllisestä ominaisuudesta johtuen kykenevät parantamaan penisilliinien ja kefalosporiinien tehokkuutta monia gram-positiivisia ja gram-negatiivisia bakteereja vastaan. Nyt on havaittu, että tietyillä klavulaanihapon johdannaisilla on myös hyödyllistä bakteereja tappavaa ja 3-laktamaasia inhibitoivaa aktiivisuutta.

2 641 62 Näin ollen tämä keksintö tarjoaa käytettäväksi bakteereja tappavasta ja β-laktamaasi-inhibiittoreina vaikuttavia klavulaanihapon eettereitä tai niiden alkali- tai maa-alkalimetallisuoloja, joilla yhdisteillä on kaava II:

H

O CH^-O-R

rT w

V

co2H

jossa R on enintään 18 hiiliatomia sisältävä alkyyli; C^_4~alkenyyli; bentsyyli, jonka 4-asemassa voi olla substituenttina halogeeni, nitro, C-^_<j-a Lkyyli tai C^_4~alkoksi ; syano-C^_4~alkyyli; C^_4~alkoksi-karbonyyli-C1_4-alkyyli; karboksi-C^_4~alkyyli tai sen suola; ase-tonyyli ; hydroksi-C^_4~alkyyli ; di-C^^-alkyylianino-Cj^-alkyyli tai enintään 8 hiiliatomia sisältävä hiilivetyryhmä, jossa on substituenttina ryhmä OR^, jossa R^ on C^_4-alkyyli.

Kaavan II mukaisten yhdisteiden sopivia suoloja ovat alkalisuolat, kuten litium-, natrium- ja kaliumsuolat, ja maa-alkalimetallisuolat, kuten kalsiumsuola.

Keksinnön mukainen menetelmä kaavan II mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi on tunnettu siitä, että yhdiste, jollä on kaava IIA

H

i

L^n. CH o-0-R

pTw

O

C02A

jossa R tarkoittaa samaa kuin edellä ja A on in vivo hydrolysoituva esteriryhmä, bentsyyli, joka mahdollisesti on substituoitu, tai C^_4~aikyyli, de-esteröidään joko hydraamalla katalyyttisesti sopivassa liuottimessa, jolloin saadaan vapaa happo, joka haluttaessa muutetaan alkali- tai maa-alkalimetallisuolaksi, tai emäksisesti hydrolysoimalla, jolloin saadaan suoraan vastaava suola.

Klavulaanihapon C-^_4~alkyyli- tai bentsyylieetterin valmistamiseksi käytetään sellaista kaavan IIA mukaista lähtöainetta, jossa R on C^_4-alkyyli tai bentsyyli.

li 3 64162

Klavulaanihapon metyylieetterin valmistamiseksi käytetään sellaista kaavan IIA mukaista lähtöainetta, jossa R on metyyli,

Klavulaanihapon etyy lieetterin valmistamiseksi käytetään se i. Laista kaavan IIA mukaista lähtöainetta, jossa R on etyyli.

Keksinnön edullisen sovellutusmuodon mukaan valmistetaan kalsium-suola .

Kaavan II mukaiset suolat voidaan valmistaa kaavan ITÄ mukaisista estereistä erittäin lievällä emäksisellä hydroIvysilLa, esimerkiksi hydroLyysilla vesiliuoksessa, jota pidetään pH-arvossa 7-9 hitaalla emäslisäykseLlä.

Kaavan II mukaiset hapot ja suolat voidaan valmistaa hydrattavista kaavan IIA mukaisista estereistä hydraamalla käyttäen matalaa vedyn painetta siirtymämetallikatalyytin läsnäollessa. Palladium, esimerkiksi 10 % palladiumia puuhiilellä on osoittautunut erityisen edulliseksi katalyytiksi. On havaittu, että käytetyn puuhiilellä olevan 10 % palladiumin ja käytetyn eetterin sopiva painosuhde on 1:3. Hydrausreaktio tapahtuu mieluummin liuoksessa liuottimessa, joka koostuu tetrahydrofuraanista tai sisältää sitä. Suositeltava hyd-rattava esteri on bentsyy1iesteri.

Jos emästä, kuten natriumbikaroonae.ttia , kaliumbikarbcnaat tia , litiumkarbonaatti a tai kalsiumkarbonaattia sisällytetään reaktio-seokseen, saatu yhdiste on suo Lan muodossa. Ellei mitään tällaista emästä lisätä, saatu yhdiste on vapaan hapon muodossa.

Kaavan II mukaiset hapot voidaan myös valmistaa hapettamalla varovaisesti vastaava natrium- tai sen tapainen suola.

Lähtöaineena käytetyt kaavan IIA mukaiset esterit, joissa R on 2 2 ryhmä -CH2R , jossa R' on ryhmän R tähde, voidaan valmistaa an- 2 tamalla klavulaanihapon vastaavan esterin reagoida kaavan N2-CH2R mukaisen diatsoaIkääni n kanssa. Sopivimmin tämä reaktio tapahtuu boori tri f luoridi n l/isnäoLlessa inert issä 1 i uottimessa, kuten tetrahydrofuraanissa, kohtuullisen alhaisessa Lämpötilassa, kuten -30°C:n ja +22°C:n välillä.

4 64162

Suositeltava menetelmä kaavan IIA mukaisten estereiden valmistamiseksi käsittää klavulaanihapon vastaavan esterin reaktion kaa- 3 3 van N2~R mukaisen diatsoyhdisteen kanssa, jossa R on ryhmän R määritelmän piiriin kuuluva ryhmä, joka on reacroimaton diatso- 3 yhdisteen suhteen. Sopivia ryhmiä R ovat alkyyli-, alkenyyli-tai aralkyyliryhmät, jossa on enintään 18 hiiliatomia ja jotka ovat inertisti substituoidut esimerkiksi halogeenilla. Suositel- 3 4 4 tavia ryhmiä R ovat kaavan -CH~R mukaiset ryhmät, joissa R on 3 1 ryhmän R tähde.

Reaktio suoritetaan sopivimmin ja tavallisesti Lewis-happokata-lyytin, esimerkiksi booritrifluoridin tai sen ekvivalentin, kuten booritrif luoridieteraatin, esimerkiksi 2 läsnäollessa.

Reaktio suoritetaan normaalisti liuottimessa, joka on inertti reaktio-olosuhteissa, kuten kloroformissa, dikloorimetaanissa, tetrahydrofuraanissa tai dioksaanissa. Sopivimmin reaktio suoritetaan alennetussa tai korottamattomassa lämpötilassa, esimerkiksi -80°C:n ja +30°C:n välillä, ja mieluummin alennetussa lämpötilassa, esimerkiksi -30°C:n ja +10°C:n välillä. Sopivaksi lämpötilaksi reaktion suorittamiseen on havaittu noin -20 - 0°C.

5 64162

Biologinen aktiivisuus a. Hiirille annettuna tämän keksinnön menetelmällä valmistetuilla yhdisteillä ei ole suurta myrkyllisyyttä; esimerkiksi ihonalaisesti annettuna esimerkin 6 yhdisteen LDcn-arvo

oU

on yli 250 mg/kg.

b. Testattaessa yhdisteitä standardi MIC-kokeissa yhdessä ampisilliinin kanssa, niiden havaitaan parantavan ampisillii-nin tehokkuutta erilaisia gram-positiivisia ja gram-negatii-visia organismeja kuten lajeja Staphylococcus aureus Russell, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis ja Escherichia coli vastaan: esimerkiksi seuraavat MlC-arvot Staphylococcus aureus Russell-lajia vastaan saatiin ampisilliinille, kun läsnä oli 1 ^ug/ml tiettyjä keksinnön mukaisia yhdisteitä:

Yhdiste esimerkistä n:o 1259 MIC (/ug/ml) 2 0,3 3 1

Ilman synergistisen aineen läsnäoloa ampisilliini ei inhibi-toinut koeorganismin kasvua väkevyydellä 250 ^ug/ml. Mikään synergistisistä aineista ei inhibitoinut koeorganismin kasvua väkevyydellä 5 ^ug/ml.

Likimääräinen β-laktamaasin inhibitio l^p(^ug/ml)

Yhdiste esimerkistä n:o_1_2_3_

Escherichia coli JT4 0,18 0,1 0,16

Klebsiella aerogenes E70 0,07 0,04 0,034

Staphylococcus aureus Russell 0,05 0,005 0,044

Proteus mirabilis C889 0,01 0,02 0,025

Pseudomonas dalgleish 0,008

Bakteereja tappava vaikutus in vitro (^ug/ml)

Yhdiste esimerkistä n:o__2_3_

Klebsiella aerogenes A. 125 15,0

Staphylococcus aureus Oxford 4,0 15,0

Staphylococcus aureus Russell 9,0 15,0

Escherichia coli 10418 31,0

Proteus mirabilis C977 62,0 6 64162

Suoritettiin biologiset kokeet amoksisilliinin in vivo synergis-tisen vaikutuksen toteamiseksi yhdistettynä klavulaanihappo-metyylieetteriin verrattuna klavulaanihappoon. Kokeet suoritettiin seuraavasti:

Koe-eläiminä käytetiin naarashiiriä, joiden paino oli 18-22 g ja koeorganismeina käytettiin Eschericia coli'n kantoja JT39, E96 ja E124. Koeorganismia laimennettiin 5 %: seen karjun mahalimaan ennalta määrättynä määränä, ja hiiriä tartutettiin antamalla 0,5 ml E coli/limasuspensiota vatsaontelon sisäisesti, jolloin 5 hiiren vertailuryhmälle annettiin vatsaontelon sisäisesti 0,5 ml steriiliä limaa.

Suun kautta annostelua varten valmistettiin amoksisilliini-suspensioita ionittomassa vedessä eri väkevyyksinä, ja β-lakta-maasi-inhibiittorit valmistettiin liuoksina ionittomassa vedessä väkevyyksinä, jotka antoivat 20 mg/kg tai 10 mg/kg hiirille annettaessa. Kaikki yhdisteet valmistettiin sellaisina väkevyyksinä, jotka antoivat halutun annoksen annettaessa hiirille joko yksin tai seoksina 0,2 ml:n tilavuutena 20 g ruumiinpainoa kohti.

Yhdelle 5 tartutetun hiiren ryhmälle annettiin ainoastaan amoksi-silliiniä suurina annoksina.

Toisille 5 tartutetun hiiren ryhmille annettiin amoksisilLiiniä laajalla alueella olevina erisuuruisina annoksina seoksena β-laktamaasi-inhibiittorin kanssa, jonka määrä oli joissakin kokeissa 20 mg/kg ja toisissa kokeissa 10 mg/kg.

5 tartutetun hiiren vertailuryhmälle annettiin ainoastaan β-laktamaasi-inhibiittoria 20 mg/kg tai 10 mg/kg annoksina.

Toiselle 5 tartutetun hiiren vertailuryhmälle annettiin steriiliä ionitonta vettä.

5 tartuttamattoman hiiren vertailuryhmälle annettiin steriiliä ionitonta vettä.

