FI117831B - Menetelmiä trombiinin tuottamiseksi - Google Patents

Description

i 1 117831

Menetelmiä trombiinin tuottamiseksi Keksinnön aihepiiri

Esillä oleva keksintö koskee yleisesti menetelmiä 5 yhdistelmä-DNA-proteiinien tuottamiseksi ja spesifisemmin menetelmiä trombiiniprekursorin ja trombiinin tuottamiseksi isäntäsoluista käyttämällä yhdistelmä-DNA-tekniikoita. Keksintö koskee myös menetelmissä käytettäviä DNA-rakenteita ja isäntäsoluja sekä menetelmää trombiinia sisältävän far-10 maseuttisen koostumuksen valmistamiseksi.

Keksinnön tausta

Viimeistä edellinen vaihe koagulaatiokaskadissa on protrombiinin tekijä-Xa-kompleksin katalysoima konversio trombiiniksi. Protrombiini on yksiketjuinen, K-vitamiinista 15 riippuvainen glykoproteiini, jota syntetisoidaan maksassa. Protrombiini sisältää pro-peptidin, gla-alueen, kaksi kringle- (eli silmukkarakenteita sisältävää) aluetta, A-ketjun ja seriiniproteaasialueen. Disulfidisilta kytkee A- ;; ketjun seriiniproteaasialueeseen. Konversio trombiiniksi 20 edellyttää, että tekijä-Xa-kompleksi pilkkoo protrombiinin kahdesta kohdasta. Yksi tekijä-Xa-pilkkominen vapauttaa proteiinifragmentin, joka käsittää gla-alueen ja kaksi kringle-aluetta. Toinen tekijä-Xa-pilkkominen, joka on vas- • · ·.1·1 tuussa katalyyttisesti aktiivisen molekyylin tuottamisesta, • · ϊ,’·ί 25 pilkkoo A-ketjun seriiniproteaasialueesta muodostaen disul- "·1: fidisiltojen kytkemän kaksiketjuisen proteiinin. Pilkkomi- ·1·1: nen molemmissa teki jä-Xa-pilkkomiskohdissa johtaa siihen, • · • että muodostuu aktiivista trombiinia, joka koostuu 49 ami-• « « · nohapon A-ketjusta, jonka disulfidisillat sitovat seriini- • · · 30 proteaasialueeseen. Trombiini hydrolysoi spesifisiä argi- . nyyli-glysiinisidoksia fibronigeenissa muodostaen fibriini- j * 1 1 !1’ monomeerejä, jotka keskenään kerääntyvät fibriinihyytymäk- • · "·;·1 si, ja tekijä-XIII: ssa tuottaen tekijä-XIIIa: ta, joka puo- m *:**: lestaan ristikytkee fibriinimonomeerit voimistaen ja stabi- ·;··1 35 loiden f ibriinihyytymää. Trombiinin roolista koagulaatio- • · · · 1 ♦ 1 • · • · · • · · · 2 117831 kaskadissa ovat esittäneet yleiskatsauksen esimerkiksi Jackson ja Nemerson [Ann. Rev. Biochem. 49 (1980) 765—811].

Trombiinia käytetään kliinisesti verenvuodon kontrolloimiseksi leikkausten aikana, palovammoihin ja tietyis-5 sä traumatilanteissa [Nakamura et ai., The Amer. Surgeon 57 (1991) 226—230; Thompson et ai., Ophtalmoloqy 93 (1986) 279—282; Harris et ai., J. Bone Joint Surq. [Am] 60 (1978) 454-456; Craig ja Asher, Spine 2 (1977) 313—317; Prasad et ai., Burns 17 (1991) 70-71]. Nautatrombiini on myös raken-10 neosa joissakin kaupallisissa kudosliimoissa.

Kaupalliset terapeuttiset trombiiniaineet puhdistetaan pooliksi yhdistetyistä ihmis- ja eläinverituotteista, minkä vuoksi niissä on vaarana kontaminaatio viruksilla kuten HIV- ja hepatiittivirukset. Verratessaan kolmea kaupal-15 lista trombiinivalmistetta Suzuki ja Sakuragawa [Thromb. Res. 53 (1989) 271—278] havaitsivat, että valmisteet sisälsivät kontaminoivia proteiineja ja että ihmisvalmiste sisälsi immunoglobuliini-G:tä, hepatiitti-B-pinta-antigeeni-vasta-aineita ja ihmisen immuunikatovasta-aineita. Kseno-20 geenistä immunisaatiota nautatrombiinille on raportoitu potilailla, jotka ovat kehittäneet itsereaktiivisia vasta-aineita sekä ihmistrombiinille että ihmistekijä-V:lie (te-kijä-V on kontaminoiva aine nautatrombiinivalmisteessa) :.**ί [Strieker et al^, Blood 72 (1988) 1375-1380; Flaherty ja • · *.**: 25 Weiner, Blood 73 (1989) 1388; Flaherty et ai., Ann. Int.

Med. Ill (1989) 631—634; Zehnder ja Leung, Blood 76 (1990) \\i 2011-2016; Lawson et Blood 76 (1990) 2249-2257; ··· Strieker et al., Blood 72 (1988) 1375—1380; Berguer et al..

j*·*j J. Trauma 31 (1991) 408—411] . Lisäksi huolta on viime ai- 30 koina kannettu nautatuotteiden mahdollisesta kontaminaa- . .·. tiosta patogeeneillä kuten naudan sienimuotoinen aivokal- • · · '."m vontulehdusaine, jota ei voida todeta tai inaktivoida ta- • · "* vanomaisin keinoin. Terapeuttiset ihmisverituotteet ovat samoin alttiina kontaminaatiolle viruspartikkeleilla, kuten *:*·: 35 hepatiittivirus ja ihmisen immuunikatovirus.

* • · • * • · · • * · • · 3 117831

Vaikka protrombiinia on valmistettu yhdistelmä-DNA-teknisin keinoin, noin 14 % proteiinista oli epänormaalisti karboksyloitu. Esillä oleva keksintö tarjoaa ratkaisun tä- r hän ongelmaan. i 5 Keksinnön yhteenveto

Lyhyesti sanottuna esillä oleva keksintö antaa käyttöön menetelmiä trombiinin tuottamiseksi. Menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksissa 20 tai 28 esitetään. Yhtenä näkökohtana menetelmien mukaan a) viedään 10 isäntäsoluun DNA-rakenne, joka kykenee ohjaamaan trombiini-prekursorin ilmentymistä ja käsittää seuraavat operatiivisesti kytketyt yksiköt: transkriptiopromoottori, DNA-sek-

venssi, joka koodittaa gla-alueetonta protrombiinia, ja transkription päättäjä; b) kasvatetaan isäntäsolua sopivis-15 sa olosuhteissa vaiheen a) DNA-sekvenssin koodittaman trom-biiniprekursorin ilmentymisen mahdollistamiseksi; ja c) eristetään trombiiniprekursori isäntäsolusta. Keksinnön yhdessä suoritusmuodossa trombiiniprekursorit erittyvät isäntäsolusta. Trombiiniprekursorit voidaan aktivoida in vivo S

20 tai in vitro.

Yhdessä suoritusmuodossa gla-alueeton protrombiini käsittää kringle-alueet 1 ja 2, A-ketjun, aktivaatiokohdan ja seriiniproteaasialueen protrombiinista. Toisessa suori- • · · *. *ί tusmuodossa gla-alueeton protrombiini käsittää kringle- • · 25 alueen 2, A-ketjun, aktivaatiokohdan ja seriiniproteaasi- "’*! alueen protrombiinista. Edelleen seuraavassa suoritusmuo- j’·*: dossa gla-alueeton protrombiini käsittää A-ketjun, aktivaa- ··· tiokohdan ja seriiniproteaasialueen protrombiinista.

• · · · ; Keksinnön mukaiselle DNA-rakenteelle ja isäntä- • * · 30 solulle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 . tai 8 esitetään. Keksinnön mukaiselle menetelmälle trom- • · * * · biiniprekursorin tuottamiseksi on tunnusomaista se, mitä • · • * *;* patenttivaatimuksessa 16 esitetään ja farmaseuttisen koos- "*" tumuksen valmistamiseksi se, mitä patenttivaatimuksessa 32 ·:··: 35 esitetään.

* • · • · ··· * * * 4 117831

Kuvioiden suppea kuvaus

Kuvio 1 havainnollistaa plasmidin Zem229R rakennetta. Käytetyt symbolit ovat SV40-term., SV40-terminaattori eli SV40-päättäjä; DHFR, dihydrofolaattireduktaasi-cDNA; 5 SV40-prom., SV40-promoottori; MT-1, hiiren metallotioniee-ni-l-promoottori.

Kuvio 2 havainnollistaa plasmidin Zeml69 rakennetta. Käytetyt symbolit ovat prepro, tPA-prepro-sekvenssi; ' hGH, hGH-päättäjä; MCF, MCF-13-promoottori.

10 Kuvaus spesifisistä suoritusmuodoista

Ennen keksinnön esittämistä saattaa sen ymmärtämiseksi olla avuksi esittää tiettyjen, tästä eteenpäin käytettyjen ilmaisujen määritelmät.

Signaalisekvenssi: DNA-segmentti, joka koodittaa 15 erityspeptidiä. Signaalisekvenssejä voidaan myös kutsua johtosekvensseiksi, prepro-sekvensseiksi ja/tai pre-sek-vensseiksi. Erityspeptidi on aminohapposekvenssi, joka vaikuttaa ohjaamalla kypsän polypeptidin tai proteiinin eritystä solusta. Erityspeptideille on karakteristista hydro-20 fobisten aminohappojen ydin ja niitä tavataan tyypillisesti ;i (mutta ei yksinomaan) vastasyntetisoitujen proteiinien ami-nopäässä. Erityspeptidi voidaan jakaa kahteen alueeseen, mukaan lukien signaalipeptidialue ja C-pääalue. Tällaiset • · · *· " alueet voi katkaista proteiinin kypsä koodausalue. DNA-seg- • φ ·.*** 25 mentti, joka koodittaa hiiva-Barrier-proteiinin 3. aluetta * *:**S voidaan esimerkiksi sijoittaa oikealle lukualueelle suh- [1·1: teessä BARl-signaalipeptidiin ja kiinnostavaan DNA-sekvens- ··· siin joko välittömästi 3' tai 5' kiinnostavaan DNA-sekvens- ; • · · · .1$1. siin nähden. Hyvin usein erityspeptidi tulee pilkotuksi • 1 30 kypsästä proteiinista erityksen aikana. Tällaiset eritys- . peptidit sisältävät prosessointikohtia, jotka mahdollista- » · 1 V.1.' vat erityspeptidin lohkeamisen kypsästä proteiinista sen "1 kulkiessa eritysreitin läpi. Prosessointikohdat voivat olla *"’Σ kooditettuja erityspeptidiin tai ne voidaan lisätä pepti- *:1·: 35 diin esimerkiksi mutagenisoinnilla in vitro.

* ····· • ♦ · • · · * 1 1 • · 5 117831

Pro-sekvenssi: DNA-segmentti, joka koodittaa pro- peptidiä ja toimii proteiinin tai peptidin prosessoinnin ohjaamiseksi ja signalloimiseksi. K-vitamiinista riippuvaisten glykoproteiinien propeptidit ovat hyvin säilyviä.

5 Vahvimmin säilyvät aminohapot pro-peptideissä ovat Val-Phe asemissa -17 ja -16, Glu tai Gin asemassa -12, Ala asemassa -10, Val-Leu asemissa -7 ja -6, Arg asemassa -4 ja Lys-Arg asemissa -2 ja -1 [Foster et ai,, Biochemistry 26 (1987) 7003—7011]. Pro-sekvenssejä edeltää yleensä pre-sekvenssi 10 ja ne poistuvat proteiinista prosessoinnin ja erityksen ai kana .

K-vitamiista riippuvaisille glykoproteiineille pro-peptidin arvellaan varmistavan proteiinin oikean translaation jälkeisen prosessoinnin (esim. glutamiinihappotähtei-15 den gamma-karboksylointi Gla-alueella).

Gla-alue: aminohapposekvenssi, joka sisältää yleensä noin 26 - noin 45 aminohappoa, ja joka yleensä mutta ei ; aina sijaitsee proteiinin aminopääalueella ja joka sisältää 3-12 glutamyylitähdettä, jotka modifioidaan translaation 20 jälkeen gamma-karboksiglutamyylitähteiksi (Gla) . Joissakin tapauksissa Gla-alueen voivat määritellä genomisekvenssin eksoni-intronirajat. gamma-karboksiglutamyylitähteet Gla- :*·.· alueilla helpottavat K-vitamiista riippuvaisten proteiinien * * :\| kalsiumvälitteistä sitoutumista membraanifosfolipideihin.

• * 25 Kuitenkin protrombiini, jossa on gla-alue, joka on koodi- • · tettu genomisekvenssin eksoniin II, ei tarvitse gla-aluetta • · ! ollakseen biologisesti aktiivinen. Funktionaalisen gla- **" alueen puuttuessa gla-alueettomalla protrombiinilla on te- • · · *** * kijä-Xa-kompleksiaktivaatiokerroin Km, joka on merkittäväs- 30 ti korkeampi kuin villityypin protrombiinin. Määrityksiä protrombiiniaktivaation määrittämiseksi ovat kuvanneet esi- merkiksi Malhorta et ai. [J. Biol. Chem. 260 (1983) 279- * . . | 287; joka liitetään tähän viitteeksi] tai Blanchard et ai.

* · |~J. Lab. Clin. Med. 101 (1983) 212—255, joka sisällytetään • · . 35 tähän viitteeksi].

*···· • * • * • · 6 117831

Gla-alueeton protrombiini: polypeptidi, jolla on aktivoitaessa trombiinin aktiivisuus. Gla-alueeton protrombiini on yksittäinen polypeptidi, josta puuttuu funktionaali nen gla-alue ja joka käsittää ainakin osan A-ketjusta 5 liittyneenä seriiniproteaasialueeseen ja sisältää disulfi-disiltoja A-ketjun ja seriiniproteaasialueen välillä.

Trombiini: kaksiketjuinen, disulfidisilloin sidottu glykosyloitu polypeptidi, joka pilkkoo spesifisiä sidoksia : fibrinogeenissä tuottaen fibriinimonomeerejä, jotka keske- 10 nään kerääntyvät muodostaen fibriinihyytymän. Kuten julkistetaan tässä yksityiskohtaisemmin, protrombiinin aktivoivat trombiiniksi kaksi tekijä-Xa-kompleksipilkkomista (arginii-nin, aminohapon 307, ja treoniinin, aminonhapon 308, välistä sekvensseissä tunnusnumerot 2 ja 3 gla- ja kringle-15 alueiden poistamiseksi, ja arginiinin, aminohappo 356, ja isoleusiinin, aminohappo 356, välistä sekvenseissä tunnusnumerot 2 ja 3 A-ketjun pilkkomiseksi seriiniproteaasialu-eesta). A-ketju- ja seriiniproteaasialueet katsotaan yleensä näiden tekijä-Xa-pilkkomiskohtien rajaamiksi. Kuitenkin ϋ 20 kuten alan ammattilaiselle on ilmeistä, alleelivariaatiot ja muut deleetiot, lisäykset tai vähäiset aminohappomuutok-set A-ketju- ja seriiniproteaasialueilla, jotka eivät tuhoa trombiiniaktiivisuutta, kuuluvat esillä olevaan keksintöön.

• 1 :1·.· Ilmaisu "aktivaatiokohta" viittaa proteolyyttiseen pilkko- • · ....: 25 miskohtaan A-ketju- ja seriiniproteaasialueen välissä, jos- sa pilkkomisesta seuraa pretrombiinin aktivaatio aktiivi- • · seksi trombiiniksi. Natiivin protrombiinin ja pretrombiinin "" kyseessä ollen villityypin trombiiniaktivaatiokohta on te- * · · i *** ki jä-Xa-pilkkomiskohta.

30 Ilrnentämisvektori: DNA-molekyyli, joka sisältää mm, kiinnostavaa proteiinia koodittavan DNA-sekvenssin promoot- • · · tori- ja muiden sekvenssien ohella, kuten transkription päättäjä ja polyadenylaatiosignaali, jotka helpottavat pro-teiinin ilmentämistä. Ilmentämisvektorit sisältävät edel- • · . 35 leen geneettistä informaatiota, joka tuottaa niiden repli- 1 kaation isäntäsolussa, joko autonomisen replikaation väli- • · • · » * #1 ..7 117831 tyksellä tai integraation isännän genomiin kautta. Alan ammattilaiselle on ilmeistä, että tällainen informaatio, joka tuottaa ilmentämisvektorin autonomisen replikaation isän-täsolussa, kattaa tunnetut hiiva- ja bakteeriperäiset rep-5 likaatioalkukohdat. Kuten tässä käsitellään yksityiskohtaisemmin, sopivat hiivavektorit sisältävät sekä hiivan repli-kaatioalkukohdan että bakteerin replikaatioalkukohdan, ja bakteeri- ja nisäkäsvektorit sisältävät yleensä bakteerin replikaatioalkukohdan. Esimerkkejä yhdistelmä-DNA:n yhtey-10 dessä tavanomaisesti käytetyistä ilmentämisvektoreista ovat plasmidit ja tietyt virukset, vaikka ne voivat sisältää yksiköitä kummastakin. Ne voivat myös sisältää yhden tai useamman valikointimerkin.

Transfektointi tai transformointi: Prosessi vastaan 15 ottavan solun tai mikro-organismin genotyypin muuttamiseksi stabiilisti ja periytyvästä liittämällä puhdistettua DNA:ta. Tämä todetaan tyypillisesti muutoksesta vastaan ottavan organismin fenotyypissä. Ilmaisua "transformointi" ; käytetään yleensä mikro-organismien yhteydessä, kun taas 20 "transfektointia" käytetään kuvaamaan tätä prosessia so luissa, jotka on saatu monisoluisista organismeista.

Viljelty solu: solu, jota voidaan kasvattaa neste-mäisessä tai kiinteässä kasvualustassa lukuisten sukupolvi- • * ·*·,; en ajan. Kun kyseessä ovat monisoluisista organismeista • · 25 saadut solut, viljelty solu on organismista yksittäisenä soluna, kudoksena tai kudososana eristetty solu.

• · tjt DNA-rakenne: DNA-molekyyli, tai tällaisen molekyy- »

Iin klooni, joko yksi- tai kaksisäikeinen, joka on ihmisen • · · *·* * toimesta modifioitu sisältämään DNA-segmenttejä, jotka on 30 yhdistetty ja sijoitettu toisiinsa nähden tavalla, jota ei • · · *.!.* muutoin luonnossa esiintyisi. DNA-rakenteet voivat sisältää • · · operatiivisesti kytkettyjä yksiköitä, jotka ohjaavat kiin- ....: nostavia polypeptide jä koodittavan DNA-sekvenssin tran- skriptiota ja translaatiota. Tällaisia yksiköitä ovat pro-. 35 moottorit, tehostimet ja transkription päättäjät. DNA- * * rakenteiden sisältämien yksiköiden ansiosta tiettyjen ra- • · • · · • · · * * 8 117831 " kenteiden ymmärretään kykenevän ohjaamaan kooditettujen po- lypeptidien ilmentymistä ja/tai eritystä. Jos kiinnostavaa polypeptidiä koodittava DNA-sekvenssi sisältää erityssig-naalisekvenssin, tarkoituksenmukaiset yksiköt sisältävän 5 DNA-rakenteen katsotaan kykenevän ohjaamaan polypeptidin eritystä.

Kuten edellä mainittiin, protrombiini tuotetaan normaalisti yksiketjuisena, glykosyloituna, gamma-karboksy-loituna proteiinina, joka sisältää gla-alueen, ensimmäisen 10 ja toisen kringle-alueen, A-ketjun ja seriiniproteaasialu-een. A-ketjun, joka tunnetaan myös kevyenä ketjuna, sitovat disulfidisillat seriiniproteaasialueeseen, joka tunnetaan sekä B-ketjuna että katalyyttisenä alueena. Koagulaatiokas-kadin aikana tekijä-Xa-kompleksi pilkkoo protrombiinin kah-15 desta kohdasta, mistä seuraa trombiinin vapautuminen. Protrombiinin yksi tekijä-Xa-kompleksipilkkominen vapauttaa protrombiinin gla- ja kringle-alueet. Toinen tekijä-Xa-kompleksipilkkominen pilkkoo protrombiinin aktivaatiokoh-dasta lohkaisten A-ketjun seriiniproteaasialueesta tuottaen 20 trombiinia. ,

Esillä olevan keksinnön eräs päämäärä on antaa käyttöön menetelmiä trombiinin tuottamiseksi käyttäen yh-distelmä-DNA-menetelmiä ja eukaryoottisia isäntäsoluja.

·*·.· Esillä olevan keksinnön eräs piirre on, että käytetään il- • · 25 mentämisvektoria, joka käsittää gla-alueetonta protrombii-nia koodittavan DNA-sekvenssin. Esillä olevan keksinnön li- .j. säpiirre on, että käytetään ilmentämisvektoreita isäntä- *1" soluissa trombiiniprekursorien tuottamiseksi, jotka akti- • · · * voidaan joko in vivo tai in vitro trombiiniksi.

30 Protrombiinin gla-alue voidaan tehdä ei-funktionaa- ♦ · · liseksi poistamalla gla-alue osittain tai kokonaisuudessaan * * · tavanomaisilla menetelmillä. Vaihtoehtoisesti glutamyyli- • in ....Ϊ tähteitä gla-alueella koodittavat sekvenssit voidaan dele- toida tai niitä voidaan muuttaa siten, että seuraa amino- • 35 happosubstituutio. Muutettuja gla-alueita käsittävien prot-····· * * rombiinivarianttien aktivaatiokinetiikka voidaan määrittää • · • · · • · · • · 9 117831 käyttämällä menetelmää, jota oleellisesti kuvaavat Malhorta et ai. (ibid.), kuten jäljempänä kuvataan. Proteiinien, jotka eivät sisällä funktionaalisia gla-alueita, aktivaa-tio-Km:t ovat yleensä noin 15 kertaa korkeampia kuin villi-5 tyypin protrombiinin, edullisesti noin 20 kertaa korkeampia. Keksinnön yhden suoritusmuodon puitteissa tässä kuvatut gla-alueettomat protrombiinit aktivoidaan ennen käyttöä in vivo.

Muutettuja alueita käsittävien protrombiinivariant-10 tien aktivaatiokinetiikka voidaan määrittää seuraavasti.

