FI110698B

FI110698B - Lignoselluloosamateriaalien proteaasilla katalysoidut käsittelyt

Info

Publication number: FI110698B
Application number: FI925352A
Authority: FI
Inventors: Alexander R Pokora; Mark A Johnson
Original assignee: Mead Corp
Priority date: 1991-11-26
Filing date: 1992-11-25
Publication date: 2003-03-14
Also published as: CA2082185C; EP0546721B1; DE69224173T2; FI925352A0; DE69224173D1; EP0546721A1; AT4589U2; AT4589U3; CA2082185A1; US5374555A; ES2111621T3; BR9204539A; FI925352A

Description

1 'I'-HWiw

Lignoselluloosamateriaalien proteaasilla katalysoidut käsittelyt - Proteaskatalyserad behandling av lignocellu-losamaterial 5 Tämä keksintö koskee puulastujen tai puuhiokkeen entsy maattista käsittelyä, mikä lisää fibrillaatiota ja helpottaa ligniinin poistamista ja valkaisua.

Aikaisemmat entsymaattiset ja biologiset selluloosan kei- 10 tot eivät ota huomioon ekstensiinin läsnäoloa soluseinis- sä. Ekstensiini on erittäin ristiinsitoutunutta proteiinia, jossa on runsaasti proliinia ja hydroksiproliinia, johon eivät ksylanaasit ja peroksidaasit, kuten ligninaa-si, vaikuta. On oletettu, että ligniini on sitoutunut 15 ekstensiiniin ja toimii soluille kannattavana tukiranka na. Ekstensiini tai ligniini immobilisoituu todennäköisemmin soluseiniin sekundäärisen seinän muodostumisen aikana.

20 Ekstensiinin osittainen hajoaminen näyttäisi olevan tär keää tekemään ligniinin helppopääsyisemmäksi uutolle kemiallisessa selluloosan keitossa ja valkaisussa tai vä-hentämään energiankulutusta ja selluloosakuitujen vauri- • · : ,·. oitumista mekaanisen selluloosan keiton aikana.

:·?4 ! ! Tämän keksinnön mukaisesti puulastuja tai puuhioketta kä- ·;· ; sitellään missä tahansa vaiheessa paperinvalmistusmene- telmää, mutta edullisesti ennen ligniinin poistoa tai c * * *.* * valkaisua proteaasientsyymillä lisäämään fibrillointia 30 ja/tai ligniinin poistamisen tai valkaisun tehokkuutta.

• * '·/·· Keksijöiden testit ovat osoittaneet, että proteaasit, pepsiini ja papaiini edistävät ligniinin poistamista • ' . puusta, mahdollisesti pilkkomalla soluseinän proteiini- • t . matriisia. Testit ovat myös osoittaneet, että puuhiok- '35 keet, joita on käsitelty proteaaseilla keksinnön mukai- : : : sesti, osoittavat korkeampaa fibrillaation astetta kuin massat, joita ei ole käsitelty proteaaseilla. Testit ovat 2 110698 osoittaneet, että proteaasikäsittely tuottaa litteämpää kuitua, mikä parantaa paperin pehmeyttä johtuen näistä kuiduista. Proteaasikäsittely voidaan yhdistää peräkkäin tai sekoittaen ksylanaasilla tai ligninaasilla käsittelyn 5 kanssa.

Teoria, joka tukee keksintöä (johon hakijat eivät toivo olevansa sidotut), on sellainen että selluloosapolymeeria on kasveissa pektiinien, ksylaanien (hemiselluloosa), 10 ligniinin ja proteaasien yhteenkudotussa matriisissa.

Proteiinien rakenteellista osuutta on selitetty käyttämällä "loimi-kude"-mallia , mikä ennustaa ekstinsiinien ristiinsitoutunutta proteiiniverkkoa, proteiineja, joissa on runsaasti hydroksiproliinia (HPRP), ja proteiineja, 15 joissa on runsaasti glysiiniä (GRP), jotka voivat olla sitoutuneet ligniiniin ja selluloosaan. Hydrolysoimalla mikä tahansa näistä proteiinisysteemeistä lisääntyy ligniinin poisto. On myös teorisoitu, että ekstinsiini voi sitoa mikrotibrillejä tekemään kuidun, mikä voi selittää, 20 miksi proteaasikäsittelyssä on havaittu lisääntynyttä fibrillointia.

