FI120305B - Menetelmä uuden terapeuttisesti käyttökelpoisen (S,S,S)-N-(1-[2-karboksi-3-(N2-mesyylilysyyliamino)propyyli]-1-syklopentyylikarbonyylityrosiinin kiteinen alfa-polymorfisen muodon valmistamiseksi ja menetelmässä käytettäviä välituotteita - Google Patents

Description

Menetelmä uuden terapeuttisesti käyttökelpoisen (S,S,S)-N-(1- [2-karboksi-3- (N2-mesyylilysyyliamino)propyyli] -1-syklo-pentyylikarbonyylityrosiinin kiteisen a-polymorfisen muodon valmistamiseksi ja menetelmässä käytettäviä välituotteita 5

Esillä oleva keksintö koskee uuden terapeuttisesti käyttökelpoisen kaavan (I) mukaisen (S, S, S)-N-(1-[2-karbok-si-3- {N2-mesyylilysyyliamino)propyyli] -1-syklopentyylikar-bonyy1i tyros i inin yHS02CH3

/OH

h,n HN^ - (I) ho2c'^v^>x:onh'^'co2h 10 kiteisen, α-polymorfisen muodon (a-muoto) valmistusta. Keksintö koskee myös valmistuksessa käytettäviä välituotteita .

Kaavan {I) mukaisen yhdisteen amorfinen muoto ("β-15 muoto”} on tuotu esille EP-hakemusjulkaisu nro 0 358 398 Esimerkkinä 181. Yhdiste on tehokas sinkistä riippuvaisen neutraalin endopeptidaasin, E.C.3.4.24.11, estäjä ja voi siten voimistaa eteisen natriureettisen tekijän biologisia vaikutuksia. Se on siten natriureettinen, verenpainetta 20 alentava ja diureettinen aine, joka on käyttökelpoinen erilaisten kardiovaskulaaristen häiriöiden hoidossa. Yhdiste on myös tehokas angiotensiinia muuttavan entsyymin estäjä, entsyymin, joka myös on mukana verenpaineen säätelyssä. Yhdisteellä on siten kaksinkertainen farmakologinen vaikutus, 25 koska se pystyy estämään kahta verenpaineen säätelyyn osallistuvaa pääentsyymiä. Siten se on todennäköisesti käyttökelpoinen hoidettaessa erilaisia verenpainetaudin muotoja ja siihen liittyviä kardiovaskulaarisia häiriöitä, kuten verentungosta aiheuttavaa sydämen vajaatoimintaa ja glau-3 0 kooma.

2 β-muoto voidaan saada menetelmillä, kuten jäädytys-kuivaamalla kaavan (I) mukaista yhdistettä sisältävä liuos, haihduttamalla nopeasti tällaisen liuoksen liuotin tai sa-ostamalla tällaisesta liuoksesta lisäämällä heikkoa liuo-5 tinta. β-muoto ei sula terävästi, mutta normaalisti se "pehmenee" noin 160 °C:SSa.

β-muodolla on kuitenkin havaittu olevan tiettyjä ominaisuuksia, mistä syystä sen ei ole todettu olevan erityisen sopiva farmaseuttiseen formulointiin. Erityisesti se 10 on hygroskooppinen luonteeltaan, sillä on alhainen kaatoti-heys ja sen valuvuusominaisuudet ovat heikot, β-muodon työstämisessä on tullut esiin ongelmia valmistettaessa tabletteja tätä muotoa sisältävistä koostumuksista.

Esillä olevan keksinnön kohteena on ollut tuottaa 15 kaavan (I) mukaisen yhdisteen tehokkaasti työstettävä muoto, josta saadaan pysyvä ja tehokas lääkeaineformulaatio.

Tähän on päästy havaitsemalla yllättäen, että voidaan valmistaa kaavan (I) mukaisen yhdisteen α-muotoa, joka ei ole hygroskooppinen ja on kiteinen, ja verrattuna β-20 muotoon, sen kaatotiheys on suurempi ja sillä on paremmat valuvuusominaisuudet. α-muoto on erityisesti käyttökelpoinen käytettäväksi lääkeaineen farmaseuttisessa formuloinnissa.

Esillä oleva keksintö koskee siten uuden, terapeut-25 tisesti käyttökelpoisen yhdisteen valmistusta, joka on kaavan (I) mukaisen yhdisteen nhso3ch3

h °H

I—I (I) H02C"^v/^'C0NH^XC03H kiteinen, α-polymorfinen muoto, 3 jolle on tunnusomaista infrapunaspektri (nujolitah-das), jossa näkyvät absorptioviivat arvoilla v = 3 407, 3 386, 3 223, 3 153, 1 699, 1 652, 1 626, 1 594, 1 516, 1 457 (nujoli} , 1 377 (nujoli) , 1 344, 1 334, 1 317, 1 267, 5 1 241, 1 228, 1 210, 1 164, 1 151, 1 137, 1 118, 1 109, 1 093, 1 074, 1 045, 1 019, 1 003, 981, 965, 911, 897, 862, 818, 800, 778, 762, 721, ja 655 crrf1. Kaavan (I) mukaisen yhdisteen kiteistä cx-muotoa voidaan valmistaa siten, että a) hydrataan katalyyttisesti vesiliuosta, jossa on 10 kaavan (il) mukaisen yhdisteen natrium-, kalium-, ammonium-tai Ci-4-alkyyliammoniumsuolaa: n öHSOjCH3 oh j---J (Π) käyttäen sopivaa katalyyttiä, joka kykenee poistamaan bent-syylioksikarbonyylisuojaryhmän, kuten palladioitua hiiltä, 15 sen jälkeen tehdään saatu kaavan (I) mukaisen yhdisteen emässuola happamaksi pH-arvoon 3-5, edullisesti noin pH 4, jolloin saadaan haluttu α-polymorfinen muoto; (b) käsitellään kaavan (I) mukaisen yhdisteen hyd-ratoitua δ-muotoa, jolle on tunnusomaista vesipitoisuus, 20 joka on 1 - 7 paino-%, määritettynä Karl Fischerin menetelmällä, ja infrapunaspektri (nujolitahdas), jossa näkyvät absorptioviivat arvoilla v = 3 667, 3 425, 3 380, 3 287, 3 137, 3 098, 1 709, 1 673, 1 637, 1 619, 1 596, 1 568, 1 556, 1 516, 1 458 (nujoli), 1 448, 1 419, 1 390, 25 1 378 (nujoli), 1 356, 1 338, 1 300, 1 270, 1 249, 1 229, 1 198, 1 174, 1 141, 1 108, 1 091, 1 075, 1 064, 1 045, 1 033, 1 019, 1 001, 985, 962, 941, 909, 889, 877, 841, 822, 807, 763, 744, 732, 721 ja 655 cm"1, vedellä, C1-4- alkanolin, kuten metanolin tai 2-propanolin vesiliuoksella 30 tai C3-6-alkanonin, kuten asetonin, vesiliuoksella; 4 (c) käsitellään kaavan (I) mukaisen yhdisteen γ~ polymorfista muotoa, jolle on tunnusomaista infrapunaspekt-ri (nujolitahdas), jossa näkyvät absorptioviivat arvoilla v = 3 377, 3 240, 1 665, 1 639, 1 594, 1 527, 1 518, 1 494, 5 1 457 (nujoli), 1 443, 1 377 (nujoli), 1 344, 1 321, 1 304, 1 254, 1 195, 1 178, 1 162, 1 143, 1 111, 1 098, 1 046, 1 031, 1 012, 972, 962, 945, 932, 907, 879, 849, 815, 806, 780, 753, 729 ja 658 cm"1, vedellä, Ci-4-alkanolin, kuten metanolin tai 2-propanolin vesiliuoksella tai C3-6-10 alkanonin, kuten asetonin vesiliuoksella; (d) käsitellään kaavan (I) mukaisen yhdisteen amor fista β-muotoa, jolle on tunnusomaista infrapunaspektri (nujolitahdas), jossa näkyvät absorptioviivat arvoilla v = 3 384, 1 708, 1 638, 1 615, 1 595, 1 533, 1 516, 1 458 (nu- 15 joli) , 1 396, 1 378 (nujoli), 1 313, 1 245, 1 172, 1 144, 1 106, 980, 889, 830, 808, 737, 721 ja 665 cm'1, vedellä,

Ci-4-alkanolin, kuten metanolin tai 2-propanolin vesiliuoksella tai C3-e-slkanonin, kuten asetonin vesiliuoksella; 20 (e) hydrataan katalyyttisesti liuos, jossa on kaa van (II) mukaista yhdistettä vesipitoisessa orgaanisessa liuottimessa, sopivan katalyytin läsnä ollessa, joka kykenee poistamaan bentsyylioksikarbonyylisuojaryhmän, kuten palladioidun hiilen läsnä ollessa, poistetaan katalyytti ja 25 liuotin seoksesta bentsyylioksikarbonyylisuojaryhmän poiston lopussa ja sekoitetaan jäännös C3-e-alkanoniin, kuten asetoniin; (f) poistetaan suojaryhmät, edullisesti happamissa olosuhteissa, yhdisteestä, jolla on kaava (XII): 5 yHSOjCH3 P*HN p j HN I-1 = [ j f (XII) jossa P1, P2, P3 ja P4 ovat suojarybmiä, jolloin P1 on formyyli tai bentsyylioksikarbonyyli ja P2, P3 ja P4 ovat kaikki t-butyylejä ja jolloin saadaan, sen jälkeen, kun pH 5 on säädetty arvoon 3-5, edullisesti arvoon 4, jälkikäsittelyn yhteydessä, haluttu a-polymorfinen muoto; tai (g) poistetaan suojaryhmä, edullisesti happamissa olosuhteissa, yhdisteestä, jolla on kaava {XIII): ^hso2ch3 (XIII) ®S r~n

H03O/\/S'CONH/\C02H

10 jossa P5 on suojaryhmä, joka on formyyli, jolloin saadaan sen jälkeen, kun pH on säädetty arvoon 3-5, edullisesti arvoon 4, jälkikäsittelyn yhteydessä, haluttu a - polymorfinen muoto.

Keksintö koskee myös kaavan (II) mukaisen yhdisteen 15 natrium-, kalium- ammonium- tai Ci-4-alkyyliammoniumsuolaa, XWHSO,CH3 H “k. |—J (II)

HO^C'^-^CONH'^CO.H

6

Keksintö koskee lisäksi yhdistettä, jolla on kaava (XII) : NHS02CH3 i ^\.^OP4

P*HN p I

HN^ - = j ! (xid p2o2c-^0><4onh^Co2p3 jossa P1 on formyyli ja P2, P3 ja P4 ovat kukin t-5 butyylejä.

Keksintö koskee edelleen yhdistettä, jolla on kaava (XIII) : yHS02CH3 Ρ5ΗΝ''''/'Νν^^ (XXII) n^Vj. f 1

HO.C^^CONH^CO.H

jossa P5 on formyyli.

