FI119723B - Suihkukuivattu erytropoietiini - Google Patents

Description

Suihkukuivattu erytropoietiini Tämä hakemus on osittain jatkoa patenttihakemukselle sarjanumero 08/357 947, joka on jätetty 16. joulukuuta 5 1994.

Tämä keksintö koskee menetelmää suihkukuivatun erytropoietiinin valmistamiseksi ja siten valmistettua kuivaa erytropoietiinijauhetta.

Keksinnön tausta 10 Erytropoietiini (EPO) on glykoproteiinihormoni, jota syntetisoituu pääasiassa munuaisessa, ja se on punasolujen tuotannon tärkein säätelijä elimistössä. Kaupallisesti saatavissa olevaa ihmisen EPO:a tuotetaan yhdistel-mä-DNA-menetelmin ja sitä kutsutaan rekombinanttihumaani-15 EPO:ksi (rhEPO) . rhEPO:n molekyylimassa on noin 36 000 daltonia SDS-PAGE:lla määritettynä. Proteiinirungon molekyylimassa on 18398 daltonia, mikä osoittaa, että koko molekyyli on voimakkaasti glykosyloitunut. Hiilihydraatti-ryhmät ovat tärkeitä biologisen aktiivisuuden kannalta in 20 vivo.

Proteiinien, kuten rhEPO:n pitäminen alkuperäisessä tilassa vesiliuoksessa tai kiinteässä faasissa on yksi suuri haaste farmaseuttisten formuloiden kentällä työskenteleville. Proteiinin olo alkuperäisessä tilassaan riippuu 25 liuotteen proteiinipitoisuudesta, lämpötilasta ja luon teesta, puskurin ionivahvuudesta jne. Muutokset missä tahansa näistä parametreista voivat vaikuttaa liuoksessa tai kiinteässä faasissa olevan proteiinin stabiiliuteen.

Kaupallisia rhEPO-valmisteita myydään nykyisin joko 30 laimeina vesiliuoksina tai kylmäkuivatussa muodossa, jota käytetään laimean vesiliuoksen muodostamiseen; molempia annetaan elimistöön injektoimalla. Näiden valmisteiden rhEPO-pitoisuus on hyvin pieni, ja rhEPO poistuu elimistöstä melko nopeasti annon jälkeen. Nykyisten valmisteiden 35 tämän rajoituksen valossa on olemassa tarve konsentroi- < i 2 duille, esimerkiksi suurempia rhEPO-määriä sisältäville, rhEPO-valmisteille, joita voidaan käyttää vaihtoehtoisissa lääkkeenantojärjestelmissä. Olemme käyttäneet suihkukui-vausmenetelmää mainitunlaisten valmisteiden valmistami-5 seen.

Lääkkeiden suihkukuivaus on alalla tunnettua. Katso esimerkiksi J. Broadhead et ai., The Spray Drying of Pharmaceuticals, Drug Dev. Ind. Pharm. 18 (11 & 12) (1992) 1169 - 1206. Pienimolekyylisten lääkeaineiden lisäksi on 10 kuivattu erilaisia biologisia materiaaleja; näihin kuuluvat entsyymit, seerumit, plasma, mikro-organismit ja hiivat. Suihkukuivaus on käyttökelpoinen menetelmä, koska sillä voidaan muuttaa nestemäinen farmaseuttinen valmiste hienojakoiseksi, pölyämättömäksi tai agglomeroiduksi jau-15 heeksi yksivaiheisessa prosessissa. Perusmenetelmä käsit tää seuraavat neljä vaihetta: a) syöteliuoksen sumutus suihkuksi; b) suihkun ja ilman välinen kosketus; c) suihkun kuivaus; 20 d) kuivatun tuotteen erotus kuivausilmasta.

Vaikka suihkukuivaus tunnetaan lääkeainealalla, sille ei ole ollut paljoakaan käyttöä terapeuttisten proteiinien, kuten rhEPOm, yhteydessä. Yksi ilmeinen syy tähän on huoli siitä, että suihkukuivausprosessissa käy-25 tettävä korkeat lämpötilat voivat hajottaa termisesti mai nitunlaisia proteiineja. Tämä pätee erityisesti monimutkaisiin glykoproteiineihin, kuten rhEPOriin, joissa on polypeptidirungon lisäksi monimutkaisia haaroittuneita hiilihydraattiosia, jotka ovat tarpeen biologisen aktiivi-30 suuden kannalta. Kylmäkuivauksen olo käytettävissä valmiina vaihtoehtona on ohjannut edelleen tällä alalla työskenteleviä pois suihkukuivauksen käytöstä terapeuttisten proteiinien yhteydessä. Suihkukuivaus tarjoaa kuitenkin tiettyjä etuja kylmäkuivaukseen nähden, koska se on talou-35 dellisempi, nopea ja helposti toteutettavissa laajamittai- 3 semmin. Suihkukuivatut jauheet ovat usein myös sopivampia jatkokäsittelyyn kuin kylmäkuivatut jauheet.