, . Riippuen puulastujen tai massan luonteesta voidaan puu- *· lastuja tai massaa käsitellä suoraan proteaasietsyymiliu- :*25 oksen kanssa. Muissa tapauksissa on toivottavaa esikäsi- : V teliä lastuja tai massaa emäksisellä liuoksella tai sel- j lulaasientsyymiliuoksella poistamaan materiaaleja, jotka voivat päällystää kuituja. Tämä lisää luoksepääsyä, mikä proteaasientsyymillä kuiduissa on ekstinsiineille.

30 : Keksinnön yksi ilmenemismuoto on menetelmä, mihin sisäl- tyy puulastujen pitäminen proteaasietsyymiliuoksessa a- janjakso ja riittävissä olosuhteissa lisäämään ligniinin poistoa, valkaisua tai fibrillaatiota selluloosassa, joka '35 on valmistettu puulastuista.

• · • » > ! Keksinnön eräs toinen ilmenemismuoto on menetelmä, mihin • * » 3 110696 sisältyy selluloosapaperimassan inkubointi proteaasient-syymiliuoksessa ajanjakso ja olosuhteissa, jotka lisäävät ligniinin poistoa, valkaisua tai fibrillatiota massassa.

5 Koska entsyymeihin, joita käytetään patenttivaatimusten menetelmissä, viitataan tavallisesti proteaaseina, huomaavat ammattimiehet, että kaikki proteaasit eivät ole tehokkaita kaikkiin substraatteihin kaikissa olosuhteissa. Mikä tahansa proteaasi, joka kykenee hydrolysoimaan 10 ekstinsiinejä, HPRP:tä ja GRP:tä, pitäisi olla tehokkaita keksinnössä. Kuten esimerkeissä 1 ja 2 osoitettiin jättö-aikaan, hyviä tuloksia lisääntyneen ligniinin poistamisen nimissä on saatu pepsiinillä (CAS nr. 9001-75-6) ja papa-iinilla (CAS nr. 9001-73-4). Bromelaiinin (CAS nr. 37189-15 34-7) ja homeproteaasin ei ole havaittu olevan yhtä teho kasta ligniinin poistossa. Erityisen edullisia proteaase-ja ovat luonnon tai synteettiset proteaasit, jotka ovat aktiivisia vähemmän happamissa tai emäksisimmissä olosuhteissa, koska happamat olosuhteet ovat taipuvaisia hajot-20 tamaan massaa. Esimerkiksi papaiini on aktiivinen pH:ssa 6,2 ja on edullisempi kuin pepsiini, joka vaatii pH:ta 2,0. Edullisilla proteaaseilla on niiden maksimiaktiivi-. . suus pH:ssa, joka on suurempi kuin 4,0 ja edullisemmin ’· *· suurempi kuin 5,0. Jopa edullisempia ovat proteaasit, ;·25 jotka ovat aktiivisia emäksisissä pH-olosuhteissa.

·.· · Tyypillisiin esimerkkeihin proteaaseista, jotka ovat hyö- dyllisiä tässä, kuuluu subtilisiini- (CAS nr. 9014-01-1), termolysiini- (CAS nr. 9073-78-3), esperaasi- (CAS nr.

• 30 9073-77-2), AI Pase- (CAS nr. 9001-12-1) proteaasit, : joilla on kollagenaasiaktiivisuutta, proteaasit, jotka • · · ··. hydrolysoivat gelatiinia, eläinten kavioita, sarvia, nah koja, nivelsiteitä, jänteitä tai rustoa tai hydrolysoivat ’* * muita substraatteja, joissa on samanlainen glysiini- ja ”35 hydroksiproliinisisältö kuin kasvin soluseinäproteiineis- : sa, proteaasit lampaan sorkkamätäorganismeista, proteaa- | sit homeista, joita on puussa, kuten puun sinistymähome, 4 110698 valkolahohome ja ruskolahohome.