Lyhyesti liuosta, joka sisältää pitoisuuden 1,4 - 6,5 μΜ protrombiinivariantti 5 mM CaCl2~liuoksessa, inkuboidaan 22 °C:ssa pitempään kuin 10 minuuttia. Inkuboinnin jälkeen liuosta, joka sisältää tekijä-Xa:ta, tekijä-Va:ta, 15 CaCl2:ta, fosfatidyylikoliini-fosfatidyyliseriiniä (3:1)

(johon viitataan tästä eteenpäin PCPS:nä) ja dansyyli-5- S

dimetyyliaminonaftaleeni-l-sulfonyyliä (johon viitataan tästä eteenpäin DAPA:na), lisätään siten, että 2,0 ml:n re-aktioseosten loppupitoisuudet ovat 0,03 M Tris-HCl, pH 7,4/ 20 0, 10 M NaCl; 3,0 nM tekijä-Xa; 10,0 nM tekijä-Va; 30 μΜ PCPS; 5,0 mM CaCl2 ja 10 μΜ DAPA. Samanaikaisesti positiivista verrokkia, joka sisältää pitoisuuden 1,4 - 6,5 μΜ - :1 2 3·.· protrombiini 5 mM CaCl2_liuoksessa, inkuboidaan 22 °C:ssa • · pitempään kuin 10 minuuttia. Inkuboinnin jälkeen lisätään • 1 25 25 μΐ liuosta, joka sisältää tekijä-Xa:ta; tekijä-Va:ta; • 1 ··,1. CaCl2:ta; PCPS:ää; ja DAPA:aa siten, että 2,0 ml:n reak- • · tioseosten loppupitoisuudet ovat 0,03 M Tris-HCl, pH 7,4; 0,10 M NaCl; 0,5 nM tekijä-Xa; 10,0 nM tekijä-Va; 30 μΜ * 1 · ’·1 PCPS; 5,0 mM Ca2+ ja 10 μΜ DAPA. Reaktion etenemistä tark- 30 käillään mittaamalla DAPA-trombiinikompleksin fluoresenssi- intensiteetti käyttäen 345 nm:n viritysaallonpituutta ja * 1 · 545 nm:n emissioaallonpituutta ja emissiosäteessä käytettyä 430 nm:n kynnyssuodinta. Viritys- ja emissioaukkoleveydet ovat 10 nm ja vastaavasti 15 nm. Km ja kcat määritetään ana- • 1 35 lysoimalla reaktioprofiili integroidun Michaelis-Menten- • · 2 • · 3 ··· • · 117831 ίο

Henri-menettelyn mukaan [Nesheim et ai., J. Biol. Chem. 254 (1979) 10952—10962; joka sisällytetään tähän viitteeksi].

Keksinnön tietyissä suoritusmuodoissa villityypin trombiiniaktivaatiokohtaa muutetaan siten, että trombiini-5 prekursorit voidaan aktivoida in vivo tai aktivoida autoka-talyyttisesti. Esimerkiksi villityypin trombiiniaktiovaati-kohtaa voidaan muuttaa siten, että sen voi pilkkoa Saccha-romyces cerevisiaen KEX2-geenituote. KEX2-geeni koodittaa endopeptidaasia, joka pilkkoo kaksiemäksisen aminohappose-10 kvenssin jälkeen [Fuller et ai. julkaisussa Leive, toim., Microbiology 1986 273—278]. Edullisesti KEX2-pilkkomis- kohdan koodittaa aminohapposekvenssi KR. Edullisemmin KEX2-pilkkomiskohdan koodittaa aminohapposekvenssi RRKR (sekvenssi tunnusnro 34) tai LDKR (sekvenssi tunnusnro 35) . 15 KEX2-geenin ilmentävä isäntäsolulinja kykenee siten pilkkomaan aktivaatiokohdassa KEX2-kohdan sisältävät trombiini-prekursorit trombiinin tuottamiseksi. Isäntäsolut, jotka eivät luonnollisesti ilmennä KEX2:ta, voidaan transformoida tai transfektoida Saccharomyces cerevisiae KEX2-geenillä 20 kuten kuvaavat esimerkiksi Mulvihill et ai. (avoinna oleva US-patenttihakemus julkaisusarjanro 07/445 302, joka sisällytetään tähän kokonaisuudessaan viitteeksi) ja Mulvihill :\j et ai., EP 319 944. Vaihtoehtoisesti villityypin trom- biiniaktivaatiokohtaa voidaan muuttaa siten, että trombiini • · 25 voi pilkkoa saadut proteiinit. Edullisessa suoritusmuodossa trombiinipilkkomiskohdan koodittaa aminohapposekvenssi PR.

• · Tällainen muutos tekee mahdolliseksi trombiiniprekursorien aktivaation autokatalyyttisesti hyvin pienen määrän ekso- • * · * geenistä trombiinia lisäämisen jälkeen. Keksinnön yhdessä 30 suoritusmuodossa villityypin trombiiniaktivaatiokohta kor- • * · *·ί·* vataan kopiolla kypsästä α-tekijästä, jota sivuaa 5'-päässä ··· ·...* trombiinipilkkomiskohta ja 3'-päässä KEX2-pii kkomis kohta.

....J Tällaiset muutokset aktivaatiokohdassa voidaan saada käyt- tämällä esimerkiksi adapteriteknologian, mutagenisoinnin in * · • 35 vitro ja polymeraasiketjureaktio- (PCR-) mutagenisoinnin ··* • ‘ tekniikoita.

• · • · · ··· • · ...

n 117831 gla-alueettomia protroinbiineja koodittavia DNA-seg-menttejä voidaan tuottaa synteettisesti tai niitä voidaan valmistaa DNA-segmenteistä, jotka koodittavat protrombii-nia, ja jotka on kloonattu esimerkiksi ihmisen maksasoluis-5 ta [Degen et ai., Biochemistry 22 (1983) 2087-2097; ja De-gen ja Davie, Biochemistry 26 (1987) 6165-6177] tai naudan maksasta oleellisesti kuten ovat kuvanneet MacGillivray ja Davie, Biochemistry 23 (1984) 1626-1634, jotka sisällyte tään tähän viitteiksi, käyttäen Maniatiksen et ai. kuvaaman 10 kaltaisia kloonausmenetelmiä ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, NY, 1982), Sambrook et al,, ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. painos,

Cold Spring Harbor, NY, 1989) tai Mullis et al. (US-patenttijulkaisu nro 4 683 195), joista kukin sisällytetään 15 tähän viitteeksi. Protrombiinia koodittavia DNA-segmenttejä voidaan muuttaa DNA-segmenttien tuottamiseksi, jotka koo-dittavat gla-alueetonta protrombiinia, restriktiopilkkomi-sella ja uudelleenligatoimalla, mutagenisoimalla in vitro tai mutagenisoimalla käyttäen polymeraasiketjureaktiomonis-20 tumista.

Edustava nukleotidisekvenssi, joka koodittaa ihmisen protrombiinia, ja siitä päätelty aminohapposekvenssi • · i/·; esitetään sekvensseinä tunnusnrot 2 ja 3. Kuten on ilmeistä :\j alan ammattilaiselle, gla-alueettomia protrombiineja koo- ·;··· 25 dittavat DNA-segmentit käsittävät alleelisia variantteja ja ·( geneettisesti manipuloituja tai synteettisiä variantteja, jotka sisältävät konservatiivisia aminohapposubstituutioita ja/tai aminohappojen vähäisiä lisäyksiä, substituutioita «Il tai deleetioita. DNA-sekvenssivariantit käsittävät myös de-30 generoitumisen DNA-koodissa, jolloin muita kodoneja, mukaan • * · **j·* lukien isännän suosimia kodoneja, on substituoitu analogis- • · *···' ten kodonien tilalle villityyppisekvenssissä. DNA-segmen- ····· tit, jotka käsittävät DNA-sekvenssejä, jotka kykenevät hyb- ridisoitumaan esillä olevan keksinnön mukaisiin DNA-sek- • · • e 35 vensseihin enemmän tai vähemmän ankarissa olosuhteissa (katso Sambrook et al., ibid.), sekä DNA-segmentit, jotka • · --* --- • · · • · · • · 12 117831 koodittavat sekvenssejä, jotka ovat degeneroituneet geneettisen koodin johdosta, tässä esitetyiksi aminohapposekvensseiksi, kuuluvat esillä olevaan keksintöön. Geneettisesti manipuloituja variantteja voidaan saada käyttämällä oligo-5 nukleotidikohdennettua paikkaspesifistä mutagenisointia, käyttämällä restriktioendonukleaasipilkkomista ja adapteri-ligatointia tai muilla, kirjallisuudessa perusteellisesti selvitetyillä menetelmillä (katso esim. Sambrook et ai., ibid., ja Smith et ai., "Genetic Engineering: Principles 10 and Methods", Plenum Press, 1981; jotka sisällytetään tähän viitteiksi).

gla-alueetonta protrombiinia koodittavat DNA-seg-mentit insertoidaan sopiviin ilmentämisvektoreihin, jotka puolestaan viedään sopiviin isäntäsoluihin. Ilmentämisvek-15 torit, joita käytetään esillä olevan keksinnön toteuttamiseksi, käsittävät promoottorin, joka kykenee ohjaamaan kloonatun DNA:n transkriptiota, gla-alueetonta protrombii-nia koodittavan DNA-segmentin ja transkription päättäjän. :

Keksinnön mukaisesti valmistettavien proteiinien 20 ohjaamiseksi isäntäsolun eritysreitille kiinnostavaan DNA-sekvenssiin on operatiivisesti kytketty ainakin yksi sig-naalisekvenssi. Edullisia signaaleja ovat α-tekijäsignaali- ·. *: sekvenssi [pre-pro-sekvenssi; Kurjan ja Herskowitz, Cell 30 • * (1982) 933—943; Kurjan et ai., US-patenttijulkaisu nro *ί”ί 25 4 546 082; Brake, US-patentti julkaisu nro 4 870 008)], PH05-siqnaalisekvenssi (Beck et ai., WO 86/00637), BAR1- • · ··· erityssignaalisekvenssi (MacKay et ai., US-patenttijulkaisu nro 4 613 572; MacKay, WO 87/002670), SUC2-signaalisekvens-si [Carlson et ai., Mol. Cell, Biol. 3 (1983) 439—447], α-30 1-antitrypsiinisignaalisekvenssi [Kurachi et ai., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 78 (1981) 6826—6830], α-2-plasmiini- * * *·;** inihibiittorisignaalisekvenssi [Tone et ai., J. Biochem.

·:**: (Tokyo) 102 (1987) 1033—1042] ja kudosplasminogeeniakti- ·;··· vaattorijohtosekvenssi [Pennica et ai., Nature 301 (1983) *. 35 214—221]. Vaihtoehtoisesti erityssignaalisekvenssi voidaan • · . , syntetisoida sääntöjen mukaan, jotka on laatinut esimerkik- • · · • ·· * · 13 117831 si von Heinje iEur. J. Biochem. 133 (1983) 17-21; J, Mol.

Biol. 184 (1985) 99-105; Nucl. Acids Res. 14 (1986) 4683- 4690] .

Signaalisekvenssejä voidaan käyttää yksittäin tai 5 niitä voidaan yhdistää. Esimerkiksi ensimmäistä signaalise-kvenssiä voidaan käyttää yksinään tai yhdistettynä sekvenssiin, joka koodittaa 3. Barrier-aluetta (jota kuvataan US-patenttijulkaisussa 5 037 743, joka sisällytetään tähän kokonaisuudessaan viitteeksi). 3. Barrier-aluetta koodittava 10 DNA-segmentti voidaan sijoittaa oikealle lukualueelle 3'-suuntaan kiinnostavasta DNA-sekvenssistä tai 5' DNA-sek-venssiin nähden ja oikealle lukualueelle sekä signaalise-kvenssiin että kiinnostavaan DNA-sekvenssiin nähden.

Isäntäsoluja käytettäväksi esillä olevaa keksintöä 15 harjoitettaessa ovat nisäkäs-, lintu-, kasvi-, hyönteis-, sieni- ja bakteerisolut. Sienisoluja, mukaan lukien hiiva-lajeja (esim. Saccharomyces spp., Schizosaccharomyces spp.) ; tai rihmasieniä (esim. Aspergillus spp., Neurospora spp.) voidaan käyttää isäntäsoluina esillä olevassa keksinnössä.

20 Hiivan Saccharomyces cerevisiae kannat ovat erityisen edullisia.

Sopivia hiivavektoreita käytettäväksi esillä ole- • · · *· ” vassa keksinnössä ovat YRp7 [Struhl et ai., Proc. Natl.

• ·

Acad. Sei. USA 76 (1978) 1035-1039], YEpl3 [Broach et ab, 25 Gene J3 (1979) 121—133], POT-vektorit [Kawasaki et ai,, US- j *]: patenttijulkaisu nro 4 931 373, joka sisällytetään tähän ··· viitteeksi), pJDB249 ja pJDB219 [Beggs, Nature 275 (1978) * * * * 104—108] ja mainittujen johdannaiset. Tällaiset vektorit sisältävät yleensä valikointimerkin, joka voi olla jokin , , 30 lukuisista geeneistä, jotka osoittavat dominoivaa fenotyyp- • · ♦ ”1^ piä, jolle on olemassa fenotyypin määritys transformanttien *" valitsemisen mahdollistamiseksi. Edullisia valikointimerk- kejä ovat sellaiset, jotka täydentävät isäntäsolun aukso- *:**: trofian, tuottavat antibioottiresistenssin tai tekevät so~ 35 lulle mahdolliseksi käyttää spesifisiä hiililähteitä, ja . . niitä ovat LEU2 (Broach et ai., ibid.), URA3 [Botstein et : • * · * *“ • · · • · 14 117C31 al., Gene 8 (1979) 17], HIS3 (Struhl et ai., ibid.) tai POTI (Kawasaki et ai., ibid.). Toinen sopiva valikointi-merkki on CAT-geeni, joka tuottaa hiivasoluille kloram-fenikoliresistenssin.

5 Edullisia promoottoreita hiivassa käytettäväksi ovat promoottorit hiivan glykolyyttisistä geeneistä [Hitze- man et ai., J. Biol. Chem. 255 (1980) 12073—12080; Alber ja Kawasaki, J. Mol, Appi. Genet. 1. (1982) 419-434; Kawasaki, US-patenttijulkaisu nro 4 599 311] tai alkoholidehydro-10 genaasigeenit [Young et ai., "Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals", Hollaender et ai. (toim.), Plenum, New York, 1982, s. 355; Ammerer, Meth. Enzymol. 101 (1983) 192-201]. Tässä suhteessa erityisen edullisia promoottoreita ovat TPI1-promoottori (Kawasaki, US-patentti- 15 julkaisu nro 4 599 311, 1986) ja ADH2-4c-promoottori [Russell et ai., Nature 304 (1983) 652—654; Irani ja Kilgore, US-patenttihakemusjulkaisu sarjanro 07/631 763, ja EP-jul-kaisu 284 044, jotka sisällytetään tähän viitteiksi] . II-mentämisyksiköihin voi kuulua myös transkription päättäjä.

20 Edullinen transkription päättäjä on TPIl-terminaattori (Alber ja Kawasaki, ibid.).

Hiivan lisäksi tässä kuvattuja proteiineja voidaan • · · ’·*ί ilmentää rihmaisissa sienissä, esimerkiksi Aspergillus-sie- 1 • · ·.*·; nen kannoissa (McKnight et ai., US-patenttijulkaisu nro 25 4 935 349, joka sisällytetään tähän viitteeksi). Esimerkke- j jä käyttökelpoisista promoottoreista ovat Aspergillus nidu- ··· länsin glykolyyttisistä geeneistä saadut, kuten ADH3-pro- Φ * « · moottori [McKnight et ai., EMBO J. 4. (1985) 2093—2099] ja tpiA-promoottori. Esimerkki sopivasta päättäjästä on ADH3- . .·. 30 päättäjä (McKnight et ai., ibid.) . Tällaisia rakenneosia • · · käyttävät ilmentämisyksiköt kloonataan vektoreihin, jotka * · *;* voidaan insertoida Asperqilluksen kromosomi-DNA:han.

*

Tekniikkoja sienten transformoimiseksi tunnetaan *:·*: kirjallisuudessa hyvin ja niitä ovat kuvanneet esimerkiksi 35 Beggs (ibid.) , Hinnen et ai. [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 7 5 . . (1978) 1929-1933], Yelton et ai. [Proc. Natl. Acad. Sei.

• · · ·~ - ‘ · · • · • 117831 15 ' USA 81 (1984) 1740-1747] ja Russell [Nature 301 (1983) 167-169] . Isäntäsolun genotyyppi sisältää yleensä geneettisen vajauksen, jonka ilmentämisvektorissa läsnä oleva valikoin-timerkki täydentää. Alan keskimääräinenkin taitaja kykenee 5 vaikeuksitta valitsemaan jonkin nimneomaisen isännän ja va-likointimerkin.

Saattaa olla edullista käyttää hiivaisäntäsolua, joka sisältää geneettisen vajauksen ainakin yhdessä geenissä, jota tarvitaan glykoproteiinien asparagiinikytkettyyn 10 glykosylaatioon. Edullisesti hiivaisäntäsolu sisältää ge- - neettisiä vajauksia joko MNN9-geenissä tai MNNl-qeenissä tai kummassakin (kuvataan avoinna olevassa US-patentti-hakemuksessa julkaisun sarjanro 189 547 ja EP-julkaisussa 314 096, jotka sisällytetään tähän kokonaisuudessaan viit-15 teiksi). Edullisimmin hiivaisäntäsolu sisältää häirintää sekä MNN1- että MNN9-geeneissä. Hiivaisäntäsoluja, joissa on tällaisia vajauksia, voidaan valmistaa käyttämällä muta-toinnin ja valikoinnin vakiotekniikoita. Ballou et ai. [J.

Biol. Chem. 255 (1980) 5986—5991] ovat kuvanneet mannopro-20 teiinibiosynteesimutanttien eristämistä, joilla on vajauk sia geeneissä, jotka vaikuttavat asparagiinikytkettyyn glykosylaatioon. Lyhyesti, mutagenisoituja hiivasoluja seulot- • · * *· " tiin käyttäen fluoreseinoituja vasta-aineita, jotka kohdis- * · ·’.*·: tuivat vastaan villityypin hiivassa esiintyviä ulompia man- *:**ί 25 noosiketjuja. Mutanttisoluja, jotka eivät sitoneet vasta- • · · : ainetta, karakterisoitiin edelleen ja ne todettiin vajavai- ··· siksi asparagiinikytkettyjen oligosakkaridiryhmien lisäämi- • · * · ;*·*; sessä. Heterologisten proteiinien tuotannon optimoimiseksi edullisesti isäntäkanta käsittää mutaation, kuten hiivan . 30 PEP4-mutaatio [Jones, Genetics 85 (1977) 23-33], joka joh- * · · "! taa alentuneeseen proteolyyttiseen aktiivisuuteen. Hetero- • · Ί* logisten proteiinien erityksen optimoimiseksi edullisesti *·*“ isäntäkanta käsittää mutaation PMRl-qeenissä (Smith, US- *:**: patenttijulkaisu 5 057 416) , joka johtaa lisäykseen hetero- 35 logisten proteiinien erityksessä. Saattaa olla edullista * · . häiritä PMR1 -geeniä.

• * ♦ • · 117831 16

Sienisolujen lisäksi viljeltyjä nisäkässoluja voidaan käyttää isäntasoluina esillä olevassa keksinnössä.

Edullisia viljeltyjä nisäkässoluja käytettäväksi esillä olevassa keksinnössä ovat solulinjat COS-1 (ATCC CRL 1650), 5 BHK ja 293 [ATCC CRL 1573; Graham et ai., J. Gen. Virol. _6 (1977) 59-72], Edullinen BHK-solulinja on BHK 570 -solu- linja (joka on talletettu talletulaitokseen the American Type Culture Collection, jossa sen hakunumero on CRL 10314). Lisäksi lukuisia muita nisäkässolulinjoja voidaan 10 käyttää esillä olevassa keksinnössä, mukaan lukien Rat Hep I (ATCC CRL 1600), Rat Hep II (ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), ihmisen keuhkosolut (ATCC CCL 75.1), ihmisen mak- 7' sakasvainsolut (ATCC HTB-52), Hep-G2-solut (ATCC HB 8065), hiiren maksasolut (ATCC CCL 29.1), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) 15 ja DUKX-solut [Urlaub ja Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 (1980) 4216-4220].

Nisäkäsilmentämisvektorit käytettäväksi esillä olevan keksinnön suorittamiseksi sisältävät promoottorin, joka kykenee ohjaamaan kloonatun geenin tai cDNArn transkriptio-20 ta. Edullisia promoottoreita ovat viruspromoottorit ja so-lupromoottorit. Viruspromoottoreita ovat välitön varhainen sytomegaloviruspromoottori [Boshart et ai., Cell 41 (1985) *· *ί ? 521-530] ja SV4 0-promoottori TSubramani et ai., Mol. Cell.

• · *. *: Biol. 1 (1981) 854—864] . Solupromoottoreita ovat hiiren me- *·"· 25 tallotioneiini-l-promoottori (Palmiter et ai., US-patentti- : \l julkaisu nro 4 579 821), hiiren Vkappa-promoottori [Bergman ··· et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1983) 7041—7045; ···· ^ ;*·*· Grant et ai., Nucl. Acids Res. 15 (1987) 5496] ja hiiren VH-promoottori [Loh et ai., Cell 33 (1983) 85-93]. Erityi- , .·, 30 sen edullinen promoottori on adenoviruksen 2 pääasiallinen • · · myöhäinen promoottori [Kaufman ja Sharp, Mol. Cell. Biol. 2 ' 1 *" (1982) 1304—1319]. Tällaiset ilmentämisvektorit voivat myös sisältää sarjan RNA-silmukoitumiskohtia, jotka sijaitsevat *:**: alavirtaan promoottorista ja ylävirtaan kiinnostavaa pepti- 35 diä tai proteiinia koodittavasta DNA-sekvenssistä. Edulli- • · . . siä RNA-silmukoitumiskohtia voidaan saada adenovirus- « · · #*·· ···...

, 17 117831 ja/tai iiranunoglobuliinigeeneistä. Samoin ilmentämisvekto-reihin sisältyy polyadenylaatiosignaali, joka sijaitsee alavirtaan kiinnostavasta koodaussekvenssistä. Polyadeny-laatiosignaaleja ovat varhaiset tai myöhäiset polyadenylaa-5 tiosignaalit SV40:stä (Kaufman ja Sharp, ibid.), poly-adenylaatiosignaali adenoviruksen 5 ElB-alueelta ja ihmisen kasvuhormonigeenipäättäjä [DeNoto et ai., Nucl. Acids Res.

9 (1981) 3719-3730]. Ilmentämisvektorit voivat sisältää ei-koodittavan virusjohtosekvenssin, kuten adenoviruksen 2 10 kolmiosaisen johtaja, joka sijiatsee promoottorin ja RNA-silmukoitumiskohtien välissä. Edulliset vektorit voivat samoin sisältää tehostinsekvenssejä, kuten SV40-tehostin ja hiiren i-tehostin [Gillies, Cell 33 (1983) 717—728]. Ilmentämisvektorit voivat myös sisältää adenovirus-VA-RNA-sek-15 venssejä koodittavia sekvenssejä.

Kloonatut DNA-sekvenssit voidaan viedä viljeltyihin nisäkässoluihin esimerkiksi kalsiumfosfaattivälitteisellä transfektoinnilla [Wigler et ai., Cell 14 (1978) 725; Cor-saro ja Pearson, Somatic Cell Genetics 1_ (1981) 603; Graham .-j 20 ja Van der Eb, Virology 52 (1973) 456; jotka sisällytetään tähän kokonaisuudessaan viitteiksi]. Muita tekniikoita kloonattujen DNA-sekvenssien viemiseksi nisäkässoluihin, *· *ί kuten elektroporaatio [Neuman et ai., EMBO J. 1 (1982) 841- φ :.**i 845], voidaan myös käyttää. Solujen identifioimiseksi, jot- ***** 25 ka ovat integroineet kloonatun DNA:n, valikointimerkki vie- !*·[: dään yleensä soluihin kiinnostavan geenin tai cDNA: n ohel- ·*· la. Edullisia valikointimerkkejä käytettäviksi viljellyissä im nisäkässoluissa ovat geenit, jotka tuottavat resistenssin lääkkeille, kuten neomysiini, hygromysiini ja metotreksaat- t 30 ti. Valikointimerkki voi olla monistettava valikointimerk-• · ♦ “I ki. Edullinen monistettava valikointimerkki on DHFR-geeni.