Tavallisesti on epäkäytännöllistä suunnitella formuloita lähtien yksinomaan bulkkilääkeaineen kylmäkuivauk-5 sesta. Tämä johtuu siitä, että monet polypeptidit ovat suhteellisen epästabiileja kylmäkuivattaessa niitä pieninä pitoisuuksina ja ne saattavat adsorboitua tuotteen pakkaukseen ja menettää aktiivisuutta. Näiden ongelmien voittamiseksi monien farmaseuttisten koostumusten yhteydessä 10 turvaudutaan kiinteiden laimennusaineiden, kylmäsuojausai- neiden tai täyteaineiden käyttöön kylmäkuivausprosessin aikana läsnä olevan kiinteän materiaalin määrän suurentamiseksi. Seurauksena on, että lopullinen kylmäkuivattu materiaali sisältää pienenä painoprosenttisena osuutena 15 aktiivista lääkeainetta sekoittuneena suuren prosentti osuuteen muuta kiinteää materiaalia.

Tämä keksintö tarjoaa sen sijaan käyttöön menetelmän rhEPO-jauheen valmistamiseksi bulkki-rhEPO:sta, jonka yhteydessä valmistettu jauhe on puhdasta tai olennaisilta 20 osiltaan puhdasta rhEPO:a tai sisältää suurempana paino-prosenttisena osuutena rhEPO:a, kuin on saatavissa aikaan käyttämällä perinteistä kylmäkuivausmenetelmää.

Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö tarjoaa käyttöön menetelmän stabii-25 Iin, kylmäkuivatun rhEPO:n valmistamiseksi ja siten valmistetun rhEPO-jauheen. j Tämän keksinnön mukainen menetelmä käsittää ensin sellaisen vesipitoisen rhEPO-liuoksen aikaansaannin, jossa pitoisuus on suunnilleen alueella 20 - 100 mg/ml. Tämä 1 30 liuos sumutetaan sitten suihkuksi ja suihku kuivataan kuumalla ilmalla veden haihduttamiseksi pois suihkusta. Siten valmistettu kuivattu rhEPO erotetaan sitten kuivausilmas- j ta.

Lähtömateriaalina oleva vesiliuos voi sisältää 35 rhEPO:n lisäksi täyteaineita, kuten mannitolia, glysiiniä 4 ja/tai pinta-aktiivisuusainetta. Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettu kuiva rhEPO-koostumus käsittää rhEPO:a pitoisuutena 4,0 - 100 paino-%, ja sen jäännösve-sipitoisuus on suunnilleen alueella 3,0 - 5,0 paino-%.

5 Koostumuksen hiukkaskoko on suunnilleen alueella 2,0 - , 6,0 μπι.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Suihkukuivaukseen käytettiin konsentroitua rhEPO-liuos, jossa pitoisuus oli vähintään 20 mg/ml. Konsentroi-10 tu vesipitoinen liuos sumutettiin pieniksi pisaroiksi pumppaamalla se paineilman avulla suuttimen läpi. Pisarat tulivat sitten kuivauskammioon, ja vesi haihdutettiin kuumalla kuivausilmalla, joka virtasi samaan suuntaan syöte-liuoksen kanssa. Kun vesi haihtui, kiinteä rhEPO ja täyte-15 aineet, mikäli niitä oli läsnä, erottuivat vesipitoisista pisaroista. Kuivausilmavirta kuljetti kuivatun rhEPO:n syklonierottimeen laskeutettavaksi, ts. kuivattu rhEPO erotettiin kuivausilmasta ja kuivattu tuote kerättiin syk-lonierottimen pohjalle kiinnitettyyn kokooma-astiaan. Kui-20 vausilma poistettiin sitten ulos hienojakoisen aineksen poistavan pesurin kautta.

