FI113763B - Nipekotiinihappojohdannaisia hyytymistä estävinä aineina - Google Patents

Description

113763

Nipekotiinihappojohdannaisia hyytymistä estävinä aineina

Keksinnön tausta Tämä on cip-hakemus hakemukselle, jonka sarjanumero 5 on 08/364 896 ja joka on jätetty 27. joulukuuta 1994 ja joka hakemus on cip-hakemus hakemukselle, jonka sarjanumero on 08/213 772 ja joka on jätetty 16. maaliskuuta 1994.

Verihiutaleiden kasautuminen on alkuperäinen hemo-staattinen vaste vuodolle, joka on verisuonivaurion ai-10 heuttama. Tämän normaalin hemostaattisen prosessin pato loginen laajeneminen voi kuitenkin johtaa tulpan muodostumiseen. Viimeinen yleinen tapahtuma verihiutaleiden kasautumisessa on fibrinogeenin sitoutuminen aktivoituun, alttiina olevaan verihiutaleen GPIIb/IIIa:hän. Aineet, jotka 15 häiritsevät fibrinogeenin sitoutumista verihiutaleglyko- proteiini IIb/IIIa:han (GPIIb/IIIa), estävät siten verihiutaleiden kasautumista. Nämä aineet ovat siten käyttökelpoisia hoidettaessa verihiutalevälitteisiä hyytymishäiriöitä, kuten valtimo- ja laskimotulppia, akuuttia sydän-20 lihasinfarktia, epästabiilia kipua, uusiotukosta, joka on seurausta tulppien liuotushoidosta ja verisuonikirurgiasta, • tulehdusta ja erilaisia verisuonten tukkeumahäiriöitä.

: Fibrinogeenireseptori (GPIIb/IIIa) aktivoituu ärsykkeistä, ·· jollaisia ovat ADP, kollageeni ja trombiini, paljastaen • t * : .·. 25 sitoutumispaikkoj a f ibrinogeenin kahdelle eri peptidi- • · · » ; alueelle: α-ketju Arg-Gly-Asp (RGD) ja γ-ketju His-His-Leu- • · » ]!!.* Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val (HHLGGAKQAGDV, γ400- • · · ’ 411). Koska näiden peptidipalasten on itse osoitettu anta- gonisoivat (estävän) fibrinogeenin sitoutumista GPIIb/III- I i i ·.'* 30 a:han, näitä jäljittelevät palaset voisivat myös toimia • · * antagonistina. Itse asiassa ennen tätä keksintöä mahdol-

t * I

2 113763 lisiä RGDrhen pohjautuvia tai RGD:tä jäljitteleviä antagonisteja on tuotu esille, ja ne estävät sekä fibrinogeenin sitoutumisen GPIIb/IIIa:hän että verihiutaleiden kasautumisen. Joillakin näistä aineista on myös ollut tehoa in 5 vivo hyytymistä estävinä aineina, ja joissakin tapauksissa niitä on käytetty myös fibrinolyyttisen hoidon yhteydessä (esim. t-PA tai streptokinaasi) .

Keksinnössä esille tuotava asia

Esillä oleva keksintö koskee yhdisteitä, joilla on 10 yleinen kaava (I): X1 f'n'Z'co,r6

V RJ

15 1

X2 Y-A

jossa X1, X2, Y, Z, R2 ja A ovat kuten edellä määriteltiin. Tällaiset yhdisteet, jotka perustuvat fibrinogeeni 20 y-400-411:n rakenteellisiin ominaisuuksiin, ovat veri hiutaleiden kasautumista estäviä aineita, jotka ovat käyt-/· tökelpoisia hoidettaessa verihiutalevälitteisiä hyytymis- : häiriöitä, kuten valtimo- ja laskimoveritulppia, akuuttia ··* sydäninfarktia, tukkeuman liuotushoidon ja verisuonikirur- • · · · : 25 gian jälkeistä uusiotukkeutumista, tulehdusta ja epästa- • · * · : ,·, biilia kipua sekä erilaisia verisuonten tukkeumahäiriöitä.

Nämä yhdisteet ovat käyttökelpoisia myös hyytymistä estä- t · · * vinä aineina käytettäessä yhdessä fibrinolyyttisen hoidon (esim. t-PA tai streptokinaasi) kanssa. Lääkekoostumukset, I » · 30 jotka sisältävät näitä yhdistietä, ovat myös osa keksintöä.

« t · 3 113763

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Tarkemmin esillä oleva keksintö koskee yhdisteitä, joilla on seuraava kaava (I); 5 X1 "*'co,n* k>r R2 Λ

10 X2 Y-A

jossa X1 ja X2 ovat samojaa tai erilaisia ja ne on valittu H2:sta tai 0:sta. Edullisesti sekä X1 että X2 ovat O.

15 Y on (CH2) mr CH (NHCOR3) (CH2)m tai CH(NH2) (CH2)m.

A on NHR1, C(NH)NH2 tai sykloalkyylirengas, jossa on typpiatomi ja joka rengas on valittu seuraavista: piperi- din-2-yyli, piperidin-3-yyli, piperidin-4-yyli, pyrrolidin-2-yyli ja pyrrolidin-3-yyli. Edullisemmin rengas on valittu 20 seuraavista: piperidin-2-yyli, piperidin-3-yyli tai piperidin-4-yyli.

V,: Z on (CH2) n tai CH(C02R4) (CH2)n. Edullisesti Z on :T: (CH2)2.

· R1 on H, Ci-8-alkyyli tai CH(NH)NH2. Edullisemmin R1 t * « > : 25 on H tai alkyyli. Edullisimmin R1 on vety.

: R2 on H tai Ci-s-alkyyli. Edullisesti R2 on vety.

• < t ‘1!.’ R3 on Ci-8-alkoksi tai Ci-s-alkyyli. Edullisesti R3 on t-butoksi tai metyyli. Edullisimmin R3 on t-butoksi.

R4 on Ci-s-alkyyli tai fenyyli-Ci-8-alkyyli, kuten *·- 30 bentsyyli, tai naftyyli-Ci-8-alkyyli. Edullisesti R4 on metyyli.

:v. R6 on H, Ci-s-alkyyli tai fenyyli-Ci-8-alkyyli, kuten ,··*, bentsyyli, tai naftyyli-Ci-8-alkyyli. Kun R6 on jokin muu kuin H, se on prodrug-muodossaan.

,,, 35 m on kokonaisluku 0, 1, 2 tai 3.

: n on kokonaisluku 0, 1 tai 2.

4 113763

Esillä olevan keksinnön yhdisteet voivat myös olla farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan muodossa. Farmaseuttisesti hyväksyttävä suola on tavallisesti muodossa, jossa 1- piperidiinisubstituentissa oleva typpi on protonoitunut 5 epäorgaanisen tai orgaanisen hapon kanssa. Kun X2 on H2, rengastyppi voi kuitenkin olla altiina suolan muodostukselle. Esimerkkeinä orgaanisista tai epäorgaanisista hapoista ovat kloorivety-, bromivety-, jodivety-, perkloori-, rikki-, typpi-, fosfori-, etikka-, propioni-, glykoli-, mai-10 to-, meripihka-, maleiini-, fumaari-, omena-, viini-, sitruuna-, bentsoe-, manteli-, metaanisulfoni-, hydrok-sietaanisulfoni-, bentseenisulfoni-, oksaali-, pamoiini-, 2- naftaleenisulfoni-, p-tolueenisulfoni-, sykloheksaani-sulfamiini-, salisyyli-, sakkariini- tai trifluorietik- 15 kahappo.

Erityisesti edullisia esilä olevan keksinnön yhdisteitä ovat yhdisteet, joiden kaava on:

O

20 YsA /(CH2)nC02R6 (T!

N

:·Γ 25 O^Y^fCHj^NHR

;1Y R5 * · · # « » * < · · · · • 1 · * R = H, m = 3, n = 2, R5 = L-NHBoc, R6 on bentsyyli (Bn) (Yhd. nro 1); A1 30 R = H, m = 3, n = 2, R5 = L-NHBoc, R6 on H (Yhd. nro 2); R = H, m = 3, n = 2, R5 = D-NHBoc, R6 on H (Yhd. nro 3); 5 113763 R = H, m = 3, n = 2, R5 = L-NH2, R6 on H (Yhd. nro 4); R = H, m = 3, n = 2, R5 = H, R6 on H (Yhd. nro 5); R = H, m = 3, n = 1, R5 = L-NHAc, R6 on H (Yhd. nro 6); R = H, m = 3, n = 2, R5 = L-NHAc, R6 on H (Yhd. nro 7); 5 R = C(NH)NH2, m = 2, n = 2, R5 = L-NHBoc, R6 = H (Yhd. nro 8): R = H, m = 3, n = 3, R5 = L-NHBoc, R6 on H (Yhd. nro 9); R = H, m = 3, n = 2, R5 = D-NH2, R6 on H (Yhd. nro 10); R = H, m = 3, n = 3, R5= D-NHBoc, R6 on H (Yhd. nro 11); 10 R = H, m = 3, n = 1, R5 = D-NHBoc, R6 on H (Yhd. nro 12); R = H, m = 3, n = 2, R5= D-NHAc, R6 on H (Yhd. nro 13); Yhd. nro 3 3-S-isomeeri, R6 on H (Yhd. nro 14); R = i-Pr, m = 3, n = 2, X = L-NHBoc, R6 on H (Yhd. nro 15); Yhd. nro 3 3-R-isomeeri, R6 on H (Yhd. nro 16); 15 0 0 0 C02Me 20 O^N^ 0^'"\/VNH2 k^NH NHBoc * Yhd. nro 17 Yhd. nro 18 Yhd. nro 19

Esillä olevan keksinnön yhdisteet voidaan valmistaa 25 kaupallisesti saatavista lähtöaineista seuraavien reak- • · » ;'V tionkulkukaavioiden AA, AB, AC ja AD mukaan.

* Keksinnön yhdisteet, joissa X1 ja X2 ovat kumpikin '·' * happeja, voidaan valmistaa reaktionkulkukaavion AA mukaan.

Tässä kaaviossa nipekotiinihappoa (joko raseemista seosta 30 tai jompaa kumpaa erotettua enantiomeeria) voidaan käsi-: .* teliä alemmalla alkyylialkoholilla ja katalyyttisellä mää- _ rällä happoa lämpötilassa, joka on noin huoneenlämpötilas- ta palautusjäähdytyslämpötilaan, jolloin saadaan esteri- t » johdannainen AA1 happamana suolana. Tyypillisistä alkoho-,’· 35 leista, kuten etanolista, metanolista, isopropanolista ja 6 113763 butanolista voidaan muodostaa pareja happamien katalyyttien, kuten p-tolueenisulfonihapon, HCl:n tai rikkihapon kanssa. Edullisia reagensseja ovat metanoli ja HC1. AAl-johdannainen voidaan asyloida rengastypestä erilaisilla 5 asylointiaineilla, jolloin saadaan johdannainen AA2. Tyypillisiä reaktio-olosuhteita ovat AA1:n käsittely asyloin-tiaineella ja ekvivalentilla määrällä orgaanista emästä inertissä liuottimessa huoneenlämpötilassa 15 min - 2 tunnin ajan. Edulliset asylointiaineet ovat aminosuojatut 10 aminohapot tai aminosuojatut aminoalkyylikarboksyylihapot, jotka aktivoidaan kiinnitysreagensseilla, kuten DCC:llä (1,3-disykloheksyylikarbodi-imidi) ja BOP-Cl:lla (bis(2-okso-3-oksatsolidinyyli)fosfiinikloridi). Voidaan käyttää kuitenkin myös aminosuojattuja happojohdannaisia, kuten 15 anhydridejä, N-oksisuksinimidejä ja happoklorideja. Sopivia suojaryhmiä ovat alemmat alkyylikarbamaatit, haaroittuneet alkyylikarbamaatit, bentsyylikarbamaatit, asetami-dit ja substituoidut asetamidit. Asylointiaineen ja sen aminoryhmän suojaryhmän (-ryhmien) valinta on tekijä, joka 20 määrittelee substituentit Y ja R1 kaavan I mukaisessa yhdisteessä, jossa X1 ja X2 ovat 0. Reaktionkulkukaaviossa AA . suojattu aminohappo on diaminohappo, jonka kaava on NH- , ; . (Boc)CHC02H(CH2 )nN(Cbz), jonka avulla kaksi aminoryhmää » · » voidaan selektiivisesti suojata kaavion viimeisessä vai-25 heessa. Tämän valinnan tarkoituksena on ainoastaan valais- • » * "V ta keksintöä, ei rajoittaa sitä.

* Johdannaista AA2 voidaan käsitellä emäksellä ja *·* ' sopivalla liuotinseoksella, jolloin saadaan johdos AA3.

Sopivia epäorgaanisia emäksiä ovat NaOH, KOH, Mg(0H)2, 30 Na2C03 ja NaHC03, joka voidaan yhdistää seoksien kanssa, : : joissa on THF:a ja vettä, huoneenlämpötilassa 1-6 tun- , niksi, jolloin saadaan haluttu tuote. Orgaanisia emäksiä, . joita voidaan käyttää, ovat trietyyliamiini, tributyyli- > * amiini, di-isopropyylietyyliamiini ja tetrametyyliguani-35 diini. Näitä emäksiä voidaan käyttää orgaanisten liuotti- 7 113763 mien kanssa lämpötilassa, joka on huoneenlämpötilasta palautus jäähdytyslämpötilaan, 1-6 tunnin ajan, jolloin saadaan AA3-suola.

