FI116557B - Paramuunisuusinduktori, joka perustuu rokkoviruskomponenttien yhdistelmiin, menetelmä sen valmistamiseksi ja sen käyttö lääkeaineena - Google Patents

Description

116557

PARAMUUNISUUSINDUKTORI, JOKA PERUSTUU ROKKOVIRUSKOMPONENTTIEN YHDISTELMIIN, MENETELMÄ SEN VALMISTAMISEKSI JA SEN KÄYTTÖ LÄÄKEAINEENA

Tämä keksintö koskee monitehoisia paramuunisuusinduktoreita, jotka perustuvat rokkoviruskomponenttien yhdistelmiin, menetelmää sellaisten valmistamiseksi sekä niiden käyttöä lääkkeinä .

Lämminveristen eläinten, erityisesti nisäkkäiden ja lintujen, immuunijärjestelmä koostuu antigeenispesifisestä osasta ja antigeeniepäspesifisestä osasta. Nämä kaksi osaa sitoutuvat ristikkäin toistensa kanssa ja muodostavat siten yhtenäisen orgaanisen järjestelmän. Antigeenispesifiset mekanismit vastaavat immuniteetin muodostumisesta, kun taas antigeeniepäspesif iset vastaavat paramuunisuuden muodostumisesta. Niinpä sekä historiallisista että toiminnallisista syistä johtuen puolustuksen antigeeniepäspesifinen osa tunnetaan paraspesifisenä immuunijärjestelmänä. Tähän saakka immunologinen tutkimus on ollut kiinnostunut pääasiassa immuunijärjestelmän antigeenispesif isestä osasta, s.o. siitä, miten immuniteetti muodostuu.

: *.. Tämän puolustuskyvyn hyödyntäminen on johtanut esimerkiksi • ·.. aktiivisen ja passiivisen immunisaation kehittymiseen. Immuuni- järjestelmän paraspesifisten vaikutusten hyväksikäyttö ennalta-•V. ehkäisyyn ja hoitoon on sitä vastoin alkuvaiheissaan. Paraspe- { .·. s if inen immuunijärjestelmä antaa organismille valmiudet välittömään puolustukseen silloin, kun se kohtaa mitä erilaisempia vieraita aineita, taudinaiheuttajapatogeeneja, toksiineja ja organismin omia transformoituja soluja. Immuunijärjes-telmän paraspesif isten ja spesifisten vaikutusten väliset lä-heiset toiminnalliset vuorovaikutukset seuraavat malleja, joi-hin kuuluu tavallisesti informaation kulku ensin reagoivista ,··; paraspesif isistä mekanismeista immuunijärjestelmän spesifisiin . mekanismeihin. Näin sellaisissa tapauksissa, joissa on eri- ;tyisen virulenttien patogeenien aiheuttama infektio, organis- 116557 2 min paraspesifinen puolustus kykenee täyttämään aukon siihen saakka, kunnes spesifinen immuniteetti on ehtinyt kehittyä.

Sen jälkeen, kun Edward Jenner esitti suojaavan immunisaation isorokkoa vastaan 1798 käyttämällä eläimistä (karja tai hevoset) saatua rokotetta, joka perustui lehmänrokkovirukseen, on kuvattu kokeellisesti saatuja tuloksia, jotka osoittavat, että suojaava immunisaatio isorokkoa vastaan sai rokotetuissa aikaan hämmästyttävän nopean, tai ilman komplikaatioita tapahtuvan, toipumisen muista infektioista ja sairauksista, etenkin kroonisista ja uusiutuvista vaivoista, joita ne sattuivat sairastamaan rokotuksen aikoihin. Erityisesti tämä pätee eri alkuperää oleviin herpesinfektioihin, papilloomiin, kroonisiin ekseemiin ja korvien, nenän ja kurkun patologisiin tiloihin. Samoin kuin tämä havaittiin kuitenkin se, että immunisoiduilla oli yleisesti kohonnut lyhytaikainen vastustuskyky akuutteja ympäröiviä infektioita vastaan. Samanlaisia ilmiöitä on havaittu eläinrokkomuotoja vastaan tehdyn suojäävän immunisaation jälkeen. Näistä havainnoista pääteltiin, että rokkovirukset tai näiden virusten tietyt rakennekomponentit voivat vaikuttaa positiivisesti organismin kykyyn vastustaa infektioita ja kasvaimia epäspesifisellä tasolla. Koska nämä epäspesifiset parantumisprosessit pannaan käyntiin heti . rokotuksen jälkeen ja siten 5-7 päivää ennen kuin rokotuksen :,’i aikaansaama spesifinen immuniteetti kehittyy, lisäksi siihen j " ·' nähden samansuuntaisesti, A. Mayr nimesi 1978 nämä profylakti- I sen immunisaation epäspesifiset seuraukset "paraspesifisiksi".

Tämän mukaisesti lääkeaineet, jotka on tuotettu spesifisesti hyväksikäyttämään tällaisia paraspesifisiä vaikutuksia, . ,·. tunnetaan "paramuunisuusinduktoreina" (paramunity inducers) ; katso A. Mayr, 'Prämunität, Prämunisierung und paraspezifische Wirkung von Schutzimpfungen' , Miinch. Med. Wschr. 1978, Voi.

' V 120, s. 239-242; A. Mayr, H. Raettig, H. Stickl ja M.

1Alexander, 1979: 'Paramunität, Paramunisierung, Paramunitäts- \ : inducer', Fortschr. Med. 97, s. 1159- 1165 ja 1205-1210.

116557 3 DE-A-27 14 665 ja US-patentti 4,191,745 kuvaavat rokkovi- ruksiin perustuvat valmisteet vyöruusun ja muiden herpesinfektioiden hoitoon. Eläinlääketieteessä paramuunisuusindukto-reita on tuotettu puhdistetuista, heikennetyistä ja inaktivoi-duista linturokko- ja pararokkoviruksista. Nämä paramuunisuus-induktorit on rekisteröity Euroopan maissa nimillä "Duphapind " ja "Duphamun " (PIND-AVI) sekä "Baypamun " (PIND-ORF) käytännöllisesti katsoen kaikille maatalous- ja kotieläin-lajeille. Paraimmuunisuusinduktori PIND-AVI valmistetaan heikennetystä linturokkoviruksesta, kannasta HP-1, ja paramuu-nisuusinduktori PIND-ORF valmistetaan heikennetystä parapox-viruksesta, kannasta D-1701. Heikennetyt virukset tehdään inaktiivisiksi tunnetulla tavalla per se, esim. -säteilyllä tai kemiallisella tavalla, kuten käsittelemällä - propiolak-tonilla.

Paraimmunisoivilla ominaisuuksilla varustetut lääkkeet, jotka ovat edullisia käytettäviksi immunostimulantteinä ja "ad-juvantti-immunoterapian" aikaansaamiseen ihmislääketieteessä, ovat BCG (Bacillus Calmette-Guerin), levamisoli ja Corynebacterium parvum (syn. Propionibacterium acnes) . Nämä valmisteet ovat kuitenkin paramunisoivan vaikutuksen osalta : ” huonompia kuin rokkovirukseen perustuvat paramuunisuusindukto- - ” rit, mikä voidaan nähdä tuloksista, jotka esitetään yhteen- vetona taulukossa 1, nämä tulokset saatiin kokeissa, joissa • V näitä valmisteita verrattiin PIND-AVI:iin ja PIND-ORF:iin i> : VSV-hiirenpoikaskokeessa; katso A. Mayr, A.M. Biittner, S.

i ’ *: Pawlas, V. Erfle, B. Mayr, R. Brunner ja K. Osterkorn, 1986: 'Vergleichende Untersuchungen iiber die immunstimulierende , (paramunisierende) Wirksamkeit von BCG, Levamisol,

Corynebacterium parvum und Präparaten aus Pockenviren in verschiedenen "in vivo"- und "in vitro"-Testen', J. Vet. Med.

V B 33, S. 321-339.

Keksinnön kohteena on antaa käyttöön terapeuttisiin sovel-; luksiin ihmis- ja eläinlääketieteessä monitehoisia, rokko-viruskomponentteihin perustuvia paramuunisuusinduktoreita, 116557 4 joiden tehokkuutta ja paramunisointiin liittyviä vaikutuksia on parannettu. Edelleen keksinnön kohteena on antaa käyttöön parannettu menetelmä mainittujen monitehoisten parattuuni suus-induktoreiden valmistamiseksi käyttämällä uutta virusten lisäämistekniikkaa soluviljelmissä ja/tai viruksen inaktivoin-tia. Lopuksi keksinnön kohteena on vielä antaa käyttöön mainittuihin monitehoisiin paramuunisuusinduktoreihin perustuvat farmaseuttiset koostumukset lääkkeinä käytettäviksi.

Näin ollen keksintö koskee monitehoisia parattuuni suusindukt o -reita, jotka perustuvat kahden tai useamman rokkoviruskomponen-tin yhdistelmään, jotka komponentit ovat peräisin sellaisista eri rokkoviruskannoista, joilla on paramunisointiominaisuuk-sia. Edelleen keksintö koskee monitehoisia parattuuni suusinduk-toreita, jotka perustuvat yhdistelmään, joka sisältää suuren määrän eri lajia olevia inaktivoituja, heikennettyjä rokko-viruksia, joilla on paramunisointiominaisuuksia. Keksintö koskee myös menetelmää sellaisten paramuunisuusinduktoreiden valmistamiseksi, joissa yhdistetään kaksi tai useampi rokko-viruskomponentti, jotka komponentit ovat peräisin eri rokko-viruskannoista, joilla on paramunisointiominaisuuksia. Lopuksi keksintö koskee menetelmiä keksinnön mukaisten monitehoisten • " paramuunisuusinduktoreiden valmistamiseksi sekä farmaseuttisia > ' koostumuksia, jotka sisältävät mainittuja monitehoisia paramuu- nisuusinduktoreita, lääkkeinä käytettäviksi.