Tässä käytettynä ilmaus "rhEPO" tarkoittaa mitä tahansa proteiinia, jolla on US-patenttijulkaisussa 4 703 008 rhEPO:n yhteydessä kuvattu kokopolypeptidirunko 25 tai osa siitä ja biologinen kyky saattaa luuytimen solut lisäämään retikulosyyttien ja punasolujen tuotantoa ja ! lisäämään henoglobiinisynteesiä tai raudan soluunottoa. Ajatuksena on, että tämän keksinnön yhteydessä voidaan käyttää EPO:n biologisesti aktiivisia fragmentteja, analo-30 geja tai kemiallisesti syntetisoituja johdoksia rhEPO:n sijasta sillä edellytyksellä, että mainitunlaisissa fragmenteissa tai johdoksissa on jäljellä rhEPO:n biologinen aktiivisuus. US-patenttijulkaisussa 4 703 008 kuvataan tiettyjä EPO-analogeja. Mainitunlaisten biologisesti ak-35 tiivisten EPO-analogien, -fragmenttien tai -johdosten käy- 5 tön katsotaan siksi olevan tämän keksinnön suoja-alan piirissä .

Tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja konsentroituja rhEPO-jauheita voidaan käyttää vaihtoehtoisissa 5 lääkkeenantojärjestelmissä rhEPO:n antamiseksi. Yksi mai- ' nitunlainen järjestelmä on kontrolloidusti vapauttava anto järjestelmä, joka luovuttaa rhEPO:a määrätyllä nopeudella määrätyn ajan elimistössä. Konsentroidut rhEPO-jauheet voidaan vaihtoehtoisesti saattaa käyttökelpoiseen muotoon 10 käyttämällä injektioihin soveltuvaa vettä tai normaalia fysiologista suolaliuosta, niin että muodostuu vesipitoisia liuoksia, jotka sovetuvat käytettäviksi ihmisen hoidossa. Edellä mainittujen kontrolloidusti vapauttavien järjestemien ajatellaan sisältävän rhEPO:a sijoitettuna 15 polymeerimateriaaliin, vesikkeleihin tai pienikoiseen pumppuun samoin kuin rhEPO:n ja muiden polymeeristen materiaalien muodostamiin makromolekyylikonjugaatteihin. Näitä järjestelmiä voidaan sitten käyttää ihonalaisina konsentroitua rhEPO:a sisältävinä varastoistutteina. Keksintöä 2 0 rajoittamattomiin esimerkkeihin näistä järjestelmistä kuu luvat rhEPO:a ympäröivät kiinteistä hydrofobisista polymeereistä, kuten hajoamattomista eteenivinyyliasetaattiko-polymeereistä tai hajoavista maitohappo-glykolihappokopo-lymeereistä, koostuvat matriksit. Mainitunlaiset hydrofo-25 biset polymeerit voivat lisäksi olla mikrohelmien muodossa.

Tämä keksintö tarjoaa käyttöön stabiilin rhEPO-jauheen. Tässä käytettynä "stabiili" tarkoittaa, että rhEPO:n I

biologinen aktiivisuus säilyy ajan kuluessa ja sen rakenne 30 säilyy alkuperäisessä tilassaan, ts. se ei hapetu tai muutu muulla tavoin toiseksi kemialliseksi lajikkeeksi. Sta- j biilius voidaan osoittaa RIA:lla, Western Blot -menetelmin ja biologisin in vivo ja in vitro -määrityksin.

Seuraavat esimerkit annetaan tämän keksinnön valai-35 semiseksi. Näiden esimerkkien ei tule ymmärtää rajoittavan i 6 keksintöä; sitä rajoittavat ainoastaan oheiset patenttivaatimukset .