• · *;* Valikointimerkeistä esittää katsauksen Thilly ("Mammalian ***** Cell Technology", Butterworth Publishers, Stoneham, MA, jo- *:*·; ka sisällytetään tähän viitteeksi) . Alan keskimääräinenkin ..1.: taitaja kykenee vaikeuksitta valitsemaan valikointimerkke- * · . . jä.

• · · 1 • ·· • * ib 1 17831

Valikointimerkit voidaan viedä soluun tai erilliseen plasmidiin samanaikaisesti kuin kiinnostava geeni, tai ne voidaan viedä samaan plasmidiin. Jos ne ovat samassa plasmidissa, valikointimerkki ja kiinnostava geeni voivat 5 olla eri promoottorien tai saman promoottorin kontrollissa, jolloin viimemainittu järjestely tuottaa dikistronisen sanoman. Tämän tyypin rakenteita tunnetaan alalla (esimerkiksi Levinson ja Simonsen, US-patenttijulkaisu nro 4 713 339). Saattaa samoin olla edullista lisätä ylimää-10 räistä DNA:ta, joka tunnetaan "kantaja-DNA:na", seokseen, joka viedään soluihin.

Transfektoitujen nisäkässolujen annetaan kasvaa jonkin ajan, tyypillisesti 1-2 päivää, jotta ne alkaisivat ilmentää haluttua DNA-sekvenssiä (tai useampaa). Sitten 15 käytetään lääkevalikointia sellaisten solujen kasvun suh teen valitsemiseksi, jotka ilmentävät valikointimerkin stabiililla tavalla. Solujen kohdalla, jotka on transfektoitu monistettavalla valikointimerkillä, lääkepitoisuutta voidaan lisätä vähin erin kloonattujen sekvenssien kasvaneen 20 kopioluvun suhteen valitsemiseksi ja siten ilmentämis- tasojen nostamiseksi. '..·* , . Edullisia prokaryoottisia isäntäsoluja käytettävik- * * * * *· si esillä olevan keksinnön suorituksessa, ovat bakteerin • · 9 a · e *· *: Escherichia coli -kannat, vaikka Bacillus ja muut suvut : *: 25 ovat myös käyttökelpoisia. Tekniikat näiden isäntien trans-

M I

• *.· formoimiseksi ja niihin kloonattujen vierasgeenien ilmentä- t>*5* miseksi ovat alalla tuttuja (katso esim. Maniatis et ai., ja Sambrook et ai., ibid.) . Vektorit, joita käytetään vie-rasgeenien ilmentämiseksi bakteeri-isännissä, sisältävät . .·. 30 yleensä valikointimerkin, kuten antibioottiresistenssigee- • a · ,···. nin, ja promoottorin, joka toimii isäntäsolussa. Sopivia • · *" promoottoreita ovat trp [Nichols ia Yanofskv, Meth. Enzv- ** * mol. 101 (1983) 155—164] lac [Casadaban et ai., J. Bacte- *·“· riol. 143 (1980) 971-980] ja fagi-lambda-promoottori- 35 systeemit [Queen, J, Mol. Appi. Genet. 2 (1983) 1—10] . Bak-,·, · teerien transformoimiseksi käyttökelpoisia plasmideja ovat I *1 »a 117831 19

pBR322 [Bolivar et ai., Gene 2 (1977) 95-113], pUO

plasmidit [Messing, Meth. Enzymol. 101 (1983) 20-77; Vieira ja Messing, Gene 19 (1982) 259—268], pCQV2 (Queen, ibid.), ja mainittujen johdannaiset. Plasmidit voivat sisältää sekä 5 virus- että bakteeriyksiköitä. Menetelmiä proteiinien talteen ottamiseksi biologisesti aktiivisessa muodossa käsi-f teilaan US-patenttijulkaisuissa nro 4 966 963 ja 4 999 422, jotka sisällytetään tähän viitteiksi.

Promoottoreita, päättäjiä ja menetelmiä, jotka ovat 10 käyttökelpoisia tässä esitettyjä gla-alueetonta protrombii-nia koodittavien ilmentämisvektorien viemiseksi kasvi-, lintu- ja hyönteissoluihin, on kuvattu alalla. Bakulovirus-ten käytöstä esimerkiksi vektoreina heterologisten DNA-sekvenssien ilmentämiseksi hyönteissoluissa ovat esittäneet 15 katsauksen Atkinson et ai. fPestic. Sei. 28 (1990) 215— 224]. Agrobacterium rhizoqenes1 n käytöstä vektoreina geenien ilmentämiseksi kasvisoluissa ovat esittäneet katsauksen Sinkar et ai. [J. Biosci. (Banqlaore) 11 (1987) 47-58].

Esillä olevan keksinnön mukaisia DNA-rakenteita si-20 sältäviä isäntäsoluja viljellään sitten gla-alueettoman protrombiinin tuottamiseksi. Soluja viljellään vakiomene-, . telmien mukaan kasvualustassa, joka sisältää isäntäsolujen

• » I

*· ** kasvuun tarvittavia ravinteita. Alalla tunnetaan lukuisia • · *. *: erilaisia sopivia kasvualustoja, jotka yleensä sisältävät 25 hiililähteen, typpilähteen, oleellisia aminohappoja, vita- • · · • \· miineja, mineraaleja ja kasvutekijöitä. Kasvualusta valit- ·:* see yleensä DNA-rakenteen sisältävien solujen suhteen esi- ···· : ;*·*· merkiksi lääkevalikoinnilla tai oleellisen ravinteen puut- tumisen perusteella, jonka puuttumisen täydentää valikoin- . ,·. 30 timerkki, joka on DNA-rakenteessa tai joka on kotransfek- * * * "* toitu DNA-rakenteen kanssa.

« · « « *!* Hiivasoluja esimerkiksi viljellään edullisesti ke- ***** miallisesti määritellyssä kasvualustassa, joka käsittää ei- *"" aminohappotyppilähteen, epäorgaanisia suoloja, vitamiineja 35 ja täydenteenä oleellisia aminohappoja. Kasvualustan pH pi-• · * ^. detään edullisesti pH:ssa yli 2 ja alle 8, edullisesti • ·· • * 20 117831 pH:ssa 6,5. Memetelmiä stabiilin pH:n ylläpitämiseksi ovat puskurointi ja jatkuva pH:n kontrollointi, edullisesti lisäämällä natriumhydroksidia. Edullisia puskurointiaineita ovat meripihkahappo ja Bis-Tris (Sigma, St. Louis, MO) .

5 Hiivasoluja, joilla on vajaus geenissä, jota tarvitaan as- paragiiniliitteiseen glykosylaatioon, kasvatetaan edulli- 0 sesti kasvualustassa, joka sisältää osmoottisen stabilisaattorin. Edullinen osmoottinen stabilisaattori on sorbitoli, jota on täydennetty kasvualustaan pitoisuus 0,1 - 1,5 10 M, edullisesti 0,5 M tai 1,0 M. Nisäkässoluja viljellään yleensä kaupallisesti saatavana olevissa seerumia sisältävissä tai seerumivapaissa kasvualustoissa. Tietylle käytetylle solulinjalle sopivan kasvualustan valitsemisen pystyy alan keskimääräinenkin taitaja suorittamaan.

15 Isäntäsoluja, jotka sisältävät esillä olevan kek sinnön mukaisia DNA-rakenteita, jotka koodittavat gla-alueetonta protrombiinia, jossa tekijä-Xa-pilkkomiskohdan korvaa trombiiniaktivaatiokohta, viljellään edullisesti kemiallisesti määritellyssä seerumivapaassa kasvualustassa.

20 Seerumivapaa kasvualusta voidaan saada kaupallisista lähteistä, esimerkiksi Gibco-BRL (Gaithersburg, MD), tai se , , voidaan valmistaa käyttäen reseptejä, jotka ovat kirjallli- i » i ** 1j suudesta tuttuja ja joita julkaisee esimerkiksi taho the • · i *· 1J American Type Culture Collection. Alan keskimääräinenkin 1 25 taitaja kykenee valitsemaan sopivat kasvunalustan rakenne- • 1 · * V osat. Saattaa olla edullista helpottaa tiettyjen näistä ,.1·1 transfektanteista tuotettujen trombiiniprekursorien akti- , vaatiota lisäämällä hepariinia tai trombiinia. Tarkemmin ottaen trombiiniprekursorien, jotka sisältävät trombiini- . 30 pilkkomiskohdan villityypin trombiiniaktivaatiokohdan (Arg- **» ,··. Ile) tilalla, aktivaatiota voidaan helpottaa lisäämällä he- • « "·1 pariinia kasvualustaan. Edullisesti 0,5 - 5,0 U/ml heparii- : ; ' 21 117831 keksinnön mukaisia DNA-rakenteita, jotka koodattavat gla-alueetonta protrombiinia, jossa tekijä-Xa-aktivaatiokohdan korvaa trombiiniaktivaatiokohta, seerumivapaaseen kasvualustaan voidaan lisätä 0,5-5 pg/ml trombiinia, edulli-5 senunin 1-2 pg/ml trombiinia, jolloin 1 pg:n/ml trombiinia lisääminen seerumivapaaseen kasvualustaan on erityisen edullista.

Esillä olevan keksinnön mukaan tuotettuja trombii-niprekursoreita voidaan puhdistaa tavanomaisella kromato-10 grafialla käyttäen edullisesti Cibacron Blue F3GA -väriä, joka on kiinnitetty kiinteään matriisiin kuten Affi-GelR-blue-affiniteettigeeli (BioRad, Richmond, CA) . Trombiini-prekursorit voidaan eluoida kolonnista altistamalla korkealle suolapitoisuudelle 0,6 - 1 M NaCl, edullisesti 1 M 15 NaCl. Piikkifraktiot määritettyinä mittaamalla absorbanssi 280 nm:ssä yhdistetään pooliksi. Poolia laimennetaan 25 mM Tris-liuokseen, pH 7,4, ja trombiiniprekursorit aktivoidaan ; lisäämällä suhteessa 1:1 000 - 1:2 000 (w/w) käärmemyrkky- ; aktivaattoria (kuvataan tarkemmin alla) arvioidun prote-20 iinipitoisuuden perusteella. Aktivoitu materiaali puhdistetaan kromatografisesti edullisesti käyttäen para-amino-bentsamidiinia, joka on kytketty kiinteään matriisiin, ku- • · · *· " ten Benzamidine Sepharose 4B (Pharmacia LKB Biotechnology • · *. *: Inc., Piscataway, NJ) . Trombiini voidaan eluoida kolonnista 25 käyttämällä 15 mM bentsamidiiniliuosta. Fraktioista määri- * · · j *4! tetään kromogeeninen aktiivisuus laimentamalla fraktioeriä ·;· ja lisäämällä trombiinin kromogeenista substraattia. Poo- ;*·*: liksi yhdistetyistä fraktioista voidaan poistaa suolat * käyttämällä materiaali G-25-kolonnin (BioRad) läpi.

, ,·. 30 Saattaa olla edullista esiajaa trombiiniprekursorit * · · kolonnimatriisin läpi, joka on ristikytketty hepariiniin, • · "* kuten Affi-Gel-hepariinigeeli (BioRad, Richmod, CA), tai « vastaavaan, trombiinin ja trombiinin kaltaisten epäpuhtauk-·:**: sien poistamiseksi. Vaihtoehtoisesti trombiiniprekursorit 35 voidaan puhdistaa affiniteettikromatografisesti käyttämällä « · . . trombiinin vastaisia vasta-aineita. Muita menetelmiä trom- • · · • ·· 22 117831 biinin puhdistamiseksi esitetään US-patenttijulkaisussa 4 965 203, joka sisällytetään tähän viitteeksi. Aktivoitu trombiini, joka on tuotettu gla-alueettomista protrombii-neista, jotka aktivoituvat eritysreitillä tai aktivoidaan 5 kasvualustassa, voidaan puhdistaa kromatografisesti käyttäen para-aminobentsamidiinia kytkettynä edellä kuvatun mukaiseen kiinteään matriisiin.

Puhdistetut trombiiniprekursorit voidaan aktivoida käyttäen myrkkyaktivaattoria käärmeestä kuten Echis carna-10 tus tai Vipera russellii, edullisesti Echis carnatus kuten kuvaavat esimerkiksi Teng et ai. [Taxicon. 27 (1989) 161— 167]. Echis carnatus -aktivaattori puhdistetaan edullisesti perättäisillä kromatografia-ajoilla Sephadex G-150:n ja DEAE-Sephadex A25:n tai vastaavien läpi, mitä seuraa tois-15 tettu FPLC käyttäen Mono-Q-kolonnia. Vaihtoehtoisesti puhdistetut trombiiniprekursorit voidaan aktivoida käyttäen tekijä-Xa:ta oleellisesti kuten kuvaavat esimerkiksi Helde-brant et ai. |~J. Biol. Chem. 248 (1973) 7149-7163], Downing et ai. [J. Biol. Chem. 250 (1975) 8897-8906] ja Krishnaswa-20 my et ai. [J. Biol. Chem. 262 (1987) 3291—3299]. Trombiiniprekursorit, jotka sisältävät trombiiniaktivaatiokohdan, voidaan aktivoida lisäämällä trombiinia.

< · • · · *· *! Aktivoitu materiaali puhdistetaan edullisesti käyt- • · ' *,*·; täen S-Sepharose-nopeavirtauskolonnia ja suolagradienttia, "**ί 25 edullisesti 100 mM - 1 M. Puhdistettua aktivoitua materiaa- j**j: lia voidaan puhdistaa edelleen käänteisfaasi-HPLC: llä. Li- ··· säpuhdistukseen voidaan päästä tavanomaisin kemiallisin • · · · .*:*· puhdistuskeinoin, kuten mm. nestekromatografia, gradient- tisentrifugointi ja geelielektroforeesi. Menetelmiä prote-, t-, 30 iinien puhdistamiseksi tunnetaan alalla (katso yleisesti « t · !!! Scopes, R., "Protein Purification", Springer-Verlag, NY, S · *" 1982, joka sisällytetään tähän viitteeksi), ja niitä voi- "**· daan käyttää tässä kuvattujen trombiiniprekursorien puhdis- *:**: tamiseksi. Oleellisesti puhdas trombiini tai trombiinipre- #>*4· 35 kursorit, joiden puhtausaste on ainakin noin 50 %, ovat • · . . edullisia, edullisemmin ainakin noin 70 - 80 %, ja edulli- S ·· 117831 23 simmin 95 - 99 % tai homogeeninen puhtaus, erityisesti farmaseuttisiin käyttöihin. Sitten kun ne on puhdistettu, osittain tai homogeenisiksi toivomusten mukaan, yhdistelmä-DNA-trombiinia tai -trombiiniprekursoreita voidaan sitten 5 käyttää farmaseuttisten koostumusten jne. valmistuksessa.

Esillä olevan keksinnön mukaan tuotetulla yhdistel-mä-DNA-ihmistrombiinilla on lukuisia erilaisia käyttöjä, mutta erityisesti farmaseuttisissa koostumuksissa koagulaa-tiohäiriöiden hoitamiseksi nisäkkäissä, etenkin ihmisissä.

10 Keksinnön mukaisesti valmistettuja trombiinivalmisteita voidaan käyttää terapeuttisesti koagulanttina tai hyytymän muodostumisen stabiloimiseksi haavoja paikattaessa, veren- , vuodon hoidossa, joka liittyy suurempiin tai vähäisempiin vaurioihin tai leikkauksiin, palovammoihin, haavaisiin vau-15 rioihin, ihon siirtoihin jne. Yhdistelmä-DNA-trombiini- koostumuksia voidaan myös käyttää kudosliimojen rakenneosana, esimerkiksi tekijä-XIII- tai muiden transglutaminaasi-valmisteiden kanssa.

Valmistettavat farmaseuttiset koostumukset käsittä-20 vät terapeuttisesti tehokkaita määriä yhdistelmä-DNA-trom-biinia ja sopivaa fysiologisesti hyväksyttävää kantajaa. Farmaseuttiset koostumukset on tarkoitettu pääasiassa pai- • · *· " kalliseen käyttöön haavaan tai leikkauskohtaan jne., mutta • · *. *: niitä voidaan antaa myös laskimonsisäisesti, kun kyseessä **’" 25 on vakava maksan toimintavajaus, laaja vamma, johon liittyy • · · j * ! runsasta verenvuotoa, ja/tai verenkorvausohjelmat, aivojen *:* tai selkäytimen lukinkalvon alainen verenvuoto ja muut vas- 1 • · * · ·*·*· taavat. Tyypillisesti esitettyjä trombiinivalmisteita voi- * daan antaa samanaikaisesti muiden koagulaatiokoostumusten , 30 kanssa tehon lisäämiseksi.

• · ·

Lukuisia erilaisia vesipohjaisia kantajia voidaan • · "* käyttää koostettaessa yhdistelmä-DNA-trombiinia käsittäviä "**· farmaseuttisia koostumuksia, esim. puskuroitua vettä, suo- *ϊ"! laliuosta, 0,3-%:ista glysiiniliuosta ja vastaavia, mukaan 35 lukien glykoproteiineja stabiilisuuden tehostamiseksi, ku- • · . . ten albumiinia, lipoproteiinia, fibronektiinia ja/tai glo- • ·· • » : 24 117831 buliinia. Koostumukset voidaan steriloida hyvin tunnetuilla sterilointitekniikoilla, ja liuokset pakata käyttöön tai kylmäkuivata. Valmistettavien farmaseuttisten koostumusten muita aineosia voivat olla farmaseuttisesti hyväksyttävät 5 apuaineet tarpeen mukaan fysiologisten olosuhteiden jäljittelemiseksi, kuten pH:ta säätävät ja puskuroivat aineet, toonisuutta säätävät aineet ja vastaavat, esimerkiksi nat-riumasetaatti, natriumlaktaatti, natriumkloridi, kaliumklo-ridi, kalsiumkloridi jne.

10 Muita aineosia voidaan niinikään lisätä yhdistelmä- DNA-trombiinikoostumuksiin, yleensä annon potilaalle ajankohtana, niiden tehokkuuden lisäämiseksi, kuten kalsium-ioneja, proteaasi-inhibiittoreita (esim. aprotiniini), fib-rinogeenia jne. Voidaan antaa myös seoksena prostaglan-15 di ineja, muita koagulaatiotekijöitä, antihistamiineja, va-sopressiinejä, kasvutekijöitä, vitamiineja, antibiootteja (esim. aminoglykosidit, penisilliinit, karbapeneemit, sul-fonamidit, tetrasykliinit) ja vastaavia. Erilaisten haava-kudosliimojen koostumusta käsitellään yksityiskohtaisesti 20 US-patenttijulkaisuissa nro 4 427 650, 4 442 655 ja 4 655 211, joista kukin sisällytetään tähän viitteeksi.

Yhdistelmä-DNA-ihmistrombiinin terapeuttisesti te- • a a .· jj *·*ϊ hokkaiden annosten pitoisuus farmaseuttisissa koostumuksis- • a sa voi vaihdella runsaasti, eli olla noin 100 - noin 10 000 25 NIH-standardiyksikköä (jolloin yleensä 1 pg oleellisesti : ·φϊ puhdistettua trombiiniproteiinia vastaa noin 3 000 yksik- ··· : köä), tavallisesti ainakin noin 500 - 5 000 yksikköä ja a a a a ·*·*· edullisemmin noin 1 000 - 2 000 yksikköä, ja se valitaan pääasiassa tilavuuksien, viskositeettien, saadun kompleksin . ,·. 30 voimakkuuden jne., nojalla aiotun nimenomaisen käytön, haa- a a · ttt van tai verenvuotohäiriöin vakavuuden, valitun antotavan, I · ' ' a · *t* potilaan yleisen terveydentilan jne. mukaan. Tulee muistaa, a *J**: että tässä esitettyjä materiaaleja voidaan yleisesti käyt- a *!**! tää vakavissa sairaus- tai vauriotiloissa, eli tilanteissa, 35 joissa on tai mahdollisesti on hengenvaara. Tällaisissa ta- a a •m . pauksissa ottaen huomioon yhdistelmä-DNA-ihmistrombiinin aa·.

• a :. 25 117831 ulkoisten aineiden minimointi, alentunut immunogeenisyys ja pidentynyt puoliintumisaika ja stabiilisuus, jotka on tehnyt mahdolliseksi tämä keksintö, on mahdollista ja hoitavan lääkärin mielestä saattaa tuntua toivottavalta antaa huo-5 mättäviä ylimääriä näitä trombiinikoostumuksia.

Seuraavat esimerkit esitetään havainnollistavassa eikä rajaavassa mielessä.

Esimerkkejä

Restriktioendonukleaasit ja muut entsyymit DNA: n 10 modifioimiseksi [esim. T4-polynukleotidikinaasi, vasikan alkalinen fosfataasi, DNA-polymeraasi-I (Klenow-fragment-ti), T4-polynukleotidiligaasi] saatiin yrityksiltä Boehrin-ger Mannheim Biochemicals, Bethesda Research Laboratories (BRL) ja New England Biolabs ja niitä käytettiin valmista-15 jän ohjeiden mukaan, ellei toisin ole mainittu,

Oligonukleotidit syntetisoitiin käyttäen Applied Biosystemsin malli 380A DNA-syntetisaattoria ja ne puhdistettiin polyakryyliamidigeelielektroforeesilla käyttäen denaturoivia geelejä. E^ coli -solut transformoitiin kuten -1 20 kuvaavat Maniatis et ai. ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual"; Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, joka sisälly- . . tetään tähän viitteeksi) tai kuten kuvaavat Sambrook et ai.

• · · ‘ *j ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual"; Cold Spring Har- • · · '· *· bor Laboratory, 2. painos, 1988, joka sisällytetään tähän ··«·· _ • * 25 viitteeksi). M13- ja pUC-kloonausvektorit ja isäntäkannat • *.· saatiin yritykseltä BRL.

..*·* Esimerkki 1

Pro trombi ini-cDNA: n kloonaus *

Ihmisprotrombiinia koodittava cDNA eristettiin . .·. 30 oleellisesti kuten kuvaavat Degen et ai. [Biochemistry 22 .··. (1983) 2087—2097, joka sisällytetään tähän kokonaisuudes- • · "·* saan viitteeksi]. Lyhyesti, ihmisen maksa-RNA:sta valmis- * * tettu cDNA-kirjasto alakloonattiin plasmidin pBR322 PstI- *·**· kohtaan. cDNA-kirjasto transformoitiin EM coliin ja noin * 35 18 000 transformanttia seulottiin käyttäen poolia de- ; generaattioligonukleotidejä, joiden sekvenssi oli 5' • ·* • * 26 ' 117831 CCNGCRCAR AACAT 3' (sekvenssi tunnusnro 1). Identifioitiin noin 30 positiivista kloonia. Positiivisten kloonien uudel-leenseulonnassa radioleimatulla Aval-BamHI-restriktiofrag-mentilla nautaprotrombiini-cDNA:sta identifioitiin 14 kloo-5 nia, jotka hybridisoituivat sekä degeneraattioligonukleoti-dipooliin että nautaprotrombiini-cDNA:hän. Kaksi positiivisista klooneista valittiin edelleen karakterisoitaviksi.

Yhden kloonin todettiin sisältävän täydellisen ihmisprot-rombiini-cDNA-sekvenssin. Ihmisprotrombiini-cDNA-sekvenssin 10 DNA-sekvenssi ja siitä päätelty aminohapposekvenssi esitetään sekvensseinä tunnusnrot 2 ja 3.