Yllättäen havaittiin, että rokkoviruskomponenttien yhdis-t*.’: täminen keksinnön mukaisiksi monitehoisiksi paramuunisuusinduk- toreiksi ei johda yksittäisten rokkoviruskomponenttien vastaa-. vien paramunisaatiovaikutusten vähenemiseen, häviämisestä puhumattakaan. Sen sijaan havaittiin, että eri rokkoviruskannoista peräisin olevien rokkoviruskomponenttien yhdistäminen ’ 'k keksinnön mukaisiksi monitehoisiksi paramuunisuusinduktoreiksi 1 .· ei aikaansaa ainoastaan additiivista tai täydentävää vaikutus- . : ta, vaan lisää kunkin (komponentin) paramuunisuusvaikutusta ·, : erikseen. Kokeet ovat osoittaneet, että rokkoviruskomponenteis- ta yhdistettyjen monitehoisten paramuunisuusinduktorien vai- 116557 5 kutus ylittää runsaasti niissä olevat yksittäiset vaikutukset. Tätä ilmiötä ei olisi voitu ennustaa, ja se parantaa näitä pa-ramuunisuusinduktoreita niiden tehokkuudessa ja paramunisaa-tioon liittyvissä vaikutuksissa verrattuna tavanomaisiin, yhdestä rokkoviruskomponentista tehtyihin valmisteisiin. Toinen odottamaton havainto on, että keksinnön mukaisilla monite-hoisilla paramuunisuusinduktoreilla ei käytännöllisesti katsoen ole immunogeenisia ominaisuuksia, mutta niillä on hyvin voimakkaat paramunisaatio-ominaisuudet, minkä seurauksena niitä voidaan turvallisesti antaa toistuvasti tai jatkuvasti.

Keksintö perustuu myös yllättävään havaintoon, että para-munisoivien ja immunisoivien rokkovirusten rakenneproteiinien epitooppien välillä esiintyy kilpailutilanne. Mitä jyrkempi aktiivisuuden lasku antigeenispesifisestä immunisaatiosta vastaavien epitooppien osalla on, sitä suurempi on paraspesifisen aktiivisuuden kasvu. Seuraavat kaksi havaintoa osoittavat tämän: a) Useilla sadoilla siirrostusvaiheilla tehty heikentäminen soluviljelmissä aiheuttaa rokkovirusten immunisointiominai-suuksien huononemisen, kun taas paraspesifiset vaikutukset eivät ainoastaan kasva vaan tiettyjen rokkokantojen kohdalla • ' vasta ilmestyvät heikentymisen jälkeen; , · * •b) paramuunisuusinduktorien valmistamiseen sopivien rokkovirus- i ten inaktivointi, edullisesti säteilyttämällä, lämpö- tai *: pH-vaikutuksella, tai edullisimmin käsittelemällä kemiallises ti -propiolaktonilla tietyissä olosuhteissa, aikaansaa rokko-virusten immunisointiominaisuuksien häviämisen, kun taas ·.·. niiden paramunisoivat vaikutukset kasvavat.

Keksinnön rokkoviruskomponenttien yhdistelmät sopivat käytettäväksi monitehoisina paramuunisuusinduktoreina sekä ihmis-että eläinlääketieteessä.

116557 6 Tämän keksinnön yhteydessä käytettynä termi "rokkoviruskompo-nentti" kattaa suuren määrän virusrakenteita, jotka ovat peräisin paramunisointiominaisuuksilla varustetuista rokko-viruksista, esimerkiksi elävät (s.o. monistumiskykyiset) tai inaktivoidut äskettäin eristetyt rokkovirukset, elävät tai inaktivoidut rekombinanttirokkovirukset, jotka ovat peräisin äskettäin eristetyistä rokkoviruksista, elävät tai inaktivoidut heikennetyt rokkovirukset, elävät tai inaktivoidut rekombinanttirokkovirukset, jotka ovat peräisin heikennetyistä rokkoviruksista, edellä lueteltujen rokkovirusten irralliset vaipat ja hajoamistuotteet sekä mainittujen vaippojen poikkeavat muodot, yksittäiset virusperäiset polypeptidit, jotka saadaan biokemiallisin tai immunokemiallisin menetelmin viljelmistä, jotka on infektoitu edellä luetelluilla rokkoviruksil-la, sekä virusperäiset rekombinanttipolypeptidit, jotka saadaan prokaryoottisella tai eukaryoottisella ilmentämisellä, ja joista ainakin osia on peräisin yhdestä tai useammasta edellä lueteltujen rokkovirusten virusperäisestä polypeptidistä.

Termi "yhdistelmä", siten kuin tämän keksinnön yhteydessä käytetään, kattaa sekä kahden tai useamman sellaisen yksittäisen rokkoviruskomponentin sekoittamisen, jotka komponentit ’ ovat peräisin eri rokkoviruskannoista, että myös suuren määrän : ’ yhdistämisen tällaisia yksittäisiä rokkoviruskomponentteja *. polypeptidiin tai polypeptidikompleksiin. Rokkoviruksista : .* peräisin olevia komponentteja, esimerkiksi rekombinanttirokko- *#: viruksia, yksittäisiä virusperäisiä polypeptidejä tai rekombi- ;nantteja virusperäisiä polypeptidejä jotka mutaation tai geenimanipulaation seurauksena sisältävät kahta tai useampaa , ’· polypeptidisekvenssiä, jotka ovat peräisin kahdesta tai useam- masta rokkoviruskannasta, kohdellaan johdonmukaisesti kahtena tai useampana erillisenä rokkoviruskomponenttina siitä seikasta huolimatta, että mainitut polypeptidisekvenssit muodostavat * » yhden aminohappoketjun osat. Sama pätee myös sellaisiin yksit-\j täisiin rokkoviruskomponentteihin, jotka liittyvät toisiinsa : millä tahansa fysikaalisella tai kemiallisella tavalla.

116557 7 Tämän keksinnön yhteydessä käytettynä termi "monitehoinen" tarkoittaa keksinnön alaisten paramuunisuusinduktorien monia ja vaihtelevia mahdollisia sovelluksia ennaltaehkäisyyn ja hoitoon, esim. seuraaviin indikaatioihin: 1) infektoivan tekijän aiheuttamat sairaudet (infectious factor diseases) ja sekainfektiot, infektioprosessien krooniset oireet, itsepintaisesti uusiutuvat infektiot sekä bakteeri- ja virusinfektiot, jotka ovat resistenttejä kemoterapial-le, 2) organismin immuunijärjestelmän heikkoudet tai sen epäsäännöllisyydet , 3) vastasyntyneen infektioiden uhka, 4) adjuvanttihoito tietyissä syöpämuodoissa ja/tai etäpesäkkeiden muodostumisen ehkäisy, 5) homeostaasin säätely hormonaalisen, verenkierto-, aineen-vaihduntajärjestelmän ja hermoston välillä.

'* Paraimmuunisuusinduktorit ovat erityisen sopivia ennalta- : ehkäisevään käyttöön seuraavissa tapauksissa: : - nopea vastasyntyneen immuniteetin aktivointi - ennen odotettuja stressitilanteita (kodinmuutos, henkinen ! :: stressi, korkean suorituskyvyn jaksot, ym.) - ennen sairaalassa oloa - infektiovaaran ollessa akuutti - rokotuskomplikaatioiden esto - syöpävaaran ja/tai etäpesäkkeiden muodostumisen vähentäminen - biosäätelyn tukeminen - suorituskyvyn nostaminen . ,· - odotettavissa olevan eliniän nostaminen : - homeostaasin säätely hormonaalisen, verenkierto-, aineenvaih dunta järjestelmän ja hermoston välillä.

8 11 6 5 S 7

Erityisen sopivia paramuunisuusinduktorit ovat terapeuttiseen käyttöön seuraavissa tapauksissa: - immuuniheikkoudet - virustaudit, hoitoresistentit bakteeritaudit, infektoivan tekijän aiheuttamat sairaudet (infectious factor diseases) - krooniset ja uusiutuvat infektiot - kasvaimet - toipilasaika - kemoterapia ja antibioottihoito - eri alkuperää olevat maksasairaudet - krooniset ihotaudit - immunopatogeeniset sekundaarisairaudet.

Taulukko 1 esittää eri rokkoviruskomponenttien ja paramuuni-suusinduktorien paramunisointivaikutukset VSV-hiirenpoikas-testissä. Esitetyt kuvat esittävät tehokkuusindeksit. Käytetty menetelmä esitetään pääpiirteittäin DE-A- 27 14 665:ssä.

Taulukko 2 esittää eri rokkoviruskantojen paramunisointitehok-kuuden voimistumisen VSV-testissä käytetyn heikentämisasteen funktiona. Käytettiin inaktivoituja virussuspensioita.

'· ’ Taulukko 3 esittää, mikä vaikutus heikentämisellä on eri la-

! * I

"> j ien ääreisveren yksitumaisten valkosolujen interferonisyntee- : V sin induktioon.

* * · # < * . : Taulukko 4 osoittaa, kuinka rekombinanttirokkovirukseen perustuvan monitehoisen paramuunisuusinduktorin parattuani sointi- vaikutus tehostuu verrattuna yksittäisten komponenttien vaikutukseen.

Kuva 1 esittää kahdesta VSV-testistä saatujen tehokkuusin-deksien vertailun, joissa testeissä käytettiin heikennettyä · linturokkovirusta HP1, parapox-virusta ORF D1701 ja HPl:n ja .: D1701:n yhdistettyä valmistetta.

116557 9

Kuva 2 esittää keksinnön rokkoviruskomponenttien ORF-proteiini 4D9 ja PIND-AVI yhdistelmän voimistavan vaikutuksen NK-solu-(luontainen tappajasolu) -aktiivisuuteen verrattuna kahden yksittäisen komponentin vaikutukseen kromi- 51:n vapautumis-testissä. Osoitetut arvot vastaavat kahden eri kokeen keskiarvoa. Käytetty testimenetelmä kuvataan edellä viitatussa kirjallisuusviitteessä Mayr 1986.