Esimerkki 1

Menetelmä rhEPO:n suihkukuivaamiseksi 5 Tässä esimerkissä kuvataan suihkukuivausmenetelmää, jota käytetään tuottamaan kiinteässä muodossa olevaa amorfista rhEPO:a yksinään tai yhdistettynä inertteihin, farmaseuttisesti hyväksyttäviin täyteaineisiin. Siten formuloitu amorfinen bulkki-rhEPO on stabiilia vähintään 6 kuulo kautta säilytettäessä sitä lämpötilassa 5 °C (jääkaapissa) . Yleisesti tiedossa olevaa terapeuttisten proteiinien suihkukuivausta kuvaavaa kirjallisuutta on rajoitetusti, eikä siinä käsitellä terapeuttisten proteiinien stabiiliutta kuivatussa muodossa suurehkoina pitoisuuksina, ku-15 ten vähintään 25 paino-%. Katso esimerkiksi Mumenthaler et ai., Pharm. Res. 11 (1994) 12 - 20. Kirjallisuudessa ei myöskään esitetä riittävää näyttöä näiden proteiinien stabiiliudesta kiinteässä muodossa. Joissakin julkaisuissa esitetään itse asiassa stabiiliuden olevan epätyydyttävä, 20 mikä saattaa johtua käytetyistä täyteaineista tai käsittelyolosuhteista. Esimerkiksi tiettyjen epäorgaanisten suolojen, aminohappojen, pinta-aktiivisuusaineiden jne. tiedetään stabiloivan proteiineja liuoksessa. Sitraattisuolo-jen läsnäolo rhEPO-massasta ei kuitenkaan antanut tulok-25 seksi stabiilia suihkukuivattua rhEPO:a. Bulkki-rhEPO dia- j lysoitiin siksi injektioihin soveltuvaan veteen ennen ! suihkukuivausta. Tyydyttävän tuoteannoon saamiseksi suih-kukuivauksessa dialyysiä jatkettiin, kunnes rhEPO-pitoi-suus oli alueella 20 - 100 mg/ml. Näillä konsentroiduilla 30 bulkki-rhEPO-liuoksilla injektioihin soveltuvassa vedessä oli tyydyttävä stabiilius vähintään 6 kuukauden ajan säilytettäessä niitä lämpötilassa 5 °C. Yksi vaihtoehtoinen menetelmä kuivien proteiinien valmistamiseksi, kylmäkui-vaus, ei soveltunut rhEPO:lle, koska stabiilius oli heikko 7 riippumatta sitraattisuolojen läsnäolosta (katso esimerkki 2) .

Menetelmä kiinteän rhEPO:n ja täyteaineita sisältävän rhEPO-jauheen valmistamiseksi koostui seuraavista kah-5 desta vaiheesta: A. bulkki-rhEPO:n dialysointi ja konsentrointi; B. dialysoidun bulkki-rhEPO:n suihkukuivaus.

A. Dialyysi ja konsentrointi

Sitraattipuskurissa (20 mmol/1) toimitettu bulkki-10 rhEPO dialysoitiin kaiken sitraatin poistamiseksi ja korvaamiseksi injektiovedellä. Dialyysi tehtiin seuraavasti:

Sitraattipuskurissa (200 ml) oleva bulkki-rhEPO (pitoisuus noin 2,0 mg/ml) siirrettiin AmiconR-dialyysi-laitteeseen, joka oli varustettu dialyysikalvolla, jonka 15 molekyylimassaraja oli 10 000. Tämä dialyysikenno kiinni tettiin ruostumattomasta teräksestä valmistettuun astiaan, joka sisälsi injektiovettä, ja astia kytkettiin typpikaa-susäiliöön. Dialyysi tehtiin paineella 207 - 276 kPa (30 -40 psi) ja sitä jatkettiin, kunnes oli kerätty vähintään 20 2 000 ml dialysaattia. Tuloksena oleva sitraatiton rhEPO- vesiliuos konsentroitiin sitten rhEPO-loppupitoisuuteen noin 20 - 100 mg/ml. Tuloksena olevaa konsentroitua rhEPO-vesiliuosta säilytettiin sitten lämpötilassa 5 °C, kunnes se suihkukuivattiin. Konsentroiduista rhEPO-liuoksista 25 seurattiin myös rhEPO:n stabiiliutta lämpötilassa 5 °C.

B. Suihkukuivaus

Suihkukuivausmenettely koostui seuraavista vaiheista.

1. syöteliuoksen sumutus; 30 2. suihkun ja ilman saattaminen kosketukseen; 3. liuotteen haihdutus; 4. kuivatun kiinteän aineen laskeutus eroon kui-vauskaasuista.

Menettelyssä käytettiin laboratoriokokeista suihku-35 kuivainta (BuchiR, malli 190) .

8 1. Sumutus rhEPO-vesiliuos syötettiin sumutus suut time en (sisä-halkaisija 0,5 mm) huoneenlämpötilassa käyttämällä peri-stalttista pumppua. Nestesyöte sumutettiin pieniksi pisa-5 roiksi paineilman avulla. Mainitunlainen sumutus voidaan » saada aikaan myös käyttämällä pyörivää kiekkoa.

2. Suihkun ja ilman saattaminen kosketukseen ja haihdutus

Kun pisarat tulivat haihdutuskammioon (sisäläpimit-10 ta 105 mm, pituus 450 mm) , vesi haihdutettiin kuumalla, myötävirtaan kulkevalla kuivausilmalla. Kuivausilman lämpötila vaihteli alueella 64 - 80 °C. Veden haihtuessa kiinteä aine erottui vesiliuoksesta pallon tai puolipallon muotoisina hiukkasina. Kuivaus voidaan tehdä myös vasta-15 virtamenetelmällä, jossa kuivausilma ja syöteliuos virtaa-vat vastakkaisiin suuntiin.