Sopiviin massoihin keksinnön käytännönsuoritusta varten kuuluvat kovapuu, pehmeäpuu ja muut 1ignoselluloosapape-5 rimassat. Esimerkiksi, mekaanisia, termomekaanisia, kemi- mekaanisia, sulfiitti-, sulfaatti-, sooda- ja modifioituja sulfiittiselluloosaa voidaan käyttää.

Proteaasikäsittely voidaan suorittaa missä tahansa as-10 tiassa, jolla on haluttu koko, jossa on mahdollisuus si sältöjen sekoittamiseen ja lämpötilan kontrollointiin. Reaktanttien lisäysjärjestys ei ole kriittinen. Perus-reaktioseoksessa on massaa ja puulastuja vedessä pH:ssa, joka on sopiva entsyymille tai käytetylle entsyymiseok-15 selle. Lignoselluloosamassan tapauksessa. Reaktioseos voi vaihdella noin 1-16 % koostumukseltaan. Proteaasia on noin suhteessa 1:1 000 000 yksikköä grammaa kuivaa massaa kohti. Yksi yksikkö proteaasia hydrolysoi kaseiinin tuottamaan väriekvivalentteja 1 μ mol:lie tyrosiinia/min 37°C 20 (väri Folin-Ciocalteu Reagent:lta). Reaktioseosta inku- boidaan 20-80°C:ssa noin 0,1-6 h. Ammattimiehet kykenevät helposti optimoimaan reaktio-olosuhteet tietylle entsyy-. . misysteemille ilman kohtuutonta kokeilua.

:·55 Erään keksinnön näkökohdan kanssa voidaan ksylanaasia, : ligninaasia, pektiiniesteraasia, pektiinilyaasia tai man- : gaaniperoksidaasia käyttää myös samanaikaisesti tai esi- : käsittelynä tai jälkikäsittelynä. Yleisesti nämä entsyymi': mit näyttävät tekevän ekstensiinin helppopääsyisemmäksi.

30 Ksylanaasin reaktiosta voidaan tehdä viite kansainväli- : seen patenttihakemukseen W091/05908. Ligninaasireaktiota ··. varten katso eurooppalainen patenttihakemus 90810681.8.

Puulastuja voidaan edullisesti käsitellä tämän keksinnön •ys mukaisesti liottamala ne entsyymiliuokseen. Lastut kui- :.·. tenkin hajotetaan edullisesti antamalla niiden kulkea * · « i ruuvipuristimen läpi, kuten U.S. patentissa 4 869 783, 5 110698

Prusas, on kuvattu. Hajottamalla ja puristamalla lastut kokoon ja antamalla lastujen laajeta entsyymiliuoksessa, saavutetaan lastujen tehokas kyllästys ja imeytyminen.

5 Massan käsittely keksinnön mukaisesti voidaan kytkeä min kä tahansa ligniinipoisto- tai valkaisuprosessin kanssa lisäämään noiden prosessien tehokkuutta. Muita prosesseja, joita voidaan kytkeä keksinnön prosessin kanssa tehtäessä paperia tai kartonkia, ovat happidelignifioinnis-10 ta, vetyperoksidaasiuuttaminen ja valkaisu, klooridioksi- divalkaisu, kloori- ja klooridioksiinivalkaisu jne. Käsittelyn erityinen seuraavuus on avoin. Mikä tahansa peräkkäisyys, jossa on ainakin yksi vaihe, missä lastuja tai massoja inkuboidaan proteaasin kanssa, ovat tässä 15 hyödyllisiä. Proteaasikäsittely voidaan sijoittaa edistä mään mihin tahansa vaiheeseen prosessisekvenssissä. Kuitenkin, jotta saadaan maksimitehokkuus ligniinin poistossa, täytyy proteaasikäsittelyn edeltää ligniinipoisto- ja valkaisuvaihetta.