10 α-muotoa karakterisoidaan edelleen sen röntgendif- fraktiokuviolla, joka saatiin käyttäen grafiittimonokro-maattorilla suodatettua kuparisäteilytystä (λ = 0,15405 nm) ja jossa päähuiput näkyvät arvoilla 7,5, 8,9, 9,9, 11,6, 15,6, 17,2, 17,5, 18,0, 20,2, 22,1 ja 23,3 20-astetta.

15 α-muotoa karakterisoidaan edelleen differentiaali- pyyhkäisykalorimetrilla, jossa tulee esiin terävä endoter-minen reaktio 248 - 259 °C:ssa, ja se hajoaa yli 260 °C:ssa, kun pyyhkäisynopeus on 20 °C minuutissa.

a-muoto sulaa tavallisesti lämpötila-alueella 242 -20 252 °C, vaikkakin alempia lämpötiloja on havaittu.

γ-muotoa karakterisoidaan edelleen sen röntgendif-fraktiokuvion avulla, joka on saatu käyttäen grafiittimono-kromaattorilla suodatettua kuparisäteilytystä (λ = 0,15405 nm), ja siinä havaitaan päähuiput arvoilla 9,0, 9,6, 10,6, 7 11,6, 12,7, 13,3, 14,6, 16,2, 17,9, 18,8, 20,2 ja 21,8 2Θ-astetta.

γ-muotoa karakterisoidaan edelleen differentiaali-pyyhkäisykalorimetrilla, jossa tulee esiin terävä endoter-5 minen reaktio 176 - 186 °C:ssa, sekä eksoterminen reaktio noin 207 °C:ssa, ja heikko endoterminen reaktio noin 213 °C:ssa, ja se hajoaa yli 250 °C:ssa, kun pyyhkäisynope-us on 2 0 °C minuutissa.

γ-muoto sulaa tavallisesti lämpötilassa, joka on 10 170 - 185 °C.

δ-muotoa karakterisoidaan edelleen sen röntgendif-fraktiokuviolla, joka on saatu käyttäen grafiittimonokro-maattorilla suodatettua kuparisäteilytystä (λ = 0,15405 nm) ja jossa näkyy päähuiput arvoilla 10,5, 10,8, 12,3, 14,5, 15 17,2, 17,6, 17,9, 18,9, 20,4, 21,5, 22,4, 23,0, 23,1, 24,7, 27,1, 27,8 ja 28,9 20-astetta.

δ-muotoa karakterisoidaan edelleen differentiaali-pyyhkäisykalorimetrilla, jossa tulee esiin terävät endoter-miset reaktiot noin 162 °C:ssa ja noin 166 - 168 °C:ssa, ja 20 se hajoaa yli 200 °C:ssa, kun pyyhkäisynopeus on 20 °C minuutissa .

δ-muoto sulaa tavallisesti terävästi 165 175 °C:ssa.

Kaavan (I) mukaisen yhdisteen a-muoto voidaan val-25 mistaa seuraavin menetelmin: 1) α-muoto voidaan valmistaa hydraamalla katalyyttisestä seuraavan kaavan mukaisen yhdisteen natrium-, kalium-, ammonium- tai Ci-4-alkyyliammoniumsuolan vesiliuosta: Λ y HS 0,0¾ H j——j an

H02C'^x-^^C0NH'^'C02H

8 käyttäen sopivaa katalyyttiä bentsyylioksikarbonyy-lisuojaryhmän poistamiseksi, esim. palladioitua hiiltä, ja sen jälkeen tekemällä saatu kaavan (I) mukaisen yhdisteen emässuola happamaksi pH-arvoon 3 - 5, edullisesti noin pH 5 4, ja edullisesti noin 35 - 45 °C:ssa, jolloin saadaan a- muoto. Edullisesti käytetään kaavan (II) mukaisen yhdisteen dinatriumsuolaa. Muita sopivia katalyyttejä bentsyylioksi-karbonyylisuojaryhmän poistamiseksi ovat katalyytit, jotka ovat asiantuntijoiden hyvin tuntemia, esim. katso T.W. 10 Greene ja P.G, Wuts, "Protective Groups in Organic Synt hesis", toinen painos, 1991, jonka sisältö liitetään tähän viitteenä.

Tyypillisessä menetelmässä liuosta, jossa on kaavan {II) mukainen yhdiste sopivassa orgaanisessa liuottimessa, 15 esim. etyyliasetaatissa, ravistellaan natriumhydroksidin vesiliuoksen kanssa dinatriumsuolan muodostamiseksi. Natri-umsuolan sisältävä vesiliuos erotetaan sitten ja sitä hyd-rataan yhdessä 5 % palladioidun hiilikatalyytin kanssa noin 414 kPa:ssa (60 psi) ja huoneenlämpötilassa bentsyylioksi-20 karbonyylisuojaryhmän poistamiseksi. Katalyytti poistetaan sitten suodattamalla ja suodoksen pH säädetään noin arvoon pH 4, käyttäen sopivaa happoa, esim. kloorivetyhapon vesi-liuosta. α-muoto saostetaan sitten liuoksesta ja se voidaan ottaa talteen suodattamalla.

25 Kaavan (II) mukainen yhdiste voidaan valmistaa kaa viossa 1 kuvattua reaktiotietä käyttäen.

9

Kaavio 1 ho (CHjijCOjCr^CH, -*- Ί απ) {CH3)jCO,C^CH2 eno CTjo CT 1 (CH3)3C03C C02H 2 eVT> m \ ^rs^OCeCHÄ \ jr \ HjN COjC(CH3)3 \ (VH) oO ' cn3,t J ^^,oc(CH3)3

σ"χ£ P

(CH3)3CO,C'^^^v'CONH'^C03C{CH3)3 fvni) f + 5 10 ) r I-j (CHj)3C02C'^v^^CONH'^'C02C(CH3)3 (IX) O yHS02CH3

U B

(X) v o yHS02CH3 ^γ-OClCHj), U H ‘So (CH3)3C02C'^Ss-^^C0ra,^v'C0,C(CH3)3 (XI) r

Yhdiste, jolla Kaava on (IX)

Tyypillisessä menetelmässä t-butyyliakrylaatti (III) saatetaan reagoimaan paraformaldehydin kanssa 3-kinu~ 5 klidinolin läsnä ollessa, jolloin saadaan t-butyylihyd-roksimetyyliakrylaattia (IV). Tätä käsitellään tionyyliklo-ridilla trietyyliamiinin ja pyridiinin läsnä ollessa, jolloin saadaan vastaava kloorimetyyliakrylaatti, joka voidaan saattaa reagoimaan (S,S)-a,a 1-dimetyylidibentsyyliamiinin 10 kanssa, jolloin saadaan akrylaattia, jonka kaava on (V).

Tämä muutetaan yhdisteeksi, jonka kaava on (IX), artikke- 11 lissa Tet. Lett., 1993, 34(8), 1323 - 6 kuvatulla tavalla. Yhdiste, jonka kaava on (IX), kondensoidaan sitten lysiini-johdannaisella, jonka kaava on (X) , menetelmällä, joka on kuvattu EP-hakemusjulkaisussa 0 358 398 kaavan (XI) mukai-5 sen yhdisteen valmistamiseksi. Yhdiste, jonka kaava on (XI) , muutetaan sitten yhdisteeksi, jonka kaava on (II), käyttäen liuosta, jossa on trifluorietikkahappoa ja ani-solia dikloorimetaanissa.

2) α-muoto voidaan valmistaa δ-muodosta sekoitta- 10 maila liuosta, jossa on δ-muoto vedessä tai sopivan or gaanisen liuottimen vesiliuoksessa, esim. Ci-4-alkanolissa, kuten metanolissa tai isopropanolissa, tai C3~6-alkanonissa, kuten asetonissa.

Tyypillisessä menetelmässä δ-muoto liuotetaan seok-15 seen, jossa on 1:5 vettä ja metanolia tai 1:10 vettä ja asetonia, ja liuosta sekoitetaan useita päiviä huoneenlämpötilassa. a-muoto saostuu liuoksesta ja se voidaan ottaa talteen suodattamalla.

3) α-muoto voidaan valmistaa γ-muodosta sekoitta- 20 maila liuosta, jossa on γ-muoto vedessä tai sopivan or gaanisen liuottimen vesiliuoksessa, esim. Ci-4-alkanolissa, kuten metanolissa tai isopropanolissa, tai C3-6-alkanonissa, kuten asetonissa.

Tyypillisessä menetelmässä γ-muoto liuotetaan seok-25 seen, jossa on 1:1 vettä ja metanolia, ja liuosta sekoite taan noin 17 tuntia huoneenlämpötilassa, α-muoto saostuu liuoksesta ja voidaan ottaa talteen suodattamalla.

4) α-muoto voidaan valmistaa β-muodosta vastaavalla menetelmällä kuin edellä menetelmässä (3).

30 5) α-muoto voidaan valmistaa poistamalla suojaus, edullisesti happamissa olosuhteissa, yhdisteestä, jonka kaava on: 12 yHS02CH3

PlHN ψ I

HN. -1 5 I J f <xn) P2OzC/\''^cONH/XOiP3 jossa P1 on formyyli tai bentsyylioksikarbonyyli ja P2, P3 ja P4 ovat kaikki t-butyylejä, jolloin saadaan α-muoto, sen jälkeen, kun pH on säädetty arvoon 3-5, edul-5 lisesti arvoon noin 4,

Tyypillisessä menetelmässä, jossa P1 on formyyli tai bentsyylioksikarbonyyli, ja P2, P3 ja P4 ovat kukin t-butyyli, liuosta, jossa on kaavan (XII) mukainen yhdiste sopivassa liuottimessa, esim, 1,4-dioksaanissa tai etyyli-10 asetaatissa, käsitellään sopivalla hapolla, esim. vetyklo-ridilla suojaryhmien poistamiseksi, ja pH säädetään arvoon noin 4 jälkikäsittelyssä, jolloin saadaan a-muoto.

Välituotteet, joiden kaava on (XII), voidaan valmistaa tunnetuin menetelmin. Yhdiste, jonka kaava on (XII), 15 jossa P1 on bentsyylioksikarbonyyli ja P2, P3 ja P4 ovat kukin t-butyylejä, vastaa kaavan (XI) mukaista yhdistettä kaaviossa 1, ja sen synteesi on edelleen kuvattu Menetelmässä (1). Yhdiste, jonka kaava on (XII), jossa P1 on formyyli ja P2, P3 ja P4 ovat kukin t-butyylejä, voidaan val-20 mistaa siten, että ensin poistetaan hydraamalla bentsyy-lioksikarbonyylisuojaryhmä yhdisteestä, jonka kaava on (XI) , käyttäen sopivaa katalyyttiä, esim. palladioitua hiiltä, ja sen jälkeen formyloidaan saatu amiini, esim. käyttäen muurahais-etikkahappoanhydridiä.

