FI111550B - Aspergillus nigerin katalaasi-R:n tuotanto - Google Patents

Description

111550

Aspergillus nigerin katalaasi-R:n tuotanto

Keksintö koskee geeniteknologisten menetelmien sovellutusta, jolla voidaan luoda uusia A. niger -kantoja, , 5 jotka tuottavat korkeilla tasoilla endogeenistä katalaasi- entsyymiä (cafcR-geenin tuote, katalaasi-R), samalla kun natriumglukonaattijätemateriaalin tuotto on minimaalista. Korkeat katalaasi-R-tasot saadaan spesifisesti aikaan korvaamalla endogeeninen catR-geenin promoottori A. nigerin 10 glukoamylaasi (glaA) -geenin promoottorilla, mikä ei pelkästään johda katalaasi-R:n korkeampiin tasoihin, vaan eliminoi myös vetyperoksidin tarpeen katalaasisynteesin indusoijana, ja endogeenisen glukoosioksidaasi (goxA) -geenin deletointi vähentää suuresti natriumglukonaattij ä-15 tetuotteen tasoa, mikä täten vähentää kallista jätteenkäsittelyä.

Keksinnön tausta

Katalaasit [vetyperoksidi: vetyperoksidioksidore-duktaasit (EC 1.11.1.6)] ovat entsyymejä, jotka katalysoi-20 vat vetyperoksidin (H202) muuttamista hapeksi (02) ja vedeksi (H20) seuraavan kaavan mukaisesti: katalaasi 2H202 -► 2H20 + 02 25 Nämä kaikkialla läsnäolevat entsyymit on puhdistettu monista erilaisista eläinkudoksista, kasveista ja mikro-organismeista (Chance ja Maehly 1955 Methods Enzymol.

2: 764 - 791; Jones ja Wilson 1978 teoksessa Metal Ions in 30 Biological Systems (toim. H. Sigel), Vol. 7, Marcel Dekker Inc., New York). Lähes kaikki karakterisoidut entsyymimuo-dot koostuvat neljästä polypeptidialayksiköstä, joista kullakin on molekyylipaino 50 000 - 60 000 ja jotka sisältävät yhden prosteettisen protohemiiniryhmän alayksikköä 35 kohden (Wasserman ja Hultin 1981 Arch. Biochem. Biophys.

2 111550 212: 385 - 392; Hartig ja Ruis 1986 Eur. J. Biochem. 160: 487 - 490). Härän maksan katalaasi on ollut laajimmin tutkittu tämän entsyymin alalaji [Schonbaum ja Chance 1976 teoksessa The Enzymes (toim. P.D. Boyer) 3. laitos, voi.

5 13, s. 363 - 408, Academic Press, New York]. Härän maksan katalaasin täydellinen aminohapposekvenssi ja kolmiulotteinen rakenne tunnetaan (Schroeder ym. 1982 Arch. Biochem. Biophys. 214: 397 - 412; Murthy ym., 1981 J. Mol.

Biol. 152: 465 - 499).

10 Vaikka rihmasienistä peräisin olevia katalaaseja ei olekaan niin hyvin tutkittu biokemialliselta ja biofysi-kaaliselta kannalta, niillä on useita piirteitä, jotka erottavat ne vastaavista nisäkäskatalaaseista. Vaikka ne ovat samanlaisia alayksiköiden lukumäärän ja hemipitoisuu-15 den suhteen, sienikatalaasit ovat oleellisesti suurempia molekyylejä kuin muista organismeista peräisin olevat ka-talaasit, ja niiden alayksiköiden molekyylipainot ovat välillä 80 000 - 97 000 (Vainshtein ym., 1986 J. Mol. Biol. 188: 63 - 72; Jacob ja Orme-Johnson 1979 Biochem.

20 18: 2967 - 2975; Jones ym., 1987 Biochim. Biophys. Acta 913: 395 - 398). Tärkeämpää on se, että sellaisista sienistä kuten Aspergillus niger peräisin olevat katalaasit kestävät proteolyysiä ja glutaraldehydi- ja SDS-inaktivaa-tiota härän maksan katalaasia paremmin, ja niillä on al-25 haisempi affiniteetti katalaasin inhibiittoreille, kuten syanidille, atsidille ja fluoridille (Wasserman ja Hultin 1981 Arch. Biochem. Biophys. 212: 385 - 392). Lisäksi A. nigerin katalaasi on merkittävästi härän maksan katalaasia stabiilimpi kun se alistetaan äärimmäisiin pH-, 30 vetyperoksidi- ja lämpötilaoloihin (Scott ja Hammer 1960 Enzymologia 22: 229 - 237). Vaikka sienikatalaasit tarjoavatkin stabiilisuusetuja, vastaavilla nisäkäsentsyy-meillä, kuten härän maksan katalaasilla, on yleensä korkeampi katalyyttinen aktiivisuus (Gruft ym., 1978, 35 Kikuchi-Torii ym., 1982). Koska entsyymin stabiilisuus on 111550 3 tärkeä tekijä entsyymien bioteknologisessa hyötykäytössä, sienikatalaasien käyttö on kuitenkin herättänyt huomattavaa mielenkiintoa, erityisesti sellaisia sovellutuksia silmällä pitäen, joihin kuuluu korkeiden vetyperoksidikon-5 sentraatioiden neutralointi. Vasudevan ja Weiland (1990 Biotechnol. Bioeng. 36: 783 - 789) havaitsivat, että de-aktivaationopeus H202:ssa oli ainakin yhtä kertaluokkaa alempi A. nigerin katalaasin kuin härän maksan katalaasin tapauksessa. Näiden kahden entsyymin stabiilisuuserot voi-10 vat mahdollisesti johtua eroista rakenneominaisuuksissa ja proteiinien koostumuksessa [Vasudevan ja Weiland 1990 Biotechnol. Bioeng. 36: 783 - 789].