Edullisia reaktio-olosuhteita (joita valaistaan) 5 ovat AA2: n käsittely LiOH:lla, vedellä ja THF:lla huoneenlämpötilassa yhden tunnin ajan. Muita sopivia epäorgaanisia emäksiä voidaan käyttää, ja sellaisia ovat NaOH, KOH, Mg(OH)2, NaC03 ja NaHC03. Mikäli jotain toista tällaista emästä käytetään, AA3:ssa oleva Li korvataan luonnollises-10 ti sopivalla metallisubstituetilla. AA3-johdannaista voidaan käsitellä karboksisuojatulla karboksialkyyliamiinilla tai karboksisuojatulla aminohapolla aminohapon liitosreak-tiolle tunnusomaisissa olosuhteissa, jolloin saadaan di-substituoitu nipekotiinijohdannainen AA4. Hyväksyttävissä 15 liitosreaktioissa käytetään peptidikiinnitysaineita, kuten DCC:tä, B0P-Cl:a ja EDC:tä (etyylidimetyyliaminopropyyli-karbodi-imidi·HCl:a). Sopivia karboksiryhmän suojaryhmiä ovat bentsyylikarbamaatit, substituoidut bentsyylikarba-maatit, alkyylikarbamaatit ja haaroittuneet alkyylikarba-20 maatit, ja synteesikemian asiantuntijoille valinta on selvää. Annetuissa esimerkeissä käytetään NH2(CH2)nC02-(Bz) :a suojattuna aminohappona. Aminohapon ja sen karboksiryhmän ;·, suojaryhmän valinta määrittelee jälleen kerran substituen- tit R2 ja Z kaavan I mukaisissa yhdisteissä, joissa X1 ja 25 X2 ovat 0. AA4-johdannaiselle voidaan suorittaa selektiivi- * * · ;*· * nen suojaryhmien poisto amino- tai karboksiryhmän suoja- : : : ryhmien vaatimusten mukaisesti. Annetussa esimerkissä ' 3-karboksiryhmässä ja yhdessä aminoryhmässä olevat suoja- ryhmät poistetaan samanaikaisesti katalyyttisesti hydraa-_ 30 maila, käyttäen Pd/C:tä H2-atmosfäärissä, jolloin saadaan ΔΔ5.- johdannainen.

i * 8 113763 f

Kaavio AA

O r^V^OMe 5 I^Y^OMe y

0^T^(CH2)n~ NHCbz H ^NH

AA1 / Boc 10 AA2 ζ^ου 0^^(CM?)n ~"C°2BZl O^Y"iCH2^ —NHCbz^ 0Ar(CH2)n —NHCbz

20 NH ^NH

Boc Boc ^A4 AA3 : . . 25

v‘: O

. γγΑΝ/(°Η2)η-002Η

;::1; 30 H

—NH2

! ^NH

Boc AA5 35 9 113763

Kaaviossa AB valaistaan kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistusta, joissa yhdisteissä X2 on 0 ja X1 on H2. Nipekotiinihappoa (joko raseemista seosta tai jompaa kumpaa erotettua enantiomeeria) voidaa käsitellä alkyylialko-5 holilla ja katalyyttisellä määrällä happoa lämpötilassa, joka on noin huoneenlämpötilasta palautusjäähdytyslämpöti-laan, jolloin saadaan esterijohdannainen ABI happamana suolana. Tyypillisiä alkoholeja ovat etanoli, metanoli, isopropanoli ja butanoli. Happokatalyyttejä ovat p-toluee-10 nisulfonihappo, HC1 ja rikkihappo, jolloin edullisia rea-gensseja ovat metanoli ja HC1. ABI.-johdannainen voidaan asyloida rengastypestä erilaisilla asylointiaineilla, jolloin saadaan AB2-johdannainen. Tyypillisiä reaktio-olosuhteita ovat ABI-johdannaisen käsittely asylointiaineella ja 15 ekvivalentilla määrällä orgaanista emästä inertissä liuot-timessa, huoneelämpötilassa 15 min - 2 tunnin ajan. Edullisia asylointiaineita ovat aminosuojatut aminohapot tai aminosuojatut aminoalkyylikarboksyylihapot, jotka aktivoidaan kiinnitysreagensseilla, jollaisia ovat DCC (1,3-di-20 sykloheksyylikarbodi-imidi) ja B0P-C1 (bis(2-okso-3-oksat-solidinyyli )fosfiinikloridi). Aminosuojattuja happojohdan-naisia, kuten anhydridejä, N-oksisuksinimidejä ja happo-. :·. klorideja voidaan kuitenkin myös käyttää. Sopivia suoja- ryhmiä ovat alemmat alkyylikarbamaatit, haaroittuneet al-; t t 25 kyylikarbamaatit, bentsyylikarbamaatit, asetamidit ja sub-stituoidut asetamidit. Aminohapon ja sen aminoryhmän suo-jaryhmän (-ryhmien) valinta on tekijä, joka määrittelee ’·* substituentit Y ja R1 kaavan I mukaisissa yhdisteissä. Kaa viossa AB suojattu aminohappo on diaminohappo, jonka kaava 30 on NH(Boc)CHC02H( CH2 )nN(Boc) , ja tämän valinnan on tarkoitus olla ainostaan keksintöä valaiseva, ei rajoittava.

. AB2-johdannainen voidaan hydrolysoida emäksellä ja sopi- valla liuotinseoksella, jolloin saadaan johdannainen ΑΒ3.

• »

Sopivia epäorgaanisia emäksiä ovat NaOH, KOH, Mg(OH), *,,,· 35 LiOH, Na2C03 ja NaHC03, jotka voidaan yhdistää seoksien 10 113763 kanssa, joissa on THF:a ja vettä, huoneenlämpötilassa 1 -6 tunnin ajaksi, jolloin saadaan haluttu tuote. Orgaanisia emäksiä, joita voidaan käyttää, ovat trietyyliamiini, tri-butyyliamiini, di-isopropyylietyyliamiini ja tetrametyyli-5 guanidiini. Näitä emäksiä voidaan käyttää orgaanisten liuottimien kanssa lämpötilassa, joka on huoneenlämpötilasta palautusjäähdytyslämpötilaan, reaktioajan ollessa 1-6 tuntia, jolloin saadaan AB3. AB3-johdannaisen 3-kar-boksiryhmä voidaan pelkistää, jolloin saadaan aldehydijoh-10 dannainen AB4, käyttäen muutamia reaktio-olosuhteita. Tällaisiin reaktio-olosuhteisiin kuuluu litium-t-di-isopro-pyyliamidin käyttö HMPT/THF:n toimiessa liuottimena, lämpötilassa -78 - 0 °C, N,N-dimetyylikloorimetyleeni-imi- niumkloridin ja litium-t-butoksialuminiumhydridin käyttö 15 pyridiinin toimiessa liuottimena -78 °C:ssa, sekä standardit Rosenmundin reaktio-olosuhteet. Edullisissa reaktio-olosuhteissa käytetään N,N'-karbonyylidi-imidatsolia, sen jälkeen di-isobutyylialuminiumhydridiä -10 °C:ssa, jolloin saadaan aldehydijohdannainen AB4. AB4-johdannaista voidaan 20 käsitellä karboksisuojatulla karboksialkyyliamiinilla tai karboksisuojatulla aminohapolla, sen jälkeen pelkistimel-• lä, jolloin saadaan disubstituoitu nipekotiinihappojohdan- t , nainen AB5. Sopivia karboksiryhmän suojaryhmiä ovat bent- syylikarbamaatit, substituoidut bentsyylikarbamaatit, ’ ” 25 alemmat alkyylikarbamaatit ja haaroittuneet alkyylikarba- !".* maatit, ja suojaryhmän valinta on selvää synteesikemian asiantuntijoille. Pelkistimiä ovat natriumsyaaniboorihyd-**' ’ ridi, litiumsyanoboorihydridi, natrium-9-syaani-6-hydrido- borabisyklo[3,3,1]nonaani, tetrabutyyliammoniumsyaaniboo-30 rihydridi ja Pd/C yhdessä happaman liuottimen kanssa, ja pelkistimen valinta riippuu käytössä olevista suojaryhmis-;·*·, tä. Esimerkissä käytetään NH2(CH2 )nC02Bzl: a suojattuna ami- • i \.! nohappona ja natriumsyaaniboorihydridiä pelkistimenä. Ami- nohapon ja sen karboksiryhmän suojaryhmän valinta määrit-35 telee yhdisteessä olevat substituentit R2 ja Z, ja valinnan 11 113763 on tarkoitus olla esimerkillinen, ei rajoittava. ABS-johdannaisesta voidaan poistaa suojaus selektiivisesti amino-tai karboksiryhmän suojaryhmän poistamiseksi vaadittavalla tavalla. Kuten on valaistu, esimerkiksi 3-karboksiryhmässä 5 ja kummassakin aminoryhmässä olevat suojaryhmät poistetaan samanaikaisesti katalyyttisesti hydraamalla, käyttäen

Pd/C: tä H2-atmosfäärissä, jolloin saadaan ΔΒ&-johdannainen. Kaavio AB

10 1 0 I J ^Kr^-(CH2)n —NHBoc

15 -► NH

H /

Boc AB1 AB2 ΐ: — 0*" H2)„ -NHBoc

/L^.(CH2)n —NHBoc O T

O NH

i NH /

. / BOC

Boc 30 AB3 AB4 12 113763

^~s^N/(CH2)n CO 2Bzl ^^N/(CH2)n C02H

N -► N

5 0^γ^(0Η2)η —NHBoc Q-i^Y^(CH2)n _Nh2 ^NH NH2

Boc AB5 AB6 10 Keksinnön yhdisteet, joissa X1 on happi ja X2 on H2, voidaan valmistaa seuraavalla reaktionkulkukaaviolla AC. Tässä kaaviossa nipekotiinihappoa (joko raseemista seosta tai erotettuja enantiomeereja) voidaan käsitellä alemmalla alkoholilla ja katalyyttisellä määrällä happoa lämpötilas-15 sa, joka on noin huoneenlämpötilasta palautusjäähdytysläm-pötilaan, jolloin saadaan esterijohdannainen AC1 happamana suolana. Tyypillisiä alkoholeja ovat etanoli, metanoli, isopropanoli ja butanoli. Happokatalyyttejä ovat p-toluee-nisulfonihappo, HC1 ja rikkihappo, joista metanoli ja HC1 20 ovat edullisia reagensseja. AC1-johdannainen voidaan alky-loida rengastypestä alkylointiaineella, jolloin saadaan AC2-johdannainen. Alkylointireagensseja ovat halogeenial-, kyyliamiinisyntonit, kuten bromialkyyliftaali-imidit ja bromialkyylinitriilit, tai suojatut aminoaldehydit, jotka . 25 on saatu pelkistävien aminointireaktioiden kautta (olosuh- teet esitetty reaktionkulkukaaviossa AD). Tyypillisiä tl· ·;; · reaktio-olosuhteita ovat AC1 :n käsittely emäksellä, kuten • ♦ · '·' * natriumhydridillä tai faasinsiirtokatalyytillä, kuten tet- rabutyyliammoniumfluoridilla ja alkylointiaineella iner-30 tissä liuottimessa huoneenlämpötilassa, reaktioajan olles- sa 15 min - kaksi tuntia, jonka jälkeen suoritetaan rutii-ninomainen 3-substituentin aminoryhmän suojaus jollakin edellä mainituista sopivista suojaryhmistä. Alkylointiai-neen ja sen aminoryhmän suojaryhmän valinta on tekijä, : 35 joka määrittelee substituentit Y ja R1. Kaaviossa AC 1-ase- 13 113763 ma on substituoitu (CH2 )NH(Cbz):11a, jolla valinnalla on tarkoitus ainoastaan valaista keksintöä, ei rajoittaa sitä. AC2-johdannaista voidaan käsitellä emäksellä ja sopivalla liuotinseoksella, jolloin saadaan suolajohdannainen 5 AC3. Kuten kaavio AA, kaaviossa AC esitetään edullisen LiOHrn käyttö. Myös muita sopivia epäorgaanisia emäksiä voidaan kuitenkin käyttää, kuten NaOH, KOH, Mg(OH)2, Na2C03 ja NaHC03, joita voidaan yhdistää THF- ja vesiseosten kanssa kanssa huoneenlämpötilassa, reaktioajan ollessa 1-6 10 tuntia, jolloin saadaan haluttu tuote. Orgaanisia emäksiä, joita voidaan käyttää, ovat trietyyliamiini, tributyyli-amiini, di-isopropyylietyyliamiii ja tetrametyyliguanidii-ni. Näitä emäksiä voidaan käyttää orgaanisten liuottimien kanssa lämpötilassa, joka on huoneenlämpötilasta palautus-15 jäähdytyslämpötilaan, reaktioajan ollessa 1-6 tuntia, jolloin saadaan AC3-suola. Edullisia reaktio-olosuhteita (joita valaistaan) ovat AC2:n käsittely LiOH:lla, vedellä ja THF:11a huoneenlämpötilassa yhden tunnin ajan. AC3-joh-dannaista voidaan käsitellä karboksisuojatulla karboksial-20 kyyliamiinilla tai karboksisuojatulla aminohapolla standardeissa aminohapponitosreaktion olosuhteissa, jolloin ; saadaan disubstituoitu nipekotiinijohdannainen AC4. Sopi- vissa liitosreaktio-olosuhteissa käytetään peptidikiinni-tysaineita, kuten DCC, B0P-C1 ja EDC (etyylidimetyyliami-25 nopropyylikarbodi-imidi* HC1). Sopivia karboksiryhmän suo-

I · I

i",’ jaryhmiä ovat bentsyylikarbamaatit, substituoidut bentsyy- » · · ·;; * likarbamaatit, alkyylikarbamaatit ja haaroittuneet alkyy- *·’ likarbamaatit, ja suojaryhmän valinta on synteesikemian asiantuntijalle selvää. Valaisevassa esimerkissä käytetään 30 NH2(CH2)nC02Bzl:a suojattuna aminohappona. Aminohapon ja sen ,11· karboksiryhmän suojaryhmän valinta määrää jälleen kerran ;v, substituentit R2 ja Z kaavan I mukaisissa yhdisteissä.

AC4-johdannaisesta voidaan poistaa suojaus selektiivisesti amino- tai karboksiryhmän suojaryhmän poistamiseksi vaa-',,,· 35 dittavallaa tavalla. Valaisevassa esimerkissä 3-karboksi- 113763 14 ryhmän ja 1-aminoryhmän suojaryhmät poistetaan samanaikaisesti katalyyttisesti hydraamalla, käyttäen Pd/C:tä H2-at-mosfäärissä, jolloin saadaan AC5-johdannainen.