Kun rokkoviruskomponentteja käytetään keksinnön mukaisiin monitehoisiin paramuunisuusinduktoreihin, rokkoviruslajeja voidaan käyttää äskettäin eristettyinä, niin sanottuina virulentteina kenttäkantoina (field strains) tai muutoin heikennetyssä, avirulentissa muodossa. Heikennettyjen kantojen käyttö on edullista, koska paramunisointiominaisuudet kasvavat heikentämisen myötä ei-heikennettyihin kantoihin verrattuna ja myös turvallisuusnäkökohtien huomioimisen vuoksi. Tähän kuuluu tarkoituksenmukaisten viruskantojen lisääminen sarjasiirrostus-vaiheina soluviljelmissä. Lisäämällä kloonivalikoima säännöllisesti plakkiteknologiaa käyttäen saadaan geneettisesti yhtenäinen virusmateriaali, joka on sopeutunut erityisen hyvin viljelyolosuhteisiin mutaation ja valikoinnin seurauksena. Heikentämisaste varmistetaan siirrostusvaiheiden kuluessa vastaanottaviin isäntiin siirrostamalla (esim. käyttämällä ihomenetelmää kanojen, kanarialintujen, jne. tapauksessa, , ; kanin ihon naarmuttamista, jne.). Eri identifikaatiomenetelmät ·' V* kuuluvat aiempaan tekniikan tasoon; katso A. Mayr ja E. Munz, ’ : 1964: 'Veränderungen von Vaccinevirus durch Dauerpassagen in

Hiihnerembryof ibroblasten-Kulturen' , Zbl. Bakt. Hyg. I. Orig. 195, s. 24-35; A. Mayr, F. Hartig ja I. Bayr, 1964: 'Entwic- klung eines Impfstoffes gegen die Kanariepocken auf der Basis eines attenuierten Kanarienpocken-Kulturvirus', Zbl. Vet. Med.

’ B 12, s. 41-49; A. Mayr ja K. Malicki, 1966: 1Attenuierung von virulentem Hiihnerpockenvirus in Zellkulturen und Eigenschaften ,* des attenuierten Virus', Zbl. Vet. Med. B 13, s. 1-13; A.

. Mayr, M. Herlyn, H. Mahnel, A. Danco, A. Zach ja H. Bostedt, , ; 1981: 1Bekämpfung des Ecthyma contagiosum (Pustulardermatitis) der Schafe mit einem neuen Parenteral-Zellkultur-Lebendimps- 116557 10 toff', Zbl. Vet. Med. B 28, s. 535-552. Yleiseen käytäntöön kuuluu useiden eri menetelmien käyttäminen kyseisen rokkovi-ruslajin heikentämisasteen määrittämiseen.

Heikentämiseen käytetyt sarjasiirrostusvaiheet päättyvät tavallisesti kolmella kloonivalikoinnilla, joissa käytetään lopullista plakkilaimennustekniikkaa (plaque final dilution technology). Tämä varmistaa sen, että käytettävä virusmate-riaali on geneettisesti yhtenäistä. Kaikki myöhemmin viitatut rokkoviruskannat saatiin tämän periaatteen mukaisesti.

Linturokkoviruksen heikentämiseen tarvitaan 200-500 vilje-lysiirrostusvaihetta, edullisesti vähintään 440 siirrostus-vaihetta. Parapox-viruksen heikentämiseen tarvitaan 100-200 viljelysiirrostusvaihetta, edullisesti vähintään 170 vähittäistä siirrostusvaihetta, alussa lampaan sikiön munuaisviljelmis-sä, joita seuraavat siirrostusvaiheet vasikan sikiön keuhkovil-jelmissä ja apinan munuaissolulinjoissa (esim. MA, vero). MVA-lehmänrokkovirus tarvitsee heikentämistä 400-600 viljely-siirrostusvaiheen verran, edullisesti vähintään 575 siirros-tusvaihetta. Kanarialinnun rokkoviruksen heikentäminen vaatii .. 200-500 viljelysiirrostusvaihetta, edullisesti vähintään 390 . siirrostusvaihetta. Jokaisen 100 siirrostusvaiheen suorittami- * nen kestää kolmesta viiteen vuotta riippuen kyseisestä rokko- ' ; viruslajista. Heikentäminen käsittää siis kymmenestä kah- '<'·' teenkymmeneen vuoteen kestävän ajanjakson.

Keksinnön mukaisiin paramuunisuusinduktoreihin rokkoviruskompo-'· nenttina käytetyt heikennetyt rokkovirukset ovat edullisesti linturokkovirus, kanta HP-l, 444. siirrostusvaihe CEF-vil-jelmissä, parapox-virus, kanta ORF D1701, 135. siirrostusvaihe t · M lampaan sikiön munuaisviljelmissä, 37. siirrostusvaihe naudan sikiön keuhkosoluviljelmissä [(bovine embryonal lung cell /.· cultures, (BEL)], 49. siirrostusvaihe MA-soluissa (apinan munuaissolulinja) , lehmänrokkovirus, kanta MVA (modified vac-ciniavirus Ankara), 572. siirrostusvaihe CEF-viljelmissä, ja kanarialinnun rokkovirus, kanta KP-1, 535. siirrostusvaihe 116557 11 CEF-viljelmissä. Näiden virusten näytteet on talletettu kylmäkuivattuina talletuslaitokseen European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Englanti. Vastaavat talletusten hakunumerot ovat V94012709, V94012706, V94012707 ja V94012708; katso myös talletettujen mikro-organismien indikaatiot seuraavilla sivuilla. Talletettuihin viruksiin liittyvät lisäindikaatiot voidaan saada myöhemmin seuraavista virustalletusten talletuskaa-vakkeiden kopioista.

Keksinnön mukaisten monitehoisten paramuunisuusinduktorien valmistamiseen on kuitenkin vaihtoehtoisesti mahdollista käyttää muita heikennettyjä rokkoviruskantoja, joilla on paramunisoin-tiominaisuuksia.

Rekombinanttirokkovirusten valmistamiseen tämän keksinnön tarkoituksen puitteissa sopivat monet eri menetelmät. Edulliseen menetelmään kuuluu samanaikainen infektio käyttämällä kahta eri rokkoviruskantaa, joilla on paramunisointiominaisuuk-sia, sellaisen rekombinaatiotapahtuman aikaansaamiseen, jossa yhden viruksen paramunisointiominaisuuksia koodaavien alueiden osat pannaan toisen rokkoviruksen genomiin. Seuraavaksi re-kombinoidut rokkovirukset, joissa yhdistyy kahden eri rokko-: ·’ viruskannan paramunisointivaikutukset, identifioidaan käyt- tämällä lopullisia plakkilaimennussiirrostusvaiheita ja sopi-v : via seulontaprosesseja. Esimerkiksi erilaiset linturokkoviruk- sen, lehmänrokko MVA-viruksen, kanarialinnun rokkoviruksen tai : parapox-viruksen yhdistelmät ovat sopivia samanaikaiseen infektioon.

Toinen rekombinanttivirusten valmistamismenetelmä hyödyntää '··' lisäksi geenitekniikoita ja homologisen rekombinaation menetel-mää. Tätä varten on ensin välttämätöntä tunnistaa alueet, i · ;\| jotka koodaavat rokkovirusten paramunisointiominaisuuksia. Tämä tehdään tekniikoin, jotka tunnetaan per se.

116557 12

Paraimmunisoivat rakenneproteiinit voidaan esimerkiksi fraktioida käyttämällä biokemiallisia tai immunokemiallisiä menetelmiä ja niiden paramunisointiominaisuudet voidaan tutkia. Tämä voidaan tehdä esimerkiksi käyttämällä jäljempänä viitattuja in vitro ja in vivo -testejä. Kun paramunisoivat rakenneproteiinit on identifioitu, kokonaisen proteiinin N-terminaaliset sekvenssit tai sen proteolyyttisen tai kemiallisen pilkonnan tuotteet voidaan sitten sekvensoida, jolloin saadaan aminohapposekvenssitiedot, jotka mahdollistavat vastaavien DNA-alueiden seulonnan sopivissa geenipankeissa käyttämällä sopivalla tavalla suunniteltuja oligonukleotidi-koettimia, käyttämällä joko perinteisiä hybridisaatioteknii-koita tai polymeraasiketjureaktiota (PCR). Toinen mahdollinen identifikaatiomenetelmä on hybridisoida alentuneen ankaruuden (decreased stringency) olosuhteissa käyttämällä rokkovirus-lajista olevia tunnettuja DNA-näytteitä, jotka ovat spesifisiä proteiineille, joilla on paramunisointiominaisuuksia, ja eristää muiden rokkovirusten vastaavat homologiset DNA-alueet, jotka samoin koodaavat proteiineja, joilla on paramunisointi-vaikutus. Tässä menetelmässä on myös mahdollista korvata tavanomainen seulontamenetelmä PCR:llä, jossa on vastaavat, tunnettujen sekvenssien kanssa homologiset alukkeet.

; ’· Muiden rokkovirusten DNA-alueet, jotka ovat homologisia : ·' tiettyjen rokkovirusten tunnettujen sellaisten DNA-alueiden kanssa, ja jotka koodaavat paramunisoivia proteiineja, voidaan V ' tunnistaa myös eri lähisukuisten rokkovirusten genomin restrik- tioentsyymikartoituksella ja vertaamalla alueita, joilla on ; samanlaiset restriktioentsyymipilkontamallit. Tämäntyyppistä vertailevaa restriktioentsyymikartoitusta kuvataan esimerkiksi artikkelissa F. Rafii ja D. Burger: 'Comparison of contagious i I ·

Ecthyma virus genomes by restriction endonucleases', Arch. Virol. 84, S. 283-289, (1985) .

Vielä eräs tapa identifioida paramunisointiominaisuuksia koodaavat DNA-alueet on käyttää geenipankkien seulontaan mo-noklonaalisia tai polyklonaalisia vasta-aineita, jotka tun 116557 13 nistavat sellaisia virusproteiineja, joilla on paramunisointi-ominaisuuksia. Sellaista menetelmää on käytetty esimerkiksi identifioimaan kanin rokkovirusgeeni, joka koodaa 14 kD:n proteiinia (fuusioproteiini) , jolla on rokkoviruksissa esiintyviä paramunisointiominaisuuksia.