Protrombiini-ilmentämisvektori rakennettiin käyttäen synteettisiä oligonukleotidejä, jotka oli suunniteltu koodittamaan protrombiinijohtosekvenssiä. Synteettiset oli-15 gonukleotidit suunniteltiin ja rakennettiin muodostamaan juotettuina adapterin, joka koodittaa ihmisen protrombiinijohtosekvenssiä, jossa on tarttuna 5' EcoRI-pää ja 3'

Sstl-pää. Oligonukleotidejä ZC1378, ZC1379, ZC1323 ja ZC1324 (sekvenssit tunnusnrot 8, 9, 6 ja vastaavasti 7) kä-20 siteltiin kinaasilla ja ne juotettiin käyttäen oleellisesti Sambrookin et ai. kuvaamaa menetelmää (ibid., joka sisälly-, . tetään tähän kokonaisuudessaan viitteeksi). Kinaasilla kä- * 1 Φ sitelty, juotettu adapteri ligatoitiin M13mpl9:ään, josta • · · *· " oli tehty lineaarinen pilkkomalla EcoRIrllä ja Sstlrllä.

1 25 Ligatointiseos transformoitiin Eh_ coli -kantaan JM101, ja t · · • ’.· valmistettiin yksisäikeinen DNA sekvenssianalyysiin. Sek- #t||1 venssianalyysissä identifioitiin klooni, joka sisälsi oike- an sekvenssin, minkä jälkeen kloonista valmistettiin RF-DNA, jota pilkottiin EcoRI:llä ja Sstlrllä, jolloin eris- . 30 tettiin 160 ep:n fragmentti. Johtosekvenssin sisältävä * · · .··. fragmentti ligatoitiin osittaiseen Sstl-EcoRI-fragmenttiin, • · ’·" joka koodittaa osaa plasmidista p594 saatua proteiini-C- * 1 cDNArta, ja EcoRIrllä linearisoituun, bakteeriperäisellä alkalisella fosfataasilla käsiteltyyn pDXrään (plasmideja 35 p594 ja pDX kuvataan yhteisesti omistetussa US-patentti- " : .·. ; julkaisussa nro 4 959 318, joka sisällytetään tähän viit- * · 1 • · 117831 27 teeksi) . Ligatointiseos transformoitiin EL coli -kantaan JM101, ja plasmidi-DNA valmistettiin valituista transfor-manteista. Restriktioanalyysillä identifioitiin klooni, jossa fragmentit olivat oikein suuntautuneet suhteessa pro-5 moottoriin. Protrombiinijohtosekvenssi saatiin pilkkomalla plasmidia EcoRIillä ja ApaLI:llä, jolloin eristettiin 756 emäsparin fragmentti.

Loput protrombiinikoodaussekvenssistä saatiin alkuperäisestä cDNA-kloonista, jota pilkottiin ApaLI:llä ja 10 BamHI:llä, jolloin eristettiin 1 558 emäsparin fragmentti, ja BamHIillä ja Pstlillä, jolloin eristettiin 385 emäsparin fragmentti. Synteettiset oligonukleotidit ZC2490 ja ZC2492 (sekvenssit tunnusnrot 10 ja 11) suunniteltiin muodostamaan juotettuina Pstl-EcoRI-adapteri liittämään protrombiini- 15 cDNA:n 3'-pää Zem229R-ilmentämisvektoriin.

Plasmidi Zem229 on pUC18-pohjainen ilmentämisvektori, joka sisältää yksittäisen BamHI-kohdan kloonatun DNA:n insertoimiseksi hiiren metallotioneiini-l-promoottorin ja SV40-transkriptiopäättäjän väliin ja ilmentämisyksikön, jo-20 ka sisältää SV40-varhaispromoottorin, hiiren dihydrofolaat- tireduktaasigeenin ja SV40-päättäjän. Zem229:ää modifioi- . . tiin kahden EcoRI-kohdan deletoimiseksi osittain pilkkomal- * · * *; *| la EcoRI:llä, tekemällä päät tasaiseksi DNA-polymeraasi- • · · ’· "· Irllä (Klenow-fragmentti) ja dNTP:eillä ja uudelleenliga- * * : 25 toimalla. Pilkkomalla saatu plasmidi BamHIillä ja sitten • · · • *,· ligatoimalla lineaariseksi tehty plasmidi BamHI-EcoRI- ##*j* adaptereihin saatiin yksittäinen EcoRI-kloonauskohta. Saatu plasmidi nimettiin Zem229R:ksi (kuvio 1).

*

EcoRI-ApaLI-protrombiinijohtofragmentti, 1,5 ke:n . 30 ApaLI-BamHI-protrombiinikoodaussekvenssifragmentti, 0,385 • ♦ · .···. ke:n BamHI-Pstl-protrombiinikoodaussekvenssifragmentti ja • · *·* Pstl-EcoRI-adapteri ligatoitiin EcoRIillä linearisoituun

Zem229:ään. Ligatointiseos transformoitiin E_^ coliin, ja *:**: valituista transformanteista valmistettiin plasmidi-DNA.

35 Restriktioanalyysillä identifioitiin klooni, jossa oli pro- * · .·.; trombiinikoodausalue insertoituna vastakkaisesti suuntautu- • • · 28 117831 neena promoottoriin nähden, ja se nimettiin protrombiini 4/229R:ksi takaperin.

Esimerkki 2

Kudosplasminogeeniaktivaattori-prepro-sekvenssin 5 rakentaminen

Kudosplasminogeeniaktivaattori- (tPA-) prepro-sek-venssi eristettiin Zeml69:stä, joka rakennettiin seuraavasti. cDNA-klooni, joka käsittää kypsän tPA:n koodaussekvens-sin, rakennettiin mRNA:sta Bowes-melanoomasolulinjasta 10 [Rijken ja Collen, J. Biol. Chem. 256 (1981) 7035—7041], Tätä cDNA:ta käytettiin sitten plasmidin pDR1296 rakentamiseksi. |h_ coli -kanta JM83, joka on transformoitu pDR1296:lla, on talletettu talletuslaitokseen the American Type Cultute Collection hakunumerolla 53 347.

15 DNA-rakenne, joka käsittää MT-l-promoottorin, täy dellisen tPA-koodaussekvenssin, mukaan lukien luonnollinen tPA-prepro-sekvenssi, ihmisen kasvuhormoni- (hGH-) päättäjän, koottiin seuraavasti. Luonnollinen tPA-prepro-sekvens-si rakennettiin syntetisoiduista oligonukleotideistä ja in- ’ 20 sertoitiin BamHIillä pilkottuun pUC8:aan. MT-l-promoottorin käsittävä Kpnl-BamHI-fragmentti eristettiin MThGH112:sta , , [Palmiter et ai., Science 22 (1983) 809—814] ja insertoi- • · · "l 1 2 3| tiin pUC18:aan Zem93:n rakentamiseksi. Plasmidia EV142, jo- • · · *· " ka käsittää MT-l:n ja hGH-sekvenssejä pBR322-johdannaisessa :1'1 25 pBX322 (Palmiter et ai., ibid.), pilkottiin EcoRIillä ja • · · • 1.· MT-l-promoottorin ja hGH-päättäjäsekvenssejä käsittävä fragmentti eristettiin. Tämä fragmentti kloonattiin Eco-

Ritilä pilkottuun pUC13:een plasmidin Zem4 rakentamiseksi.

Zem93:sta tehtiin sitten lineaarinen pilkkomalla BamHIillä , 30 ja Sällillä. Zem4:ää pilkottiin Bglllilla ja Sällillä ja • » 1 .···. hGH-päättäjä puhdistettiin. tPA-prepro-sekvenssi poistet- 2 • · 3 tiin pUC8-vektorista Sau3A-fragmenttina. Sitten kyseiset ***" kolme DNA-fragmenttia liitettiin yhteen ja plasmidi, jossa *"'1 oli tPA-prepro-sekvenssi oikein suuntautuneena, nimettiin ....: 35 Zem97iksi. Zem97:ää leikattiin Bglllilla ja Bglll-BamHI- • · • · 1 • · 1 • « 117831 29 tPA-fragmentti pDR1296:sta insertoitiin. Saatu vektori nimettiin Zem99:ksi (kuvio 2).

Kuten esitetään kuviossa 2, tPA-koodaussekvenssi Zem99:stä liitettiin sitten operatiivisesti MCF-13-pro-5 moottoriin [Yoshimura et ai., Mol. Cell. Biol. 5 (1985) 2832—2835]. MCF-13-promoottori saatiin PstI- ja Smal-fragmenttina, joka ligatoitiin Pstl:llä ja Smalrllä lineaariseksi tehtyyn pIC19H:hon. Saatu plasmidi, joka nimettiin Zeml61:ksi, tehtiin lineaariseksi Bglllrllä. tPA-koodaus-10 sekvenssi ja ihmisen kasvuhormonipäättäjä eristettiin

Zem99:stä BamHI-fragmenttina. BglII:lla linearisoitu Zeml61 ja BamHI-tPA-hGH-fragmentti ligatoitiin yhteen. Plasmidi, joka sisälsi insertin oikein suuntautuneena suhteessa promoottoriin, nimettiin Zeml69:ksi (kuvio 2). tPA-johtosek-15 venssi eristettiin Zeml69:stä pilkkomalla EcoRIjllä ja BglII:lla 120 ep:n fragmentin eristämiseksi.

tPA-johtosekvenssi liitettiin sitten proteiini-C:tä koodittavaan sekvenssiin. Synteettiset oligonukleotidit ZC1237 ja ZC1238 (sekvenssit tunnusnrot 4 ja 5) suunnitel-20 tiin antamaan juotettuina käyttöön adapteri, joka koodittaa ·: proteiini-C:n ensimmäisiä 8 aminohappoa ja jossa on tarttu- . , va 5' Bglll-pää ja tarttuva 3' Sstl-pää. Oligonukleotidejä ♦ « ♦ '[ ‘j ZC1237 ja ZC1238 (sekvenssit tunnusnrot 4 ja 5) käsiteltiin • * · *· " kinaasilla oleellisesti kuten kuvaavat Sambrook et ai.

·· · * * ** 25 (ibid.). 3'-proteiini-C-koodaussekvenssi saatiin plasmidis- • * · • ta pDX/PC962 (jota kuvataan avoinna olevassa, yhteisesti t>*j* omistetussa US-patenttihakemuksessa julkaisusarjanro 07/582 131 ja PCT-julkaisussa WO 91/09 953, jotka sisälly- * tetään tähän kokonaisuudessaan viitteiksi), joka sisältää . 30 SV40-ori:n ja tehostimen, adenoviruksen pääasiallisen myö- * · · .···. häisen promoottorin ja 5'- ja 3'-silmukoitumiskohdat, pro- * · *" teiini-C-cDNA-sekvenssin ja SV40-polyadenylaatiosignaalin.

Plasmidi pDX/PC962 pilkottiin EcoRI:llä kokonaan ja osit-tain Sstlrllä 1,5 ke:n fragmentin eristämiseksi, joka si-35 sältää 3'-proteiini-C-sekvenssin. 120 ep:n EcoRI-Bglll-tPA- • * ; johtofragmentti, ZC1237 (sekvenssi tunnusnro 4), ZC1238 • «» • · ; 30 117831 (sekvenssi tunnusnro 5) ja 1,5 ke:n Sstl-EcoRI-fragmentti liitettiin pDX:ään (jota kuvataan US-patenttijulkaisussa 4 959 318, joka sisällytetään tähän viitteeksi), josta oli tehty lineaarinen pilkkomalla EcoRI:llä. Ligatointiseos 5 transformoitiin Eh. coli -kantaan HB101, ja plasmidi-DNA valmistettiin valituista transformanteista. Valittujen plasmidien restriktioanalyysi osoitti, että yksi plasmidi, joka nimettiin tPA/pC/pDX:ksi, sisälsi fragmentit oikeassa järjestyksessä ja oikein suuntautuneina.

10 Esimerkki 3 gla-alueettomien protrombiini-ilmentämisyksiköiden rakentaminen ja ilmentäminen nisäkässoluissa A. ThrlOO:n rakentaminen

Plasmidia ThrlOO käytettiin gla-alueettoman pro-15 trombiinin ilmentämiseksi, joka sisälsi A-ketjun, aktivaa-tiokohdan ja seriiniproteaasialueen protrombiinista.

60 emäsparin fragmentti tPA-johtosekvenssistä eristettiin plasmidista tPA/PC/pDX (esimerkki 2) pilkkomalla EcoRI:llä ja Narlrllä. Adapterit rakennettiin käyttäen syn-20 teettisiä oligonukleotidejä (ZC3830, ZC3831, ZC3832 ja ZC3833 (sekvenssinrot 12, 13, 14 ja vastaavasti 15), jotka . , antoivat käyttöön loput 60 emäsparia tPA-johtosekvenssistä • · · ‘ * liittyneenä DNA-segmenttiin, joka koodittaa ihmisen prot- • · · ** " rombiinista sekvenssin arginiini-415 - glysiini-431 (sek- * * 25 venssi tunnusnro 3) . Tähän adapterisekvenssiin suunnitel- · · ; tiin tarttuva 5' Narl-pää ja tarttuva 3' Aval-pää. Kaikki Φ neljä oligonukleotidiä käsiteltiin kinaasilla erikseen ja kinaasin inaktivoinnin jälkeen yhdistettiin ja juotettiin. 1 035 emäsparin Aval-EcoRI-protrombiinifragmentti eristet- • 30 tiin plasmidista protrombiini 4/229R takaperin (esimerkki • · · 1) .

• · •# 60 emäsparin EcoRI-Narl-tPA-johtofragmentti, Narl- * * · * ·

Aval-adapteri, Aval-EcoRI-protrombiinifragmentti ja Eco- **’*· RI:llä linearisoitu Zem22 9R-vektori ligatoitiin. Ligatoin- ····· 35 tiseoksella transformoitiin E_^ coli -kanta HB101. Plasmidi- .·. : DNA valmistettiin 8 transformantista. Restriktioanalyysi • · 117831 31 Näriltä ja EcoRl:tä käyttäen osoitti, että yksi transfor-mantti sisälsi insertin, jonka koko oli oikea mutta joka oli käänteisesti suuntautunut suhteessa promoottoriin. Plasmidi-DNA:ta tuosta kloonista, joka nimettiin nro 8:ksi, 5 pilkottiin EcoRI:llä insertin kokonaisuudessaan vapauttamiseksi ja pilkottu DNA uudelleenligatoitiin kloonin saamiseksi, jossa insertti on oikein suuntautunut. Tästä liga-; toinnista yhden kloonin osoitettiin käsittävän insertin oikein suuntautuneena. Tätä kloonia, joka nimettiin nro 10 15:ksi, analysoitiin edelleen käyttäen entsyymejä EcoRI,

PstI, Aval, Narl ja Sacl ja sen todettiin sisältävän kaikki DNA-fragmentit oikean kokoisina ja oikein suuntautuneina suhteessa promoottoriin.

Plasmidi-DNA:ta kloonista nro 15 käytettiin kal-15 siumfosfaattivälitteisessä transfektoinnissa (Wigler et ai., ibid.) BHK570-soluihin (talletettu talletuslaitokseen the American Type Culture Collection, Rockville, MD, jossa ·· hakunumero on 10 314). Transfektointiseos sisälsi 2 - 10 pg plasmidi-DNA:ta ja pitoisuuden 100 μΜ klorokiini. Seos li-20 sättiin 70-%risesti yhteenkasvaneeseen 10 cm:n petrimal- jaan, joka sisälsi kasvualustaa (taulukko 1), ja inkuboi-. , tiin 37 °C:ssa pitoisuuden 5 % C02:ta läsnä ollessa. 4 tun- » i · *| nin kuluttua kasvualusta poistettiin ja soluille annettiin • · · *· " 1 minuutin kestävä glyserolishokki lisäämällä DMEM-kasvu- • : 25 alustaa (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD), joka sisälsi 15 % * · · • *.· glyserolia. Inkuboinnin jälkeen glyserolikasvualusta kor- j o|J* vattiin kasvualustalla (taulukko 1). 1

Taulukko 1 * 1. Kasvualusta . 30 500 ml Dulbeccon modifioitua Eagle-kasvualustaa • · · ,*··, (DMEM) (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) * « 5 % vasikansikiöseerumia (Hyclone, Logan, UT) *· * 1 mM natriumpyruvaatti (Irvine, Santa Ana, CA) * *·’*· 0,29 mg/ml L-glutamiinia (Hazelton, Lenexa, KS) 35 • · · • · · • · * • · 1 117831 32 2. Valikointikasvualusta 500 ml Dulbeccon modifioitua Eagle-kasvualustaa (DMEM) ! 5 % vasikansikiöseerumia 5 1 mM natriumpyruvaatti 0,29 mg/ml L-glutamiinia 1 μΜ tai 10 μΜ me r.ot re k saatti 3. Seerumivapaa kasvualusta 500 ml Dulbeccon modifioitua Eagle-kasvualustaa 10 (DMEM) 1 mM natriumpyruvaatti 0,29 mg/ml L-glutamiinia 10 mg/litra transferriiniä (JRH, Lenexa, KS) 5 mg/litra fetuiinia (Aldrich, Milwaukee, WI) 15 5 mg/litra insuliinia (Gibco, Grand Island, NY) 2 pg/litra seleniumia (Aldrich, Milwaukee, WI) 24 tunnin kuluttua transfektoinnista solut käsiteltiin trypsiinillä ja joko 10 % tai 2,5 % soluista uudel-leenmaljättiin valikointikasvualustaan (taulukko 1). Soluja 20 kasvatettiin kunnes muodostui pesäkkeitä. Erillisiä pesäk- , f keitä noukittiin 24-kuoppaisille levyille (American Scien- .·, : tific Products, Chicago, IL) ja kasvatettiin yhteenkasva- | viksi. Kun solut olivat kasvaneet yhteen, kasvualusta kus- • · · • I sakin kuopassa korvattiin 0,5 ml :11a seerumivapaata kasvu- »·*·· / 25 laustaa (taulukko 1) .

· • ·’ 24 tunnin kuluttua seerumivapaassa kasvualustassa kasvualustat otettiin talteen ja testattiin reaktiivisuus

• M

V * kromogeenisessa määrityksessä (esimerkki 4). Mitään reaktiivisuutta ei osoitettu, ja sittemmin suoritettu DNA:n : 30 kloonista nro 15 sekvenssianalyysi paljasti kaksi mutaatio- • · · 1 ta. Oligonukleotidin ZC3833 kattava sekvenssi (sekvenssi * * * • , tunnusnro 15) sisälsi substituution emäksessä 42 T > A, , • · · · · [ · josta seuraa Tyr Phe -substituutio. Tämä substituutio on * * konservatiivinen substituutio, ja määritettiin, ettei sek- *:*·· 35 venssiä tarvinnut korjata. Lisäksi oligonukleotidin ZC3831 .*. : kattavan sekvenssin (sekvenssi tunnusnro 13) todettiin kä- * * 117831 · 33 .

sittävän deleetion emäksessä 29, joka aiheutti aluekehys- siirtymän.

Deleetion korjaamiseksi plasmidi-DNA kloonista nro 15 pilkottiin EcoRI-.llä ja BssHIillä noin 119 ep:n fragmen-5 tin eristämiseksi, joka koodittaa tPA-johtosekvenssiä ja ZC3833:ZC3830- (sekvenssit tunnusnrot 15 ja vastaavasti 12) adapterisekvenssejä. Plasmidi-DNA kloonista nro 15 pilkottiin myös Avalrllä ja EcoRI:llä noin 1 ke: n fragmentin eristämiseksi, joka sisältää protrombiini-cDNA-sekvenssin.

10 Mutaatiot oligonukleotideissä ZC3831 ja ZC3832 (sekvenssit tunnusnrot 13 ja 14) olivat seurausta oligonukleotidivalmisteiden vähäisistä epäpuhtauksista, jolloin uusia oligo-nukleotidejä ei ollut syntetisoitu. Oligonukleotidit ZC3831 ja ZC3832 (sekvenssit tunnusnrot 13 ja 14) käsiteltiin ki-15 naasilla ja juotettiin. 119 ep:n EcoRI-BssHI-fragmentti, kinaasilla käsitelty ja juotettu ZC3831:ZC3832-adapteri (sekvenssit tunnunnrot 13 ja 14), 1 ke:n Aval-EcoRI-pro- , trombiinifragmentti ja EcoRI:llä lineaariseksi tehty

Zem229R ligatoitiin. Ligatointiseoksella transformoitiin ER_ ! 20 coli -kannan XL-l-soluja. Plasmidi-DNA:n valituista trans-formanteista restriktio- ja sekvenssianalyysin jälkeen . . useiden kloonien todettiin sisältävän oikean, ZC3831:n • · · ; 1 (sekvenssi tunnusnro 13) kattavan sekvenssin. Klooni, joka · · *· 1· sisälsi oikean sekvenssin ZC3831:nä (sekvenssi tunnusnro .·, · kuten edellä kuvattiin. Transfektantteja kasvatettiin ja * #· • * 1 25 13) ja käsitti hiiren metallotioneiinipromoottorin; tPA- • · · i 1.: johtosekvenssin; A-ketjun ja seriiniproteaasialueen ihmisen ,.)·1 protrombiinista; ja SV40-polyadenylaatiosignaalin, nimet- tiin Thrl00:ksi.

Vaihtoehtoisesti molemmat muaatiot voidaan korjata . 30 uudelleenligatoimalla kaikki rakenteen osat alunperin kuva- * 1 1 .···, tun mukaisesti ja seulomalla saadut plasmidit sekvenssiana- 117831 34 kasvualusta transfektoiduista soluista määritettiin kuten edellä kuvattiin. Kromogeeninen määritys (esimerkki 4) osoitti, että ThrlOO-klooni 1 ilmensi gla-alueetonta prot-rombiinia 9,4 pg/ml ja THrlOO-klooni 3 ilmensi gla-aluee- .

5 tonta protrombiinia 3,4 pg/ml.

B. Thrl01:n rakentaminen

Plasmidia ThrlOl käytettiin gla-alueettoman prot-rombiinin ilmentämiseksi, joka sisälsi kringle-alueen 2, A-ketjun, villityypin trombiiniaktivaatiokohdan ja seriini-10 proteaasialueen ihmisprotrombiinista. : Täysi 120 emäsparin tPA-johtosekvenssi eristettiin tPA/PC/pDX:stä. Tämä fragmentti eristettiin EcoRI-Bglll-fragmenttina. Synteettiset oligonukleotidit ZC3858 ja ZC3859 (sekvenssit tunnusnrot 16 ja 17) suunniteltiin ja 15 rakennettiin antamaan käyttöön 80 emäsparin adapterin juottamisen jälkeen. Adapteri koodittaa ihmisen protrombiinise-kvenssivälin seriini-192 —arginiini-217 ja sisältää tarttuvan 5' Bglll-pään ja tarttuvan 3' Haell-pään. C-pään pro-trombiinisekvenssi saatiin plasmidista protrombiini 4/229R 20 takaperin (esimerkki 1) Haell-EcoRI-fragmenttina. »

EcoRI-Bglll-tPA-johtosekvenssi, Bglll-Haell-adapte- · ri, Haell-EcoRI-protrombiini-cDNA-fragmentti ja EcoRI:llä • · · I J linearisoitu Zem229R ligatoitiin. Ligatointiseoksella * * transformoitiin Eh_ coli -kanta HB101, ja plasmidi-DNA väli- tl··· *t t* 25 tuista transformanteista analysoitiin käyttäen entsyymejä * * * ‘ ·' Narl, EcoRI, PstI, Aval, SstI ja XhoI. Tämä analyysi pal- ..li’ jasti kloonin, jossa oli insertti, jonka koko vastasi odo- « · · J tuksia mutta joka oli käänteisesti suuntautunut suhteessa promoottoriin. Plasmidi-DNA tästä kloonista, joka nimettiin • ·': 30 #l:ksi, pilkottiin EcoRI :llä insertin vapauttamiseksi vek- II* ·'**. torista ja uudelleenligatoitiin. Plasmidi-DNA valituista • · · * , transformanteista analysoitiin restriktioanalyysillä kloo- ] nin identifioimiseksi, jossa on insertti oikein suuntautu- ’ neena suhteessa promoottoriin.