A. nigeristä peräisin olevia katalaasivalmisteita myydään kaupallisesti diagnostisina entsyymitarvikesarjoi-15 na natriumglukonaatin entsymaattista tuottamista varten glukoosista, H202-jätteen neutraloimista varten ja H202:n poistamista ja/tai 02:n tuottamista varten ruuissa ja virvoitusjuomissa. Härän maksan katalaasi on perinteisesti ollut edullinen entsyymi diagnostisia tarkoituksia varten 20 ja farmaseuttisiin aloihin liittyviä sovellutuksia varten (esim. piilolinssin puhdistus/desinfiointi/H202:n neutralointi). Hitaan viruksen aiheuttaman taudin, joka tunnetaan nimellä BSE (naudan BSE-tauti), äskettäiset epidemiat eurooppalaisissa nautakarjoissa ja pelko, että tämä tauti 25 voisi levitä ihmiseen [Dealler ja Lacey 1991 Nutr. Health (Bicester) 7: 117 - 134; Dealler ja Lacey 1990 Food

Microbiol. 7: 253 - 280] ovat kuitenkin saaneet aikaan mielenkiintoa löytää vaihtoehtoja härän maksan katalaasil-le useimmissa teollisissa sovelluksissa.

30 Katalaasin synteesin säätelystä A. nigerissä on julkaistu vähän tietoja. On kuitenkin havaittu, että kata-laasia tuotetaan responssina H202:n tuotolle kun organismi kasvaa glukoosin tai rasvahappojen varassa. Esimerkiksi glukoosin metabolismin aikana H202:ta muodostuu kun sokeria 4 111550 hapetetaan glukonaatiksi. Tätä reaktiota katalysoi entsyymi glukoosioksidaasi: glukoosioksidaasi 5 Glukoosi + 02 -► glukonaatti + H202

Rasvahappojen solutason metabolia, joka tapahtuu peroksisomeiksi kutsutuissa erikoistuneissa organelleissa, tuottaa myös H202:ta, joka indusoi katalaasin muodostumis-10 ta. Kaukaista sukua olevassa sienessä (hiivassa) Saccharo-myces cerevisiae indusoituu kuitenkin spesifinen katalaasi rasvahappojen varassa kasvun aikana. Tämä katalaasi, jolle on annettu nimeksi katalaasi-A (epätyypillinen), sijaitsee pääasiassa peroksisomeissa, joissa rasvahappojen hapetus 15 tapahtuu. Toinen S. cerevisiaen entsyymi, katalaasi-T (tyypillinen) on liukoinen sytoplasminen entsyymi, jota syntetisoidaan vasteena monille erilaisille muille meta-bolisille ja ympäristöstä tuleville stressitekijöille. Nämä kaksi hiivakatalaasia ovat kahden erilaisen tumassa 20 sijaitsevan geenin tuotteita, ja näille on annettu nimeksi CTA1 ja CTT1. Kaksi katalaasigeeniä on samoin eristetty A. nigreristä (Genencor International, Inc., julkaisematta).

A. nigerin catA-geeni, joka kloonattiin ristiinhybridisoi-malla hiivan CTAl-geeniin, koodittaa katalaasientsyymiä, 25 joka indusoituu pääosin rasvahappojen varassa kasvun aikana ja on oletettavasti peroksisomaalinen. Tämä entsyymi (katalaasi-A) ei ole tällä hetkellä kaupallisesti tärkeä, toinen kloonattu A. nigerin katalaasigeeni, jolle on annettu nimeksi catR, koodittaa kuitenkin liukoista syto-30 plasmista entsyymiä (katalaasi-R), joka edustaa pääaktii-··' visuutta kaupallisissa katalaasivalmisteissa.