3. Laskeutus

Kuivausilmavirta kuljetti kuivatun jauheen sykloni-erottimeen laskeutettavaksi. Syklonierottimessa kuivattu 20 kiintoainemassa erotettiin kuivausilmasta. Kuivattu tuote kerättiin kokooma-astiaan, joka oli kiinnitetty sykloerot-timen pohjalle. Kuivausilma (kuivattua tuotetta sisältämätön) päästettiin ulos hienojakoisen aineksen poistavan pesurin kautta.

25 C. Kemiallinen karakterisointi

Tunnettu määrä suihkukuivattua rhEPO:a liuotettiin injektioveteen. Tämä vesiliuos analysoitiin sitten seuraavasti: 1. Radioimmuunimääritys (RZA) : 30 Käytetty menetelmä oli Egrien et ai. mukainen [J.

Immunol. Meth. 99 (1987) 235 - 241]. Tämä menetelmä koostuu rhEPO:n kompleksoinnista kaniinin polyklonaalisen vasta-aineen (kehitetty rhEPO:a vastaan) kanssa. Tämä tehiin inkuboimalla rhEPO:a kaniinin polyklonaalisen vasta-aineen 35 kanssa yön yli jääkaappilämpötilassa. Inkubointia jatket- 9 tiin vielä päivä samoissa olosuhteissa, sen jälkeen kun oli lisätty I-EPO:a. Antigeeni-vasta-ainekompleksi saos-tettiin vuohen antikaniinivasta-aineella, normaalilla kaniinin seerumilla ja polyeteeniglykolilla. Saostettu komp-5 leksi pestiin ja sitoutuneen 125I-EPO:n määrä määritettiin gammalaskurilla. Tämä menettely toistettiin pitoisuudeltaan tunnetuille rhEPO-standardiliuoksille ja tutkittaville näyteliuoksille. Tutkittavien näytteiden rhEPO-pitoi-suudet laskettiin vertaamalla gammalaskurilukemia rhEPO-10 standardiliuoksilie saatuihin vastaaviin lukemiin.

2. Western Blot -analyysi Käytetty menetelmä oli Egrien et ai. [Immunobiol. 172 (1986) 213 - 224] esittämä menetelmä. Annos (0,5 mg) denaturoitua rhEPO:a laitettiin tavanomaiselle (12,5-pro-15 senttiselle) natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidi- geelille (SDS-PAGE). Toteutettiin elektroforeesi ja tehtiin siirto geeliltä nitroselluloosakalvolle käyttämällä Tris:stä, glysiinistä ja metanolista koostuvaa siirtopus-kuria. Nitroselluloosakalvolle tehtiin suojaus liuoksella, 20 joka sisälsi 5 % rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa. rhEP0:a sisältävälle suojatulle nitroselluloosakalvolle tehtiin sitten konjugointi hiiren monoklonaalisen anti-ihmisvasta-aineen kanssa ja sen jälkeen vuohen polyklonaalisen antihiirivasta-aineen 25 kanssa. Kompleksi värjättiin sitten käyttämällä alkalinen fosfataasi -konjugaattisubstraattivälineistöä. Kukin kalvo sisälsi rhEPO-standardia, tunnetun määrän rhEPO-aggregaatteja sisältävää rhEPO-standardia ja yhden tai useamman tutkittavan näytteen. rhEPO-standardin ja aggregaattistan-30 dardin intensiteettiä verrattiin tutkittavan näytteen intensiteettiin.

3. Hiirillä tehtävä biologinen tutkimus

Tunnetusta määrästä suihkukuivattua rhEPO:a valmistettiin käyttövalmis liuos injektioveteen. Tämän liuoksen 35 biologinen aktiivisuus mitattiin seuraamalla raudan vas- 10 taanottonopeutta ekshypoksisissä hiirissä rhEPO-liuoksen injektoinnin jälkeen. Käytetty menetelmä oli Cotesin et ai. mukainen [Nature 191 (1961) 1065 - 1067].

Taulukko 1 5 Formulaesimerkkejä

Nro Aineosat Formulan # (määrät grammoina)

I II III IV V

1 rhEPO 0,0813 0,162 1,5 25 25 10 2 Glysini 1,00 2,00 0 37,5 37,495 3 Mannitol i 1,00 2,00 0 37,5 37,495 4 TweenR 80 0,01 0 0 0 0,01 5 WFI (q.s.) 100 100 100 2000 2000

Huomautus: WFI = injektiovesi 15 Formula nro II suihkukuivattiin kahdessa eri sisääntulo-lämpötilassa, 64 ja 80 °C.