····· 35 Yksittäistä kloonia, jossa oli insertti oikein ·*·4! suuntautuneena ja joka nimettiin nro 21:ksi ja sitten uu- • » 117831 35 delleennimettiin ThrlOOrksi, käytettiin BHK570-solujen kai-siumfosfaattivälitteisessä transfektoinnissa edellä kuvatun mukaisesti. Transfektoituja soluja kasvatettiin ja erillisiä pesäkkeitä noukittiin ja maljättiin 24-kuoppaisille le-5 vyille kuten edellä kuvattiin. Kasvualusta vaihdettiin see- rumivapaaksi kasvualustaksi, sitten kun solut olivat kasvaneet yhteen. 24 tunnin kuluttua kromogeeninen aktiivisuus määritettiin käyttäen kromogeenistä määritystä (esimerkki 4) . Kloonin #29 todettiin ilmentävän gla-alueetonta prot-10 rombiinia 20 pg/ml.

C. Thrl02:n rakentaminen

Plasmidia Thrl02 käytettiin gla-alueettoman pro-trombiinin ilmentämiseksi, joka sisälsi kringle-alueet 1 ja 2, A-ketjun, villityypin trombiiniaktivaatiokohdan ja se-15 riiniproteaasialueen ihmisprotrombiinista.

Kokonainen 120 emäsparin tPA-johtosekvenssi eristettiin EcoRI-Bglll-fragmenttina plasmidista tPA/PC/pDX

(esimerkki 2) . Synteettiset oligonukleotidit ZC3860 ja Ji ZC3861 (sekvenssit tunnusnrot 18 ja 19) suunniteltiin muo- j 20 dostamaan juotettuina adapterin, joka käsittää DNA-seg- mentin, joka koodittaa ihmisen protombiinista välin serii- ,·, · ni-68 —». proliini-89, ja antaa käyttöön tarttuvan 5' Bglll- • ·· ! pään ja tarttuvan 3' Xhol-pään. Protrombiini-cDNA, joka * · · * koodittaa kringle-alueet 1 ja 2, A-ketjun, villityypin ·· · · v .* 25 trombiiniaktivaatiokohdan ja seriiniproteaasialueen, eris- • i · • ·* tettiin plasmidista protrombiini 4/229R takaperin XhoI- ··· ...J EcoRI-fragmenttina.

• · · ·.♦ : EcoRI-Bglll-tPA-johtosekvenssi, Bglll-XhoI-adapte- ri, XhoI-EcoRI-protrombiini-cDNA-fragmentti ja EcoRI:llä : 30 linearisoitu vektori Zem229R ligatoitiin. Ligatointiseok- »··

;***. sella transformoitiin |h_ coli -kanta HB101 ja plasmidi-DNA

• ♦ ♦ , * . valituista transformanteista analysoitiin käyttäen entsyy- ] mejä Narl, EcoRI, PstI, Aval, SstI, Xbal, BssHI ja XhoI ku- • · · · · ten on kuvattu edellä. Yhden kloonin, joka nimettiin ·;·*: 35 Thrl02:ksi, todettiin sisältävän insertin, jonka koko oli .\j oikea ja joka oli oikein suuntautunut suhteessa promootto- * · 117831 36 riin. Tästä kloonista valmistettua plasmidi-DNA:ta käytettiin BHK570-solujen kalsiumfosfaattivälitteisessä transfek-toinnissa kuten edellä on kuvattu. Erillisiä pesäkkeitä noukittiin 24-kuoppaisille levyille ja monistettiin vali-5 kointikasvualustassa, joka sisälsi pitoisuuden 10 μΜ metot-reksaatti. Sitten kun solut olivat yhteenkasvaneita, gla-alueeton protrombiini mitattiin käyttäen kromogeenistä määritystä (esimerkki 4). Kloonin, joka nimettiin nro 15:ksi, osoitettiin ilmentävän gla-alueetonta protrombiinia 9,9 10 pg/ml.

D. KEX2-ilmentämisvektorin KEX2/Zem228 rakentaminen

Saccharomyces cerevisiaen KEX2-geeni eristettiin hiivan genomikirjastosta seulomalla transformoituja kex2- mutanttisoluja ä-tekijäkehän tuottamisen suhteen sopivalla 15 testisolualustalla. Saatiin yksi klooni, joka täydensi kex2-mutanttien kaikki raportoidut vajaukset (pariutuminen, ; α-tekijätuotanto, tappajatoksiinin kypsyminen ja itiöinti homotsygoottisessa diploidikannassa) . Geeni alakloonattiin ; pUC-vektoriin hiivan GA11-promoottorin kontrolliin. Saatu 20 plasmidi, joka nimettiin pl515:ksi, on talletettu talletus- : laitokseen the American Type Culture Collection, 12301 t·' . Parklawn Dr., Rockville, MD 20221, jossa sen hakunumero on • 1 · ‘ 1 : 67 569. Plasmidia pl515 pilkottiin HindIII:lla ja saatiin · » * \ talteen 2,1 ke:n fragmentti. Tämä fragmentti ligatoitiin [ 25 HindIII:lla leikattuun pUC18:aan plasmidin pUC18/KEX2 ra- : kentamiseksi. Sitten KEX2-fragmentti (2,1 ke) eristettiin * „!:1 pUC18/-KEX2:sta pilkkomalla plasmidi osittain HindIII:lla • 1 1 ί#ϊ ϊ ja täysin BamHI:llä. Loput KEX2-sekvenssistä eristettiin sitten 0,43 ke:n fragmenttina pl515:n BamHI+Hindlll-pilkko- . .1. 30 mistuotteesta.

··· • · · .···. Kaksi KEX2-fragmenttia ligatoitiin sitten vektorin < Zem228 BamHI-kohtaan. Zem228 on pUC18-pohjäinen ilmentämis- • · 1 · · * 1 vektori, joka sisältää yksittäisen BamHI-kohdan vieras- ***** DNA: n insertoimiseksi hiiren metallotioeneiini-I-promoot- 35 torin ja SV40-transkriptiopäättäjän väliin. Zem228 sisältää ,·, ; myös ilmentämisyksikön, joka käsittää SV40-varhaispro- • ·· • · 117831 37 moottorin, neomysiiniresistenssigeenin ja SV40-päättäjän. Saatu plasmidi nimettiin KEX2/Zem228:ksi.

E. Plasmidien rakentaminen, jotka sisältävät vaihtoehtoisia pilkkomiskohtia villityypin trombiiniaktivaa-5 tiokohdan tilalla

Villityypin trombiiniaktivaatiokohta (Arg-Ile) korvattiin aktivaatiokohdalla, joka käsittää aminohappose-; kvenssin RRKR (sekvenssi tunnusnro 34), vaihtoehtoisen pilkkomiskohdan adapteri-insertiolla ThrlOOrn protrombiini-10 koodausalueen A-ketju- ja seriiniproteaasialueiden väliin.

Oligonukleotidit ZC3932, ZC3933, ZC3934 ja ZC3936 (sekvenssit tunnusnrot 22, 23, 24 ja vastaavasti 25) suunniteltiin antamaan juotettuina käyttöön SacI-MroI-adapteri, joka koo-dittaa RRKR- (sekvenssi tunnusnro 34) aktivaatiokohtaa, ja 15 sivuavia A-ketju- ja seriiniproteaasialuesekvenssejä. Oli gonukleotidit ZC3932 ja ZC3934 (sekvenssit tunnusnrot 22 ja vastaavasti 24) käsiteltiin kumpikin kinaasilla. Oligonuk-leotidiparit ZC3933 ja ZC3932 (sekvenssit tunnusnrot 23 ja vastaavasti 22) ja ZC3936 ja ZC3934 (sekvenssit tunnusnrot 20 25 ja vastaavasti 24) juotettiin. Plasmidi ThrlOO pilkot tiin EcoRIrllä ja Saclrllä 0,243 ke:n fragmentin eristämiseksi, joka käsittää A-ketjun 5'-koodaussekvenssin, sekä • · ·.**: MroI:llä ja EcoRIrllä 0,88 kern fragmentin eristämiseksi, * * !.*·· joka käsittää seriiniproteaasialueen 3'-koodaussekvenssin.

*:··: 25 Oligonukleotidiparit ligatoitiin 0,243 kern EcoRI-SacI- ·’·*: fragmenttiin, 0,88 kern MroI-EcoRI-fragmenttiin ja • ·

Zem229Rrään, joka oli linearisoitu pilkkomalla EcoRIrllä ja • · · · .*:·. käsitelty vasikan alkalisella fosfataasilla ympyrän muotoon • * · uudelleenasettumisen estämiseksi. Saadulla ligatointiseok- . 30 sella transformoitiin E. coli -kannan XL-l-soluia. Väli- • · · • · · tuista transformanteista valmistettu plasmidi-DNA seulot- * · *·;* tiin restriktioanalyysillä, ja plasmidi, joka sisälsi gla- ·:*·: alueettoman protrombiinin koodausalaueen oikein suuntautu- ·;··· neena suhteessa promoottoriin, nimettiin Thrl03rksi.

* . 35 DNA-rakenne, joka koodittaa kringle-aluetta 2, A- • · . . ketjua, insertoitua RRKR-aktivaatiokohtaa (sekvenssi tun- • · * • * * • · :. , 38 117831 nusnro 34) ja seriiniproteaasialuetta, rakennettiin plasmi-dista Thrl03. 0,591 ke:n EcoRI-SacI-fragmentti, joka käsittää kringle-alueen 2 ja 5'-A-ketjukoodaussekvenssejä ihmis-protrombiinista, saatiin plasmidista ThrlOl. Plasmidi 5 Thrl03 pilkottiin Sacl:llä ja EcoRI:llä 0,97 ke:n fragmentin eristämiseksi, joka käsittää ihmisprotrombiinin A-ketjun 3'-koodaussekvenssin, insertoidun RRKR-aktivaatio-kohdan (sekvenssi tunnusnro 34) ja seriiniproteaasialuekoo-daussekvenssin. 0,591 ke:n EcoRI-SacI-fragmentti ligatoi-10 tiin 0,970 ke:n SacI-EcoRI-fragmenttiin ja Zem229R:ään, joka oli tehty lineaariseksi EcoRI:llä ja käsitelty vasikan alkalisella fosfataasilla uudelleen ympyrän muotoon asettumisen estämiseksi. Saadulla ligatointiseoksella transformoitiin E_;_ coli -kannan XL-l-soluja. Valituista transfor-15 mänteistä valmistettu plasmidi-DNA seulottiin restriktio- analyysillä, ja plasmidi, joka sisälsi gla-alueettoman pro-trombiinikoodausalueen oikein suuntautuneena suhteessa promoottoriin, nimettiin Thrl22:ksi.

Analoginen plasmidirakenne, joka käsitti DNA-seg-20 mentin, joka koodittaa ihmisprotrombiinin kringle-2- aluetta, A-ketjua ihmisprotrombiinista, LDKR-KEX2-pilkko-miskohtaa, joka korvaa villityypin trombiinipilkkomiskohdan • * ·.*·· (sekvenssi tunnusnro 35) ja seriiniproteaasialueen ihmis- 1 * * :,*· protrombiinista, valmistettiin käyttäen samoja restrik- *:*·: 25 tiopilkkomisia fragmenttien saamikseksi, jotka käsittävät ·*·*; kringle-2-koodaussekvenssin ja 5'-koodaussekvenssin A-ket- ! • ♦ justa; 3'-koodaussekvenssin seriiniproteaasialueelta; ja • * · · .···. vektorisekvenssejä. Nämä fragmentit liitettiin adapteriin, • · · joka antoi käyttöön A-ketjun 3'-koodaussekvenssin, LDKR-. 30 pilkkomiskohtakoodaussekvenssin (sekvenssi tunnusnro 35) ja * t · • · · 5'-koodaussekvensin seriiniproteaasialueelta plasmidin « * *···* Thrl27 muodostamiseksi.

* *:·*: Plasmidi Thrl22 ja KEX2/Zem228 kotransfektoitiin ·;··· nisäkässolulinjaan BHK570 (talletettu talletuslaitokseen * . 35 the American Type Culture Collection hakunumerolla 10314) ] | käyttäen Boehringer-Mannheim-transfektointireagenssia N-[l- • * * * * · * · ' „ 117831 39 (2,3-dioleoyylioksi)propyyli]-N,N,N-trimetyyliammoniumme-tyylisulfaattia (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ja ; valmistajan toimittamia ohjeita. Transfektantteja kasvatettiin, ja kasvualusta transfektoiduista soluista määritet-5 tiin kromogeenisella määrityksellä (esimerkki 4). Kromogee- nisen määrityksen tulokset osoittivat, että kloonit tuotti- ’ vat noin 300 ng/litra trombiinia.

Villityypin trombiiniaktivaatiokohta ja kaksi ami-nohappokodonia välittömästi ylävirtaan aktivaatiokohdasta 10 korvattiin RRKRiää koodittavalla DNA-segmentillä (sekvenssi tunnusnro 34) plasmidin rakentamiseksi, joka sisältää DNA-segmentin, joka koodittaa ihmisprotrombiinin A-ketjua, RRKR- (sekvenssi tunnusnro 34) pilkkomiskohtaa ja seriini-proteaasialuetta ihmisprotrombiinista. Oligonukleotidit 15 2C4713, ZC4720, ZC4721 ja ZC4722 (sekvenssit tunnusnrot 26, 27, 28 ja vastaavasti 29) suunniteltiin antamaan juotettuina käyttöön SacI-MroI-adapterin, joka koodittaa RRKR-pilkkomiskohtaa (sekvenssi tunnusnro 34), joka koodittaa 3'-A-ketjun sivuamia alueita ja 5'-seriiniproteaasialue-20 koodaussekvenssejä. Oligonukleotidit ZC4720 (sekvenssi tunnusnro 27) ja ZC4721 (sekvenssitunnusnro 28) käsiteltiin kumpikin kinaasilla ja kumpikin oligonukleotidi juotettiin \ '! kumppanioligonukleotidiinsä [ZC4713:ZC4720 (sekvenssit tun- ·,*·; nusnrot 26 ja vastaavasti 27) ja ZC4721: : ZC4722 (sekvenssit *"" 25 tunnusnrot 28 ja vastaavasti 29). Plasmidi ThrlOO pilkot- :*·]: tiin EcoRIillä ja Saclillä 0,243 ke:n fragmentin eristämi- ··· seksi, joka koodittaa A-ketjun 5'-koodaussekvenssiä, ja * · · t

MroI:llä ja EcoRIillä 0,88 ke:n fragmentin eristämiseksi, joka koodittaa seriiniproteaasialueen 3'-koodaussekvenssiä.

'•m 30 Oligonukleotidiparit ligatoitiin 0,243 kein EcoRI-SacI- • · · fragmenttiin, 0,88 kein MroI-EcoRI-fragmenttiin ja • · *" Zem229R:ään, josta oli tehty lineaarinen pilkkomalla Eco- *"*: Rilliä ja jota oli käsitelty vasikan alkalisella fosfataa- *:**: silla ympyrämuodon uudelleenmuodostumisen estämiseksi. Saa- 35 dulla ligatointiseoksella transformoitiin E^. coli -kannan * · . , XL-l-soluja. Valituista transformanteista valmistettu plas- • * · • ·· • · 117831 40 midi-DNA seulottiin restriktioanalyysillä, ja plasmidi, jo-; ka sisälsi gla-alueettoman protrombiinin koodausalueen oikein suuntautuneena suhteessa promoottoriin, nimettiin Thrll5:ksi.

5 DNA-rakenne, joka koodittaa ihmisprotrombiinin kringle-2-aluetta ja A-ketjua, RRKR-aktivaatiokohtaa (sekvenssi tunnusnro 34), joka korvaa villityypin trombiiniak-tivaatiokohdan, ja kahta aminohappokodonia välittömästi ylävirtaan ja seriiniproteaasialuetta ihmisprotrombiinista, 10 rakennettiin plasmidista Thrll5. 0,591 kein EcoRI-SacI-fragmentti, joka koodittaa kringle-2- ja 5'-A-ketjukoodaus-sekvenssin ihmisprotrombiinista, saatiin plasmidista ThrlOl. Plasmidi Thrll5 pilkottiin Saclillä ja EcoRIillä 0,97 kein fragmentin eristämiseksi, joka käsittää 3'-A-15 ketjukoodaussekvenssin, muutetun aktivaatiokohdan ja serii- niproteaasialueita koodittavan sekvenssin. 0,591 kein Eco-RI-SacI-fragmentti ligatoitiin 0,970 kein SacI-EcoRI-fragmenttiin ja Zem229R:ään, joka oli tehty lineaariseksi EcoRIillä ja jota oli käsitelty vaiskan alkalisella fosfa-20 faasilla renkaan uudelleenmuodostumisen estämiseksi. Saadulla ligatointiseoksella transformoitiin Eb coli -kannan XL-l-soluja. Valituista transformanteista valmistettu plas- *. *i midi-DNA seulottiin restriktioanalyysillä, ja gla-alueet- • # ·.**: toman protrombiinin koodausalueen oikein suuntautuneena *!**i 25 suhteessa promoottoriin sisältävä plasmidi nimettiin

Thrl21iksi.

• * ··« Analogisia plasmidirakenteita, jotka käsittävät • · · · DNA-segmentin, joka koodittaa kringle-2-aluetta ja A-ketjua * ihmisen protrombiinista, LDKR- (sekvenssi tunnusnro 35) 30 KEX2-pilkkomiskohdan, joka korvaa villityypin trombiiniak- » · · tivaatiokohdan, ja kaksi aminohappokodonia välittömästi ·“ ylävirtaan villityypin trombiiniaktivaatiokohdasta ja se- *ί**ϊ riiniproteaasialueen ihmisen protrombiinista, valmistettiin *;··: käyttäen samoja restriktiokohtia fragmenttien saamiseksi, 35 jotka käsittävät kringle-2- ja 5'-A-ket jukoodaussekvens- • · . , sejä; 3'-koodaussekvenssin seriiniproteaasialueelle; ja • · · • · # · • · 41 117831 vektorisekvenssejä. Nämä fragmentit liitettiin adapteriin, joka antoi käyttöön DNA-segmentin, joka käsitti 3'-A-ketjukoodaussekvenssin, LDKR-pilkkomiskohtakoodausalueen ja seriiniproteaasikoodaussekvenssin Thrl28:n muodostamiseksi. 5 Plasmidi Thrl21 ja KEX2/Zem228 kotransfektoitiin nisäkässolulinjaan BHK570 (joka on talletettu ATCC-talle-tuslaitokseen, jossa hakunumero on 10314) käyttäen Boehrin-ger-Mannheimin transfektointireagenssia. Transfektantteja kasvatettiin ja kasvualusta transfektoiduista soluista mää-10 ritettiin kromogeenisella määrityksellä (esimerkki 4) . Tulokset kromogeenisesta määrityksestä osoittivat, että kloonit tuottivat noin 300 mg/litra trombiinia.

F. Plasmidin Thrll8 rakentaminen

Villityypin trombiiniaktivaatiokohta (Arg-Ile), jo-15 ka esiintyy plasmidissa ThrlOO, korvattiin trombiinipilkko-miskohdalla adapteri-insertiolla. Oligonukleotidit ZC4738, ZC4781, ZC4741 ja ZC4742 (sekvenssit tunnusnrot 30, 33, 31 ja vastaavasati 32) suunniteltiin antamaan juotettuina käyttöön SacI-MroI-adapterin, joka sisältää DNA-segmentin, 20 joka koodittaa karboksyylipääosaa A-ketjusta, trombiini-pilkkomiskohtaa ja aminopääosaa seriiniproteaasialueesta. Oligonukleotidit ZC4781 ja ZC4741 (sekvenssit tunnusnrot 33 • · · *· " ja vastaavasti 31) käsiteltiin kumpikin kinaasilla ja juo- • * *. *: tettiin tarkoituksenmukaiseen kumppanioligonukleotidiin *·**: 25 (ZC4781: : ZC4738, sekvenssit tunnusnrot 33 ja vastaavasti ί *^1 30) ja ZC4741: :ZC4742 (sekvenssit tunnusnrot 31 ja vastaa- *·· vasti 32). Plasmidi ThrlOO pilkottiin EcoRI:llä ja Saclrllä ···· «’·'· 0,243 ke:n fragmentin eristämiseksi, joka sisältää ihmis- protrombiinin A-ketjun 5'-koodaussekvenssin, ja MroI:llä ja , 30 EcoRI:llä 0,88 ke:n fragmentin eristämiseksi, joka sisältää • · · protrombiinin seriiniproteaasialueen 3'-koodaussekvenssin. "* Juotetut oligonukleotidiparit ZC4781::ZC4738 (sekvenssit tunnusnrot 33 ja vastaavasti 30) ja ZC4741::ZC4742 (sek-"*·: venssit tunnusnrot 31 ja vastaavasti 32) ligatoitiin 35 0,243 ke:n EcoRI-SacI-ThrlOO-fragmenttiin, MroI-EcoRI- * »

ThrlOO-fragmenttiin ja Zem229R:ään, josta oli tehty lineaa- • • * i 42 117831 rinen EcoRIillä ja jota oli käsitelty vasikan alkalisella fosfataasilla renkaan uudelleenmuodostumisen estämiseksi.

3 μ1:η erä ligatointiseosta transformoitiin Eh_ coli -kannan XL-l-soluihin. Plasmidi-DNA valmistettiin valituista trans-5 formanteista ja seulottiin restriktioanalyysillä. Plasmidi, joka sisälsi DNA-sekvenssin, joka koodittaa ihmisprotrom-biinin A-ketjua, trombiinipilkkomiskohtaa ja seriiniprote-aasialuetta ihmisen protrombiinista oikein suuntautuneena suhteessa promoottoriin, nimettiin Thrll8:ksi.

10 Plasmidi Thrll8 transfektoitiin BHK570-soluihin käyttäen Boehringer-Mannheim-transfektointireagenssia edellä kuvattuun tapaan. Transfektantteja kasvatettiin, ja kasvualusta transfektoiduista soluista määritettiin kromo-geenisellä määrityksellä (esimerkki 4). Transfektoiduista 15 soluista valittiin klooni, jota kasvatettiin ja joka siir-rostettiin kuhunkin kuoppaan kahdella 6-kuoppaisella levyllä. Kasvualusta (taulukko 1) kustakin kuopasta korvattiin seerumivapaalla kasvualustalla (taulukko 1), joka sisälsi taulukossa 2 esitetyt lisäaineet. .;i 20 Taulukko 2

Kuoppa nro Lisäaine Trombiinia .·. : (pg/ml) :·*·ί 1 - . 0,14 * * :.‘*i 2 - .0,18 25 3 - 0,18 • *,! 4 0,1 U/ml hepariinia (Sigma) 0,18 *:* 5 1 U/ml hepariinia >1,1 ·*·· .

6 10 U/ml hepariinia 1 0,56 7 10 ng/ml käärmemyrkkyaktiv. 0,15 , 30 , 8 50 ng/ml käärmemyrkkyaktiv. 0,45 • · · 9 200 ng/ml käärmemyrkkyaktiv. 1,0 ..