Koska A. nigerin katalaaseja kohtaan on olemassa ilmeistä kaupallista mielenkiintoa, olisi suotavaa hankkia sellaisia A. niger -kantoja, jotka tuottavat korkeammilla 35 tasoilla catR-geenin tuotteita. Olisi lisäksi merkittävän 111550 5 hyödyllistä saada aikaan korkeita katalaasin synteesitasoja tarvitsematta tuottaa vetyperoksidia indusoijaksi. Vetyperoksidin tekemisen yhteydessä muodostuu natriumglukonaattia, joka muodostaa jätteenpoisto-ongelman. Niinpä on myös hyvin ' 5 suotavaa minimoida glukonaatin tuotanto A. nigerin kata- laasituotantokannoissa suuren mittakaavan fermentoinneissa.

Tämä keksintö esittää ratkaisun, jolla voidaan samanaikaisesti saavuttaa kaikki nämä tavoitteet.

Keksinnön yhteenveto 10 On havaittu, että on mahdollista lisätä katalaasi- R:n (catR-geenin tuote) ekspressiota ilman tarvetta tarjota vetyperoksidia katalaasisynteesin indusoijaksi. Samanaikaisesti havaittiin, että glukoosioksidaasigeenin ekspression eliminointi (goxA-geenin deleetion avulla) minimoi 15 glukonaattijätemateriaalin tuotannon ja näin kiertää kalliiden jätteenkäsittelymenetelmien tarpeen. Keksintö käsittää geenisekvenssin, jolle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Geeni koodittaa Aspergillus nigerin katalaasi-R:ää (catR-geeni), johon A. nigerin 20 glukoamylaasigeenin (glaA) promoottori- ja terminaatto-rielementit kiinnitettiin toiminnallisesti. Samanaikaisesti tämän kanssa A. nigerin glukoosioksidaasigeenin (goxA) koo-dittava alue tuhottiin käyttämällä kohdistettua geeninkor-vausmenettelyä. Keksintö käsittää myös transformoidun A.

25 niger -organismin, joka kykenee ekspressoimaan korkeita tasoja katalaasi-R:ää ilman vetyperoksidin induktiota. Keksinnön mukaiselle Aspergillus nigerille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 5 esitetään. Tämä organismi käsittää toiminnallisen ekspressioyksikön, joka käsittää 30 catR-geenin, johon A. nigerin glaA-geenin promoottori- ja • « terminaattorisekvenssit on toiminnallisesti liitetty. Keksintö käsittää lisäksi replikoituvan plasmidin tai vektorin, jolle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 4 esitetään.

35 Keksijät paljastavat myös menetelmän, jolla voidaan tuottaa korkeita tasoja katalaasi-R:ää, joka käsittää sei- 111550 6 laisten transformoitujen A. niger -solujen kasvatuksen, jotka sisältävät kromosomaalisesti integroituja kopioita catR-geenistä A. nigerin glaA-promoottorin toiminnallisen kontrollin alaisuudessa. Keksinnön mukaiselle menetelmälle 5 on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 7 esitetään.

Kuviot

Kuvio 1 on kaavamainen esitys cati?-ekspressioplas-midin muodostamisesta, joka käsittää A. nigerin glaA-pro-10 moottorin, catR:ää koodittavan alueen, glaA-terminaattorin ja A. nigerin pyrG-geenin. Lineaarinen fragmentti (EC2L), joka sisältää nämä komponentit, leikattiin irti digestoi-malla Notlrllä ja Pmelrllä ja käytettiin transformoimaan isäntäkanta A. niger AgoxA pyrG metC.

15 Kuvio 2 esittää A. nigerin catR-geenin ja sen mo lemmin puolin sijaitsevien alueiden nukleotidisekvenssin ja päätellyn aminohapposekvenssin. Esitetään restriktiokohdat entsyymeille, jotka tunnistavat heksanukleotidi- ja okta-nukleotidisekvenssejä. Intronit on merkitty katkoviivoilla.

20 Päätellyt aminohapposekvenssit, jotka vastaavat peptidejä, jotka on sekvensoitu suoraan katalaasi-R-proteiinista, on alleviivattu umpinaisella janalla.

Kuvio 3 on lineaarisen fragmentin (EC2L), jota käytettiin transformoimaan A. niger AgoxA pyrG metC, täydelli-. 25 nen nukleotidisekvenssi.

Kuvio 4, osakuva A on kaavamainen esitys sellaisen A. niger -vektorin muodostamisesta, jota käytettiin dele-toimaan glukoosioksidaasi (goxA) -geeni. Lineaarinen fragmentti, joka käsitti Smal - Clal-segmentin, leikattiin irti 30 ja sitä käytettiin transformoimaan isäntäkanta A. niger pyrG. Osakuva B on kaavakuva, joka esittää odotettua integraatiot apahtumaa goxA-lokuksessa, joka johtaa goxA:n koodittavan alueen korvautumiseen A. nigerin pyrG-geenillä.