Valmistettiin viisi liuosta liuottamalla täyteaineet, kuten mannitoli, glysiini ja/tai TweenR 80 konsentroituun rhEPO-vesiliuokseen yksi kerrallaan varovasti se-20 koittaen. Formulan III ollessa kyseessä ei lisätty täyteaineita. Näiden liuosten formulat esitetään edellä taulukossa 1. Kaikki nämä liuokset suihkukuivattiin noudattamalla seuraavia suihkukuivausparametreja:

Liuoksen syöttönopeus: 1 ml/min 25 Sumutusilman nopeus: 600 - 700 1/h (NTP)

Kuivausilman nopeus: 32 000 - 45 000 1/h !

Sisääntulolämpötila: 64 - 80 °C

Ulosmenolämpötila: 46 - 65 °C.

Lopullisen kiinteän tuotteen rhEPO-pitoisuus suih- j 30 kukuivauksen jälkeen oli formuloiden I ja II kohdalla noin ( 4 paino-%, formulan III kohdalla 100 paino-% ja formuloiden IV ja V kohdalla 25 paino-% rhEPO:a. Jäännösvesipitoi-suus vaihteli alueella 3,0 - 5,0 paino-% määritettynä

Karl-Fisher-menetelmällä (USP XXII - NF XVII 1995, s.

11 1840 - 1843, menetelmä la). Suihkukuivatun formulan III hiukkaskoko oli 4,1 + 1,89 μτα.

Alustavat kokeet, joissa käytetiin sitraattipusku-ria sisältävää bulkki-rhEPO:a, eivät antaneet tulokseksi 5 stabiilia suihkukuivattua rhEPO:a yhdessä mainnitolin, glysiinin ja/tai TweenR 80:n kanssa. Siksi bulkki-rhEPO:n dialysointi sitraattisuolojen poistamiseksi oli välttämätön suihkukuivauksen kannalta. Hyvän saannon saaamiseksi suihkukuivauksessa syöteliuoksen kiintoainepitoisuuden 10 tuli olla vähintään 2 %. Dialysoitu rhEPO-liuos konsentroitiin siksi pitoisuuteen 20 - 100 mg/ml.

Vertaamalla formuloilla I ja II ja formuloilla IV ja V saatuja stabiiliustuloksia todettiin, ettei TweenR 80 ole välttämätön stabiilin suihkukuivatun rhEPO:n tuotta-15 miseksi. Myös puhtaalla rhEPO:11a 6 kuukautta kestävässä varastoinnissa saadut stabiiliustulokset viittavat siihen, etteivät mannitoli ja/tai glysiini ehkä ole välttämättömiä stabiilin suihkukuivatun rhEPO:n tuottamiseksi. Niinpä mannitolin ja glysiinin - jos niitä käytetään - tehtäväksi 20 näyttää jäävän vain toimiminen täyteaineina (isotoni-suus-/iso-osmoottisuussäätöaineina) , joita voidaan käyttää valmiin suihkukuivatun rhEPO-formulan rhEPO-pitoisuuden muuttamiseen.

Tämän keksinnön mukaisella suihkukuivatulla 25 rhEPO:11a on etuja kylmäkuivattuun rhEPO:iin nähden. Vertailua varten formulat I, II ja III myös kylmäkuivattiin I

(katso esimerkki 2). RIA-tulokset, joita saatiin 2 kuukautta lämpötilassa 5 °C säilytetyille kylmäkuivatuille näytteille, olivat kuitenkin 73 - 78 % etiketin mukaisesta 30 pitoisuudesta (LC; label claim). Nämä heikot EPO-voimak- ! kuusarvot (määritettynä RIA:11a) näin lyhyen varastoinnin ollessa kyseessä ovat merkki epästabiiliudesta. 6 kuukautta säilytetyissä kylmäkuivatuissa näytteissä esiintyi uudelleenliuotuksen jälkeen myös yli 2 % EPO-aggregaatteja 35 SDS-PAGE:11a. Tämä on merkki uudelleenlluotetun rhEPO:n 12 epästabiiliudesta. Niinpä suihkukuivatut formulat olivat stabiilimpia kuin koostumukseltaan samanlaiset kylmäkuivatut formulat.