Kaavio AC

5 O

O r^Y^OMe Υγ^ΟΜθ f (CH2)n —NHCbz I -►

10 H

AC1 AC2 15 / ^ V 8 20 (CH2)n —NHCbz (CH2)n —NHCbz AC4 AC3 25 « ' # o

V 5 ^(CH2)n~C02H

U H

30 (CH2)n — NH2 1 , t 35 AC5 15 113763

Keksinnön yhdisteet, joissa X1 ja X2 ovat kumpikin H2/ voidaan valmistaa seuraavan kaavion AD mukaan. Tässä kaaviossa nipekotiinihappoa (joko raseemista seosta tai erotettuja enantiomeereja) voidaan käsitellän alemmalla 5 alkyylialkoholilla ja katalyyttisellä määrällä happoa lämpötilassa, joka on noin huoneenlämpötilasta palautusjäähdytys lämpötilaan, jolloin saadaan esterijohdannainen API happamana suolana. Tyypillisiä alkoholeja ovat etanoli, metanoli, isopropanoli ja butanoli. Happokatalyyttejä ovat 10 ji-tolueenisulfonihappo, HC1 ja rikkihappo. Edullisia rea-gensseja ovat metanoli ja HC1. Αβί-johdannainen voidaan alkyloida rengastypestä alkylointiaineella, jolloin sadaan ÄEZ-johdannainen. Alkylointireagensseja ovat halogeenial-kyyliamiinisyntonit, kuten bromialkyyliftaali-imidit ja 15 bromialkyylinitriilit tai suojatut aminoaldehydit, jotka on saatu pelkistävien aminointireaktioiden avulla (reaktio-olosuhteet esitetty kaaviossa AD). Tyypillisiä reaktio-olosuhteita ovat API:n käsittely emäksellä, kuten nat-riumhydridillä tai faasinsiirtokatalyytillä, kuten tetra-20 butyyliammoniumfluoridilla ja alkylointiaineella inertissä liuottimessa, huoneenlämpötilassa, reaktioajan ollessa 15 : : minuutista kahteen tuntiin, sen jälkeen rutiininomainen aminoryhmän suojaus jollakin edellä mainituista sopivista suojaryhmistä. Alkylointiaineen ja sen aminoryhmän suoja-: 25 ryhmän valinta on tekijä, joka määrää substituentit Y ja : ,·, R1. Kaaviossa AD 1-asema substituoidaan (CH2)NH(Cbz) :11a, f · » joka on valintana ainoastaan keksintöä valaiseva esimerk- • » · * ki. ÄD2-johdannainen voidaan hydrolysoida emäksellä ja sopivalla liuotinseoksella, jolloin saadaan AD3-johdannai-·>' 30 nen. Sopivia epäorgaanisia emäksiä ovat NaOH, KOH, MgOH,

LiOH, Na2C03 ja NaHC03, joka emäs voidaan yhdistää THF- ja vesiseosten kanssa huoneenlämpötilassa, reaktioajan olles-sa 1 - 6 tuntia, jolloin saadaan haluttu tuote. Orgaanisia emäksiä, joita voidaan käyttää, ovat trietyyliamiini, tri-’··* 35 butyyliamiini, di-isopropyylietyyliamiini ja tetrametyyli- 16 113763 guanidiini. Näitä emäksiä voidaan käyttää orgaanisten liuottimien kanssa lämpötilassa, joka on huoneenlämpötilasta palautusjäähdytyslämpötilaan, reaktioajan ollessa 1-6 tuntia, jolloin saadaan AD3. AD3-johdannaisen 3-kar-5 boksiryhmä voidaan pelkistää, jolloin saadaan aldehydijohdannainen AD4, käyttäen muutamia reaktio-olosuhteita. Tällaisia ovat litiumdi-isopropyyliamidin käyttö HPMT/THF:n toimiessa liuottimena, lämpötilassa, joka on -78 - 0 °C, N,N-dimetyylikloorimetyleeni-iminiumkloridin ja litium-t-10 butoksialuminiumhydridin käyttö pyridiinin toimiessa liuottimena, lämpötilassa -78 °C, sekä Rosenmundin standardit pelkistysolosuhteet. Edullisia reaktio-olosuhteita ovat N,N'-karbonyylidi-imidatsolin, sen jälkeen di-isobu-tyylialuminiumhydridin käyttö lämpötilassa, joka on 15 -10 °C, jolloin saadaan aldehydijohdannainen AD4.

AD4-johdannaista voidaan käsitellä karboksisuoja-tulla karboksialkyyliamiinilla tai karboksisuojatulla aminohapolla, sen jälkeen pelkistimellä, jolloin saadaan di-substitoitu nipekotiinihappojohdannainen AD5. Sopivia kar-20 boksiryhmän suojaryhmiä ovat bentsyylikarbamaatit, substi- tuoidut bentsyylikarbamaatit, alemmat alkyylikarbamaatit ja haaroittuneet alkyylikarbamaatit, ja suojaryhmän valin-j'. ta on synteesikemian asiantuntijalle selvää. Pelkistimiä ovat natriumsyaaniboorihydridi, litiumsyanoboorihydridi, 25 natrium-9-syaani-9-hydridoborabisyklo[3,3,l]nonaani, tet- » » » rabutyyliammoniumsyaaniboorihydridi ja Pd/C yhdessä happa- f « i V.' man liuottimen kanssa, ja pelkistimen valinta riippuu käy- «11 '' tettävistä suojaryhmistä. Valaisevassa esimerkissä käyte tään NH2(CH,nC02Bzl:a suojattuna aminohappona ja natrium-,,V 30 syaaniboorihydridiä pelkistimenä. Aminohapon ja sen kar- V,‘ boksiryhmän suojaryhmän valinta määrää substituentit R2 ja , Z yhdisteessä, ja sen on tarkoitus olla valaiseva, ei ra- ,·<·, joittava. AD5-johdannaisesta voidaan poistaa suojaus se- V lektiivisesti amino- ja karboksiryhmän suojaryhmälle vaa- ' 35 dittavalla tavalla. Kuten on valaistu, 3-karboksiryhmässä 17 113763 ja aminoryhmässä olevat suojaryhmät poistetaan samanaikaisesti katalyyttisesti hydraamalla, käyttäen Pd/C:tä H2-at-mosfäärissä, jolloin saadaan AD6-johdannainen.

Kaavio AO

5 0 1

Λ -► I

ίο n (CH2)n —NHBoc AD1 ^ AD2

15 O

σ’- —- ςΛ

(CH2)n —NHBoc I

20 (CH2)n —NHBoc AD3 / AD4 ;;; 25 / . /(CH2)n C02Bzl ; „ y 3

(CH2)n —NHBoc I

: (ÖH2)„ —NHBoc t t 35 AD6 AD5 18 113763

Koskien kaikkien kaavioiden lähtöaineita, suurin osa aminohapoista ja aminoalkyylikarboksyylihapoista, joita tarvitaan yhdisteiden valmistamiseksi, joissa A on NHR1, ovat kaupallisesti saatavissa olevia yhdisteitä, joihin 5 täytyy lisätä ainoastaan suojaryhmiä haluttujen kaavan I mukaisten yhdisteiden saamiseksi. Keksinnön mukaisten yhdisteiden, joissa A on sykloalkyylirengas, jossa on typpi, valmistamiseksi 1-substituenttia (piperidiini) täytyy kuitenkin muunnella lisäyksen jälkeen haluttujen kaavan I 10 mukaisten yhdisteiden saamiseksi. Yhdisteiden, joissa 1-substituentti on C(0)(CH2)2-4-yylipiperidiini, saamiseksi AA1- ja ABI-johdannaiset asyloidaan 3-(4-pyridyyli)akryy-lihapolla, jolloin saadaan asyloidut johdannaiset AA2 ja AB2, käyttäen edellä mainittuja asylointimenetelmiä. Nämä 15 johdannaiset muutetaan kaavioissa kuvatulla tavalla, jol loin saadaan AA4 ja AB5. Johdannaiset AA5 ja AB5 voidaan valmistaa siten, että käsitellään AA4:ää ja AB5:ttä sopivalla pelkistimellä, joka tässä tapauksessa poistaa 3-ase-massaa olevan karboksiryhmän suojaryhmän ja pelkistää ety-20 leenisubstituoidun pyridiinin, jolloin saadaan haluttu yhdiste. Edullinen pelkistysaine/suojauksen poistoaine on .. Pt02. 2- ja 3-piperidiinit voidaan valmistaa muuntelemalla ;. akryylihappojohdannaista tunnetuilla tavoilla.

Yhdisteiden, joissa 1-substituentti on C(0)(CH2)2-3-j [i 25 yylipyrroli, valmistamiseksi johdannaiset AA1 tai ABI asy-!‘V loidaan 3-(l-bentsyylipyrrolidin-3-yyli)akryylihapolla, ’ jolloin saadaan asyloidut johdannaiset AA2 ja AB2, käyttä- *·* en edellä mainittuja asylointimenetelmiä. Substituoitu pyrroliakryylihappojohdannainen voidaan saada hydrolysoi-,,ii‘ 30 maila vastaava nitriilijohdannainen hapon vesiliuoksella.

3-( l-bentsyylipyrrolidin-3-yyli )akrylonitriilisyntetisoi-tiin menetelmällä, joka on kuvattu US-patentissa ... 4 002 643, joka liitetään tähän viitteellä. Johdoksia kä- sitellään edellä kuvatulla tavalla (kuusiatomisen renkaan 19 113763 tapaukselle), jolloin saadaan keksinnön yhdisteet, joissa A on viisiatominen rengas, joka sisältää typen.

Diastereomeerisesti rikastettujen loppuyhdisteiden, jotka sisältävät Boc-Lys- ja joko R- tai S-nipekotyyliryh-5 miä (katso yhdisteet 14 ja 16), valmistamiseksi synteesien alussa käytettiin vastaavia enantiomeerisesti rikastettuja nipekotiinihappometyyliestereitä. Enantiomeerisesti rikastetut nipekotiinihappometyyliesterit eristettiin hajoittamalla raseeminen aine kiraalisesti julkaisussa kuvatulla 10 tavalla (A. M. Akkerman, Rec. Trav. Chlm. Pays-Bas 1951, 70, 899).

Tämän keksinnön lääkekoostumusten valmistamiseksi yksi tai useampia keksinnön yhdisteitä, joiden kaava on (I), tai niiden suoloja, jotka toimivat vaikuttavana aine-15 osina, sekoitetaan perusteellisesti farmaseuttisen kantaja-aineen kanssa tunnetun farmasian teknologian tekniikan mukaisesti, ja kantaja-aine voi olla monessa eri muodossa, riippuen annosteltavaksi, esim suun kautta tai ruoansulatuskanavan ulkopuolelle, kuten lihakseen annosteltavaksi 20 halutun valmisteen muodosta. Valmistettaessa suun kautta annosteltavaa lääkemuotoa, voidaan käyttää mitä tahansa tavallista väliainetta. Siten nestemäisiä suun kautta annosteltavia valmisteita, kuten esimerkiksi suspensioita, eliksiirejä ja liuoksia varten, sopivia kantaja-aineita ja !25 apuaineita ovat vesi, glykolit, öljyt, alkoholit, makuai-neet, säilytysaineet, väriaineet ja vastaavat aineet; kii-’ nteitä suun kautta annosteltavia valmisteita, kuten esi- merkiksi jauheita, kapseleita, pikkukapseleita, geelikap-seleita ja tabletteja varten sopivia kantaja-aineita ja 30 apuaineita ovat tärkkelykset, sokerit, laimennusaineet, : : rakeistusaineet, liukuaineet, sideaineet, hajoitusaineet ;·*·. ja vastaavat aineet. Koska tabletit ja kapselit on helppo ... annostella, ne edustavat edullisinta suun kautta annostel- * tavaa lääkemuotoa, jossa tapauksessa käytetään luonnolli- 35 sesti kiinteitä farmaseuttisia kantaja-aineita. Haluttaes- 20 113763 sa tabletit voidaan päällystää sokerilla tai enterokalvol-la perus tekniikoiden mukaisesti. Ruoansulatuskanavan ulkopuolelle annosteltavissa lääkemuodoissa kantaja-aine on tavallisesti steriiliä vettä, joskin muita aineosia, esi-5 merkiksi liukoisuutta parantavia aineita tai säilytysai-neita voidaan lisätä. Voidaan valmistaa myös injisoitavia suspensioita, jossa tapauksessa voidaan käyttää sopivia nestemäisiä kantaja-aineita, suspensointiaineita ja vastaavia aineita. Keksinnön lääkekoostumukset voivat sisäl-10 tää annostusyksikköä, esim. tablettia, kapselia, jauhetta, injektiota, teelusikallista ja vastaavaa yksikköä kohden sellaisen määrän vaikuttavaa aineosaa, joka on välttämätön edellä kuvatun tehokkaan annoksen saamiseksi. Keksinnön lääkekoostumukset sisältävät annostusyksikköä, esim. tab-15 lettiä, kapselia, jauhetta, injektiota, peräpuikkoa, teelusikallista ja vastaavaa yksikköä kohden noin 0,03 - 100 mg/kg (edullisesti 0,1 - 30 mg/kg) vaikuttavaa aineosaa, ja ne voidaan annostella annostuksena, joka on noin 0,1 -300 mg/kg/päivä (edullisesti 1-50 mg/kg/päivä). Annos-20 tuksia voidaan kuitenkin vaihdella, riippuen potilaiden tarpeesta, hoidettavan tilan vakavuudesta ja käytettävästä yhdisteestä. Voidaan käyttää joko päivittäistä annostelua , : . tai postperiodista annostusta.

Farmakologia 25 Esillä olevan keksinnön yhdisteet keskeyttävät fib- rinogeenin sitoutumisen verihiutaleiden glykoproteiiniin ·;;/ Ilb/Illa (GPIIb/IIIa) ja estävät siten verihiutaleiden *** ’ kasautumista. Tällaiset yhdisteet ovat siten käyttökelpoi sia hoidettaessa verihiutalevälitteisiä hyytymishäiriöitä, 30 kuten valtimo- ja laskimotulppia, akuuttia sydäninfarktia, : : veritulpan liuotushoidon ja verisuonikirurgian jälkeistä uusiotukosta ja erilaisia verisuonten tukoshäiriöitä. Kos-ka viimeinen yleinen tapahtuma normaalissa verihiutaleiden kasautumisessa on fibrinogeenin sitoutuminen aktivoituun, 35 alttiina olevaan GPIIb/IIIa:han, tämän sitoutumisen estä- 21 1 13763 minen edustaa mahdollista yritystä estää hyytyminen. Reseptori aktivoituu ärsykkeistä, joita ovat ADP, kollageeni ja trombiini, tarjoten sitoutumispaikkoja fibrinogeenin kahdelle eri peptidialueelle: α-ketju Arg-Gly-Asp (RGD) ja 5 γ-ketju 400-411. Kuten tässä myöhemmin kuvattujen farmako-logisisten tutkimusten tuloksilla osoitetaan, esillä olevan keksinnön yhdisteillä on kyky salvata fibrinogeenin sitoutuminen eristettyyn GPIIb/IIIa:hän (IC50 3-5 800 nM), estää kasautuminen in vitro erilaisten verihiutaleär-10 sykkeiden läsnä ollessa, ja edelleen ne ovat estäneet verihiutaleiden kasautumista eläinmalleissa ex vivo.