Kuvio 5 on kaavakuva, joka esittää katalaasin tuo-35 tantoa sellaisissa A. niger AgoxA pyrG metC -kannoissa, jotka on transformoitu catR-ekspressiokasetilla (EC2L). Ai- 7 111550 kuperäinen lähtökanta, A. niger FS-1, ja isäntäkanta A. ni-ger AgoxA pyrG metC on otettu mukaan kontrolleiksi. Kukin kanta kasvatettiin kahtena rinnakkaiskasvatuksena ja kummastakin esitetään määritystulokset.

5 Edullisten suoritusmuotojen kuvaus

Kuvataan yksityiskohdat catR-ekspressiovektorin muodostamisesta ja niistä geneettisistä muokkauksista, joita käytettiin parannettujen katalaasituotantokantojen aikaansaamiseksi. Ammattimies ymmärtää, että seuraavissa esi-10 merkeissä voidaan tehdä monia erilaisia muutoksia. Esimerkkien ei vastaavasti ole tarkoitus olla rajoittavia.

Tekniikat, joita A. nigerin catR-geenin kloonauksessa ja catR-ekspressiokasetin muodostamisessa käytettiin, ovat tavanomaisia menetelmiä, jotka on kuvattu Sambrookin 15 ym. teoksessa 1989 Molecular cloning, A Laboratory Manual,

Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY.

1. A. nigerin catR-geenin kloonaus ja karakterisointi

Puhdistettu katalaasi-R hankittiin kaupallisesta A.

20 niger -katalaasivalmisteesta (Fermcolase 1000, Genencor International, Inc.) ja tehtiin sarja proteolyyttisiä fragmentteja. Nämä peptidifragmentit alistettiin aminohappose-kvenssianalyysiin. Aminohapposekvenssitietoa käytettiin suunniteltaessa synteettisiä DNA-koettimia catR-spesifisten 25 cDNA-sekvenssien tunnistusta varten Agtll-kirjastossa. Lyhyesti ilmaisten, peptidifragmenttia Met-Phe-Trp-Asn-Ser-Leu-Ile-Pro-Ala-Glu-Gln-Gln-Met käytettiin suunniteltaessa kolmen synteettisen oligonukleotidin yhdistelmä, jolla on seuraavat sekvenssit: 30 5' ATG TTC TGG AAC AGC CTG ATC CCC GCC GAG CAG CAG ATG 3' 5' ATG TTC TGG.AAC TCC CTG ATC CCC GCC GAG CAG CAG ATG 3' 5' ATG TTC TGG AAC AGC TTG ATC CCC GCC GAG CAG CAG ATG 3' Tämä peptidi valittiin, koska aminohapot antavat 35 minimaalisen degeneroituneet kodonivalikoimat, se on: kolmen synteettisen oligonukleotidin väliset erot edustavat 8 111550 vaihtoehtoisia kodonivalintoja, siellä missä ei ollut olemassa vahvaa vinoutumaa A. nlgerin tunnetussa kodoninkäyt-tötaulukossa. Tämän proteolyyttisen fragmentin kohta vastaa kuviossa 2 esitettyä peptidiä 3. Klooni, joka sisältää 5 osittaisen cDNA-fragmentin, tunnistettiin positiivisesti hybridisoimalla synteettisen DNA-koettimen kanssa ja tämän kloonin nukleotidisekvenssianalyysi vahvisti, että se koo-ditti katalaasi-R:ää. Tätä kloonattua cDNA-segmenttiä käytettiin koettimena tutkittaessa A. nigerin genomista DNA-10 kirjastoa. Tämän jälkeen koko catR-geeni sekä ylävirran ja alavirran transkription kontrollielementit koostettiin 9,0 kb:n Hindlll - XhoJ-restriktiofragmenttina. catR-.ää.

koodittavan alueen nukleotidisekvenssi on määritetty ja se annetaan kuviossa 3.

15 2. A. nigerin transformaatiossa käytetyn kata- laasiekspressiovektorikasetin (EC2) muodostaminen Näissä tutkimuksissa käytetty catR-ekspressio-vektori käyttää hyödyksi transkriptio- ja translaatiokont-rollisignaaleja, jotka ovat peräisin hyvin tutkitusta A.