Alla esitetään edellä mainittujen kylmäkuivattujen 5 formuloiden III ja IV stabiiliutta kuvaavat taulukot. Kum- > massakin tapauksessa näytteitä säilytettiin lämpötilassa 5 °C ja alle 2 % aggregaatteja sisältävän rhEPO:n läsnäolo varmistettiin kunkin mittauksen kohdalla Western Blot -analyysillä.

10 Taulukko 2

Formulan IV stabiiliustulokset Aika Odotettu pitoisuus RIA RIA

(yksikköä/ml) (yksikköä/ml) (% LC:stä) 0 31 500 35 049 111 15 1 30 843 34 188 111 2 30 121 29 646 98 6 29 250 28 521 97,5

Taulukko 3

Formulan III stabiiliustulokset 20 Aika Odotettu pitoisuus RIA RIA

(yksikköä/ml) (yksikköä/ml) (% LC:stä) 0 142 169 120 339 84 1 123 614 96 295 78 2 120 482 106 523 88 25 3 125 542 109 520 87 6 118 554 115 441 97

Esimerkki 2

Menetelmä EPO:n kylmäkuivaamiseksi Tässä esimerkissä kuvataan kylmäkuivausmenetelmää, 30 jota käytettiin kuivatun rhEPO:n valmistamiseksi puhtaana tai yhdistettynä farmaseuttisesti hyväksyttäviin täyteaineisiin. Kylmäkuivatun rhEPO:n stabiilius määritettiin, ja tulokset esitetään jäljempänä. Kaikki tässä esimerkissä käytetyt rhEPO-valmisteet myös suihkukuivattiin edellä 35 kuvatulla tavalla. RIA ja Western Blot -menettelyt toteu- i 13 tettiin olennaisilta osiltaan edellä suihkukuivatun rhEPO:n yhteydessä kuvatulla tavalla.

Tyypillinen kylmäkuivaussykli täyteaineita sisältämättömien rhEPO-liuosten kylmäkuivaamiseksi alkoi jäähdyt-5 tämällä liuos suunnilleen lämpötilaan -40 °C ja pitämällä se tässä lämpötilassa noin 3 tuntia sen varmistamiseksi, että liuos oli jäätynyt kokonaan. Liuoksen jäädytyksen aikana lauhduttiminen lämpötila laskettiin suunnilleen arvoon -50 °C. Ensimmäinen kuivaus tehtiin laskemalla kui-10 vauskammiossa vallitseva paine ensin noin 27 Paziin (200 millitorriin) ja järjestelmän annettiin stabiloitua noin 3 tuntia. Sitten lämpötila nostettiin suunnilleen arvoon -30 °C nopeudella noin 0,1 °C/min. Kuivausta (sublimoimalla jää vesihöyryksi) jatkettiin noin 60 tuntia. Toinen 15 kuivaus tehtiin nostamalla tuotteen lämpötila suunnilleen arvoon 15 °C nopeudella noin 0,5 °C/min. Kuivauskammiossa vallitseva paine laskettiin edelleen noin 27 Pazsta (200 millitorrista) noin 13 Paziin (100 millitorriin). Toista kuivausvaihetta jatkettiin noin 16 tuntia täydellisen kui-20 vumisen takaamiseksi. Toisen kuivauksen jälkeen pullot varustettiin tulpilla ja suljettiin. Suljettuja pulloja säilytettiin suunnilleen lämpötilassa 5 °C, kunnes ne poistettiin seuraavaksi kuvattavan stabiiliustestin tekemiseksi. Stabiiliuden testaamiseksi pullon sisältö liuo-25 tettiin uudelleen veteen ja analysoitiin RIAzlla ja Western Blot -analyysillä. Stabiiliustestin tulokset muunnettiin jäljellä olevan rhEPOzn prosenttiosuudeksi. Pienemmät rhEPO:n prosenttiosuudet ovat osoitus heikosta stabiiliudesta. Western Blot -tulokset osoittavat, onko rhEPO 30 alkuperäisessä muodossa vai denaturoituneessa aggregoitu-neessa muodossa. rhEPO-näytteiden, jotka sisältävät yli 2 % aggregaatteja verrattuna 2 % aggregaatteja sisältävään rhEPO-standardiin, määritetään olevan stabiiliudeltaan heikkoja. Erilaisissa formuloissa kylmäkuivatulle 14 rhEPO:lle tehtyjen stabiiliustestien tulokset esitetään taulukossa 4.