20 . Massoja esikäsitellään materiaalien, jotka voivat saostua .* paperikuitujen päälle ja jotka voivat kuluttaa proteaa- * · · ;;*/ siä, poistamiseksi. Monet näistä materiaaleista ovat » * · : ·* emäsliukoisia ja siksi on toivottavaa pestä massa nat- ..25 riumhydroksidiliuoksella (pH noin 11-14) ennen proteaasi- * · käsittelyä. Milloin massa valmistetaan emäksisissä olo- ·,·* ·* suhteissa, tämä ei ehkä ole tarpeellista. Esimerkiksi sulfaattiselluloosien emäksinen käsittely ei ole tarpeel- lista. Surfaktantti- tai detergenttikäsittelyä voidaan .*30 käyttää lisäämään proteaasin tunkeutumista kuituaukkoihin \ ja lisäämään epäpuhtauksien ja häiritsevien aineiden pe- • ♦ · semistä. Huokoset voidaan aukaista sellulaasi- tai pekti-'...· naasiesikäsittelyillä. Myös käsittely kelatoivila aineil- la metallien poistamiseksi saattaa lisätä tunkeutumista.

::Ä5

Emäksinen esikäsittely suoritetaan yleensä 10-80°C:ssa 6 11069:6 käyttämällä noin 5-200 osaa emästä/100 osaa kuivaa massaa. Toinen tehokas esikäsittely suoritetaan emäksisessä pH :ssa ja käyttämällä noin 50-5 000 sellulaasiyksikköä/ 100 g massaa tai lastuja.

5

Keksintöä kuvaillaan yksityiskohtaisemmin seuraavilla ei-rajoittavilla esimerkeillä.

Esimerkki 1 10 Sellulaasi-esikäsittely

Hierre (RMP) (750 g, 14 % koostumus) sekoitettiin 5 1 kanssa 0,1 M natriumasetaattia, pH 5 ja 20 g sellulaasia Penicillium funiculmista (134 000 yksikköä, Sigma Chemi-15 cal Co.) ja sekoitettiin 2 h huoneenlämpötilassa. Liete suodatettiin, sekoitettiin 1 1 kanssa 2 M natriumhydroksidia 30 min, suodatettiin, pestiin samalla natriumhyd-roksidiliuoksella, suodatettiin, pestiin vedellä 3 kertaa ja jaettiin 10 yhtä suureen osaan.

20

Esimerkki 2 Proteaasikäsittely

Sellulaasilla käsitelty ja emäksellä pesty massa (40 g) •*25 tasapainotettiin 500 ml:ssa puskureita, jotka nähdään • ·' taulukossa 1. Liuosten pH:t säädettiin osoitettuun tasoon : sen jälkeen, kun oli lisätty massa esimerkistä 1. Prote- :.i aasit (2 g) lisättiin jokaiseen lietteeseen taulukon 1 : ; : mukaisesti.

30 » » · · * 110696

Taulukko 1

Puuhiokkeen proteaasikäsittely 5 Proteaasi Puskuri /pH Entsyymiyks iköt1 f 100 mM1 (Sioma Chemical Co.1

Kontrolli (esim.l) Fosfaatti, 6,2 0

Pepsiini Fosfaatti, 2,0 250 000 10 Bromelaiini Sitraatti, 4,5 3 750 000

Homeproteaasi Fosfaatti, 2,8 1 200

Papaiini Fosfaatti, 6,2 5 600 1 Sigma Chemical on kuvannut yksiköt.

15

Proteaasikäsittely suoritettiin sekoittamalla 1 h huoneenlämpötilassa. Massa suodatettiin, uutettiin 100 ml: 11a 4 % natriumboraattia 2 M:ssa natriumhydroksidissa, pH 12, jonka jälkeen 100 ml:11a 2 M natriumhydroksidia. Lig-20 niinin poisto mitattiin määrittämällä absorbanssi (OD) 280 nm:ssa jokaisesta uutteesta. Nämä tulokset nähdään taulukossa 2.

• ·

Taulukko 2 ;;25 • Proteaasi Boraattiiuutto Hydroksidiuutto % Kontrolli : (OD 280nm (OD 280nm yksiköt) yksiköt) • · · • —........... " 1 ..... 1 ' I — - I I 1 ' ' 30 Kontrolli 15,4 0,34 100 :\j Pepsiini 21,4 0,80 141

Bromelaiini 5,2 1,90 45 • Homeproteaasi 3,1 0,64 23

Papaiini 5,1 1,02 39 ’33 ___ : Tulokset taulukossa 2 osoittavat, että ligniiniä poiste- 8 11069-8 taan merkittävästi enemmän pepsiinikäsittelyllä kuin poistettiin käsittelemättömästä massasta. Jotkut nähdyt erot voivat olla uuttoajan ja kontrolli-inkubaation pH:n (6,2) funktio. Allaoleva esimerkki 3 tutkii uuttoajan ja 5 pH:n vaikutusta vertailuna ligniinin poistamiseen prote- aasikäsittelyllä.