Ί* 10 10 ng/ml trombiinia (Dr. Walt 0,18 *:**! Kisiel, University of New Mexico,

Albuquerque, nM) 35 11 100 ng/ml trombiinia 0,23 • · ; 12 1 000 ng/ml trombiinia 1,1 • il « « 43 1 1 7831

Levyjä inkuboitiin 24 tunnin ajan 37 °C:ssa, minkä jälkeen kasvualusta kustakin kuopasta määritettiin käyttäen i esimerkissä 4 kuvattua kromogeenistä määritystä lukuun ottamatta, että aktivointivaihe käärmemyrkkyaktivaattorilla 5 jätettiin pois. Määrityksen tulokset esitetään taulukossa 3 ja ne osoittavat, että Thrll8:sta tuotettu gla-alueeton protrombiini kykenee itseaktivaatioon matalien hepariini-, käärmemyrkkyaktivaattori- tai trombiinitasojen läsnä ollessa.

10 Thrll8-transfektoiduista soluista tuotetun gla- " alueettoman protrombiinin autoaktivaation testaamiseksi satunnaisesti valittu Thrll8-transfektoitu klooni jaettiin 6-kuoppaiselle levylle ja kasvatettiin yhteenkasvavaksi see-rumivapaassa kasvualustassa. Kuhunkin kuoppaan lisättiin 2 15 yg/ml trombiinia 2 mlrssa seerumivapaata kasvualustaa ja levyjä inkuboitiin. Kahden päivän kuluttua 90 % kasvualustasta poistettiin ja korvattiin tuoreella seerumivapaalla kasvualustalla, joka ei sisältänyt trombiinia, ja levyjä inkuboitiin. 3 päivän inkuboinnin jälkeen 90 % kasvualus-20 tästä poistettiin kustakin kuopasta ja korvattiin tuoreella seerumivapaalla kasvualustalla, joka ei sisältänyt trombiinia. Näyte käytetystä kasvualustasta kustakin kuopasta mää- 11 • · · " ritettiin kromogeenisellä määrityksellä. Tulokset osoitti- , 11 * Φ :.**i vat, että solut valmistivat noin 2,5 pg/ml trombiinia. Le- 25 vyjä inkuboitiin 3 päivän ajan, minkä jälkeen 90 % kasvu-j**[i alustasta korvattiin kuten edellä, ja näyte käytetystä kas- ·;· vualustasta määritettiin kuten edellä. Määrityksen tulokset ·1»· ;1{1; osoittivat, että solut tuottivat noin 2 pg/ml trombiinia.

♦

Levyjä inkuboitiin 4 päivän ajan ja kasvualusta vaihdettiin . .·. 30 ja määritettiin kuten kuvattiin edellä. Määrityksen tulok- • · · V.'. set osoittivat, että solut tuottivat noin 1 ug:n/ml trom- • · *** biinia.

»··«♦ • · ····· • · * *·1»» • · · · • · · • · 44 · - 117831

Esimerkki 4

Trombiiniprekursorien puhdistaminen ja aktiivisuus-määritykset A. Trombiinin puhdistaminen transfektoiduista isän-5 täsoluista

Trombiiniprekursorit puhdistettiin valituista transfektanteista, joita kasvatettiin valikoiden yhteenkas-vaviksi 150 mm:n kudosviljelymaljoissa. Sitten kun trans-fektantit olivat yhteenkasvaneita, käytetty kasvualusta 10 kustakin maljasta poistettiin, heitettiin pois ja korvattiin 25 ml:11a seerumivapaata kasvualustaa (taulukko 2). Kaksi tai kolme kertaa viikossa käytetty kasvualusta otettiin talteen ja varastoitiin -20 °C:seen, ja 25 ml tuoretta seerumivapaata kasvualustaa lisättiin kullekin levylle. Va-15 rastoitu kasvualusta kullekin transfektantille sulatettiin, yhdistettiin pooliksi ja suodatettiin 0,45 μπι:η suodattimen (Nalge, Rochester, NY) läpi. Suodatettuun kasvualustaan lisättiin natriumatsidia loppupitoisuuteen 0,2 % (v/v).

Suodatettu kasvualusta Thrl02-transfektanteista pa-20 nostettiin Affi-GelR Blue -kolonniin (BioRad, Richmond, CA). Trombiiniprekursorit eluoitiin kolonnista 1 M NaCl-liuoksella, 25 mM Tris, pH 7,4. A28o-piikki kerättiin tai- • · ♦ *· *i teen. Jos kerätyn piikin tilavuus on liian suuri, näyte • · *.**; voidaan konsentroida käyttäen Centricon-konsentroi jaa (Ami- ***** 25 con, Arlington Heights, IL) . Pooliksi yhdistetyt fraktiot Γ*]: laimettiin 1:2 25 mM Tris-puskuriin, pH 7,4.

«*· Puhdistettua Echis carinatus -myrkkyaktivaattoria m m · · saatiin Dr. Walt Kisieliltä (University of Mexico, Albu- * querque, nM). Lyhyesti, myrkkyaktivaattori puhdistettiin 30 raakamyrkystä perättäisellä geelisuodatuksella Sephadex ♦ · · ‘.V. G150 -, DEAE-Sephadex A25 -kolonneissa, jota seurasi tois- « · *1* tettu Mono Q -FPLC. SDS-polyakryyliamidigeelielektroforee- ***** ' sissa sekä merkaptoetanolin läsnä ollessa että puuttuessa *:·*: myrkkyaktivaattori kulki yhtenä nauhana, jonka näennäinen

35 Mr oli 80 000. Puhdistettu aktivaattori liuotettiin 0,5 M

• · • · ····.'.' *· · 117831 45

Tris-HCl:ään, pH 8,0, joka sisälsi pitoisuuden noin 0,2 M NaCl.

Pooliksi yhdistetyssä A28o-piikissä läsnä olevat trombiiniprekursorit aktivoitiin lisäämällä laimennos 5 1:1 000 - 1:2 000 (w/w) käärmemyrkkyaktivaattoria laskettu na arvioidusta proteiinipitoisuudesta. Seosta inkuboitiin 4 tunnin ajan 37 °C:ssa piikkiproteiinin täydellisen aktivaation mahdollistamiseksi. Inkuboinnin jälkeen materiaali panostettiin Benzamidine Sepharose 4B -kolonniin (Pharmacia 10 LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) . Kolonni pestiin liuoksella, jossa olivat pitoisuudet 1 M NaCl, 25 mM Tris, pH 7,4, ja eluoitiin liuoksella, jossa oli pitoisuus 15 mM bentsamidiini TBS:ssä. Fraktioita kerättiin ja eriä kustakin näytteestä laimennettiin 200 - 500-kertaisesti TBS:ään, 15 jossa oli 1 mg/ml BSA:ta. 20 - 50 μ1:η erä kustakin laimennetusta näytteestä määritettiin kromogeenisellä määrityksellä trombiiniaktiivisuutta sisältävien fraktioiden identifioimiseksi.

Ihmisen plasman protrombiinia (jota saatiin Dr. 20 Walt Kisieliltä, University of New Mexico; ihmisprotrombii-nia on saatavana Sigmalta, St. Louis, MO) käytettiin standardina kromogeenisessä määrityksessä. 20 yg ihmisen plas- • · · *. *! maprotombiinia laimettiin sarjassa TBS:ään, pH 7,4 (Sam- k · :.**i brook et ai., ibid.), jossa oli 1 mg/ml nautaseerumialbu- * 25 miinia, pitoisuuksiin 20 yg/ml, 10 yg/ml, 5 yg/ml, 2,5 yg/ :*·]: ml, 1,25 yg/ml, 0, 625 yg/ml, 0,312 yg/ml ja 0,156 yg/ml.

··· Kaksinkertaiset 10 yl:n standardit lisättiin 96-kuoppaisen »11« .*j*. mikrotiitterilevyn kuoppiin.

k 20 - 50 yl kutakin näytettä ja 10 yl kutakin stan-30 dardia lisättiin 96-kuoppaisen mikrotiitterilevyn kuoppiin.

• * ·

Kuhunkin näytteeseen ja standardiin lisättiin 40 yl kromo- • *** geenisen trombiinisubstraatin 1 mM liuosta (American Diag- nostica, New York, NY). Puskuria (TBS, 1 mg/ml BSA:ta) li- ·:**: sättiin kuhunkin näytteeseen ja standardiin lopulliseen >4*t· 35 määritystilavuuteen 100 yl. Levyjä inkuboitiin noin 5 mi- * · * · . . nuutin ajan huoneenlämpötilassa, jotta väri kehittyisi. Ab- » » *

M

• · 4 6 117831 sorbanssi 405 nm:ssä luettiin kullekin standardille ja näytteelle. Trombiiniaktiivisuuspiikkejä osoittavat fraktiot yhdistettiin pooliksi. Pooliksi yhdistetyistä fraktioista voidaan poistaa suolat panostamalla materiaali G-25-5 kolonniin (BioRad).

B. Kromogeeninen määritys

Kromogeeniset määritykset ' trombiiniaktiivisuus- tasojen määrittämiseksi suoritettiin lisäämällä 10 μΐ sopivasti laimennettua näytettä (TBS:ssä, pH 7,4, 1 mg/ml 10 BSA:ta) tai standardia (kuvattiin edellä) 96-kuoppaisen mikrotiitterilevyn kuoppiin. Kuhunkin näytteeseen lisättiin 80 μΐ käärmemyrkkyaktivaattorin TBSrään, pH 7,4, +1 mg/ml nautaseerumialbumiinia, pitoisuuteen 0,5 pg/ml laimennettua liuosta. Näytteitä inkuboitiin 37 °C:ssa 1 tunnin ajan. In-15 kuboinnin jälkeen lisättiin 50 μΐ kromogeenisen trombiini-substraatin 0,5 mM liuosta (American Diagnostica, New York, NY) ja levyjä inkuboitiin noin 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, jotta väri voisi kehittyä. Absorbanssi 405 nm:ssä luettiin kullekin standardille ja näytteelle. Näy-20 teabsorbanssiarvoista muodostettiin keskiarvo, jota verrattiin standardikuvaajaan läsnäolevan aktivoitavan trombiini-prekursorin määrän määrittämiseksi.

• · *. 1: Piikkinäytettä laimennettiin 8-kertaisesti vedellä • t ·,1·; ja Eh_ carinatus -aktivaattoria lisättiin w/w-suhteessa ak- ·1.2 3 4 5: 25 tivaattori: aktivoitava trombiiniprekursori 1:100 - 1:1 000.

·1·1: Sitten näytettä inkuboitiin 1-4 tunnin ajan 37 °C:ssa.

··· Erillä aktivoidusta näytteestä suoritettiin elektroforeesi- ···· ajo pelkistävissä ja ei-pelkistävissä akryyliamidigeeleissä * prekursorin muuttumisen trombiiniksi vahvistamiseksi.

30 Esimerkki 5 • · · 2

I t I

gla-alueettomien protrombiini-ilmentämisyksiköiden • 1 3 rakentaminen ja ilmentäminen hiivasoluissa 4 *ί2ί A. pZHl0:n rakentaminen 5

Rakennettiin DNA-rakenne, joka käsittää DNA-mole- 35 kyylin, joka koodittaa trombiiniprekursoria, joka käsittää • t , , kringle-2-, A-ketju- ja seriiniproteaasialueet ihmisen pro- • · · * ·♦ · 117831 47 tombiinista. Plasmidiprotrornbiinia, joka käsittää protrom-biinikoodaussekvenssin alakloonattuna Pstl-fragmenttiin plasmidissa pBR322, pilkottiin Narl:llä ja Bcll:llä 1,2 ke:n fragmentin eristämiseksi, joka koodittaa kringle-2-5 koodaussekvenssin, A-ketjukoodaussekvenssin ja 5'-koodaus-sekvenssin ihmisen protombiinin seriiniproteaasialueelta.

TPI1-promoottori, MFal-siqnaalisekvenssi ja TPI1-päättäjäsekvenssit saatiin pretrombiini-ilmentämisyksikös-tä, joka rakennettiin ensin valmistamalla synteettinen Hin-10 dlll-Sstl-adapteri, joka käsittää hiivakodonioptimoidun sekvenssin, joka koodittaa aminohapot Ser-Leu-Asp, jotka vastaavat aminohappoja 81 - 83 α-tekijä-prepro-sekvens-sissä, Lys-Arq-KEX2-piikkomi s kohdan ja aminopään aminohapposekvenssin pretrombiinista (aminohapot 308 - 345 sekvens-15 sistä tunnusnro 1). Oligonukleotidit ZC1562, ZC1563, ZC1564 ja ZC1565 (sekvenssit tunnusnrot 39, 40, 41 ja vastaavasti 42) käsiteltiin kinaasilla ja juotettiin edellä kuvatun Hindlll-Sstl-adapterin muodostamiseksi. Toinen oligonukle-otidiadapteri syntetisoitiin antamaan juotettuna käyttöön 20 BclI-Xbal-adapterin, joka käsittää hiivakodonioptimoidun sekvenssin, joka koodittaa pretrombiinin karboksyylipään aminohappoja (aminohapot 611 - 615 sekvenssistä tunnusnro *.**: 1), ja jota seuraa stop-kodoni. Synteettiset oligonukleoti- • · *,**: dit ZC1629 ja ZC1630 (sekvenssit tunnusnrot 43 ja vastaa- *:**: 25 vasti 44) käsiteltiin kinaasilla ja juotettiin Bcll-Xbal- :*·*: adapterin muodostamiseksi. Plasmidiprotrornbiinia pilkottiin ··· Sstlrllä ja Bcllrllä 787 emäsparin protrombiinifragmentin

• •M

.*;·. eristämiseksi. Hindlll-Sstl-adapteri, Sstl-BclI-protombii- nifragmentti ja BclI-Xbal-adapteri liitettiin Hindlll-30 Xbalrllä linearisoituun pUC19:ään neliteisessä ligatoinnis- » i » , sa. Saatu plasmidi, joka nimettiin pTHRlrksi, käsittää DNA- • · ***** segmentin, joka koodittaa aminopään aminohapposekvenssin, * *:**: MFal-signaalista, KEX2-piikkomiskohdan ja ihmisen pretrom- *:**: biinin.

* . 35 TPIl-promoottori- ja α-tekijäsignaalisekvenssi saa- . . tiin plasmidista pTGFaCB. Plasmidi pTGFaCB saatiin plasmi- • · · • ·· • · 4 8 117831 dista pB12, joka käsittää TPIl-promoottorin, MFal-signaalisekvenssin, PDGF-BB-sekvenssin, TPIl-päättäjän ja pIC19R-vektorisekvenssejä. pB12:n rakentaminen julkistetaan US-patenttijulkaisussa 4 766 073, joka sisällytetään tähänä 5 viitteeksi. MFal-signaalisekvenssi ja PDGF-BB-sekvenssi pBl2:sta alakloonattiin EcoRI-Xbal-fragmenttina M13:een. MFal-signaalisekvenssissä läsnä oleva Sstl-kohta vaihdettiin Hindlll-kohdaksi mutagenisoinnilla in vitro käyttäen menetelmää, jota kuvaavat Kunkel et ai, (US-patenttijul-10 kaisu 4 873 192, joka sisällytetään tähän viitteeksi), ja oligonukleotidia ZC1159 (sekvenssi tunnusnro 36). Identifioitiin klooni, jossa oli Hindlll-kohta Sstl-kohdan tilalla. MFal-signaalisekvenssin sisältävä fragmentti eristettiin EcoRI-Hindlll-fragmenttina. EcoRI-Hindlll-fragmentti, joka 15 sisälsi MFal-signaalisekvenssin, ja Hindlll-Xbal-frag- mentti, joka sisälsi syntetisoidun transformoivan kasvute-kijä-α- (TGFa-) koodaussekvenssin, ligatoitiin EcoRI-Xbal:llä linearisoituun pUC13:een. Saatua plasmidia, joka nimettiin afTGFa/pUC13:ksi, pilkottiin EcoRI:llä ja 20 Xbalillä MFal-TGFa-insertin eristämiseksi, joka kloonattiin pl70CB/pBR:ään. Plasmidin pl70CB/pBR rakentamista kuvaa Murray (avoinna oleva US-patenttihakemus julkaisusarjanro *· " 07/557 219, ja WO-julkaisu 92/01 716, jotka sisällytetään • · tähän viitteeksi), ja se sisältää TPI1-promoottorin, MFal- * '"*· 25 signaalisekvenssin, PDGF-BB-koodaussekvenssin, TPIl-päättä-

ί"’*ϊ jän ja pBR322-vektorisekvenssejä. Plasmidia pB170CB/pBR

··* pilkottiin EcoRI-Xbal: llä fragmentin eristämiseksi, joka * · · * sisältää TPI1-promoottorin, pBR322-vektorisekvenssin ja TPIl-päättäiän. EcoRI-XbaI-pB170CB/pBR-fragmentti ja EcoRI- , ,·. 30 Xbal-MFal-TGFa-fragmentti ligatoitiin. Saatu plasmidi, joka * * * nimettiin TGFaCB:ksi, käsittää TPIl-promoottorin, MFal-sig- • · “* naalisekvenssin, TGFa-koodaussekvenssin ja TPIl-päättäiän.

f"" Pretrombiini-ilmentämisvektorin rakentamiseksi *"*: plasmidia TGFaCB pilkottiin Hindlllrlla ja Xbal:llä frag- 35 mentin eristämiseksi, joka sisältää MFal-signaalin, TPI1- • · . . promoottorin, pBR322-vektorisekvenssejä ja TPIl-päättäjän.

• · · « · 117831 49

Plasmidia pTHRl pilkottiin HindIII:lla ja Xbal:llä MFal-pretrombiinikoodaussekvenssin eristämiseksi. Kyseiset kaksi fragmenttia ligatoitiin, ja saatu plasmidi nimettiin pTHR2:ksi.

5 Rakennettaessa hiivailmentämisyksikköä, joka kyke nee ohjaamaan gla-alueettoman protrombiinin eristystä, plasmidi pTHR2 toimi TPIl-promoot torin, MFotl-signaalisek-venssien ja TPIl-päättäjän lähteenä. Plasmidia pTHR2 pilkottiin HindIII:lla ja Bcll:llä 5,97 ke:n fragmentin eris-10 tämiseksi, joka käsittää TPI1-päättäjän, vektorisekvens- sejä, TPIl-promoottorin ja MFal-siqnaalisekvenssin. Adapteri MFal-prepro:n liittämiseksi toiseen kringle-alueeseen KEX2-piikkomis kohdan välityksellä muodostettiin suorittamalla kinaasikäsittely ja juottamalla oligonukleotidit 15 ZC5344 (sekvenssi tunnusnro 47) ja ZC5345 (sekvenssi tun- nusnro 48) . Adapteri käsittää tarttuvat Hindlll- ja Narl-päät, jotka sivuavat DNA-sekvenssiä, joka koodittaa KEX2-pilkkomiskohtaa, joka välittömästi edeltää aminohappoja se- 1 riini, aminohappoja 192 - 216 protrombiinista (sekvenssi 20 tunnusnro 2). Toinen adapteri, joka sisälsi 15 emäsparia pään protrombiinikoodausalueesta ja tarttuvat päät trom-biiniprekursorikoodaussekvenssin 3'-pään liittämiseksi • « \"*i TPIl-päättäjään, muodostettiin suorittamalla kinaasikäsit- • · !.**· tely ja juottamalla oligonukleotidit ZC1630 (sekvenssi *:*·: 25 tunnsunro 44) ja ZC1629 (sekvenssi tunnusnro 43). 5, 97 ke:n fragmentti pTHR2: sta, ZC5344/ZC5345-adapteri, 1,2 ke:n • · ·!· fragmentti protrombiinista ja ZC1630/ZC1629-adapteri liga- • · · · toitiin plasmidin pZH6 muodostamiseksi. Plasmidi pZH6 ka- * sittaä TPIl-promoottorin; MFal-siqnaalisekvenssin; kringle-30 2-alueen, A-ketjun ja seriiniproteaasialueen ihmisen prot- • S * t“ rombiinista; ja TPIl-päättäjän.

• · **;·' Plasmidi pDPOT saatiin plasmidista pCPOT korvaamal- *:**: la 750 ep:n SphI-BamHI-fragmentti pCPOT:stä, joka sisältää ·;·*: 2 mikronin ja pBR322-sekvenssejä, 186 ep:n Sphl-BamHI- * . 35 fragmentilla, joka on peräisin pBR322-tetrasykliiniresis- *·* · . . tenssigeenistä. (Plasmidi pCPOT on talletettu talletuslai- • · « • «· • a ' 117831 50 tokseen ATCC E_;_ coli -kanta-HBIOl-transformanttina ja sen hakunumero on 39685. Se käsittää kokonaan 2 mikronin plas-midi-DNA:n, leu-2-d-qeenin, pBR322-sekvenssejä ja Schizo-saccharomyces pomben POTl-qeenin.) 5 Plasmidi pRPOT saatiin plasmidista pDPOT korvaamal la ShpI-BamHI-fragmentti polyliittäjällä. Plasmidia pDPOT pilkottiin Sphl:llä ja BamHI:llä 10,8 ke:n fragmentin eristämiseksi. Oligonukleotidit 2C1551 ja ZC1552 (sekvenssit tunnusnrot 37 ja 38) suunniteltiin muodostamaan adapterin 10 tarttuvaa BamHI-päätä ja tarttuvaa SphI-päätä sivuavien

Smal-, SstI- ja Xhol-restriktiokohtien kanssa. Oligonukleotidit ZC1551 ja ZC1552 (sekvenssit tunnusnrot 37 ja 38) käsiteltiin kinaasilla ja juotettiin BamHI-SphI-adapterin muodostamiseksi. 10,8 ke:n pDPOT-fragmentista tehtiin ympy-15 rän muotoinen ligatoimalla ZC1551/ZC1152-adapteriin. Saatu plasmidi nimettiin pRPOT:ksi.

Plasmidissa pZH6 läsnä oleva ilmentämisyksikkö ala- kloonattiin pRPOT:hen ensin pilkkomalla pZH6 BglII:lla ja

HindIII:lla 1,2 ke:n fragmentin eristämiseksi, joka käsit- 20 tää TPIl-promoottorin ja MFal-prepron: n. Plasmidia pZH6 h;· pilkottiin myös HindIII:lla ja Sphl:llä 2,2 ke:n fragmentin eristämiseksi, joka käsittää trombiiniprekursorikoodausse- *. *ί kvenssin ja TPIl-päättäjän. Kyseiset kaksi fragmenttia li- • · ·.*«: gatoitiin BamHI-SphI-linearisoituun pRPOT :hen. Saatu plas- *ϊ**ϊ 25 midi nimettiin pZH10:ksi.