Taulukko 4

Stabiilius prosentteina etiketin mukaisesta EPO-määrästä

5 kylmäkuivatussa formulassa lämpötilassa 5 °C

Formula RIA Western Blot

Alku 1 kk 2 kk Alku 1 kk 2 kk 6 kk I 93,2 71,5 75,0 Vahvistettiin EPO:n Yli 2 % II 82,0 76,5 72,9 läsnäolo aggre- 10 III 79,6 69,7 78,1 Alle 2 % aggregaattia gaattia

Taulukossa 4 esitetyt tulokset osoittivat, ettei kylmäkuivattu rhEPO säily yhtä stabiilina kuin suihkukui-vattu rhEPO. rhEPO:n suihkukuivaus johtaa siten stabiilimpaan tuotteeseen kuin kylmäkuivaus. Tämä keksintö tarjoaa 15 siten käyttöön stabiilin suihkukuivatun rhEPO:n, joka voidaan valmistaa lisäämättä täyteaineita tai stabilointiaineita, kuten syklodekstriinejä, glysiiniä, mannitolia tai Tween 80:ä. Täyteaineeton rhEPO-valmiste on toivottava tiettyjen lääkkeenantojärjestelmien kannalta, kuten keuh-20 kojen kautta tapahtuvan annon yhteydessä, joka vaatii yleensä lääkkeen oloa mahdollisimman vapaa täyteaineista.

Keksintöä on kuvattu tässä viitaten tiettyihin edullisiin suoritusmuotoihin ja esimerkkeihin. Koska ammattimiesten mieleen tullee ilmeisiä variaatioita, keksin-25 non ei tule katsoa olevan niiden, vaan ainoastaan seuraa-vien patenttivaatimusten, rajoittama.

Claims (14)

1. Menetelmä suihkukuivatun rhEPO:n, sen fragmenttien, analogien tai kemiallisesti syntetisoitujen johdosten 5 valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) hankitaan vesipitoinen liuos, jonka rhEPO:n, sen fragmenttien, analogien tai kemiallisesti syntetisoitujen johdosten pitoisuus on alueella 20 - 100 mg/ml; b) sumutetaan mainittu liuos suihkuksi; 10 c) kuivataan mainittu suihku kuumalla kuivausilmal la veden haihduttamiseksi suihkusta; ja d) erotetaan kuivattu rhEPO, sen fragmentit, analogit tai kemiallisesti syntetisoidut johdokset kuivausilmas-ta, jolloin mainitulla rhEPO:11a, sen fragmenteilla, analo-15 geilla tai kemiallisesti syntetisoiduilla johdoksilla on biologinen kyky saattaa luuytimen solut lisäämään retikulo-syyttien ja punasolujen tuotantoa ja lisäämään hemoglobii-nisynteesiä tai raudan soluunottoa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että vesipitoinen rhEPO, sen fragmenttien, analogien tai kemiallisesti syntetisoitujen johdosten liuos ei sisällä suoloja eikä muita lisäaineita.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesipitoinen liuos dialysoidaan 25 suolojen poistamiseksi ennen vaihetta (b).

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, j tunnettu siitä, että liuos sumutetaan syöttämällä se suuttimeen paineen alaisena.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että suihku ja kuivausilma johdetaan kuivaimen läpi samaan suuntaan.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kuivattu rhEPO, sen fragmentit, analogit tai kemiallisesti syntetisoidut johdokset erote- 35 taan syklonierottimessa.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kuivaus tehdään alueella 60 - 85 °C olevassa lämpötilassa.

8. Kuiva rhEPO, tunnettu siitä, että se si-5 sältää alle 2 % aggregaattia 6 kuukauden varastoinnin jälkeen 5 °C:ssa.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen rhEPO, tunnettu siitä, että se on 100-painoprosenttinen EPO.

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen rhEPO, t u n - 10. e t t u siitä, että sillä on seuraava formulaatio: Aineosa Paino-% a) rhEPO 25 b) Mannitoli 37,5 c) Glysiini 37,5, 15 jolloin suihkukuivattu rhEPO on saatu patenttivaa timuksen 1 mukaisella menetelmällä.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen rhEPO, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi pinta- aktiivisuusainetta.

12. Suihkukuivattu rhEPO-koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää rhEPOra alueella 4,0 - 100 paino-% olevana pitoisuutena ja sen jäännösvesipitoisuus on alueella 3,0 - 5,0 paino-%, jolloin mainittu rhEPO-koostumus on saatu patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että hiukkasten koko on alueella ! 2,0 - 6,0 pm.

14. Suihkukuivattu rhEPO-jauhe, tunnettu siitä, että se koostuu olennaisilta osiltaan rhEPO:sta, I 30 jolloin mainittu rhEPO-jauhe on saatu patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä. j