Paraimmunisoivia virusproteiineja koodaavien DNA-alueiden identifioinnin ja kloonauksen jälkeen on sitten mahdollista spesifisesti valmistaa keksinnön mukaiset rekombinoidut rokkovirukset homologisella rekombinaatiolla sopivia vektoreita käyttämällä. Vieraalle DNA:lie sopiva insertiokohta olisi esimerkiksi tymidiinikinaasigeenin lokus, koska se ei ole rokkoviruksille välttämätön. Menetelmässä transfektoidaan siirtäjävektori, joka kantaa heterologista geenialuetta, joka pannaan rokkoviruksen sisään homologisella rekombinaatiolla ja joka geenialue on peräisin toisesta paramunisointiominaisuuk-silla varustetusta rokkoviruksesta, soluihin, jotka on infek-toitu rekombinoitavalla rokkoviruksella. Edullisesti siirtäjä-vektorit kantavat valintamarkkerigeeniä, samoin kuin homologisia reunustavia sekvenssejä, jotka ovat peräisin rekombinoi-tavasta rokkoviruksesta, jotta homologinen rekombinaatiotapah-tuma mahdollistuu tehtäväksi tyydyttävässä määrin. Tätä seuraa ’ sitten sellaisten rekombinoitujen rokkovirusten identifiointi, '· : joissa yhdistyy kahden eri rokkoviruskannan paramunisointi- : ·' vaikutukset, jälleen kerran käytetään lopullisia plakkilaimen- \ .* nussiirrostusvaiheita ja sopivia seulontaprosesseja, kuten : esimerkiksi immunokemiallista yksittäisen plakin toteamista monoklonaalisilla tai polyklonaalisilla vasta-aineilla.

: Insertoidut DNA-rakenteet voidaan todeta myös käyttämällä hybridisaatiotekniikoita, esim. "dot-blot"-hybridisoinnilla. Insertin ilmentyminen todetaan joko suoraan tarkoituksenmukai-sen rakenneproteiinin toteamisella monoklonaalisilla tai ’;·* polyklonaalisilla vasta-aineilla, tai muutoin epäsuorasti laboratorioeläinten immuuni-paramuuni-vasteen välityksellä (VSV-altistustesti) , soluviljelmissä (soluviljelmän altistus-testi) tai in vitro -parametreillä (interferoni-induktio, tiettyjen interleukiinien, CSF:n, TNF:n, ym. muodostus).

14

Tuloksena on rekombinanttirokkovirus, jota voidaan käyttää rokkoviruskomponenttina tai monitehoisena paramuunisuusindukto-rina tämän keksinnön tarkoituksen puitteissa.

Heikennetyt rokkovirukset ovat erityisen sopivia keksinnön mukaisten rekombinoitujen rokkovirusten valmistamiseen, koska niiden tiedetään olevan sekä ympäristön kannalta turvallisia että samaan aikaan niillä on erittäin hyvä paramunisointitehok-kuus.

Myös heikennettyjä rekombinoituja rokkoviruksia voidaan käyttää elävässä muodossa ja inaktivoidussa muodossa monitahoisten paramuunisuusinduktorien ja keksinnön mukaisten farmaseuttisten kostumusten valmistamiseen. Inaktivoitujen rekombinoitujen rokkovirusten käyttö on edullista.

Esimerkkejä rokkoviruskomponentteina käytettäväksi sopivista elävistä tai inaktivoiduista rekombinoiduista heikennetyistä rokkoviruksista, joilla on paramunisointivaikutus, ovat MVA-virus, joka kantaa linturokkoviruksen ja parapox-viruksen paramunisointiproteiineja koodaavia geenejä, heikennetty kanarialinnun rokkovirus, joka kantaa MVA-viruksen, linturokko-. viruksen ja parapox-viruksen paramunisointiproteiineja koodaa- ; via geenejä, sekä "vice versa" -yhdistelmät kaikkein vaihtele- : vampia, heikennettyjä rokkoviruskantoja.

V * Edellä mainittujen rokkovirusten, joita käytetään rokkovi ruskomponentteina keksinnön mukaisiin monitehoisiin para-:muunisuusinduktoreihin, monistaminen voi tapahtua sekä primaa-: :*·. risissa että sekundaarisissa soluviljelmissä, samoin kuin pysyvissä solulinjoissa. Keksinnön mukaisesti käytettyjen rokkovirusten monistaminen ja viljely tehdään per se tunnetuil-;· la tekniikoilla. Esimerkiksi heikennettyä linturokkovirusta /·, voidaan monistaa primaarisissa tai sekundaarisissa kanan sikiön f ibroblasteissa (CEF-vil jelmät, fibroblasts from chicken embryos) ja pysyvien CEF-solujen viljelmissä (chicken embryo fibroblasts; solulinja). Primaarisissa CEF-viljelmissä 116557 15 monistaminen on edullista. Heikennettyä parapox-virusta voidaan monistaa esimerkiksi lampaan munuaisviljelmissä tai naudan sikiön keuhko- (bovine embryo lung (BEL)) -viljelmissä (primaariset tai sekundaariset viljelmät; valmistetaan esimerkiksi seuraavalla menetelmällä: S. H. Mädin, P.C. Andriese, N.B. Darby, 1957: 'The in vitro cultivation of tissues of domestic and laboratory animals', Am. J. Vet. Res. 18, s. 932-941), vero- ja MA-soluissa (afrikkalaisen pitkähäntäisen vihermarakatin (African green long-tailed monkey) munuais-solulinjoja; ATCC CCL 81 ja Microbiology Associated 104) . Vero-soluissa monistaminen on edullista. MVA-lehmänrokkovirus-ta voidaan monistaa esimerkiksi primaarisissa CEF-viljelmissä tai CEF- solukannoissa (solulinja). Lisääminen CEF-viljelmissä on edullista. Kanarialinnun rokkovirusta voidaan monistaa CEF-vil jelmissä ja pysyvissä CEF-soluissa. Lisääminen primaarisissa CEF-viljelmissä on edullista.

Heikennetyn linturokkoviruksen, MVA-lehmänrokkoviruksen ja heikennetyn kanarialinnun rokkoviruksen tapauksessa monistaminen on edullista mainituille viruksille alttiiden nisäkkäiden ;·, tai lintujen primaarisissa tai sekundaarisissa soluviljelmis- sä. Primaarisissa tai sekundaarisissa CEF-viljelmissä monista-\ , minen tapahtuu edullisesti 33-39 °C:ssa, edullisimmin 37 °C:ssa. CEF-soluviljelmät valmistetaan tavanomaisella menetel-• ·* mällä käsittelemällä trypsiinillä kanan sikiöiden keho-osa ja ‘d·* raajoja, joita on inkuboitu 10- 12 päivää, sen jälkeen kun !.: · sisälmykset ja pää on poistettu (fibroblastiviljely) , soluvil jelmiin niitä vastaavissa lasi- tai muoviastioissa, esim. penisilliinipulloissa, käyttämällä paikallaan olevaa inkuboin-tia tai pyörivää inkubointia (roller-viljelmät) . Kaikkein edullisinta on modifioida yleistä tekniikkaa ja käyttää kokonaista ‘,1 sikiötä, pää ja sisälmykset mukaan lukien (sekasolususpensio, | \ ;· paremmat viruksen talteenotot, paramunisointiominaisuudet ovat laadullisesti ja määrällisesti vakaammat). Primaariviljelmät saadaan edullisesti esitrypsinoimalla (10-15 minuutin ajan, supernatantin poisto) ja päätrypsinoimalla 45-60 minuutin ajan. Viljelmään otettu kasvualusta koostuu edullisesti minimi- 16 kasvualustasta (MEM) + 10 %:sta laktalbumiinihydrolysaattia + 10 %:sta BMS:ää (seerumikorvike); kasvualusta ylläpitoa varten koostuu yksinomaan MEM:stä. Soluviljelmät infektoidaan viruksella juuri ennen niiden tihenemistä (80-100 % yhtenäinen solumatto), s.o. 1-3 päivää maljauksen jälkeen, edullisesti 20 tuntia maljauksen jälkeen, ja inkuboidaan 33-39 °C:ssa, edullisimmin 37 °C:ssa.

Edullinen CEF-viljelmiin siirrostettava virus on tarkoituksenmukaisen heikennetyn rokkoviruskannan plakkipuhdistettu virusmateriaali. Edullinen siirrostusannos on 107'0 TCID50/IOO ml kasvualusta (TCID5q= annos, joka infektoi 50 % kudosviljel-mästä).

Infektoituja soluviljelmiä inkuboidaan 33 - 39 °C:ssa, edullisesti 37 °C:ssa, jotta soluviljelmistä saadaan heikennettyjen rokkovirusten suspensiot monitehoisiin paramuunisuusinduktorei-hin käytettäväksi. Virusmateriaali otetaan talteen 1-10 päivän kuluttua, edullisesti 3-4 päivän kuluttua ja edullisesti silloin, kun 5 - 100 % solumatosta on tuhoutunut, edullisimmin kun pallomaisia, pyöreitä soluja on 5 - 60 % ja hajoaminen (lyysis) on 40 - 95 %. Riittävä määrä virussuspen-, . siota otetaan talteen tavallisten bakteriologisten, virologis- ; ten ja mykologisten tarkastusten suorittamiseksi kontaminaa- : ·’ tioiden kontrollia koskevien kansainvälisten säädösten mukai- sesti. Seuraavaksi solut varastoidaan kokonaisina +4 °C:ssa, V · -20 °C:n ja -80 °C:n välisissä lämpötiloissa tai matalammissa lämpötiloissa, edullisesti -80 °C:ssa. Viljelmiä pidetään : tässä lämpötilassa, kunnes bakteriologiset, virologiset ja ; Γ; mykologiset tarkastukset on suoritettu loppuun. Jos kaikki tarkastukset täyttävät turvallisuusvaatimukset, talteenotetut virukset sulatetaan. Tämä tuhoaa yhä ehyeenä olevat solut ja vapauttaa siten soluihin sitoutuneen viruksen, mikä mahdollis-/ ' taa virustitterin kohoamisen. Solut rikotaan edullisesti toistuvalla pakastus- ja sulatusprosessilla, edullisimmin käsittelemällä ultraäänellä. Tätä seuraa vielä steriiliystar-kastus ja infektiviteettititterin tarkastus.