Puhdistetun glykoproteiini Ilb/IIIa -kiinteän faasin in vitro sitoutumiskoe 96-koloiselle Immulon-2-mikrotiitterilevylle (Dyna-15 tech-Immulon) laitetaan 50 μΐ/kolo RGD-affiniteetiltaan puhdistettua GPIIb/IIIa:ta (tehoalue 0,5 - 10 pg/ml), joka on 10 mMrssa HEPESrtä, 150 mM:ssa NaClra, 1 mM:ssa, pH:ssa 7,4. Levy peitetään ja sitä inkuboidaan yön yli 4 °C:ssa. GPIIb/IIIa-liuos heitetään pois ja 150 μΐ 5 % BSA:ta lisä-20 tään ja inkuboidaan huoneenlämpötilassa 1-3 tuntia. Levy pestään hyvin muunnellulla Tyrodes-puskurilla. Biotinyloi-. tua fibrinogeeniä (25 μΐ/kolo) lisätään konsentraationa,

joka on 2 x lopullinen konsentraatio, koloihin, jotka sisältävät koeyhdisteet (25 μΐ/kolo) konsentraationa, joka 25 on 2 x lopullinen konsentraatio. Levy peitetään ja sitä inkuboidaan huoneenlämpötilassa 2-4 tuntia. 20 minuuttia ·;; · ennen inkuboinnin päättymistä lisätään pisara reagenssia A

*' ' (Vecta Stain ABC House Radish Peroxidase -pakkaus, Vector

Laboratories, Inc.) ja yksi pisara reagenssia B sekoittaen 30 5 ml: aan muunneltua Tyrodes-puskuriseosta, ja annetaan : : seistä. Ligandiliuos heitetään pois ja levy pestään (5 x 200 μΐ/kolo) muunnellulla Tyrodes-puskurilla. Vecta Stain HRP-Blotin-Avidin-reagenssia (50 μΐ/kolo, valmistettu edellä kuten edellä) lisätään ja inkuboidaan huoneenlämpö-35 tilassa 15 minuuttia. Vecta Stain -liuos heitetään pois ja 22 113763 kolot pestään (5 x 200 μΐ/kolo) muunnellulla Tyrodes-pus-kurilla. Lisätään kehityspuskuria (10 ml 50 mM sitraatti/ fosfaattipuskuria, pH 5,3, 6 mg o-fenyleenidiamiinia, 6 μΐ 30 % H202:ta; 50 μΐ/kolo) ja inkuboidaan huoneenlämpötilas-5 sa 3 - 5 minuuttia, ja sitten lisätään 2 N H2S04:a (50 μΐ/kolo). Absorbanssi luetaan konsentraatiossa 490 nM. Tulokset esitetään taulukossa I.

Trombiini11a aiheutetun geelisuodatetun verihiutaleiden in vitro kasautumiskoe 10 Prosentuaalinen verihiutaleiden kasautuminen laske taan yhdisteellä käsitellyn verihiutaletiivisteen vs. kontrollilla käsitellyn verihiutaletiivisteen valonläpäisyn lisääntymisenä. Veri saadaan lääkettä nauttimattomilta, luonnollisilta luovuttajilta putkiin, jotka sisältävät 15 0,13 M natriumsitraattia. Verihiutalepitoinen plasma (PRP)

kerätään talteen, sentrifugoimalla kokoverta nopeudella 200 x g, 10 minuuttia 25 °C:ssa. PRP (5 ml) geelisuodate-taan Sepharose 2B -suodattimen läpi (kerrostilavuus 50 ml), ja verihiutalelaskin säädetään arvoon 2 x 107 veri-20 hiutaletta per näyte. Seuraavat aineosat lisätään siliko-nikyvettiin: konsentroitu verihiutalesuodos ja Tyrode-pus-kuri (0,14 M NaCl, 0,0027 M KC1, 0,012 M NaHC03 , 0 , 76 mM Na2HP04 , 0,00 5 5 M glukoosi, 2 mg/ml BSA ja 5,0 mM HEPES, pH

7,4) määränä, joka vastaa 350 pl:aa, 50 pl:aa 20 mM kal-25 siumia ja 50 pl:aa koeyhdistettä. Kasautumista seurataan BIODATA-aggregometrillä kolmen minuutin ajan, sen jälkeen ·;; · lisätään agonistia (trombiini 50 μΐ 1 yksikköä/ml). Tulok- '·' set esitetään taulukossa 1.

Ex vivo koirakoe.

30 Täysikasvuisia sekarotuisia koiria (8 - 13 kg) nu- · kutettiin natriumpentobarbitaalilla (35 mg/kg, i.v.) ja kytkettiin hengityskoneeseen. Valtimon verenpainetta ja sydämen lyöntinopeutta mitattiin käyttäen Millar-katetri-T päistä paineanturia, joka oli asetettu reisivaltimoon.

,,,· 35 Toinen Millar-paineanturi laitettiin vasempaan kammioon 23 113763 (LV) kaulavaltimon kautta LV:n diastolisen loppupaineen ja sydänlihaksen supistuvuusindeksien mittaamiseksi. Il-johdon sydänsähkökäyrä tallennettiin raajaelektrodeista. Katetrit laitettiin reisivaltimoon ja -laskimoon verinäyt-5 teen ottamiseksi ja lääkkeiden infusoimiseksi, vastaavassa järjestyksessä. Vasteita seurattiin jatkuvasti, käyttäen Modular Instruments -tiedonhankintajärjestelmää.

Valtimoverinäytteitä (5 - 9 ml) otettiin putkiin, joissa oli 3,8 % natriumsitraattia, verihiutalepitoisen 10 plasman (PRP) valmistamiseksi ja koaguloitumisparametrei-hin kohdistuvien vaikutusten määrittämiseksi: protrombii-niaika (PT) ja aktivoitu osittainen tromboplastiiniaika (APTT). Erilliset verinäytteet (1,5 ml) otettiin EDTA:aan hematokriitin määrittämiseksi ja solujen laskemiseksi (ve-15 rihiutaleet, punasolut ja valkosolut). Templaatin vuoto-ajat saatiin posken limakalvon pinnalta, käyttäen symp-laattilävistyslaitetta ja Whatman-suodatinpaperia.

PRP:n aggregoituminen suoritettiin käyttäen BioDa-ta-aggregometriä. Kokoveren aggregoituminen suoritettiin 20 käyttäen Chronolog-näennäisvastuksellista aggrometriä. PT

ja APTT määritettiin joko BioData- tai ACL 3000+ -koagu-laatioanalysaattorilla. Solut laskettiin Sysmex K-1000:11a.

. Yhdiste 17 solubilisoitiin pieneen tilavuuteen di- !“* 25 metyyliformamidia (DMF) ja laimennettiin suolaliuoksella * » · lopulliseen konsentraatioon, joka oli 10 % DMF. Yhdiste 17 : annosteltiin suonensisäisesti Harvard-infuusiopumpun avul- v ’ la. Annokset, jotka olivat 0,3, 1, 3 ja 10 mg/kg, annet tiin kumulatiivisesti kullekin eläimelle. Kukin annos an-,.|* 30 nettiin 15 min välein vakionopeudella 0,33 ml/min. Tiedot saatiin kunkin annoksen jälkeen ja 30 ja 60 min lääkkeen annostelun jälkeen.

Yhdiste 17 sai aikaan selvän verihiutaleiden kasau- I · ;· tumisevasteiden eston ex vivo. Siten kokoveressä yhdiste 35 17 esti kollageenilla aiheutetun kasautumisen annoksilla 24 113763 0,3 - 10 mg/kg, ja se esti merkittävästi kollageenilla stimuloitua verihiutaleiden ATP:n vapautumista annoksella 10 mg/kg. PRPrssä yhdiste 17 esti myös kollageenilla stimuloidun verihiutaleiden kasautumisen, ja sillä oli mer-5 kittävää vaikutusta annoksella 0,3 mg/kg. Gammatrombiinil-la aiheutettu PRP:n kasautuminen estyi annoksilla 3,0 mg/kg sekä edellä olevalla annoksella. Sekä PRP:ssä että kokoveressä verihiutaleiden toiminta alkoi palautua 30 -60 min aikana, mikä viittaa suhteellisen lyhyeen lääkevai-10 kutuksen kestoon. Yhdisteellä 17 ei ole mitattavissa olevaa hemodynaamista vaikutusta annoksilla 10 mg/kg asti, iv. Lääke sai aikaan templaatin vuotoajan kasvun annoksilla 3 ja 10 mg/kg sekä nopean palautumisen käsittelyn jälkeen. Käsittelyn aikana ei havaittu vaikutuksia koaguloi-15 tumiseen (PT tai APTT) ja verihiutale-, valkosolu- ja pu-nasolumäärät pysyivät muuttumattomina kaikilla yhdisteen 17 annoksilla.

Tulokset osoittavat, että yhdiste 17 on laajasti vaikuttava verihiutaleiden kasautumisen estäjä ex vivo 20 (antagonisoiden sekä kollageeni- että trombiiniteitä), kun se annetaan suonensisäisesti annoksina, jotka ovat 0,3 -10 mg/kg. Kasautumista estävä vaikutus on suhteellisen lyhyt ja siihen liittyy vuotoajan pidentyminen suuremmilla annoksilla. Muita hemodynaamisia tai hematologisia vaiku-25 tuksia ei havaita.

* » · * · » i I * 25 113763

Taulukko 1

Yhdiste nro Sitoutuminen IC50 (μΜ) Verihiutaleiden kasautuminen @50 μΜ 5 1 20,1 20% 2 0,74 67% 3 0,021 0,60 μΜ* 4 2,6 21% 5 0,013 1,6μΜ* 10 6 24% @ 50 μΜ 4% 7 0,074 86% 8 2,7 28% 9 59% @ 50 μΜ 2% 10 0,76 75% 15 11 7,6 43% 12 50 49% 13 0,34 78% 14 0,028 78% 15 20% (g) 5 μΜ 4% 20 16 0,008 73% 17 0,003 0,13 μΜ* 18 0,029 87% 19 5,80 85% .* *Kuvaa lC50:ttä ;· 25 . In vivo koirakoe » *. Yhdistettä 16 testattiin seuraavassa in vivo koira- *, mallissa terapeuttisen tehon määrittämiseksi.

Kirurginen valmistus 30 Täysikasvuisia sekarotuisia koiria, jotka olivat ;; jompaa kumpaa sukupuolta (9 - 13 kg) nukutettiin pentobar- ;'' bitaalinatriumilla (35 mg/kg, iv) ja ventiloitiin huoneil- = maila henkitorvensisäisen putken kautta (12 lyöntiä/min, ; : 25 ml/kg). Valtimoverenpaineen mittaamiseksi vasen kaula- .·>·, valtimo kanyloitiin suolaliuoksella täytetyllä polyetylee- nikatetrilla (PE-200) ja kytkettiin Statham-paineanturiin 26 113763 (P23ID, Oxnard, CA). Valtimoveren diastolisen paineen keskiarvo. Sydämen lyöntinopeutta seurattiin käyttäen kardio-takometriä (Biotach, Gould Electronics, Cleveland, OH), joka oli saatu II-johdon sydänkäyrästä, joka oli johdettu 5 raajoissa olevista johdoista. Kaulalaskimo kanyloitiin (PE-200) lääkkeen antoa varten. Vasen reisivaltimo ja vasen reisilaskimo kanyloitiin silikonilla käsitellyllä (Sigmacote, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), suolaliuoksella täytetyllä polyetyleeniputkella (PE-200) ja 10 kytkettiin 5 cm:n alueelta silikonilla käsiteltyyn putkeen (PE-240) elimistön ulkopuolisen valtimo-laskimo-oikovir-tauksen (A-V) muodostamiseksi. Oikovirtauksen toimivuttaa seurattiin käyttäen Doppler-virtausjärjestelmää (malli VF-1, Crystal Biotech Inc, Hopkinton, MA) ja se oli lähin-15 nä oikovirtauspaikkaa. Kaikkia parametrejä valvottiin jatkuvasti polygrafitallentimella (Gould TA-4000, Oxnard, CA), paperinnopeuden ollessa 10 mm/min.

Suunnitelma

Kun 15 minuuttia kestänyt leikkauksen jälkeinen 20 stabilointiaika oli päättynyt, tukoksen aiheuttava tulppa muodostettiin asettamalla verihyytyrniä tuottava pinta (0-vahvuista silkkilankaa, 5 cm pitkä, Ethicon Inc., So- f merville, NJ) oikovirtaukseen. Käytettiin neljää peräk-käistä 15 minuutin oikovirtausjaksoa, joista ensimmäinen ; ,·, 25 koostui vehiikkeli-infuusiosta, sen jälkeen kasvavista konsentraatioista yhdistettä 16, SC-47643, suolaliuokses- * · ta, jossa oli DMF:a, tai suolaliuoksesta, jossa oli sit-*’ ‘ ruunahappoa ja joka annettiin boluksena, sen jälkeen in- fuusiosta, joka aloitettiin 5 min ennen verihyytymiä tuot-30 tavan pinnan asettamista ja jota jatkettiin vielä 15 min ajan. Kunkin 15 min oikovirtausjakson lopussa silkki pois-·,*, tettiin varovasti ja punnitiin. Viidettä oikovirtausta, joka tapahtui välittömästi sen jälkeen, kun kumulatiivinen kokonaishoitoannos oli annettu, käytettiin määritettäessä 35 vaikutuksen kestoa, joka ilmoitettiin aikana, joka kului 27 113763 täydelliseen tukkeutumiseen. Tulpan paino laskettiin vähentämällä silkin paino ennen paikoilleen asettamista silkin kokonaispainosta oikovirtauksesta poistamisen jälkeen. Valtimoverta otettiin ennen ensimmäistä oikovirtausta sekä 5 kunkin oikovirtausjakson jälkeen ja siitä määritettiin kokoveren kollageenin aiheuttama verihiutaleiden kasautuminen, trombiinin aiheuttama verihiutaleiden hajaantuminen (verihiutaleiden ATP:n vapautuminen), protrombiiniaika ja verihiutaleiden lukumäärä. Templaatin vuotoaika suoritet-10 tiin, aloittaen 10 minuutin kohdalla, kussakin oikovirtaus j aksossa.

Hematologiset tutkimukset

Verihiutaleiden, valkosolujen ja punasolujen lukumäärät ja hematokriittimääritykset suoritettiin kokoveres-15 tä, jota oli otettu 2 mg/ml:aan dinatrium-EDTA:ta, käyttäen Sysmex™ KlOOOra (Baxter Laboratories, McGraw Park, IL. ).

Kokoveren verihiutaleiden kasautuminen ja ATP:n vapautuminen mitattiin käyttäen lumiaggroraetriä (Chrono-20 log, Havertown, PA), tallentaen näennäisvastuksen (verihiutaleiden kasautuminen) ja valonläpäisyn (ATP:n vapau-*. tuminen) muutos sekoitetun (1 000 rpm) kokoverisuspenion läpi, pitäen lämpötila 37 °C:ssa. Verinäytteet otettiin 0,01 M natriumsitraattiin ja laimennettiin 50-%risesti 25 suolaliuoksella, johon oli lisätty 0,5 mM Cara (25 μΐ 0,02 M CaCl2:a ja 20 μΐ lusiferolia (Chrono-log, Havertown, * PA). Lopullinen tilavuus oli 1 ml. Kasautuminen aiheutet- ‘ tiin kollageenilla (2 pg/ml), ja samanaikaisesti erilli sessä näytteessä verihiutaleiden haajaantumista seurat-30 tiin, käyttäen trombiinia (0,5 U/ml) (Chrono-log, Haver-: town, PA), ja muutokset näennäisvastuksessa ja luminesens- sissä tallennettiin 6 min ajan. Protrombiiniaikaa (PT) seurattiin käyttäen mikronäytteelle tarkoitettua koagulaa-tioanalysaattoria (Ciba Corning 512, Corning, NY). Temp-35 laatin vuotoaikaa, joka suoritettiin tekemällä viilto ku- 28 113763 miin (Surgicutt, ITC Corp., Edison, NJ), ja aikaa hyytymän muodostumiseksi seurattiin.