Annostelu suoritettiin vatsaletkulLa käyttäen 0,2 mL yhdistettä tai seosta 20 g ruumiinoainoa kohti 1, 3 ja 5 tuntia tartunnan jälkeen.

n 7 64162

Ruiskeena annostelua varten valmistettiin amoksisilliiniliuok-sia fosfaattipuskurissa pH 6,6 eri väkevyyksinä, ja β-laktamaasi-inhibiittorit valmistettiin liuoksina fosfaattipuskurissa pH 6,6 sellaisina väkevyyksinä, jotka antoivat 2 mg/kg ja/tai 1 mg/kg annoksia hiirille annettaessa. Koeolosuhteet olivat muuten samat kuin suun kautta annettaessa, mutta annostelu suoritettiin ihonalaisesti antamalla 0,2 ml yhdistettä tai seosta 20 g kohti ruumiinpainoa 1 ja 5 tuntia tartunnan jälkeen.

Amoksisilliinin CD^q laskettiin kunkin koeryhmän kuolleisuuspro- sentin perusteella kullakin annoksella, ja amoksisilliinin CDcn

b U

käytettynä yhdessä eri 6-laktamaasi-inhibiittorien kanssa laskettiin samalla tavalla.

Näiden kokeiden perusteella määritettiin klavulaanihapon ja klavulaanihapon metyylieetterin tehokkuus.

Saadut tulokset olivat seuraavat:

Ruiskeena annetun amoksisilliinin CD^g E. coli JT39 vastaan synergistin läsnäollessa_

Klavulaanihappometyylieetteri Klavulaanihappo 1 mg/kg 2 mg/kg 1 mg/kg 2 mg/kg <12 12 81 23 13 4 23 25 8,8 3,6 19 24 11,5 6,5 15 15 11,3 6,5 34,5 19,3

Suun kautta annetun amoksisilliinin CD_n E. coli JT39 vastaan synergistin läsnäollessa____

Klavulaanihappometyylieetteri Klavulaanihappo 10 mg/kg 20 mg/kg 10 mg/kg 20 mg/kg 55 31 220 70 8 64162

Amoksisilliinin CDc.n E. coli E96 vastaan synergistin läsnäollessa______

Klavulaanihappometyylieetteri Klavulaanihappo 2 mg/kg 20 mg/kg 2 mg/kg 20 mg/kg 16 25 21 38 26 16 40 35 35 85 25,7 20,5 48,7 36,5

Amoksisilliinin CD,-fi E. coli E124 vastaan synergistin läsnä-ollessa_______

Klavulaanihappometyylieetteri Klavulaanihappo 2 mg/kg 20 mg/kg 2 mg/kg 20 mg/kg 33 11 75 27 40 8,6 70-120 13,6 7,3 14,6 36,5 8,8 =88 18,4 il 5 64162

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä.

Esimerkki 1

A. Bentsyyliklavulanyyli-O-metyylieetterin valmistus H

__l-ο /CHjOH CH,OCH, 1 i >=/ „ —/ COjCHjCjHj 0 'cO,CH,CKH.

(el) (e3) 2265

Bentsyyliklavulanaattia (el) (300 mg) liuotettiin kuivaan metyleenidikloridiin (25 ml) ja jäähdytettiin 0°C:een. Boo-ritrifluoridieteraattia (5 tippaa) lisättiin 0°C:ssa, mitä seurasi diatsometaanin eetteriliuos.· Reaktioseosta sekoitettiin 0°C:ssa yksi tunti ja pestiin 3 %:sella natriumbikarbo-naattiliuoksella (2 x 25 ml). Orgaaninen faasi kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin: kromatograafinen puhdistus antoi otsikon yhdistettä (e3) (66 mg).

IR (CHC13): 1800, 1745, 1695 cm-1; NMR (CDC13): 3,10 (1H, d, J 17Hz, 68-CH), 3,35 (3H, s, OCi^), 3,60 (1H, dd, J 17Hz, J' 2,5Hz, 6a-CH), 4,12 (2H, d, J 8Hz, CH2OCH3) , 4,94 (1H, t, J 8Hz, =CH-CH2) , 5,24 (1H, br.s, 3-CH), 5,32 (2H, s, C02CH2Ph), 5,82 (1H, d, J 2,5Hz, 5-CH), 7,51 δ (5H, s, C02CH2Ph).

10 641 62

B. Natriumklavulanyyli-O-metyylieetterin valmistus H

CH-OCH-, H

_/ 2 3 : n CH2OCH3 V-/ -Ι""°χ / 0 / C0oCH-CcH, 0 2 265 C02Na (e3) (e4)

Eetteriä (e3) (30 mg) liuotettiin tetrahydrofuraaniin (3 ml) ja 10 %:sta palladium-hiilikatalyyttiä (10 mg) lisättiin.

Liuosta hydrattiin ympäristön lämpötilassa ja paineessa 15 minuuttia, suodatettiin ja natriumbikarbonaattia (8,4 mg) 0,5 mlrssa vettä lisättiin. Liuotin haihdutettiin, jolloin saatiin natriumsuolaa amorfisena kiinteänä aineena eetterissä hiertämisen jälkeen (15 mg).

IR (KBr-kiekko): 1790, 1690, 1615 cm'1; NMR (D20): 3,07 (1H, d, J 17Hz, δβ-CH), 3,27 (3H, s, OCH3), 3,54 (1H, dd, J 17Hz, J' 2,5Hz, 6a-CH), 4,04 (2H, d, J 8Hz, CH2OCH2), 4,87 (1H, t, J 8Hz, =CH-CH2), 4,93 (1H, s, 3-CH), 5,69 δ (1H, d, J 2,5Hz, 5-CH) .

li 11 64162

Esimerkki 2

A. Metyyliklavulanyyli-O-bentsyylieetterin valmistus H

ch2oh K

—] ·'' \^/ ___; - o _ f» 20CH 2 / ' / X "K . ./ -> O \ // C02CH2C6H5 o ' (el) (e5) C02CH2C6H5

Bentsyyliklavulanaattia (el) (300 mg) liuotettuna metyleeni-kloridiin (25 ml) jäähdytettiin -30°C:een ja käsiteltiin booritrifluoridieteraatilla (5 tippaa) mitä seurasi diatso-tolueenin eetteriliuos. Liuosta sekoitettiin -30°C:ssa tunnin ajan ja pestiin 3 %:sella natriumbikarbonaattiliuoksel-la (3 x 25 ml). Orgaaninen faasi kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin, jolloin saatiin kromatografiän jälkeen epäpuhdasta bentsyyli-3-(2-bentsyylioksietylideeni)- 7-okso-4-oksa-l-atsabisyklo/3,2,07heptaani-2-karboksylaattia (e5) (150 mg) öljynä.

64162 B. Natriumklavulanyyli-O-bentsyylieetterin valmistus __®20εΗ2-<3 " CH2OCH2-<J2> J......

O 0 C0oCHoCcHc 2 265 C02Na (e5) (e6)

Epäpuhdasta bentsyyli-3-(2-bentsyylioksietylideeni)-7-okso- 4-oksa-l-atsa-bisyklo/3,2, j3/heptaani-2-karboksylaattia (e5) (150 mg) liuotettiin tetrahydrofuraaniin (5 ml) ja hydrat-tiin ympäristön lämtötilassa ja paineessa 10 %:sella Pd/C-katalyytilla (20 mg) 20 minuuttia. Liuos suodatettiin ja sitä käsiteltiin natriumbikarbonaatilla (15 mg) 1 ml:ssa vettä. Liuotin haihdutettiin ja jäännös liuotettiin veteen (10 ml) ja pestiin etyyliasetaatilla ( 3 x 10 ml). Vesifaasi haihdutettiin, jolloin saatiin vaadittu natriumsuola amorfisena kiinteänä aineena eetterissä hiertämisen jälkeen (e6) (35 mg).

IR (KBr): 1790, 1690, 1615 cnf1; NMR (D20): 3,09 (1H, d, J 17Hz, 63-CH), 3,59 (1H, dd, J 17Hz, J’ 2,5Hz, 6a-CH), 4,20 (2H, d, J 8Hz, =CH-CH20), 4,48 (2H, s.

OOH2Ph), 4,97 (1H, br.t., J 8Hz, =CH-CH20), 4,99 (1H, m, 3-CH), 5,74 (1H, d, J 2,5Hz, 5-CH), 7,42 ό (5H, s, OCH2Ph); /σ72^ = +22,5° (c = 1,15; 50 %:nen MeOH:n vesiliuos).

li 13 641 62

Esimerkki 3 A. Bentsyyliklavulanyyli (etoksikarbonyylimetyyli)eetterin valmistus

H CH OH H

;n2 n CHo0CH»C0oCoH(-

r+V _ H'-W

A-N--V I__N.__/ o \ \ C02CH2C6H5 'C02CH2C6H5 (el) (e7)

Bentsyyliklavulanaattia (el) (1/44 g) liuotettiin kuivaan metyleenidikloridiin (100 ml) ja booritrifluoridieteraattia (25 tippaa; 0,3 ml) lisättiin -30°C:ssa. Etyylidiatsoase-taattia (2,90 g, 5 ekvivalenttia) metyleenidikloridissa (10 ml) lisättiin tipottain puolen tunnin aikana ja seosta sekoitettiin -30 - -10°C:ssa tunnin ajan. Liuos pestiin 3 %:sella natriumkarbonaattiliuoksella (3 x 50 ml) ja kuivattiin magnesiumsulfaatilla. Liuotin haihdutettiin huoneenlämpötilassa ja jäännös kromatografoitiin, jolloin saatiin otsikon yhdistettä (e7) värittömänä öljynä (600 mg).

IR (CHC13) : 1800, 1745, 1695 cm"1; NMR (CDC13): 1,29 (3H, t, J 8Hz, -C02CH2CH3), 3,00 (1H, d, J 17Hz, 68-01), 3,50 (1H, dd, J 17Hz, J* 2,5Hz, 6a-CH), 3,97 (2H, s CH2C02Et, 3,90-4,50 (4H, kompleksinen rakenne, -CH-CH^ ja C02CH2CH3), 4,79 (1H, t, J 8Hz, =CH-CH2), 5,14 (1H, brs, 3-CH), 5,23 (2H, s, C 2OK2Ph), 5,72 (1H, d, 2,5Hz, 5-CH), 7,37 δ (5H, s, C02CH2PH).

/α/β1 = +35,3° (c = 1,29; MeOH).

14 641 62 B. Natriumklavulanyyli (etoksikarbonyylimetyyli)eetterin valmistus

H

H

CH-OCH-CO-C^Ht- , ' <0 f 1 1 1 2 b i ch9och9co9c9h, ;“! —> rrw

<// "< /'-NV

C00CH0CcH(. O

2 2 b b CO„Na (e7) (e8) 2

Esteriä (e7) (188 mg) liuotettiin kuivaan tetrahydrofuraa- niin (5 ml) ja 10 %:sta Pd/C-katalyyttiä (65 mg) lisättiin. Liuosta hydrattiin ympäristön lämpötilassa ja paineessa viisitoista minuuttia, liuos suodatettiin piimään läpi ja natriumbikarbonaattia (42 mg) vedessä (1 ml) lisättiin. Liuotin haihdutettiin ja jäännös kromatografoitiin piihappogee-lillä eluoiden butanoli/etanoli/vesiliuoksella suhteessa 4/1/1. Tuotteen hiertäminen eetterissä antoi natriumsuolaa amorfisena kiinteänä aineena (e8) (95 mg).