Esimerkki 3

Esimerkki 3 suoritettiin kuten esimerkki 2 käyttämällä 10 ainoastaan pepsiiniä ja papaiiniä. Kuitenkin sellulaasil- la käsitelty massa vähennettiin 30 g:aan/testi. Uuttoai-kaa pidennettiin 85 minuuttiin boraattiuutolle ja 100 minuuttiin hydroksidiuutolle. Tulokset näkyvät taulukossa 3.

15

Proteaasi Boraattiiuutto Hvdroksidiuutto % Kontrolli (OD 280nm (OD 280nm yksiköt) yksiköt) 20 Kontrolli, pH 2 1,36 1,87 100

Pepsiini, pH 2 6,28 2,15 261

Papaiini, pH 6,2 2,80 2,18 154 ^/25 Näkyvissä oleva materiaali osoitti, että erityisesti pep- ·' *' siinille tämän entsyymin toiminta lisää ligniinin liukoi- • · : suutta melkein 3-kertaisesti. Nämä tulokset osoittavat, :.’ i että proteaasit voivat edistää ligniinin poistamista '/< : puusta, mahdollisesti pilkkomalla soluseinän proteiini- 30 matriisia.

Esimerkki 4 Tämän esimerkin tarkoitus on osoittaa esikäsittelyn vaikutus ligniinin poistamiseen. Valmistettiin yksi näyte •35 hierrettä ilman esikäsittelyä. Toinen näyte valmistettiin , .·. ja pestiin 2 M:ssa NaOH:ssa. Kolmatta käsiteltiin sellu- laasilla ja pestiin 2 M:11a NaOHrlla. Jokaista näytettä 110696 9 käsiteltiin papaiinilla (fosfaattipuskuri, pH=6,2) taulukossa 3 osoitetuissa määrissä, jonka jälkeen seuraavaksi vesipesu proteiinin poistamiseksi ja boraattiuutto pH:ssa 12 ligniinin poistamiseksi, mikä erottaa proteiinin 280 5 nm:n kontribuution ligniinin ja minkä muun tahansa hiili hydraatin kontribuutiosta. Tulokset nähdään taulukossa 3 prosenttina kontrollia (s.o. ei proteaasientsyymiä).

Taulukko 4 10 Esikäsittelyjen vaikutus OD 280 (ligniin) hierteestä uu tettavissa oleviin % yli kontrollin (ei entsyymiä) - boraattiuutto OD 280 15 Papaiini Ei esikäsittelyä Emäspesu Esikäsittelyt (ai 2 M NaOH sellulaasi esikäsittelyt 2 M NaOH-pesu 20 0,5 0,7 39 61 1.0 3,1 74 160 1,5 22 77 165 2.0 12 98 216 • « · :.-2¾ * Esimerkki 5 : : : Inkubaatioajan vaikutus määritettiin käsittelemällä hio- kettä, jota oli käsitelty 2 Milla NaOH-esikäsittelyllä ja inkuboitu papaiinin kanssa, 1 g, aikaolosuhteissa, jotka 30 nähdään taulukossa 5.

• · ♦ t tl* 5 10 110658

Taulukko 5

Papaiinilla inkuboitaessa ajan vaikutus emäksiseen, hierteestä uutettavissa olevaan.

Papaiini-inkubaation %-lisäys 280 nm:n uutettavissa aika f mini_ oleviin yli 0-aian kontrollin 15 111 30 134 10 45 160 60 130

Tulokset taulukossa 5 osoittavat, että lisääntyneiden 15 uutettavissa olevien esiintyminen ei ole käsittelyn teko- tuote vaan mieluummin ajasta riippuva papaiinikatalyysin tulos.

Esimerkki 6 20 Voimapaperin ruskeaa ainetta käsiteltiin papaiinilla tai bromelaiinilla ilman esikäsittelyä taulukossa 6 osote-tuissa olosuhteissa.