25 6) α-muoto voidaan valmistaa poistamalla suojaus, edullisesti tappamissa olosuhteissa, yhdisteestä, jonka kaava on: 13

JviHS02CH3 f^Y°H 1x1111 “N r—i JO1

h^^CO^H

jossa Pb on formyyli, joka voidaan poistaa, edullisesti happamissa olosuhteissa, jolloin saadaan α-muoto sen jälkeen, kun pH on säädetty arvoon noin 3-5, edullisesti 5 noin 4, jälkikäsittelyvaiheessa.

Tyypillisessä menetelmässä, jossa P5 on formyyli, liuosta, jossa on kaavan (XIII) mukainen yhdiste sopivassa liuottimessa, esim. 1,4-dioksaanissa, käsitellään sopivan hapon, esim. kloorivetyhapon, vesiliuoksessa suojaryhmän 10 poistamiseksi, ja säädettäessä pH noin arvoon 4 jälkikäsittelyssä, saadaan a-muoto.

Välituotteet, joiden kaava on (XIII), voidaan valmistaa tunnetuin menetelmin, kuten suorittamalla selektiivinen suojauksen poisto yhdisteelle, jonka kaava on (XII), 15 ainoastaan P2~, P3- ja P4-suojaryhmien poistamiseksi. Esi merkiksi, kun P1 on formyyli ja Pz, P3 ja P4 ovat kukin t-butyylejä, t-butyylisuojaryhmät voidaan poistaa selektiivisesti käsittelemällä kaavan (XII) mukaista yhdistettä trif-luorietikkahapolla sopivassa liuottimessa, esim. dikloori-20 metaanissa, β-, γ- ja δ-muodot, joita käytetään välituotteina ot-muodon valmistuksessa, voidaan valmistaa seuraavasti: (i) β-muoto voidaan valmistaa hydraamalla katalyyt-tisesti liuosta, jossa on kaavan (II) mukaista yhdistettä 25 sopivassa liuottimessa suojaryhmän poistamiseen sopivan ka talyytin, esim. palladioidun hiilen, läsnä ollessa.

Tyypillisessä menetelmässä liuosta, jossa on kaavan (II) mukaista yhdistettä etanolin vesiliuoksessa, hydrataan noin 414 kPa:Ssa (60 psi) ja huoneenlämpötilassa palladioi-30 dun hiilikatalyytin läsnä ollessa. Katalyytti poistetaan 14 sitten suodattamalla ja suodos joko väkevöidään alennetussa paineessa, jolloin saadaan vaahtoa, jota sekoitetaan C3-6-alkanonissa, esim. asetonissa, tai se jäädytyskuivataan, jolloin saadaan β-muoto, joka voidaan ottaa talteen suodat-5 tamalla.

Tästä valmistuksesta on saatu, jos on käytetty C3-6-alkanonia, toisinaan a-muotoa.

(ii) δ-muoto voidaan valmistaa hydraamalla kata- lyyttisesti liuosta, jossa on kaavan (II) mukaista yhdis- 10 tettä seoksessa, jossa on sopivaa veteen sekoittuvaa or gaanista liuotinta, esim. etyyliasetaattia, ja vettä, suo-jaryhmän poistoon sopivan katalyytin, esim. palladioidun hiilen, läsnä ollessa, minkä jälkeen katalyytti poistetaan, vesikerros erotetaan ja tuote saostetaan vesikerroksesta 15 käyttäen Ci-4-alkanolia, esim. metanolia. Tyypillisessä me netelmässä liuokseen, jossa on kaavan (II) mukaista yhdistettä etyyliasetaatissa, lisätään vettä, ja seosta hydra-taan noin 414 kPa:ssa (60 psi) ja huoneenlämpötilassa palladioidun hiilikatalyytin läsnä ollessa. Katalyytti poiste-20 taan sitten suodattamalla, vesifaasi erotetaan ja suodok-sesta, väkevöidään alennetussa paineessa alhaiseen tilavuuteen ja kaadetaan metanoliin. δ-muoto saostuu hitaasti liuoksesta ja voidaan ottaa talteen suodattamalla.

Myös tästä valmistuksesta on toisinaan syntynyt a- 25 muoto.

(iii) β-muoto voidaan valmistaa siten, että ensin jäädytetään liuos, jossa on δ-muoto, ja sitten jäädytys-kuivataan syntynyt kiinteä massa.

(iv) γ-muoto voidaan valmistaa sekoittamalla δ- 30 muotoa n-propanolin tai asetonitriilin kanssa.

Tyypillisessä menetelmässä seosta sekoitetaan noin 24 tuntia huoneenlämpötilassa ja γ-muoto otetaan talteen suodattamalla.

(v) γ-muoto voidaan valmistaa sekoittamalla suspen- 35 siota, jossa on β-muoto asetonitriilissä tai n-propano- 15 lissa, tavallisesti noin viisi päivää huoneenlämpötilassa. γ-muoto otetaan talteen suodattamalla.

(vi) γ-muoto voidaan valmistaa käsittelemällä liuosta, jossa on δ-muoto, C3-6-alkanonilla, esim. asetonilla.

5 Tyypillisessä menetelmässä δ-muodon vesiliuos kaade taan voimakkaasti sekoittaen tilavuudeltaan ylimäärään asetonia huoneenlämpötilassa, γ-muoto saostuu liuoksesta ja voidaan ottaa talteen suodattamalla.

Tästä valmistuksesta on myös toisinaan syntynyt a- 10 muoto.

(vii) β-muoto voidaan valmistaa jäädytyskuivaamalla väkevöityä α-muodon vesiliuosta.

Tyypillisessä menetelmässä valmistetaan väkevöity liuost jossa on a-muoto kuumassa vedessä, liuos suodatetaan 15 kaiken liukenemattoman materiaalin poistamiseksi, sitten se jäähdytetään, jäädytetään ja lopuksi jäädytyskuivataan, jolloin saadaan β-muoto.

Kuten aikaisemmin mainittiin, α-muoto on tehokas neutraalin endopeptidaasin (E.C.3.4.24.11) estäjä. Tämä 20 entsyymi on mukana joidenkin peptidihormonien ja peptidiau- takoidiaineiden hajottamisessa, mukaan lukien erityisesti eteisen natriureettisen tekijän (ANF) hajoaminen. Siten a-muoto voi tehostaa ANF:n biologisia vaikutuksia estämällä neutraalia endopeptidaasian, E.C.3.4.24.11, hajottamasta 25 sitä, ja siten se on diureettinen, natriureettinen ja verenpainetta alentava aine, joka on käyttökelpoinen hoidet-taessaa erilaisia häiriöitä, kuten verenpainetta, sydämen vajaatoimintaa, rintakipua, munuaisten vajaatoimintaa, kroonista munuaisten vajaatoimintaa, premenstruaalisyndroo-30 maa, jaksottaista turvotusta, Menierin tautia, hyperaldo-steronismia (primaarista ja sekundaarista) ja virtsan korkeata kalsiumpitoisuutta. Lisäksi, koska α-muoto pystyy tehostamaan ANF:n vaikutuksia, se on käyttökelpoinen hoidettaessa glaukoomaa. Edelleen, koska α-muoto pystyy estämään 35 neutraalia endopeptidaasia, E.C.3.4.24.11, se voi olla käyttökelpoinen hoidettaessa astmaa, tulehdusta, kipua, 16 epilepsiaa, tunnehäiriöitä, dementiaa, vanhuuden sekavuutta, ylipainoa, maha-suolikanavan häiriöitä (erityisesti ripulia ja ärtyneen paksusuolen syndrooma) ja veren korkeata reniinipitoisuutta, sekä säädeltäessä mahahapon eritystä.

5 Vaikutusta neutraaliin endopeptidaasiin, E.C.3.4.- 24.11, voidaan arvioida käyttäen menetelmää, joka perustuu kokeeseen, jonka ovat kuvanneet Barclay, P.L., et ai., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1989, 164, 58 - 65. Menetelmässä määritetään yhdisteen konsentraatio, joka tarvitaan, 10 jotta rotan munuaisista valmistettu neutraali endopepti-daasipreparaatti vähentää 50 % radioaktiivisesti merkatun hippurihapon vapautumisuopeutta hippuryyli-L-fenyyliala-nyyli-L-arginiinista.

Kuten aikaisemmin mainittiin, α-muoto on myös an-15 giotensiinia muuttavan entsyymin (ACE) estäjä. Sellaisena se on käyttökelpoinen hoidettaessa erilaisia tiloja, joissa ACE-estäjien tiedetään olevan käyttökelpoisia, kuten verenpainetta, verentungosta aiheuttavaa sydämen vajaatoimintaa, rajoitettaessa iskeemistä vauriota sydänlihakseen, suojat-20 taessa munuaisia ylisuodattumisvauriolta, estettäessä tai muutettaessa käänteiseksi vasemman kammion liikakasvua, muistin parantamisessa, kognitiivisen toiminnan säätelyssä, dementiassa ja estettäessä sepelvaltimoleikkauksen tai sepelvaltimo-ohitusleikkauksen jälkeistä uustukkeumaa. Sen 25 vaikutusta tätä entsyymiä vastaan voidaan arvioida käyttäen menetelmää, joka perustuu Rohrbach, M.S.:n kuvaaman menetelmän muunnelmaan, Anal. Biochem., 1978, 84, 272. Menetelmässä määritetään yhdisteen konsentraatio, joka tarvitaan vähentämään 50 % rotan munuaisista eristetyn angiotensiinia 30 muuttavan entsyymin aikaansaamaa radioaktiivisesti merkatun hippurihapon vapautumista hippuryyli-L-histidyyli-L-leusii-nista.

Estovaikutusta voidaan mitata myös in vivo sen jälkeen, kun nukutetuille koirille on annettu suonensisäinen 35 injektio, käyttäen menetelmää, jonka ovat kuvanneet I.L. Natoff et ai., Journal of Pharmacological Methods, 1981, 5, 17 305 ja D.M. Gross et ai., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1981, 216, 552. Määritetään estäjän annos, joka tarvitaan vähen tämään suonensisäisen angiotensiini I -injektion (50 ng bolus) aiheuttama painevaste.

5 a-muodon vaikutus diureettisena aineena voidaan määrittää mittaamalla sen kykyä lisätä virtsan eritystä ja natriumionin erittymistä tajuissaan olevissa AV-salvatuissa koirissa, käyttäen menetelmää, jonka ovat kuvanneet Alabaster, C.T. et ai., Brit. J. Pharmacol., 1989, 98, 823P.

10 α-muodon verenpainetta alentavaa vaikutusta voidaan arvioida mittaamalla verenpaineen alenema sen jälkeen, kun suolattomille, diureetilla esikäsitellyille, spontaanisti korkean verenpaineen omaavalle rotille, suolattomille, mu-nuaisperäisesti korkean verenpaineen omaavalle koirille, 15 tai desoksikortikosteroniasetaatti (DOCA)/suo1averenpäinei-sille rotille annettiin yhdistettä suun kautta tai suonensisäisesti .