IR (KBr): 1790, 1740, 1690, 1600 cm"1; NMR (D20) : 1,27 (3H, t, J 8Hz, CC>2CH2CH3) , 3,09 (1H, d, J 17Hz, 60-CH), 3,57 (1H, dd, J 17Hz, J’ 2,5Hz, 6a-CH), 4,14 (2H, s, 0CH2C02Et) 4,21 (4H, dupletti ja kvartetti päällekkäin, J = J’ 8Hz, =CH-CH2- ja C02CH2CH3), 4,86, (1H, t, J 8Hz, =CH-CH2-), 4,96 (1H, brs, 3-CH), 4,71 δ (1H, d, J 2,5Hz, 5-CH).

/a= 36,5° (c = 1,15; 50 %:nen MeOh:n vesiliuos).

15 641 62

Esimerkki 4

Natriumklavulanyyli (etoksikarbonyylimetyyli)eetterin valmistus __>o ch2och2co2c2h5 h o ch2och2co2c2h5 ' " '' /-ν'"""' C0~CHoCcH[- ° V- „ 2 265 C02Na (e7) (e8)

Esimerkin 3 A mukaisella tavalla valmistettua esteriä (e7) (112 mg) hydrolysoitiin käyttäen 1-N NaOH:a vakio-pH-arvolla (käyttäen pH-staattia), kunnes hydrolyysi oli mennyt loppuun. Kromatogra-fia tuotti natriumsuolan amorfisena kiinteänä aineena eetterissä hiertämisen jälkeen (e8) (15 mg).

Esimerkki 5 A. Bentsyyliklavulanyyli (bentsyylikarbonyylimetyyli)eetterin valmistus

H H

• CH-OH n 1.2 , CH-OCH-CO-CH-C^Hr· ___/ 2 2 2 2 6 5 ! ! —- °v. / —------- ! · /—^

\ 0 V

C02CH2C6HS 'CO_CH„C,H.

(el) 2265 (e9) 2265

Bentsyyliklavulanaattia (el) (1,8 g) liuotettiin kuivaan metyleeni-kloridiin (100 ml) ja booritrifluoridieteraattia (25 tippaa, 0,3 ml) lisättiin -30°C:ssa- Bentsyylidiatsoasetaattia (5 g 66 %:sesti puhdasta materiaalia) metyleenikloridissa (20 ml) -30°C:ssa lisättiin tipottain puolen tunnin aikana ja seosta sekoitettiin -30 - -10°C:ssa tunnin ajan. Liuosta pestiin 3 %:sella natrium-bikarbonaattiliuoksella (2 x 50 ml) ja kuivattiin magnesiumsulfaatilla. Liuotin haihdutettiin huoneenlämpötilassa ja jäännös kromatografoltiin piihappogeelillä eluoiden heksaani/etyyliase-taattiseoksella. Saatu jonkinverran epäpuhdas öljy kromatogra-foitiin uudelleen, jolloin saatiin puhdasta otsikon yhdistettä (e9) värittömänä öljynä (0,32 g).

IR (kalvo): 1800, 1760, 1750, 1695 cm“1; ie 64162 NMR (CDC13): 7,29 (10H, aromaattinen H), 5,58 (1H, d, J 2,5Hz, 5-CH), 5,13 (4H, CH2Ph), 5,03 (1H, 3-CH), 4,79 (1H, t, J 7Hz, =CH-CH2), 4,16 (2H, d, J 8Hz =CH-CH2), 4,00 (2H, s, =CH-CH2~0-CH2~), 3,40-2,95 δ (2H, dd, J 18Hz, 6-CH2).

bentsyylidiatsoasetaatti valmistettiin bentsyyliklooriformaatin ja di-atsometaanin reaktiolla 4°C:ssa 3 päivän aikana, jolloin saatiin 66 %:sesti puhdasta tuotetta öljynä.

B. Dinatrlumklavulanyyli ( karboksimetyyli)eetterin valmistus

H H

! CHo0CHoC0oCH-C,H- , ,_|^° / 2 2 2 2 6 5 ! o CH20CH2C02Na booCH0C,H,- 0 \ (e9) 2 2 6 5 (elo) C02Na

Esteriä (e9) (260 mg) liuotettiin tetrahydrofuraanin ja veden seokseen (5:1, 12 ml) ja natriumbikarbonaattia (100 mg) ja 10 %:sta Pd/C-katalyyttiä (150 mg) lisättiin. Liuosta hydrattiin huoneenlämpötilassa ja paineessa 30 minuuttia, suodatettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin haluttua dinatriumsuolaa (elo).

IR (KBr): 1780, 1685, 1600, 1425 cm"1.

Esimerkki 6 A. Bentsyyli-9-(0-syanometyyli)klavulanaatin valmistus 1! >-f + N--CH-CN -^ I /==^ J-N"V J-N--/ o \ 0 \ C02CH2C6H5 C02CH2C6H5 (el) (eli) 17 641 62

Liuosta, jossa oli bentsyyliklavulanaattia (el) (5,18 g) metyleenidi-kloridissa (50 ml), kuivattiin 4 A-molekyyliseuloilla ja suodatettiin. Liuos jäähdytettiin -40 - -30°C:een ja 1 ml booritrifluoridieteraat-tia lisättiin. Liuosta, jossa oli diatsoasetonitriiliä (valmistettu aminoasetonitriilihydrokloridista (9,3 g) teoksessa Houben-Weyl voi. 10/4 esitetyllä tavalla) metyleenikloridissa (250 ml) lisättiin tipoittaan 1 tunnin aikana pitäen lämpötila välillä -40 - -30°C. Seoksen annettiin sitten lämmetä -10°C:een. Yhden tunnin kuluttua -10°C: ssa liuos pestiin 3 erällä laimeaa natriumbikarbonaatti liuosta (200 ml), kuivattiin kalsiumkloridilla ja haihdutettiin,jolloin saatiin ruskeaa kumia. Tuote puhdistettiin pyiväskromatografisesti (pii-happogeeli; sykloheksaani:etyyliasetaatti 3:1 ja sen jälkeen 1:1), jolloin saatiin hieman epäpuhdas tuote. Kromatografisen käsittelyn (sama systeemi) toisto antoi haluttua tuotetta (eli) (1,56 g).

IR (kalvo): 1805, 1750, 1698 cm"1.

NMR (CDCl.j) : δ 3,02 (1H, dupletti, J 17Hz) , 3,45 (1H, kaksoisdupletti, J 17Hz ja 3 Hz), 4,01 (2H, singletti), 4,14 (2H, dupletti, J 7Hz), 4,70 (1H tripletti, jossa pientä kytkeytymistä, J trip 7Hz), 5,06 (1H, singletti), 5,14 (2H, singletti), 5,68 (1H, singletti, jossa pientä kytkeytymistä), 3,28 (5H, singletti).

B. Natrium-9-(0-syanometyyli)klavulanaatin valmistus ? H

I CH«-0-CHn-CN · CH_-0-CH -CN

,-\^°\ / ____O / 2 2 ° \ O * \ C02CH2C6H5 C02Na (eli) (el2)

Seosta, jossa oli benteyyli-9-(O-syanometyyli)klavulanaattia (eli) (1,56 g) ja natriumbikarbonaattia (0,399 g) tetrahydrofuraanin ja veden seoksessa (30 ml 5:1 tetrahydrofuraani:vesi), hydrattiin lO %:sella palladium-hiilikatalyytillä (0,5 g) huoneenlämpötilassa ja normaalipaineessa, kunnes vaadittu määrä vetyä oli absorboitunut.

Tämän jälkeen seos suodatettiin ja katalyytti pestiin vedellä. Yhdistetyt suodokset haihdutettiin sitten, kunnes suurin osa tetrahydro- 18 641 62 furaania oli poistettu. Jäljelle jäänyt vesiliuos pestiin etyyliasetaatilla ja pakastekuivattiin, jolloin saatiin haluttua tuotetta (e 12) (913 mg) ruskeana kiinteänä aineena. Näyte (535 mg) johdettiin lyhyen piihappogeelikolonnin läpi käyttäen n-butanolin, HjOrn ja EtOH:n (4:1:1) liuotinseosta, jolloin saatiin yhdistettä (el2) (213 mg) vaaleankeltaisena kiinteänä aineena.

NMR (D2O): 6 3,24 (1H, dupletti, J 16Hz), 3,66 (1H, kaksoisdupletti, J 16Hz ja 3Hz), 4,30 (2H, dupletti, J 7Hz), 4,40 (2H, singletti), 4,91 (1H, tripletti, jossa pientä kytkeytymistä, J 7Hz), 5,00 (1H, singletti), 5,78 (1H, dupletti, 3Hz).

IR (KBr-kiekko): 1780, 1610 (leveä) cm”^.

Esimerkki 7 A.Bentsyyli-9-/0- (4-nitrobentsyyli]_7klavulanaatin valmistus _, L.

'C02CH2C6H5 ^°2CH2C6H5 (el) (el3)

Liuosta, jossa oli bentsyyliklavulanaattia (el) (4,33 g) metyleeniklo-ridissa (50 ml) kuivattiin 4 A-molekyyliseuloilla 1/2 tuntia. Sen jälkeen liuos suodatettiin ja jäähdytettiin -30°C:een. Booritrifluori-dieteraattia (0,8 ml) lisättiin sitten. Liuosta, jossa oli 4-nitro-fenyylidiatsometaania (7,34 g) metyleenikloridissa (150 ml) lisättiin sitten sekoitettuun liuokseen -30°C:ssa 1 tunnin aikana. Seos lämmitettiin sitten -10°C:een 1 tunnin aikana. Liuos pestiin sitten nat-riumbikarbonaattiliuoksella (3 x 150 ml), kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin. Toistettu kromatografinen käsittely (kahdesti sykloheksaani/etyyliasetaattiseos 1:1 ja kerran metyleenikloridi eluanttina) Kieselgel H-massalla antoi puhdasta eetteriä (el3) (230 mg) .

IR (kalvd: 1800, 1750, 1700, 1520 cm-1.

NMR (CDCl·^): 2,98 (1H,dupletti, J 17Hz), 3,44 (1H, kaksoisdupletti, J 17Hz ja 3Hz), 4,09 (2H, dupletti, J 7Hz), 3,45 (2H, singletti), 4,8 (1H, tripletti, jossa pientä kytkeytymistä, J 7Hz), 5,05 (1H, singletti), 5,14 (2H, singletti), 5,63 (1H, dupeltti, jossa pientä kytkeytymistä), 7,27 (5H, singletti), 7,38 (2H, dupletti, J 9Hz), 8,11 (2H, dupletti, J 9Hz).