20 nigerin glukoamylaasigeenistä (glaA). Toisin kuin catR-promoottori, vahva glaA-promoottori ei vaadi H202*.ta induktioon. Sen sijaan glaA-promoottori reagoi tärkkelyksen, maltoosin tai muiden malto-oligosakkaridien läsnäoloon (Nunberg ym., 1984 Mol. Cell. Biol. 4: 2306 - 2316, Barton 25 ym. , 1972 J. Bacteriol. 111: 771 - 777; Fowler ym. , 1990 Curr. Genet. 18: 537 - 545). Niinpä glaA-promoottorin käyttö mahdollistaa sellaisten katalaasituottokantojen muodostamisen, jotka eivät ole riippuvaisia vetyperoksidin tuotannosta katalaasisynteesin induktiota varten. Kuviossa 1 30 esitetään kaavamaisesti vektorikasetin muodostaminen kata- • · .. laasin ekspressiota varten glaA-promoottorin transkriptio- tason säätelyn alaisuudessa. Tämän konstruktion oleellinen piirre on se, että glukoamylaasi-katalaasi-ekspressio-yksikkö (se on: glaA-promoottori + catR:n koodittava jakso 35 + glaA-terminaattori) ja sen viereinen selektoitavissa ole- 111550 9 va markkeri (A. nigerin pyrG-geeni) voidaan leikata irti yhtenä NotI - Pmel -restriktiofragmenttina (kuvio 1).

catJ?:n koodittava alue liitettiin glaA-promootto-riin käyttämällä hyödyksi synteettistä oligonukleotidilink-5 keriä (13 emäsparia) , joka oli suunniteltu niin, että se liittää nämä kaksi DNA-segmenttiä glaA-promoottorissa olevan Bglll-kohdan kautta ainutkertaiseen Sspl-kohtaan (tuotettiin kohdennetulla mutageneesillä) neljä emäsparia catRin aloituskodonin jälkeen. Tämän linkkerin sijoittami-10 nen palauttaa catRm nukleotidisekvenssin siksi, joka oli olemassa ennen kohdennettua mutageneesiä ja fuusioi tarkoin catJ?:n koodittavan alueen glaA-promoottoriin. Fowlerin ym. antamassa glaA-promoottorialueen kuvauksessa (1990 Curr. Genet. 18: 537 - 545) havaittiin, että aloi-15 tuskodonista kaukana ylävirran suunnassa on DNA-sekvenssejä, jotka vaaditaan korkean tason ekspressioon. Nämä sekvenssit, jotka edustavat oletettavasti transkription tehosta jaelementtejä, sisältyvät 1,9 kb:n glaA-promoottori-segmenttiin, joka sisältyy catR-ekspressiokasetin muodos-20 tamiseen. glaA-terminaattorialue liitettiin samalla tavalla catR:n 31-päähän luonnossa ilmenevän Clal-kohdan kaut-ta, joka on alavirran suunnassa catalaasi-R-geenin lope-tuskodonista. Xbal-kohta, joka on Clal-.n vieressä, sijoitettiin käyttämällä synteettistä DNA-linkkeriä, ja sitä . 25 käytettiin sitten terminaattorifuusion täydentämiseksi.

Tämä terminaattorisegmentti, joka koodittaa tarpeellista informaatiota asianmukaista polyadenylaatiota ja transkription terminaatiota varten, on sama segmentti jota käytettiin Genencorin kymosiiniekspressiovektoria varten 30 (Culen ym., 1987 Bio/Technol. 5: 369 - 376). Restriktio- fragmentti, joka sisältää A. nigerin pyrG-geenin (Wilson ym., 1988 Nucl. Acids Res. 16: 2339) subkloonattiin glaA- terminaattorin viereen, niin että koko glukoamylaasin, katalaasin ja selektoitavissa olevan markkerin muodostama 35 kasetti kooditetaan yhdessä restriktiofragmentissa (tämän 10 111550 fragmentin (EC2L) nukleotidisekvenssi esitetään kuviossa 3).

3. Sellaisten A. nlger -kantojen kehittely, joita on tarkoitus käyttää katalaasin tuotantoon 5 Sellaisen A. niger -kannan, jota käytettiin isäntä nä glukoamylaasi-katalaasi-kasetin ekspressiota varten, piirteisiin kuuluvat a) uridiinia vaativa auksotrofia, erityisesti auksotrofinen pyrG:n mutaatio, b) glukoosiok-sidaasia koodittavan goxA-geenin deleetio ja c) metionii-10 nia vaativa auksotrofia, erityisesti mutaatio joka tekee soluista vajaita kystationaasi (metC) -aktiivisuuden suhteen. Vaikka metC-markkeria ei tarvitakaan katalaasi-R:n korkean tason ekspressioon, se sisällytettiin isäntäkannan ominaisuudeksi, jotta se tyydyttäisi hallituksen valvonta-15 virastojen säännöksen, joka koskee rajoitettua selviytymiskykyä. Edellä kuvattua katalaasiekspressiokasettia käytettiin transformoimaan A. nigerin AgoxA pyrG metC -kanta ja tuloksena olevia transformantteja seulottiin ravistelu-pulloviljelraissä silmällä pitäen niiden kykyä tuottaa kor-20 keitä katalaasitasoja. Näistä transformanteista valittiin jatkotutkimuksiin parhaat katalaasin tuottajat. Ravistelu-pulloviljelmiä kasvatettiin kaksi päivää 33 °C:n lämpötilassa 50 ml:ssa nestemäistä elatusainetta, joka tehtiin seuraavan reseptin mukaisesti: kutakin elatusainelitraa 25 kohden lisää maltodekstriiniä [Staley 200, A. E. Staley Co., (100 g)], ammoniumsulfaattia (4 g), kalsiumkloridia (0,4 g), magnesiumsulfaattia (0,6 g), maissinliotusnestet-tä [Archer Daniels Midland Co., (10 g)] ja kaliumfosfaattia (3 g); tilavuus saatetaan 500 ml:ksi tislatulla vedel-30 lä, pH säädetään 7,0:aan ja liuos autoklavoidaan; erikseen *: tehdään 500 ml 12-prosenttista kalsiumkarbonaattiliuosta tislatussa vedessä, pH säädetään 7,0:aan ja liuos autoklavoidaan. Kaksi steriiliä liuosta yhdistettiin aseptisesti, jolloin saatiin yksi litra katalaasintuottonestettä. Kah-35 den päivän kasvatuksen jälkeen huovastot kerättiin suodat- 111550 11 tamalla (Miracloth, Calbiochem, Inc.) ja solut pakastettiin nopeasti nestetypessä. Solut hajotettiin jauhamalla jäätynyttä sakkaa sähköllä toimivassa kahvimyllyssä noin 60 sekuntia tai kunnes saatiin hieno jauhe. Hajotetut so-5 lut resuspendoitiin uuttopuskuriin, joka oli 100-millimo-laarinen natriumformiaatin, pH 7, 0,01-prosenttinen nat-riumdodekyylisulfaatin ja 1-millimolaarinen sekä fenyyli-metyylisulfonyylifluoridin että pepstatiinin suhteen. Liukenematon sakka kerättiin sentrifugoimalla noin 1 500 g:n 10 kiihtyvyydellä ja liukoisen katalaasin aktiivisuus uutteessa mitattiin aikaisemmin kuvatuilla menetelmillä (Patti ja Bonet-Maury 1953 Bull Soc. Biol. 35: 1177;

Teranishi ym., 1974 Agric. Biol. Chem. 38: 1213). Spesifiset menetelmät katalaasintuotto-organismien aikaansaami-15 seksi hahmotellaan jäljempänä. Kaikissa näissä kuvatuissa tutkimuksissa lähtökanta oli A. niger FS-1 (NRRL3).

A. niger FS-1 pyrG -kantojen eristys 5-fluori-oroottihappoa (FOA), oroottihapon myrkyllistä analogia, on käytetty selektoitaessa uridiinia vaa-20 tivia auksotrofeja rihmasienissä ja hiivoissa (VanHarting-veldt ym., 1987 Mol. Gen. Genet. 206: 71 - 75). Sienikan-nat, jotka ovat vajavaisia orotidiini-5'-monofosfaattide-karboksylaasin (pyrG-geenin tuotteen) suhteen, ovat resistenttejä FOA:lie ja tarvitsevat kasvaakseen ulkoista uri-" 25 diinia. A. nigerin pyrG-geeni kloonattiin (Wilson ym., 1988 Nucl. Acids Res. 16: 2339) ja käytettiin selektoita-vana markkerina pyrG-mutanttikantojen transformaatiota silmällä pitäen. FOA:n käytön etu pyrG-auksotrofien positiivisena selektiona on se, että spontaaneja mutantteja 30 voidaan valikoida ilman ylenmääräisen mutageneesin ja seu-** lonnan tarvetta. A. nigerIn FS-1 pyrG -mutanttien seulon tamenetelmä on seuraava: A. niger FS-1:n itiöitä levitettiin minimialustamaljojen pinnalle, jotka sisälsivät uridiinia (2 mg/ml) ja FOA:ta (1,2 mg/ml). Resistentit pesäk-35 keet (FOAr) olivat selviä 2-3 päivän kasvatuksen jälkeen 12 111550 37 °C:n lämpötilassa. Itiöitä kuudesta FOAr-pesäkkeestä vedettiin viivoiksi FOA:ta sisältävän tuoreen alustan pinnalle ja eristetyt pesäkkeet poimittiin jatkoanalyysiin. Kuudesta FOAr-kannasta kolmen osoitettiin tarvitsevan uri-5 diinia kasvaakseen. Jotta saataisiin määritettyä, millä uridiinia tarvitsevista kannoista oli toimimaton pyrG-gee-ni, kukin kannoista testattiin silmällä pitäen sen kykyä transformoitua (se on: komplementoitua) plasmidilla, joka sisälsi A. nidulansin pyrG-geenin. Vain yksi kanta, FS-1 10 pyrGl, antoi transformantteja (arvioitu frekvenssi 10 transformanttia per milligramma DNA:ta), mikä viittasi siihen että se sisälsi pyrG-mutaation. Tätä kantaa käytettiin kaikissa myöhemmissä kokeissa.

A. niger FS-1:n ÄgoxA-kantojen tekeminen 15 Jotta saataisiin aikaan kromosomaalinen deleetio goxA-geenissä, muodostettiin vektori, joka sisälsi goxA-geenistä 5'- ja 3'-pään viereiset sekvenssit ja selektoi-tavissa olevan pyrG-geenin, joka sijoitettiin goxA:n koo-dittavan alueen osan paikalle (katso kuvio 4). goxA-geenin 20 nukleotidisekvenssiä koskevan täydellisen informaation suhteen voi tutkia artikkeleja Frederick ym., 1990 J.

Biol. Chem. 265: 3793 - 3802 989 ja Kriechbaum ym., 1989 FEBS Lett. 255: 63 - 66. Lyhyesti ilmaisten, 4,1 kb:n Clal-Smal-fragmentti, joka sisälsi A. niger FS-1:n goxA-25 geenin, subkloonattiin pUC218-johdannaiseen (josta EcoRI-kohta oli aikaisemmin poistettu), jolloin saatiin pUC218goxA. A. nigerin pyrG-geeni eristettiin pUC4XL:stä EcoRI-fragmenttina, jossa oli kummassakin päässä (27 bp ja 16 bp) pUC4XL-polylinkkerin DNA:ta. goxA:n koodittava alue 30 poistettiin tämän jälkeen EcoRI-digestiolla ja jäljelle jäänyt plasmidifragmentti ligoitiin EcoRI-fragmenttiin, joka sisälsi A. nigerin pyrG-geenin, jolloin saatiin aikaan pUC218ÄgoxA. Tästä plasmidista eristettiin 4,75 kb:n Smal-Xbal-restriktiofragmentti, joka sisältää goxA-geenin 35 5'- ja 3'-pään viereiset alueet, niin että osa goxA:n koo- 111550 13 dittavasta sekvenssistä poistettiin ja korvattiin toimivalla pyrG-geenillä. Tämän fragmentin käyttö A. niger FS-1 pyrGltn transformoinein, jolloin selektoidaan uridiinin prototrofiaa, johti monien sellaisten kantojen eristyk-5 seen, jotka eivät antaneet sinistä väriä glukoosioksi-daasi-indikaattorimaljoilla (Witteveen ym., 1990 Appi. Microbiol. Biotechnol. 33i 683 - 686). Näistä goxA-va-jaista transformanteista uutetun genomisen DNA:n analyysi Southernin blottauksella viittasi siihen, että 10 AgoxA::pyrG-kasetti oli integroitunut homologisella rekom-binaatiotapahtumalla goxA-lokukseen (kuten kuviossa 4B kaavamaisesti esitetään). Toisin sanoen selektoitavissa oleva pyrG-geeni oli korvannut goxA:n koodittavan alueen.

Kuten kuviossa 5 esitetään, katalaasin tuotanto 15 AgoxÄ-mutanteissa oli noin kolmesta kuuteen kertaa matalampi kuin lähtökannassa FS-1. Tulkitsemme näiden tulosten viittaavan siihen, että glukoosioksidaasin poissa ollessa tehdään vähän vetyperoksidia, ja tällä on vuorostaan haitallinen vaikutus katalaasin induktioon.

20 A. nigerin FS-1 AgoxA pgrG -kantojen eristys A. niger FS-1 AgoxA:n spontaanit uridiinia tarvitsevat mutantit selektoitiin FOA:ta käyttäen edellä kuvatulla tavalla. Tämä vaihe oli välttämätön kannan myöhempää transformaatiota varten pyrG-pohjaisella EC2-kasetilla.

25 A. nigerin FS-1 Agox.A pgrG metC -kannan eristys

Jotta saataisiin rajoitettua rekombinanttisen kata-laasintuotto-organismin elinkykyä ympäristössä, metionii-nia tarvitseva auksotrofia tuotettiin seuraavasti. A. niger FS-1 AgoxA pyrG:n itiöitä mutagenisoitiin UV-valolla 30 (95-prosenttinen tappo) ja henkiin jääneet alistettiin suodatusrikastukselle Aspergillus-minimialustassa. Tällä menetelmällä epäsuotavat prototrofit germinoituivat ja kasvavat muodostaen huovastoja, jotka voidaan poistaa suodattamalla. Auksotrofiset solut eivät voi germinoitua tai 35 kasvaa minimialustassa, ja näin ollen ne menevät läpi huo- 14 111550 koislsta suodattamista (esim. Miracloth, Calbiochem, Inc.). Useiden suodatus- ja kasvatuskierrosten jälkeen jäljellä olevat huokoset maljattiin täydelliselle alustalle. Pesäkkeitä siirrettiin näiltä maljoilta minimialusta-5 agarille ja tuoreille täydelliselle alustamaljoille. Ne jotka kasvoivat täydellisellä alustalla mutta eivät mini-miagarilla, olivat auksotrofisia. Auksotrofipopulaatiosta tunnistettiin pesäke, joka kasvoi minimialustalla, johon oli lisätty metioniinia. Lisätestauksessa havaittiin, että 10 kanta oli vajaa spesifisen vaiheen suhteen metioniinin biosynteesireitissä. Kasvua tuki joko homokysteiinin tai metioniinin lisäys, mutta ei homoseriinin tai kystationin lisäys. Tunnetun metioniinin biosynteettisen reitin perusteella vaikuttaa siltä, että tämä metioniinia vaativa 15 auksotrofi oli vajaa kystationaasiaktiivisuuden suhteen, ja niinpä sille annettiin määritelmä metC muiden organismien suhteen yleisen tavan mukaisesti.

4. A. nigec FS-1 ÄgoxA pgrG metC -kannan transformaatio ja katalaasia ylimäärin tuottavien kantojen karak-20 terisointi

Katalaasin ekspressiokasetti (lineaarisessa muodossa) eristettiin sen jälkeen kun pUC-EC2-plasmidi oli eristetty Pmel:llä ja WotI:llä ja EC2-fragmentti oli puhdistettu preparatiivisella geelielektroforeesilla. Puhdistet-25 tua DNA-fragmenttia käytettiin sitten transformoitaessa A. niger LgoxA pgrG metC -kanta ja prototrofisia transfor-mantteja seulottiin ravistelijapulloviljelmässä silmällä pitäen niiden kykyä tuottaa katalaasia. Noin viidestäkymmenestä ravistelijapulloissa seulotusta transformantista 30 tunnistettiin kymmenen, jotka tuottivat oleellisesti kor- ” keampia katalaasitasoja kuin kontrollikannat. Nämä kymme nen kantaa arvioitiin uudestaan kaksina rinnakkaisina ravisteli japulloviljelminä ja katalaasiaktiivisuuden määri-tystulokset esitetään kuviossa 5. Yhdeksän kymmenestä kan-35 nasta tuotti oleellisesti korkeampia tasoja katalaasi-R:ää 111550 15 kuin lähtökanta FS-1. Kaksi transformanttia (EC2L-19, EC2L-23) tuotti ravistelijapulloviljelmissä katalaasisaan-toja, jotka olivat noin kymmenestä viiteentoista kertaa A. niger FS-l-kannan tuottama taso, ja nämä kannat valittiin 5 testattavaksi suuren mittakaavan tuotanto-olosuhteisiin. Fermentointikokeet 10 litran ja 50 000 litran mittakaavassa ovat osoittaneet, että katalaasi-R:n tuotanto transfor-mantista EC2L-23 vastaa katalaasi-R:n ekspressiotasoa, joka havaitaan ravistelijapulloviljelmissä.

10 Lisäksi A. niger EC2L-23:n ja FS-l-lähtökannan fer- mentointien aikana tuotettujen orgaanisten happojen HPLC-analyysit antoivat seuraavat natriumglukonaattisaannot:

Kanta Natriumglukonaatti (mg/ml) 15 FS-1 > 200 000 EC2L-23 (koe 27) 48 EC2L-23 (koe 28) 123 Nämä tulokset osoittavat dramaattista vähenemistä 20 EC2L-23:n tuottaman natriumglukonaattijätemateriaalin mää rässä. 1 ·« • ♦«

Claims (7)

111550

1. Geenisekvenssi, tunnettu siitä, että se käsittää koodittavan alueen geenistä, joka koodittaa Asper- 5 gillusista peräisin olevan katalaasi-R-entsyymin, joka käsittää kuvion 2 A-C mukaisen aminohapposekvenssin, ja As-pergillusin glukoamylaasipromoottorigeenin, joka on toiminnallisesti liitetty mainittuun geeniin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen geenisekvenssi, 10 tunnettu siitä, että Aspergillusin glukoamylaasi- promoottori on peräisin A. nigeristä.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen geeni-sekvenssi, tunnettu siitä, että geeni sisältää kuviossa 2 A-C tai kuviossa 3 A-F esitetyn catR-sekvenssin.

4. Replikoituva plasmidi tai vektori, tunnet- t u siitä, että se pystyy integroitumaan Aspergillus nige-rin genomiin, johon jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen geenisekvenssi on insertoitu.

5. Aspergillus niger, tunnettu siitä, että 20 se on transformoitu jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukaisella geenisekvenssillä.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen Aspergillus niger, tunnet tu siitä, että siitä on deletoitu na-tiivi glukoosioksidaasigeeni.

7. Menetelmä katalaasi-R-entsyymin tuottamiseksi Aspergillusista, joka entsyymi käsittää kuvion 2 A-C mukaisen aminohapposekvenssin, tunnettu siitä, että viljellään patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen Aspergillus niger käyttäen assimiloitavia hiili- ja typpilähteitä. 30 • « 1 « 111550