Annettaessa eläimelle verenpainetaudin, verentungosta aiheuttavan sydämen vajaatoiminnan tai munuaisten va-20 jaatoiminnan hoitoon, suun kautta annettavat α-muodon annokset ovat tavallisesti 1 - 500 mg päivässä, ja edullisesti 5 - 200 mg päivässä hoidettaessa ihmisiä, keskivertoa!-kuispotilaalle. Siten tyypillisille ihmisaikuispotilaalle yksittäiset tabletit tai kapselit sisältävät 1 - 200 mg yh-25 distettä sopivassa farmaseuttisesti hyväksyttävässä laimen-timessa tai kantaja-aineessa, ja ne annetaan yhtenä tai mo-niannoksina, kerran tai useita kertoja päivässä. Suonensisäisesti annettavat annokset käsittävät tavallisesti noin 0,01 - 50 mg, edullisesti 0,1 - 10 mg yhdistettä tarvitta-30 vaa yksittäistä annosta kohden. Käytännössä lääkäri määrittää kullekin potilaalle parhaimman todellisen annostuksen, joka riippuu nimenomaisen potilaan iästä, painosta ja vasteesta. Edellä olevat annostukset ovat esimerkkejä keskivertotapauksista, mutta luonnollisesti voi olla yksittäisiä 35 tapauksia, joissa korkeammat tai matalammat annokset ovat 18 tarpeen, ja tällaiset annokset kuuluvat tämän keksinnön suojapiiriin.

Annettaessa ihmiselle α-muoto voidaan annostella yksinään, mutta tavallisesti se annetaan seoksena far-5 maseuttisesti hyväksyttävän laimeatimen tai kantaja-aineen kanssa, joka on valittu aiotun antotavan ja farmaseuttisen peruskäytännön perusteella. Esimerkiksi se voidaan annostella suun kautta tabletteina, jotka sisältävät apuaineita, kuten tärkkelystä tai kaksiemäksistä kalsiumfosfaattia, tai 10 kapseleina tai ovaaleina joko yksistään tai seoksena apuaineiden kanssa, tai eliksiirinä tai suspensiona, joka sisältää maku- tai väriaineita. Se voidaan injisoida ruoansulatuskanavan ulkopuolelle, esimerkiksi suonensisäisesti, lihakseen tai ihon alle. Annettaessa ruoansulatuskanavan ul-15 kopuolelle sitä on parasta käyttää steriilinä vesiliuoksena, joka voi sisältää muita aineita, esimerkiksi riittävästi suoloja tai glukoosia, jotta liuos on isotoninen veren kanssa.

a-muoto voidaan antaa yhdessä muiden aineiden kas-20 sa, jotka ovat käyttökelpoisia verenpaineen säätelemisessä, sydänsairauksien tai munuaisten vajaatoiminnan hoidossa. Siten esimerkiksi se voidaan antaa yhdessä sydäntä stimuloivan aineen, kuten digitaliksen, alfasalpaajan, esimerkiksi doksatsosiinin, beetasalpaajan, kalsiumkanavasalpaa-25 jän, esimerkiksi amlodipiinin, eksogeenisen ANF:n, kalium-kanavaa aktivoivan aineen tai jonkin muun diureetin kanssa, josta lääkäri tekee päätöksen kyseessä olevan potilaan ja sairauden tilan perusteella.

Terapeuttinen hoito α-muotoa käyttäen, kuten se 30 tuodaan esille tässä, voi tarkoittaa kyseessä olevan sairauden parantavaa tai ehkäisevää hoitoa.

α-muodon valmistusta valaistaan seuraavilla esimerkeillä : 19

Esimerkki 1 (S# S, S) -N- (1- [2-karboksi-3- (N2-mesyylilysyyliami-no)propyyli]-1-syklopentyylikarbonyyli)tyrosiini, a-muoto

Liuosta, jossa oli (S,S,S)-N-(1-[2-karboksi-3-(N2-5 mesyylilysyyliamino)propyyli]--1-syklopentyylikarbonyyli)- tyrosiini etyyliasetaatissa (1 190 ml) (osa liuoksesta, joka saatiin Valmistuksen 9 menetelmän mukaan, sisälsi 219 g lähtöainetta} ravisteltiin liuoksen kanssa, jossa oli nat-riumhydroksidia (23,1 g) vedessä (503 ml). Vesifaasi ero-10 tettiin ja sitä hydrattiin 414 kPa:ssa (60 psi) ja huoneenlämpötilassa yhdessä 5 % palladioidun hiilikatalyytin kanssa (20 g) viisi tuntia. Katalyytti suodatettiin sitten pois ja suodoksen pH säädettiin pH 4:ään 5-N:lla kloorivetyhapon vesiliuoksella, ja saostui valkoista kiinteää ainetta. Kun 15 oli rakeistettu 18 tuntia huoneenlämpötilassa, kiinteä tuote suodatettiin, pestiin vedellä ja kuivattiin, jolloin saatin otsikon yhdiste valkoisena kiinteänä aineena (124,4 g), sp. 248 - 250 °C. Saadut arvot: C, 53,47; H, 7,25; N, 9,50. Yhdisteelle C26H40N4O9S vaadittavat arvot: C, 53,41; H, 20 6,90; N, 9,58 %.

Esimerkki 2 (S, S, S) -N- (1- [2-karboksi-3- (N2-me syyli ly syy li amino) propyyli] -1-syklopentyylikarbonyyli)tyrosiini, a-muoto

Liuosta, jossa oli (S,S,S)~N~(1~[2-karboksi-3-(N2-25 mesyylilysyyliamino)propyyli]-1-syklopentyylikarbonyyli)- tyrosiinihydraattia (δ-muoto, katso Valmistus 2) (3,0 g) 1:5 vesi/metanoliseoksessa (18 ml) tai 1:10 vesi/aseto-niseoksessa (33 ml) , sekoitettiin kolme päivää huoneenlämpötilassa. Syntynyt kiinteä aine otettiin talteen suodatta-30 maila ja kuivattiin, jolloin saatiin otsikon yhdiste valkoisena kiinteänä aineena, sp. 246 - 8 °C (käytettäessä me-tanolin vesiliuosta), sp. 242 - 3 °C (käytettäessä asetonin vesiliuosta).

20

Esimerkki 3 (5.5.5) -N- (1- [2-karboksi-3- (N2 -me syy li ly syy li ami-no)propyyli]-1-syklopentyylikarbonyyli)tyrosiini/ a-muoto (S, S, S) -N- (1- [2-karboksi-3- (N2-mesyylilysyyliamino) -5 propyyli]-1-syklopentyylikarbonyyli}tyrosiinia, y-muotoa (katso Valmistukset 4, 5, 7 ja 8} (0,5 g) liuotettiin ve teen (4 ml} ja lisättiin metanolia (4 ml} . Syntynyttä liuosta sekoitettiin 17 tuntia huoneenlämpötilassa. Muodostui valkoista kiinteää ainetta, joka otettiin talteen suodatta-10 maila ja kuivattiin, jolloin saatiin otsikon yhdiste (0,43 g), sp. 250 - 252 °C.

Esimerkki 4 (5.5.5) -N- (1- [2-karboksi-3- (N2-me syy li ly syy li ami-no)propyyli]-1-syklopentyylikarbonyyli)tyrosiini/ a-muoto 15 (S, S, S) -N- (1- [2-karboksi-3- (N2-mesyylilysyy li ami no) propyyli]-1-syklopentyylikarbonyyli)tyrosiinia, S-muotoa (katso Valmistukset 1, 3 ja 6) (0,5 g) liuotettiin veteen (4 ml) ja lisättiin metanolia (4 ml) . Syntynyttä liuosta sekoitettiin 17 tuntia huoneenlämpötilassa. Muodostui val-20 koista kiinteää ainetta, joka otettiin talteen suodattamalla ja kuivattiin, jolloin saatiin otsikon yhdiste (0,43 g), sp. 249 - 251 °C.

Esimerkki 5 (S, S, S) -N- (1- [2-karboksi-3- (D^-mesyylilysyyliami-25 no)propyyli]-1-syklopentyylikarbonyyli)tyrosiini/ a-muoto

Liuokseen, jossa oli Valmistuksen 12 yhdiste (2,50 g, 3,20 mmol) 1,4-dioksaanissa (20 ml), lisättiin liuos, jossa oli 1,4-dioksaania (20 ml), joka oli kyllästetty HCl-kaasulla. 30 minuutin kuluttua alunperin kirk- 30 kaasta liuoksesta tuli öljyistä ja sitä sekoitettiin 24 tuntia huoneenlämpötilassa. Lisättiin vettä (20 ml), jolloin saatiin kirkas liuos, jota sekoitettiin huoneenlämpö-tilassa 60 tuntia. Haihduttamalla synytnyt liuos alennetussa paineessa saatiin öljyä, joka liuotettiin veteen ja teh-35 tiin emäksiseksi natriumhydroksidin vesiliuoksella, kunnes pH oli 4. Liuotin poistettiin haihduttamalla alennetussa 21 paineessa ja rakeistamalla syntynyt aine metanolilla saatiin harmahtavan valkoista kiinteää ainetta, joka otettiin talteen suodattamalla ja suspensoitiin uudelleen veteen (4 ml) yöksi. Kiinteät aineet suodatettiin pois ja kuivattiin, 5 jolloin saatiin otsikon yhdiste (0,97 g), sp. 225 - 230 °C. IR- ja PXRD-analyysit vahvistivat tuotteen halutuksi a-muo-doksi.

Esimerkki 6 (S, S, S) -N- (1- [2-karboksi-3- (N2-me syy li ly syy li ami-10 no) propyyli ] -1 - syklopentyylikarbonyyli) tyrosiini, ot-muoto

Liuokseen, jossa oli Valmistuksen 13 yhdiste (1,78 g) 1,4-dioksaanissa (18 ml), lisättiin 4 M kloorive-tyhapon vesiliuosta (18 ml). Kirkkaan liuoksen annettiin sekoittua huoneenlämpötilassa 60 tuntia, sen jälkeen vielä 15 18 tuntia 35 °C:ssa. Poistamalla liuotin alennetussa pai neessa saatiin 5,42 g ainetta, josta 4,22 g liuotettiin veteen (10 ml), liuos tehtiin emäksiseksi natriumhydroksidin vesiliuoksella pH-arvoon 4,0, se ympättiin esimerkin 1 yhdisteellä ja sitä sekoitettiin huoneenlämpötilassa 18 tun-20 tia. Syntynyt kirkas liuos väkevöitiin noin 10 ml:ksi alennetussa paineessa, se laimennettiin metanolilla (15 ml) ja sitä rakeistettiin 48 tuntia. Kiinteät aineet otettiin talteen suodattamalla ja kuivattiin, jolloin saatiin otsikon yhdiste (1,25 g), sp. 232 - 235 °C.