I; 19 641 62 B. Natrium-9-/p-(4-nitrobentsyylil7klavulanaatin valmistus h /r~\ h ·:" no , CH^-O-CH^7 V NO„ ; CH_-0-CHo ' 2

rf-'W w n'V

~( —' H" ~( t02CH2C6H5 0 C02Na (el3) (e21)

Liuosta, jossa oli bentsyyli-9-Ζθ-(4-nitrobentsyyli)_7klavu-lanaattia (el3) (110 mg) ja natriumkarbonaattia (21,7 mg) tetrahydrofuraanin ja veden seoksessa (5:1, 8 ml), hydrat-tiin 10 %:sella palladiumhiilikatalyytilla (68 mg) 15 minuutin ajan. Liuos suodatettiin seliitin läpi ja kiinteä aine pestiin vedellä. Yhdistetyt suodokset haihdutettiin tetrahydrofuraanin poistamiseksi suurimmaksi osaksi ja jäljelle jäänyt vesiliuos pestiin etyyliasetaatilla. Vesiliuos haihdutettiin sitten ja jäljelle jäänyt kumi puhdistettiin pylväs-kromatografisesti (kieselgel H, n-butanoli:vesi:etanoli, 4:1:1 eluanttina), jolloin saatiin tuote (e21) (39 mg) kel taisena kiinteänä aineena (arviolta 70 %:sesti puhdasta).

IR (KBr) 1790, 1605 (leveä) cm”1 ; NMR (DMSO) 2,83 (1H, dupletti, J 17Hz), 3,41 (1H, kaksoisdup-letti, J 17Hz ja 3 Hz), 3,88 (2H, dupletti, J 7Hz), 4,4 (2H, singletti), 4,52 (1H, singletti), 4,67 (1H, multipletti), 5,57 (1H, singletti, jossa pientä kytkeytymistä), 6,46 (2H, dupletti J 9Hz), 6,89 (2H, dupletti, J 9Hz).

641 62 20

Esimerkki 8 Δ. Bentsyyli-9-(O)-allyyliklavulanaatin valmistus

! /CH20H ! CH -O-CH -CH-CH

rrV —, -rv

\ ' ΡΠ PP P VT

CO-CH„CcHc ^2 '2Vn5 2 2 6 5 (el) (el4) (i) N-nitroso-N-ai]yvlibentsamidi

Liuos, jossa oli typpidioksidia (24,1 g) hiilitetrakloridissa (150 ml), lisättiin sekoitettuun seokseen, jossa oli vedetöntä natriumasetaat-tia (45 g) ja hiilitetrakloridia (150 ml) -20°C:ssa. N-allyylibens-amidia (28,4 g) hiilitetrakloridissa (150 ml) lisättiin sekoitettuun seokseen -5°C:ssa, jota sekoitettiin sitten 0°C:ssa 0,5 tuntia.

Tämä pestiin natriumbikarbonaatin vesiliuoksella (2 x 400 ml), kuivattiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin N-nitrosc-N-allyylibensamidia (28,5 g).

v (nestekalvo): 1710, 1650, 1600, 1570, 1355, 1285, 1155, 1040 11 Id A. _ ' ja 920 cm , 5(CDC13): 7,83-7,20 (5H, m, ArH), 6,03-4,83 (3K, m, «k ), ja 4,33 (2H, leveä d, J 4Hz). ~ (ii) 3-diatsoprop-l-eeni

Pyrrolidiinia (4,53 ml) lisättiin N-nitroso-N-allyylibensamidin (9,5 g) liuokseen metyleenikioridissa (100 ml) -20°C:ssa ja seosta sekoitettiin -20°C:ssa 15 minuuttia, jolloin saatiin 3-diatsaprop-l-eenin liuos.

vmax : 2030 cm Tätä liuosta säilytettiin sitten 0°C:ssa käyttöön asti.

(iii) Bentsyyli-9-(0)-allyyliklavulanaatti

Booritrifluoridieteraattia (1 ml) lisättiin bentsyyliklavulanaatin (2,89 g) liuokseen metyleenikioridissa (150 mi) -30°C:ssa. Yllä valmistettu 3-diatsoprop-l-eenin liuos lisättiin seokseen -30°C:ssa ja seosta sekoitettiin -30 - -10°C:ssa tunnin ajan. Tämä pestiin natriumbikarbonaatin vesiliuoksella (2 x 200 ml), kuivattiin ja haih- l! 2i 64162 dutettiin, jolloin saatiin epäpuhdas tuote öljynä, joka kromatog- rafoitiin piihappogeelillä (50 g). Kolonnin eluointi syklohek- saanin ja etyyliasetaatin seoksella antoi bentsyyli-9-(O)-allyy- liklavulanaattia (el4) (0,92 g) värittömänä nesteenä /ot/D +45,3° (CHCl,; c 1,0), υ (nestekalvo) : '1800, 1750, 1695, 1300, 1 175, 1030, 1010, 995 cm' . 6(CDC13): 7,37 (5H, s, Ar-H), 6,05-5,70 (1H, m, C - C^jJ) , 5,60 (lH,d, J 2,5Hz, 5-CH) , 5,30-5,10 (2H, m, -CH2-CH=C^) , 5,13 (2H, s, -Cä2Ph), 5,03 ( 1H, m, 3-CH), 4,79 (1H, leveä t, J 8Hz, 8-CH), 4,01 (2H, d, J 8Hz, 9-CH2), 3,86 (2H, leveä d, J 7Hz, -CH2~CH=CH2), 3,41 (1H, dd, J 18Hz, J' 2,5Hz, 6a-CH), 2,98 (1H, d, J 18Hz, 6&-CH). (Kokeellisesti C, 65,85; H 5,65; N 4,45 %. Laskemalla kaavasta C.oH.nN0r: I c Ί y t) C 6 5,65; H 5,8; N 4,25 %) .

B. Natrium-9-Q-aliyyiiklavulanaatti H

« CH„-0-CHo-CH=CHo O /2 2 2 t : \—/ ------^ J—N^/ cr ¥ ch9-o-ch9-ch=ch

vC0oCHoCcHr L^-Ö I Z Δ Z

(el4) YW

--N\ / o' (e25) C02Na

Bentsyyli-9-O-allyyIiklavuianaatin (el4) (0,5 g) liuosta tetra- hydrofuraani-vesiseoksessa (1:4, 30 ml) titrattiin vakio-pH-ar-voon pH-arvossa 10 natriumhydroksidin vesiliuoksella huoneenlämpötilassa. Keaktioseos laimennettiin vedellä (30 ml) ja neutraali orgaaninen aine poistettiin uuttamalla jatkuvasti eetterillä. Vesiliuos pakastekuivattiin ja kromatografoitiin sen jälkeen piigeelillä. Eluoimalla kolonni butanoliretanoli: vesiliuoksella (4:1:1,75) saatiin otsikon yhdistettä (e25) (0,01 g) .

NMR (D20): 5,63 (1H, d J 3Hz, 5-CH), 4,97-5,40 (3H, m, -CH=CH2>, 4,87 (1H, m, 3-CH), 4,83 (1H, leveät t, J 8Hz, 3-CH), 4,19 (2H, d, J 8Hz, 9-CH2) , 3,91 (2li, leveä d, J 6Hz, -CH2CH=CH2) , 3,49 (1H, dd, J 18Hz, J' 3Hz, 6a-CH), ja 2,97 δ (1H, d, J 18Hz, 6p-CH).

22 641 62

Esimerkki 9 A. Bent syy li-9-/Q- (2-bentsyylioksibikarbonyylietyyli)_Alavulanaatin valmistus

H H

CH-OH ' CH2~O-CH2~CH2“002®2*“6^5

0^-NV

υ \ O ' ' CO-CH^C^Hj. 'cO-CH-Cf-H,.

(el) 2 265 (el5) * z ö 5 (i) Bentsyyli-N-nitroso-N-bentsyylioksikarbonyyli-g-alanaatti Liuos, jossa oli typpidioksidia (6,9 g) hiilitetrakloridissa (40 ml), lisättiin sekoitettuun liuokseen, jossa oli vedetöntä natriumasetaattia (12,3 g) ja hiilitetrakloridia (40 ml) -20°C: ssa. Bentsyyli-N-bentsyylioksikarbonyyli-(J-alanaattia (12,95 g) hiilitetrakloridissa (50 ml) lisättiin sekoitettuun seokseen -5°C:ssa, jota sitten sekoitettiin 0°C:ssa 0,5 tuntia. Reaktioseos pestiin natriumbikarbonaatin vesiliuoksella (2x100 ml) ja hiilitetrakloridiliuos kuivattiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin bentsyyli-N-nitroso-N-bentsyylioksi-kar-bonyyli-fi-alanaattia (12,5 g) öljynä.

v (CC1.): 1745, 1705, 1520, 1400, 1350, 1175, 1140, 1095, uiqX η 4 960 cm ”, δ (CDC13): 7,30 (10H, s, ArH), 5,46 (2H, s, CH^Ph), 4,90 (2H, s, CH2Ph), 3,92 (2H, t, J 7Hz) ja 2,36 (2H, t, J 7Hz), (NMR-spektri osoitti, että lähtöaine ja tämä öljy olivat vain n. 73 %:sesti puhtaita).

li 23 641 62 (ii) Bentsyyli-9-/Ö-(2- bentsyyLioksikarbonyylietyyli) 7klavulanaatti

Pyrrolidiinia (0,58 ml) lisättiin liuokseen, jossa oli bentsyyli-N- nitroso-N-bentsvvlioksikarbonyyli-B-alanaattia (3,24 g) metyleeniklo- o o ridissa (25 ml) -20 C:ssa ja seosta sekoitettiin -20 C:ssa 15 minuuttia, jolloin saatiin bentsyyli-3-diatsopropionaatin liuos, jota pidettiin 0°C:ssa seuraavaa vaihetta varten.

Booritrifluoridieteraattia (0,5 ml) lisättiin liuokseen, jossa oli bentsyyliklavulanaattia (1 g) metyleenikloridissa (150 ml) -30°C:ssa. bentsyyli-3-diatsopropionaatin yllä valmistettu liuos lisättiin seokseen -30°C:ssa ja liuosta sekoitettiin -30 - -10°C:ssa tunnin ajan. Tämä pestiin natriumbikarbonaatin vesiliuoksella (2 x 50 ml), kuivattiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin epäpuhdas tuote öljynä, joka kromatografoltiin piihappogeelillä (30 g). Kolonnin eluointi syklo-heksaanin ja etyyliasetaatin seoksella antoi bent^ryli-9-/Ö- (2-bentsyyli-oksikarbonyylietyyli)_7klavulanaattia (el5) (0,21 g) värittömänä nes teenä, /öt_7D 29,3° (CHC13; c, 1,0).

(nestekalvo: 1805, 1740, 1700, 1240, 1170, 1100, 1040 ja 1020 cm *, <S(CDC13): 7,28 (10H, s, Ar-H) , 5,60 (1H, d, J 2,5Hz, 5-CH) , 5,14 (2H, s, CH2Ph), 5,09 (2H, S, CH2Ph), 5,02 (1H, m, 3-CH), 4,74 (1H, leveä t, J 8Hz, 8-CH), 4,01 (2H, leveä d, J 8Hz, 9-CH2), 3,60 (2H, t, J 7Hz) , 3,41 (1H, dd, J 18Hz, J' 2,5Hz, 6a-CH) , 2-,99 (1H, d, J 18Hz, 6(3-CH) , ja 2,57 (2H, t, J 7Hz) .

M+ 451,1626 laskemalla kaavasta C25H25N07 —+ 451/1631.