:***; B. pZH8:n rakentaminen • · ♦·· Valmistettiin DNA-rakenne, joka käsittää DNA-mole- • · · · kyylin, joka koodittaa trombiiniprekursoria, joka käsittää kringle-1-, kringle-2-, A-ketju- ja seriiniproteaasialueen # 30 ihmisen protrombiinista. Plasmidiprotrombiini pilkottiin • · ·

XhoI:llä ja Bcll:llä 1,6 ke:n fragmentin eristämiseksi, jo- • · *"** ka käsittää DNA-segmentin, joka koodittaa kringle-1- ja *:**: kringle-2-koodaussekvenssejä, A-ket jukoodaussekvenssiä ja *:··· 5'-koodaussekvenssiä seriiniproteaasialueelta. Plasmidi 35 pZH6 pilkottiin HindIII:lla ja Bcll:llä 5,99 ke:n fragmen- • · , , tin eristämiseksi, joka käsittää MFal-signaalisekvenssin, • * * • «« • · 117831 51 TPIl-promoottorin, vektorisekvenssejä, TPIl-päättäjän ja päässä sijaitsevat 15 emäsparia protrombiinikoodaussekvens-sistä. Adapteri MFotl-prepron:n liittämiseksi kringle-1: een muodostettiin suorittamalla kinaasikäsittely ja juottamalla 5 oligonukleotidit ZC5339 (sekvenssi tunnusnro 45) ja ZC5340 (sekvenssi tunnusnro 46). Adapteri käsittää tarttuvan 5'-Hindlll-paän, joka tuhoaa Hindlll-kohdan, DNA-segmentin, joka koodittaa KEX2-pilkkomiskohtaa, joka edeltää välittömästi aminohappoja seriini, aminohappoja 68-89 protrom-10 biinista (sekvenssi tunnusnro 2), ja tarttuvan 3'-XhoI-pään. 1,56 kein XhoI-BclI-fragmentti plasmidiprotrombiinis-ta, 5,99 kein BclI-Hindlll-fragmentti pZH6ista ja Hindlll-Xhol-adapteri ligatoitiin, jolloin rakennettiin plasmidi pZH5.

15 Plasmidissa pZH5 läsnä oleva ilmentämisyksikkö ala- kloonattiin pRPOTihen ensin pilkkomalla pZH5 Bglllilla ja Xholillä 1,31 kein fragmentin eristämiseksi, joka käsittää TPIl-promoottorin ja MFotl-prepron. Plasmidia pZH5 pilkottiin myös Xholillä ja Sphlillä 2,45 kein fragmentin eristä-20 miseksi, joka käsittää trombiiniprekursorikoodaussekvenssin ja TPI1-päättäjän. Kyseiset kaksi fragmenttia ligatoitiin · BamHI-Sphl:llä linearisoituun pRPOTihen. Saatu plasmidi ni- I mettiin pZH8iksi. . ' • * · * * C. pZHlOin ja pZH8in ilmentäminen hiivasoluissa • * * * · 25 Plasmidit pZHIO, joka käsittää DNA-segmentin, joka • · : .* koodittaa toista kringle-aluetta, A-ketju- ja seriiniprote- * aasialueita trombiinista, ja pZH8, joka käsittää DNA-seg- • · · V : mentin, joka koodittaa kringle-alueita 1 ja 2, A-ketju- ja seriiniproteaasialuetta trombiinista, transformoitiin Sac- • :*; 30 charomyces verevisiae -kantoihin ZM114 (MATa leu2-3, 112 * * * ade2-101 ura3-52 A-pep41 :TPIlprom-CAT qa!2 suc2-A-9 Δ- * . tpil::URA3 vpt3) ja ZM118 (ΜΑΤα/ΜΑΤα ura3/ura3 Δ- tpil: :URA3M-tpil: :URA3 barl/barl pep4 : iURA3/pep4 : ;URA3 * * [cir"]) käyttäen menetelmää, jota oleellisesti kuvaavat ....j 35 Hinnen et ai. (ibid.) . Transformantit valittiin niiden ky- * · • · ·

I M

117831 52 vyn perusteella kasvaa glukoosin ainoana hiililähteenä läsnä ollessa.

Valittujen ZM114- ja ZM118-transformanttien kyky tuottaa aktivoitavaa trombiinia määritettiin siirrostamalla 5 5 ml kunkin transformantin yön yli kasvanutta YEPD-vil- jelmää 1,2 litraan YEPD:tä, jossa oli 6 % glukoosia 2,5 litran kolvissa, ja inkuboimalla viljelmiä 60 tunnin ajan 30 °C:ssa ravistelijassa. Kulloinkin 100 ml:n näytteitä otettiin ajankohtina 24, 36, 48 ja 60 tuntia siirrostukses-10 ta. Näytteet sentrifugoitiin ja käytetystä kasvualustasta määritettiin aktivoidun trombiinin läsnäolo kromogeenisellä määrityksellä.

Ihmisen plasmaprotrombiinistandardit valmistettiin käyttäen ihmisen plasmaprotrombiinia, joka saatiin Dr. Walt 15 Kisieliltä (University of New mexico). Ihmisprotrombiini laimennettiin aktivaatiopuskuriin (kuvattiin edellä) pitoisuuksiksi 5,0, 2,5, 2,0, 1,5, 1,0, 0,5, 0,4 ja 0,3 pg/ml.

Kaksinkertaiset näytteet standardista lisättiin 96-kuop-paisen mikrotiitterilevyn kuoppiin.

20 Kuhunkin 20 il:n näytteseen supernatanttia lisät tiin 80 μΐ käärmemyrkkyaktivaattorin 1 pg/ml liuosta lai-

4 . mennettuna aktivaatiopuskuriin (20 nM Tris, pH 7,4, 150 mM

• · 1 ** 1| NaCl, 0,2 % Na-atsidia) . Näytteitä inkuboitiin 37 °C:ssa 1 • · 1 *· 1♦ ; tunnin ajan. Inkuboinnin jälkeen lisättiin 100 μΐ kromo- M··· * 1 25 geenisen trombiinisubstraatin 0,25 mM liuosta (American ·· 1 •'.· Diagnostica) ja levyjä inkuboitiin 1-3 tunnin ajan, jotta #<1·1 väri kehittyisi. Absorbanssi 405 nmrssä luettiin kullekin standardille ja näytteelle. Näyteabsorbanssiarvoista muodostettiin keskiarvo, jota verrattiin standardikuvaajaan . 30 läsnä olevan aktivoitavan trombiiniprekursorin määrän mää- • · · .···. rittämiseksi. Taulukossa 3 esitetään määrityksen tulokset.

• 1 • · » * · 1 · • · ...

··»1· • · • · · · · • ♦ • · · • ·· * · 117831 53

Taulukko 3

Aktio!tavan trombiinin tasot (pg/ml)

Kanta (plasmidi) 24 tuntia 36 tuntia 48 tuntia 60 tuntia ZM118 (DPOT) 0 0 0 0 5 ZM118 (pZH8) 0,11 0,08 0,5 0,5 ZM118 (pZHIO) 0,08 0,05 0,2 - ZM114 (pZH8) - - 0,84 0,88 ZM114 (pZHIO) 0,10 - 0,18 0,3 10 Vaikka edeltävää keksintöä on kuvattu jossain mää rin yksityiskohtaisesti havainnollistamistarkoituksessa ja esimerkinomaisesti ymmärrettävyyden selkeyttämiseksi, on ilmeistä, että tiettyjä muutoksia ja modifikaatioita voidaan tehdä oheisten patenttivaatimusten puitteissa.

• · * ♦ ♦ • ·· ♦ · i • · • · · • «· • ♦ ·····-* · • · · • ♦ · • · • ♦ • » » • · · • · · • ♦ · • · · « « · ·#♦ • · • ♦ • · · »«·»» ·1··· ·· 1» · • 1 · • ♦ · • ·· • · 54 _ 117831

SEQUENCE LISTING

(1) GENERAL INFORMATION : (i) APPLICANT: Holly, Richard D.

Foster, Donald C.

(ii) TITLE OF INVENTION: METHODS FOR PRODUCING THROMBIN

(Ui) NUMBER OF SEQUENCES: 48 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: Townsend and Townsend (B) STREET: One Market Plaza, Stewart Street Tower,

Twentieth Floor (C) CITY: San Francisco

(D) STATE: CA

(E) COUNTRY: USA 1 (F) ZIP: 94105 (v) COMPUTER READABLE FORM: ! (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: * (B) FILING DATE: i (C) CLASSIFICATION: ; l (vii) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US 07/860,701 (B) FILING DATE: 31-MAR-1992 (vii) PRIOR APPLICATION DATA: f (A) APPLICATION NUMBER: US 07/816,281 (B) FILING DATE: 31-DEC-1991 (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION:

• * (A) NAME: Parmelee, Steven W

;*·.· (B) REGISTRATION NUMBER: 31,990 I

* · (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: 13952-12-2 ; ««·· (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: j (A) TELEPHONE: 206-467-9600 * *. (B) TELEFAX: 415-543-5043 1

·*· I

• I] • e · · ij i) · (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:l: j (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ^ ‘ ! . (A) LENGTH: 14 base pairs i i.j ϊ (B) TYPE: nucleic acid ... (C) STRANDEDNESS: single i (D) TOPOLOGY: linear . ! • ····♦ • ♦ (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ IDNO;l: CCNGCRCARA ACAT 14 • * • · · . > ♦ ·· 55 117831 (2) INFORMATION FOR SE0 ID NO:2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1947 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear <vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens (F) TISSUE TYPE: Hepatic (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: CDS

(B) LOCATION: 3..1847 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2: TG CAG CTG CCT GGC TGC CTG GCC CTG GCT GCC CTG TGT AGC CTT GTG 47

Gin Leu Pro Gly Cys Leu Ala Leu Ala Ala Leu Cys Ser Leu Val 15 10 15 CAC AGC CAG CAT GTG TTC CTG GCT CCT CAG CAA GCA CGG TCG CTG CTC 95

His Ser Gin His Val Phe Leu Ala Pro Gin Gin Ala Arg Ser Leu Leu 20 25 30 CAG CGG GTC CGG CGA GCC AAC ACC TTC TTG GAG GAG GTG CGC AAG GGC 143

Gin Arg Val Arg Arg Ala Asn Thr Phe Leu Glu Glu Val Arg Lys Gly 35 40 45 AAC CTA GAG CGA GAG TGC GTG GAG GAG ACG TGC AGC TAC GAG GAG GCC 191

Asn Leu Glu Arg Glu Cys Val Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala 50 55 60 TTC GAG GCT CTG GAG TCC TCC ACG GCT ACG GAT GTG TTC TGG GCC AAG 239

Phe Glu Ala Leu Glu Ser Ser Thr Ala Thr Asp Val Phe Trp Ala Lys 65 70 75 TAC ACA GCT TGT GAG ACA GCG AGG ACG CCT CGA GAT AAG CTT GCT GCA 287

Tyr Thr Ala Cys Glu Thr Ala Arg Thr Pro Arg Asp Lys Leu Ala Ala ; \ 80 85 90 . 95 • » · *. *: TGT CTG GAA GGT AAC TGT GCT GAG GGT CTG GGT ACG AAC TAC CGA GGG 335 *:**: Cys Leu Glu Gly Asn Cys Ala Glu Gly Leu Gly Thr Asn Tyr Arg Gly .. . 100 105 110 • · · * ; CAT GTG AAC ATC ACC CGG TCA GGC ATT GAG TGC CAG CTA TGG AGG ACT 383 ·:* His Vai Asn Ile Thr Arg Ser Gly He Glu Cys Gin Leu Trp Arg Ser **.*.*. 115 120 125 • · * • · * 1 CGC TAC CCA CAT AAG CCT GAA ATC AAC TCC ACT ACC CAT CCT GGG GCC 431

Arg Tyr Pro His Lys Pro Glu He Asn Ser Thr Thr His Pro Gly Ala . 130 135 140 • · · • ♦ * .···. GAC CTA CAG GAG AAT TTC TGC CGC AAC CCC GAC AGC AGC AAC ACG GGA 479

Asp Leu Gin Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro Asp Ser Ser Asn Thr Gly * . 145 150 155 ·····' * CCC TGG TGC TAC ACT ACA GAC CCC ACC GTG AGG AGG CAG GAA TGC AGC 527 ·:**: Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Thr val Arg Arg Gin Glu Cys Ser 160 165 170 175 .'**** ATC CCT GTC TGT GGC CAG GAT CAA GTC ACT GTA GCG ATG ACT CCA CGC 575 .·, : He Pro Val Cys Gly Gin Asp Gin val Thr Val Ala Met Thr Pro Arg *. *ϊ 180 185 190 1 1 7831 56 TCC GAA GGC TCC AGT GTG AAT CTO TCA CCT CCA TTG GAG CAG TGT GTC 623

Ser Glu Gly Ser Ser Val Asn Leu Ser Pro Pro Leu Glu Gin Cys Val 195 200 205 CCT GAT CGG GGG CAG CAG TAC CAG GGG CGC CTG GCG GTG ACC ACA CAT 671 t

Pro Asp Arg Gly Gin Gin Tyr Gin Gly Arg Leu Ala Val Thr Thr His 210 215 220 GGG CTC CCC TGC CTG GCC TGG GCC AGC GCA CAG GCC AAG GCC CTG AGC 719

Gly Leu Pro Cys Leu Ala Trp Ala Ser Ala Gin Ala Lys Ala Leu Ser 225 230 235 AAG CAC CAG GAC TTC AAC TCA GCT GTG CAG CTG GTG GAG AAC TTC TGC 767

Lys His Gin Asp Phe Asn Ser Ala Val Gin Leu Val Glu Asn Phe Cys 240 245 250 255 CGC AAC CCA GAC GGG GAT GAG GAG GGC GTG TGG TGC TAT GTG GCC GGG 815

Arg Asn Pro Asp Gly Asp Glu Glu Gly Val Trp Cys Tyr Val Ala Gly 260 265 270 AAG CCT GGC GAC TTT GGG TAC TGC GAC CTC AAC TAT TGT GAG GAG GCC 863

Lys Pro Gly Asp Phe Gly Tyr Cys Asp Leu Asn Tyr Cys Glu Glu Ala 275 280 285 GTG GAG GAG GAG ACA GGA GAT GGG CTG GAT GAG GAC TCA GAC AGG GCC 911

Val Glu Glu Glu Thr Gly Asp Gly Leu Asp Glu Asp Ser Asp Arg Ala 290 295 300 ATC GAA GGG CGT ACC GCC ACA AGT GAG TAC CAG ACT TTC TTC AAT CCG 959 lie Glu Gly Arg Thr Ala Thr Ser Glu Tyr Gin Thr Phe Phe Asn Pro 305 310 315 AGG ACC TTT GGC TCG GGA GAG GCA GAC TGT GGG CTG CGA CCT CTG TTC 1007

Arg Thr Phe Gly Ser Gly Glu Ala Asp Cys Gly Leu Arg Pro Leu Phe 320 325 330 335 GAG AAG AAG TCG CTG GAG GAC AAA ACC GAA AGA GAG CTC CTG GAA TCC 1055

Glu Lys Lys Ser Leu Glu Asp Lys Thr Glu Arg Glu Leu Leu Glu Ser 340 345 350 • · " TAC ATC GAC GGG CGC ATT GTG GAG GGC TCG GAT GCA GAG ATC GGC ATG 1103 ί Tyr Ile Asp Gly Arg Ile Vai Glu Gly Ser Asp Ala Glu He Gly Met *· " 355 360 365 TCA CCT TGG CAG GTG ATG CTT TTC CGG AAG AGT CCC CAG GAG CTG CTG 1151 ·***: Ser Pro Trp Gin Val Met Leu Phe Arg Lys Ser Pro Gin Glu Leu Leu * · 370 375 380 *·· ...: TGT GGG GCC AGC CTC ATC AGT GAC CGC TGG GTC CTC ACC GCC GCC CAC 1199 ! :***: Cys Gly Ala Ser Leu He Ser Asp Arg Trp Val Leu Thr Ala Ala His * 385 390 395 * . TGC CTC CTG TAC CCG CCC TGG GAC AAG AAC TTC ACC GAG AAT GAC CTT 1247 ::: Cys Leu Leu Tyr Pro Pro Trp Asp Lys Asn Phe Thr Glu Asn Asp Leu 400 405 410 415 • · • ♦ T CTG GTG CGC ATT GGC AAG CAC TCC CGC ACC AGG TAC GAG CGA AAC ATT 1295 ....: Leu Val Arg He Gly Lys His Ser Arg Thr Arg Tyr Glu Arg Asn He * * 420 425 430 ’ ‘ GAA AAG ATA TCC ATG TTG GAA AAG ATC TAC ATC CAC CCC AGG TAC AAC ' 1343 . ί . Glu Lys He Ser Met Leu Glu Lys He Tyr He His Pro Arg Tyr Asn ****“· 435 ’ 440 445 • · TGG CGG GAG AAC CTG GAC CGG GAC ATT GCC CTG ATG AAG CTG AAG AAG 1391

Trp Arg Glu Asn Leu Asp Arg Asp He Ala Leu Met Lys Leu Lys Lys 450 455 460 117831 57 CCT GTT GCC TTC AGT GAC TAC ATT CAC CCT GTG TGT CTG CCC GAC AGG 1439

Pro val Ala Phe Ser Asp Tyr lie His Pro Val Cys Leu Pro Asp Arg 465 470 475 GAG ACG GCA GCC AGC TTG CTC CAG GCT GGA TAC AAG GGG CGG GTG ACA 1487

Glu Thr Ala Ala Ser Leu Leu Gin Ala Gly Tyr Lys Gly Arg Val Thr 480 485 490 495 GGC TGG GGC AAC CTG AAG GAG ACG TGG ACA GCC AAC GTT GGT AAG GGG 1535

Gly Trp Gly Asn Leu Lys Glu Thr Trp Thr Ala Asn Val Gly Lys Gly 500 505 510 CAG CCC AGT GTC CTG CAG GTG GTG AAC CTG CCC ATT GTG GAG CGG CCG 1583

Gin Pro Ser Val Leu Gin Val Val Asn Leu Pro He Val Glu Arg Pro 515 520 525 GTC TGC AAG GAC TCC ACC CGG ATC CGC ATC ACT GAC AAC ATG TTC TGT 1631

Vai Cys Lys Asp Ser Thr Arg He Arg He Thr Asp Asn Met Phe Cys 530 535 540 GCT GGT TAC AAG CCT GAT GAA GGG AAA CGA GGG GAT GCC TGT GAA GGT 1679

Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly 545 550 555 ^ GAC AGT GGG GGA CCC TTT GTC ATG AAG AGC CCC TTT AAC AAC CGC TGG 1727

Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val Met Lys Ser Pro Phe Asn Asn Arg Trp 560 565 570 575 TAT CAA ATG GGC ATC GTC TCA TGG GGT GAA GGC TGT GAC CGG GAT GGG 1775

Tyr Gin Met Gly He Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Asp Arg Asp Gly 580 585 590 AAA TAT GGC TTC TAC ACA CAT GTG TTC CGC CTG AAG AAG TGG ATA CAG 1823

Lys Tyr Gly Phe Tyr Thr His Val Phe Arg Leu Lys Lys Trp He Gin 595 600 605 AAG GTC ATT GAT CAG TTT GGA GAG TAGGGGGCCA CTCATATTCT GGGCTCCTGG 1877 Lys Val He Asp Gin Phe Gly Glu 610 615 AACCAATCCC GTGAAAGAAT TATTTTTGTG TTTCTAAAAC TATGGTTCCC AATAAAAGTG 1937 « ♦ ACTCTCAGCG 1947 * · «···· .* (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:3: • · * * I (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 615 amino acids "I! (B) TYPE: amino acid V · (D) topology: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:3: • · · *...* Gin Leu Pro Gly Cys Leu Ala Leu Ala Ala Leu Cys Ser Leu Val His * . 1 5 10 15 ····· ♦ · , Ser Gin His Val Phe Leu Ala Pro Gin Gin Ala Arg Ser Leu Leu Gin ·:··: 20 25 30 ....: Arg Val Arg Arg Ala Asn Thr Phe Leu Glu Glu Val Arg Lys Gly Asn • * * 35 40 45 • · *· Leu Glu Arg Glu Cys Val Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Phe 50 55 60 117831 58

Glu Ala Leu Glu Ser Ser Thr Ala Thr Asp Val Phe Trp Ala Lys Tyr 65 70 75 80

Thr Ala Cys Glu Thr Ala Arg Thr Pro Arg Asp Lys Leu Ala Ala Cys 85 90 95 Ί

Leu Glu Gly Asn Cys Ala Glu Gly Leu Gly Thr Asn Tyr Arg Gly His 100 105 110

Vai Asn Ile Thr Arg Ser Gly He Glu Cys Gin Leu Trp Arg Ser Arg 115 120 125

Tyr Pro His Lys Pro Glu He Asn Ser Thr Thr His Pro Gly Ala Asp 130 135 140

Leu Gin Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro Asp Ser Ser Asn Thr Gly Pro 145 150 155 160

Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Thr Vai Arg Arg Gin Glu Cys Ser He 165 170 175

I

Pro Val Cys Gly Gin Asp Gin Val Thr Val Ala Met Thr Pro Arg Ser 180 185 190

Glu Gly Ser Ser Val Asn Leu Ser Pro Pro Leu Glu Gin Cys Val Pro 195 ' 200 205

Asp Arg Gly Gin Gin Tyr Gin Gly Arg Leu Ala Val Thr Thr His Gly 210 215 220

Leu Pro Cys Leu Ala Trp Ala Ser Ala Gin Ala Lys Ala Leu Ser Lys 225 230 235 240

His Gin Asp Phe Asn Ser Ala Val Gin Leu Val Glu Asn Phe Cys Arg 245 250 255

Asn Pro Asp Gly Asp Glu Glu Gly Val Trp Cys Tyr Val Ala Gly Lys 260 265 270 .*. : Pro Gly Asp Phe Gly Tyr Cys Asp Leu Asn Tyr Cys Glu Glu Ala Val *· " 275 280 285 • · a · · *· *· Glu Glu Glu Thr Gly Asp Gly Leu Asp Glu Asp Ser Asp Arg Ala He ....: 290 295 300 ·.*; Glu Gly Arg Thr Ala Thr Ser Glu Tyr Gin Thr Phe Phe Asn Pro Arg * * 305 310 315 320 .:. . . , j .... Thr phe Gly ger Gly Glu Ala Agp Gly Leu Arg pro Leu phe Glu ::: 325 330 335

Lys Lys Ser Leu Glu Asp Lys Thr Glu Arg Glu Leu Leu Glu Ser Tyr . 340 345 350 • · · • · · V.', He Asp Gly Arg He Val Glu Gly Ser Asp Ala Glu He Gly Met Ser :...: 355 360 365 • ....: Pro Trp Gin Val Met Leu Phe Arg Lys Ser Pro Gin Glu Leu Leu Cys * * 370 375 380 ···· 41 * * Gly Ala Ser Leu He Ser Asp Arg Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys ii 385 390 395 400 ... · Leu Leu Tyr Pro Pro Trp Asp Lys Asn Phe Thr Glu Asn Asp Leu Leu \ »: 405 410 415 . f

Val Arg He Gly Lys His Ser Arg Thr Arg Tyr Glu Arg Asn He Glu 117831 59 420 425 430

Lys Ile Ser Met Leu Glu Lys lie Tyr lie His Pro Arg Tyr Asn Trp t 435 440 445 '·

Arg Glu Asn Leu Asp Arg Asp lie Ala Leu Met Lys Leu Lys Lys Pro 450 455 460

Val Ala Phe Ser Asp Tyr lie His Pro Val Cys Leu Pro Asp Arg Glu 465 470 475 480

Thr Ala Ala Ser Leu Leu Gin Ala Gly Tyr Lys Gly Arg Val Thr Gly Ϊ 485 490 495

Trp Gly Asn Leu Lys Glu Thr Trp Thr Ala Asn Val Gly Lys Gly Gin 500 505 510

Pro Ser Val Leu Gin Val Val Asn Leu Pro lie Val Glu Arg Pro Val 515 520 525

Cys Lys Asp Ser Thr Arg lie Arg lie Thr Asp Asn Met Phe Cys Ala 530 535 540 i

Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly Asp 545 550 555 560

Ser Gly Gly Pro Phe Val Met Lys Ser Pro Phe Asn Asn Arg Trp Tyr 565 570 575

Gin Met Gly lie Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Asp Arg Asp Gly Lys 580 585 590