25 IR- ja PXRD-analyysit vahvistivat tuotteen halutuk si a-muodoksi.

Esimerkki 7 (S, S, S) -N- (1- [2-karboksi-3- (N2 -me syy li ly syy li amino )propyyli]-1-syklopentyylikarbonyyli)tyrosiini, ci-muoto 30 Jäähdytettyyn (10 °C) liuokseen, jossa oli tert- butyyli- (S, S, S) -N- (1- [3- (N6-bentsyylioksikarbonyyli-N2-me-syylilysyyliamino)-2-{tert-butoksikarbonyyli)propyyli]-1-syklopentyylikarbonyyli)-O4-tert-butyylityrosinaattia (13,3 g, 15,0 mmol) etyyliasetaatissa (27 ml), lisättiin 35 5,1 M liuos, jossa oli vetykloridia etyyliasetaatissa (70 ml) (357 mmol HCl:a). 30 minuutin kuluttua alunperin 22 kirkkaasta liuoksesta saostui tervaa. Seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 18 tuntia. Kirkas liuos dekantoitiin pois tervasta ja tervaa trituroitiin etyyliasetaatissa (75 ml) , jolloin saatiin tahmeaa kiinteää ainetta. Dekan-5 tointi ja triturointi toistettiin viisi kertaa, jolloin saatiin hygroskooppista kiinteää ainetta, joka liuotettiin veteen (12 ml). Syntynyt vesiliuos pestiin kahdesti etyyliasetaatilla, tehtiin emäksiseksi natriumhydroksidin vesi-liuoksella pH-arvoon 4,0, ympättiin esimerkin 1 yhdisteellä 10 ja sekoitettiin 45 - 50 °C:ssa 42 tuntia. Harmahtavan valkoiset kiinteät aineet otettiin talteen suodattamalla, ne pestiin vedellä ja asetonilla ja kuivattiin, jolloin saatiin otsikon yhdiste (1,95 g), sp. 237 - 238 °C.

IR- ja PXRD-analyysit vahvistivat tuotteen halutuk-15 si a-muodoksi.

Seuraavat valmistukset valaisevat tiettyjen a-muodon syntetisoinnissa käytettyjen välituotteiden valmistusta :

Valmistus 1 2 0 (S,S, S) -N- (1- [2-karboksi“3- (N^-mesyylilysyyliamino) - propyyli]-1-syklopentyylikarbonyyli)tyrosiini, β-muoto

Liuosta, jossa (S,S,S)-N-(l-[3-(N6-bentsyylioksikar~ bonyyli-N2-mesyylilysyyliamino) -2-karboksipropyyli] -1-syk-lopentyylikarbonyyli)tyrosiinia (katso Valmistus 9) (371 g) 25 seoksessa, jossa oli 9:1 etanolia ja vettä (2,225 1), hyd-rattiin 414 kPa:ssa (60 psi) ja huoneenlämpötilassa 10 % palladioidun hiilikatalyytin läsnä ollessa (37,0 g) neljä tuntia. Katalyytti suodatettiin pois ja suodos haihdutettiin, jolloin jäi jäljelle käsittelemätöntä tuotetta vaah-30 tona. Tätä ainetta sekoitettiin asetonissa (3,13 1} 24 tuntia, jolloin saatiin otsikon yhdiste valkoisena amorfisena kiinteänä aineena (283 g). Saadut arvot: C, 52,97; H, 7,02; N, 8,97. Yhdisteelle C26H40N4O9S vaadittavat arvot: C, 53,41; H, 6,90; N, 9,58 %.

35 23

Valmistus 2 (S, S, S) -N- (1- [2-karboksi-3- (N2 -me syy li ly syy li amino) -propyyli]-1-syklopentyylikarbonyyli)tyrosiinihydraatti (δ-muoto) 5 Liuos, jossa (S,S,S)-N-(l-[3-(N6-bentsyylioksikarbo- nyyli-Kf2-mesyylilysyyliamino) -2-karboksipropyyli] -1-syklopentyylikarbonyyli) tyros iinia (katso Valmistus 9) (351 g) etyyliasetaatissa (1 300 ml) , lisättiin veteen (385 ml) ja kaksifaasista seosta hydrattin 414 kPa:ssa (60 psi) ja huo-10 neenlämpötilassa 5 % palladioidun hiilikatalyytin läsnä ollessa (35 g) 20 tuntia. Katalyytti suodatettiin pois, vesi-faasi erotettiin ja väkevöitiin alhaiseen tilavuuteen alennetussa paineessa. Viskoosi liuos kaadettiin metanoliin (2,85 1) ja sitä sekoitettiin huoneenlämpötilassa 18 tun-15 tia, jona aikana saostui vähän kiinteää ainetta. Kiinteää ainetta rakeistettiin 5-10 °C:ssa kaksi tuntia, se suodatettiin, pestiin metanolilla ja kuivattiin, jolloin saatiin otsikon yhdiste valkoisena kiinteänä aineena (178,1 g), sp. 168 - 171 °C. Saadut arvot: C, 51,37; H, 7,47; N, 9,06. Yh-2 0 dis teelle C26H40N4O9S. KH2O (jossa κ = 1) vaadittavat arvot: C, 51,81; H, 7,02; N, 9,30 %.

Vesipitoisuus = 3,6 paino-% Karl Fischerin menetelmällä määritettynä (k = 1 edellyttää 3,0 paino-%).

Valmistus 3 25 (S,S,S) -N-{1- [2-karboksi-3- (t^-mesyylilysyyliamino) - propyyli]-1-syklopentyylikarbonyyli)tyrosiini, β-muoto (S, S, S) -N- (1- [2-karboksi-3- (N2-mesyylilysyyliamino) -propyyli]-1-syklopentyylikarbonyyli)tyrosiinihydraattia (δ-muotoa, katso Valmistus 2) (20,0 g) liuotettiin veteen (250 30 ml) huoneenlämpötilassa ja kirkas liuos jäädytettiin, käyttäen hiilihappojää/asetonihaudetta. Kiinteä massa jäädytys-kuivattiin, jolloin saatiin otsikon yhdiste valkoisena kiinteänä aineena (19,0 g). Tämä aine hajosi hitaasti lämpötila-alueella 155 - 170 °C.

35 24

Valmistus 4 {S, S, S) -N- (1- [2-karboksi-3- (N2-me syy li ly syy li amino) -propyyli] -1-syklopentyylikarbonyyli)tyrosiini, γ-muoto (S, S, S) “N" (1- [2-karboksi-3- {N2-mesyylilysyyliamino) -5 propyyli]-1-syklopentyylikarbonyyli)tyrosiinihydraattia (δ-muotoa, katso Valmistus 2) (1,0 g) sekoitettiin joko n-pro- panolin tai asetonitriilin (10 ml) kanssa 24 tuntia huoneenlämpötilassa. Kummassakin tapauksessa saatiin valkoista kiinteää ainetta, joka otettiin talteen suodattamalla ja 10 kuivattiin, jolloin saatiin otsikon yhdiste, sp. 172 176 °C.

Valmistus 5 (S,S, S) -N- (1- £2-karboksi-3-(N^-mesyylilysyyliamino) -Propyyli]-1-syklopentyylikarbonyyli)tyrosiini, γ-muoto 15 (S, S, S) -N- (1- [2-karboksi-3- (N2-mesyylilysyyliamino) - propyyli]-1-syklopentyylikarbonyyli)tyrosiinihydraattia (ö-muotoa, katso Valmistus 2) (847,0 g) liuotettiin veteen (762 ml) ja liuos laimennettiin asetonilla (1,0 1). Tämä liuos lisättiin hitaasti voimakkaasti sekoitettuun aseto-20 niin (18,05 1) huoneenlämpötilassa, ja saostui valkoista kiinteää ainetta. Seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 18 tuntia, kiinteä aine otettiin talteen suodattamalla, se pestiin asetonilla ja kuivattiin, jolloin saatiin otsikon yhdiste valkoisena kiinteänä aineena (775 g) , sp. 179 - 25 181 °C. Saadut arvot: C, 53,42; H, 6,88; N, 9,37; S, 5,49.

Yhdisteelle C26H40N4O9S vaadittavat arvot: C, 53,41; H, 6,90; N, 9,58; S, 5,48 %.

Valmistus 6 (S, S, S) -N- (1- [2-karboksi-3- {N^-mesyylilysyyliamino) -30 propyyli]-1-syklopentyylikarbonyyli)tyrosiini, β-muoto (S, S, S) -N- (1- [2-karboksi-3- (N2-mesyylilysyyliamino) -propyyli] -1-syklopentyylikarbonyyli) tyrosiinia, cx-muotoa (katso esimerkit 1-4) (4,0 g) lisättiin veteen (200 ml) ja seosta sekoitettiin 90 - 95 °C:ssa 30 minuuttia. Liu-35 kenematon aine suodatettiin pois, suodos laimennettiin edelleen vedellä (50 ml) ja jäähdytettiin huoneenlämpöti- 25 laan. Kun oli suodatettu vähäisen utuisuuden poistamiseksi, kirkas suodos jäädytettiin, käyttäen hiilihappojää/aseto-nihaudetta. Saatu kiinteä massa jäädytyskuivattiin, jolloin saatiin otsikon yhdiste valkoisena kiinteänä aineena 5 {3,0 g). Tämä aine hajoaa hitaasti lämpötila-alueella 155 - 165 °C.

Valmistus 7 (S, S, S) -N- {1- [2 -karboksi-3- (N2 -me syyl i ly syy 1 i amino) -propyyli]-1-syklopentyylikarbonyyli)tyrosiini, γ-muoto 10 (S, S, S) -N- (1- [2-karboksi-3- (N2-mesyylilysyyliamino) - propyyli]-1-syklopentyylikarbonyyli)tyrosiinia, S-muotoa (katso Valmistukset 1, 3 ja 6) (0,3 g), suspensoitiin ase- tonitriiliin (15 ml) ja sekoitettiin viisi päivää. Syntynyt valkoinen kiinteä aine otettiin talteen suodattamalla ja 15 kuivattiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin otsikon yhdiste (0,26 g).

Valmistus 8 (S# S# S) -N- (1- [2-karboksi-3” (N2 -me syyl i ly syy 1 i amino) -propyyli] -1-syklopentyylikarbonyyli) tyrosiini, y-muoto 20 (S, S, S) -N- (1- [2-karboksi-3- (N2-mesyylilysyyliamino) - propyyli]-1-syklopentyylikarbonyyli)tyrosiinia, β-muotoa (katso Valmistukset 1, 3 ja 6) (0,3 g), suspensoitiin n- propanoliin (10 ml) ja sekoitettiin viisi päivää. Syntynyt valkoinen kiinteä aine otettiin talteen suodattamalla ja 25 kuivattiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin otsikon yhdiste (0,26 g), sp. 175 - 180 °C.