B. Dlnatrium-9-/0-(2-karboksletyylij7klavulanaatln valmistus H

! CH^-O-CH^-CH-j-CO-CH-C^He , ->

J—H

O* \ ; CH -O-CH -CH0-CO-Na r-rw (el5) cr \ 'COjNa (el6) 24 6 4 1 6 2

Seosta, jossa oli bentsyyli-9~/0- (2-bentsyylioksikarbonyylietyylj)/klavu-lanaattia (el5) (0,17 g) ja natriumbikarbonaattia (0,063 g) tetrahydro- furaanin ja veden seoksessa suhteessa 5:1 (12 ml), hydrattiin 10 %:sen palladium-hiilikatalyytin (0,1 g) läsnäollessa huoneenlämpötilassa ja -paineessa 0,5 tuntia. Seos suodatettiin ja suodos haihdutettiin, jolloin saatiin dinatrium-9-/0- (2-karboksietyyli27klavulanaattia (el6) (0,084 g) .

Vmav (KBr) : 1780, 1690, 1620, 1390, 1310, 1195 , 1155, 1085, 1040 ja 89 5 cm 6(D20): 5,65 (1H, d, J, 2,5Hz, 5-CH), 4,87 (1H, s, 3-CH), 4,81 (1H, leveä t, j 8Hz, 8-CH), 4,06 (2H, d, J 8Hz, 9-CH2), 3,63 (3H, t, J 7Hz), 3,51 (1H, dd, J 18Hz, J' 2,5Hz, 6a-CH),3,05 (1H, d, J 18Hz, 6β-CH) ja 2,49 (3H, t, J 7Hz) .

Esimerkki 10

A. Benteyyli-9-asetonyyliklavulanaatln valmistus H H

; .CH20H 1 CH--0-CH-*C0*CH- β? -βΤ 'co2ch2c6h5 0 'co2ch2c6h5 (el) (el7)

Liuokseen, jossa oli bentsyyliklavulanaattia (el) (1,0 g) ja diatso- asetonia (1,4 g) metyleenikloridissa (30 ml), lisättiin booritrifluo- o rididietyylieteraattia (20 tippaa) ja liuosta sekoitettiin -10 C:ssa 2,0 tuntia. Reaktioseos sammutettiin laimealla bikarbonaattiliuok-sella. Orgaaninen uute pestiin natriumkloridiliuoksella, kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin. Piihappogeelikromatografia (eluoiden etyyliasetaatti/sykloheksaanilla) tuotti otsikon tuotetta (el7) (190 mg) värittömänä öljynä.

IR (CHC13): 1800, 1730-1760, 1695 cm-1; NMR (CDC13) : 2,10 (3H, s, -¾) , 2,96 (1H, d, J 17Hz, 6 β-CH), 3,36 (1H, dd, J 17Hz, J’ 2,5Hz, 6a-CH), 3,99 (2H, d, J 7Hz, =CH-CH2), 4,68 (1H, t, J 7Hz, =CH-CH2), 5,03 (1H, brs., 3-CH), 5,20 (2H, s, -CT2Ph), 5,70 (1H, d, J 2,5Hz, 5-CH), 7,33 (5H, s, C02CH2Ph).

M (massaspektrometrisesta) 345.

25 641 62

B. Natrium-9-asetonyyliklavulanaatin valmistus H

' CH 0-O-CH 0”CO~ CH 0 H

/ 2 2 3 j __:__ ch2och2coch3 J-N ».../ --j i 0 \ C0~CHoCcH,. \ (el7) 2 2 6 5 (el8) C02Na

Asetonyylieetteribentsyyliesteriä (el7) (80 mg) hydrattiin tetrahydrofuraani/vesiliuoksessa (5:1) natriumbikarbonaatin (5 mg) ja 10 %: sen palladium/hiilikatalyytin (30 mg) läsnäollessa. 20 minuutin kuluttua katalyytti suodatettiin pois.

Suodos laimennettiin vedellä ja uutettiin etyyliasetaatilla ennen pakastekuivausta. Tämä antoi otsikon tuotetta likaisen valkoisena kiinteänä aineena.

IR (KBr): 1780, 1720, 1690, 1610 cm-1; NMR (CDCl-j) : 2,09 (3H, s, -CHj) , 3,00 (1H, d, J 17Hz, ββ-CH) , 3,45 (1H, dd, J 17Hz, J’ 2,5Hz, 6a-CH), 4,08 (2H, d, J 8Hz, =CH-CH2), 4,18 (2H, s, CH2C=0), 4,80 (1H, t, J 8Hz, =CH), 4,90 (1H, s, 3-CH), 5,65 (lH, d, J 2,5Hz, 5-CH).

Esimerkki 11 A. Bentsyy1i-9-L2~(N-bentsyy1ioksikarbonyy1i-N-metyy1iamino)-etyylj/klavulanaatin valmistus

H H

“ CH 0-OH I CH,-0-CH--CH,-N-CH, C02CH2C H v CO^CH-C,H. CH2C6H5 (el) (e20) 2 265 26 6 4 1 62 (i) N-metyyli-N'-nitroso-Ν,Ν'- dibentsyylioksikarbonyyli-l,2-di-aminoetaani - 0

Hiilitetrakloridiin (90 ml), jota sekoitettiin välillä -5 - -10 C, lisättiin vedetöntä natriumasetaattia (27,8 g), jota seurasi typpioksidin (15,6 g) liuos hiilitetrakloridissa (90 ml) sellaisella nopeudella, että lämpötila ei noussut yli -5°C. N-metyyli-N,N'-dibensyyli-oksikarbonyyli-1,2-diaminoetäänin (29 g) liuos hiilitetrakloridissa (90 ml), lisättiin sitten sekoitettuun liuokseen 40 minuutin aikana pitäen lämpötila -10°C:ssa. Kun lisäys oli päättynyt, seoksen annettiin sekoittua 2 tuntia. Seos pestiin sitten ylimäärin olevalla nat-riumbikarbonaattiliuoksella, vesifaasi uutettiin hiilitetrakloridilla ja yhdistetyt orgaaniset faasit kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin, jolloin saatiin 29,8 g suunnilleen 80 %:sesti puhdasta ainetta.

(ii) N-metyyli-N,N'- dibentsyylioksikarbonyyli-1,2-diaminoetaani Sekoitettuun liuokseen, jossa oli N-metyyli-1,2-diaminoetaania (7,4 g) ja trietyyliamiinia (20,2 g) kloroformissa(50 ml) 0°C:ssa, lisättiin tipoittain 30 minuutissa bensyyliklooriformaattia (34,1 g). Seos jätettiin sitten lämpenemään huoneenlämpötilassa tunnin ajaksi. Orgaaninen liuos pestiin sitten vedellä, sitruunahappoliuoksella, natriumkarbonaattiliuoksella ja lopuksi jälleen vedellä. Kloroformi-liuos kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin, jolloin saatiin keltainen öljy (29,6 g).

(iii) Bentsyyli-9-/?-(bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyliamino) etyyli7~ klavulanaatti

Sekoitettu liuos, jossa oli N-metyyli-N'-nitroso-N,N’-dibentsyylioksikarbonyyli-1, 2-diaminoetaania (3,71 g) metyleenikloridissa (10 ml), jäähdytettiin -30°C:een ja käsiteltiin pyrrolidiinilla (0,71 g). Seoksen annettiin sekoittua -25 - -30°C:ssa puoli tuntia ja käytettiin sitten alla kuvatulla tavalla.

Liuos, jossa oli bentsyyliklavulanaattia (1,0 g) metyleenikloridissa (10 ml), jäähdytettiin -30°C:een ja käsiteltiin booritrifluoridiete- raatilla (0,5 ml). Yllä kuvatulla tavalla valmistettu diatsoyhdisteen liuos lisättiin sitten sekoitettuun liuokseen sellaisella nopeudella, että lämpötila pysyi -25°C:ssa. Seosta sekoitettiin sitten yksi tun- o ti nostaen lämpötila vähitellen -lO C:een. Ylimäärin jääkylmää nat-riumbikarbonaattiliuosta lisättiin sitten ja orgaaninen faasi erotet-

II

27 641 62 tiin. Vesifaasi uutettiin metyleenikloridilla ja yhdistetyt orgaaniset faasit pestiin vedellä, kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin. Jäännöksen toistettu kromatografia antoi haluttua eetteriä (e20).

IR (kalvo) (ei OH-absorptiota), 1800, 1745 ja 1700 cm Ohutlevykromatografiset ominaisuudet yhdenmukaiset kaavan kanssa.

B. 9-O-N-metyyliaminoetyyliklavulaanihapon valmistus H /C02CH2C6H5 ! CHo-0-CHo-CHo-N -----> i 0 . 2 2 2 \ -/ CH, _N / H © CH2-0-CH2-CH2-NH (CH3) 2 C°2C!I2C6B5 rT’V.r.r/ (e20) N.^/ ° ' 0 (e24) C02 ^

Bentsyyliesterin (e20) (90 mg) liuosta tetrahydrofuraanissa (5 ml) ja vedessä (1 ml) hydrattiin 10 %:sella palladium-puuhiilellä (30 mg) 15 minuuttia. Katalyytti poistettiin suodattamalla ja pestiin vedellä. Yhdistetyt suodatteet haihdutettiin tetrahydrofuraanin poistamiseksi ja vesiliuos uutettiin sen jälkeen kaksi kertaa etyyliasetaatilla. Vesiliuos haihdutettiin ja jäännös puhdistettiin pilarikromatografoimalla (Whatman-selluloosajauhe CC31 käyttäen eluoimisaineena 4:1:1 butanoli:vesiretanoliseosta) halutun tuotteen aikaansaamiseksi (e24) (15 mg).

IR (CHC13): 1790 ja 1620 cm”1.

NMR (D2<D) yhtäpitävä kaavan kanssa.

28 641 62

Esimerkki 12 A. Bentsyyl1-9-0-(3-hydroksipropyyli)klavulanaatin valmistus

^ OH OH H

0 2 , CH2-0-CH2-CH2-CH2-0H

/ ______a ! \=/ i—n ..y - 1 / 0 \ C02CH2C6H5 ° CO-CH-C-H.

(el) (622) 2 2 6 5 (i) Ν,Ο-bls-(bentsyylioksikarbonyyli)-3-aminoprcpanoli Bentsyyliklooriformiaattia (47 ml) lisättiin tipoittain sekoitettuun liuokseen, jossa oli 3-aminopropanolia (11,4 ml) py-ridiinissa (150 ml) 0°C:ssa. Seosta sekoitettiin sitten huoneenlämpötilassa yli yön. Tämä kaadettiin jääveteen (300 ml) ja uutettiin etyyliasetaatilla (3 x 200 ml). Orgaaninen uute pestiin kloorivetyhapolla (5-M, 3 x 400 ml), kuivattiin vedettömällä natriumkarbonaatin ja magnesiumsulfaatin seoksella ja haihdutettiin, jolloin saatiin haluttua yhdistettä öljynä joka oli hieman dimetyylikarbonaatin saastuttama, (30,23 g).