Tyr Gly Phe Tyr Thr His Val Phe Arg Leu Lys Lys Trp lie Gin Lys 595 600 605

Val He Asp Gin Phe Gly Glu 610 615 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4: • · *7 *· “ (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS : .*·,· (A) LENGTH: 28 base pairs *· ” (B) TYPE: nucleic acid ·:··: (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear ·· · • ® * • · ♦ · •J‘ (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC1237 * · · • · · (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4: : gatctgccaa ctccttcctg gaggagct 28 • · · */]*: (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5: • ....: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 base pairs ♦··«: (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear • a · # · • · • · V·: (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC1238 _60 117831 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5: CCTCCAGGAA GGAGTTGGCA 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 27 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC1323 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6: CCTCCAGGAA GGAGTTGGCT CGCCGGA 27 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 35 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC1324 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:7: CGCGTCCGGC GAGCCAACTC CTTCCTGGAG GAGCT 35 : (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8: • ft ft • ♦ (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: *· “ (A) LENGTH: 126 base pairs ·;··· (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single ·'·*! (D) TOPOLOGY: linear * ft • .1 • ft· ·; ··.··. (vii) IMMEDIATE SOURCE: j ::: (B) CLONE: ZC1378 . (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8: » · · ft ft · AATTCCACCA TGGCTCATGT GAGAGGACTG CAACTGCCTG GCTGCCTGGC TCTGGCTGCT 60 ft · * · • CTGTGCAGCC TGGTGCACAG CCAGCATGTG TTCCTGGCTC CTCAGCAGGC CAGGAGCCTG 120 ft ft*··· CTGCAA 126 ft • · ft ft ft • · e ft ft ft · · ft ft ft ft ft ft * ft • •ft • ft (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9: ei 1 1 7831 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 126 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC1379 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9: CGCGTTGCAG CAGGCTCCTG GCCTGCTGAG GAGCCAGGAA CACATGCTGG CTGTGCACCA 60 GGCTGCACAG AGCAGCCAGA GCCAGGCAGC CAGGCAGTTG CAGTCCTCTC ACATGAGCCA 120 TGGTGG 126 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:10: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 19 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC2490 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10: AATTCTACAC AATGCTGCA 19 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:11: ϊ,*·· (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ... · (A) LENGTH: 11 base pairs ·.**; (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single • * (D) TOPOLOGY: linear t · · • · « • · • · (vii) IMMEDIATE SOURCE: ...: (B) CLONE: ZC2492 • · · 1 ‘j • · · • * * (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:11: . GCATTGTGTA G 11 • · · • * · .***. (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:12: • · · * . (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 56 base pairs • (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single - * , (D) TOPOLOGY: linear i :*·.· (vii) IMMEDIATE SOURCE: * * (B) CLONE: ZC3830 : e;: ' 1 1 7831 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:12: GCGCGCTCCT CTTCTGAATC GGGCATGGAT TTCCTGGCTG GGCGAAACGA AGACGG 56 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 54 base pairs (B) TYPE: nucleic acid · (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC3831 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:13: GCGCGCACCG CCACAAGTGA GTACCAGACT TTCTTCAATC CGAGGACCTT TGGC 54 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:14: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 52 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: linear (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC3832 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:14: CCGAGCCAAA GGTCCTAGGA TTGAAGAAAG TCTGGTACTC ACTTGTGGCG GT 52 ' (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:15: ···' *1 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 52 base pairs * 1 (B) TYPE: nucleic acid •S1·: (C) STRANDEDNESS: single ... (D) TOPOLOGY: linear < • · « · *i1 (vii) IMMEDIATE SOURCE: ΊΓ. (B) CLONE: ZC3833 • · · .

(Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:15: ♦ CGCCGTCTTC GTTTCGCCCA GCCAGGAAAT CCATGCCCGA TTCAGAAGAG GA 52 • · · (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:16: * ·:1·: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: . (A) LENGTH: 80 base pairs ·:1·; (B) TYPE: nucleic acid . (C) STRANDEDNESS: single · ...,: (D) TOPOLOGY: linear * · · 1 " (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC3858 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:16: 63 ’:. : 117831 GATCTGAAGG CTCCAGTGTG AATCTGTCAC CTCCACTCGA GCAGTGTGTC CCTGATCGGG 60 GGCAGCAGTA CCAGGGGCGC 80 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:17: <i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 72 base pairs (B) TYPE: nucleic acid <C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear · (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC3859 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:17: CCCTGGTACT GCTGCCCCCG ATCAGGGACA CACTGCTCGA GTGGAGGTGA CAGATTCACA 60

If CTGGAGCCTT CA 72 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:IS: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 64 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC3860 (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:18: t’’.j GATCTTCCAC GGCTACGGAT GTGTTCTGGG CCAAGTACAC AGCTTGTGAG ACAGCGCGCA 60 ϊ/Ί CGCC 64 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:19: • a 1 : (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ,·. (A) LENGTH: 64 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid I

(C) STRANDEDNESS: single *.· 1 (D) TOPOLOGY: linear , (vii) IMMEDIATE SOURCE: *·ί·1 (B) CLONE: ZC3861 • · a a · • · aaa (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:19: a · TCGAGGCGTG CGCGCTGTCT CACAAGCTGT GTACTTGGCC CAGAACACAT CCGTAGCCGT 60 • · • GGAA 64 • • a «aa • a a a a a a ai a a j54 1 1 7 8 31 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:20: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS : (A) LENGTH: 27 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC4393 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:20: CTCTCCCGAG CCAAAGGTCT GCGGATT 27 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:21: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 30 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC4443 | (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:21: GTCACCGGGA ATTCATCGAT ATCTAGATCC 30 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:22: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 56 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single .·. : (D) TOPOLOGY: linear • * · • · e·'··.

* · * *· “ (vii) IMMEDIATE SOURCE: ; ·:··· (B) CLONE: ZC3932 • · a • · · : ·.’ (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:22: • * * * *t" ATCCGAGCCC TCCACAATGC GCTTTCGGCG CCCGTCGATG TAGGATTCCA GGAGCT 56 • · · • * · * (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:23: . (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 4 6 base pairs I" (B) TYPE: nucleic acid :...: (C) STRANDEDNESS: single • (D) TOPOLOGY: linear *·**·': • · ....: (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC3933 *··«· * · ; (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:23: * ** CCTGGAATCC TACATCGACG GGCGCCGAAA GCGCATTGTG GAGGGC 46 65 1 1 7831 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :24: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 44 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC3934 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:24: TCGGATGCAG AGATCGGCAT GTCACCTTGG CAGGTGATGC TTTT 44 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:25: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 42 base pairs (B) TYPE: nucleic acid <C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC3936 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:25: CCGGAAAAGC ATCACCTGCC AAGGTGACAT GCCGATCTCT GC 42 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2S: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: -f" (A) LENGTH: 37 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single > (D) TOPOLOGY: linear • · • * · • · · « · (vii) IMMEDIATE SOURCE: * * (B) CLONE: ZC4713 * · ·*·*: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :26: • « •I* CCTGGAATCC TACCGACGAA AGCGCATTGT GGAGGGA 37 **· (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:27: * (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 47 base pairs ·.·.· (B) TYPE: nucleic acid .··. (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear * »····.

[ (vii) IMMEDIATE SOURCE: ; ·:**: (B) CLONE: ZC4720 ' · (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:27: • * :.**i ATCGGATCCC TCCACAATTC GCTTTCGTCG GTAGGATTCC AGGAGCT 47 V 117831 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:28: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 44 base pairs {B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: 2C4721 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:28: TCCGATGCAG AGATCGGCAT GTCACCTTGG CAGGTGATGC TTTT 44 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:29: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 42 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: linear (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC4722 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:29: CCGGAAAAGC ATCACCTGCC AAGGTGACAT GCCGATCTCT GA 42 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:30: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ! (A) LENGTH: 37 base pairs i (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single , (D) TOPOLOGY: linear 7 * · • · · « · · • · : (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC4738 * »·*·» • · :***: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:30: ’ • · •j* CCTGGAATCC TACATCGACC CGCGCATTGT GGAGGGA 37 • · · · (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:31: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: . (A) LENGTH: 44 base pairs ::: (B) TYPE: nucleic acid ::: (O STRANDEDNESS: single :: (D) TOPOLOGY: linear • · · * ·* * · · * * (vii) IMMEDIATE SOURCE: ·;··; (B) CLONE: ZC4741 (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:31: • · TCCGATGCAG AGATCGGCAT GTCACCTTGG CAGGTGATGC TTTT 44 1 1 7831 67 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:32: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 42 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC4742 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:32: CCGGAAAAGC ATCACCTGCC AAGGTGACAT GCCGATCTCT GC 42 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:33: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 47 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC4781 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:33: i

'(I

ATCGGATCCC TCCACAATGC GCGGGTCGAT GTAGGATTCC AGGAGCT 47 j, (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:34: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: |

(A) LENGTH: 4 amino acids I

(B) TYPE: amino acid ]i (D) TOPOLOGY: linear ' ' i .*. : (v) FRAGMENT TYPE: internal * · · • * • * * * * • · · ·.

• * ·:*·· (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:34: **· : Arg Arg Lys Arg , i 1 : ·"·, (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:35:

• * * J

··· * (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: |, (A) LENGTH: 4 amino acids , (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear * · · (v) FRAGMENT TYPE: internal • · *:··: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :35: m ....j Leu Asp Lys Arg * · 1 * · ···.

• · » ee 1 1 7831 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:36: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC1159 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:36: TTGTCCAAGC TTACACCTTC 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:37: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 27 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC1551 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:37: GATCCCCGGG GAGCTCCTCG AGGCATG 27 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:38: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: f ;‘..j (A) LENGTH: 19 base pairs *· "· (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single * * (D) TOPOLOGY: linear ♦ • · :***: (vii) IMMEDIATE SOURCE: * '. (B) CLONE: ZC1552 ···' • · * · (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:38: CCTCGAGGAG CTCCCCGGG 19 :.:.: (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:39: • · ft :...: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: • (A) LENGTH: 70 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single ' ·:··· (D) TOPOLOGY: linear • (vii) IMMEDIATE SOURCE: .·. : (B) CLONE: ZC1562 • · · * · 69 1 1 7831 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:39: AGCTTGGACA AGAGAACCGC TACCTCTGAA TACCAAACCT TCTTCAACCC AAGAACCTTC 60 GGTTCTGGTG 70 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:40: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 67 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC1563 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:40: AAGCTGACTG TGGTTTGAGA CCATTGTTCG AAAAGAAGTC TTTGGAAGAC AAGACCGAAA 60 GAGAGCT 67 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:41: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 69 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC1564 (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:41: • · CTCTTTCGGT CTTGTCTTCC AAAGACTTCT TTTCGAACAA TGGTCTCAAA CCACAGTCAG 60 • · · • l· : CTTCACCAG 69 • ·· (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:42: • · :\\ (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: : (A) LENGTH: 60 base pairs ;; .:. (B) TYPE: nucleic acid · ··.: (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear • · * (vii) IMMEDIATE SOURCE: • (B) CLONE: ZC1565 • · · .

• · · * * ’*;** (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:42: AACCGAAGGT TCTTGGGTTG AAGAAGGTTT GGTATTCAGA GGTAGCGGTT CTCTTGTCCA 60 ····· • · «···* • · « · • · · • ♦ 70 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:43: 117831 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 19 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC1629 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:43: CTAGACTATT CACCGAATT 19 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:44: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 19 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single > (D) TOPOLOGY: linear (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC1630 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ IDNO:44: GATCAATTCG GTGAATAGT 19 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:45: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: Θ0 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear * · • · * • ·* ·, · (vii) IMMEDIATE SOURCE: \ *: (B) CLONE: ZC5339 • * (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:45: • · • * .Ϊ. AGCTGCTTGG ACAAGAGATC CTCCACGGCT ACGGATGTGT TCTGGGCCAA GTACACAGCT 60 • · · · .*:*. TGTGAGACAG CGAGGACGCC 80 • » * * (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:46: * · * **”* (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 80 base pairs *" (B) TYPE: nucleic acid : (C) STRANDEDNESS: single *’ * (D) TOPOLOGY: linear i; * *· * , (vii) IMMEDIATE SOURCE: *:·*: (B) CLONE: ZC5340 • · • · · (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:46: 71- 117831 li. j TCGAGGCGTC CTCGCTGTCT CACAAGCTGT GTACTTGGCC CAGAACACAT CCGTAGCCGT 60 GGAGGATCTC TTGTCCAAGC 80 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:47: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 90 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single f (D) TOPOLOGY: linear .

(vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC5344 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:47: AGCTTGGACA AGAGATCCGA AGGCTCCAGT GTGAATCTGT CACCTCCATT GGAGCAGTGT 60 GTCCCTGATC GGGGGCAGCA GTACCAGGGG 90 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:48: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 88 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (Vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: ZC5345 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:48: CGCCCCTGGT ACTGCTGCCC CCGATCAGGG ACACACTGCT CCAATGGAGG TGACAGATTC 60 • * *· *5 ACACTGGAGC CTTCGGATCT CTTGTCCA 88 • · • · ♦ » *· • * aaaaa • · ' ·· · • ♦ · .

♦ ♦ * · ;; a aaa a a a a a a a a a a a aaa a a aaa a a a aaa aaa a a a a aaa a a aaaaa a * · a aaaaa a a a > .

a aaaaa a a * a a a · · a aa a a

Claims (32)

72 1 1 7831

1. DNA-rakenne, joka kykenee ohjaamaan trombiini-prekursorin ilmentymistä, tunnettu siitä, että se kä- 5 sittää seuraavat operatiivisesti kytketyt yksiköt: tran- skriptiopromoottori, DNA-segmentti, joka koodittaa pro-trombiinia, josta puuttuu funktionaalinen gla-alue, ja transkriptiopäättäjä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, 10 tunnettu siitä, että promoottori on hiiren metallotio- neiini-l-promoottori, adenoviruksen pääasiallinen myöhäis-promoottori, Saccharomyces cerevisiae -TPIl-promoottori tai Saccharomyces cerevisiae -ADH2-4C -promoottori.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, 15 tunnettu siitä, että DNA-rakenne käsittää lisäksi sig- naalisekvenssin.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että signaalisekvenssi on ihmisen ku-dosplasminogeeniaktivaattori johtosekvenssi, ihmisen cx-2- 20 plasmiini-inhibiittorisignaalisekvenssi, Saccharomyces cerevisiae -BARl-erityssignaalisekvenssi tai Saccharomyces cerevisiae -MFotl-signaalisekvenssi.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, • M tunnettu siitä, että DNA-segmentti koodittaa ihmisen • ·· * \ 25 protombiinia, josta puuttuu funktionaalinen gla-alue.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, ·· · 9 • · · i ·1 2 tunnettu siitä, että protrombiini, josta puuttuu funk- tionaalinen gla-alue, käsittää kringle-l:n, kringle-2:n, *·· *.· : A-ketjun, aktivaatiokohdan ja seriiniproteaasialueen pro- 30 trombiinista; kringle-2:n, A-ketjun, aktivaatiokohdan ja : seriiniproteaasialueen protrombiinista; tai A-ketjun, ak- ·«· ·3; tivaatiokohdan ja seriiniproteaasialueen protrombiinista. ··· ··«·· • · ··«·· • · . • ••f· • 1 · · 2 • · · 3 • · 117831

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että aktivaatiokohta voidaan pilkkoa käärmemyrkkyaktivaattorilla, trombiinilla tai Saccharomy-ces cerevisiae -KEX2-geenituotteella.

8. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että siihen on 11 viety DNA-rakenne, joka kykenee ohjaamaan trombiiniprekur-sorin ilmentymistä, jolloin mainittu rakenne käsittää seu-raavat operatiivisesti kytketyt yksiköt: transkriptiopro- moottori, DNA-sekvenssi, joka koodittaa protrombiinia, 10 josta puuttuu funktionaalinen gla-alue, ja transkriptio-päättäjä.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että DNA-rakenne käsittää lisäksi signaali sekvenssin.

10 A-ketjun, aktivaatiokohdan ja seriiniproteaasialueen pro- trombiinista; kringle-2:n, A-ketjun, aktivaatiokohdan ja '} seriiniproteaasialueen protrombiinista; tai A-ketjun, aktivaatiokohdan ja seriiniproteaasialueen protrombiinista.

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että DNA-segmentti koodittaa ihmisen protrombiinia, josta puuttuu funktionaalinen gla-alue.

11. Patenttivaatimuksen 8 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että protrombiini, josta puuttuu funk-20 tionaalinen gla-alue, käsittää kringle-l:n, kringle-2:n, A-ketjun, aktivaatiokohdan ja seriiniproteaasialueen pro-trombiinista; kringle-2:n, A-ketjun, aktivaatiokohdan ja J . . seriiniproteaasialueen protrombiinista; tai A-ketjun, ak- • M I t tivaatiokohdan ja seriiniproteaasialueen protrombiinista. • » t * ** 25

12. Patenttivaatimuksen 8 mukainen isäntäsolu, t ' ···1·, tunnettu siitä, että protrombiini, josta puuttuu funk- • · · ί .* tionaalinen gla-alue, sisältää aktivaatiokohdan, joka voi- .,1·* daan pilkkoa käärmemyrkkyaktivaattorilla, trombiinilla tai • M ί#ί ί Saccharomyces cerevisiae -KEX2-geenituotteella.

13. Patenttivaatimuksen 8 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on nisäkäs- tai sienisolu. • M .***.

14. Patenttivaatimuksen 8 mukainen isäntäsolu, t · ' « 1 · • t tunnettu siitä, että se on hiivasolu. ····· * 1 «···· • 1 · * · * · · • · · « « 74 1 1 7 8 31

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että hiivasolussa on mutaatio MNN9-geenissä, MNNl-geenissä, PMRl-geenissa tai PEP4-geenissä.

16. Menetelmä trombiiniprekursorin tuottamiseksi, 5 tunnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraavat vaiheet : kasvatetaan isäntäsolua, johon on viety DNA-raken-ne, joka kykenee ohjaamaan trombiiniprekursorin ilmentymistä ja joka DNA-rakenne käsittää operatiivisesti kytke-10 tyn transkriptiopromoottorin, DNA-segmentin, joka koodit-taa protrombiinia, josta puuttuu funktionaalinen gla-alue, ja transkriptiopäättäjän, sopivissa olosuhteissa DNA-segmentin koodittaman trombiiniprekursorin ilmentymisen mahdollistamiseksi; ja 15 eristetään trombiiniprekursori isäntäsolusta.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi vaiheen, jossa trombiiniprekursori aktivoidaan trombiiniksi in vitro.

18. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että DNA-rakenne käsittää lisäksi signaali sekvenssin.

19. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, ,, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi koodittaa ihmisen * 1 1 '· 1; protrombiinia, josta puuttuu funktionaalinen gla-alue. • · · *· " 25

20. Menetelmä trombiinin tuottamiseksi, tunnet- *' 1 tu siitä, että menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: i« » • V kasvatetaan isäntäsolua, johon on viety DNA-raken- *t1 ne, joka kykenee ohjaamaan trombiiniprekursorin ilmenty- ·1:1· mistä ja joka käsittää operatiivisesti kytketyn transkrip- 30 tiopromoottorin, DNA-segmentin, joka koodittaa protrombii-, nia, josta puuttuu funktionaalinen gla-alue, ja transkrip- .’1·, tiopäättäjän, sopivissa olosuhteissa DNA-segmentin koodit- • · "1 tämän trombiiniprekursorin ilmentymisen ja sen aktivaation *·**· trombiiniksi isäntäsolussa mahdollistamiseksi; ja "**· 35 eristetään aktivoitu trombiini isäntäsolusta. ·#··· « ♦ 0 0 · · · : 75 117831

21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-rakenne käsittää lisäksi signaali sekvenssin.

22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi koodittaa ihmisen protrombiinia, josta puuttuu funktionaalinen gla-alue.

23. Patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että protrombiini, josta puuttuu funktionaalinen gla-alue, käsittää kringle-l:n, kringle-2:n,

24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että aktivaatiokohta voidaan pilkkoa j käärmemyrkkyaktivaattorilla, trombiinilla tai Saccharomy-ces cerevisiae -KEX2-geenituotteella. .

25. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu on nisäkäs- tai sieni- g 20 solu.

26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu on hiivasolu. ',jli .

. 27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen menetelmä, * 1 · · | | tunnettu siitä, että hiivasolussa on mutaatio MNN9- • 1 « *· 2 25 geenissä, MNNl-geenissä, PMRl-geenissä tai PEP4-geenissä.

’ 28. Menetelmä trombiinin tuottamiseksi, tunnet- »· · : 1.1 tu siitä, että menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: ..II1 kasvatetaan isäntäsolua, johon on viety DNA-raken- ϊ ne, joka kykenee ohjaamaan trombiiniprekursorin ilmenty- 30 mistä ja joka käsittää operatiivisesti kytketyn transkrip- . .1. tiopromoottorin, ensimmäisen DNA-segmentin, joka koodittaa ·«· .··1. signaalisekvenssiä, liitettynä toiseen DNA-segmenttiin, • joka koodittaa protrombiinia, josta puuttuu funktionaali- • 1 nen gla-alue, ja transkriptiopäättäjän, sopivassa kasvu- ***** 35 alustassa ja olosuhteissa, jotka mahdollistavat mainitun 2 · • · ··· • 1 · • · 117831 toisen DNA-segmentin koodittaman trombiiniprekursorin ilmentymisen; aktivoidaan trombiiniprekursori trombiiniksi; ja eristetään trombiini kasvualustasta.

29. Patenttivaatimuksen 28 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi koodittaa ihmisen protrombiinia, josta puuttuu funktionaalinen gla-alue.

30. Patenttivaatimuksen 29 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että protrombiini, josta puuttuu funk-10 tionaalinen gla-alue, käsittää kringle-l:n, kringle-2:n, A-ketjun, aktivaatiokohdan ja seriiniproteaasialueen pro-trombiinista; kringle-2:n, A-ketjun, aktivaatiokohdan ja seriiniproteaasialueen protrombiinista; tai A-ketjun, aktivaatiokohdan ja seriiniproteaasialueen protrombiinista. 15

31. Patenttivaatimuksen 30 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aktivaatiokohta voidaan pilkkoa trombiinilla.

32. Menetelmä farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, joka käsittää yhdistelmä-DNA-ihmistrombiinia ja 20 fysiologisesti hyväksyttävää kantajaa, tunnettu siitä, että menetelmässä (i) valmistetaan yhdistelmä-DNA-ihmistrombiinia . menetelmällä, johon kuuluu vaiheet, joissa (1) viljellään • ·1 ‘ \ isäntäsolu, johon on viety DNA-rakenne, joka kykenee oh- • · ** 1j 25 jaamaan trombiiniprekursorin ilmentymistä ja joka käsittää operatiivisesti kytketyn transkriptiopromoottorin, signaa- ·· · ! lisekvenssin, DNA-segmentin, joka koodittaa ihmisprotrom- « „1·1 biinia, josta puuttuu funktionaalinen gla-alue, ja tran- • · · I skriptiopäättäjän, sopivissa olosuhteissa DNA-segmentin 30 koodittaman trombiiniprekursorin ilmentymisen mahdollista- . miseksi, (2) eristetään trombiiniprekursori isäntäsolusta, * 1 1 .1··. ja (3) aktivoidaan prekursori trombiiniksi; ja (ii) sekoitetaan mainittu yhdistelmä-DNA-ihmis- «••I» * 1 trombiini ja fysiologisesti hyväksyttävä kantaja. • · · • · • · · . • ·· • φ 77 . 117831