Valmistus 9 (S, S,S)-N-(1- [3- (N6 - bent syyl i ok s ikarbonyyl i - N2 -me -syylilysyyliamino) -2-karboksipropyyli] -1-syklopentyylikar-3 0 bonyyli)tyrosiini

Tert-butyyli- (S, S, S) -N- (1- [3- (N6-bentsyylioksikarbo-nyyli-N2-mesyylilysyyliamino) -2- (tert-butoksikarbonyyli] -1-syklopentyyl ikarbonyyl i) -O4-tert-bu tyyli tyros inaatt ia (404 g) liuotettiin dikloorimetaaniin (810 ml). Lisättiin 35 anisolia (769 g yhdessä erässä, ja sitten lisättiin trif-luorietikkahappoa (1,158 kg) tipoittain noin 10 minuutin 26 aikana. Lisäyksen loputtua reaktioseosta sekoitettiin 35 °C:ssa kuusi tuntia ja sitten huoneenlämpötilassa yön yli. Lisättiin vettä (1 000 ml) ja muodostui kolme kerrosta. Ylin ja -alin kerros yhdistettiin, ne liuotettiin etyy-5 liasetaattiin (2 1) ja syntynyt liuos pestiin suolaliuok sella. Orgaaninen faasi sekoitettiin suolaliuoksen kanssa, pH säädettiin arvoon 3 ja kerrosten annettiin erottua. Muodostui kolme kerrosta. Orgaaniset faasit erotettiin, ne otettiin talteen etyyliasetaattiin ja uutettiin kylläisellä 10 natriumbikarbonaatin vesiliuoksella 81,6 1) ja suolaliuoksella (0,5 1). Yhdistetyt vesikerrokset pestiin etyyliasetaatilla, sitten ne tehtiin happamiksi ja uutettiin etyyliasetaatilla, jolloin saatiin etyyliasetaattiliuos (1,54 1), jossa oli otsikon yhdiste. Tämä liuos käytettiin joko suo-15 raan (esim. katso esimerkki 1) tai liuotin poistettiin, jolloin saatiin otsikon yhdiste.

Valmistus 10 (S) -N6-bent syy 1 i ok s i ka r bonyy 1 i -N2 -mesyylilysiini (S)-N6-bentsyylioksikarbonyylilysiiniä (1,5 kg) sus-20 pensoitiin metyleenikloridiin (7,5 1} ja klooritrimetyy- lisilaania (1,36 1) lisättiin 10 minuutin aikana. Seosta kuumennettiin palautusjäähdytyslämpötilassa 30 minuuttia, jolloin saatiin liuos, joka jäähdytettiin 3 °C:seen, ennenkuin samanaikaisesti lisättiin di-isopropyylietyyliamiinia 25 (1,87 1) ja metaanisulfonyylikloridia (435 ml) sellaisella nopeudella, että lämpötila pysyi alle 25 °C:ssa. Reaktiota sekoitettiin vielä 2,5 tuntia, sitten se kaadettiin 2 M kloorivetyhappovesilluokseen. Kerrokset erotettiin ja mety-leenikloridifaasi pestiin 2 M kloorivetyhappovesiliuoksel-30 la, sen jälkeen vedellä. Liuotin poistettiin alennetussa paineessa ja korvattiin n-butyyliasetaatilla. Liuos jäähdytettiin ja syntynyt kiteinen aine otettiin talteen suodattamalla, se pestiin n-butyyliasetaatilla ja kuivattiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin otsikon yhdiste 35 (1,63 kg), sp. 83,5 - 84 °C. [α]ο^-13,4 °C (c = 1, metano- li) . Saadut arvot: C, 50,23; H, 6,40; N, 7,76. Yhdisteelle 27 C15H22N2O6S vaadittavat arvot: C, 50,27; H, 6,19; N, 7,82 %.

]-H-igMR (300 MHz, d6-DMSO) : δ = 1,23 - 1,78 (6H, m), 2,85 (3 H, s), 2,98 (3H, q) , 3,80 (1H, dt) , 5,00 (2H, s), 7,25 (1H, t), 7,30 - 7,43 (5H, m), 7,51 (1H, d) ppm.

5 Valmistus 11

Tert-foutyyli-(S,S,S)-N-(1-[2-tert-butoksikarbonyy- li-3- (K^-mesyylilysyyliaminoJpropyyli] -1-syklopentyylikar-bonyyli)-04-tert-butyylityrosinaatti

Liuokseen, jossa oli tert-butyyli-(S,S,S)-N-(1-[3-10 (N5~bentsyylioksikarbonyyli-N2-mesyylilysyyliamino)-2-(t ert-butoks ikarbonyy1i)propyy1i]-1-sykiopentyylikarbonyy-li)-04-tert~butyylityrosinaattia (48,64 kg, 54,8 mmol) teollisesti metyloidussa alkoholissa (1,0 1), lisättiin 5 % palladioitua hiiltä (5,0 g) (vesimärkää) ja seosta hydrat-15 tiin 345 - 414 kPa:ssa (50 - 60 psi) ja huoneenlämpötilassa 19 tuntia. Kun katalyytti oli poistettu suodattamalla, syntynyt liuos väkevöitiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin otsikon yhdiste värittömänä öljynä (46,56 g), joka sisälsi etanolia. 1H-MMR (300 MHz, CDCI3) : δ = 1,27 (9H, s) 20 1,41 (9H, s), 1,44 (9H, s), 1,45 - 1,62 (14H, leveä m), 1,8 - 2,05 (4H, leveä m), 2,21 (2H, m), 2,27 (2H, t), 2,79 (3H, leveä), 2,96 (2H, s}, 3,1 (2H, m), 3,59 (1H, m), 3,96 (1H, t}, 4,73 (1H, m), 6,43 (1H, dt) , 6,89 (2H, dt) , 7,09 (2H, dt), 7,51 (1H, dt) ppm.

25 Valmistus 12

Tert-butyyli-(S,S,S)-N-(1-[2-tert-butoksikarbonyy-li-3-(N6-f ormyy 1 i - N2 -me syy 1 i ly syy 1 i amino) p r opyy 1 i ] -1 - syki o -p en tyyl ikarbonyy li) -04-tert-butyylityrosinaatti Jäähdytetty (0 °C) liuos, jossa oli muurahais-etik-30 kahappoanhydridiä etikkahapossa (valmistettu yhdistämällä 45,3 ml etikkahappoanhydridiä ja 22,8 ml muurahaishappoa, kuumentaen syntynyttä liuosta 50 - 60 °C:ssa 15 minuuttia, sitten jäähdyttäen 0 °C:seen), lisättiin liuokseen, jossa oli valmistuksen 11 yhdiste (27,3 g, 36,3 mmol) muurahais-35 hapossa (33,7 ml) 0 °C:ssa, 10 minuutin aikana. Liuoksen annettiin lämmetä ja sitä sekoitettiin huoneenlämpötilassa 28 45 minuuttia ja tukahdutettiin sitten jäillä. Syntynyt seos neutraloitiin natriumhydroksidin vesiliuoksella ja uutettiin dikloorimetaailla (x 2}. Yhdistetyt orgaaniset kerrokset pestiin kaksi kertaa suolaliuoksella ja haihdutettiin 5 alennetussa paineessa, jolloin saatiin otsikon yhdiste keltaisena vaahtona (28,0 g). (300 MHz, CDCI3} : δ = 1,26 <9H, s), 1,41 (18H, s), 1,45 - 2,03 (16H, leveä), 2,23 (2H, leveä m), 2,97 (3H, s(, 3,08 (2H, m), 3,28 (2H, m), 3,51 (1H, m), 3,98 (lH, leveä m), 4,73 (1H, q) , 5,57 (1H, 10 leveä dt), 5,91 (1H, leveä), 6,32 (lH, dt), 6,90 (2H, dt), 7,08 (2H, dt), 7,29 (1H, leveä), 8,17 (1H, s) ppm.

Valmistus 13 (S/ S, S) -N- (1- [2-karboksi-3- (N^formyyli-N2-mesyyli-lysyyliamino)propyyli] -1-syklopentyylikarbonyyli) tyrosiini 15 Jäähdytettyyn (0 °C) liuokseen, jossa oli valmis tuksen 12 yhdiste (2,71 g, 3,46 mmol) dikloorimetaanissa (4,8 ml), lisättiin trifluorietikkahappoa (4,8 ml). Reaktion annettiin lämmetä huoneenlämpötilaan ja sitä sekoitettiin 24 tuntia. Seos väkevöitiin alennetussa paineessa, 20 jolloin saatiin otsikon yhdiste kiinteänä aineena (2,4 g), sp. 56 - 60 °C. 1H-NMR (300 MHz, d6-DMSO) : δ = 1,2 - 1,6 {14H, leveä m), 1,71 - 1,86 (3H, m), 1,86 - 1,99 (1H, m), 2,28 - 2,41 (1H, m), 2,78 (3H, s) 2,8 - 3,09 (4H, m), 3,12 - 3,25 (2H, m), 3,71 (1H, m), 4,35 (lH, m), 6,6 (2H, 25 dt) , 6,98 (2H, dt), 7,25 (1H, dt) , 7,50 (1H, dt) , 7,91 (2H, m), 7,97 (1H, s) ppm.

a-, IS-, γ- ja δ-muotojen karakterisointi IR-, PXRD-ja DSC-analyysimenetelmien ja sulamispisteen määrityksen avulla 30 a) Infrapunaspektroskopia (IR)

Eri muotojen iR-spektrit määritettiin nujol-huippuina, käyttäen Nicolet 800 FT-IR -spektrometriä. Kunkin muodon absorptioviivojen aaltoluvut (v [cm-1]) on lueteltu taulukossa 1.

35

Taulukko 1 29 α-muoto β-muoto γ-muoto S^iiuötö --~---” ' 3667' 3407* 3425’ 3386* 3384 3377 3380 3223 3240 3287 3153 3137 3098 1708 1709 1699 1673’ 1652* 1665’ 1638 1639 1637 1626 1615 1619 1594 1595 1594 1596 1568 1556 1533 1527 1516 1516 1518 1516 1494* 1457 (nujol) 1458 (nujo!) 1457 (nujoi) 1458 (nujot) 1443 1448 1419 1396 1390 1377 (nujol) 1378 (nujol) 1377 (nujoi) 1378 (nujol) 1356 1344 1344 1334 1338 1321 1317 1313 1304 1300 1270 1267 1254 1241 1245 1249 1228 1229 1210 l I l i 5

Taulukko 1 (jatkoa) 30 α-muoto S-muoto_Y^muoto_ Π95 1198 1172 Π7Β 1174 1164 1162 1151’ 1144 1143 1141 1137 1118 im Π09 1106 1108 1093 109B 1091 1074 1075 1064 1045 1046 1045 1031 1033 1019 1012 1019 1003 1001 981 980 965 972 965 962 962 945 941 932 911 907 909 897* 889 8S9 879 877 862 649 841 830 622 81B 615 800 80B 606 607 780 778 762 763 753 744 737 732 721 721 729 721 665 _655_,___668_____ 655 5 * tarkoittaa viivoja, jotka on katsottu tärkeimmik si eri muotojen eroavaisuuden suhteen.