(ii) N-nitroso-N,Q-bis-(bentsyylioksikarbonyyli)-3-aminopropanoli Vedetöntä natriumasetaattia (45 g) lisättiin hiilitetrakloridiin (150 ml) 0°C:ssa ja seos jäähdytettiin -20°C:een, minkä jälkeen se lisättiin liuokseen, jossa oli typpidioksidia (24,1 g) hiili-tetrakloridissa (150 ml). Liuos, jossa oli N,O-bis-(bentsyylioksikarbonyyli) -3-aminopropanolia (30,23 g) hiilitetrakloridis-sa (150 ml), lisättiin sekoitettuun seokseen -5°C:ssa, minkä jälkeen sitä sekoitettiin 0°C:ssa 0,5 tuntia. Reaktioseos pestiin natriumbikarbonaatin vesiliuoksella (2 x 400 ml), kuivattiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin haluttu yhdiste öljynä (31,23 g), = „ (nestekalvo) , 1750, 1510, 1400, 1260, 1 125 ja 1035.

ITlclX

(iii) Bentsyyli-9-O-(3-bentsyylioksikarbonyylioksipropyyli) klavulanaatti

Pyrrolidiinia (4,94 ml) lisättiin liuokseen, jossa oli N-nitroso-N, O-bis-(bentsyylioksikarbonyyli)-3-aminopropanolia (31,22 g) (0,056 moolia seoksessa) metyleenikloridissa (100 ml), -20°C:ssa 15 minuutin aikana, jolloin saatiin 3-diatso-O-bentsyylioksikarbonyylipro-panolin liuos, v v (CH0C1~) 2030 cm Tätä liuosta pidettiin ^ lUcLX /

Oi:ssa searaavaa vaihetta varten.

l! 29 6 4 1 62

Booritrifluoridieteraattia (1 ml) lisättiin liuokseen, jossa oli bentsyyliklavulanaattia (3 g) metyleenikloridissa (150 ml) -30° C:ssa. Yllä valmistettu 3-diatso-O-bentsyylioksikarbonyylipro-panolin liuos lisättiin seokseen -30°C:ssa ja liuosta sekoitettiin -30- -10°C:ssa tunnin ajan. Tämä pestiin natriumbikarbonaatin vesiliuoksella (2 x 200 ml), kuivattiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin öljy, joka kromatografoitiin piihappogeelillä (80 g). Kolonnin eluointi sykloheksaanin ja etyyliasetaatin seoksella tuotti otsikon yhdistettä (e22) (1,5 g), 6 (CDClj) 7,36 (10H, s, ArH), 5,70 (1H, d, J = 2,5Hz, 5-CH), 5,18 (4H, s, CH2Ph), 5,13 (1H, m, 3-CH), 4,84 (1H, leveä t, J = 8Hz, 8-CH), 4,26 (1H, t, J = 6Hz, CH2CH2OCBz) , 4,06 (1H, d, J = 8h'z, 9-CH2), 3,60-3,26 (4H, m, 0-CH2CH2 ja 6a-CH), 3,02 (1H, d, J = 18Hz, 68-CH) ja 1,86 (1H, m, CH2CH2CH2) .

B. Natrium-9-Q-(3-hydroksipropyyli)klavulanaatin valmistus

H H

__,0 /CH2-0-CH2-CH2-CH2-0H o CH2-0-CH2~CH2-CH20H

i r \=/ —r v--/ O o ' C0oCHoCcHc 2 265 CO-Na (e22) 2

Seosta, jossa oli bentsyyli-9-0-(3-bentsyylioksikarbonyyli-oksipropyyli)-klavulanaattia (0,5 g) ja natriumbikarbonaattia (0,05 g) tetrahydrofuraanin ja veden seoksessa (S = 1, 12 ml), hydrattiin huoneenlämpätilassa ja paineessa 15 minuuttia, kun läsnä oli 10 %:sta palladiumhiilikatalyyttiä (0,3 g). Seos suodatettiin ja suodos haihdutettiin, jolloin saatiin öljy, joka jaettiin veden ja etyyliasetaatin kesken. Vesijae pakas-tekuivattiin, jolloin saatiin otsikon yhdistettä, jolla on yhdenmukainen NMR-spektri.

30 641 62

Esimerkki 13 A. Etyyliklavulanaatin O-etyylieetterin valmistus ,-n CH-OH ___O CH-OH -i j CH2OC2H5

| I W H2/kat.^ I | V/ c2h4n I y=J

^-N —/ 0^ 0 C02CH2Ph C02H C02C2H5

Bentsyyliklavulanaattia (1,5 g, 5,2 moolia) lisättiin suspensioon, jossa oli 10 %:sta palladium-hiilikatalyyttiä (0,4 g, Johnson and Matthey Type 87L) metanolissa (10 ml, lisätty kiinteän hiilidioksiditabletin lisäyksen jälkeen) ja seosta hydrattiin normaalipaineessa 30 minuuttia. Katalyytti poistettiin suodattamalla seliittikerroksen läpi, pestiin metano-lilla (5 ml) ja liuos jäähdytettiin (jää/vesihaude).

Oiatsoetaani valmistettiin lisäämällä N-etyyli-N'-nitro-N-nitroso-guanidiinia (6,1 g, 37 moolia) sekoitettuun seokseen, jossa oli kaiiumhydroksidin 50 %:sta vesiliuosta (7 ml) ja eetteriä (35 ml) -10°:ssa 30 minuutin aikana. Eetteriliuos erotettiin dekantoimalla ja kaadettiin kuivassa naarmuuntu-mattomassa pullossa olevien kaliumhydroksidipillerien (1,7 g) päälle. Vesipitoiseen reaktioseokseen lisättiin eetteriä (10 ml) ja sekoitettiin -10°:ssa 10 minuuttia. Tämä eetteri-liuos erotettiin myös dekantoimalla ja kaadettiin jää/vesihau-teella jäähdytetyssä pullossa olevien alkalihydroksidipille-rien päälle.

li 31 64162

Diatsoetaanin yhdistetyt eetteriliuokset lisättiin sekoittaen yhtenä annoksena klavulaanihapon metanoliliuokseen 0°:ssa. Typen kehittymisen jälkeen oranssinvärinen väri häipyi ja vaaleanvä-rinen liuos säilytettiin yön yli 0°:ssa lasitulpalla varustetussa 'Clearfit' pullossa.

Lisättiin yksi tippa jääetikkahappoa ja liuotin tislattiin pois alennetussa paineessa ja lämpötilassa ^20°. Saadusta oranssinvärisestä öljystä liuotinjäännökset poistettiin suurtyhjössä (1,35 g) .

Kromatografointi

Kromatografiapylväs valmistettiin suspendoimalla Kieselgel 60 (30 g) sykloheksaanin ja etyyliasetaatin (2:1) seokseen. Suspensio kaadettiin lasipylvääseen (halkaisija 40 ran, johon oli sovitettu sint-rattu lasilevy), jolloin ylimääräinen liuotin valui pois. Raaka esteri (l,35g) 'liuotettiin* 2:1 seokseen (5 ml) ja 2-faasiliuos lisättiin pylvään yläosaan, jota seurasi sykloheksaani:etyyliase-taattilisäys (kaiken kaikkiaan 400 ml 2:1 seosta). Sarja 25 ml:n jakeita otettiin talteen pienen ilmanpaineen avulla, joista jokaisesta otettiin pieni näyte joka aplikoitiin ohutkerroskroraatografi (TLC) levylle (0,25 nm paksu kerros Kieselgel 60.1*254) * TLC-levyt käsiteltiin metyyliasetaatin, etyyliasetaatin ja metyylisyklopentaanin seoksella (1:1:2), ilmakuivattiin ja ruiskutettiin kaliumpermanganaatin liuoksella. Muodostuneiden täplien Rp-arvot verrattiin etyyliklavulanaatin etyylieetterin standardi-näytteen (valmistettu trietyoksoniumtetrafluoroboraatin ja etyyli-klavunaatin välisellä reaktiolla) R^-arvojen kanssa, Rp tässä systeemissä oli 0,54.

Kaikki eluenttijakeet, jotka osoittivat halutun esterin läsnäolon, yhdistettiin ja liuotin poistettiin tislaamalla alennetussa paineessa ja lämpötilassa < 20°. Saadusta vaaleanvärisestä öljystä liuotinjäännökset poistettiin suurtyhjössä (0,11 g).

Pystytettiin pieni kromatografiapylväs (5 g Kieselgel 60 suspensio 2:1 sykloheksaani:etyyliasetaatissa, halkaisijaltaan 10 mm:sessä pylväässä) ja kertaalleen puhdistetun esterin liuos (0,11 g 0,5 ml:ssa 2:1 sykloheksaani:etyyliasetaatti-seosta) kaadettiin pylvään yläosaan. Se eluoitiin kaatamalla lisää 2:l-liuosta pienen ilmanpai- 32 641 62 neen avulla ja sarja 1 ml:n jakeita otettiin talteen.

Näyte jokaisesta jakeesta tutkittiin ohutkerroskromatografiällä kuten edellä. Kaikki jakeet, jotka osoittivat etyyliklavulanaa-tin etyylieetterin läsnäolon, muttei muita merkittäviä vyöhykkeitä, yhdistettiin ja liuotin poistettiin tislaamalla alennetussa paineessa ja lämpötilassa <20°. Saatu vaaleanvärinen öljy (55 mg) 4,3 % teoreettisesta saannosta) tutkittiin NMR-spektroskopisesti: NMR (CDCl^) 1,18 ja 1,27 (6H, 2t, J=7Hz, eetteri ja esteri -CH^CH^) 2,99 (1H, dd, J=16Hz, J'=lHz, 6&-CH) 3,42 (2H, q, J=7Hz, OCH2CH3) 3,43 (1H, dd, J=16Hz, J'=2,5 Hz, 6a-CH) 4,03 (2H, d, J=8Hz, CH2OCH2CH3) 4,10 (2H, q, J=7Hz, C02CH2CH3) 4,81 (1H, brt, J=8Hz, olefiininen CH) 4,99 (1H, m, 3-CH) 5,636 (1H, dd, J=2,5Hz, J'=lHz, 5-CH).