* « ’· *· Taulukko 6 » « · :.25 : V Proteaasimäärä Uutettavissa olevien lisääntyminen yli ;.· * a_ kontrollin _

Papaiini: 0,5 50 30 1,0 83 .·. : 1,5 94 • ( « 2,0 202

Bromelaiini: 0,5 22 ’35 1,0 17 : .·. 1,5 33 J 2,0 56 11 110696

Tulokset taulukossa 6 osoittavat proteaasipitoisuuden lisääntyneen vaikutuksen ligniinin vapautumiseen sulfaattiselluloosan ruskeasta aineesta ilman lisäesikäsittelyä. 5 Sekä bromelaiini (proteaasi ananaksen varsista) että pa- paiini ovat tehokkaita, mutta tässä on kuvattu papaiinin ylivoimainen valikoivuus.

Kun keksintöä on kuvattu yksityiskohtaisesti ja viittaa-10 maila sen edullisiin suoritusmuotoihin, on selvää että modifikaatiot ja muunnelmat ovat mahdollisia ilman, että poiketaan liitetyissä patenttivaatimuksissa kuvatun keksinnön rajoista.

* * · * · ♦ < · I « t * » * t

Claims

110698

1. Menetelmä, joka koostuu lignoselluloosamassan käsittelystä proteaasientsyymiliuoksella, tunnettu siitä, että 5 massa on valmistettu aikalisissä olosuhteissa tai esikä-sitelty alkalisella liuoksella, jolloin käsittely alkali-sella liuoksella lisää mainitun proteaasientsyymin imeytymistä mainittuun massaan.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu käsittely suoritetaan noin 20-80 °C lämpötilassa.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tun-15 nettu siitä, että mainittuun esikäsittelyyn kuuluu mainitun massan käsittely natriumhydroksidiliuoksella.

4. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittuun esikäsittelyyn 20 kuuluu mainittujen massojen käsittely sellulaasientsyymi-liuoksella.

< · · ; .·. 5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen mene- • · iV telmä, tunnettu siitä, että mainittuun menetelmään kuuluu * · ! 25 lisävaiheena mainitun massan käsitteleminen ksylanaasi- ;··, entsyymillä. * t * i

· · '·* * 6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että mainittu proteaasi kykenee • · · : 30 hydrolysoimaan ekstensiiniä, proteiinia, jossa on run- ;V: säästi hydroksiproliinia, tai proteiineja, joissa on run- \ säästi glysiiniä. * j »t

• · ·;*’ 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu :,ti.· 35 siitä, että mainittu proteaasi on aktiivinen pHrssa, joka : ’ *': on suurempi kuin 4,0. 13 11G6Sfc

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu proteaasi on papaiini.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, 5 tunnettu että mainittu proteaasi valitaan ryhmästä, joka koostuu subtilisiineistä, termolysiineistä, esperaasista, Alpasesta, kollagenaaseista, lampaan sorkkamätäorganis-mien proteiineista, sinistymähomeesta, valkolahohomeesta ja ruskolahohomeesta. 10

10. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu massa on mekaanista massaa.

11. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että mainittuun menetelmään kuuluu lisäksi mainitun massan ligniinin poisto ja/tai valkaisu mainitulla proteaasientsyymillä mainitun käsittelyn jälkeen. 20

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu : siitä, että mainittu ligniinin poisto- tai valkaisupro- : ,·. sessi valitaan ryhmästä, joka koostuu happidelignifioin- !V nista tai -valkaisusta, vetyperoksidiuutosta tai -valkai- ! 25 susta ja kloori- tai klooridioksidivalkaisusta.

'· ’·’ 13. Menetelmä, johon kuuluu puulastujen käsittely prote- ‘· aasientsyymiliuoksella massan muodostamiseksi mainituista lastuista, tunnettu siitä, että mainittuja lastuja esikä-v : 30 sitellään alkalisella liuoksella ja esikäsittely alkali-T: sella liuoksella lisää mainitun proteaasientsyymin imey- \ tyrnistä mainittuun massaan.

·;·’ 14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu 35 siitä, että mainitut lastut hajotetaan ennen kuin ne saa- tetaan kosketuksiin mainitun proteaasientsyymin kanssa. 11069ε