31

Infrapunaspektrit eri muodoille esitetään kuvissa IA, IB, 2A, 2B, 3A, 3B, 4A ja 4B.

(b) Röntgendiffraktio (PXRD)

Eri muotojen röntgendiffraktiokuviot saatiin käyt-5 täen Siemens D500 -diffraktometria, jota käytettiin 40 kV/30 mA:n säädöillä ja käyttäen grafiittimonokromaatto-rilla suodatettua kuparisäteilytystä (λ = 0,15405 nm) ja tuikelaskindetektoria. Kullekin muodolle tallennettiin sä-dekimpun intensiteetti kulman 2Θ funktiona alueella 2 - 45° 10 2Θ, käyttäen vaiheittaista laskentaa kuuden sekunnin ajan, vaihevälin ollessa 0,03° 2Θ. Kunkin muodon päähuiput (2Θ — astetta), jotka tulivat esiin kuviossa, on lueteltu taulukossa 2 .

15 Taulukko 2

Ct-muoto B-imioto γ-muoto 5-inuoto (terävät huiput) (terävät huiput) (terävät huiput) 7,5 8.9 9.9 Leveät huiput, 9,0,.9,6 joiden keski- 10,6 10,5, 10,8 11 g kohdat olivat 116 1 arvojen 11 ja y „ 20 kohdalla “V ‘'v'3 13,3 14,6 14,5 15,6 16,2 17,2, 17,5 17,9 17,2, 17,6, 17.9 18.0 18,8 18,9 20.2 20,2 20,4 21,8 21,5 22.1 22,4 23.3 23,0, 23,1 24,7 27,1, 27,8 28.9 32 Röntgendiffraktiokuviot eri muodoille esitetään kuvissa 5-8.

(c) Differentiaalipyyhkäisykalorimetri (DSC)

Eri muotojen näytteitä (noin 5 mg) analysoitiin 5 käyttäen Perkin-Elmer 7 -sarjan lämpöanalysaattoria pyyh- käisynopeudella 20 °C minuutissa. Eri muodoille saadut tulokset on esitetty yhteenvetona taulukossa 3.

Taulukko 3 10 Muoto DSC-analyysin yhteenveto α-muoto Terävä endoterminen reaktio 248 - 259 °C:ssa. Hajoaminen yli 260 °C:ssa.

β-muoto Leveä endoterminen reaktio 60 - 15 130 °C:ssa. Heikko endoterminen reaktio noin 147 °C:ssa.

Hajoaminen yli 200 °C:ssa.

γ-muoto Terävä endoterminen reaktio 176 - 186 °C:ssa. Terävä eksoterminen 2 0 reaktio noin 207 °C:ssa.

Heikko endoterminen reaktio noin 213 °C:ssa.

Hajoaminen yli 250 °C:ssa.

δ-muoto Terävät endotermiset reaktiot noin 25 162 ja noin 166 - 168 °C:ssa.

Hajoaminen yli 200 °C:ssa.

Eri muotojen DSC-lämpögrammit esitetään kuvissa 9 - 12 .

30 (d) Sulamispiste

Eri muotojen sulamispisteet määritettiin lämpölevy-mikroskoopilla, käyttäen Mettler FP5/FP52 -laitetta kuumen-nusnopeudella 2 °C minuutissa. Tyypilliset lämpötila-alueet, joissa eri muodot sulivat, esitetään taulukossa 4.

Taulukko 4 33

Muoto Terävät sulamispisteet alueella (°C)

Ot-muoto 242-252 T-muoto 170-185 —— ---—.............................—-— - _5-muoto__165-175_

Vertailututkimukset a- ja β-muotoja verrattiin käsittely- ja hygro-5 skooppisuuskokeita käyttäen.

(a) Käsittelytutkimus

Instrumentoitu tablettikone (Manesty Machines Limited, malli F3) kalibroitiin tyydyttävästi voiman ja yläpai-nimen säädön suhteen.

10 Kun se oli kalibroitu, Avicel- (tavaramerkki)/DCP- plaseboseosta (kaksiemäksinen kalsiumfosfaatti) työstettiin koneessa, käyttäen 13 mmm tasapintaisia painimia menetelmän toistettavuuden mittaamiseksi. Käyttäen tasamääriä seosta, kone säädettiin sopivasti siten, että saatiin ha-15 luttu puristepaino (400 mg) ja riittävä kovuus. Konetta käytettiin alivoimalla, kunnes syöttökengässä oleva seos oli käytetty loppuun eikä tabletteja enää valmistunut. Kuva 13 esittää kuvaajaa yläpainimen voimalle tablettien lukumäärän funktiona kolmelle Avicel/DCP-plaseboseokselle, kul-20 lekin 20 yksikölle, ja taulukossa 5 esitetään 10 kovimman tabletin (joiden oletetaan olevan 10 ensimmäistä tablettia) keskimääräiset painot ja kovuudet. Kuvassa 13 esitetyistä tiedoista voidaan nähdä, että kokona!smenetelmä tälle seokselle on erittäin toistettava. Yläpainimen voiman vähenemi-25 nen, joka ilmeni kierroksen lopussa, voi korreloida syöt-tösukassa olevan määrän vähenemisen ja sitä seuraavan muotin heikon täyttymisen kanssa.

34

Taulukko 5

Taulukko, jossa esitetään Avicel/DCP-plaseboseosta käyttäen valmistettujen tablettien keskimääräiset painot ja kovuudet.

Keski- Keskiinääräi-

Klerros paino Hajonta nen kovuus Hajonta __(mg)___(kPa)_____ 1 394,3 7,82 16,0 1,68 2 3B9,6 9,20 14,6 2,04 3 393,3_6,93 15,1 1,22 5

Kun menetelmän toistettavuus oli määritetty, a- ja β-muotoa sisältävät seokset valmistettiin erikseen seuraa-van formulaation mukaisesti: a- tai β-muotoa {100 mg), esi-gelatinoitua tärkkelystä (40 mg) , kaksiemäksistä kalsium-10 fosfaattia (vedetön laatu) (256 mg) ja magnesiumstearaattia (2 mg) . Sekoitus/seulonta/sekoitusmenetelmää käytettiin 20 g:n seoksen valmistamiseksi ennen koneeseen viemistä. Syöt-tömäärä oli 100 mg, sillä aikaisemman kokemuksen perusteella oli osoitettu, että mitä suurempi on syöttömäärä, sitä 15 enemmän ilmenee ongelmia prosessin aikana. Kone säädettiin seosta varten ja valmistettiin 50 tablettia kyseessä olevasta seoksesta yhdessä erässä.

Koneen optimointi oli vaikeampaa β-muodon seoksen kanssa, koska sen valuvuusominaisuudet olivat heikommat. 20 Huolimatta tarkasta menetelmämuuttujien säädöstä, yläpaini-men voimaa ei pystytty pitämään vakiona kummankin seoksen välillä, ja siten β-muodon seos puristettiin kovemmiksi tableteiksi.

Yläpainimen tiedot esitetään kummallekin seokselle 25 kuvassa 14. Suuri vaihtelu yläpainimen voimassa (ja tabletin painossa) β-muodon seokselle liitettiin muotin epäyhtenäiseen täyttymiseen tämän formulaation tapauksessa. Taulukossa 6 esitetyt tiedot vahvistavat sen, että β-muodon formulaation työstäminen oli huomattavasti vaikeampaa ja sii-30 hen liittyy paljon enemmän vaihtelua kuin käytettäessä a-muodon formulaatiota.

Taulukko 6

Taulukossa esitetään menetelmäparametrien vaihtelu a- ja β-muotoja sisältäville seoksille.

35 Näyte YlHpal- Hajonta . Tabletin Hajonta Keskimaa- Hajonta nimen keski— räinen keskim. paino kovuus voima (mg) (kP) __(kN)___

Ot-muodon seos 18,0 1,B5 398 17,6 5,0 1,15 fb "OIQ0- ä°n seos 23,2 7,07 446 4B,7 18y5 4,69 5

Mitattu syöttövoima kymmenelle viimeiselle tabletille kummallekin seokselle esitetään kuvassa 15. Tabletit, jotka oli muodostettu β-muodosta, vaativat paljon suuremman voiman niiden poistamiseksi muotista. Tämä vaikutus tuli 10 esiin tableteissa, jotka syöttökenkä "lennätti" muotista.

Saadut tiedot osoittavat, että β-muodolla on huonot työstöominaisuudet α-muotoon verrattuna, β-muodolla on alhainen kaatotiheys (irtotiheys = 0,09 g ml'1, verrattuna 0,36 g ml-:i:een α-muodolle) sekä huonot valuuvusominaisuu-15 det, ja tabletoitaessa sitä sisältävää seosta tablettien painoissa on suurta eroa ja tarvitaan suurta ejektiovoimaa. Kaikkien näiden suhteen α-muodolla on osoitettu olevan paremmat ominaisuudet, mikä tekee siitä erityisesti sopivan farmaseuttiseen formulointiin.

20 (b) Hygroskooppisuuskoe (i) a- ja β-muotojen hygroskooppisuutta arvioitiin gravimetrisellä analyysillä seuraavasti.

a- ja β-näytteet laitettiin erikseen Kilner (tavaramerkki) -astioihin seuraaviin olosuhteisiin: 40 °C; 40 °C 25 ja 75 % RH (suhteellinen kosteus) ja 40 °C ja 95 % RH. Veden talteenotto kussakin näytteessä arvioitiin gravimetri-sesti, triplikaatteina, valittujen ajanjaksojen jälkeen.

36 β-muodon näytteissä, joita säilytettiin 40 °C/75 % RH:ssa tai 40 °C/95 % RH:ssa yksi päivä, ilmeni morfologisia muutoksia. β-muodon näytteissä, joita säilytettiin 40 °C/95 % RH:ssa yksi päivä, ilmeni pientä painonpudotusta 5 (oletettavasti sen jälkeen, kun paino oli noussut veden imeytymisen vuoksi ja sitä seuranut morfologinen muutos ja sitten kosteushäviö), kun taas näytteet, joita säilytettiin 40 °C/75 % RH:ssa, lisäsivät painoaan keskimäärin 6 %.

Kuvassa 16 esitetään gravimetrisistä analyyseistä 10 saadut tulokset, α-muodon ei havaittu olevan hygroskooppi nen. β-muoto oli kuitenkin erittäin hygroskooppinen 40 °C/75 % RH:ssa.

(ii) a- ja β-muodoilla suoritetut kosteusmikrotasa-painotutkimukset vahvistivat, että α-muoto ei ollut hygro-15 skooppinen, kun β-muoto oli erittäin hygroskooppinen, a- ja β-muotojen näytteet laitettiin erikseen laitteeseen 40 °C:seen ja annettiin tasapainottua ympäristön kanssa, ennenkuin kyseessä oleva näyte altistettiin kasvaville suhteellisille kosteuksille, ja kosteuden lisäysten välillä 20 oli tasapainottumisjaksot.

Tulokset esitetään kuvassa 17. Nämä osoittavat, että kokeen aikana β-muoto keräsi itseensä yhteensä 8 paino-% vettä (verrattuna alkuperäiseen painoon).

Suurissa kosteuspitoisuuksissa β-muodon läpikäymää 25 morfologista muutosta tutkittiin edelleen ja havaittiin erittäin alhaisen kaatotilavuuden omaavan jauheen muuttuminen tiheäksi lasimaiseksi kiinteäksi aineeksi.

Claims (15)

1. Menetelmä uuden, terapeuttisesti käyttökelpoisen yhdisteen valmistamiseksi, joka on kaavan (I) mukaisen yh~ 5 disteen i^hso2ch3 .. JL o Η-,Ν ^ f fl 10 * »S π At HOiC^^XONH^CO.H kiteinen, a-polymorfinen muoto, 15 jolle on tunnusomaista infrapunaspektri {nujolitah- das), jossa näkyvät absorptioviivat arvoilla v = 3 407, 3 386, 3 223, 3 153, 1 699, 1 652, 1 626, 1 594, 1 516, 1 457 (nujoli) , 1 377 (nujoli}, 1 344, 1 334, 1 317, 1 267, 1 241, 1 228, 1 210, 1 164, 1 151, 1 137, 1 118, 1 109, 20 1 093, 1 074, 1 045, 1 019, 1 003, 981, 965, 911, 897, 862, 818, 800, 778, 7 62, 721, ja 655 cm-1, tunnettu siitä, että a) hydrataan katalyyttisesti vesiliuosta, jossa on kaavan (II) mukaisen yhdisteen natrium-, kalium-, ammonium- 25 tai Ci-4-alkyyliammoniumsuolaa: O yHSO,CH3 fT0H

30 H -1 (II) HO.C^^'^CONH'^CChH 35 käyttäen sopivaa katalyyttiä, joka kykenee poistamaan bent-syylioksikarbonyylisuojaryhmän, kuten palladioitua hiiltä, sen jälkeen tehdään saatu kaavan (I) mukaisen yhdisteen emassuola happamaksi pH-arvoon 3-5, edullisesti noin pH 4, jolloin saadaan haluttu α-polymorfinen muoto; (b) käsitellään tässä patenttivaatimuksessa määri-5 tellyn kaavan (I) mukaisen yhdisteen hydratoitua δ-muotoa, jolle on tunnusomaista vesipitoisuus, joka on 1 - 7 paino-%, määritettynä Karl Fischerin menetelmällä, ja infrapuna-spektri (nujolitahdas) , jossa näkyvät absorptioviivat arvoilla v = 3 667, 3 425, 3 380, 3 287, 3 137, 3 098, 10 1 709, 1 673, 1 637, 1 619, 1 596, 1 568, 1 556, 1 516, 1 458 (nujoli), 1 448, 1 419, 1 390, 1 378 (nujoli), 1 356, 1 338, 1 300, 1 270, 1 249, 1 229, 1 198, 1 174, 1 141, 1 108, 1 091, 1 075, 1 064, 1 045, 1 033, 1 019, 1 001, 985, 962, 941, 909, 889, 877, 841, 822, 807, 763, 744, 732, 15 721 ja 655 cm”1, vedellä, Ci_4-alkanolin, kuten metanolin tai 2-propanolin vesiliuoksella tai C3-6-"alkanonin, kuten asetonin, vesiliuoksella; (c) käsitellään tässä patenttivaatimuksessa määritellyn kaavan (I) mukaisen yhdisteen γ-polymorfista muotoa, 20 jolle on tunnusomaista infrapunaspektri (nujolitahdas), jossa näkyvät absorptioviivat arvoilla v = 3 377, 3 240, 1 665, 1 639, 1 594, 1 527, 1 518, 1 494, 1 457 (nujoli), 1 443, 1 377 (nujoli), 1 344, 1 321, 1 304, 1 254, 1 195, 1 178, 1 162, 1 143, 1 111, 1 098, 1 046, 1 031, 1 012, 25 972, 962, 945, 932, 907, 879, 849, 815, 806, 780, 753, 729 ja 658 cm”1, vedellä, Ci-4-alkanolin, kuten metanolin tai 2-propanolin vesiliuoksella tai C3-6~alkanonin, kuten asetonin vesiliuoksella; (d) käsitellään tässä patenttivaatimuksessa määri-30 tellyn kaavan (I) mukaisen yhdisteen amorfista β-muotoa, jolle on tunnusomaista infrapunaspektri (nujolitahdas), jossa näkyvät absorptioviivat arvoilla v = 3 384, 1 708, 1 638, 1 615, 1 595, 1 533, 1 516, 1 458 (nujoli), 1 396, 1 378 (nujoli), 1 313, 1 245, 1 172, 1 144, 1 106, 980, 35 889, 830, 808, 737, 721 ja 665 cm”1, vedellä, Ci-4-alkanolin, kuten metanolin tai 2-propanolin vesiliuoksella tai C3-6“ alkanonin, kuten asetonin vesiliuoksella; (e) hydrataan katalyyttisesti liuos, jossa on tässä patenttivaatimuksessa määriteltyä kaavan (II) mukaista yh- 5 distettä vesipitoisessa orgaanisessa liuottimessa, sopivan katalyytin läsnä ollessa, joka kykenee poistamaan bentsyy-lioksikarbonyylisuojaryhmän, kuten palladioidun hiilen läsnä ollessa, poistetaan katalyytti ja liuotin seoksesta bentsyylioksikarbonyylisuojaryhmän poiston lopussa ja se- 10 koitetaan jäännös Cj-g-alkanoniin, kuten asetoniin; (f) poistetaan suojaryhmät, edullisesti happamissa olosuhteissa, yhdisteestä, jolla on kaava (XII): 15 nhso2ch3 i //-oö p‘hn v r I HN. - ^ I I f (xii) 20 pi02C'^O><^0NH'^C02P3 jossa P1, P2, P3 ja P4 ovat suojaryhmiä, jolloin P1 on formyyli tai bentsyylioksikarbonyyli ja P2, P3 ja P4 ovat 25 kaikki t-butyylejä ja jolloin saadaan, sen jälkeen, kun pH on säädetty arvoon 3-5, edullisesti arvoon 4, jälkikäsittelyn yhteydessä, haluttu a-polymorfinen muoto; tai (g) poistetaan suojaryhmä, edullisesti happamissa olosuhteissa, yhdisteestä, jolla on kaava (XIII): 30 yHS02CH3 ΡΉΝ ^ v J Γ )| (XIII) |—............| H02C^\^^CONH'x\CO;;H jossa P5 on suojaryhmä, joka on formyyli, jolloin saadaan sen jälkeen, kun pH on säädetty arvoon 3-5, edullisesti arvoon 4, jälkikäsittelyn yhteydessä, haluttu a-polymorfinen muoto.

2. Patenttivaatimuksen l{a} mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että katalyytti on palladioitu hii li.

3. H02C'^x-^>X0NH'^C02H

3. Patenttivaatimuksen l{a} tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään kaavan {II} mu- 10 kaisen yhdisteen natriumsuolaa.

4. Patenttivaatimuksen 1(a), 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että happamaksi tekeminen suoritetaan 35 - 45 °C:ssa.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen me-15 netelmä, tunnettu siitä, että kaavan (I) mukaisen yhdisteen α-polymorfista muotoa karakterisoidaan lisäksi jauheröntgendiffraktiokuviolla, joka on saatu käyttäen ku-parisäteilytystä, joka on suodatettu grafiittimonokromaat-torilla (λ - 0,15405 nm), ja siinä näkyvät päähuiput ar-20 voi 11 la 7,5, 8,9, 9,9, 11,6, 15,6, 17,2, 17,5, 18,0, 20,2, 22,1 ja 23,1 20-astetta.

6. Patenttivaatimuksen 1(c) mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan (I) mukaisen yhdisteen γ-polymorfinen muoto valmistetaan siten, että patent- 25 tivaatimuksen 1 kohdassa (b) määriteltyä kaavan (I) mukaisen yhdisteen hydratoitua δ-muotoa käsitellään 1-propano-lilla tai asetonitriilillä.

7. Patenttivaatimuksen 1(c) mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan (I) mukaisen yhdisteen 30 y-polymorfinen muoto valmistetaan siten, että patent tivaatimuksen 1 kohdassa (d) määriteltyä kaavan (I) mukaisen yhdisteen amorfista β-muotoa käsitellään asetonitriilillä tai n-propanolilla.

8. Patenttivaatimuksen 1(c) mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että kaavan (I) mukaisen yhdisteen γ-polymorfinen muoto valmistetaan siten, että patent- tivaatimuksen 1 kohdassa (b) määriteltyä kaavan (I) mukaisen yhdisteen hydratoidun δ-muodon vesiliuosta käsitellään tilavuusylimäärällä C3_6-alkanonia, kuten asetonia.

9. Patenttivaatimuksen 1(b) mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että kaavan (I) mukaisen yhdisteen hydratoitu δ-muoto valmistetaan siten että, hydrataan ka-talyyttisesti liuosta, jossa on patenttivaatimuksen 1 kohdassa (a) määriteltyä kaavan (II) mukaista yhdistettä seoksessa, jossa on veteen sekoittumatonta liuotinta ja vettä, 10 sopivan katalyytin läsnä ollessa, joka kykenee poistamaan bentsyylioksikarbonyylisuojaryhmän, poistetaan katalyytti ja erotetaan vesikerros bentsyylioksikarbonyylisuojaryhmän poiston lopussa, sen jälkeen käsitellään vesikerrosta Ci_4-alkanolilla, kuten metanolilla.

10. Patenttivaatimuksen 1(d) mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan (I) mukaisen yhdisteen amorfinen β-muoto valmistetaan siten, että jäädytyskuivataan patenttivaatimuksen 1 kohdassa (b) määritelty kaavan (I) mukaisen yhdisteen hydratoidun δ-muodon jäädytetty ve- 20 siliuos.

11. Patenttivaatimuksen 1(d) mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan (I) mukaisen yhdisteen amorfinen β-muoto valmistetaan siten, että jäädytyskuiva-taan väkevöity vesiliuos, jossa on patenttivaatimuksessa 1 25 määritellyn kaavan (I) mukaisen yhdisteen a-polymorfista muotoa.

12. Kaavan (II) mukaisen yhdisteen natrium-, kalium- ammonium- tai Ci-^-alkyyliammoniumsuola 30 o «hso2ch3 X J> ^OH rf rr tm kj «S ΓΠ

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen yhdiste, joka on kaavan {II) mukaisen yhdisteen natriumsuola.

14. Yhdiste, jolla on kaava (XII): NHS02CH3 P HN ~ y I HN. j-j ? ! j Γ (XIIS P202C/\-^'C0NH'^C02P3 5 jossa P1 on formyyli ja P2, P3 ja P4 ovat kukin t- butyylejä.

15. Yhdiste, jolla on kaava (XIII): ynso2CH3 “S n jossa P5 on formyyli.