B. Lltiumklavulanaatin O-etyylleetterin valmistus ,_O ,CH2OC2H5 __^0 ,CH2OC2H5

j W + LiOH pH 9-5· i W

0 0^—N-^/ COjCjHj C0,Li

Puhdistettu etyyliklavunaatin etyylieetteri (51 mg, 0,2 mmoolia) liuotettiin uudelleentislattuun tetrahydrofuraaniin (5 ml) ja laimennettiin vedellä (30 ml) . Samentunut liuos titrattiin 1,0M litiumhydroksidiliuoksella 'Metrohm pH-Stat'-laitteella vakio pH-arvossa 9,5. Kun oli lisätty 0,20 ml LiOH-liuosta (0,2 mmoolia) 30 minuutin aikana, pH stabiloitui ja liuos tuli kirkkaaksi. Liuottimet poistettiin tislaamalla alennetussa paineessa ja lämpötilassa^20°, jolloin otsikkoyhdiste saatiin keltaisena, kumimaisena kiinteänä aineena (48 no, 86%)? * IR (KBr kiekko) 1785, 1770, 1615 cm"1; NMR (D20) 1,08 (3H, t, J=7Hz, OCH2CH3) 3,00 (1H, dd, J=16Hz, J’=lHz, 6g-Op 3,46 (2H, q, J=7Hz, OCH2CH3)^3,5 (1H, dd, J=16Hz, J'=2,5 Hz, 6ct-CH) 4,03 (2H, d, J=8Hz, CH2OCH2CH3) ~ 4,8 (1H, olefiinisen CH signaalin peittämä, 3-CH) 4,88 (1H, brt, J=8Hz, olefiininen CH) 5,48Λ (.lii, dd, J-2,5Hz, J' = 1 Hz, 5-CH) .

li 33 6 4 1 62

Esimerkki 14 A. Bentsyyli-9-O-metoksimetyyliklavunaatti

H 0 H

, CH-OH CH-OCH-OCH 0 i" "j y * -1 \ / £ l ά 0 n · ’ r-'^y C°2CH2C6H5 'C02CH2C6H5 (e 1) (e 26)

Bentsyyliklavulanaatti (e 1) (2,89 g, 0,01 moolia), klooridime- tyylieetteri (1,6 ml, 1,7 g ja 2, 4, 6-kollidiini (1,3 ml) liuotettiin 5°C:ssa sekoittaen dikloorimetaaniin (20 ml). 1 tunnin kuluttua 10°C:ssa TLC osoitti bentsyyliklavulanaatin hävinneen lähes täysin. Lisättiin vettä (50 ml) ja seosta ravistettiin ja erotettiin (vesiliuos oli vahvasti hapan). Dikloorimetaani-kerrokseen lisättiin natriumbikarbonaatin 3 %:sta vesiliuosta (50 ml). Orgaaninen faasi erotettiin, kuivattiin (Na2S04), suodatettiin, käsiteltiin piihapolla (5 g), suodatettiin, haihdutettiin pieneen tilavuuteen ja pylväskromatorgarfoitiin silikagee-lillä käyttäen etyyliasetaattia ja sykloheksaania eluointiaineena. Tuote eristettiin vaaleankeltaisena öljynä (1 g).

v (kalvo); 1803, 1753, 1700 cm (C=C).

IDoX

6 (CDC13): 3,01 (1H, bd, J 17Hz, 6-g-CH), 3,33 (3H, s, 0CH3) , 3,50 (1H, dd, J 3 ja 17 Hz, 6-a-CH), 4,14 (2H, bd, J 7Hz, CHCH20), 4,57 (3H, s, CH30), 4,86 (lH, bdt, J 7 ja 1,5Hz, CH=), 5,10 (1H, d, J 1,5Hz), 5,69 (lH,bd, J 3Hz, 5-CH), 7,36 δ (5H, s, W · B. Litium-9-O-metoksimetyyliklavulanaatti

H H

,______'^ °\ CH-OCH-OCH., J/Ό CH-OCH-OCH, (e 26U.| j \_ / 1 -—> --j \ 2 2 3 n-ns/ n\/ o o CO-H CO-Li (e 27) * (e 28) * 34 6 4 1 62

Bentsyyli-O-metoksimetyyliklavulanaattia (e26) (0,7 g) tetra- hydrofuraania (7 ml) sisältävässä vedessä (0,5 ml) hydrattiin 10 %:sella palladiumhiilikatalyytillä (0,2 g) 1 tunnin ajan, jolloin saatiin yhdisteen (e27) liuos. Katalyytti poistettiin suodattamalla ja suodokseen lisättiin vettä (10 ml), neutraloitiin 1 M litiumhydroksidiliuoksella pH-arvoon 7,0 ja haihdutettiin kuiviin, jolloin muodostui värittömiä kiteitä, jotka trituroi-tiin asetonilla ja suodatettiin, pestiin eetterillä ja ilmakui-vattiin, jolloin saatiin 0,45 g otsikkoyhdistettä (e28).

max (nujol mull): 1785, 1705, 1617 cm 6 (D20): 2,98 (1H, d, J 17Hz, 60-CH), 3,43 (1H, dd, J 17 ja 3Hz, 6-ot-CH) , 4,07 (2H, d, J 8Hz, 9-CH2) , „ 4,5 (HOD:n alla, 0CH20) , 4,79 (1H, t, J 8Hz, 8-CH=), 4,83 (1H, s, 3-CH), 5,61 (1H, d; J 3Hz, 5-CH) .

Esimerkki 15 A. Bentsyyli-9-O-etoksimetyyliklavulanaatti

H H

I-. CH„OH -‘^°\ , CH_OCH0OC_H[- 1 2 _, ' W 2 2 2 5 *-N'-/ 0 C02CH2C6H5 C02CH2C6H5 (el) (e29)

Bentsyyliklavulanaatin (el) (5,78 g), 2, 4, 6-kollidiinin (5,8 ml) ja kloorimetyylietyylieetterin (3,7 ml) liuosta dikloorimetaanis-sa (100 ml) sekoitettiin huoneenlämpötilassa 2 tunnin ajan. Reaktioseos pestiin sitten laimennetulla suolahapolla (2m, 100 ml), kuivattiin vedettämällä natriumkarbonaatti-magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin öljy, joka kromatogra-foitiin silikageelillä (50 g). Pylväs eluoitiin sykloheksaani-etyyliasetaatilla, jolloin saatiin otsikkoyhdistettä (e29) (6,15 g) öljynä.

ZäJ^0 + 45,2° (c, 1,0 CHC13) .

v max (CHC13): 1810, 1755, 1705, 1310, 1190, 1030 cm-1, δ (CDC13): 7,28 (5Hs, ArH), 5,61 (1H, d, J-2,5Hz, 5-CH), 5,13 (2H, s, -CH2Ar), 5,03 (1H, leveä s, 3-CH), 4,78 (1H, leveä t, J=8Hz, 8-CH), 4,56 (2H, s, -0CH20-), 4,09 (2H, leveä d, J=8Hz, 35 6 4 1 62 9-CH2), 3,52 {2H, g, J=7,5Hz, -OCH^CH-j) , 3,41 (1H, dd, J=17Hz, J=2,5Hz, 6ot-CH), 2,99 (1H, d, J=17Hz, 6$-CH), 1,18 (3H, t, J= 7,5Hz, OCH2CH3).

(Saatu analyysillä: C 62,2, H 6,15, N 3,8 %

Cl8H21N06vastaa: C 62,25, H 6,1, N 4,05 %) B. Litium-9-O-etoksimetyyliklavulanaatti H - o ch2och2oc2h5 __CH,0CH,0CoH. . I ! \- ./ : '' . / 2 2 2 5 - i_N , ' ------N , ../ 0 0 (e29) C02CH2C6H5 <e30, C°2L1

Bentsyyli-9-O-etoksimetyyliklavulanaatin (e29) (5,95 g) liuos ta tetrahydrofuraanissa (80 ml) ja vedessä (2 tippaa) hydrattiin huoneenlämpötilassa ja normaalipaineessa 10 %:sen palladium-hiilikatalyytin (3,35 g) läsnäollessa 1/2 tunnin ajan. Seos suodatettiin, sitten suodos laimennettiin vedellä (250 ml) ja neutraloitiin pH-arvoon 7,2 litiumhydroksidin vesiliuoksella (IM). Sitten seos haihdutettiin kuiviin ja jäännöstä tritu-toitiin eetterillä, jolloin saatiin otsikkoyhdistettä (e30) (4,4 g) .

/q720 + 34,8° (c, 1,0 H20).

v (KBr): 1780, 1700, 1620, 1320 ja 1030 cm"1.

(CD20): 5,70 (1H, d, J=2,5Hz, 5-CH), 4,90 (1H, s, 3-CH), 4,88 (1H, leveä t, J=8Hz, 8-CH), 4,68 (2H, s, -0CH20-), 4,17 (2H, d, J=8Hz, 9-CH2), 3,58 (2H, q, J=8Hz, -OCH2CH3), 3,52 (1H, dd, J=17Hz, J'=2,5Hz, 6a-CH), 3,04 (1H, d, J=17Hz, 63-CH), 1,13 (3H, t, J=8Hz, -och2ch3).

Esimerkki 16 A. Bentsyyli-9-O-(1-etoksi)prop-l-yyliklavulanaatti H 0-CH2-CH3 . CH„OH O CH„-OCH-CH0-CH^ ! ! V/ --------? : ( \ ./ / · N /— N ./ ti o CO OI C Ilr CO.,CI10C Hr 2 2 f, j 2 2 0 5 (Cl) (o31) 36 641 62

Bentsyyliklavulaanaatin (el) (578 mg) ja etyylipropenyylieette-rin (0,3 ml) sekoitettuun liuokseen etyyliasetaatissa (10 ml) lisättiin p-tolueenisulfonihappoa (5 mg). Seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 1,5 tunnin ajan ja johdettiin sitten lyhyen silikageelipylvään läpi eluoimalla etyyliasetaatilla. Liuottimen poistamisen jälkeen tuote eristettiin pylväskromatografi-alla käyttämällä gradienttieluointia (silikageeli, 3:1 sykloheksaani-etyyliasetaatista siirryttiin 1:1 sykloheksaani-etyyliasetaattiin), jolloin saatiin bentsyyli-9-O-(1-etoksi)-prop-l-yyliklavulanaattia (e31) (601 mg).

v max (kalvo): 1805, 1750 ja 1700 cm”3.

6 (CDC13): 0,88 (3H, t, J=7Hz), 1,17 (3H, t, J=7Hz), 1,60 (2H, leveä kvintetti, J=7Hz, 2,99 (1H, d, J=17Hz), 3,44 (1H, dd, J= 3 ja 17 Hz), 3,54 (2H, q, J=7Hz), 4,0-4,2 (2H, m), 4,36 (lH, t, H=6Hz), 4,79 (1H leveä t, J=7Hz), 5,05 (1H, s), 5,15 (2H, s), 5,63 (1H, d, J=3Hz), 7,29 (5H, s).

B. Natrium-9-O-(1-etoksi)prop-l-yyliklavulanaatti H °~CH2~CH3 0-CH2-CH3 _' CH2-0-CH-CH2-CH -CH0-O-Qi-CH,.-CH^ ' \-_V —> I \ ./ 2 2 3 \ (e31) 002CH2C6H5 (e32) C02Na

Bentsyyli-9-O-(1-etoksi)prop-l-yyliklavulanaatin (e31) (572 mg) ja natriumbikarbonaatin (128 mg) liuosta tetrahydrofuraanissa (22,5 ml) ja vedessä (7,5 ml) hydrattiin 10 %:sella palladium-hiilikatalyytillä (250 mg) 1 tunnin ajan. Liuos suodatettiin seliitin läpi, laimennettiin vedellä ja tetrahydrofuraani poistettiin rotaatiohaihduttimella. Vesiliuos uutettiin etyyliasetaatilla ja pakastekuivattiin, jolloin saatiin natrium-9-0-(l-etok-si) prop-l-yyliklavulanaattia (e32) (370 mg).

v max (KBR): 1785, ja 1615 cm 3.

ö (D20): 0,85 (3H, t, J=7Hz), 1,16 (3H, t J=7Hz), 1,59 <2H, leveä kvintetti, J=7Hz), 3,05 (1H, d, J=17Hz), 3,4-3,85 (4H, m), 4,19 (2H, d, J=7Hz), 4,90 (1H, leveä t, J=7Hz), 4,93 (1H, s).

5,71 (1H, d, J=3Hz).

li 38 6 4 1 62 kastekuivattiin, jolloin saatiin otsikkoyhdistettä (e36) (447 mg) .

v max (KBr-kiekko): 1780, 1690, 1610 cm ^.