116557 17

Menetelmä heikennetyn parapox-viruksen viljelemiseksi ja monistamiseksi on sama kuin heikennetyn linturokkoviruksen, lehmänrokkoviruksen ja kanarialinnun rokkoviruksen kohdalla kuvattiin. Ainoa ero on primaaristen tai sekundaaristen lampaan munuaisviljelmien, naudan sikiön keuhkosoluviljelmien tai sellaisten eri solulinjojen kuin esimerkiksi vero-solujen tai MA-solujen (molemmissa tapauksissa kannat on otettu apinan sikiön munuaisista) käytössä soluviljelminä. Parapox-virus-suspensioiden valmistamiseen edullisia ovat vero-solut.

Keksinnön mukaisia monitehoisia paramuunisuusinduktoreita on mahdollista valmistaa myös käyttämällä rokkoviruskomponenttei-na ei-rekombinoitujen tai rekombinoitujen rokkovirusten irronneita vaippoja samoin kuin mainittujen vaippojen poikkeavia muotoja, joita syntyy viruspartikkelien epätäydellisessä synteesissä.

Virusvaipat valmistetaan edullisesti pilkkomalla virusvaippa irti virusytimestä (nukleokapsidista) sellaisella tavalla, .. että edellisellä tavalla saatujen rokkovirusten suspensioita inkuboidaan detergentin kanssa pelkistävissä olosuhteissa ja '· ‘ näin halkaistut viruspartikkelit erotetaan virusytimiksi ja * · virusvaipoiksi tiheysgradienttisentrifugoinnilla.

! ,· Toinen edullinen menetelmä rokkovirusten paramunisoivien ! ' virusvaippojen tai näiden vaippojen poikkeavien muotojen talteenottamiseksi on infektoida sellaiset soluviljelmät, ; ;*; jotka eivät ole vastaanottavia (not permissive) eri rokko- . viruslajeille. Eräs esimerkki tästä konstellaatiosta on heikennettyn ORF-viruksen viljely kanan sikiön fibroblasteis-sa. Kyseinen rokkoviruslaj i käy läpi abortiivisen lisääntymis- syklin ei-vastaanottavissa soluviljelmissä. Toisin sanoen inf ektoituj en solujen viroplasmavyöhykkeissä ei ole lopul-“·_· listen infektoivien viruspartikkelien kerääntymää. Viruksen syntetisoidut, abortiiviset esiasteet ("tyhjät vaipat", epätäydelliset muodot, poikkeavat muodot, jne.) sisältävät jo 116557 18 paramunisaatiota aikaansaavia rakenneproteiineja. Ne erittyvät viljelyalastaan tai voidaan vapauttaa infektoitujen solujen lyysillä. Ne eristetään, puhdistetaan ja konsentroidaan edellä pääpiirtein selostetuilla menetelmillä.

On edullista käyttää edellä mainittuja rokkoviruksia heikennetyssä muodossa edellä mainittujen virusvaippojen ja virusvaippojen poikkeavien muotojen valmistamiseen. Eräs edullinen menetelmä virusvaippojen valmistamiseksi kuvataan jäljempänä esimerkissä 6.

Keksinnön tarkoituksen puitteissa rokkoviruskomponenttina on mahdollista käyttää myös virusperäisiä polypeptidejä. Sellaiset virusperäiset polypeptidit ovat tavallisesti virusperäisiä paramunisointiominaisuuksilla varustettuja rakenneproteiineja, joita voidaan valmistaa monilla eri menetelmillä, tavallisesti puhdistamalla rokkoviruksilla infektoiduista soluviljelmistä. Nämä soluviljelmät ovat edullisesti niitä, jotka on edellä kuvattu, ja on mahdollista käyttää sekä niitä, joissa isäntä-solut ovat vastaanottavia infektoiville rokkoviruksille, että niitä, jotka eivät ole vastaanottavia rokkoviruksille. Virusperäiset polypeptidit puhdistetaan käyttämällä tavanomaisia . . biokemiallisia tai immunokemiallisia menetelmiä, esimerkiksi monoklonaalisten vasta-aineiden käytöllä immuuniaffiniteetti- I T t : ; kromatografiaan. Näillä prosesseilla puhdistettuihin edulli- siin proteiineihin kuuluvat esimerkiksi rokkovirusten rakenne- 1 * proteiinifraktiot, joiden molekyylipaino on 14 kDa (fuusiopro- teiini) tai 30 kDa (adsorptioproteiini). Fuusioproteiini stimuloi fagosytoosia, interferonisynteesiä ja interleukiinien ; ; : muodostumista. Adsorptioproteiini, joka on yleinen kaikille ’·, orto-rokkolaj eille (orthopox species), stimuloi NK-soluja, » » jyvässoluja ja makrofageja, ja käyttää vahvistajasoluja inter-N feronien ja tiettyjen interleukiinien muodostumisen aikaansaa- ’/·· miseen.

116557 19

Paraimmunisoivat virusperäiset polypeptidit voidaan ottaa talteen myös suoraan rokkoviruspartikkeleja pilkkomalla, jota seuraa eristys, fraktiointi (esim. molekyylipainon mukaan), puhdistus ja konsentrointi (esim. käyttämällä tiheysgradient-teja, ultrasentrifugointia, kromatografiaa, preparatiivista SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesia tai muita tavanomaisia prosesseja). Esimerkki 8 esittää menetelmän preparatiivi-silla SDS-polyakryyliamidigeeleillä saatujen virusperäisten polypeptidien puhdistamiseksi.

Paraimmunisointiominaisuuksilla varustettuja proteiineja koodaavien geenialueiden identifioinnin jälkeen, mikä on jo mainittu rekombinoitujen virusten valmistuksen yhteydessä, näin kloonattuja ja karakterisoituja DNA-alueita voidaan käyttää myös virusperäisten rekombinanttipolypeptidien valmistamiseen. Niiden valmistamiseen sopiviin ilmentymisjärjes -telmiin kuuluvat prokaryoottiset tai eukaryoottiset ilmenty-misvektorit, jotka perustuvat plasmideihin, faageihin tai viruksiin, esimerkiksi sellaiset, jotka sopivat ilmentämiseen E. colissa, hiivassa tai nisäkässoluissa. Erityisen sopivia ovat ne, jotka sopivat ilmentämiseen nisäkässoluissa.

Tavanomaisia geenitekniikan menetelmiä (A. Mayr: 'Virologische “· : Arbeitsmethoden', voi. 3, julkaissut Fischer Verlag, Jena, * » : ·' 1989) käytetään siirtämään DNA-alueet tunnetuilla tavoilla v faagi- tai plasmidivektoreihin tai viruksiin perustuviin vekto- v : reihin, ja ilmentämään niitä sopivissa isäntäsoluissa. Sitten ilmennetyt proteiinit puhdistetaan tavanomaisilla menetelmillä ; ja ne muodostavat raaka-aineen rokkoviruskomponenttien vastaa- . ville yhdistelmille. Rekombinantti-ilmentäminen ei ainoastaan mahdollista paramunisointiominaisuuksilla varustettua virus-polypeptidiä koodaavan DNA-alueen ilmentämistä, vaan sellaiset DNA-alueet voidaan myös kloonata ilmentämisvektoriin tavalla, joka johtaa tuloksena saadun viruspolypeptidin ilmentymiseen fuusioproteiinina. Useat polypeptidisekvenssit ovat sopivia fuusioproteiinikomponentteja fuusioitavaksi viruspolypepti-diosien kanssa, esim. bakteeriperäisestä - galaktosidaasista 116557 20 (IacZ) peräisin olevat sekvenssit; näitä komponentteja koo-daavat DNA-alueet ovat tavallisesti jo läsnä ilmentämiseen käytetyissä vektorijärjestelmissä. Kuitenkin tämän keksinnön puitteissa rokkoviruskomponenteiksi sopivat fuusioproteiinit voivat olla myös sellaisia kahden tai useamman eri viruspoly-peptidin fuusioita, jotka polypeptidit ovat peräisin eri paramunisoivista rokkoviruskannoista. Nämä viimeksi mainitut fuusioproteiinit yhdistävät eri rokkovirusten paramunisoivat polypeptidialueet yhteen polypeptidiin, ja ne saadaan liittämällä yhteen sopivassa järjestyksessä ja oikeassa lukukehyksessä kaksi tai useampia DNA-alueita, jotka koodaavat mainittuja polypeptidialueita.

Lisäpuhdistusmenetelmien käyttö saattaa olla välttämätöntä rokkoviruskomponenttien käyttämiseksi monitehoisina para-muunisuusinduktoreina ihmislääketieteessä. Esimerkiksi valmiste voidaan vielä puhdistaa käyttämällä per se tunnettuja lisäpuhdistusmenetelmiä, mukaan lukien ultrasentrifugointi, tiheysgradienttisentrifugointi, jne..

Rokkoviruskannat tai rekombinanttiviruskannat voidaan inakti-voida monilla eri käsittelymenetelmillä, esim. lämpökäsit- 1 · . telyllä, käyttämällä fysikaalisia tai kemiallisia tapoja tai 1 * pH-vaikutuksella. Inaktivointi tehdään edullisesti gammasätei- : lyllä tai käsittelyllä -propiolaktonin kanssa, ja käytetyt ’ menetelmät on tehtävä olosuhteissa, joissa paramunisointiomi- , . i V * naisuudet eivät tuhoudu.

li Edullisimmassa suoritustavassa heikennetty rokkovirus inakti- , voidaan -propiolaktonilla pH-alueella välillä 8-9. Käsittely -propiolaktonilla suoritetaan edullisesti seuraavissa olosuhteissa: t ;*’ Virussuspension pH säädetään pH-arvoon 8,6 käyttämällä i * ; NaHC03:a (8,8 % tislatussa vedessä). -propiolaktoni lai- : mennetaan alussa 1:10 tislatulla vedellä ja sopivia varo toimenpiteitä noudattaen lisätään virussuspensioon suhteessa 0,5-100. Tämä vastaa -propiolaktonin 0,05 %:n laimennusta.

116557 21 Tätä suspensiota sekoitetaan 1 tunnin ajan jääkaappilämpötilassa (+4 °C - +8 °C) ja 4 tunnin ajan 37 °C:ssa, ja varastoidaan sitten jääkaappiin noin 12-18 tunniksi (yli yön) . Inaktivoitu suspensio puhdistetaan sentrifugoimalla 10 minuutin ajan 2600 rpm:llä. Sitten pH tarkistetaan jälleen ja säädetään tarpeen mukaan uudelleen.

Todisteena inaktivoinnista on CEF-viljelmien siirrostus testinäytteillä, jotka sisältävät riittävän määrän käsiteltyä materiaalia. Mikäli tyypillisiä solun ulkonäkömuutoksia (sytopaattisia muutoksia) ei ole kehittynyt 9 päivään mennessä siirrostuksesta, tämän katsotaan osoittavan inaktivaation olevan täydellinen. Mikäli inaktivoitumattomasta virusjäännöksestä on mitä tahansa epäilyä, suoritetaan kolme alisiirrostus-vaihetta (subpassages). Lisäksi suoritetaan toinen tarkastus virusten, bakteerien tai sienten kontaminaatioiden suhteen sopivissa viljelmissä tai sopivalla kasvualustalla, samoin kuin tarkastelu elektronimikroskooppia käyttäen.

On edullista kyömäkuivata rokkoviruskomponenttien liuokset tai suspensiot puhdistuksen jälkeen. Ennen kylmäkuivausta rokko- tt viruskomponentteihin lisätään edullisesti sopivia stabilointi aineita. Kun käytetään heikennettyjen rokkovirusten suspen-*, ; sioita rokkovirussuspensioon lisätään sellaisia stabilointi- aineita kuin esimerkiksi Kollidon , Molico (vähärasvainen maitojauhe) tai gelatiini. Edullisimmassa suoritustavassa ;;; lisätään sukkinyloitua gelatiinia (valmistaja Hausmann of St.

’ Gallen, Sveitsi) 2,5 %:n lopulliseen konsentraatioon. Ennen gelatiinin lisäystä (50 % konsentraatio), sen pH on säädettävä arvoon 8,0. Tämä koskee myös muita stabilointiaineita.

.\\ Lopullinen valmiste jaetaan osiin, esim. 2 ml:n eriin, ja ,, kylmäkuivataan. Kylmäkuivattu moni tehoinen paramuunisuus- ’(* induktori pysyy stabiilina ainakin 10 vuoden ajan varastoitaes- ·; sa +4 °C:n ja +8 °C:n välisissä tai alhaisemmissa lämpötilois- ·.'·· sa. Kylmäkuivatun tuotteen tehokkuusyksiköt, jotka määritet tiin VSV-altistustestillä tai soluviljelmän altistustestillä, 116557 22 eivät muutu ainakaan 10 vuoden aikana näissä olosuhteissa ("tehokkuusyksikkö" määritellään jäljempänä). Ennen lopullista varastointia lyofilisaatin puhtaus tutkitaan jälleen bakteriologisesta, virologisesti ja toksikologisesta.

Edellä kuvatulla tavalla valmistetut rokkoviruskomponentit keksinnön mukaisten paramuunisuusinduktorien valmistamista varten yhdistetään toistensa kanssa erilaisissa sekoitussuhteissa niiden tehokkuuden voimistamiseksi. Heikennettyjen rokkovirusten tapauksessa sekoitussuhde on edullisesti 1:1. Yhdistelmät ovat mahdollisia myös esimerkiksi seuraavissa sekoitussuhteissa: 1. linturokkovirus ja parapox-virus 5:1 - 1:5, edullisesti 2:1 - 1:2, 2. linturokkovirus, parapox-virus ja MVA-lehmänrokkovirus 6:3:1 - 1:3:6, edullisesti 6:3:1, edullisimmin 1:1:1, 3. linturokkovirus, parapox-virus, MVA ja kanarialinnun rokkovirus suhteessa 1:1:1:1.

Vastaavia sekoitussuhteita voidaan käyttää myös muihin keksinnön mukaisiin rokkoviruskomponentteihin. Muut sekoitussuhteet ovat kuitenkin yhtä sopivia keksinnön mukaisten monitehoisten paramuunisuusinduktorien valmistamiseen.

% ·

Rokkoviruskomponenttien yhdistelmä keksinnön mukaisten moni-tehoisten paramuunisuusinduktorien valmistamiseksi voi tapah-!! tua niiden valmistusprosessin eri vaiheissa, edullisesti ennen • niiden inaktivointikäsittelyä, ennen kylmäkuivausta tai kylmäkuivauksen jälkeen. Jos rokkoviruskomponentteinä käyte-’>··' tään rokkoviruksia, on edullista yhdistää komponentit ennen *.· · kuin ne inaktivointikäsitellään.

,··*. Sekä keksinnön mukaisten monitehoisten paramuunisuusindukto rien että yksittäisten rokkoviruskomponenttien tehokkuus ’· voidaan osoittaa monilla eri menetelmillä: VSV-infektiomallia '. 1: hiirenpoikasessa käytetään in vivo -osoituksena; katso Mayr et ai. (1986), ibid. Tätä mallia voidaan käyttää samaan aikaan 116557 23 tehokkuusyksiköiden (UE/ml) määrittämiseen. Taulukko 1 esittää PIND-AVI:n ja PIND-ORF:n eri laimennusten tehokkuuden VSV-testissä. Valmisteen tai laimennusasteen tehokkuusindeksi lasketaan seuraavan kaavan mukaan: b - a

Tehokkuusindeksi (EI, efficacy index) = _ x 100 b a = testiryhmän kuolleisuus-% b = kontrolliryhmän kuolleisuus-%

Laimennusaste, jolla saavutetaan vielä vähintään tehokkuus-indeksi 20, sisältää 1 UE/0,1 ml (infektioannos hiirenpoikasta kohti), tai 10 UE/ml. PIND-AVI:n esimerkissä lopullinen titteri on 1:16, minkä mukaan erä sisältää 160 UE/ml).

Monia eri testimenetelmiä voidaan käyttää sekä keksinnön mukaisten paramuunisuusinduktorien että yksittäisten rok-koviruskomponenttien tehokkuuden in vitro -osoituksena: a) vatsakalvon NK-solujen aktiivisuus 24 tuntia PIND-AVI-käsittelyn jälkeen 4 tunnin kromi-51:n vapautumistestissä; Mayr et ai. (1986), ibid., b) pesäkettä stimuloiva aktiivisuus hiirten seerumissa 8 : tuntia käsittelyn jälkeen; katso G. Wolf, 1986: 'Kolonies- ·. timulierende Aktivität in Mäuseseren nach Vorbehandlung mit

Inducern aus Pockenviren und anderen Mikroorganismen1 ,- Czerny i ! 1990, ibid. , ja c) interferonisynteesi yksitumaisissa valkosoluissa ääreis- veressä; katso M. Steinmassl ja G. Wolf, 1990: 'Bildung von ', · Interleukin-2 und Interferona durch mononukleäre Leukozyten des Schweines nach in vitro-Stimulation mit verschiedenen ,' Viruspräparaten1, J. Vet. Med. B 37 s. 321- 331.

"> Kuitenkin myös vaihtoehtoisia toteamismenetelmiä voidaan , *: käyttää, esimerkiksi tuumorinekroositekijän (TNF) aktiivisuu den mittaamista esikäsitellyissä kaneissa tai hiirissä L929- 1 1 6557 24 sytotoksisuustestissä, Aujeszky-viruksella tehty altistuskoe aikuisessa hiiressä, pesäkettä stimuloivan aktiivisuuden (CSA) määritys eri eläinten seerumissa ja granulosyyttiaktiivisuuden mittaaminen ihmisissä ja eläimissä "FACS-analysaattorissa" (partikkelin talteenotto, "hengityspurkaus").

Edellä mainituilla menetelmillä saatuja monitehoisia paramuuni-suusinduktoreita voidaan käyttää raaka-aineena lääkkeinä käytettävien farmaseuttisten koostumusten valmistamiseen. Tätä tarkoitusta varten lyofilisaattiin voidaan lisätä yleisiä farmaseuttisia apuaineita alkutilavuuden mukaisesti, edullisesti steriiliä, pyrogeenitöntä, tislattua vettä. Tämä formulaatio sopii sekä parenteraaliseen (esim. intramuskulaariseen tai subkutaaniseen) että paikalliseen antoon. Keksinnön mukaiset monitehoiset paramuunisuusinduktorit ovat myrkyttömiä, pyrogee-nittömiä, eivätkä esimerkiksi aiheuta poikkeavia rokotuksen-jälkeisiä reaktioita intramuskulaarisesti injektoituna.

Keksinnön mukaiset farmaseuttiset koostumukset sisältävät myös muita formulaatioita. Esimerkkeihin paikalliseen applikaatioon tarkoitetuista formulaatioista kuuluvat imeskelytabletit, voiteet, peräpuikot, nenätipat, nenäsumutteet, jne. Esimerkkeihin parenteraaliseen applikaatioon tarkoitetuista formulaa-tioista kuuluvat injektiovalmisteet. Ne valmistetaan per se ' tunnetuilla menetelmillä.

*

Muihin esimerkkeihin keksinnön puitteissa sopivista farmaseuttisten koostumusten formulaatioista kuuluvat rektaaliset tai vaginaaliset lääkepuikot. Niitä voidaan jommassa kummassa muodossa käyttää hoitamaan peräpukamia ja emätintulehdusta tai - ‘ muita emätinvaurioita. Niiden valmistuksessa on noudatettava ; varovaisuutta sen varmistamiseksi, että kantajan aineosat, esim. ne, joilla on proteolyyttistä aktiivisuutta, eivät vaikuta haitallisesti steriiliyteen ja stabiiliuteen.

'· '· Ennaltaehkäisevää käyttöä varten monitehoisia paramuunisuus- induktoreita annetaan edullisesti 1-3 kertaa 24 tunnin välein.

116557 25

Terapeuttiseen käyttöön on, tietyn tilan vakavuudesta riippuen, edullista suorittaa päivittäin 1-3 käsittelyä 3-5 päivän aikana tai kunnes kliiniset oireet rauhoittuvat. Annos riippuu hoidettavista oireista ja valitusta antotavasta. Parenteraali-sessa applikaatiossa tavallinen annos on yleensä 2 ml, yksi annos sisältää edullisesti vähintään 160 tehokkuusyksikköä. Annosta ja applikaatiomenetelmää on kuitenkin mahdollista vaihdella niin, että ne sopivat yksilöllisiin tilanteisiin.

Seuraavien esimerkkien on tarkoitus selventää keksintöä edelleen.

Esimerkki 1

Keksinnön mukaisen rokkoviruskomponentin valmistamiseen käytetty lähtöaine oli linturokkokanta HP1, joka oli eristetty yleissairastavasta (generalized diseased) kanasta ja heikennetty 440 viljelysiirrostusvaiheessa kanan sikiön fibroblas-ti-(CEF)-viljelmissä. Kloonivalinta käyttämällä lopullista plakkilaimennustekniikkaa sekä immunogeenisuuden ja paramuni-sointitehokkuuden kontrollitestit suoritettiin säännöllisin väliajoin heikennyssiirrostusvaiheiden aikana. Keksinnön mukaisen rokkoviruskomponentin valmistamiseen käytettiin 440.

: CEF-siirrostusvaihetta, joka oli vielä läpikäynyt kloonivalin- nan kolmessa viimeisessä siirrostusvaiheessa plakkiteknii- t kalla, jolloin voimme työskennellä genettisesti yhtenäisen ; '! materiaalin kanssa. Taulukko 2 tuo esiin varhaisesta ja myöhemmästä soluviljelysiirrostusvaiheesta peräisin olevan virusmateriaalin väliset erot paramunisointitehokkuudessa.

v : CEF-viljelmät valmistettiin muunnetulla menetelmällä, joka ‘ perustui yleiseen tekniikkaan, jossa viljellään kokonaista "·. kanan sikiötä (pää ja sisälmykset mukaan lukien); katso A.

• ( Mayr, P. A. Bachmann, B. Bibrack ja G. Wittmann, 1974: 'Vi- ’· rologische Arbeitsmethoden' , voi. 1, VEB Gustav Fischer - *: Verlag, Jena. Yleistä tekniikkaa muunnettiin käyttämällä kokonaan synteettistä kasvualustaa, joka sisälsi 10 % BMS:ää 116557 26 (seeruminkorvauskasvualusta), 10 % laktalburaiinihydrolysaattia ja MEM:ää (minimal essential medium). Yksikerroksiset soluviljelmät, joiden tiheys oli noin 90 %, siirrostettiin viruskannalla HP1, 440. siirrostusvaihe, infektiviteettititteri 107'5 TCIDgo/nil. Käytettiin infektioannosta 107 TCID50/IOO ml. MEM:ää (ilman antibiootteja) käytettiin ylläpitokasvualustana. Virus otettiin talteen kun solumatto oli transformoitu virus-spesifiseksi määrään 5-100 %. Kaikki jäljelle jäänyt solumatto irrotettiin ravistelemalla viljelypulloja. Soluja sisältävää viruskasvualustaa käsiteltiin ultraäänellä, jotta vielä kokonaisina olevat solut saatiin rikottua (3 minuutin ajan 40- 50 watilla Branson-sonikaattorilla).

Virussaannosta otettiin näytteet steriiliyden ja infektiivi-syyden tarkastamiseksi. Vain niitä virussaantoja käsiteltiin edelleen, joissa ei ollut kontaminaatiota (esim. bakteereita, viruksia, sieniä, mykoplasmoja) ja joiden infektiivisyystit-teri ei ollut alle 107'25/ml. Virussaantoja voidaan varastoida +4 tai -80 °C:ssa ennen lisäkäsittelyä.

Virusmateriaalin pH säädettiin arvoon 8,6 ennen inaktivoinnin aloittamista -propiolaktonilla. -propiolaktonia lisättiin konsentraatioon 0,05 %. Seuraavaksi reaktioseos inaktivoitiin l sekoittamalla sitä 1 tunnin ajan jääkaapissa, mitä seurasi 4 /.·, tuntia inkubaattorissa (37 °C:ssa). Inaktivaatioprosessi päätettiin varastoimalla virussuspensiota levossa jääkaapissa yli yön. Inaktivoitu virussuspensio puhdistettiin karkeasti sentrifugoimalla 2600 rpm:llä. Näin talteenotettu induktori nimettiin PIND-AVI:ksi ja säilytettiin lämpötiloissa +4 °C tai -60 °C ja kylmäkuivattiin sen jälkeen kun kontrollitestit oli ‘ suoritettu loppuun.

. ·, Tuloksena saatujen heikennettyjen rokkovirussuspensioiden spesifisyys, puhtaus ja vaarattomuus testattiin niin, että ne 1 '* täyttivät Euroopan farmakopean vaatimukset seuraavien kritee- • 7 reiden suhteen: 116557 27 1. Elektronimikroskooppitarkastelu yleisillä menetelmillä toi valmisteessa esiin tyypillisiä rokkoviruspartikkeleita, joista jotkin olivat tyhjiä. Valmisteessa ei ollut muita mikrobi -rakenteita.

2. Yleiset mikrobikontaminaatiotarkastukset osoittivat, että valmisteessa ei ollut muita viruksia, bakteereita, sieniä eikä mykoplasmoj a.

3. Toksisuus, teratogeenisuus ja pyrogeenisuus tutkittiin Euroopan farmakopean ohjeiden mukaisesti, eikä mitään positiivisia tuloksia havaittu.

4. Ei-inaktivoidun jäännösviruspitoisuuden tarkastus: tämä tehtiin titraamalla lopullinen rokkovirusvalmiste CEE- viljelmissä tavallisella tavalla. Seuraavissa 3 siirrostusvaiheessa jäännösviruspitoisuus oli nolla.

PIND-AVI-rokkoviruskomponentin paramunisointivaikutus osoitettiin käyttämällä VSV-infektiomallia. Taulukossa 1 luetellaan saadut tulokset.

*Esimerkki 2 i = *

Keksinnön mukainen rokkoviruskomponentti valmistettiin heikennetystä MVA-lehmänrokkoviruksesta FCE-viljelmissä, kuten < · 1 [ esimerkissä 1. Kuten taulukosta 2 voidaan nähdä, viruskannan paramunisointiaktiivisuutta vahvistettiin heikentämällä vähintään 500 viljelysiirrostusvaiheella. Puhtaus-, vaaratto-·' muus-, spesifisyys- ja tehokkuustestit suoritettiin, kuten ' ’ esimerkissä 1 on pääpiirteittäin esitetty. Saatiin samat tulokset kuin esimerkissä 1, ja näistä tuloksista esitetään yhteenveto taulukossa 2.

Esimerkki 3 »

Heikennetystä kanarialinnun rokkoviruksesta, kannasta KP1, 116557 28 saatu rokkoviruskomponentti valmistettiin CEF-viljelmissä, esimerkissä 1 pääpiirteittäin esitetyllä tavalla. Kuten taulukosta 2 voidaan nähdä, viruskannan paramunisointiaktiivi-suutta vahvistettiin heikentämällä vähintään 390 viljelysiir-rostusvaiheella. Puhtaus-, vaarattomuus-, spesifisyys- ja tehokkuustestit suoritettiin, kuten esimerkissä 1 on pääpiirteittäin esitetty. Saatiin samat tulokset kuin esimerkissä 1, ja näistä tuloksista esitetään yhteenveto taulukossa 2.

Esimerkki 4

Keksinnön mukainen rokkoviruskomponentti valmistettiin heikennetystä parapox-viruksesta, kannasta D 1701, MA- tai vero-soluissa (pysyvä apinan munuaissolulinja), kuten esimerkissä 1 on esitetty. Kuten taulukosta 2 voidaan havaita, viruskannan paramunisointiaktiivisuutta vahvistettiin heikentämällä vähintään 170 viljelysiirrostusvaiheella. Puhtaus-, vaarattomuus-, spesifisyys- ja tehokkuustestit suoritettiin, kuten esimerkissä 1 on pääpiirteittäin esitetty. Saatiin samat tulokset kuin esimerkissä 1.

Taulukoissa 1 ja 2 esitetään yhteenveto tuloksista, jotka saatiin yksittäisille komponenteille (esimerkkien 1-4 tuot- : teet) .

« »

Esimerkki 5 t ·

Keksinnön tarkoittaman monitehoisen paramuunisuusinduktorin valmistus aikaansaatiin kussakin tapauksessa sekoittamalla ' kahta heikennettyä, inaktivoitua rokkovirussuspensiota, jotka v * on kuvattu esimerkeissä 1-4, 1:l-valmisteeksi. Valmistettiin / seos rokkoviruskomponenteista PIND-AVI ja PIND-ORF, kuten myös rokkoviruskomponenteista linturokkovirus HP1 ja parapox-virus f ORF D 1701. Kuten taulukosta 1 ja kuvasta 1 voidaan havaita, ”· induktorien yhdistäminen voimistaa paramunisointitehokkuutta.

1 (Jos vaikutus olisi additiivista, sekä yksittäisten laimennus ten tehokkuusindeksit että niiden UE/ml pysyisivät muuttumat- 29 116557 tornina). Tämän osoittaa kuvatussa tapauksessa selvästi nousu kahdessa parametrissä, kussakin erikseen niin paljon kuin 20-40 %:lla (yhdistelmän tehokkuusindeksi verrattuna D 1701:n ja vastaavasti HPl:n 1:8-laimennuksiin) ja 200-400 %:lla (yhdistelmän UE/ml verrattuna D 1701:een ja vastaavasti HPlreen). Puhtaus-, vaarattomuus-, spesifisyys- ja tehokkuustestit suoritettiin, kuten esimerkissä 1 pääpiirteittäin on esitetty. Saatiin samat tulokset kuin esimerkissä 1 kohonnutta paraspe-sifisyysaktiivisuutta lukuunottamatta.

Esimerkki 6

Lehmänrokkovirusta, linturokkovirusta HP1 ja parapox-virusta ORF D1701 heikennettiin, kuten esimerkissä 1, ja heikentämisen vaikutusta paramunisointitoimintaan verrattiin testissä, jossa mitattiin interferonisynteesin indusoituminen ääreisveren yksitumaisissa valkosoluissa. Taulukossa 3 esitetään tulosten yhteenveto.

Esimerkki 7

Keksinnön mukaisen rokkoviruskomponentin valmistamiseksi ·, MVA-lehmänrokkoviruksen ja parapox-viruksen ORF D1701 suspen- sioiden proteiinipitoisuus säädettiin 2 mg/ml:ksi PBS:llä ja . suspensioita inkuboitiin l%:isella Nonidet P- 40:llä (NP-40; ; .* Sigma) ja 50 μΐ-.lla 2-merkaptoetanolia 60 minuutin ajan 37 1 ; °C:ssa. Viruksen ytimistä (core) koostuva pelletti saatiin sen » ’ jälkeen, kun alusta oli pohjustettu 3,5 ml:11a 36%:ista « sakkaroosipohjaa (sucrose cushion) (w/v, PBS:ssä) ja sentri-fugoitu 45 minuutin ajan ultrasentrifugilla Beckmann SW-60 • Ti-Rotor -laitteessa 40 000 rpm:llä (230 000 g) 4 °C:ssa.

: Irronneet virusvaipat olivat supernatantissa. Supernatanttia dialysoitiin perusteellisesti PBS:ää vastaan ja käytettiin sen 1 jälkeen keksinnön mukaisten monitehoisten paramuunisuusinduk- torien valmistamiseksi.

- * 116557 30

Esimerkki 8

Yksittäisten virusproteiinivyöhykkeiden eristämiseksi valmistettiin 12%:iset SDS-polyakryyliamidigeelit. Käytetyt puskurit ja liuokset olivat, kuten esitetään artikkeleissa U.K. Laemmli (1970), 'Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T41 , Nature 227: 680-685, ja A. Mayr, P.A. Bachmann, B. Bibrack, G. Wittmann, 1989, 'Virolo- gische Arbeitsmethoden, Teil III: Biochemische und biophysi- kalische Methoden', Gustav Fischer Verlag, Jena. MVA-lehmän-rokkoviruksen ja parapox-viruksen CRF D1701 suspensioita keitettiin 50 μΐ-.ssa näytepuskuria. Näytteistä pantiin 50 μ1:η erät jokaiseen geeliuraan, mikä merkitsi 10 μg:n virusmäärää uraa kohti. Seuraavaksi virusproteiinit eroteltiin elektrofo-reettisesti 50 V:lla ja 20-30 mA:lla noin 16 tunnin ajan. Kaksi molekyylipainostandardia (MW SDS-70L-pakkaus ja MW SDS-200-pakkaus, Sigma) ajettiin yhtä aikaa proteiinien identifioimiseksi, ja nämä kattoivat 14 300:n ja 205 000:n dalto-nin välisen alueen. Erottelun jälkeen merkkiproteiinien kaistat ja yksi kaista, jolla virusproteiinit oli eroteltu, leikattiin irti ja hopeavärjättiin merkkivyöhykkeiden paikallistamiseksi. Muu osa proteiinigeelistä pidettiin sillä aikaa elektrodipuskurissa 4 °C:ssa. Käyttämällä hopeavärjättyä I geelisuikaletta ohjeena, kaikki noin 14 kD:n molekyylipaino- alueella olevat proteiinivyöhykkeet irrotettiin leikkaus-veitsellä. Jokaisessa tapuksessa kuusi tällaista geelipalaa (tilavuudeltaan noin 0,5 ml) pantiin sitten vuorostaan niille • * tehtyihin koloihin Extraphor elektroforeettiseen rikastuslait- teeseen (Pharmacia LKB) . Eri proteiinivyöhykkeitä eluoitiin * t t geelipaloista 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja 100 * V:lla, ja samalla niitä saostettiin "hyvin suolapitoisessa puskurissa" ("high-salt buffer"). Saostuneet proteiinit poistettiin, yhdistettiin ja sentrifugoitiin 30 minuutin ajan 10 000 rpm:llä. Sedimentti resuspendoitiin 1 ml:aan PBS:ää ja f ? • Ί dialysoitiin yli yön 4 °C:ssa dialyysiputkessa, jossa oli 8 ! ) ','!; kD:n molekyylikoon yläraja, minkä jälkeen valmisteita sentri fugoitiin 30 minuutin ajan 10 000 rpm:llä steriileissä olo- 31 116557 suhteissa ja käsiteltiin sitten monitehoisten paramuunisuus-induktorien valmistamiseksi, kuten edellä on kuvattu.

Esimerkki 9

Eri rokkoviruskomponenteille tehtiin VSV-testi niiden paramuni-sointiominaisuuksien vertaamiseksi. Rokkoviruskomponentteja PIND-AVI ja PIND-ORF sekä ORF-proteiinia 4D9, joka oli puhdistettu soluviljelmistä immunoaffiniteettikromatografiaa käyttäen, verrattiin rekombinantti- rokkovirukseen PIND-AVI + ORF 4D9, johon ORF 4D9 -polypeptidiä koodaava DNA-kappale oli asetettu homologisella rekombinaatiolla. Kuten taulukon 4 perusteella voidaan ymmärtää, monitehoisen paramuunisuusinduk-torin vaikutus oli selvästi kohonnut yli yksittäisten komponenttien vaikutuksen.

Esimerkki 10

Yhdistettyjen monitehoisten paramuunisuusinduktorien tehostava vaikutus verrattuna yksittäisten komponenttien vaikutukseen osoitettiin kromi-51:n vapautumistestissä; katso Mayr et ai., 1986, ibid. Vertailussa käytettiin rokkoviruskomponentteja PIND-AVI ja ORF-proteiini 4D9 (viimeksi mainittu oli puhdis-; '* tettu sellaisten solujen solusupernatanteista, jotka oli aikaisemmin infektoitu parapox-viruksella ORF D1701) · PIND-AVI:n ja ORF-proteiinin 4D9 yhdistelmään. Kuva 2 esittää : saadut tulokset.

e ·

Claims (13)

116557

1. Paramuunisuusinduktori, joka perustuu rokkoviruskomponent-teihin, tunnettu siitä, että paramuunisuusinduktori sisältää kahden tai useamman rokkoviruskomponentin yhdistelmän, jotka komponentit ovat peräisin eri rokkoviruskannoista, joilla on paramunisointiominaisuuksia.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen paramuunisuusinduktori, tunnettu siitä, että rokkoviruskomponentit ovat rokko-viruksia .

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen paramuunisuusinduktori, tunnettu siitä, että yksi tai useampi rokkoviruskom-ponenteista on linturokkovirus HP-1, parapox-virus ORF D1701, lehmänrokkovirus MVA tai kanarialinnun rokkovirus KP-1, jotka on vastaavasti identifioitu ECACC-talletusnumeroilla V94012709, V94012706, V94012707 ja V94012708.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen paramuunisuusinduktori, tunnettu siitä, että rokkoviruskomponentit ovat virus-vaippoja tai virusvaippojen poikkeavia muotoja, jotka virus- : vaipat ovat peräisin rokkoviruksista.

5. Patenttivaatimusten 2 tai 3 mukainen paramuunisuusin- ;;; duktori, tunnettu siitä, että rokkovirukset on inakti- *’ ’ voitu. : : : 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen paramuunisuusinduktori, tunnettu siitä, että rokkovirukset on inaktivoitu käsittelemällä β-propiolaktonilla pH-alueella 8-9.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen paramuunisuusinduktori, ’ * '·* tunnettu siitä, että rokkoviruskomponent it ovat yksit- » » # n täisiä virusproteiineja, jotka on saatu biokemiallisilla tai 116557 immunokemiallisillä menetelmillä viljelmistä, jotka on infek-toitu rokkoviruksilla.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen paramuunisuusinduktori, tunnettu siitä, että rokkoviruskomponentit ovat rekom-binanttiviruspolypeptidejä, jotka on otettu talteen proka-ryoottisella tai eukaryoottisella ilmentämisellä, joista polypeptideistä ainakin osa on peräisin yhdestä tai useammasta rokkovirusten viruspolypeptidistä.

9. Jonkun patenttivaatimuksista 2, 4, 5, 6, 7 ja 8 mukainen paramuunisuusinduktori, tunnettu siitä, että rokko-virukset on juuri eristetty.

10. Jonkun patenttivaatimuksista 2, 4, 5, 6, 7 ja 8 mukainen paramuunisuusinduktori, tunnettu siitä, että rokko-virukset on heikennetty.

11. Patenttivaatimusten 9 tai 10 mukainen paramuunisuusinduktori, tunnettu siitä, että rokkovirukset on rekom-binoitu. t *

12. Menetelmä paramuunisuusinduktorien valmistamiseksi, « tunnettu siitä, että yhdistetään kaksi tai useampia *· * rokkoviruskomponentteja, jotka ovat peräisin eri rokkoviruskan- , noista, joissa on paramunisointiominaisuuksia. > ♦ · » k ·

13. Sellaisten paramuunisuusinduktorien käyttö farmaseuttis- • ten koostumusten valmistamiseen, jotka perustuvat eri rokko-viruskannoista peräisin olevien rokkoviruskomponenttien yhdistelmiin. i » » ♦ » » * I 116557