Lääkkeet

Yhdiste 16; 1 + 0,03, 3 0 0,1 ja 5 + 0,3 mg/kg, iv 5 (bolus) + mg/kg/tunti, iv (infuusio) solubilisoitiin suolaliuokseen + DMFtiin (5 %) ja sarjalaimennettiin kantayh-disteelle ilmoitettujen konsentraatioiden saamiseksi.

Tilastollinen analyysi

Tulokset esitetään taulukoissa 2-4. Kaikki arvot 10 ilmoitetaan keskiarvona ja keskiarvon keskivirheenä. Muutoksen tilastollisen merkitsevyyden arviointi perustui muutokseen, joka poikkesi perusviivasta, käyttäen varianssianalyysiä ja Studentin t-testiä. Erot katsottiin merkitseviksi, kun P < 0,05.

15 Taulukko 2

Tukoksia muodostavan tulpan muodostumisen todennäköisyys käsittelyjaksojen aikana ja kumulatiivisen annoksen jälkeen. Annetut arvot kuvaavat eläinten lukumäärää per ryhmä, joissa on ilmennyt nolla veren oikovirtausta 20 eikä oikovirtaus ole enää avoin. Koiria seurattiin 60 min käsittelyn jälkeisen toipumisjakson aikana.

> ‘ ’» Ryhmä Jakso 1 Jakso 2 Jakso 3 Jakso 4 Käsittelyn . »' Kontrolli Käsittely Käsittely Käsittely jälkeen •i. Vehikkeli Annos 1 Annos 2 Annos 3 : : 25 ' Kontrolli 4/4 2/4 1/4 4/4 4/4 . * . (DMF 5 *) • ·. ’ CP nro 16 4/4 2/4 1/4 0/4 3/4 : ; j 30 Kontrolli 5/5 5/5 5/5 5/5 t (Sitruuna- ; ; happo) ' · * > I t t > » » * 29 1 13763

Taulukko 3

Yhdisteen nro 16 vaikutus tulpan painoon ja vuoto- aikaan.

Käsittely- N Oikovirtaus- Tulpan paino Vuotoaika 5 ryhmä jakso (mg) (sekunteja)

Kontrolli 4 Perusviiva 119 ± 18 DMF 5 % 4 1 - Vehlkkeli 58 ± 5 116 ± 27 4 2 - Annos 1 56 ± 5 120 ± 15 10 4 3 - Annos 2 55 t 6 104 i 15 4 4 - Annos 3 63 ± 5 121 i 27

Yhdiste nro 16 4 Perusviiva 101 ± 11 4 1 - Vehikkeli 68 ± 5 84 ± 8 15 4 2 - Annos 1 52 1 3 94 ± 7 4 3 - Annos 2 27 ± 1» 123 ± 14 4 4 - Annos 3 19 ± 2* 241 ± 23*

Kontrolli 5 Perusviiva 103 ± 14 20 Sitruunahappo 5 1 - Vehikkeli 80 ± 5 80 ± 6 5 2 - Annos 1 69 ± 4 88 ± 10 5 3 - Annos 2 65 ± 7 93 * 18

Kaikki arvot on ilmoitettu keskiarvo ± SEMrnä. Kaikki parametrit tallennettiin välittömästi kunkin oikovir-25 tausjakson jälkeen käsittelyn vaikutusten arvioimiseksi.

* Studentin t-testi vs. esikäsittely, P < 0,05.

» 4 f » 4 » * · ► · > · > » « » I 1

I I

* t t * % 30 113763

Cl c ·

3 -H -H -H

3 E -H 10

P 3 5-5 ^ -P M

,|J .jj φ g co <η m r*· n r** ro ro α> 9> co h +J(J)

O) 3 OM +1 +1+1+1« +l+t«+l+t +I+I+4+4 <D CO

y ® 4) *H +J ©COiNOin H CO © CO © G ‘«"j

n (f) 6 +J C ro ro ro ro ro ^ v » co ro in in in ir Γ C

ΖΓ\ Zl MC® r+HHrHrH rHr+»-tf«i« H H P rl ii,

<D (Q Ό :o ►. 0) -H

£ X J?Ä2 H O

H ^ H "H

(Ojit (O H O Oi (MD co (0 > ψ io io in ro in h « co « σι p j | (rt ^ C4)ÖI +«+1+1+1+« «+«+!+«+« +1+1+1+1

, -H OCX CO CO rl CO

rn Λ. ί -h s σι oi (N oi fO r- rH r* rH rH ro ro co co \ _

_1 VU 4) M B Ulliin ΙΟΌ (Ο Ί1 ’f ^ PPPP +^C

'“J ^ J> Qt *—«· rl H rt H H rt rt rt rt rt >n| jT? '2 (0 M n .5 -μ -μ w •H 2 g 3

J3 £ i >8 S S +J

e: Xrt o -h ta 1U 3

0 -H 5 JS f %X

(T H «o «o #> * * (0

Hji» «> — * * ro n. — ij νϋ «0 3 ro in Ό (N v oi io h o rt rl ro © m MO (Π s Ή -h C ir 1 H ^ o +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 ^ (0 c cu-h ro in ό n 10 10 σι ί· σι o (N h in o ro — er-( 0) Φ e H Oi O (O in rH V h M 4) > 3 rH 'Π Su

E= 3 σ» +j V

S n «3D ,j r| (0 rH +^ Φ Jj fll l-Tl JJ rH V « (Tl Φ

UIΉ o 0) id £5 JJ

a) « +j jc ä |T

s I ! S i S o M £ .

•IU .C z; φ M 4-* C4 k* ,0*

L 5 Φ £-H li u LO

,*J □ JJ rt o o ·· O

2 ® 3 " « * 2 C ° E m O "3“ * “®o ö I—I Qj rH -H C * * +-* Ui u) .ΪΓ1 ·ηΛ4) ro ro ro ro ro ro ,c u

CrH O C *r! c 4) JC V

_, 2 rt li rt +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 « +j , I _I

O) Ή C rt o e +! vj jJl /-h . 1 λ>3 ro r·* co *· m r«. o (O n h h -h ra Cl, Ό bs n S ro h N Η φ .JL ^ -M 0) *P O =* 3 Λ ^

^ ΛΥ >rt ^ +J (0 O

m (1) C +-> +-> u> s r· ^ T hifi 1 o « r5?Su H U) =U o u x l-| O 3? S”h «j»® .3 s c s • · * ’S ε ® ^ 2 2 w •n rH 3. ro o ro in ro in ro 1^ Ό O (N Ό ro cn roro·^^ _V 3

Ci ^ ra «OM (N (N (N rO H (O N1 (N N (N (N CN N N ΓΟ CO ΓΟ —t AU

** H r 4-> P O (o TJ

* * (I) <n Ό 3 M O +i +i « +i +« +» +» +1+1+1+1+1+1+1 ♦» « +t +1 . 1 i ,¾

r Φ k. -H M O

®S Oi CO CO CO «O (N (N σι O N (O (O σι O r- m CO <*) I , u !.

,,, rl m rt 3 η tn rH r- r- ro ro rH o ro ro ro ro ro ro h h rt h +^,(/)

U3 γμ ro oj (N CN (N (N rt< co co co (O ro «o ro ro ro CO M ‘H

(0.^«3Χ

36« >H“ S O

: : : t! § «s B c c : .·. - II -h i I „ g o >

:!* -rJ i 0) 1 rH (U 4) rH <D Φ rH C

, , . Ϊ ^ (0 Λ% « 41 H (N ro £ £ «rlNrOÄi 4>rH(N _| . _, (0 ΛΛ Ui 3 «0 X Ό Ό «0 X :0 Ό «0 X ^

k' W m «o > jc 10 m 10 >1 >1 > ^ io 10 n s >1 > jc mo -H _3 U

» t* -ri-HoooEB-H-HOooee-H-Hoo Ή

**. wfl) ^ -HJCCCC -riÄCCC rt £ c c vCO

10^0) Ti o S 5; S S 5 -S -5 cc<u

Hfifi 2,,,,EB 2,,,,eE S,,, o 3 "P

d)-H*H«d <u οοφ 004) v*l Ο^ίΟ O-·-) cu rH (N ro ro ro o, h (N ro H1 ro ro n h (N ro ; · p -h a ti ή

c 0) c z ^ «ί* ^j· ^ ^ "sj· ro ro ro ro kI^C

rt· h a) r w -h : : diop:e e m2ti

OQ)+JQ)p h g ®EC

J0Q)3>-& o & :Od) : . . 2+>-rt ^ ^ h ^5 ·η«ό * c a:4->3 H-H-HC* S 03 λ:·η« : : 3^0 i i1" “ ie -ddw EHi>wS S o f S3 «>* 3i 113763

Esimerkit

Suojatut aminohapot ostettiin Bachem Bioscience Inc.:sta. Suojattujen amino-N-hydroksisuksinimdiesterien käyttö sulkee pois BOP-Cl:n käytön (katso yhdisteen 14 5 synteesi). Enantiomeerisesti rikastettuja nipekotiinihap-pometyyliestereitä eristettiin hajoittamalla kiraalisesti raseemista ainetta julkaisussa kuvatulla tavalla (A. M. Akkerman, Rec. Trav. Chim. Pays-Bas 1951, 70, 899). Kaikki muut kemikaalit hankittiin Aldrich Chemical Company, 10 Inc.rsta. Suurikenttäiset *Η NMR -spektrit tallennettiin Bruker AC-360-spektrometrillä taajuudella 360 MHz, ja kyt-kentäkertoimet annetaan hertseinä. Sulamispisteet määritettiin Mel-Temp II -sulamispisteen määrityslaitteessa, ja ne ovat korjaamattomia. Mikroanalyysit suoritettiin 15 Robertson Microlit Laboratories, Inc.rssa, Madison, New Jersey, tai R. W. Johnson Pharmaceutical Research -instituutin analyyttisellä osastolla. Lopulliset yhdisteet puhdistettiin uudelleenkiteyttämällä/saostamalla yleisistä orgaanisista liuottimista ja/tai pylväskromatografoimalla, 20 käyttäen Merckin silikageeliä 60. Puhtaudet määritettiin Beckam/Waters HPLC System'in ja Phenomenex-Ultracarb 5 ODS (30) -pylvään (100 x 4,6 mm) yhdistelmällä, käyttäen ase- ;5, tonitriilin vesiliuosta liikkuvana faasina (tavallisesti * % ;t 10 % MeCN/90 % vesi). Esimerkeissä ja kaikkialla tässä !’*. 25 hakemuksessa seuraavilla lyhenteillä on alla olevat merki- ; ”, ‘ tykset: • * : Ac = asetyyli · Bn tai Bzl = bentsyyli

Boc = t-butoksikarbonyyli 30 B0P-C1 = bis( 2-okso-3-oksatsolidinyyli )fosfiinikloridi Cbz = bentsyylioksikarbonyyli CP = yhdiste *,,! DiBAL = di-isobutyylialuminiumhydridi EDC = etyylidimetyyliaminopropyylikarbodi-imidi ^ 35 EDTA = etyleenidiamiinitetraetikkahappo 32 113763 HOBT = hydroksibentotriatsoli i-Pr = isopropyyli NMM = N-metyylimorfoliini

Nip = nipekotyyli (ellei toisin ole mainittu, raseeminen 5 3-asemasta) PTSA = p-tolueenisulfonihappo RT = huoneenlämpötila TFA = trifluorietikkahappo

Esimerkki 1 - N“-Boc-D-Lys-S-(+)-Nip-8-Ala-0H (yhd.

10 nro 14)

Seokseen, jossa oli Na-Boc-D-Lys(Cbz)-OH:ta (2,9 g, 7.7 mmol CH2Cl2:ssa (80 ml) 5 °C:ssa, lisättiin BOP-Cl:a (1,96 g, 7,7 mmol) ja NMM:a (0,83 ml, 7,7 mmol). Tätä seosta sekoitettiin 30 minuuttia, sitä käsiteltiin (S)- 15 (+)-nipekotiinihappometyyliesterihydrokloridilla (1,39 g, 7.7 mmol) ja NMM:11a (0,83 ml), sekoitettiin kaksi tuntia 5 °C:ssa ja laimennettiin kylläisellä NH4Cl:lla (50 ml). Orgaaninen kerros erotettiin vesikerroksesta, kuivattiin MgS04:lla ja haihdutettiin lasimaiseksi kiinteäksi aineek- 20 si. Tämä kiinteä aine puhdistettiin tasapainokromatogra- foimalla (4 % EtOH/CH2Cl2), jolloin saatiin Na-Boc-D-Lys-(Cbz)-S-( + )-Nip-OMe:ä valkoisena vaahtona; ·. ^-NMR (CDClg) 6 7,30 (m, 5 H), 5,50 (m, 1H), 5,09 (s, 2H), 4,61 (m, 1 H), 3,92 (m, 1 H), 3,66 (s, 3 H), 3,20 (m, 4 25 H), 2,79 (m, 1 H), 2,51 (m, 1 H), 2,12 (m, 1 H), 1,50 - V 1,80 (m, 10 H), 1,39 (s, 9 H); MS m/e 506 (MH+).

Liuokseen, jossa oli Na-Boc-D-Lys(Cbz)-S-(+)-Nip-• ‘ ‘ 0Me:ä (3,52 g, 7,0 mmol) THF:ssa (25 ml) huoneenlämpöti lassa, lisättiin litiumhydroksidin vesiliuosta (0,19 g 30 15 ml:ssa vettä) tipoittain 3 min ajan. Tätä liuosta se- : koitettiin kuusi tuntia ja se haihdutettiin kuiviin, jol- ;·' t loin saatiin valkoista vaahtoa. Tämä vaahto suspensoitiin CH2Cl2:een (80 ml) huoneenlämpötilassa ja sitä käsiteltiin peräkkäin Η-β-Ala-OBn· PTSA: 11a (2,43 g, 7,0 mmol), 35 HOBT: 11a (5 mg), EDC-HCl:lla (1,98 g, 10,4 mmol) ja 33 113763 NMM:lla (0,76 ml, 7,0 mmol). Tätä seosta sekoitettiin 13 tuntia, se laimennettiin kylläisellä NH4Cl:lla (50 ml) ja kerrokset erotettiin. Orgaaninen kerros kuivattiin MgS04:lla ja haihdutettiin, jolloin saatiin valkoista vaah-5 toa. Vaahto puhdistettiin tasapainokromatografoimalla (3 -4 % EtOH/CH2Cl2), jolloin saatiin Na-Boc-D-Lys(Cbz)-S-( + )-Nip-B-Ala-OBn valkoisena vaahtona; XH-NMR (CDC13) δ 7,35 (m, 10 H), 6,29 (m, 1 H), 5,45 (m, 1 H), 5,12 (s, 2H), 5,05 (s, 2H), 5,00 (m, 1H), 4,55 (m, 10 1 H), 4,32 (m, 1 H), 3,48 (m, 2 H), 3,19 (m, 4 H), 2,53 (m, 3 H), 2,21 (m, 1 H), 1,84 (m, 1 H), 1,48 - 1,72 (m, 9 H), 1,42 (s, 9 H); MS m/e 653 (MH+).

Liuokseen, jossa oli Na-Boc-D-Lys(Cbz)-S-(+)-Nip-B-Ala-0Bn:a (0,80 g, 1,22 mmol) THF:ssa (15 ml), Parr-pul-15 lossa typpiatmosfäärissä, lisättiin AcOH:a (5 ml), vettä (10 ml) ja Pd/C:tä (10 %, 0,09 g). Tätä seosta hydrattiin 50 psi/huoneenlämpötilassa 21 tuntia, se suodatettiin Celite-suodattimen läpi ja haihdutettiin noin 5 ml:ksi. Tätä liuosta käsiteltiin Et20:lla (60 ml), jolloin saatiin 20 valkoista saostumaa, joka suodatettiin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin yhdiste 14 värittöminä hiutaleina: sp.

. 52 - 60 °C; 1H-NMR (DMS0-d6) δ 7,85 (m, 1 H), 6,83 (d, J = 7, 1 H), 4,34 (d, J = 12, 1 H), 4,22 (m, 1 H), 3,60 (m, 2 H), 3,41 , 25 (m, 2 H), 2,98 (t, J = 11, 1 H), 2,88 (m, 1 H), 2,69 (m, 2 H), 2,35 (m, 2 H), 2,12 (m, 1 H), 2,03 (m, 1 H), 1,70 : (m, 2 H), 1,4 - 1,6 (m, 8 H), 1,35 ja 1,38 (pr.s, 8,5:1, v : 9 H), 1,16 (m, 2 H); IR (KBr) 3450 - 2860, 1709, 1641 cm’1; MS m/e 429 (MH+); [a]” - 15,20° (c 0,63, MeOH).

30 Anal, lasketut arvot C20H36N4O6»C2H4O2:lie (488,6): C, 54,08; H, 8,25; N, 11,47.

;]·, Saadut arvot: C, 54,64; H, 8,26; N, 10,79.

„ 113763

Esimerkki 2 - N“-Boc-L-Lys(Cbz)-Nip-B-Äla-OBn (yhd.

nro 1)

Yhdiste 1, joka valmistettiin lähtien Na-Boc-L-Lys-(Cbz)-OH:sta ja raseemisesta nipekotiinihappometyylieste-5 ristä, kuten esimerkissä 1, eristettiin lasimaisena aineena:

Hl-NMR (CDC13) 6 7,29 (m, 10 H), 6,51 (m, 1 H), 5,39 (m, 1 H), 5,11 (s, 2 H), 5,06 (s, 2 H), 4,94 (m, 1 H), 4,54 (m, 2 H), 4,18 (m, 1H) 4,02 (d, J = 10, 1 H), 3,61 (m, 1 10 H), 3,48 (m, 2 H), 3,17 (m, 4 H), 2,54 (m, 3 H), 2,20 (m, 1 H), 1,83 (m, 1 H), 1,67 (m, 2 H), 1,51 (m, 4 H), 1,39 (s, 9 H); MS m/e 653 (MH+);

Anal, lasketut arvot C35H48N408· 1,5H20:lie (679,8): C, 61,84; H, 7,56; N, 8,24.

15 Saadut arvot: C, 62,00; H, 7,25; N, 8,23.

Esimerkki 3 - Ne-Boc-L-Lys-Nip-8-Ala—OH (yhd. nro 2)

Yhdiste 2, joka valmistettiin hydraamalla yhdiste 1 esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, eristettiin valkoisena 20 vaahtona: "H-NMR (DMS0-d6) δ 8,00 (m, 1 H), 7,86 (m, 1 H), 4,29 (m, V: 2 H), 3,82 (m, 1 H), 3,11 (m, 3 H), 2,70 (m, 2 H), 2,53 . (m, 1 H), 2,31 (m, 2 H), 2,17 (m, 2 H), 1,4 - 1,9 (m, 10 H), 1,34 ja 1,36 (pr.s, 1:1, 9 H), 1,23 (m, 2 H); MS 25 m/e 429 (MH+); [a]“ + 0,85° (c 0,82, MeOH).

/,' Anal, lasketut arvot C20H36N4O6· 1,5H20: lie (518,6): C, 53,27; H, 8,16; N, 10,80.

’ Saadut arvot: C, 53,61; H, 8,18; N, 10,47.

Esimerkki 4 - N“-Boc-D-Lys-Nip-8-Ala--0H (yhd. nro 30 3) / Na-Boc-D-Lys( Cbz )-Nip-8-Ala-0Bn, joka valmistettiin :v, lähtien raseemisesta nipekotiinihappometyyliesteristä ja

Na-Boc-D-Lys(Cbz)-OH:sta esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, eristettiin valkoisena vaahtona: 35 113763

Hi-NMR (CDClj) δ 7,32 (m, 10 H), 6,59 (m, 1 H), 5,45 (m, 1 H), 5,12 (s, 2H), 5,07 (s, 2 H), 4,94 (m, 1 H), 4,56 (m, 1 H), 4,12 (m, 1 H), 3,51 (m, 2 H), 3,17 (m, 3 H), 2,57 (m, 2 H), 2,21 (m, 1 H), 1,89 (m, 1 H), 1,45 - 1,79 (m, 5 11 H), 1,41 (s, 9 H); MS m/e (MH*).

Yhdiste 3, joka valmistettiin hydraamalla N°-Boc-D-Lys(Cbz)-Nip-8-Ala-0Bn esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, eristettiin värittöminä hiutaleina: sp. 48 - 54 °C; ^-NMR (DMS0-d6) 6 7,96 (m, 1 H), 6,82 (m, 1 H), 4,30 (m, 10 2 H), 3,81 (m, 1 H), 3,12 (m, 4 H), 2,69 (m, 2 H), 2,56 (m, 1 H), 2,33 (m, 2 H), 2,14 (m, 2 H), 1,80 (m, 2 H), 1,4 - 1,7 (m, 9 H), 1,32 ja 1,34 (pr.s, 1:1, 9 H), 1,22 (m, 2 H); IR (KBr) 3580 - 2770, 1711, 1642 cm-1; MS m/e 429 (MH+); [a]n5 - 7,78° (c 1,71, MeOH).

15 Anal, lasketut arvot C20H36N4O6*2C2H4O2»0, 5H20: lie (557,6): 0,51,69; H, 8,13; N, 10,05.

Saadut arvot C, 51,46; H, 8,11; N, 10,10.

Esimerkki 5 - Na-Boc-D-Lys-Nip-L-Asp-OMe (yhd. nro 18) 20 Na-Boc-D-Lys(Cbz)-Nip-L-Asp(Obn)-OMe, joka valmis tettiin H-L-Asp(0Bn)-0Me:sta ja Na-Boc-D-Lys(Cbz)-Nip-0H:sta esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, eristettiin lasi-maisena aineena: .:. ^-NMR (CDCI3) 6 7,36 (m, 10 H), 6,84 (m, 1 H), 5,40 (m, '1' 25 1 H), 5,14 (s, 2 H), 5,09 (s, 2 H), 4,88 (m, 2 H), 4,54 (m, 1 H), 4,30 (m, 1 H), 3,68 (s, 3 H) 3,19 (m, 3 H) 3,03 (m, 1 H), 2,89 (m, 1 H), 2,29 (m, 1 H), 1,43 - 2,06 (m, v : 12 H), 1,40 (s, 9 H); MS m/e 711 (MH*).

Yhdiste 18, joka valmistettiin hydraamalla Na-Boc-D-30 Lys(Cbz)-Nip-L-Asp(0bn)-0Me esimerkissä 1 kuvatulla taval-: : la, eristettiin valkoisena vaahtona: V, "H-NMR (DMS0-d6) 6 8,33 (m, 1 H), 6,77 (d, J = 7, 1 H), 4,32 (m, 3 H), 3,82 (m, 1 H), 3,59 (s, 3 H), 2,96 (m, ;·’ 2 H), 2,73 (m, 3 H), 2,46 (m, 2 H), 2,34 (m, 1 H), 1,79 35 (m, 3 H), 1,4 - 1,7 (m, 8 H), 1,34 ja 1,37 (pr.s, 1:1, 36 113763 9 H), 1,27 (m, 2 H); MS m/e 487 (MH+); [a]“-3,57° (c 0,56, MeOH).

Anal, lasketut arvot 022Η38Ν408·02Η402·Η20: lie (564,6): C, 51,05; H, 7,85; N, 9,92.

5 Saadut arvot: 50,89; H, 7,88; N, 9,74.

Esimerkki 6 - H-L-Lys-Nip-B-Ala-OH (yhd. nro 4)

Liuokseen, jossa oli yhdiste 2 (0,30 g, 0,70 nunol) MeOH:ssa (10 ml) ja vedessä (10 ml) huoneenlämpötilassa, lisättiin HCl:a (0,50 ml, väkevää). Tätä liuosta sekoitet-10 tiin yksi tunti ja se haihdutettiin n. 2 ml:ksi öljyä. Tätä öljyä käsiteltiin MeCN:lla (20 ml), se suodatettiin, pestiin Et20:lla (3 x 20 ml) ja kuivattiin, jolloin saatiin yhdiste 4 valkoisena jauheena: sp. 65 - 75 °C; XH-NMR (DMS0-d6) δ 8,23 (m, 3 H), 8,06 (m, 3 H), 4,33 (m, 15 2 H), 3,73 (m, 4 H), 3,25 (m, 2 H), 3,01 (m, 1 H), 2,72 (m, 2 H), 2,44 (m, 1 H), 2,34 (m, 2 H), 1,5 - 1,8 (m, 6 H), 1,35 (m, 4 H); MS m/e 329 (MH+).

Anal, lasketut arvot C15H28N404»2HC1»2H20: lie (437,4): C, 41,19; H, 7,84; N, 12,81.

20 Saadut arvot: C, 40,97; H, 7,75; N, 12,14.

Esimerkki 7 - N- (Ne-aminokaproyyli)-Nip-B-Ala-OH

(yhd. nro 5) ; _ N-(Ne-Boc-aminokaproyyli)-Nip-B-Ala-OBm:a, joka val mistettiin raseemisesta nipekotiinihappometyyliesteristä '; 25 ja Ne-Boc-aminokaproiinihappo-N-oksisuksinesteristä esimer- • kissä 1 kuvatulla tavalla, eristettiin öljymäisenä jään- ;· nöksenä: V : 1H-NMR (CDC13) 6 7,34 (m, 5 H), 6,51 (m, 1 H), 5,12 (s, 2 H), 4,60 (m, 1 H), 4,39 (m, 1 H), 3,90 (m, 1 H), 3,71 ( 30 (t, 1 H), 3,52 (m, 3 H), 3,19 (m, 4 H), 2,59 (m, 2 H), 2,30 (m, 2 H), 1,85 (m, 3 H), 1,63 (m, 2 H), 1,51 (m, 2 H), 1,42 (s, 9 H), 1,34 (m, 2 H); MS m/e 504 (MH+).

Yhdiste 5, joka valmistettiin hydraamalla ja sitten hydrolysoimalla N-(Ne-Boc-aminokaproyyli)-Nip-B-Ala-0Bm:a 37 113763 esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, eristettiin lasimaisena aineena: ^-NMR (DMSO-d6) 6 8,18 (t, J = 5, 1 H), 8,04 (br. s, 3 H), 4,28 (m, 2 H), 3,78 (m, 2 H), 3,20 (m, 3 H), 2,99 (t, J = 5 12, 1 H), (d, J = 6, 2 H), 2,39 (m, 2 H), 2,31 (m, 2 H), 2,16 (m, 1 H), 1,79 (m, 1 H), 1,61 (m, 4 H), 1,42 (t, J = 6, 2 H), 1,28 (m, 2 H), 1,19 (m, 1 H); MS m/e 314 (MH*); Anal, lasketut arvot C15H27N304»2HCl:lle (386,3); C, 46,04; H, 7,57; N, 10,88.

10 Saadut arvot; C, 45,91; H, 7,63; N, 11,17.

Esimerkki 8 - N-[3-(4-piperidiinipropionyyli)]-Nip- 8-Ala-0H (yhd. nro 17) N-[3-(4-pyridiiniakryloyyli)]-Nip-8-Ala-0Bn:a,joka valmistettiin 3-(4-pyridiini)akryylihaposta ja raseemises-15 ta nipekotiinihappometyyliesteristä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, eristettiin lasimaisena aineena: 1H-NMR (CDC13) δ 8,61 (d, J = 4 Hz, 2 H), 7,52 (d, J = 15 Hz, 1 H), 7,35 (m, 7 H) 7,03 (d, J = 15 Hz, 1 H), 6,58 (m, 1 H), 5,12 (s, 2 H), 4,40 (m, 1 H), 3,89 (m, 1 H), 3,51 20 (m, 2 H), 3,38 (m, 2 H), 2,60 (t, J = 6 Hz, 2 H), 2,31 (m, 1 H), 1,97 (m, 2 H), 1,74 (m, 1 H), 1,56 (m, 1 H); MS m/e 422 (MH*).

Liuokseen, jossa oli N-[3-(4-pyridiiniakryloyyli)]-Nip-8-Ala-0Bn:a (0,56 g, 1,33 mmol) EtOH:ssa (20 ml) ja ·, 25 vedessä (10 ml) typpiatmosfäärissä, lisättiin HCl:a ‘ (0,66 ml, 4,0 M dioksaanissa) ja platina(IV)dioksidia (0,060 g). Tätä seosta hydrattiin 50 psi/huoneenlämpöti-• ‘ lassa 22 tuntia, se suodatettiin Celite-suodattimen läpi ja haihdutettiin noin 5 ml:ksi. Tätä liuosta käsiteltiin 30 MeCN:lla (30 ml), se suodatettiin, pestiin Et20:lla (3 x 20 ml) ja kuivattiin, jolloin saatiin yhdiste 17 haalean-keltaisena vaahtona.

1H-NMR (DMS0-d6) 6 9,02 (br. s, 2 H), 8,03 (m, 1 H), 7,46 (m, 1 H), 4,28 (t, J = 7, 1 H), 4,11 (m, 1 H), 3,79 (m, 35 1 H), 3,44 (t, J = 7, 1 H), 3,19 (m, 3 H), 3,06 (t, J = > > 38 113763 12, 1 H), 2,75 (d, J - 11, 1 H), 2,53 (m, 1 H), 2,32 (m, 4 H), 2,12 (m, 1 H), 1,77 (m, 2 H), 1,4 - 1,7 (m, 7 H), 1,27 (m, 2 H), 1,18 (t, J = 6, 1 H); MS m/e 340 (MH*); Anal, lasketut arvot C17H29N304»2HCl:lle (412,4): C, 49,52; 5 H, 7,58; N, 10,19.

Saadut arvot: C, 49,15; H, 7,02; N, 10,48.

Tarkka protonoitu massa, laskettu yhdisteelle C17H29N3O4: 340,2236.

Saatu arvo: 340,2245.

10 Esimerkki 9 - Na-Ac-L-Lys-Nip-Gly-0H (yhd. nro 6)

Na-Ac-L-Lys(Boc)-Nip-Gly-OBn:a, joka valmistettiin Na-Ac-L-Lys(Boc)-OH:sta ja raseemisesta nipekotiinihappome-tyyliesteristä (katso 14), eristettiin lasimaisena aineena: 15 Hl-NMR (CDCI3) δ 7,35 (m, 5 H), 6,97 (m, 1 H), 6,38 (m, 1 H), 5,14 (s, 2 H), 4,70 (m, 1 H), 4,46 (m, 1 H), 4,06 (dd, J = 5, 16 Hz, 2 H), 3,71 (m, 1 H), 3,10 (m, 2 H), 1,99 (s, 3 H), 1,91 (m, 2 H), 1,64 (m, 1 H), 1,41 - 1,60 (m, 1 H), 1,39 (s, 9 H); MS m/e 547 (MH*).

20 Yhdiste 6, joka valmistettiin hydraamalla N“-Ac-L-

Lys(Boc)-Nip-Gly-OBn:a esimerkissä 1 kuvatulla tavalla ja poistamalla sitten TFA-välitteinen Boc (katso menetelmän kuvaus M. Bodanzky The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag: New York, 1984), eristettiin kullankel-25 täisenä jauheena: sp. 40 - 55 °C; 1H-NMR (DMS0-d6) δ 8,24 (t, J = 6, 1 H), 8,03 (d, J = 8, 1 H), 7,75 (br.s, 3 H), 4,24 (m, 1 H), 3,72 (t, 3 = 6, 1 2 H), 3,61 (m, 2 H), 2,72 (m, 2 H), 1,83 (s, 3 H), 1,78 (m, 2 H), 1,63 (m, 2 H), 1,4 - 1,6 (m, 8 H), 1,28 (m, 30 4 H); MS m/e 357 (MH+); : Anal, lasketut arvot C16H28N405»3C2HF302: lie (698,5): C, v. 37,83; H, 4,47; N, 8,02.

•f Saadut arvot 37,91; H, 4,89; N, 8,47.

39 113763

Esimerkki 10 - N“-Äc-L-Lys-Nip-B-Ala-OH (yhd. nro 7)

Na-Ac-L-Lys(Boc)-Nip-ö-Ala-OBn, joka valmistettiin lähtien Na-Ac-L-Lys(Boc)-OH:sta ja raseemisesta nipekotii-nihappometyyliestersitä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, 5 eristettiin valkoisena vaahtona: 1H-NMR (CDC13) δ 7,34 (m, 5 H), 6,53 (m, 2 H), 5,12 (s, 2 H), 4,58 (m, 1 H), 4,10 (m, 1 H), 3,72 (m, 1 H), 3,54 (m, 2 H), 3,11 (m, 3 H), 2,59 (m, 2 H), 2,24 (m, 1 H), 2,01 (s, 3 H), 1,88 (m, 1 H), 1,73 (m, 2 H), 1,52 (m, 8 10 H), 1,40 (s, 9 H), 1,31 (m, 1 H); MS m/e 561 (MH+).

Yhdiste 7, joka valmistettiin hydraamalla N“-Ac-L-Lys(Boc)-Nip-B-Ala-OBn esimerkissä 1 kuvatulla tavalla ja sitten happohydrolysoitiin esimerkissä 6 kuvatulla tavalla, eristettiin valkoisena vaahtona: sp. 53 - 67 °C; 15 ^-NMR (DMS0-d6) 6 8,13 (m, 1 H), 8,00 (m, 1 H), 7,91 (d, J = 15, 3 H), 4,64 (m, 1 H), 4,36 (m, 1 H), 3,87 (m, 1 H), 3,66 (m, 2 H), 3,23 (m, 3 H), 2,99 (m, 1 H), 2,68 (m, 2 H), 2,59 (m, 1 H), 2,38 (m, 2 H), 2,11 (m, 1 H), 1,80 (s, 3 H), 1,63 (m, 1 H), 1,4 - 1,6 (m, 5 H), 1,24 (m, 20 3 H); MS m/e 371 (MH+);

Anal, lasketut arvot C17H30N4O5»2HCl*2H2O:lle (479,4): C, 42,59; H, 7,57; N, 11,69.

*. Saadut arvot: C, 43,83; H, 7,79; N, 10,91.

Esimerkki 11 - Na-Boc-L-Arg-Nip-B-Ala-OH (yhd. nro . 25 8)

Na-Boc-L-Arg(Cbz)-Nip-B-Ala-OBn, joka valmistettiin » lähtien Na-Boc-L-Arg(Cbz2)-OSu:sta ja raseemisesta nipeko-' ‘ tiinihappometyyliesteristä esimerkissä 1 kuvatulla taval la, eristettiin lasimaisena aineena; 30 1H-NMR (CDCI3) δ 7,33 (m, 10 H), 6,69 (m, 1 H), 5,70 (m, 1 H), 5,13 (s, 2 H), 5,03 (s, 2 H), 4,59 (m, 1 H), 4,29 V. (m, 1 H), 3,52 (m, 2 H), 3,28 (m, 1 H), 3,09 (m, 3 H), 2,60 (m, 3 H), 2,18 (m, 1 H), 1,49 - 1,90 (m, 11 H), 1,42 (s, 9 H); MS m/e 681 (MH+).

40 113763

Yhdiste 8, joka valmistettiin hydraamalla Na-Boc-L-Arg(Cbz)-Nip-B-Ala-OBn esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, eristettiin valkoisena vaahtona; sp. 47 - 55 °C; 1H-NMR (DMS0-d6) δ 9,53 (m, 1 H), 7,85 (m, 2 H), 6,96 (m, 5 1 H), 4,32 (m, 2 H), 3,84 (m, 1 H), 3,38 (m, 2 H), 3,03 (m, 4 H), 2,20 (m, 3 H), 1,74 (m, 2 H), 1,4 - 1,7 (m, 8 H), 1,35 (s, 9 H), 1,24 (m, 2 H); MS m/e 457 (MH*);

Anal, lasketut arvot C20H36N5O6· 1,5C2H402:lle (546,6): C, 50,54; H, 7,74; N, 15,37.

10 Saadut arvot: C, 50,24; H, 7,96; N, 15,26.

Esimerkki 12 - Na-Boc-L-Lys-Nip-Y-aminovoihappo (yhd. nro 9) I^-Boc-D-LysiCbz)-Nip-Y-aminovoihappobentsyylieste-riä, joka valmistettiin lähtien Na-Boc-L-Lys(Cbz)-0H:sta ja 15 raseemisesta nipekotiinihappometyyliesteristä (katso 1-1, 1-2), eristettiin lasimaisena aineena: 1H-NMR (CDC13) δ 7,33 (m, 10 H), 6,48 (m, 1 H), 6,16 (m, 1 H), 5,40 (m, 1 H), 5,11 (s, 2 H), 5,08 (s, 2 H), 4,89 (m, 1 H), 4,58 (m, 1 H), 4,07 (m, 1 H), 3,22 (m, 5 H), 20 2,52 (m, 1 H), 2,40 (m, 2 H), 1,50 - 2,30 (m, 12 H), 1,42 (s, 9 H), 1,33 (m, 1 H); MS m/e 667 (MH*).

Yhdiste 9, joka valmistettiin hydraamalla Na-Boc-L-Lys(Cbz)-Nip-y-aminovoihappobentsyyliesteri esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, eristettiin valkoisena vaahtona: sp.

25 65 - 71 °C; V 1H-NMR (DMS0-d6) δ 8,25 (m, 1 H), 6,87 (m, 1 H), 4,31 (m, 3 H), 3,74 (m, 2 H), 3,15 (m, 2 H), 2,98 (m, 3 H), 2,69 (m, 2 H), 2,10 (m, 3 H), 1,76 (m, 3 H), 1,4 - 1,7 (m, 9 H), 1,31 (s, 9 H), 1,21 (m, 2 H); MS m/e 443 (MH*); 30 Anal. laskektut arvot C21H38N406»2C2H402: lie (562,7): C, , 53,37; H, 8,24; N, 9,96.

V. Saadut arvot: C, 53,94; H, 8,17; N, 9,70.

t 41 113763

Esimerkki 13 - H-D-Lys-Nip-fl-Ala-OH (yhd. nro 10)

Yhdiste 10, joka valmistettiin suorittamalla happo-hydrolyysi yhdisteelle 3 esimerkissä 6 kuvatulla tavalla, eristettiin kermanvärisenä jauheena: sp. 108 - 128 °C; 5 1H-NMR (DMS0-d6) δ 8,28 (m, 3 H), 8,05 (m, 3 H), 4,31 (m, 2 H), 3,84 (m, 2H), 3,25 (m, 2 H), 3,09 (m, 2 H), 2,72 (m, 3 H), 2,37 (m, 3 H), 1,80 (m, 1 H), 1,5 - 1,7 (m, 6 H), 1,33 (m, 4 H); MS m/e 329 (MH+);

Anal, lasketut arvot C15H28N404»2HC1»C2H402: lie (461,4): C, 10 44,26; H, 7,43; N, 12,14.

Saadut arvot: C, 43,98; H, 7,27; N, 12,29.

Esimerkki 14 - Na-Boc-D-Lys-Nip-y-aminovoihappo (yhd. nro 11) N^-Boc-D-LysiCbz J-Nip-y-aminovoihappobentsyylieste-lS riä, joka valmistettiin Na-Boc-D-Lys(Cbz)-OH:sta ja rasee-misesta nipekotiinihappometyyliesteristä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, eristettiin lasimaisena aineena: 1H-NMR (CDC13) δ 7,31 (m, 10 H), 6,51 (m, 1 H), 6,15 (m, 1 H), 5,48 (m, 1 H), 5,10 (s, 1 H), 5,06 (s, 2 H), 4,90 20 (m, 1 H), 4,55 (m, 1 H), 4,10 (m, 1 H), 3,59 (m, 1 H), 3,23 (m, 5 H), 2,39 (m, 2 H), 2,23 (m, 1 H), 1,84 (m, 2 H), 1,45 - 1,80 (m, 10 H), 1,38 (s, 9 H), 1,32 (m, 1 H); MS m/e 667 (MH*) .

Yhdiste 11, joka valmistettiin hydraamalla Na-Boc-D-·. 25 Lys(Cbz)-Nip-y-aminovoihappobentsyyliesteri esimerkissä 1 4 kuvatulla tavalla, eristettiin kullankeltaisena jauheena: f sp. 50 - 57 °C;

Hl-NMR (DMS0-d6) δ 7,97 (m, 1 H), 6,91 (m, 1 H), 4,32 (m, 1 H), 4,22 (m, 1 H), 3,82 (m, 1 H), 3,02 (m, 3 H), 2,71 30 (m, 2 H), 2,52 (m, 1 H), 2,29 (m, 1 H), 2,17 (m, 2 H), 1,84 (m, 5 H), 1,4 - 1,7 (m, 9 H), 1,33 (s, 9 H), 1,19 (m, 2 H); MS m/e 443 (MH+); * ", Anal, lasketut arvot C21H38N406»C2H402»0, 5H20: lie (571,7): C, t " 52,53; H, 8,29; N, 9,80.

35 Saaadut arvot: C, 52,91; H, 8,21; N, 9,39.

42 113763

Esimerkki 15 - N“-Boc-D-Lys-Nip-Gly-OH (yhd. nro 12)

Na-Boc-D-Lys(Cbz)-Nip-Gly-OBn, joka valmistettiin Na-Boc-D-Lys(Cbz)-OH:sta ja raseemisesta nipekotiinimetyy-liesteristä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, eristettiin 5 lasimaisena aineena: ^i-NMR (CDC13) 6 7,39 (m, 10 H), 6,87 (m, 1 H), 5,42 (m, 1 H), 5,19 (s, 2 H), 5,13 (s, 2 H), 4,93 (m, 1 H), 4,60 (m, 1 H), 4,20 (m, 1 H), 4,09 (m, 1 H), 3,40 - 4,00 (m, 3 H), 3,21 (m, 2 H), 2,61 (m, 1 H), 2,43 (m, 1 H), 1,45 -10 2,20 (m, 10 H), 1,39 (s, 9 H); MS m/e 639 (MH*).

Yhdiste 12, joka valmistettiin hydraamalla Na-Boc-D-Lys(Cbz)-Nip-Gly-OBn esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, eristettiin valkoisina hiutaleina; sp. 66 - 80 °C; ^-NMR (DMS0-d6) δ 7,82 (m, 1 H), 6,81 (d, J = 7, 1 H), 15 4,34 (m, 2 H), 4,09 (m, 1 H), 3,77 (m, 1 H), 3,48 (m, 1 H), 3,16 (m, 2 H), 2,70 (m, 3 H), 2,44 (m, 2 H), 2,28 (m, 1 H), 1,78 (m, 2 H), 1,4 - 1,7 (m, 8 H), 1,32 ja 1,35 (pr.s, 1:1, 9 H), 1,23 (m, 2 H); MS m/e 415 (MH*);

Anal, lasketut arvot C19H34N406»2C2H402: lie (534,6): C, 51,67; 20 H, 7,92; N, 10,48.

Saadut arvot: C, 52,06; H, 8,33; N, 10,19.

Esimerkki 16 - Ne-Ac-D-Lys-Nip-B-Ala-OH (yhd. nro 13)

Na-Ac-D-Lys(Cbz)-Nip-B-Ala-OBn:a, joka valmistettiin ; ^ 25 Na-Ac-D-Lys(Cbz)-OH:sta ja raseemisesta nipekotiinihappome- * * · tyyliesteristä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, eristet-tiin lasimaisena aineena: 1H-NMR (CDCI3) 6 7,32 (m, 10 H), 6,54 (m, 1 H), 6,36 (m, 1 H), 5,10 (s, 2 H), 5,02 (s, 2 H), 4,89 (m, 2 H), 4,48 ./I' 30 (m, 1 H), 4,04 (m, 1 H), 3,69 (m, 1 H), 3,52 (m, 2 H), \’j 3,17 (m, 3 H), 2,57 (m, 2 H), 2,20 (m, 1 H), 1,98 (s, :v, 3 H), 1,25 - 1,90 (m, 10 H); MS m/e 595 (MH*).

( ·· Yhdiste 13, joka valmistettiin hydraamalla Na-Ac-D- ’’’ Lys(Cbz)-Nip-B-Ala-OBn esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, 35 eristettiin lasimaisena aineena: sp. 46 - 59 °C; 43 113763 1H-NMR (DMSO-d6) 6 8,11 (m, 3 H), 4,70 (m, 1 H), 4,33 (m, 1 H), 3,74 (m, 1 H), 3,38 (m, 1 H), 3,19 (m, 4 H), 3,00 (m, 1 H), 2,68 (m, 2 H), 2,21 (m, 4 H), 1,82 (s, 3 H), 1,76 (m, 2 H), 1,4 - 1,7 (m, 7 H), 1,24 (m, 2 H); MS m/e 5 371 (MH+);

Anal, lasketut arvot C17H30N4O5·2,5C2H402:lie (520,6): C, 50,76; H, 7,74; N, 10,76.

Saadut arvot: C, 51,12; H, 8,04; N, 10,75.

Esimerkki 17 - N“-Boc-L-Lys(i-Pr)-Nip-B-Ala-OH (yhd.

10 nro 15)

Na-Boc-L-Lys(i-Pr)(Cbz)-Nip-B-Ala-OBn, joka valmistettiin Na-Boc-L-Lys(i-Pr)(Cbz)-OH:sta ja raseemisesta ni-pekotiinihappometyyliesteristä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, eristettiin lasimaisena aineena: 15 1H-NMR (CDC13) δ 7,33 (m, 10 H), 6,58 (m, 1 H), 5,10 (s, 2 H), 5,08 (s, 2 H), 4,55 (m, 1 H), 4,21 (m, 1 H), 3,73 (m, 1 H), 3,50 (m, 2 H), 3,17 (m, 3 H), 2,55 (m, 2 H), 2,18 (m, 1 H), 1,50 - 2,00 (m, 13 H), 1,40 (s, 9 H), 1,13 (d, J = 8 Hz, 6 H); MS m/e 695 (MH*).

20 Yhdiste 15, joka valmistettiin hydraamalla N°-Boc-L-

Lys(i-Pr)(Cbz)-Nip-B-Ala-OBn esimerkissä 1 kuvatulla ta-'· valla, eristettiin valkoisina hiutaleina; sp. 90 - 123 °C; 1H-NMR (DMS0-d6) 6 7,93 (m, 1 H), 6,81 (d, J = 7, 1 H), 4,36 (m, 1 H), 4,24 (m, 1 H), 3,60 (m, 1 H), 3,37 (m, 25 1 H), 3,10 (m, 1 H), 2,91 (m, 3 H), 2,62 (m, 3 H), 2,39 (m, 2 H), 2,14 (m, 1 H), 2,05 (m, 1 H), 1,4 - 1,8 (m, 9 H), 1,34 ja 1,37 (pr.s, 1:1, 9 H), 1,26 (m, 3 H), 1,13 (d, : J = 5, 6 H); IR (KBr) 3500 - 2830, 1704, 1638 cm-1; MS m/e 471 (MH+); 30 Anal, lasketut arvot C23H42N406»2C2H402: lie (590,7): C, 54,90; : H, 8,53; N, 9,48. Saadut arvot C, 54,67; H, 8,65; N, 9,79.

Esimerkki 18 - Na-Boc-D-Lys-R-(-)-Nip-8-Ala-0H (yhd.

nro 16)

Yhdiste 16, joka valmistettiin lähtien Na-Boc-D-Lys-35 (Cbz)-0H:sta ja R-( - )-nipekotiinihappometyyliesteristä 44 113763 esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, eristettiin värittöminä hiutaleina: sp. 42 - 51 °C; ^-NMR (DMSO-d6) δ 7,95 (m, 1 H), 6,82 (d, J = 7, 1 H), 4,33 (m, 1 H), 4,19 (m, 1 H), 3,79 (m, 1 H), 3,25 (m, 5 1 H), 3,04 (t, J = 10, 2 H), 2,69 (m, 2 H), 2,34 (m, 1 H), 2,21 (m, 1 H), 2,14 (m, 2 H), 1,78 (m, 2 H), 1,71 (m, 2 H), 1,4 - 1,6 (m, 9 H), 1,34 ja 1,38 (pr. s, 1:8, 9 H), 1,20 (m, 2 H); MS m/e 429 (MH+).

Anal, lasketut arvot C20H36N404»2, 5C2H402:lle (578,7): C, 10 51,89; H, 8,01; N, 9,68.

Saadut arvot: C, 52,05; H, 7,98; N, 9,58.

Esimerkki 19 - N- (N€-aminokaproyyli)-3-piperidiini-metyyliaminopropionihappo (yhd. nro 19)

Liuokseen, jossa oli N-(Ne-aminokaproyyli )nipekotii-15 nihappoa (3,1 g, 9,0 mmol) ja THF:a (50 ml), lisättiin 1,1-karbonyylidi-imidatsolia (1,45 g, 9,0 mmol). Tätä liuosta sekoitettiin yksi tunti, se jäähdytettiin -10 °C:seen, sitä käsiteltiin DiBAL:lla (36,0 ml, 1,0 M tolueenissa) tipoittain 20 minuutin ajan, ja sitä sekoi-20 tettiin vielä kaksi tuntia. Tätä liuosta käsiteltiin sitruunahapon vesiliuoksella (5,0 g 40 ml:ssa vettä), se lai-V; mennettiin CHCl3:lla (200 ml) ja syntyneet kerrokset ero- . tettiin. Vesikerros uutettiin CHCl3:lla (100 ml) ja yhdis- tetyt orgaaniset kerrokset kuivattiin, haihdutettiin ja 25 puhdistettiin tasapainokromatografoimalla (4 % EtOH/ CH2C12), jolloin saatiin N-(Ne-Boc-aminokarproyyli)piperi-diini-3-karboksialdehydiä lasimaisena aineena: 1H-NMR (CDC13) δ 9,65 (d, J = 8 Hz, 1 H), 4,58 (m, 1 H), 4,10 (m, 1 H), 3,65 (m, 1 H), 3,45 (m, 1 H), 3,22 (m, 30 1 H), 3,14 (m, 2 H), 2,46 (m, 2 H), 2,33 (t, J = 7 Hz, 1 H), 2,09 (m, 1 H), 1,5 - 1,8 (m, 7 H), 1,39 (s, 9 H), :·!·. 1,33 (m, 2 H); MS m/e 327 (MH+).

.’t Liuokseen, jossa oli N-(Ne-Boc-aminokarproyyli )pipe- ridiini-3-karboksialdehydiä (0,69 g, 2,12 mmol) MeOH:ssa ,,,· 35 (10 ml) huoneenlämpötilassa, lisättiin Η-β-Ala-OBn* PTSA:ta 45 113763 (0,74 g, 2,12 mmol) ja NaCNBH4:ä (0,13 g, 2,12 mmol). Tätä seosta sekoitettiin 2,5 tuntia ja se haihdutettiin valkoiseksi kiinteäksi aineeksi. Tämä kiinteä aine jaettiin kylläisen NaHC03:n (10 ml) ja CH2Cl2:n (50 ml) kesken, ja ker-5 rokset erotettiin. Vesikerros uutettiin CH2Cl2:lla (2 x 50 ml) ja yhdistetyt orgaaniset kerrokset kuivattiin, haihdutettiin ja puhdistettiin tasapainokromatografoimalla (0,5 % NH4OH/4 - 10 % EtOH/CH2Cl2), jolloin saatiin N-(Ne-aminokaproyyli)-3-piperidiinimetyyliaminopropionihappo-10 bentsyy1iesteri lasimaisena aineena; XH-NMR (CDC13) δ 7,33 (m, 5 H), 5,13 (s, 2 H), 4,61 (m, 1 H), 4,28 (m, 1 H), 3,70 (m, 1 H), 3,11 (m, 3 H), 2,85 (m, 3 H), 2,53, (m, 4 H), 2,31 (t, J = 7 Hz, 2 H), 1,5 - 1,9 (m, 8 H), 1,42 (s, 9 H), 1,29 (m, 3 H) 0,89 (m, 1 H); 15 MS m/e 490 (MH+).

Liuokseen, jossa oli N-(Ne-aminokaproyyli )-3-piperi-diinimetyyliaminopropionihappobentsyyliesteriä (0,28 g, 0,57 mmol) ja THF:a (10 ml) huoneenlämpötilassa, lisättiin HCl:n vesiliuosta (3,4 ml, 1,0 N). Tätä seosta sekoitet-20 tiin 22 tuntia, se haihdutettiin lasimaiseksi kiinteäksi aineeksi, jauhettiin kuivaksi Et20:ssa (3 x 25 ml) ja kuivattiin, jolloin saatiin valkoista jauhetta. Tämä jauhe . ;·. liuotettiin THFriin (5 ml) ja veteen (10 ml), siirrettiin

Parr-astiaan typpiatmosfääriin ja käsiteltiin Pd/C:lla 25 (0,04 g, 10 %). Tätä seosta hydrattiin 50 psi/huoneenläm- ; V pötilassa 20 tuntia, se suodatettiin Celite-suodattimen ‘ r f ; * läpi ja haihdutettiin n. 5 ml:ksi. Tätä liuosta käsitel- > » > ’ tiin MeCN:lla (25 ml), se suodatettiin, pestiin Et20:lla (2 x 25 ml) ja kuivattiin, jolloin saatiin yhdiste 19 vä-./;* 30 rittömänä lasimaisena aineena (HPLC puhtaus > 95 %): sp.

65 - 74 °C; :V, "H-NMR (DMS0-d6) 6 9,31 (m, 2 H), 8,12 (br. s, 3 H), 4,18 (m, 2 H), 3,70 (m, 1 H), 3,04 (m, 2 H), 2,67 (m, 5 H), : ’ 2,51 (m, 1 H), 2,35 (m, 3 H), 1,87 (m, 2 H), 1,58 (m, 4 35 H), 1,42 (m, 2 H), 1,30 (m, 4 H); MS m/e 300 (MH*).

Tarkka protonoitu massa, laskettu yhdisteelle C15H29N303· 2HCl:lle (372,3): 300,2287. Saatu arvo: 300,2306.

Claims (13)

113763

1. Yhdiste, jonka yleinen kaava on (I): X1 r^V^N7 C02R6 R Λ

5. Y"A jossa X1 ja X2 ovat samoja tai erilaisia ja ne on valittu joko H2:sta tai 0:sta; jossa Y on valittu seuraavista: (CH2)m,

10 CH (NHCOR3) (CH2) m tai CH(NH2) (CH2)m; A on valittu seuraavista: NHR1, C(NH)NH2 tai syklo-alkyylirengas, jossa on typpiatomi ja joka rengas on valittu seuraavista: piperidin-2-yyli, piperidin-3-yyli, pi-peridin-4-yyli, pyrrolidin-2-yyli ja pyrrolidin-3-yyli; 15 jossa Z on valittu seuraavista: (CH2)n tai CH(C02R4) (CH2) n; jossa R1 on valittu seuraavista: H, Ci-8-alkyyli tai CH(NH)NH2; '·; jossa R2 on valittu H:sta tai Ci_8-alkyylistä; • · > 20 jossa R3 on valittu Ci_8-alkoksista tai Ci-8-alkyy- : lista; V : jossa R4 on valittu Ci-8-alkyylistä tai fenyyli- Ci_8-alkyylistä tai naftyyli-Ci-8-alkyylistä; ;· jossa R6 on valittu seuraavista: H, Ci-8-alkyyli 25 tai fenyyli-Ci-8-alkyyli tai naftyyli-Cx.8-alkyyli; jossa m on kokonaisluku 0, 1, 2 tai 3; jossa n on kokonaisluku 0, 1 tai 2; tai sen enantiomeeri tai farmaseuttisesti hyväk-syttävä suola.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, tun nettu siitä, että Z on (CH2)2. 113763

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että R1 on H.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että R2 on H.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, tun nettu siitä, että R3 on t-butoksi.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että R4 on metyyli.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, tun-10 nettu siitä, että Z on CH (C02R4) (CH2) .

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että se on valittu seuraavista: N“-Boc-L-Lys(Cbz)-Νϊρ-β-Ala-OBn (yhdiste nro 1); N“-Boc-L-Lys-Nip-p-Ala-OH (yhdiste nro 2);

15 Na-Boc-D-Lys-Nip-p-Ala-OH (yhdiste nro 3); H-L-Lys-Nip-p-Ala-OH (yhdiste nro 4); N-(N£-aminokaproyyli)-Νϊρ-β-Ala-OH (yhdiste nro 5) ; Na-Ac-L-Lys-Nip-Gly-OH (yhdiste nro 6);

20 IN^-Ac-L-Lys-Nip^-Ala-OH (yhdiste nro 7); Na-Boc-L-Arg-Nip^-Ala-OH (yhdiste nro 8) ; •',•‘.1 Na-Boc-L-Lys-Nip-y-aminovoihappo (yhdiste nro 9) ; : : : H-D-Lys-Nip^-Ala-OH (yhdiste nro 10) ; ··· N“-Boc-D-Lys-Nip-Y-aminovoihappo (yhdiste nro 11) ; : 25 N“-Boc-D-Lys-Nip-Gly-OH (yhdiste nro 12); ; ,·. N“-Ac-D-Lys-Nip^-Ala-OH (yhdiste nro 13) ; Na-Boc-D-Lys-S-( + )-Νίρ-β-Ala-OH (yhdiste nro 14); Na-Boc-L-Lys-(i-Pr)-Νίρ-β-Ala-OH (yhdiste nro 15); Na-Boc-D-Lys-R-(-)-Νίρ-β-Ala-OH (yhdiste nro 16); • s 1 ·>··’ 30 N-[3-(4-piperidiinipropionyyli) ]-Νίρ-β-Ala-OH (yh- diste nro 17 ) ; N“-Boc-D-Lys-Nip-L-Asp-OMe (yhdiste nro 18); tai N- (NE-aminokaproyyli)-3-piperidiinimetyyliamino-•t propionihappo (yhdiste nro 19). 48 1 13763