δ (D20): 0,84 (3H, tripletti, J=8Hz), 1,20 (3H, dupletti J=5Hz), 1,15-1,65 (4H, multipletti), 3,01 (1H, dupletti, J=18Hz), 3,45- 3,7 (3H, multipletti), 4,15 (2H, dupletti, J=8Hz), 4,65-4,95 (3H, multipletti), 5,68 (1H, dupletti, J=3Kz).

Esimerkki 19

. 4-metoksibentsyyli-9-0-(1-etoksi)etyyliklavulanaatti H

I H ' ./O CH^OH i,0 CH„-0-CH-0-CHoCH? l W „ I I V=/

--j__N X

O'^ 0 X

(e37) C°2CH2C6H4OCH3 (e38) C02”CH2-/ -OCH-.

/ ^ p-metoksibentsyyliklavulanaatin (e37) (1,5 g) ja vinyylietyyli- eetterin (1 ml) liuokseen etyyliasetaatissa (15 ml) lisättiin p-tolueenisulfonihappoa (25 mg). Seosta sekoitettiin 15 minuutin ajan ja johdettiin sitten lyhyen kiselgel G pylvään läpi eluoimalla etyyliasetaatilla. Liuotin poistettiin tyhjiössä ja tuote eristettiin pylväskromatografiällä (kiselgel G, 3:1 sykloheksaani: etyyliasetaatti eluenttina), jolloin saatiin otsikkoyhdistettä (e38) (1,26 g).

v max (kalvo): 1805, 1750, 1700 cm δ (CDC3D : 1,16 (3H, tripletti, J=8Hz), 1,27 (3H, dupletti, J=5Hz), 2,97 (1H, dupletti, J=17Hz), 3,25-3,7 (3H, multipletti), 3,75 (3H, singletti), 4,0-4,15 (2H, multipletti), 4,5-4,85 (2H, multipletti), 5,0 (1H, singletti), 5,07 (2H, singletti), 5,60 (1H, dupletti, J=3Hz), 6,80 (2H, dupletti, J=9Hz), 7,21 (2H, dupletti, J=9Hz) .

. Natrium-9-0-(1-etoksi)etyyliklavulanaatti CH3

H CH3 H J

_'^O CH--0-CH9-0-CH9CH^ -\^°\ CH2"°“CH“°”CH2CH3 ! 1 —> ί >.-/ j__N / J_N / 0 C02CH2C6H40CH3 0 ' C02Na (e38) (e39) 37 641 62

Esimerkki 17

Natrium-9-O-metoksimetyyliklavulanaatti

H H

! -O CH-OCH-OCH.. · Ä CHo0CHo0CH^ l-f \ 2 2 3 .-^Ov 2 2 3 ! i > - / li NV --> J_N /

° X

(e33) C02CH2C6H40CH3 (e34) SC02Na p-metoksibentsyyli-O-metoksimetyyliklavulanaatti (e33) (6,0 g) liuotettiin etanoliin (60 ml) painepullossa. Lisättiin natriumbikarbonaattia (1,39 g) liuotettuna veteen (8 ml). Pullo huuhdeltiin typellä ja siihen lisättiin 10 %:sta palladium-hiilika-talyyttiä (0,75 g, Johnson Matthey Type 76/L) . Seosta hydrat-tiin sitten paineessa 1,8 at 1 tunnin ajan. Ohutkerroskromatogre fia (Merck silikageeli, etyyliasetaatti/kloroformi 50/50) osoitti että hydrogenolyysi oli täydellinen, ja seos suodatettiin selii-tin läpi, joka pestiin vedellä (10 ml). Suodos haihdutettiin rotaatiohaihduttimella, jolloin saatiin kumimainen aine, joka liuotettiin asetoniin (10 ml) ja tähän liuokseen lisättiin voimakkaasti ravistaen kuivaa dietyylieetteriä (900 ml). Tällöin saatiin hieno valkoinen sakka. Suspensio jäähdytettiin 4°C:ssa 2 tunnin ajan ja suodatettiin sen jälkeen. Kiinteä aine pestiin eetterillä (2 x 100 ml) ja kuivattiin välittömästi pien-tyhjiöeksikaattorissa, jolloin saatiin ostikkoyhdistettä (e34) hydroskooppisena, vaaleankeltaisena jauheena (2,1 g).

Esimerkki 18

Natrium-9-0-(1-butoksi)etyyliklavulanaatti

H /*3 H CH

-i/0\ /3½-0-0^ _I/O CH2-0-CH·^ 3 N OCH2ai2CH2CH3 » ! Y=/ XNOC^CH2CH2ai3 <r~ ^ (e35) C02CH2C6H40CH3 (e36) VC02Na 4-metoksibentsyyli-9-0-(1-butoksi)etyyliklavulanaatin (e35) (800 ja natriumbikarbonaatin (160 mg) liuosta tetrahydrofuraanin vesi-liuoksessa (5 ml vettä, 25 ml tetrahydrofuraania) hydrattiin 20 minuutin ajan 10 %:sella palladium-hiilikatalyytiliä (400 mg). Liuos suodatettiin ja suurin osa tetrahydrofuraanista poistettiin tyhjiössä. Vesiliuos uutettiin kahdesti etyyliasetaatilla ja pa-

II

39 641 62 4-metoksibentsyyli-9-0(1-etoksi)etyyliklavulanaatin (e38) (1,185 g) ja natriumbikarbonaatin (254 mg) liuosta tetrahyd-rofuraanin vesiliuoksessa (5 ml vettä, 25 ml tetrahydrofuraania) hydrattiin 10 %:sella palladiumhiilikatalyytillä (400 mg) 25 minuutin ajan. Liuos suodatettiin seliitin läpi ja haihdutettiin tyhjiössä kunnes suurin osa tetrahydrofuraanista oli poistunut. Vesiliuos uutettiin kolmella etyyliasetaattierällä ja pakastekuivattiin. Tuote puhdistettiin pylväskromatografisesti (kiselgel G, 4:1:1 n-butanoli:etanoli:vesi) jolloin saatiin otsik-koyhdistettä (e39) (589 mg).

v max (KBr): 1795, 1695, 1615 cm”1.

δ (D20): 1,23 (3H, tripletti, J=8Hz), 1,34 (3H, dupletti, J=6Hz), 3,11 (1H, dupletti, J=18Hz), 3,45-4,0 (3H, multipletti), 4,25 (2H, dupletti, J=8Hz), 4,75-5,1 (3H, multipletti), 5,77 (1H, dupletti, J=3Hz).

Esimerkki 20

9-O-metoksimetyyllklavulaanihappo H

H n CH,OCH,OCH,

_^ 0^ CH2OCH2OCH3 __^ I Y

: I >::/ J-' 0 n' v

Voii C02H

(e28) cu2Jj1 (e40) *

Litium-9-0-metoksimetyyliklavulanaatin (0,43 g) liuokseen vedessä (25 ml) joka oli peitetty etyyliasetaatilla (50 ml) ja jota oli sekoitettu, lisättiin vahvaa happoioninvaihtohartsia IR 120 (H+-muoto) kunnes vesikerroksen pH oli < 2,0 (noin 20 ml märkä-hartsia). Seos suodatettiin ja suodos erotettiin. Vesikerros uutettiin 3 x 30 ml:n erillä etyyliasetaattia. Etyyliasetaatti-uutokset yhdistettiin, kuivattiin nopeasti molekyyliseuloilla (3A, 30 g), suodatettiin ja haihdutettiin alennetussa paineessa rotaatiohaihduttimella, jolloin saatiin 0,3 g otsikkoyhdistettä öljynä.

IR (kalvo): v max: 2500-3600 (mkt leveä), 1805, 1750, 1695 cm 1. NMR <CDCl3) δ: 3,00 (1H, d, J 17Hz, β-β-CH), 3,33 (3H, s, OCH-j) , 3,45 (1H, dd, J 2,5 ja 17Hz, 6-a-CH), 4,13 (2H, d, J 7Hz, 9-CH2), 4,58 (2H, s, 0CH20), 4,88 (1H, t, J 7Hz, 8-CH), 5,01 (1H, s, 3-CH), 5,63 (1H, d, J 2,5Hz, 5-CH).

Claims (7)

1. 40 641 62
2. 1. Menetelmä bakteereja tappavasti ja [l-laktamaasi-inhibiittoreina vaikuttavien klavulaanihapon eettereiden tai niiden alkali- tai maa-alkalimetallisuolojen valmistamiseksi, joilla yhdisteillä on kaava II: H ___1^0 CH -0-R il. / Z ! ii S---- 0 co2H f jossa R on enintään 18 hiiliatomia sisältävä alkyyli; C^_^-alkenyyli; bentsyyii, jonka 4-asemassa voi olla subs- tituenttina halogeeni, nitro, C^^-alkyyli tai C^^-alkok- si; syano-C- .-alkyyli; C -alkoksikarbonyvli-C -alkvyli; karboksi-C- ,- 1_4 1 -4 " alkyyli tai sen suola; asetonyyli; hydroksi-C^_^-alkyyli; di-C^_jj-alkyyliamino-C1 _4~alkyyli tai enintään 8 hiiliatomia sisältävä hiilivetyryhmä, jossa on substituenttina ryhmä OR1, jossa R on _4~alkyyli, tunnettu siitä, että yhdiste, jolla on kaava IIA H ’O CH -O-R rT w o co2a jossa R tarkoittaa samaa kuin edellä ja A on in vivo hydrolysoituva esteriryhmä, bentsyyii, joka mahdollisesti on substituoitu, tai C^^-alkyyli, de-esteröidään joko hydraa-malla katalyyttisesti sopivassa liuottimessa, jolloin saadaan vapaa happo, joka haluttaessa muutetaan alkali- tai maa-alkalimetallisuolaksi, tai emäksisesti hydrolysoimalla, jolloin saadaan suoraan vastaava suola.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä klavulaanihapon C^_4-alkyyli- tai bentsyylieetterin valmistamiseksi, t u n - 41 64162 n e t t u siitä, että käytetään sellaista kaavan HA mukaista lähtöainetta, jossa R on C^_^-alkyyli tai bentsyyli.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä klavulaani-hapon metyylieetterin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että käytetään sellaista kaavan IIA mukaista lähtöainetta, jossa R on metyyli.
5. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä klavulaani-hapon etyylieetterin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että käytetään sellaista kaavan IIA mukaista lähtöainetta, jossa R on etyyli.
6. 5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kalsiumsuola.
7. 1. Förfarande för framställning av antibakteriellt och som (5-laktamasinhibitorer verksamma etrar av klavulansyra eller alkali- elier jordalkalimetallsalter därav, vilka föreningar har formeln II: H ! ^ 0 CHo-0-R ' Γ v / o Sco2h väri R Mr alkyl med upp tili 18 kolatomer; _4-alkenyl; bensyl, som i 4-stälining kan vara substituerad med halogen, nitro, C-j^-alkyl eller C^_^-alkoxi; cyano-C^-alkyl; C^_4~ alkoxikarbonyl-C^_4~alkyl; karboxi-C^_4-alkyl eller ett sait därav; acetonyl; hydroxi-C1_4-alkyl; di-C^_4-alkylamino-C1_4~ alkyl eller en kolvätegrupp med upp tili 8 kolatomer substituerad med en grupp 0r\ väri R^ är C^_4-alkyl, k ä n n e -t e c k n a t av att en förening med formeln IIA: